PL192684B1

PL192684B1 - Sposób utrzymania błony komórkowej i supresji hemolizy przy przechowywaniu koncentratu płytek

Info

Publication number: PL192684B1
Application number: PL336294A
Authority: PL
Inventors: Secondo Dottori
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2006-11-30
Also published as: CZ368199A3; KR20010006464A; ATE257326T1; US6960428B2; IL132271A0; US20030022228A1; CA2286721A1; US6482585B2; CZ298671B6; CN1252687A; WO1998046073A1; HK1025477A1; EP0975214B1; HUP0001936A2; KR100508408B1; PL336294A1; DE69821002T2; CN1698430A; BR9808911B1; JP2001523225A

Abstract

1. Sposób utrzymania b lony komórkowej i supresji hemolizy przy przechowywaniu koncen- tratu p lytek (PC), znamienny tym, ze obejmuje zawieszanie PC w roztworze konserwuj acym, zawieraj acym w ilo sci 0,25 do 50 mM produkt karnitynowy dobrany z grupy, do której nale zy L-karnityna (LC), alkanoilo-L-karnityna lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole albo ich mie- szaniny. PL PL PL

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób utrzymania błony komórkowej i supresji hemolizy przy przechowywaniu koncentratu płytek krwi. Bardziej szczegółowo, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wydłużania żywotności produktów krwiopochodnych, jak również ich oporności na czynniki uszkadzające błonę komórkową, takie jak promieniowanie, poprzez przechowywanie tych produktów w zawiesinie, zawierającej skuteczną ilość L-karnityny lub alkanoilo-L-karnityny.

Coraz więcej uwagi poświęca się problemowi zapasów krwi, zarówno w skali krajowej, jak i międzynarodowej. Poddawano w wątpliwość zarówno integralność, jak i wiarygodność istniejących zapasów, oraz możliwość gromadzenia z czasem większych ilości. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest względnie krótki okres stabilności przy przechowywaniu produktów krwiopochodnych.

Najczęściej obecnie stosowana do przetoczeń postać produktu krwiopochodnego - koncentrat krwinek czerwonych, czyli masa erytrocytarna (red [blood] cell concentrate - RCC) - ma czas przechowywania ograniczony do 42 dni. Po tym czasie następuje znaczny spadek poziomu ATP i jednocześnie znaczny spadek pH, wskazujący na spadek żywotności, ewentualnie - przy zachowaniu żywotności - bardzo krótki czas pozostawania w krążeniu po wlewie. Krwi pełnej in vivo nie przechowuje się przez dłuższy czas.

Obecnie osiągany czas przechowywania płytek krwi jest jeszcze krótszy i zwykle wynosi 5 dni w temperaturze 22°C. Różnica w stabilności przy przechowywaniu koncentratów płytkowych (platelet concentrates - PC) w porównaniu z RBC (koncentrat krwinek czerwonych) jest spowodowany reakcjami metabolicznymi, zachodzącymi w płytkach, po części dlatego, że w PC obecne są mitochondria, których brak jest w RBC. Jakkolwiek oba produkty krwiopochodne wykazują spadek poziomu ATP wraz ze spadkiem pH po pewnym czasie, jak również wytwarzanie kwasu mlekowego, obecność mitochondriów w PC prawdopodobnie nasila ten proces z uwagi na glikolizę.

Jednocześnie zastanawiano się nad wiarygodnością i integralnością zapasów krwi: wielokrotnie stwierdzano mianowicie zanieczyszczenie zapasów krwi bakteriami lub innymi drobnoustrojami i wirusami. Sytuacja jest jeszcze gorsza w krajach stosujących mniej skomplikowane sposoby pobierania i przechowywania krwi.

W celu zmniejszenia zanieczyszczenia produktów można dodawać różne środki, ich obecność nie jest jednak korzystna, biorąc pod uwagę to, że produkty te przetacza się później biorcom. Jednym z innych korzystnych sposobów jest napromienianie produktów po zamknięciu ich w docelowych opakowaniach, zwykle w elastycznych pojemnikach winylowych. Takie napromienienie ma jednak niekorzystny wpływ na przechowywanie RBC i PC, powodując osłabienie czynności tych komórek.

Oprócz tego niewielka, lecz rosnąca część populacji biorców krwi narażona jest na chorobę o zwykle złym rokowaniu, znaną jako związana z przetoczeniem choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (Transfusion Associated Graft Versus Host Disease - TAGYHD), spowodowaną obecnością żywych allogenicznych krwinek białych. Zespół ten występuje zwykle u pacjentów z immunosupresją w wyniku na przykład choroby nowotworowej lub przeszczepu szpiku kostnego, może również jednak wystąpić u pacjentów immunokompetentnych w ramach restrykcyjnego polimorfizmu miejsca A leukocytów ludzkich (HLA) w populacji. Dużo uwagi poświęcono znalezieniu sposobów zapewnienia stabilności w czasie przechowywania. Jeden z takich sposobów, służący wydłużaniu czasu przechowywania PC, opisano w patencie Stanów Zjednoczonych 5466573.

Przedmiotem tego patentu jest zapewnienie preparatów PC ze źródłami jonów octanowych, które działają zarówno jako substrat fosforylacji oksydatywnej, jak i jako bufor przeciwdziałający spadkowi pH spowodowanemu wytwarzaniem kwasu mlekowego. Sposób ten nie ma bezpośredniego wpływu na problem hemolizy i rozpadu błony komórkowej. Inny sposób opisano w często cytowanym patencie Stanów Zjednoczonych 5496821. W patencie tym krew pełną przechowuje się w preparacie zawierającym L-karnitynę (LC) lub jej pochodne alkanoilowe. Patent ten jednak nie opisuje wpływu na produkty krwiopochodne takie, jak zawiesiny PC lub RBC, i co najmniej w pewnym zakresie zależy od wpływu LC na charakterystykę osocza.

Jak to wspomniano powyżej, zanieczyszczenie zapasów krwi drobnoustrojami lub wirusami jest innym problemem, przed jakim staje społeczność medyczna. Jednym ze sposobów wyjałowienia produktu i poprawy wiarygodności w odniesieniu do zanieczyszczenia jest napromienianie produktu krwiopochodnego. Na ogół korzystne jest zastosowanie promieniowania gamma w ilości około 25 centygrejów (cG) i napromienienie produktu po jego zamknięciu w pojemniku plastykowym, szklanym lub innym. Niestety napromienienie pobudza uszkodzenia błony komórkowej i hemolizę w RBC. NaproPL 192 684 B1 mienienie produktów krwiopochodnych, w tym krwi pełnej, koncentratu krwinek czerwonych i PC, nadal nastręcza problemy.

W związku z tym specjaliści działają w kierunku opracowania sposobu wydłużenia okresu żywotności i czasu półtrwania w krwiobiegu RBC i PC po przetoczeniu powyżej obecnego maksimum. Ponadto celem specjalistów jest znalezienie sposobu wyjaławiania przez napromienienie produktów krwiopochodnych, w tym krwi pełnej, koncentratu krwinek czerwonych i PC, bez znaczniejszych uszkodzeń błony komórkowej i bez hemolizy.

Zgłaszający na drodze szeroko zakrojonych badań stwierdził, że uszkodzenia błon komórkowych RBC i PC w czasie przechowywania, lub wskutek napromienienia, można istotnie opóźnić i zahamować poprzez zawieszenie produktu krwiopochodnego w konwencjonalnym roztworze konserwującym, takim jak AS-3, przy czym roztwór konserwujący zawiera ponadto L-karnitynę lub jej pochodną alkanoilową w stężeniu 0,25-50 mM lub więcej. Osiągnięcie Zgłaszającego polega na stwierdzeniu, że pierwotną przyczyną większości przypadków rozkładu produktów krwiopochodnych, dotychczas wiązanych ze spadkiem poziomu ATP i spadkiem pH, w istocie jest uszkodzenie błony komórkowej i hemoliza. Zachowanie i naprawę błony komórkowej można osiągnąć poprzez reacylację lipidów, dokonywaną częściowo poprzez zastosowanie L-karnityny, ustalono bowiem, w trakcie badań prowadzących do wynalazku, że w RBC i podobnych produktach krwiopochodnych dochodzi do nieodwracalnego wychwytu zwrotnego L-karnityny.

Według wynalazku sposób utrzymania błony komórkowej i supresji hemolizy przy przechowywaniu koncentratu płytek (PC), charakteryzuje się tym, że obejmuje zawieszanie PC w roztworze konserwującym, zawierającym w ilości 0,25 do 50 mM produkt karnitynowy dobrany z grupy, do której należy L-karnityna (LC), alkanoilo-L-karnityna lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole albo ich mieszaniny. Produkt karnitynowy jest obecny korzystnie w ilości 1-20 mM.

Roztwór konserwujący w sposobie według wynalazku dobiera się z grupy obejmującej roztwór: kwas cytrynowy-cytrynian sodowy-dekstroza, cytrynian-fosforan-dekstroza i ich modyfikacje oraz sztuczne osocze.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku koncentrat płytek zawiesza się w roztworze konserwującym, po czym poddaje sterylizacji przez napromieniowanie.

W korzystnym wykonaniu wynalazku alkanoilo L-karnitynę wybiera się z grupy obejmującej acetylo-, propionylo-, butyrylo-, izobutyrylo-, walerylo- i izowalerylo-L-karnitynę.

W innym wykonaniu wynalazku koncentrat płytek w roztworze konserwującym umieszcza się w pojemniku, który po zamknięciu poddaje się sterylizacji przez napromieniowanie.

Krótki opis rysunków

Figura 1. Czas trwania po wlewie RBC przechowywanych 42 dni w stosunku do dawcy - kontrola i przechowywanie z użyciem LC. Strzałki wskazują, odpowiednio, średnią ± SD dla RBC kontrolnych i przechowywanych z użyciem LC. Na górze wykresu przedstawiono również dokładną obliczoną wartość p.

Figura 2. Zawartość karnityny w krwinkach czerwonych w poszczególnych tygodniach przechowywania krwi. Testy na obecność karnityny przeprowadzono w sposób omówiony w rozdziale Materiał i metody. Wartości są średnią z trzech doświadczeń, z których każde wykonano dwukrotnie. Różnice między doświadczeniami nie przekraczały 7%. Symbole otwarte: RBC przechowywane z samym AS-3; symbole zamknięte: RBC przechowywane w AS-3 uzupełnionym LC (5 mM).

Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest L-karnityna i jej pochodne alkanoilowe, jako środek sprzyjający utrzymaniu i naprawie błony komórkowej i supresji hemolizy w produktach krwiopochodnych. Do L-karnityn alkanoilowych należą acetylo-, butyrylo-, izobutyrylo-, walerylo-, izowaleryloi zwłaszcza propionylo-L-karnityna. W niniejszym opisie ta grupa związków określana jest całościowo jako LC, to znaczy L-karnityna. Zamiast L-karnityny można jednak stosować opisane L-karnityny alkanoilowe i ich farmakologicznie dopuszczalne sole.

Dodawanie LC do produktów krwiopochodnych, w tym RBC i PC, wymaga obecności LC w ilości skutecznej dla umożliwienia utrzymania i naprawy błony komórkowej oraz supresji hemolizy.

Przeprowadzone badania, w tym te opisane poniżej, wykazały, że minimalny skuteczny zakres dla produktów pochodzących od większości dawców wynosi około 0,25 mM-0,5 mM. Górna granica jest bardziej praktyczna, niż fizjologiczna. Stężenia aż 50 mM i więcej są dobrze tolerowane. Dopuszczalne są wartości nie powodujące problemów toksykologicznych ani osmologicznych. Korzystny zakres wynosi 1-30 mM. Korzystny jest zakres 1-10 mM lub więcej, przy czym szczególnie korzystne są war4

PL 192 684 B1 tości 4-6 mM. Działanie niniejszego wynalazku, z tym przedłużanie żywotności, mogą w znacznym stopniu zależeć od dawcy. W związku z tym, ogólnie rzecz biorąc, skuteczne stężenie LC wynosi 0,5-50 mM. Specjalista może jednak rozszerzać ten zakres w obu kierunkach, w zależności od właściwości dawcy.

Takie rozszerzenie nie wykracza poza zakres niniejszego wynalazku.

LC wykazuje zgodność z konwencjonalnymi roztworami konserwującymi (stabilizującymi), które typowo wytwarza się tak, aby miały działanie buforujące. Do powszechnie stosowanych roztworów należy ACED (kwas cytrynowy - cytrynian sodowy - dekstroza), CPD (cytrynian-fosforan-dekstroza) i ich modyfikacje, w tym CPD2/A-3, i preparaty pokrewne. Typowo roztwór zawiera węglowodan, taki jak glukoza lub mannit, co najmniej jedną sól fosforanową, cytrynian i inne sole buforujące. LC jest konwencjonalnie rozpuszczalna i można ją dodawać do woli do tych preparatów w korzystnym zakresie.

Korzystne roztwory opisano w patencie Stanów Zjednoczonych 5496821, który włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Można jednak stosować roztwory konserwujące różne od konwencjonalnie stosowanych, w tym sztuczne osocze i inne fizjologicznie dopuszczalne roztwory, pod warunkiem, że zawierają LC według niniejszego wynalazku. LC jest ważnym składnikiem roztworów konserwujących.

Zdolność LC, po dodaniu jej do zawiesiny produktów krwiopochodnych, takich jak RBC i PC, do wydłużenia czasu żywotności, a zatem okresu przechowywania, i okresu utrzymywania się w krążeniu po podaniu ich biorcy, zilustrowano w poniżej opisanych doświadczeniach in vitro i in vivo. W doświadczeniach stosowano LC, można jednak stosować inne L-karnityny alkanoilowe. Szczególnie istotne jest, co udowodniono poniżej, że lepsze wyniki uzyskuje się poprzez poprawę utrzymywania (w tym naprawy) błony komórkowej i supresję hemolizy.

Materiał i metody

Badanie I

Ocena in vivo i in vitro jakości RBC przechowywanych z LC i bez LC

Osoby badane. Populację badaną stanowiły osoby badane obu płci w wieku od 18 do 65 r.ż., u których nie stwierdzano chorób somatycznych ani psychicznych, nie przyjmujące leków, które mogłyby wpływać na żywotność RBC. Do badania włączono osoby spełniające konwencjonalne kryteria dla dawców allogenicznych, wymienione w Kodeksie Rejestru Federalnego, rozdział 2, normy Amerykańskiego Stowarzyszenia Banków Krwi i zalecenia Służby Krwi Amerykańskiego Czerwonego Krzyża. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Kolegium Medycznego w Hampton Roads, a osoby badane wyraziły świadomą zgodę na udział.

Każdy z dawców oddał krew dwukrotnie w odstępie 72 dni, i przy pierwszym pobraniu został zrandomizowany do grupy badanej lub grupy kontrolnej. System przechowywania krwi. Standardowy system CP2D/AS-3 M (Miles, Inc.)

Zastosowano worki plastykowe z poli(chlorku winylowego) (PVC) z dodatkiem dietylo-(n)-heksyloftalanu (DEHP) jako środka zwiększającego plastyczność. Dla każdej jednostki badanej do pojemnika zawierającego roztwór addycyjny AS-3 dodano 245 mg LC (w 1,1 ml czystego, apirogennego roztworu w wyjałowionej butelce szklanej) do końcowego stężenia 5 mM. W przypadku jednostek kontrolnych do roztworu AS-3 dodano w tych samych warunkach 1,1 ml 0,9% NaCl. Dodania LC lub soli fizjologicznej do worków dokonano poprzez wstrzyknięcie, przez złączkę miejsca pobrania, za pomocą strzykawki. Dokonano tego w kołpaku przepływu laminarnego w świetle UV.

Oddanie krwi i jej obróbka.

Standardowym sposobem dokonano nakłucia żyły i aspiracji krwi, pobierając około 450±50 ml krwi pełnej. Krew pełną przechowywano przez 4-8 godzin w temperaturze pokojowej przed obróbką. Jednostkę odwirowano w standardowych warunkach i po odwirowaniu usunięto osocze stanowiące nadsącz, a stanowiący osad koncentrat RBC ponownie zawieszono w standardowym roztworze (kontrola) lub w roztworze AS-3 zawierającym L-karnitynę (próbka badana). Zawieszone jednostki RBC przechowywano w temperaturze 4°C przez 42 dni.

Pomiary in vitro: Pomiary przeprowadzono przed pobraniem próbek (dzień 0) i w 42 dni po pobraniu próbek, i obejmowały one poziom ATP w RBC; hemoglobinę całkowitą i hemoglobinę w nadsączu; hematokryt (Het), RBC, WBC (krwinki białe) i liczbę płytek krwi; osmotyczną kruchość RBC; morfologię RBC; poziom mleczanów i glukozy; poziom potasu w nadsączu. Oznaczenia te wykonano standardowymi sposobami opisanymi uprzednio; Heaton i wsp., Vox Sang 57: 37-42 (1989).

Pomiary in vivo po przetoczeniu: po 42 dniach przechowywania pobrano próbkę i przechowywane komórki wyznakowano Cr, standardowymi sposobami. W tym samym czasie w celu oznaczenia masy RBC, od dawcy pobrano świeżą próbkę, w celu wyznakowania RBC ⁹⁹Tc. Po wyznakowaniu

PL 192 684 B1 zmieszano 15 pCi przechowywanych komórki, wyznakowanych ⁵¹Cr, i 15 pCi świeżych komórek, wyznakowanych ⁹⁹Tc, i podano je jednocześnie. Po wstrzyknięciu w różnych odstępach czasowych, do 35 dnia, pobierano próbki krwi (5 ml) w celu obliczenia 24-godzinnego % odtwarzania i przeżycia. 24-godzinny % odtwarzania określano metodą pojedynczego znacznika, w której dla określenia poziomu czasowego 0 stosowano logarytmiczno-liniową regresję poziomu radioaktywności próbek pobranych po 5, 7,5, 10 i 15 minutach, lub metodą podwójnego znacznika, stosując masę RBC dawcy, określoną

99-.pomiarem 99Tc.

Czas trwania w krążeniu przetoczonych wyznakowanych Cr RBC, które przeżyły, oznaczono poprzez pobieranie próbek po 24 godzinach i następnie dwa razy w tygodniu przez czas do 5 tygodni. Poziom radioaktywności skorygowano dla stałej 1% elucji dziennie. Dane dostosowano do funkcji liniowej z liczbą dni od przetoczenia jako zmienną niezależną (oś x) i skorygowanymi zliczeniami Cr jako zmienną zależną (oś y). Czas trwania RBC przyjęto następnie jako punkt przecięcia dostosowanej linii z osią x.

Analiza statystyczna. Na danych z badania in vivo i in vitro jednostek wykonano parzysty test t lub dokonano rutynowej nieparametrycznej analizy statystycznej, w celu stwierdzenia, że istniały jakiekolwiek statystycznie znamienne różnice (koniec 1) w średnich pomiędzy jednostkami badanymi a jednostkami kontrolnymi. Za różnicę statystycznie znamienną uważano wartość p poniżej 0,05.

Badanie II

Badanie wychwytu zwrotnego LC erytrocytów i reacylacji lipidów z przechowywaniem do 42 dni

Substancje chemiczne. Bydlęcą albuminę surowicy (BSA) wolną od niezbędnych kwasów tłuszczowych nabyto w firmie Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo. (Stany Zjednoczone).

Kwas [1- C] palmitynowy nabyto w New England Nuclear Corporation, Boston, Mass (Stany Zjednoczone). Płytki cienkowarstwowe Whatman LK6 (żel silikonowy) (20x20 cm) z warstwą preabsorpcyjną nabyto w firmie Carlo Erba w Mediolanie (Włochy). Wszystkie inne stosowane związki miały czystość odczynników.

Test karnityny czerwonokrwinkowej. Z przechowywanej jednostki RCC pobrano próbkę krwi i przemyto jeden raz 4 objętościami zimnego 0,9% NaCl. RBC ponownie zawieszono następnie w 0,9% NaCl do uzyskania końcowego hematokrytu 50% i odbiałczono kwasem nadchlorowym, jak to opisano (Cooper i wsp., Biochem. Biophys. Acta 959: 100-105 (1988). Próbki z ostatecznego wyciągu analizowano pod kątem zawartości wolnej LC testem radiochemicznym Pace i wsp., Clin. Chem. 24: 32-35 (1978).

Wyniki

Badanie I

Charakterystyka jednostek RCC AS-3 przed przechowywaniem

Właściwości produktów RCC AS-3 po obróbce jednostek krwi pełnej były takie, jak oczekiwano. Nie stwierdzano statystycznie znamiennych różnic między jednostkami badanymi a kontrolnymi w zakresie charakterystyki jednostki RBC AS-3 pod względem objętości jednostki, Hct i zawartości WBC oraz cech RBC in vitro, takich jak poziom ATP, poziom hemoglobiny i potasu w nadsączu i kruchość osmotyczna (tabela 1).

Charakterystyka jednostek RBC po 42 dniach przechowywania

Właściwości metaboliczne. Ilość zużytej glukozy i mleczanu wytworzonego przez 42 dni były podobne dla jednostek badanych i kontrolnych (tabela 2). Jak tego oczekiwano, stwierdzono wysoką odwrotną korelację między tymi dwoma parametrami glikolizy (r=0,76). Jednakże dla jednostek RBC przechowywanych z karnityną stwierdzano mniejszą hemolizę i wyższy poziom ATP w porównaniu z kontrolą. Jak to przedstawiono na fig. 1, ten wyższy poziom ATP stwierdzano we wszystkich parach z wyjątkiem jednej (p<0,01).

Błona. Na końcu okresu przechowywania odsetkowa hemoliza była mniejsza w jednostkach z L-karnityną, jak to ukazano na fig. 2. Z drugiej strony nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w odniesieniu do poziomu potasu w nadsączu, wstrząsowej reakcji osmotycznej i wyników morfologicznych, które pozostawały w oczekiwanym przedziale na końcu 42-dniowego okresu przechowywania.

Żywotność poprzetoczeniowa. Średnie 24-godzinne % odtwarzanie dla jednostek kontrolnych było podobne do stwierdzanego uprzednio. Jednakże średnie % odtwarzanie dla krwinek czerwonych przechowywanych z karnityną było większe, niż dla komórek przechowywanych w warunkach kontrolnych (p<0,05).

PL 192 684 B1

Ponadto wyższy był również średni czas trwania w krwiobiegu przetoczonych przechowywanych krwinek czerwonych w przypadku komórek przechowywanych z karnityną (fig. 1). Masa RBC dawców, oznaczana dwukrotnie, była wysoce podobna (r=0,98) i nie różniła się w sposób znamienny statystycznie.

Badania korelacji. Jak tego oczekiwano, 24-godzinne % odtwarzanie wykazywało znamienną korelację z poziomem ATP (r=0,63) i wynikami innych pomiarów integralności błony RBC, takich jak hemoliza (r=0,57), kruchość osmotyczna (r=0,71) i morfologia (r=0,59). Odsetkowa hemoliza korelowała znacznie z poziomem ATP (r=0,83), jak również z zawartością WBC w jednostkach RBC (r=0,83). Czas trwania RBC w krwiobiegu nie wykazywał znamiennych korelacji z żadnym z parametrów in vitro.

Badanie II

Wychwyt zwrotny karnityny w przechowywanych RBC

RBC przechowywane w samym AS-3 nie wykazywały znamiennej utraty zawartości LC w czasie przechowywania (fig. 2). Pozostaje to w zgodności z wynikami Cooper i wsp., jak wyżej, którzy stwierdzili, że LC ludzkich krwinek czerwonych nie podlega wolnej wymianie ani z osoczem, ani z buforem izoosmotycznym. Przy przechowywaniu krwinek czerwonych w AS-3 uzupełnionym LC wykrywano większą ilość wewnątrzkomórkowego LC, niż w przypadku samego AS-3 (fig. 2). Zawartość LC rosła liniowo w czasie przechowywania, osiągając czterokrotność po 42 dniach.

Omówienie

Badanie in vitro i in vivo jednostek RBC po 42 dniach przechowywania wykazało znamienne różnice między RBC przechowywanymi z karnityną a RBC przechowywanymi w warunkach kontrolnych. Rozmaite właściwości in vitro RBC, odzwierciedlające integralność metabolizmu i błony komórkowej, takie jak ATP i % hemolizy, jak również bezpośredni pomiar żywotności komórek (24-godzinny % odtwarzania i czas trwania w krwiobiegu) były znamiennie lepsze dla komórek przechowywanych z karnityną. Wydłużenie średniego czasu przeżycia RBC krążących w 24 godziny po przetoczeniu jest interesujące. Odkrycie to może być związane z nieodwracalnym wychwytem zwrotnym LC w czasie przechowywania, co jest odkryciem nieoczekiwanym i dotąd nie opisywanym. Wartości uzyskane w badaniach kontrolnych dla różnych właściwości RBC były takie, jak oczekiwano, i nie różniły się od stwierdzanych w uprzednich badaniach.

W czasie pobierania krwi nie stwierdzano istotnych różnic w charakterystyce RBC lub jednostek badanych w porównaniu z kontrolnymi. Jak to ukazano na fig. 1-3, poziom ATP w RBC, % hemolizy i czas trwania w krążeniu wyraźnie zależały od dawki, a ponieważ badanie było randomizowane i prowadzone z pięcioma próbkami badanymi i pięcioma kontrolnymi, badanymi za pierwszym i za drugim razem, mało prawdopodobne jest, aby obserwowane różnice zależały od przypadku lub nieprawidłowego planu badania. Oczywiste jest zatem, że różnice obserwowane w niniejszym badaniu spowodowane były dodaniem L-karnityny do jednostek badanych. Nie można wykluczyć, że wydłużenie czasu trwania jest odzwierciedleniem zmniejszenia elucji Cr, nie jest to jednak zgodne z poprawą pomiarów in vitro przechowywanych krwinek czerwonych, co do których stwierdzono, że korelują z żywotnością in vivo.

W kilku badaniach stwierdzono, że L-karnityna i jej estry acylowe mają wpływ cytoprotekcyjny i stabilizujący błony w odniesieniu do różnych komórek, w tym krwinek czerwonych. Zob. np. Snyder i wsp., Arch. Biochem. Biophys. 276: 132-138 (1990). W badaniu tym stwierdzono, że L-karnityna była nieodwracalnie wychwytywana zwrotnie przez RBC w czasie przechowywania. Mimo że natura tego procesu nie jest całkiem jasna, wykluczalibyśmy udział swoistego nośnika wychwytu zwrotnego L-karnityny. Według naszej wiedzy, jedyny znany nośnik L-karnityny działa w układach komórkowych, w których stężenie wewnątrzkomórkowej L-karnityny jest kilkakrotnie większe, niż stwierdzane w zwykłych warunkach w środowisku zewnątrzkomórkowym. Stężenie L-karnityny w krwinkach czerwonych jest podobne do stężenia w osoczu. Tak więc niezależnie od niskiej temperatury, spadku ATP i innych możliwych zmian metabolicznych, zmiany zachodzące w czasie przechowywania, gdy krwinki czerwone przechowuje się w medium zawierającym względnie dużą ilość egzogennej L-karnityny, zachodzi, jak się wydaje, bezkierunkowy wychwyt zwrotny L-karnityny przez komórki. Nie można było tego przewidzieć na podstawie stanu techniki.

Działanie L-karnityny na przechowywane RBC można uważać za wpływ biofizyczny i/lub metaboliczny na kompartment błonowy. Przeżycie krwinek czerwonych po przetoczeniu związane jest z integralnością czynności błony, na co wskazuje znamienna korelacja między żywotnością in vivo przetoczonych krwinek czerwonych i pomiary stosunku powierzchni do objętości. Głównym czynniPL 192 684 B1 kiem struktury błonowej i czynności RBC jest siateczka cytoszkieletu - Marchesi, Ann. Rev. Cell Biol. 1: 531-536 (1985 nadcząsteczkowa organizacja białek leżących poniżej wewnętrznej części błony RBC. Wolfe i wsp. w badaniu nad strukturą i czynnością białka błony cytoszkieletu przechowywanych krwinek czerwonych stwierdzili, że jedyną istotna zmianę stanowiło zmniejszenie zdolności spektryny do łączenia się z aktyną w obecności lub w nieobecności białka 4.1. Wolfe i wsp., J. Clin. Invest. 78: 1681-1686 (1986).

Wykazaliśmy, że L-karnityna wpływa na odkształcalność błony RBC zawierających białko 4.1. ponownie zamkniętych cieni komórkowych, poddanych zwiększonemu naprężeniu ścinającemu. Arduini i wsp., Life Sci. 47: 2395-2400 (1990). Tak więc L-karnityna może wywierać działanie stabilizujące na błonę poprzez interakcję spektryny z jednym lub więcej składnikiem cytoszkieletu. Niedawno przeprowadzone przez Butterfield i Rangachari (Life Sci. 52: 297-303) badanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego nad interakcją spektryna-aktyna w krwince czerwonej wykazało, że L-karnityna znamiennie zmniejszała ruchy segmentalne wyznakowanych spinowo miejsc na spektrynie.

Oprócz opisanego powyżej potencjalnego działania biofizycznego, poprawa obserwowana w krwinkach czerwonych przechowywanych z LC może być wynikiem korzystnego procesu metabolicznego. W zwykłych warunkach cykl dezacylacji-reacylacji fosfolipidów błonowych wymaga ATP lub wytwarzania acylo-CoA. Część acylowa acylo-CoA jest następnie przenoszona do lizofosfolipidów przez acylo-CoA transferazę lizofosfolipidową. Oprócz tego w czasie stresu oksydacyjnego proces naprawy fosfolipidów błony RBC przebiega tym samym szlakiem metabolicznym.

Ostatnie badania wykazały, że CPT wpływa na proces reacylacji fosfolipidów błony krwinek czerwonych i komórek nerwowych poprzez modulowanie wielkości puli acylo-CoA między etapem aktywacyjnym kwasów tłuszczowych a jego przeniesieniem do lizofosfolipidów. Arduini i wsp., J. Biol. Chem. 267: 12673-12681 (1992). Ponadto badania nad wykrywaniem impulsów i spadkiem ATP wykazały, że pula acylokarnityny krwinek czerwonych stanowi rezerwuar aktywowanych grup acylowych, nie obciążający ATP. Arduini i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 353-358 (1994).

Większy 24-godzinny % odtwarzania i wydłużenie czasu trwania w krwiobiegu odpowiada poprawie o około 15% w odniesieniu do potencji (ilość krążących przetoczonych RBC dostępnych dla biorcy razy średni czas trwania). Ten wzrost potencji odpowiada klinicznie zmniejszeniu liczby przetoczeń niezbędnych u pacjentów wymagających przewlekłych przetoczeń, na przykład chorych na talasemię lub chorych z niewydolnością szpiku kostnego. Zamiast tego można wydłużyć czas przechowywania płynnych przechowywanych RBC.

Nasze wyniki wskazują, że obecność L-karnityny w medium konserwującym w czasie przechowywania RBC może mieć działanie oszczędzające pulę ATP zużywaną do reacylacji fosfolipidów w trakcie naprawy błony komórkowej. Korzystny proces metaboliczny, związany z możliwym korzystnym działaniem biofizycznym, może zatem tłumaczyć zmniejszenie hemolizy, wyższy poziom ATP i ulepszone odtwarzanie in vivo i przeżywalność krwinek czerwonych przechowywanych w LC.

Napromienienie

Problem zanieczyszczenia produktów krwiopochodnych, w tym krwi pełnej, RBC, PC i produktów podobnych, bakteriami lub innymi drobnoustrojami i wirusami, można znacznie zmniejszyć przez zastosowanie napromienienia. Prowadzono szeroko zakrojone badania poziomu napromienienia niezbędnego do wyjałowienia i zabicie w zasadzie 100% wyżej wymienionych organizmów, stanowiących zanieczyszczenie tych produktów.

Oprócz tego, co ważniejsze, takie napromienienie może niszczyć krwinki białe. Można stosować napromienienie różnego typu, w tym napromienienie promieniami gamma (Cobalt GG, akceleracja Van de Graf), promieniowaniem UV, promieniowaniem światła czerwonego itd. Wystarczający jest ścisły równoważnik około 20-50 cG promieniowania gamma.

Na całym świecie co roku pobiera się od 60 do 80 milionów jednostek krwi, którą następnie stosuje się do przetoczeń w różnych populacjach pacjentów. W krajach słabo rozwiniętych współczynnik pobrań na 1000 populacji jest niższy, a większości przetoczeń dokonuje się w położnictwie i pediatrii, zwłaszcza w przypadkach niedokrwistości spowodowanej zimnicą. W krajach wysoko rozwiniętych współczynnik pobrań na 1000 populacji jest 50-10 razy wyższy, a większości przetoczeń dokonuje się w chirurgii (50%) i w leczeniu chorych z niedokrwistością w przebiegu choroby nowotworowej, przy przeszczepach szpiku kostnego i w przypadkach krwawień z przewodu pokarmowego, nie związanych z chorobą nowotworową (fig. 1). Z przetoczeniem krwi allogenicznej wiąże się wiele potencjalnych objawów niepożądanych. Szczególnym powikłaniem, stanowiącym niepożądany objaw przetoczenia krwi, jest rzadka i zwykle śmiertelna jednostka chorobowa, znana jako związana z przetoczeniem

PL 192 684 B1 choroba „przeszczep przeciwko gospodarzowi (TA-GVHD); w powikłaniu tym rolę odgrywają żywe immunocyty allogeniczne. TA-GVHD jest rzadkim powikłaniem przetoczenia krwi, które potencjalnie może wystąpić w dwóch grupach populacji pacjentów otrzymujących przetoczenia krwi. Śmiertelność TA-GVHD wynosi niemal 100%; jedynym skutecznym postępowaniem jest zapobieganie. Pierwszą z tych grup stanowią pacjenci z zaburzeniami odporności, na przykład po przeszczepie szpiku kostnego lub innego narządu, chorzy z chorobą Hodgkina lub dziedzicznymi niedoborami odpornościowymi. Drugą grupę stanowią pacjenci bez zaburzeń odporności, wtedy, gdy istnieje podobieństwo HLA między dawcą a biorcą krwi. Dochodzi do tego najczęściej w przypadku oddawania krwi dla bliskich krewnych lub w populacjach z bardziej ograniczonym polimorfizmem HLA, na przykład w Japonii i Izraelu.

Z tego względu powszechną praktyką jest napromienianie komórkowych produktów krwiopochodnych promieniowaniem gamma do plateau dawki około 25 centygrejów 9cG) w celu zniszczenia zdolności żywych immunocytów do namnażania. Należy zauważyć, że TA-GVDH występuje w przypadku produktów komórkowych świeżych, to znaczy w czasie krótszym od 15 dni. Jednakże poddawanie krwi „procesowi starzenia” nie jest na razie przyjętym sposobem zapobiegania temu powikłaniu. Mimo że immunocyty są częścią populacji allogenicznych leukocytów, stopień oddzielania leukocytów osiągany obecnie przy użyciu filtrów trzeciej generacji uważa się za niedostateczny w celu zapobieżenia temu powikłaniu. Tak więc jak do tej pory napromienienie promieniami gamma pozostaje jedynym przyjętym sposobem zapobiegania.

Problemem związanym z napromienianiem krwinek czerwonych promieniami gamma jest zwłaszcza możliwość uszkodzenia błony komórkowej. Oczywiste jest, że napromienienie taką dawką powoduje utratę potencji o około 7-8% w odniesieniu do stwierdzanego in vitro zmniejszenia poziomu ATP w krwinkach czerwonych, zwiększenia hemolizy i zwiększenia poziomu potasu w nadsączu. Zmiany te odpowiadają działaniu uszkadzającemu błonę. Tym zmianom in vitro towarzyszy zmniejszenie odtwarzania w czasie 24 godzin napromienionych promieniami gamma krwinek czerwonych. Opisywano również zmniejszenie żywotności płytek krwi.

Istnieje wiele dowodów na to, że promieniowanie gamma wywiera swój wpływ poprzez tworzenie aktywowanych odmian tlenu, takich jak singlety tlenowe, anion hydroksylowy, rodniki i anion nadtlenkowy. Odmiany te powodują wewnątrzkomórkowe uszkodzenie DNA, co uniemożliwia namnażanie się komórek, które jest warunkiem niezbędnym do wystąpienia TA-GVHD. Te same odmiany tlenu mogą utleniać lipidy błonowe krwinki czerwonej i być może błony płytki krwi, powodując uszkodzenie błony, zmniejszające jakość (potencję) produktu komórkowego.

Wiadomo, że L-karnityna odgrywa kluczową rolę w transporcie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez błonę mitochondrialną. Zaburzenia dziedziczne, w których istnieje niewydolność układu karnitynowego w zakresie transportu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, powodują znaczne upośledzenie czynności mięśni poprzecznie prążkowanych. Od niedawna dużo uwagi poświęca się roli L-karnityny w błonie krwinek czerwonych. Zadziwiające było jednak to, że krwinki czerwone nie posiadają mitochondriów, dziwna jest zatem obecność w nich karnityny i transferazy karnityno-palmitoilowej - enzymu biorącego udział w odwracalnej acylacji L-karnityny. Nie było po pierwsze jasne, jaką rolę mogłaby ona odgrywać w krwince czerwonej. Krwinka czerwona może być poddana stresowi oksydacyjnemu w czasie swego długiego cyklu życia in vitro, a naprawa utlenionych lipidów błony komórkowej z udziałem L-karnityny może mieć istotne znaczenie dla prawidłowego przeżycia krwinek czerwonych.

Wczesne zwiększenie ilości acylowanej karnityny w czasie zwiększonej dostępności ATP może działać jako rezerwuar aktywowanych kwasów tłuszczowych, które mogą być następnie stosowane w mechanizmie naprawy uszkodzonych utlenionych lipidów błonowych. Takie wyjaśnienie dobrze tłumaczy zmniejszenie hemolizy, obserwowane w czasie przechowywania in vitro krwinek czerwonych sposobem opisanym powyżej, ponadto tłumaczy poprawę odtwarzania i przeżycia in vivo. Efektem netto dodania L-karnityny jest około 17% wzrost potencji.

Tak więc L-karnityna lub wyżej wymienione L-karnityny alkanoilowe można stosować w celu zmniejszenia lub zapobieżenia uszkodzeniom błony komórkowej, wywołanym napromienieniem. Doszłoby do tego poprzez zdolność karnityny, magazynowanej w krwinkach czerwonych, do naprawy utlenionych lipidów in vitro.

W celu zmniejszenia podatności produktów krwiopochodnych (RCC, PC i tym podobnych) na uszkodzenia błony i hemolizę, produkty krwiopochodne można najpierw zawieszać w roztworze zawierającym L-karnitynę lub jedną z wyżej wymienionych L-karnityn alkanoilowych w ilości 0,25 mM-50 mM. Osiąga się utrzymanie błony komórkowej i supresję hemolizy w stopniu dostatecznym dla napromiePL 192 684 B1 nienia zamkniętego produktu w celu jego wyjałowienia; w wyniku tego uzyskuje się wydłużenie czasu przechowywania i półtrwania w krążeniu po przetoczeniu. Można osiągać żywotność rzędu obecnie osiąganej żywotności przy użyciu materiałów, których jałowość jest pełniejsza, i mało prawdopodobne jest powodowanie przez nie TA-GVHD, ze względu na napromienienie po zamknięciu zawiesiny produktu krwiopochodnego. Należy podkreślić, że termin „produkt krwiopochodny w tym kontekście należy interpretować szeroko: obejmuje on krew pełną, osocze krwi, RCC, PC ich mieszaniny i tym podobne.

W celu potwierdzenia, że dodanie L-karnityny do preparatów krwinek czerwonych, przeznaczonych do napromienienia promieniami gamma w celu wyjałowienia ich lub zniszczenia znajdujących się w nich immunocytów, i następnie do przechowywania, poprawia przeżycie krwinek czerwonych, przeprowadzono poniższe badania.

Materiał i metody

System przechowywania krwi. Zastosowano standardowe poczwórne worki do przechowywania krwi systemu CP2D/AS-1 (Baxter, Inc.). Dla każdej jednostki badanej do worka zawierającego roztwór addycyjny AS-1 dodano 245 mg soli wewnętrznej L-karnityny (LC) rozpuszczonej w 1,1 ml czystego, apirogennego roztworu soli fizjologicznej, do uzyskania końcowego stężenia 5 mM. Dla jednostek kontrolnych do roztworu AS-1 dodano w tych samych warunkach 1,1 ml roztworu soli fizjologicznej.

Oddanie krwi i jej obróbka. Standardowym sposobem dokonano nakłucia żyły i aspiracji krwi, pobierając około 450 ± 50 ml krwi pełnej. Jednostkę krwi pełnej przechowywano przez 4-8 godzin w temperaturze pokojowej przed obróbką. Jednostkę odwirowano w standardowych warunkach (zob. Heaton W.A. i wsp., Vox sanguinis, 1989, 57: 37-42) i po odwirowaniu usunięto osocze stanowiące nadsącz, a stanowiący osad koncentrat krwinek czerwonych (RBC) ponownie zawieszono w standardowym roztworze

AS-1 (kontrola) lub w roztworze AS-1 zawierającym L-karnitynę (próbka badana).

Warunki przechowywania i napromienienie gamma jednostek RBC. Zawieszone jednostki RBC (kontrolne i badane) przechowywano w temperaturze 1-6°C przez 14 dni, po czym napromieniowano promieniami gamma do dawki 25 cG. Następnie jednostki RBC) przechowywano w temperaturze 1-6°C do 42 dni.

Pomiary in vitro. Pomiary przeprowadzono przed pobraniem próbek (dzień 0) i w 42 dni po pobraniu próbek, i obejmowały one poziom hemoglobiny w nadsączu; i średnią objętość krwinki (MCV). Pomiary te wykonano standardowymi sposobami, jak to opisali Heaton i wsp., jak wyżej.

Analiza statystyczna. Wielkość próbki oparto na uprzednich danych odnośnie wahań poziomu hemoglobiny w nadsączu. Tak więc pobrano w sumie 94 jednostki RBC, po 47 w każdej grupie (kontrolnej i badanej). Analiza dystrybucji danych dla hemoglobiny w osoczu wykazała znamienny skos (>2) i kurtozę (8-0). Dane analizowano więc z użyciem testów nieparametrycznych pod kątem mediany z zastosowaniem oprogramowania komputerowego (Epistat, Richardson, TX).

Wyniki

Po obróbce jednostek krwi pełnej właściwości jednostek RBC przed przechowywaniem były takie, jak oczekiwano. Nie obserwowano znamiennych różnic między kontrolnymi jednostkami RBC a jednostkami zawierającymi LC w zakresie zawartości hemoglobiny w nadsączu i MCH (tabela A). Na zakończenie okresu przechowywania (42 dni), RBC napromieniowane promieniami gamma wykazywały statystycznie znamienne różnice pomiędzy jednostkami kontrolnymi a jednostkami zawierającymi LC (zob. wartości p w tabeli A). W szczególności w próbkach badanych obserwowano mniejszą hemolizę w porównaniu z kontrolnymi jednostkami RBC. Wartość MCV jednostki RBC zawierającej LC była niższa, niż jednostki kontrolnej.

Powyższe badanie dowodzi, że można zapobiec uszkodzeniom związanym z napromieniowaniem gamma produktów czerwonokrwinkowych i późniejszym ich przechowywaniem poprzez dodanie do produktów czerwonokrwinkowych L-karnityny.

PL 192 684 B1

T a b e l a A

	Dzień 0	Dzień 42
	Kontrola	L-karnityna	P	Kontrola	L-karnityna	P
MCV (fl)	91,2	90,7	0,46	100,2	97,5	0,006
Hb osocza (mg/dl)	11,8	11,5	0,58	495	382	0,05

Niniejszy wynalazek opisano terminami ogólnymi, jak również w odniesieniu do szczegółowych przykładów. Specjalista może dokonać zmian w wynalazku bez wychodzenia poza jego zakres. W szczególności można dokonywać modyfikacji preparatów stabilizujących, produktów krwiopochodnych, środków konserwujących, inhibitorów i tym podobnych bez wychodzenia poza zakres wynalazku. Ponadto konkretne wartości poziomu, okresu żywotności i czasu półtrwania w krwiobiegu będą różne u różnych dawców i u różnych biorców.

T a b e l a 1

Charakterystyka RBC przed przechowywaniem - koncentraty krwinek czerwonych

	Kontrola	Próbka badana (L-karnityna)
Jedn. obj. (ml)	305±38	295±41
Uni:He: (Jo)	60±3	60±3
J^edn. WBC ⁽x 10⁹⁾	2,6±1,1	2,4±1,1
ATP (gmol/g Hb)	4,6±0,2	4,3±0,4
Nadsącz Hb (mg/dl)	34±15	26±8
^Nads^ącz ^K+ (mE^q/l)	23±0,2	2,2±0,3
Kruchość osmotyczna (%)	50±4	49±4

T a b e l a 2

Charakterystyka RBC po przechowywaniu (42 dni) - koncentraty krwinek czerwonych

	Kontrola	Próbka badana (L-karnityna)
Parametry in vitro
Glukoza (mg/dl)	208±33	193±40
Mleczan (mg/dl)	201±27	199±37
PH	6,33±0,03	6,32±0,04
ATP (gmol/g Hb)	3,01±0,42	3,24±0,38*
Hemoliza (%)	0,47±0,41	0,30±0,22
^Nadsącz ^K+ (m^Eq/l)	61±4	60±3
Kruchość osmotyczna (%)	51±3	50±4
Wynik morfologiczny	69±8	68±15
Parametry in vivo
24h% odtwarzanie (znacznik pojedynczy)	81,1±6,2	84,0±4,4
24h% odtwarzanie (znacznik podwójny)	80,1±6,0	83,9±5,0
Masa RBC (ml)	1634±510	1591±534
Czas przeżycia (dni)	85,9±14,3	96,1±11,2*

'(P<0,05)

Claims

1. Sposóbutrzymamabłonykomórkoweji supresji hemolizyprzy przechowywamukoncentratu płytek (PC), znamienny tym, żc nbsjmpjs emwicuemyic PC w rsetwsrec Osyucrwpjąemm, eswicrsjąeym w ilsśei 0,25 ds 50 mM produkt kmrcityyswy dsbrmcy e grupy, ds ktbrcj cmlcży L-kmryitycm (LC), mlkmysils-L-kmryityym lub ieO fmrmmkslsgieeyic dsppueeemlyc uslc mlbs ieO micuemyiyy.

2. Ppsubb wcdług emutre. 1, znamienny tym, żc prsdukt kmryityyswy jcut sbceyy w ilsśei 1-20 mM.

3. SponóbweSłup zestrz.1 albb2, zzamieeny tym, żż nontwerkonyósrwjąchd dniesasięz ggjp py sbcjmująecj rsetwbr: kwsu eytryyswy-eytryyisy usdswy-dckutrses, eytryyisy-fsufsrsy-dckutrses i ieO msdyfiksejc srse uetpeeyc suseec.

4. βρ^ίό weSłup zes^Ze 1, zzamieeny tym, żż koncestrat płytec zewiesóe się w rontwerze ksyucrwująeym, ps eeym psddsjc utcrylieseji prece ysprsmicyiswsyic.

5. Sposób wedłup zas^z. 1, znamienny tt^ym, że stosuje się alkanoilo-L-karnityyę tw^braną e grupy sbcjmpjąecj sectyls-, prspisyyls-, butyryls-, iesbutyryls-, wslcryls- i ieswslcryls-L-ksryityyę.

6. SponóbweSłupz estrz.1 albb 3,albb 4,albb5, zzamieenytym. ż ż koncestratpłyteS 0^0^ twsrec ksyucrwująhym umicueees uię w psjcmyiku, który ps esmkyięeiu psddsjc uię utcrylieseji prece ysprsmicyiswsyic.