PL193510B1

PL193510B1 - Sposób otrzymywania inhibitorów reduktazy HMG-CoAo wysokiej czystości

Info

Publication number: PL193510B1
Application number: PL99342513A
Authority: PL
Inventors: Zlatko Pflaum; Dusan Milivojevic; David Senica
Original assignee: Lek Tovarna Farmacevtskih
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2007-02-28
Also published as: CZ297093B6; HRP20000541A2; DE69925459D1; BG104696A; AU3438499A; US6825015B1; RO120922B1; SK11852000A3; YU50100A; KR20010041024A; EP1054993A1; WO1999042601A1; HUP0100820A2; JP2002504345A; SI9800046A; JP2005110693A; HUP0100820A3; KR100582620B1; CA2321052A1; IL137782A0

Abstract

1. Sposób izolowania i oczyszczania inhibitorów reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo ko- enzymu A - HMG-CoA, znamienny tym, ze obejmuje poddawanie inhibitora reduktazy HMG-CoA polaczonym etapom krystalizacji, obejmujacym krystalizacje z mieszajacego sie z woda lub rozpusz- czalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego i krystalizacje z rozpuszczalnika organicznego wykazujacego ograniczona zdolnosc do mieszania sie z woda lub rozpuszczania sie w wodzie, do uzyskania inhibitorów reduktazy HMG-CoA o czystosci wiekszej niz 99,6%. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Lowastatyna, prawastatyna, mewastatyna, simwastatyna, ich pochodne i analogi znane są jako inhibitory reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo koenzymu A (HMG-CoA) i stosuje się je jako czynniki przeciw hipercholesterolemii. Wytwarza się je przez fermentację stosując mikroorganizmy różnych gatunków, zidentyfikowane jako gatunki należące do rodzajów Aspergillus, Monascus, Nocardia, Amycolatopsis, Mucor lub Penicillium.

Czystość składnika aktywnego jest ważnym czynnikiem wytwarzania bezpiecznego i skutecznego środka farmaceutycznego. Najwyższa możliwa czystość produktu jest szczególnie ważna, jeśli produkt farmaceutyczny powinien być przyjmowany w ciągu dłuższego okresu, tak jak dzieje się w przypadku leczenia lub zapobiegania wysokiemu poziomowi cholesterolu w osoczu. Akumulacja zanieczyszczeń ze środków farmaceutycznych o niższej czystości może powodować wiele efektów ubocznych podczas leczenia.

Sposoby izolowania i oczyszczania czynników przeciw hipercholesterolemii ujawnione we wcześniejszych zgłoszeniach patentowych obejmują różne kombinacje metod ekstrakcji, chromatografii, laktonizacji i krystalizacji. Czystość produktu końcowego otrzymywanego dzięki tym procedurom jest niższa niż 99,6%. Otrzymanie produktu o wyższej czystości z zastosowaniem tych metod jest możliwe, ale wydajność pożądanego produktu jest zbyt niska, aby stosować te metody na dużą skalę przemysłową.

Sposób izolowania ujawniony w światowym zgłoszeniu patentowym numer WO 92/16276 zapewnia roztwór do otrzymywania inhibitorów reduktazy HMG-CoA o czystości wyższej niż 99,5%, ale wymagane jest stosowanie wysoce specjalistycznego przemysłowego wyposażenia do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Według światowego zgłoszenia patentowego numer WO 92/16276, nieoczyszczony inhibitor reduktazy HMG-CoA o czystości 85% lub wyższej rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym lub w roztworze rozpuszczalnika organicznego i wody. Mieszaninę buforuje się następnie do pH pomiędzy 2 a 9 i umieszcza na kolumnie HPLC. Po zebraniu będącego przedmiotem zainteresowania piku inhibitora reduktazy HMG-CoA usuwa się część rozpuszczalnika i dodaje wodę lub, alternatywnie, usuwa się dwie trzecie mieszaniny rozpuszczalników w celu wykrystalizowania inhibitora reduktazy HMG-CoA. Po zakończeniu, czystość produktu uzyskiwanego tym sposobem wynosi rzeczywiście co najmniej 99,5%, przy wydajności około 90%.

Podsumowanie wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego przemysłowego sposobu izolowania i oczyszczania z brzeczki fermentacyjnej inhibitorów reduktazy HMG-CoA o czystości wyższej niż 99,6%, a korzystnie wyższej niż 99,7%. Dla osiągnięcia tego celu, przeprowadzono rozległe badania związków chemicznych wytwarzanych podczas fermentacji z zastosowaniem różnych gatunków mikroorganizmów należących do rodzajów Aspergillus, Monascus, Nocardia, Mucor, Amycolatopsis lub Penicillium, ich właściwości chemicznych oraz ich zachowania w różnych rozpuszczalnikach w różnym pH. A zatem, wymieniony powyżej cel osiągnięto przez sposób, według niniejszego wynalazku, który obejmuje następujące etapy:

- klarowania brzeczki grzybni i zatężania sklarowanej brzeczki do mniejszej objętości,

- zakwaszenia koncentratu do wartości pH w zakresie od 4,5 do 7,5, a następnie ekstrakcji inhibitora reduktazy HMG-CoA octanem etylu,

- ewentualnie przeprowadzenia laktonizacji,

- przeprowadzenia krystalizacji inhibitora reduktazy HMG-CoA z mieszającego się z wodą lub rozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego, oraz

- przeprowadzenia krystalizacji inhibitora reduktazy HMG-CoA z rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie.

Szczegółowy opis wynalazku

Odnośnie rysunków, fig. 1 przedstawia zależność współczynnika podziału odpowiednio inhibitora reduktazy HMG-CoA (lowastatyna) i zanieczyszczeń od pH na etapie ekstrakcji octanem etylu, oraz fig. 2, 3 i 4 przedstawiają wykresy HPLC próbek inhibitora reduktazy HMG-CoA po ekstrakcji octanem etylu odpowiednio w postaci nieoczyszczonej kompozycji, po krystalizacji z mieszającego się z wodą lub rozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego oraz po dalszej krystalizacji z rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie.

PL 193 510 B1

Ponieważ inhibitory reduktazy HMG-CoA są zazwyczaj produktami zarówno wewnątrz-, jak i zewnątrzkomórkowymi, nie jest obowiązkowe, ale korzystne ich efektywne wymywanie z grzybni do płynu fermentacyjnego. Sposób wymywania ujawniony w światowym zgłoszeniu patentowym numer WO 97/20834 obejmuje traktowanie brzeczki fermentacyjnej zasadą do uzyskania pH 11,5 i mieszanie w ciągu trzech godzin. Światowe zgłoszenie patentowe numer WO 97/06128 podaje, że wymywanie można osiągnąć przez alkalizację brzeczki fermentacyjnej do pH pomiędzy 10 a 13. Stosuje się również temperaturę pomiędzy 60 a 95°C. Inhibitory reduktazy HMG-CoA można bardzo efektywnie wymywać z grzybni w pH wyższym niż 9, ale zbyt długa ekspozycja na tak surowe warunki powoduje degradację wiązania estrowego pomiędzy grupą hydroksylową pierścieniem naftalenowym i kwasem karboksylowym. Równowaga pomiędzy inhibitorami reduktazy HMG-CoA i deacylowanymi inhibitorami reduktazy HMG-CoA przesuwa się w bardziej surowych warunkach ku produktom deacylowanym. Nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że skuteczność wymywania prowadzonego w zakresie temperatur od 10 do 40°C, korzystnie w zakresie od 18 do 25°C, tak jak w temperaturze pokojowej, w ciągu mniej niż jednej godziny, korzystnie w ciągu mniej niż pół godziny, na przykład w ciągu około 10 minut, w pH pomiędzy 9,5 a 13, najkorzystniej pomiędzy 9,5 a 11,5, jest równa skuteczności uzyskiwanej mniej korzystnymi z ekonomicznego punktu widzenia i bardziej czasochłonnymi sposobami przeprowadzanymi w wyższych temperaturach, opisanymi we wcześniejszych zgłoszeniach patentowych. Wymywanie można również przeprowadzać w pH niższym niż 9,5, a szczególnie niższym niż 6, ale w tym przypadku konieczne jest stosowanie ogromnych ilości rozpuszczalników organicznych.

Jeśli przeprowadzono to korzystne rozwiązanie wymywania inhibitora reduktazy HMG-CoA, brzeczkę fermentacyjną traktuje się następnie czynnikiem zakwaszającym, odpowiednim kwasem nieorganicznym, w celu doprowadzenia wartości pH do pomiędzy 7,5 a 8,5. Odpowiednimi kwasami nieorganicznymi są kwas fosforowy, siarkowy i solny. Inhibitory reduktazy HMG-CoA są stabilne w tym zakresie pH i brzeczkę fermentacyjną można również, jeśli jest to konieczne lub pożądane, przechowywać przez pewien czas po tym etapie.

Grzybnię usuwa się z brzeczki fermentacyjnej poprzez odpowiednie etapy rozdzielania, takie jak sączenie i/lub wirowanie. Korzystne jest sączenie, a jako technikę sączenia, poza sączeniem klasycznym, można stosować również mikro-, ultra- i diafiltrację. Sklarowaną brzeczkę zatęża się następnie do mniejszej objętości, najkorzystniej od pięciu do dziesięciu razy, poprzez odwróconą osmozę lub stosując inne metody zmniejszania objętości.

Poniżej opisany etap zakwaszania i ekstrakcji octanem etylu jest istotnym punktem sposobu oczyszczania.

Rzeczony koncentrat zakwasza się czynnikiem zakwaszającym, odpowiednim kwasem nieorganicznym, do wartości pH pomiędzy 4,5 a 7,5. Można zastosować wymienione już powyżej jako przykłady kwasy nieorganiczne. Następnie inhibitor reduktazy HMG-CoA ekstrahuje się octanem etylu z rzeczonego koncentratu o doprowadzonym pH. Ekstrakcję odpowiednio przeprowadza się przez zastosowanie przeciwprądowej kolumny ekstrakcyjnej. Stosunek pomiędzy współczynnikami podziału inhibitorów reduktazy HMG-CoA i zanieczyszczeń rozpuszczalnych w octanie etylu jest najwyższy przy wartościach pH od 5,5 do 7,5, a zwłaszcza przy wartościach pH od 6,0 do 7,0, i część polarnych zanieczyszczeń ulega usunięciu już na tym etapie. Ekstrakcja prowadzona przy wartości pH niższej niż 5,0, szczególnie niższej niż 4, jest bardziej skuteczna, z powodu wyższego współczynnika inhibitorów reduktazy HMG-CoA, ale jej wynikiem jest wysoki poziom zanieczyszczeń polarnych. Współczynniki podziału zanieczyszczeń rozpuszczalnych w octanie etylu są również wysokie przy tej wartości pH, jak przedstawiono na fig. 1. Wynikiem ekstrakcji do octanu etylu prowadzonej przy wartościach pH pomiędzy 4,5 a 7,5, szczególnie powyżej 5, a zwłaszcza powyżej 5,5, jest niższy poziom zanieczyszczeń polarnych z powodu ich niskich współczynników podziału. Gorszy rozdział inhibitorów reduktazy HMG-CoA z koncentratu do octanu etylu przy tej wartości pH można skompensować dłuższą przeciwprądową kolumną ekstrakcyjną.

Jeśli jest to pożądane, uzyskany w wyniku ekstrakt w octanie etylu zatęża się następnie i ewentualnie na tym etapie inhibitor reduktazy HMG-CoA poddaje się laktonizacji. Przy pH pomiędzy 5,5 a 7,5 zasadnicza część inhibitora reduktazy występuje w postaci wolnego kwasu. Dlatego też, zatężanie i laktonizację można pominąć, jeśli inhibitora reduktazy HMG-CoA nie stosuje się w środku farmaceutycznym w postaci laktonu. Laktonizację przeprowadza się odpowiednio przez zetknięcie inhibitora reduktazy HMG-CoA z katalityczną ilością kwasu nieorganicznego lub organicznego, najkorzystniej kwasu trifluorooctowego (TFA). Inhibitor reduktazy HMG-CoA, który ewentualnie poddano laktonizacji, można następnie bezpośrednio wykrystalizować z octanu etylu, jak zostanie opisane poniżej. Al4

PL 193 510 B1 ternatywnie, octan etylu usuwa się, odpowiednio przez odparowanie, i otrzymuje się surowy produkt inhibitora reduktazy HMG-CoA, który ewentualnie został poddany laktonizacji.

Tak otrzymany surowy inhibitor reduktazy HMG-CoA można następnie ewentualnie poddać chromatografii adsorpcyjnej, korzystnie chromatografii z odwróconymi fazami. Jako fazę ruchomą do chromatografii adsorpcyjnej można odpowiednio zastosować acetonitryl lub niższe alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol, bądź mieszaninę tych rozpuszczalników z wodą. Korzystnie, surowy inhibitor reduktazy HMG-CoA rozpuszcza się w czystym acetonitrylu lub mieszaninie acetonitryl/woda o stężeniu objętościowo/objętościowym (v/v) acetonitylu co najmniej 30% i uzyskany w wyniku roztwór nakłada się na kolumnę do chromatografii adsorpcyjnej. Wypełnienie kolumny obejmuje, ale nie ogranicza się do nieruchomych faz opartych na oktylosilanie, dimetylosilanie, oktadecylosilanie, cyjanosilanie, kopolimerze polistyrenodiwinylobenzenowym lub polimerze akrylowym. Można również stosować inne typowe materiały faz nieruchomych, na przykład krzemionkę, tlenek glinowy lub podobne. Zaadsorbowane związki eluuje się odpowiednią fazą ruchomą, taką jak gradient acetonitryl/woda. Pik będącego przedmiotem zainteresowania inhibitora reduktazy HMG-CoA zbiera się i usuwa się rozpuszczalnik fazy ruchomej w celu wykrystalizowania inhibitora reduktazy HMG-CoA. Czystość wykrystalizowanych nieoczyszczonych inhibitorów reduktazy HMG-CoA wynosi pomiędzy 80% a 92% i zależy od profilu zanieczyszczeń w brzeczce fermentacyjnej. Ewentualnie chromatografię adsorpcyjną można również zastąpić normalną chromatografią, chromatografią rzutową, przemysłową HPLC lub metodami ekstrakcji bądź krystalizacji.

Procedura połączonej krystalizacji, która jest szczególna zgodnie z niniejszym wynalazkiem, zostanie bardziej szczegółowo opisana poniżej. Bardziej szczegółowo, obejmuje ona krystalizację inhibitora reduktazy HMG-CoA z rozpuszczalnika organicznego, który miesza się z wodą lub jest rozpuszczalny w wodzie, oraz krystalizację inhibitora reduktazy HMG-CoA z rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie. Kolejność obu krystalizacji może również być odwrotna. Zdolność do mieszania się z wodą lub rozpuszczania się w wodzie, bądź ograniczona zdolność do mieszania się z wodą albo rozpuszczania się w wodzie jest właściwością rozpuszczalnika organicznego znaną per se specjalistom w tej dziedzinie i opisano ją na przykład w „Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, tom A24, wydanie 5 (1993), str. 437-505, włączonej do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. W znaczeniu niniejszego wynalazku, termin „mieszający się z wodą lub rozpuszczalny w wodzie będzie odnosić się do rozpuszczalników organicznych, które wykazują zasadniczo nieograniczoną, korzystnie 100% zdolność do mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie, a termin „ograniczona zdolność do mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie będzie również obejmować nie mieszające się z wodą lub nierozpuszczalne w wodzie rozpuszczalniki organiczne. Ponadto, koncepcja krystalizacji według niniejszego wynalazku w szczególności obejmuje również wytrącanie.

Przykłady zasadniczo mieszających się z wodą lub rozpuszczalnych w wodzie rozpuszczalników organicznych obejmują: alkohole alkilowe o krótkim łańcuchu, takie jak metanol, etanol, propanol i alkohol izopropylowy, ketony alkilowe o krótkim łańcuchu, takie jak aceton i keton metylowoetylowy, etery glikolu i niższych alkili, takie jak glikol metylowy, glikol etylowy, glikol propylowy i diglikol etylowy, oraz dipolarne rozpuszczalniki aprotonowe, takie jak N,N-dimetyloformamid (DMF), N,N-dimetyloacetamid (DMA) oraz dimetylosulfotlenek (DMSO), włącznie z mieszaninami tych rozpuszczalników. Jako szczególnie korzystne przykłady mieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych wymienia się aceton i alkohole alkilowe o krótkim łańcuchu. Przykłady rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie obejmują: wyższe alkohole alkilowe, takie jak butanol, izobutanol, alkohol amylowy, heksanol, 2-etyloheksanol, alkohol benzylowy i cykloheksanol, wyższe ketony alkilowe, takie jak keton metylobutylowy, keton metyloizobutylowy i cykloheksanon, estry, takie jak octan metylu, octan etylu, octan n-propylu (i izopropylu), octan n-butylu (i izo-butylu lub sec-butylu) i octan amylu, etery, takie jak eter dietylowy i eter diizopropylowy, chlorowane węglowodory, takie jak chlorek metylenowy i chloroform, acetonitryl i podobne, włącznie z mieszaninami tych rozpuszczalników. Szczególnie korzystny jako rozpuszczalnik posiadający ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie jest octan etylu.

Nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że krystalizacja inhibitorów reduktazy HMG-CoA z rozpuszczalnika mieszającego się z wodą, takiego jak aceton, lub niższy alkohol alkilowy, po której następowały dalsze rekrystalizacje z tego samego rozpuszczalnika, może usunąć tylko niewielką część zanieczyszczeń niepolarnych i główną część zanieczyszczeń polarnych, a krystalizacja z rozpuszczalnika

PL 193 510 B1 organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą, takiego jak octan etylu, po której następowały dalsze rekrystalizacje z tego samego rozpuszczalnika, usunąć tylko główne zanieczyszczenia niepolarne. Ten ostatni fakt jasno wynika z wykresów HPLC nieoczyszczonego inhibitora reduktazy HMG-CoA (fig. 2), inhibitora reduktazy HMG-CoA po krystalizacji z acetonu (fig. 3) oraz inhibitora reduktazy HMG-CoA otrzymanego przez krystalizację z acetonu, a następnie rekrystalizowanego z octanu etylu (fig. 4). Zgodnie z tym nieoczekiwanym odkryciem, w sposobie uzyskiwania inhibitorów reduktazy HMG-CoA o wysokiej czystości nie można pominąć ostatniego etapu według niniejszego wynalazku, obejmującego połączoną krystalizację z mieszającego się z wodą lub rozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego oraz z rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie.

Proces połączonej krystalizacji według niniejszego wynalazku można przeprowadzić w następujący sposób. Po pierwsze, kryształy nieoczyszczonego inhibitora HMG-CoA rozpuszcza się w wymienionym powyżej, zasadniczo (korzystnie w 100%) mieszającym się z wodą lub rozpuszczalnym w wodzie rozpuszczalniku organicznym, w szczególności acetonie lub niższym alkoholu, a następnie dodaje się wodę, aby umożliwić krystalizację lub wytrącanie inhibitora reduktazy HMG-CoA. Alternatywnie, nieoczyszczony inhibitor reduktazy HMG-CoA, rozpuszczony w zasadniczo mieszającym się z wodą lub rozpuszczalnym w wodzie rozpuszczalniku organicznym, dodaje się do wody w celu jego krystalizacji lub wytrącenia. Procedury te można, jeśli jest to konieczne, powtarzać ponownie z tym samym lub innym mieszającym się z wodą lub rozpuszczalnym w wodzie rozpuszczalnikiem organicznym, na przykład od jednego do czterech razy, zależnie od czystości nieoczyszczonego materiału wyjściowego.

Otrzymane w ten sposób kryształy rozpuszcza się w wymienionym powyżej rozpuszczalniku, posiadającym ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie, takim jak octan etylu, do odpowiedniego stężenia, korzystnie pozostającego w zakresie od 10 do 35 g/litr, najkorzystniej w zakresie od 15 do 25 g/litr. Po usunięciu od jednej trzeciej do jednej czwartej rozpuszczalnika, inhibitor reduktazy HMG-CoA ulega krystalizacji. Krystalizację z tego samego lub innego rozpuszczalnika posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie można, jeśli jest to konieczne, powtarzać, na przykład, od jednego do trzech razy, zależnie od czystości produktu otrzymanego przez krystalizację z rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą lub rozpuszczalnego w wodzie. Wykrystalizowany inhibitor reduktazy sączy się następnie i suszy, otrzymując produkt o czystości co najmniej 99,6%.

Jak już wspomniano, kolejność krystalizacji można odwrócić, t j. najpierw przeprowadzić krystalizację z rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie, następnie przeprowadzić krystalizację z rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą lub rozpuszczalnego w wodzie. W korzystnym rozwiązaniu niniejszego wynalazku, pierwszą krystalizację z octanu etylu jako rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie można odpowiednio przeprowadzać bezpośrednio po etapie ekstrakcji octanem etylu lub, ewentualnie, po opisanym powyżej etapie laktonizacji.

Stosując sposób według niniejszego wynalazku, można uzyskać produkty posiadające czystość co najmniej 99,6%, a nawet co najmniej 99,7%.

W dalszym alternatywnym rozwiązaniu, różne rodzaje krystalizacji można prowadzić powtarzając je w naprzemienny sposób.

W dalszym aspekcie niniejszego wynalazku, opisany uprzednio sposób połączonych etapów krystalizacji z mieszającego się z wodą lub rozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego oraz z rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie wykorzystuje się jako ostateczny etap kończący jakikolwiek sposób izolowania i/lub oczyszczania inhibitorów reduktazy HMG-CoA. Zgodnie z tym, taki ostateczny etap kończący można również stosować wobec nieoczyszczonych materiałów inhibitora, który otrzymano w sposób konwencjonalny. Osiągana w ten sposób czystość inhibitora reduktazy HMG-CoA wynosi co najmniej 99,6%, a nawet 99,7%.

Sposób według niniejszego wynalazku jest szczególnie odpowiedni jeśli jako inhibitor reduktazy HMG-CoA wybierze się lowastatynę. Zgodnie z tym, w innym aspekcie niniejszego wynalazku, opisany powyżej sposób stosuje się do izolowania i oczyszczania lowastatyny.

Zasadniczo czyste inhibitory reduktazy HMG-CoA otrzymywane sposobem według niniejszego wynalazku, takie jak lowastatyna, mewastatyna, prawastatyna i simwastatyna, jak również ich po6

PL 193 510 B1 chodne i analogi można korzystnie stosować do przygotowywania środka farmaceutycznego do zapobiegania i/lub leczenia chorób. Otrzymane inhibitory i środki farmaceutyczne są szczególnie użyteczne jako leki lub środki zapobiegające do obniżania ryzyka udaru, ataków przejściowej niedokrwistości, miażdżycy tętnic i zawału mięśnia sercowego.

Poniższe przykłady ilustrują sposób według tego wynalazku i nie należy ich uważać za ograniczenie wynalazku przedstawionego w dołączonych tu zastrzeżeniach.

P r z y k ł a d y

Przykład 1

Brzeczkę fermentacyjną (160 litrów) o stężeniu lowastatyny wynoszącym 1 g/litr, otrzymaną przez fermentację Aspergillus terreus ATCC 20542, umieszczono w naczyniu (400 litrów) i doprowadzono do pH 10 1 M wodnym roztworem wodorotlenku sodowego. Po dziesięciu minutach intensywnego mieszania w temperaturze pokojowej, pH brzeczki doprowadzono do 9 stosując 1 M roztwór kwasu siarkowego i odsączono biomasę. Przesącz zakwaszono następnie 1M roztworem kwasu siarkowego do pH 6,5. Do przesączu dodano 160 litrów octanu etylowego i otrzymaną mieszaninę mieszano w ciągu 20 minut. Fazy wodną i octanu etylu rozdzielono stosując wirówkę ekstrakcyjną. Ekstrakt octanu etylu zatężono w wyparce obrotowej do objętości 15 litrów. Stężenie lowastatyny w postaci wolnego kwasu w koncentracie octanu etylu wynosiło do 10 g/litr.

Koncentrat octanu etylu (14 litrów) umieszczono następnie w reaktorze (40 litrów) i poddawano laktonizacji. Laktonizację zainicjowano katalityczną ilością TFA (0,5 ml / 2 litr koncentratu). Procedura laktonizacji trwała 2 godziny w temperaturze 40°C. Po laktonizacji koncentrat przemyto dwa razy 14 litrami 5% wodnego roztworu wodnego wodorowęglanu amonowego. Fazę wodną odrzucono, a fazę organiczną dalej zatężano do sucha w wyparce obrotowej. Uzyskany w wyniku oleisty produkt zawierał 133 g lowastatyny.

Otrzymany oleisty produkt (161 ml) rozpuszczono w 80 ml acetonitrylu i nałożono na kolumnę chromatograficzną (80 cm, 3,6 cm) wypełnioną KAD-16 (XAD-16 jest nazwą handlową firmy Rohm & Hass, 20-50 mesh). Kolumnę eluowano najpierw acetonitrylem/wodą w stosunku 40:60 (pH 3, doprowadzone kwasem solnym) z szybkością przepływu 75 ml/miutę. Elucję monitorowano stosując detektor UV (236 nm), a po pierwszym spadku absorpcji rozpoczęto elucję kolumny acetonitrylem/wodą w stosunku 55/45 (pH 3, doprowadzone kwasem solnym). Zebrano główną frakcję i, po spadku absorpcji, kolumnę przemywano acetonitrylem/wodą w stosunku 80:20 (pH 3, doprowadzone kwasem solnym). Acetonitryl usunięto z głównej frakcji stosując wyparkę obrotową (50°C, 150 mbarów) i odsączono uzyskane w wyniku kryształy. Masa kryształów wynosiła 24,5 g, a zawartość lowastatyny wynosiła 50% wagowo/wagowych (w/w). Czystość określona za pomocą HPLC wynosiła 92,5%.

Uzyskane w wyniku kryształy (24 g) rozpuszczono w 350 ml acetonu i, podczas ciągłego mieszania, dodano 700 ml wody. Mieszaninę umieszczono w temperaturze 4°C na 30 minut. Otrzymane kryształy odsączono i wysuszono in vacuo w temperaturze pokojowej. Masa kryształów wynosiła 12,7 g, przy 90% w/w zawartości lowastatyny. Czystość określona za pomocą HPLC wynosiła 98,8%.

Krystalizację z acetonu powtórzono w tych samych warunkach i uzyskano 11,3 g kryształów zawierających 97% w/w lowastatyny. Czystość określona za pomocą HPLC wynosiła 99,4%.

Kryształy (11,3 g) otrzymane po drugiej krystalizacji z acetonu rozpuszczono w 700 ml octanu etylu i octan etylu odparowano in vacuo do stężenia lowastatyny wynoszącego 70 g/litr. Koncentrat umieszczono w temperaturze 8°C na jedną godzinę. Uzyskane w wyniku kryształy lowastatyny odsączono, a następnie wysuszono in vacuo. Masa kryształów wynosiła 9,4 g przy 99,6% w/w zawartości lowastatyny. Czystość określona za pomocą HPLC wynosiła 99,7%.

Przykład 2

Kryształy lowastatyny (3 g), wyizolowane po opisanej w przykładzie 1 chromatografii adsorpcyjnej na XAD, rozpuszczono w 170 ml octanu etylu. Octan etylu odparowano in vacuo (200 mbarów) w temperaturze 50°C do objętości 35 ml. Koncentrat umieszczono w temperaturze 10°C na jedną godzinę. Otrzymane w wyniku kryształy lowastatyny odsączono, a następnie wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Masa kryształów wynosiła 2,1 g przy 96% w/w zawartości lowastatyny. Czystość określona za pomocą HPLC wynosiła 99,0%.

Otrzymane kryształy (2,1 g) rozpuszczono w 50 ml acetonu i dodano 85 ml wody. Mieszaninę umieszczono następnie w temperaturze 10°C na 30 minut i kryształy odsączono i wysuszono in vacuo w temperaturze 40°C. Masa otrzymanych w wyniku kryształów wynosiła 1,9 g przy 99% w/w zawartości lowastatyny. Czystość określona za pomocą HPLC wynosiła 99,8%.

PL 193 510 B1

P r zyk ł a d 3

Brzeczkę fermentacyjną (30 litrów w fermentorze o pojemności 50 litrów) zawierającą prawastatynę (690 g na kg brzeczki fermentacyjnej; czystość prawastatyny określona za pomocą HPLC wynosiła 48,7%) przesączono i otrzymaną w wyniku grzybnię przemyto wodą. Przesącz (51 litrów) zakwaszono do pH 5,0 10% wodnym roztworem kwasu fosforowego. Następnie substancję aktywną (prawastatynę) wyekstrahowano z przesączu do 70 litrów octanu etylu w kolumnie ekstrakcyjnej. Fazę wodną (50 litrów), zawierającą mniej niż 2 g prawastatyny i zasadniczą część zanieczyszczeń, odrzucono. Fazę octanu etylu odparowano do objętości 800 ml i stosowano dalej w procesie izolowania. Czystość prawastatyny w ekstrakcie octanu etylu określona za pomocą HPLC wynosiła 70,3%.

W celu dalszego izolowania, oleisty produkt poddano chromatografii adsorpcyjnej i połączonym etapom krystalizacji zgodnie z przykładem 1.

P r zyk ł a d 4

Nieoczyszczoną simwastatynę (2,3 g) w postaci laktonu rozpuszczono w acetonie (7 ml) i dodano 15 ml wody. Wynikiem był oleisty produkt, który wykrystalizował następnie w ciągu 10 minut. Otrzymane kryształy odsączono, przemyto wodą i suszono w temperaturze 40°C w ciągu 60 minut. Otrzymane w wyniku kryształy (2,2 g), o czystości określonej za pomocą HPLC i wynoszącej 99,51%, rozpuszczono następnie w octanie etylu (8 ml). Uzyskany w wyniku roztwór zatężono do objętości 4 ml i simwastatynę pozostawiono do krystalizacji na 60 minut w temperaturze 8°C. Produkt odsączono i przemyto wodą. Następnie kryształy wysuszono w temperaturze 40°C w ciągu 60 minut. Czystość otrzymanej w wyniku simwastatyny (1,7 g) wynosiła 99,73%.

P r zyk ł a d 5

Nieoczyszczoną mewastatynę (2,0 g) w postaci laktonu, o czystość 98,5% określonej za pomocą HPLC rozpuszczono w acetonie (7 ml) i dodano 20 ml wody. W wyniku uzyskano oleisty produkt, który wykrystalizował następnie w ciągu 10 minut. Otrzymane kryształy następnie odsączono, przemyto wodą i suszono w temperaturze 40°C w ciągu 60 minut. Otrzymane w wyniku kryształy (1,8 g), o czystości określonej za pomocą HPLC i wynoszącej 99,33%, rozpuszczono następnie w octanie etylu (8 ml). Uzyskany w wyniku roztwór zatężono do objętości 4 ml i mewastatynę pozostawiono do krystalizacji na 60 minut w temperaturze 8°C. Produkt odsączono i przemyto wodą. Następnie kryształy wysuszono w temperaturze 40°C w ciągu 60 minut. Czystość otrzymanej w wyniku mewastatyny (1,3 g) wynosiła 99,72%.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób izolowania i oczyszczania inhibitorów reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo koenzymu A - HMG-CoA, znamienny tym, że obejmuje poddawanie inhibitora reduktazy HMG-CoA połączonym etapom krystalizacji, obejmującym krystalizację z mieszającego się z wodą lub rozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego i krystalizację z rozpuszczalnika organicznego wykazującego ograniczoną zdolność do mieszania się z wodą lub rozpuszczania się w wodzie, do uzyskania inhibitorów reduktazy HMG-CoA o czystości większej niż 99,6%.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymane inhibitory reduktazy HMG-CoA posiadają czystość wyższą niż 99,7%.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako mieszający się z wodą lub rozpuszczalny w wodzie rozpuszczalnik organiczny stosuje się aceton lub niższy alkohol alkilowy.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że krystalizacja obejmuje wymywanie inhibitora HMG-CoA acetonem, a następnie dodawanie do niego wody.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krystalizacja z rozpuszczalnika organicznego o ograniczonej zdolności mieszania się z wodą lub rozpuszczalności w wodzie obejmuje wymywanie inhibitora reduktazy HMG-CoA w stężeniu od 10 do 35 g/litr rozpuszczalnikiem organicznym i usuwanie od jednej trzeciej do trzech czwartych wspomnianego rozpuszczalnika organicznego.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny o ograniczonej zdolności mieszania się z wodą lub rozpuszczalności w wodzie stosuje się octan etylu.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitorem reduktazy HMG-CoA jest lowastatyna.
8. Sposób izolowania i oczyszczania inhibitorów reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo koenzymu A - HMG-CoA z biomasy grzybni, znamienny tym, że

PL 193 510 B1

- klaruje się brzeczkę grzybni i zatęża sklarowaną brzeczkę do mniejszej objętości,

- koncentrat zakwasza się do wartości pH w zakresie od 4,5 do 7,5, a następnie przeprowadza się ekstrakcję inhibitora reduktazy HMG-CoA octanem etylu,

- ewentualnie przeprowadza się laktonizację,

- przeprowadza się krystalizację z mieszającego się z wodą lub rozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego, oraz

- przeprowadza się krystalizację z rozpuszczalnika organicznego posiadającego ograniczoną zdolność mieszania się z wodą lub rozpuszczalność w wodzie

- do uzyskania inhibitorów reduktazy HMG-CoA o czystości większej niż 99,6%
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że przed klarowaniem brzeczki biomasy grzybni, inhibitor reduktazy HMG-CoA wymywa się z biomasy grzybni do płynu fermentacyjnego przy wartości pH w zakresie pomiędzy 9,5 a 13 i doprowadza się pH brzeczki do wartości pomiędzy 7,5 a 8,5.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wymywanie przeprowadza się w temperaturze w zakresie od 10 do 40°C w czasie krótszym niż jedna godzina.
11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że klarowanie brzeczki grzybni przeprowadza się przez usunięcie grzybni z brzeczki poprzez sączenie.
12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że sklarowaną brzeczkę zatęża się wykorzystując odwróconą osmozę.
13. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że koncentrat zakwasza się do pH o wartości w zakresie od 5,5 do 7,5.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że koncentrat zakwasza się do pH o wartości w zakresie od 6,0 do 7,0.
15. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że inhibitor reduktazy HMG-CoA, który ekstrahuje się z octanu etylu i ewentualnie laktonizuje, oczyszcza się przy wykorzystaniu chromatografii adsorpcyjnej.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako fazę ruchomą w chromatografii adsorpcyjnej wykorzystuje się mieszaninę acetonitrylu i wody.
17. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że kolejność etapów krystalizacji jest odwrócona.
18. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że inhibitorem reduktazy HMG-CoA jest lowastatyna.