PL193190B1 - Sposób wytwarzania paklitakselu i związki pośrednie - Google Patents

Abstract

Sposob wytwarzania padlikselu o wzorze 1 znamienny tym, ze amid o wzorze 2 gdzie R oznacza wodór lub metyl, a R1 oznacza niższy alkil. Korzystnie o 1-3 atomach węgla, poddaje się cyklizacji w obojętnym rozpuszczalniku organicznym przy pomocy dwumetylowego acetalu aktywowanego benzaldehydu o wzorze 2a, w którym R2 i R3 oznaczają niezależnie atom wodoru lub grupę alkoksylową o 1-3 atomach węgla, w warunkach kwaśnej katalizy, z jednoczesnym usuwaniem metanol

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowa, pół-syntetyczna metoda wytwarzania leku przeciwnowotworowego paklitakselu o wzorze 1.

W metodzie tej stosuje się unikalny sposób wytwarzania nienasyconych pochodnych aktywowanych oksazoli, które następnie hydrolizuje się do pochodnych, z których po procesie utlenienia i przegrupowania wytwarza się między innymi paklitaksel. Metoda według wynalazku może potencjalnie być pożyteczna do syntezy różnorodnych nowych pochodnych taksanowych.

Dotychczasowy stan techniki

Różne półsyntezy pochodnych taksanowych z 10-deacetylobakatinu III prowadzone są już od kilku lat. Pierwsza synteza opublikowana przez Greene'a (J. N. Denis, A.E. Greene, D. Guenard, F.Gueritte-Vogelein, L. Mangantal, P. Potier, J.Am.Chem.Soc., 1988, 110 5917 - 5919) była mało wydajna, używano dużego nadmiaru kosztownego łańcucha bocznego, oraz zaobserwowano epimeryzację na węglu 2' łańcucha bocznego. Holton et al. (R.A. Holton, EP-A 400971, 1990) opublikowali bardziej wydajną syntezę używając szeregu pochodnych cyklicznych amidów. Rhone-Poulenc Rorer przedstawił wydajną syntezę taksotere i paklitakselu z użyciem specjalnych pochodnych cyklicznych acetali (A. Commercon, D. Bezard, F. Bernard, J.D. Bourzat, Tetrahedron Lett. 1992, 33, 5185). Także Bristol-Mayers zademonstrował wydajną syntezę paklitakselu przy użyciu pochodnych oksazolinowych (J.K. Trottathil, J.D. Trifunovich, EP-A 0735036 A1 1996. (Bristol Myers Squibb). Opublikowanych zostało jeszcze kilka innych syntez jednak nie mają one większego znaczenia praktycznego. Chociaż, niektóre z tych syntez są dość wydajnymi, jednakowoż nie pozwalają one na wyprodukowanie innych pochodnych taksanowych lub nowa pochodna musi być wytwarzana od razu na początku syntezy. Znana jest także metoda opublikowana przez Kingstona et al. (D.G.l. Kingston, A.A. Molinero, A.A.L. Gunatilaka U.S.P. 5,470,866 Nov. 28 1995) posiadająca wydajną syntezę związków pośrednich, ale warunki ostatniego etapu syntezy tam podane są nieefektywne.

Dlatego też poszukiwano metody, która dałaby możliwość syntezy różnorodnych pochodnych taksanowych ze wspólnego związku pośredniego.

W pracach własnych, zmodyfikowano znacznie znane dotychczas metody syntezy w celu uzyskania pożądanego rezultatu.

Nieoczekiwanie, okazało się, że metodą według wynalazku wytwarza się unikalną pochodną fenyloizoseryny, która po przereagowaniu z odpowiednio zablokowana pochodną bakatyny III tworzy taksanowy substrat, który może być przekształcony w paklitaksel lub inne potencjalnie użyteczne pochodne taksanowe.

PL 193 190 B1

Sposób według wynalazku polega na tym, że amid o wzorze 2

gdzie R oznacza wodór lub metyl, a R1 oznacza niższy alkil, korzystnie o 1 - 3 atomach węgla, poddaje się cyklizacji w obojętnym rozpuszczalniku organicznym przy pomocy dwumetylowego acetalu aktywowanego benzaldehydu o wzorze 2a, w którym R2 i R3 oznaczają niezależnie atom wodoru lub grupę alkoksylową o 1 - 3 atomach węgla w warunkach kwaśnej katalizy, z jednoczesnym usuwaniem metanolu, wytwarzając pochodną oksazolową o wzorze 3, gdzie R, R1, R2 i R3 mają wyżej podane znaczenie, który hydrolizuje się przy pomocy zasady i zakwasza w celu wytworzenia kwasu karboksylowego o wzorze 4, w którym R, R2 i R3 mają wyżej podane znaczenie, po czym łączy się związek 4 ze związkiem 5 przez zastosowanie dicykloheksylodikarbodiimidu (DCC) z DMAP uzyskując związek 6, w którym R, R2 i R3 mają wyżej podane znaczenie, następnie usuwa się grupy zabezpieczające uzyskując związek o wzorze 7, gdzie R ma wyżej podane znaczenie, który benzoiluje się w pozycji 2', jedną ze znanych metod, korzystnie z zastosowaniem mieszaniny chlorek benzoilu, trójetyloamina, wodorowęglan sodu w chlorku metylenu, do wytworzenia amidowej olefiny o wzorze 8, z której na drodze oksydatywnego rozszczepienia przy pomocy ozonu wytwarza się związek 9, który przekształca się do związku 1 poprzez uwolnienie grupy aminowej z amidu w reakcji z ortofenylenodiaminąw obecności kwasu i migrację grupy benzoilowej z pozycji 2' na uwolnioną grupę aminową na pozycji 3'.

W sposobie według wynalazku stosuje się a,b-nienasycony amid 2R,3S-fenyloizoseryny o wzorze 2, gdzie R oznacza wodór lub metyl, otrzymany poprzez estryfikację chlorowodorku 2R,3S-fenyloizoseryny alkoholem (R1) w obecności chlorku tionylu. Otrzymany ester reaguje się z chlorkiem kwasu a-alkilo- lub -cynamonowego w środowisku zasadowym lub obojętnym wytwarzając związek 2, który jest substancją krystaliczną.

W sposobie według wynalazku w reakcji cyklizacji, korzystnie stosuje się toluen. Jako aktywowany benzaldehyd stosuje się benzaldehyd zawierający przynajmniej jedną grupę O-alkilową.

Taki aktywowany benzaldehyd zwiększa gęstość elektronów w pierścieniu aromatycznym, co jest konieczne dla procesu hydrolizy w późniejszym etapie syntezy. Grupa aktywująca benzaldehyd musi zapewnić w procesie hydrolizy estru, wytworzenie trwałego kwasu z całego łańcucha bocznego, który przyłącza się do alkoholu taksanowego. Stwierdzono, że benzaldehydy zawierające grupy alkiloeterowe w pozycji 4 są korzystne, a najkorzystniejsze są benzaldehydy zawierające dwie grupy alkiloeterowe. Grupa metoksylowa jest preferowana, a 3,4-dimetoksybenzaldehyd okazał się najkorzystniejszym aktywnym benzaldehydem.

Warunki hydrolizy jak i zakwaszania muszą być tak dobrane aby nie spowodować epimeryzacji pozycji 2' w części fenyloizoseryny, ani rozpadu delikatnego oksazolowego produktu pośredniego. Do tego celu korzystne są wodorotlenki metali. Preferowany jest wodorotlenek litu a korzystnymi rozpuszczalnikami są alkohole i THF. Zakwaszenia można dokonać używając różnorodnych kwasów, jednak korzystnymi przy zakwaszeniu do pH ok. 2 są kwas solny lub kwas cytrynowy.

PL 193 190 B1

10-Deacetylobakatinę III otrzymuje się z igieł cisa europejskiego Taxus baccata jako odnawialnego źródła. Pozycję 7 tego związku zabezpiecza się jako trójetylosililowy eter. Grupę trójetylosililową przyłącza się różnymi metodami, korzystnie takimi jak pirydyna/TESCI lub DMF/imidazol/TESCI. 7-Trójetylosililo-10-deacetylobaccatin III (7-TES-10-DAB) następnie przekształca się w 7-TES-baccatin (wzór 5) przez acetylowanie grupy hydroksylowej w pozycji 10. Acetylowania korzystnie dokonuje się w roztworze pirydynowym przy pomocy chlorku acetylu, lub przez deprotonowanie alkilolitem i acetylowanie bezwodnikiem octowym. Związek 5 w tak otrzymanej odpowiedniej formie łączy się z pochodną kwasową o wzorze 4.

Połączenie związków 4 i 5 z wytworzeniem związku 6 osiąga się przez zastosowanie dicykloheksylodikarbodiimidu (DCC) z DMAP. Korzystnymi rozpuszczalnikami są toluen i octan etylu lub rozpuszczalniki aprotonowe. Korzystne temperatury tej reakcji wynoszą od 0° do temperatury wrzenia rozpuszczalnika, jednakże najkorzystniejsza jest temperatura 25°C. Związek 6 wyizolowuje się przy pomocy ekstrakcji. W następnym etapie usuwa się dwie grupy zabezpieczające. Grupę trójetylosililową usuwa się w środowisku kwaśnym wytwarzając związek 7-hydroksy. Jednakże usunięcie oksazolu wymaga wzmiankowanej wcześniej aktywacji (benzaldehydu), jak i dokładnego monitoringu reakcji w celu zapobieżenia tworzenia się produktów rozkładu. Korzystnymi rozpuszczalnikami dla przeprowadzenia tej reakcji są alkohole lub THF, a kwaśnymi katalizatorami mocne kwasy takie jak chlorowodór gazowy, kwas solny lub kwas trójfluorooctowy. Korzystną temperaturą reakcji jest temperatura od 0°C do temperatury wrzenia rozpuszczalnika, jednakże preferowanym zakresem temperatur jest 0 - 40°C. W wyniku całkowitego usunięcia grup zabezpieczających otrzymuje się związek 7. Benzoilowania pozycji 2' można dokonać w różnych warunkach. Stwierdzono, że zastosowanie mieszaniny chlorek benzoilu, trójetyloamina, wodorowęglan sodu w chlorku metylenu jest szczególnie korzystne dla tego przekształcenia. Inną metodą dla przeprowadzenia ostatniej reakcji jest użycie DCC i kwasu benzoesowego w toluenie.

Otrzymanie docelowego związku osiąga się na drodze oksydatywnego rozszczepienia amidowej olefiny o wzorze 8 przy pomocy ozonu z wytworzeniem związku 9, który przekształca się do związku 1 poprzez uwolnienie grupy aminowej z amidu w reakcji z ortofenylenodiaminą w obecności kwasu i migrację grupy benzoilowej z pozycji 2' na uwolnioną grupę aminową na pozycji 3'. Oczyszczenia otrzymanego paklitakselu (1) dokonuje się w znany sposób, korzystnie przy pomocy krystalizacji lub chromatografii.

Poniżej przedstawiono przykład wykonania wynalazku.

Przykład.

Etap 1 (otrzymywanie związku 2. R= Me. R1=Me)

W kolbie dwu szyjnej o pojemności 1 l zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne umieszczono 100 g kwaśnego węglanu sodu, 400 ml chlorku metylenu i 13 g (56.3 mmol) estru metylowego chlorowodorku fenyloizoseryny i włączono mieszadło. Następnie do kolby dodano porcjami, w temperaturze pokojowej, w ciągu 1 godziny chlorek kwasu metylocynamonowego (ok. 12 g, 67 mmol), aż do momentu, gdy TLC (płytka pokryta żelem krzemionkowym f-my Merck, chlorek metylenu / izopropanol 49/1) wykazywała nadmiar chlorku kwasowego (Rf = 0.16) w mieszaninie. Mieszanie kontynuowano przez następną godzinę, po czym zawartość kolby filtrowano i z przesączu oddestylowano rozpuszczalnik na wyparce. Pozostałość rozpuszczono, na ciepło, w małej ilości chlorku metylenu i roztwór rozcieńczono toluenem. Wytrącony produkt - związek o wzorze 2 (R= Me, R1=Me) (Rf = 0.21) odsączono, przemyto toluenem i suszono na powietrzu. Otrzymano 16.2 g produktu (88%).

¹H NMR (500 MHz, CDCI3) d: 2.10 (d, J=1.2 Hz, 3H); 3.85 (s, 3H); 4.60 (d, J=2.1 Hz, 1H); 5.65 (dd, J=9.0, 1.7 Hz, 1H); 6.74 (d, J=9.0 Hz, 1H); 7.27-7.34 (m, 5H); 7.35-7.39 (m., 4H); 7.42-7.45 (m., 2H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCI3) 6: 14.27; 53.23; 54.80; 73.22; 126.94; 127.94; 128.34; 128.75; 129.36; 131.63; 134.52; 135.90; 138.82; 168.96; 173.43.

t.t. =162-164°C

Etap 2 (otrzymywanie związku 3. R=Me. R1=Me. R2=OMe. R3= OMe)

W kolbie kulistej o pojemności 500 ml, zaopatrzonej w propeler magnetyczny i nasadkę destylacyjną z zamontowaną chłodnicę prostą umieszczono 12g (56.6 mmol) acetalu dwumetylowego-3,4-dimetoksybenzaldehydu, 17 g (50.1mmol) amidu metylocynamonowego 2 (R= Me, R1=Me)i 220 ml toluenu. Włączono mieszadło magnetyczne i roztwór ogrzano do wrzenia. Z mieszaniny oddestylowano 20 ml rozpuszczalnika. Następnie mieszaninę ochłodzono, dodano katalityczną ilość kwasu p-toluenosulfonowego (100 mg) i ponownie ogrzano do wrzenia oddestylowując powoli toluen (ok. 1 ml/min.). Ogrzewanie prowadzono aż do zaniku substratu wg TLC (ok. 1 godz.). Następnie mieszaPL 193 190 B1 ninę ochłodzono i przemyto 50 ml 10% wodnego roztworu węglanu sodu. Warstwę organiczną suszono siarczanem magnezu i oddestylowano rozpuszczalnik na wyparce. Oleistą pozostałość zalano 100 ml metanolu i odsączono wytrącone kryształy. Otrzymano 15.8 związku o wzorze 3 (R=Me, R1= Me, R2=OMe, R3=OMe) (65%), Rf = 0.14 (heksan/ chlorek metylenu/ eter etylowy 9/9/2).

¹H NMR (500 MHz, CDCI3) d: 1.88 (s, 3H); 3.67 (s, 3H); 3.86 (s, 3H); 3.88 (s, 3H); 4.97 (s, 1H); 5.63 (s, 1H); 6.40 (d, J=1.2 Hz, 1H); 6.79 (s, 1H); 6.82 (d, J=8.3 Hz, 1H); 6.90-7.09 (m, 4H); 7.20-7.44 (m., 7H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCI3) d: 15.44; 52.74; 55.65; 55.92; 64.08; 81.36; 91.61; 110.49; 110.68; 120.46; 127.62; 128.11; 128.22; 128.71; 128.96; 130.29; 131.23; 133.06; 135.35; 139.09; 148.84; 149.45; 170.57; 173.54.

t.t. = 131-133°C

Związek 3 (R=Me, R1=Me, R2=OMe, R3=H) ¹H NMR (500 MHz, CDCI3) d: 1.88 (bs, 3H); 3.82 (s, 3H); 3.85 (s, 3H); 4.90 (d, J=2.2 Hz, 1H); 5.56 (d, J=1.9 Hz, 1H); 6.40 (d, J=1.4 Hz, 1H); 6.81 (s, 1H); 6.88 (m, 2H); 6.95 (m, 2H); 7.19-7.45 (m, 10 H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCI3) d: 15 41; 52.72; 55.29; 64.44; 81.90; 91.25; 113.68; 127.31;

127.57; 128.08; 128.20; 128.70; 128.96; 129.96; 131.25; 133.11; 135.40; 139.24; 160.03; 170.53.

Etap 3 (otrzymywanie związku 4. R=Me. R2= OMe. R3=OMe)

W kolbie kulistej o pojemności 1 l umieszczono 15.6 g estru o wzorze 3 (R=Me, R1=Me, R2=OMe, R3=OMe) (32 mmol) i 100 ml metanolu. Do mieszanej zawiesiny wkroplono w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej 37 ml 1N (37 mmol) wodnego roztworu NaOH. Mieszanie kontynuowano aż do zaniku substratu wg TLC. Następnie do kolby wlano 375 ml 0.1 N HCI (37.5 mmol) i mieszaninę ekstrahowano chlorkiem metylenu (w przypadku utworzenia emulsji dodawano trochę kwasu solnego). Warstwę organiczną przemyto wodą i wysuszono siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik oddestylowano na wyparce i surowy produkt - związek o wzorze 4 (R=Me, R2=OMe, R3=OMe) użyto w całości do następnej reakcji. Wydajność ilościowa.

Etap 4 (otrzymywanie związku 6. R=Me. R2=OMe. R3=OMe)

W kolbie kulistej o pojemności 1 l, zaopatrzonej w propeler magnetyczny umieszczono cały produkt o wzorze 4 (R=Me, R2=OMe, R3=OMe) z poprzedniej reakcji (ok. 32 mmol), 18.8 g (27 mmol) sililowanego bakatynu o wzorze 5, 570 ml toluenu, 10 g (49 mmol) DCC i 1.26 g (10 mmol) DMAP. Zawartość kolby mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 godzin a następnie odsączono nierozpuszczalne składniki mieszaniny. Z przesączu oddestylowano rozpuszczalnik na wyparce a pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym 230-400 (600 g, CH2CI2/eter 6%). Otrzymano 28 g związku o wzorze 6 (R=Me, R2=OMe, R3= OMe) (addukt A) (90%).

¹H NMR (500 MHz, CDCl3) d: 0.51-0.61 (m, 6H, część AB układu ABX3); 0.92 (t, J=8.0 Hz, 9H, część X układu ABX3); 1.23 (s, 3H); 1.25 (s, 3H); 1.68 (s, 3H); 1.74 (s, 1H); 1.84-1.91 (m., 4H); 2.05 (s, 3H); 2.13 (d, J=1.2 Hz, 3H); 2.19 (s, 3H); 2.25-2.31 (m., 2H); 2.35 (s, 1H); 2.50 (ddd, J=14.4, 9.7, 6.7 Hz, 1H); 3.71 (s, 3H); 3.84 (d, J=7.0 Hz, 1H); 3.91 (s, 3H); 3.96 (d, J=11.9 Hz, 1H); 4.14 (d, J=8.3 Hz, 1H); 4.31 (d, J=8.3 Hz, 1H); 4.48 (dd, J=10.4, 6.7 Hz, 1H); 4.88 (dd, J=7.8, 1.2 Hz, 1H); 4.99 (s, 1H); 5.68 (d, J=7.0 Hz, 1H); 5.73 (s, 1H); 6.32 (td, J=9.1, 1.1 Hz, 1H); 6.40 (d, J=1.1 Hz, 1H); 6.47 (s, 1H); 6.79 (s, 1H); 6.86 (d, J=8.3 Hz, 1H); 6.93-7.10 (m., 4H); 7.13-7.28 (m., 6H); 7.34-7.49 (m., 6H); 7.60 (tt, J=7.4, 1.2 Hz, 1H); 8.04-8.08 (m, 2H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCI3) d: 5.29; 6.70; 10.02; 14.64; 15.45; 20.83; 21.00; 21.42; 22.03; 26.61; 35.43; 37.20; 43.30; 46.81; 55.66; 55.96; 56.01; 56.17; 58.52; 71.59; 72.24; 74.87; 74.97; 76.48; 78.97; 80.93; 84.18; 110.53; 110.81; 120.22; 125.28; 127.62; 127.66; 128.35; 128.62; 128.89; 128.96; 129.01; 129.22; 130.06; 131.58; 132.94; 133.70; 134.17; 135.29; 139.63; 149.00; 149.57; 167.01; 169.11; 169.92;170.00; 190.85; 201.64.

olej

[a]D = -51.8 (c=1.8, chloroform)

Związek 6 (R=Me, R2=OMe, R3=H) ¹H NMR (500 MHz, CDCI3) d: 0.58 (m, 9H, część AB układu ABX3); 0.92 (t, J=8.0 Hz, 6H); 1.23 (s, 3H); 1.24 (s. 3H); 1.59 (s, 1H); 1.68 (s, 3H); 1.73 (s, 1H); 1.85-1.92 (m, 1H); 1.89 (s, 3H); 2.05 (s, 3H); 2.12 (d, J=1.0 Hz, 3H); 2.19 (s, 3H); 2.24-2.30 (m, 2H); 2.35 (s, 1H); 2.51 (ddd, J=14.4, 9.7, 6.7 Hz, 1H); 3.82-3.86 (m, 1H); 3.84 (s, 3H); 4.13 (d, J=8.3 Hz, 1H); 4.27 (d, J=8.3 Hz, 1H); 4.48 (dd, J=10.5, 6.7 Hz, 1H); 4.89 (dd. J=9.6, 1.5 Hz, 1H); 4.91 (d, J=1.8 Hz, 1H); 5.67 (s, 1H); 5.68 (d, J=5.2 Hz,

PL 193 190 B1

1H); 6.31 (td, J=9.1, 1.2 Hz, 1H); 6.41 (d, J=0.8 Hz, 1H); 6.47 s, 1H); 6.82 (s, 1H); 6.90-6.96 (m, 4H); 7.44-7.49 (m, 4H); 7.60 (tt, J=7.4, 1.1 Hz, 1H); 8.04-8.08 (m, 2H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCI3) d: 5.30; 6.71; 10.03; 14.62; 15.41; 20.83; 21.01; 21.42; 21.98; 26.60; 35.44; 37.18; 43.29; 48.80; 55.34; 58.51; 71.62; 72.22; 74.89; 74.97; 76.47; 79.00; 80.89; 84.22; 113.87; 127.51; 127.61; 128.20; 128.29; 128.61; 128.78; 128.82; 128.96; 129.24; 129.75; 130.06; 131.61; 133.00; 133.69; 134.11; 135.33; 139.26; 139.70; 160.13; 167.07; 169.09; 169.89; 169.96; 201.68.

Etap 5 (otrzymywanie związku 7. R=Me)

Do roztworu adduktu A o wzorze 6 (R=Me, R2=OMe, R3= OMe) (22g) w tetrahydrofuranie (220 ml) dodano 10% kwas solny (22 ml) i mieszaninę pozostawiono w temperaturze pokojowej. Przebieg reakcji kontrolowano za pomocą TLC (płytki f-my Merck pokryte żelem krzemionkowym, benzen/octan etylu 7/3). Po 24 godzinach obserwowano zanik substratu (Rf = 0.65) i pojawienie się produktu desililacji (Rf = 0.46) oraz niewielkiej ilości produktu całkowitej hydrolizy (Rf = 0.33). Reakcję prowadzono aż do momentu zaobserwowania tworzenia się produktówrozkładu (Rf = 0.23 i 0.11) (ok. 72 godziny). Następnie reakcję przerwano przez zneutralizowanie kwasu solnego 10% wodnym roztworem wodorowęglanu sodowego (100 ml) i z mieszaniny oddestylowano tetrahydrofuran na wyparce. Do pozostałości dodano wodę (200 ml) i ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 200 ml). Ekstrakt suszono siarczanem magnezu i usunięto rozpuszczalnik na wyparce. Pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym f-my Merck o granulacji 230 -400 Mesh (800 g, chlorek metylenu / izopropanol 49/1). Otrzymano produkt desililacji (5 g) i właściwy produkt hydrolizy (12 g). Produkt desililacji rozpuszczono w tetrahydrofuranie (50 ml) i do roztworu dodano 10% kwas solny (5 ml). Po 72 godzinach reakcję przerwano przez zneutralizowanie kwasu solnego wodorowęglanem sodu (25 ml) i z mieszaniny usunięto tetrahydrofuran na wyparce. Do pozostałości dodano wodę (50ml) i ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 50 ml). Ekstrakt suszono siarczanem magnezu i usunięto rozpuszczalnik na wyparce. Pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym f-my Merck o granulacji 230-400 Mesh (200g, chlorek metylenu/izopropanol 49/1). Otrzymano dodatkową porcję właściwego produktu hydrolizy (2.5g) o wzorze 7 (R=Me). Całkowita wydajność reakcji wynosiła 84%.

¹H NMR (500 MHz, CDCI3) d: 1.15 (s, 3H); 1.26 (s, 3H); 1.68 (s, 3H); 1.81 (d, J=1.3 Hz, 3H); 1.88 (ddd, J=14.6, 11.0, 2.3 Hz, 1H); 2.07 (d, J=1.4 Hz, 3H); 2.24 (s, 3H); 2.28 (dd, J=15.5, 9.0 Hz, 1H); 2.34 (dd, J=15.5, 9.0 Hz, 1H); 2.38 (s, 3H); 2.46 (d, J=3.9 Hz, 1H); 2.54 (ddd, J=14.8, 9.7, 6.7 Hz, 1H); 3.57 (d, J=5.3 Hz, 1H); 3.80 (d, J=7.0 Hz, 1H); 4.19 (dd, J=8.4, 0.8 Hz, 1H); 4.29 (d, J=8.4 Hz, 1H); 4.40 (m., 1H); 4.75 (dd, J=5.2, 2.9 Hz, 1H); 5.67 (d, J=7.1 Hz, 1H); 5.70 (dd, J=8.8, 2.7 Hz, 1H); 6.24 (td, J=8.9, 1.4 Hz, 1H); 6.28 (s, 1H); 7.24-7.37 (m., 6H); 7.40-7.75 (m., 6H); 7.60 (tt, J=7.4, 1.3 Hz, 1H); 8.11-8.15 (m., 2H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCI3) 8: 9.56; 14.27; 14.81; 20.83; 21.84; 22.60; 25.33; 26.87; 35.61; 35.68; 43.19; 45.63; 55.02; 58.62; 72.17; 73.31; 74.97; 75.56; 76.50; 79.09; 81.14; 84.40; 127.00;

127.04; 128.04; 128.34; 128.70; 129.01; 129.14; 129.32; 130.22; 131.19; 133.19; 133.72; 134.91; 135.69; 138.05; 142.01; 167.01; 169.14; 170.35; 171.21; 172.74; 203.62.

olej

[a]D = -39.3 (c=1.2, chloroform)

Etap 6 (otrzymywanie związku 8. R=Me)

W kolbie dwu szyjnej o pojemności 11 zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne i rurkę z chlorkiem wapnia umieszczono 15 g (16.8 mmol) hydroksyamidu o wzorze 7 (R=Me), 600 ml chlorku metylenu, 100 g wodorowęglanu sodu, 8 ml trójetyloaminy i 3g (21 mmol) chlorku benzoilu. Zawartość kolby mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę a następnie do mieszaniny dodano 60 ml metanolu. Po 15 godzinach mieszaninę filtrowano, a z przesączu oddestylowano rozpuszczalnik na wyparce. Suchą pozostałość związku o wzorze 8 (R=Me) użyto do następnej reakcji bez oczyszczania.

¹H NMR (500 MHz, CDCI3) d: 1.15 (s. 3H), 1.26 (s. 3H); 1.69 (s. 3H), 1.89 (ddd. J=2.4, 11.1, 14.5 Hz, 1H), 1.97 (d. J=1.2Hz, 3H), 2.10 (d. J=1.4Hz, 3H), 2.16-2.25 (m. 2H), 2.22 (s. 3H), 2.35 (dd. J=9.4, 15.3Hz, 1H), 2.43 (s. 3H), 2.56 (ddd. J=6.6, 9.7, 14.8Hz, 1H), 3.83 (d. J=7.0Hz, 1H), 4.20 (d. J=8.3Hz, 1H), 4.30 (d. J=8.3Hz, 1H), 4.46 (dd. J=6.7, 10.9HZ, 1H), 4.97 (dd. J=2.0, 9.6Hz, 1H), 5.68 (d. J=3.9Hz, 1H), 5.69 (d. J=7.2Hz, 1H), 6.00 (dd. J=3.8, 9.1 Hz, 1H), 6.29 (d. J=9.1Hz, 1H), 6.31 (s. 1H), 6.85 (d. J=9.1Hz, 1H), 7.24-7.63 (m. 14H), 7.99 (dd. J=1.2, 6.5Hz,2H), 8.05 (dd. J=1.2, 6.4Hz, 2H), 8.11 (dd. J=1.4, 8.5Hz, 2H).

IR (CHCI3) v: 3636, 3485, 3282, 1737, 1722, 1615, 1533, 1452, 1376, 1316, 1273, 1240, 1176, 1108, 1070, 1026, 985, 708 cm^-1.

PL 193 190 B1

UV (etanol) lmax: 230, 264 nm

[a]D = -54.5 (c=3.0, etanol) t.t. = 171-173°C

Etap 7 (otrzymywanie związku 9. R=Me)

Substrat o wzorze 8 (R=Me) (11 g, 11.02 mmol) rozpuszczono w 500 ml chlorku metylenu (destylowany suchy* 1) w 2 litrowej kolbie trójszyjnej, zaopatrzonej w termometr do pomiaru niskich temperatur, wlot gazu (ozonu) i wylot gazu (nadmiaru ozonu) z odprowadzeniem wężem do wyciągu, oraz mieszadło magnetyczne (propeller teflonowany). Kolbę umieszczono w łaźni (krystalizator szklany) na dobrym mieszadle magnetycznym. Całość schłodzono w acetonie z suchym lodem (aceton wlano do krystalizatora, stanowiącego łaźnię dla kolby z roztworem substratu), mieszając roztwór energicznie, do -70°C. Wtedy zaczęto przepuszczać przez roztwór substratu ozon z generatora przy pomocy bełkotki. Roztwór stopniowo szarzał, różowiał, a następnie zniebieszczał. Ozon przepuszczano przez ok. 45 min. Następnie odłączono wąż generatora ozonu, a przez roztwór przepuszczono tlen (ok. 1 min), po czym ostrożnie dodano siarczek dwumetylu kroplami aż do momentu odbarwienia się niebieskiego roztworu (ok. 1ml), w celu rozłożenia ozonku. Roztwór pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej (ok. 16 godz.) i wtedy odparowano rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, otrzymując związek o wzorze 9 (R=Me) w postaci ciągliwej bezbarwnej piany (ok. 11 g), której używano do następnej reakcji bez oczyszczania.

¹H NMR (500 MHz, CDCI3) d: 1.12 (s. 3H); 1.23 (s.3H); 1.65 (s.3H); 1.90 (d. J=0.8 Hz, 3H); 1.98-2.05 (m., 2H); 2.21 (s.3H); 2.35 (s. 3H); 2.39 (s. 3H); 2.48-2.59 (m. 2H); 3.78 (d. J=7.1 Hz, 1H); 4.16 (d. J=8.5 Hz, 1H); 4.28 (d, J=8.5 Hz, 1H); 4.42 (dd. J=10.9, 6.6 Hz, 1H); 4.94 (dd. J=9.5, 1.7 Hz, 1H); 5.58 (d. J=4.3 Hz, 1H); 5.65 (d. J=7.2 Hz, 1H); 5.71 (dd. J=9.5, 4.3 Hz, 1H); 6.19 (t. J=9.0 Hz, 1H); 6.27 (s. 1H); 7.28-7.52 (m. 8H); 7.59-7.65 (m. 3H); 8.00 (dd. J=8.4, 1.2 Hz, 2H); 8.10 (dd. J=8.41, 1.2 Hz, 2H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCI3) d: 9.59; 14.79; 20.78; 22.16; 22.53; 24.38; 26.81; 35.39; 35.45; 43.16; 45.55; 53.33; 58.45; 72.01; 72.03; 74.56; 75.16; 75.52; 76.36; 79.36; 81.01; 84.44; 126.75; 128.36; 128.66; 128.73; 128.97; 129.22; 129.91; 130.17; 132.75; 133.71; 134.00; 135.91; 142.74; 159.58; 165.45; 167.04; 167.80; 169.25; 169.65; 171.23; 196.12; 203.74.

olej

[a]D = -28.9 (c=2.4, chloroform)

Etap 8 (otrzymywanie paklitakselu 1)

Substrat o wzorze 9 (R=Me) rozpuszczono w benzenie i zawartość kolby wypłukano argonem. Dodano dwuaminę, kwas p-toluenosulfonowy, uruchomiono mieszadło i zapewniono atmosferę argonu przy pomocy balonika z argonem. Całość mieszano w temperaturze pokojowej (18 - 25°C); Przebieg reakcji kontrolowano TLC (Płytki Merck No. 5554 i No. 5559) uwidaczniając plamy przy pomocy lampy DV (254 nm) lub spryskaniem roztworu aldehydu anyżowego. Reakcja przebiegała bardzo powoli, przez okres 30 - 45 dni (im dłużej tym lepiej). Reakcję kontrolowano także przy pomocy HPLC w układzie 65% acetonitrylu, 30% wody i 5% metanolu.

Przerób produktu reakcji.

Z roztworu usunięto propeler magnetyczny i zatężono go do 30% objętości benzenu na wyparce obrotowej w 40°C pod próżnią. Do pozostałości dodano chlorek metylenu (~ 500 ml) i roztwór przeniesiono do rozdzielacza. Aminę usunięto jednorazowym przemyciem warstwy organicznej 10% kwasem solnym z dodatkiem potłuczonego lodu. Roztwór organiczny przemyto dwukrotnie nasyconą solanką i osuszono siarczanem magnezu. Po odsączeniu siarczanu magnezu roztwór organiczny odparowano na wyparce w próżni pompy olejowej, otrzymując brunatną pozostałość zawierającą paklitaksel (w/g analizy HPLC 70 -80%).

Izolowanie Paklitakselu.

Surową mieszaninę poreakcyjną (6 g) rozpuszczono w 500 ml rozpuszczalnika składającego się z 20% wody w metanolu, do roztworu dodano 6 g węgla aktywnego (Merck) i roztwór zagrzano prawie do wrzenia (2 min.). Całość przefiltrowano przez ubity na lejku Schotta celit i przemyto dwoma porcjami (50 ml) gorącym roztworem 5% wody w metanolu. Tak otrzymany roztwór po odbarwieniu węglem był jasno żółty. Węgiel i celit przemyto 250 ml chlorku metylenu; rozpuszczalnik odparowano, otrzymując ciemno brązową pozostałość (0.8 g) zawierającą trochę taksolu. Odbarwiony roztwór metanolowo wodny odparowano częściowo na wyparce w 35°C, otrzymany mętny roztwór po usunięciu większej części metanolu wyekstrahowano chlorkiem metylenu. Ekstrakt odparowano w próżni otrzymując 5.8 g produktu zawierającego 73% paklitakselu (HPLC). Produkt ten czyszczono następnie na

PL 193 190 B1 kolumnie chromatograficznej przy użyciu żelu krzemionkowego (60 g), który zawieszono w heksanie z dodatkiem trójetyloaminy (200 ml heksanu 0.1 ml N(Et)3). Na kolumnę naniesiono produkt rozpuszczony w układzie 10% acetonu w benzenie. Wyeluowano czysty paklitaksel w układzie gradientowym 20% - 30% acetonu w heksanie, otrzymując 4.1 g czystego paklitakselu (95% HPLC) z 0% popiołu. Chromatografię monitorowano przy pomocy TLC.

a) w fazach normalnych płytki Merck 5554, 30% acetonu w benzenie.

b) w fazach odwróconych płytki Merck 5559, acetnitryl/woda/metanol 65/30/5.

Dane spektroskopowe otrzymanego paklitakselu.

¹H NMR (CDCI3, 500 MHz) d: 1.14 (s, 3H), 1.23 (s, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.79 (s, 3H), 1.87 (m, 1H), 1.95 (s, 1H), 2.23 (s, 3H), 2.29 (dd, J = 15.5, 8.9 Hz, 1H), 2.35 (dd, J = 15.5, 8.9 Hz, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.49 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 2.53 (ddd, J = 14.6, 9.7, 6.7 Hz, 1H), 3.64 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 3.79 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.28 (d, J =8.4 Hz, 1H), 4.39 (m, 1H), 4.79 (br.s, 1H), 4.94 (dd, J = 9.5, 2.0 Hz, 1H), 5.67 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.78 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 6.23 (td, J = 8.9, 1.1 Hz, 1H), 6.27 (s, 1H), 7.02 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.33-7.43 (m, 5H), 7.46-7.54 (m, 5H), 7.61 (tt, J= 7.4, 1.3 Hz, 1H), 7.73 (m, 2H), 8.13 (m, 2H);

¹³C NMR (CDCI3, 50 MHz) d: 9.55, 14.75, 20.81, 21.79, 22.54, 26.76, 35.62, 43.12, 45.62, 55.08, 58.48, 72.04, 72.22, 73.13, 74.90, 75.53, 78.83, 81.08, 84.34, 126.98, 127.02, 128.26, 128.63, 128.93, 129.15, 130.13, 131.92, 133.11, 133.57, 133.64, 137.94, 141.84, 166.84, 167.23, 171.20, 1.72.68, 203.58.

t.t. = 222-224°C

[a]D = 49.72 (C 0.36, EtOH)

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania paklitakselu o wzorze 1:

   PL 193 190 B1 znamienny tym, że amid o wzorze 2:

   gdzie R oznacza wodór lub metyl, a R1 oznacza niższy alkil.

   Korzystnie o 1-3 atomach węgla, poddaje się cyklizacji w obojętnym rozpuszczalniku organicznym przy pomocy dwumetylowego acetalu aktywowanego benzaldehydu o wzorze 2a, w którym R2 i R3 oznaczają niezależnie atom wodoru lub grupę alkoksylową o 1 - 3 atomach węgla, w warunkach kwaśnej katalizy, z jednoczesnym usuwaniem metanolu, wytwarzając pochodną oksazolową o wzorze 3, gdzie R ma wyżej podane znaczenie, R1 oznacza krótki alkil, korzystnie o 1 - 3 atomach węgla, R2 oznacza O-alkil, korzystnie o 1-3 atomach węgla, a R3 oznacza O-alkil, korzystnie o 1-3 atomach węgla lub wodór, który hydrolizuje się przy pomocy zasady i zakwasza w celu wytworzenia kwasu karboksylowego o wzorze 4, w którym R, R2 i R3 mają wyżej podane znaczenie, po czym łączy się związek 4 ze związkiem 5 przez zastosowanie dicykloheksylodikarbodiimidu (DCC) z DMAP do wytworzenia związku 6, w którym R, R2 i R3 mają wyżej podane znaczenie, następnie usuwa się grupy zabezpieczające uzyskując związek o wzorze 7, gdzie R ma wyżej podane znaczenie, który benzoiluje się w pozycji 2', jedną ze znanych metod, korzystnie z zastosowaniem mieszaniny chlorek benzoilu, trójetyloamina, wodorowęglan sodu w chlorku metylenu, do wytworzenia amidowej olefiny o wzorze 8 z której na drodze oksydatywnego rozszczepienia przy pomocy ozonu wytwarza się związek 9, który przegrupowuje się do związku 1 w obecności o-fenylenodiaminy i kwasu p-toluenosulfonowego.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się a,b-nienasycony amid 2R,3S-fenyloizoseryny o wzorze 2, gdzie R oznacza wodór lub metyl, otrzymany poprzez estryfikację chlorowodorku 2R,3S-fenyloizoseryny alkoholem R1-OH gdzie R1 ma wyżej podane znaczenie, w obecności chlorku tionylu, a wytworzony ester reaguje się z chlorkiem kwasu a-metylocynamonowego w środowisku zasadowym lub obojętnym wytwarzając krystaliczny związek 2.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w reakcji cyklizacji, korzystnie stosuje się toluen.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywowany benzaldehyd stosuje się benzaldehyd zawierający przynajmniej jedną grupę O-alkilową w której alkil jest niższym alkilem, korzystnie zawierającym 1-3 atomów węgla.
5. 5. Związek o wzorze 3, gdzie R oznacza metyl lub wodór, R1 oznacza niższy alkil, korzystnie o 1-3 atomach węgla, R2 oznacza -O-alkil i R3 oznacza -O-alkil lub wodór, w których alkil jest niższym alkilem, korzystnie zawierającym 1-3 atomów węgla.

   PL 193 190 B1
6. 6. Związek według zastrz. 5, znamienny tym, że we wzorze 3 R jest metylem, R1 jest metylem lub etylem, R2 oznacza OMe, a R3 oznacza OMe lub wodór.
7. 7. Związek o wzorze 6, gdzie R oznacza niższy alkil lub wodór, R2 oznacza -O-alkil i R3 oznacza -O-alkil lub wodór, gdzie alkil jest niższym alkilem, korzystnie zawierającym 1-3 atomów węgla.

   PL 193 190 B1
8. 8. Związek o wzorze 4, gdzie R oznacza metyl lub wodór, R2 -O-alkil, gdzie alkil oznacza niższy alkil), R3 oznacza O-alkil (niższy alkil) lub wodór.
9. 9. Związek o wzorze 7, gdzie R oznacza metyl.

   PL 193 190 B1
10. 10. Związek o wzorze 8, gdzie R oznacza metyl.