PL194096B1

PL194096B1 - Zastosowanie wyciągów z roślin irysa, Cimicifuga racemosa i wyciągów zawierających tektorygeninę i/lub glikozyd tektorygeniny albo wyciągów wzbogaconych tektorygeniną i/lub glikozydem tektorygeniny do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego

Info

Publication number: PL194096B1
Application number: PL99342486A
Authority: PL
Inventors: Wolfgang Wuttke; Hubertus Jarry; Volker Christoffel; Barbara Spengler; Michael Popp
Original assignee: Bionorica Ag
Priority date: 1998-03-19
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2007-04-30
Also published as: RU2003137324A; PT1064009E; JP2002506827A; WO1999047149A1; CN1509712A; CA2321444A1; EP1064009B9; ES2184427T3; HK1035660A1; DE59902932D1; HUP0200921A2; CZ292684B6; RU2263505C2; AU755900C; HU227694B1; CN1293575A; BR9908256A; EP1064009A1; JP2010132699A; HUP0200921A3

Abstract

1. Zastosowanie wyciagów z roslin irysa (Iridaceae ÷ kosaccowate) do wytwarzania estroge- noidowego organoselektywnego srodka leczniczego, o braku dzialania uterotropowego lub przynaj- mniej o pomijalnym dzialaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych nie- doborem estrogenu, zwlaszcza miazdzycy naczyn, i osteoporozy. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyciągów z roślin irysa, Cimicifuga racemosa i wyciągów, zawierających tektorygeninę i/lub glikozyd tektorygeniny albo wyciągów wzbogaconych tektorygeniną i/lub glikozydem tektorygeniny do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego.

Utworzony w jajnikach 17p-estradiol (jeśli następnie mówi się o estradiolu, to zawsze ma się na myśli fizjologiczny 17p-estradiol) (następnie zwany też skrótowo E2) ma w organizmie działanie ogólnie sprzyjające rozmnażaniu. Obok sterowania cyklem kobiety wykazuje on homeostatyczny wpływ na metabolizm kości i przeszkadza powstawaniu aterotycznych płytek na śródbłonku naczyń.

W menopauzie dochodzi do obniżenia poziomu estradiolu w następstwie wygaśnięcia czynności jajników. Wynikiem tego jest osłabienie procesów proliferacyjnych i doprowadzenie w podwzgórzu do wzmocnienia aktywności generatora impulsów-GnRH. (Generator impulsów gonadotropinowego uwalniającego hormonu podwzgórza + „Gonadotropin-Releasing-Hormon-Pulsgenerator” jest rodzajem generatora impulsów w podwzgórzu i podaje takt wydzielania LH (hormonu luteinizującego), przy czym steroidy wywierają wpływ na amplitudę i częstotliwość). Wynikowe stymulowane wydzielanie-LH prowadzi w przypadku kobiety klimakterycznej do zaburzeniowo odczuwanych, narastających uderzeń gorąca, tak zwanego „Hot flushes” (nagłych zaczerwienień twarzy).

Pod nieobecność wystarczająco wysokiego poziomu estradiolu w krwi przeważa w tkance kostnej aktywność osteoklastów i tym samym przemiana wsteczna masy kostnej, której towarzyszy zwiększone niebezpieczeństwo złamania kośćca. Równocześnie istnieje długoterminowo niebezpieczeństwo tworzenia się płytek w układzie naczyniowym i tym samym podwyższone ryzyko zawału.

Zarówno o wyciągach z Cimicifuga racemosa jak i z Belamcanda chinensis wiadomo w medycynie ludowej, że mogą one łagodzić dolegliwości okołomenopauzalne i pomenopauzalne. Dotychczas sprowadzało się to do tego, że wyciągi obu roślinnych leków wykazują estrogenoidowe działanie wraz z wszystkimi jego pozytywnymi oddziaływaniami na szereg narządów ustroju ludzkiego, zwłaszcza na mózg, jajeczniki, kości i układ naczyniowy. Niekorzystnymi byłyby estrogenoidowe oddziaływania na macicę, pochwę, tkankę piersiową, i wątrobę. Niepożądane w tym jest jednak to, że w stanie techniki nie było dotychczas do dyspozycji żadnego środka leczniczego, który można byłoby stosować do organoselektywnego zapobiegania i leczenia w przypadku niedoboru estrogenu.

Opis DE 196 52 182 C1 ujawnia tylko zastosowanie wyciągu z Cimicifuga racemosa w połączeniu z antyestrogenową substancją czynną do zwalczania zależnych od estrogenu nowotworów. Przy tym działanie tej antyestrogenowej substancji czynnej potęguje się dzięki równoczesnemu podawaniu wyciągu z Cimicifuga racemosa. Opis DE 196 52 182 C1 ani nie docenia organoselektywnego wyciągów z Cimicifuga racemosa ani pomijalnego działania uterotropowego tych wyciągów. Opis ten ponadto nie dotyczy ani roślin irysa ani tektorygeniny i/lub glikozydów tektorygeniny.

Publikacja WO 97/09056 dotyczy zastosowania wyciągów z irysa jako substancji CGRP- i/lub P-antagonistycznej. Według tej publikacji zaleca się uzupełniające dodawanie estrogenów lub estradiolu do wyciągów z roślin irysa. Samo estrogenoidowe działanie tych wyciągów nie zostało w tej publikacji omówione. Również nie omówiono w niej organoselektywności i/lub pomijalnego działania uterotropowego tych wyciągów. Wreszcie publikacja ta nie dotyczy ani wyciągów z Cimicifuga racemosa, ani tektorygeniny i/lub glikozydów tektorygeniny.

Reasumując opis DE 196 52 182 C1 i publikacja WO 97/09056 omijają rozwiązanie według wynalazku i w niczym go nie sugerują.

Wychodząc z tego stanu techniki jest zatem zadaniem niniejszego wynalazku postawienie do dyspozycji roślinnego środka leczniczego, który wykazywałby organoselektywne działanie bez lub z tylko pomijalnym działaniem na macicę.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyciągów z roślin irysa (Iridaceae + kosaćcowate) do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego, o braku działania uterotropowego lub przynajmniej o pomijalnym działaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych niedoborem estrogenu, zwłaszcza miażdżycy naczyń, i osteoporozy.

Korzystnie stosuje się wyciągi wytworzone z Belamcanda chinensis.

Dalej przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyciągów z Cimicifuga racemosa do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego, o braku działania uterotropowego lub przynajmniej o pomijalnym działaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych niedoborem estrogenu, zwłaszcza miażdżycy naczyń, i osteoporozy.

PL 194 096 B1

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyciągów, zawierających tektorygeninę i/lub glikozyd tektorygeniny albo wyciągów wzbogaconych tektorygeniną i/lub glikozydem tektorygeniny, do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego, o braku działania uterotropowego lub przynajmniej o pomijalnym działaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych niedoborem estrogenu, zwłaszcza miażdżycy naczyń, i osteoporozy.

Kolejnym przedmiotem według wynalazku jest zastosowanie tektorygeniny (tj. 5,7-dwuhydroksy-3-(4-hydroksyfenylo)-6-metoksy-4H-1-benzopiran-4-onu) i/lub jej glikozydów do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego, o braku działania uterotropowego lub przynajmniej o pomijalnym działaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych niedoborem estrogenu, wybranych spośród miażdżycy naczyń, osteoporozy.

Podczas prób in vitro i in vivo okazało się nieoczekiwanie, że wyciągi, wytworzone zarówno z roślin irysa (Iridaceae), zwłaszcza Belamcanda chinensis, jak i z Cimicifuga racemosa za pomocą rozpuszczalników organicznych lub dwutlenku węgla w stanie nadkrytycznym, działają organoselektywnie na ośrodkowy układ nerwowy i na układ naczyniowy, przy czym brakuje działania na macicę, czyli tak zwanego działania uterotropowego. Stosowane według wynalazku wyciągi są zatem odpowiednie do wytwarzania gotowo sporządzonego środka do selektywnego leczenia i/lub zapobiegania osteoporozie.

Nadto są one odpowiednie do wytwarzania gotowo sporządzonego środka do selektywnego leczania i/lub zapobiegania schorzeniom sercowo-naczyniowym, zwłaszcza miażdżycy naczyń.

Dalej mogą się one nadawać do wytwarzania gotowo sporządzonego środka do selektywnego leczenia i/lub zapobiegania okołomenopauzalnym i pomenopauzalnym dolegliwościom psychowegetatywnym, takim jak np. uderzenia gorąca.

Stwierdzono ponadto, że wyodrębniony z Belamcanda chinensis składnik o nazwie tektorygenina i o niżej podanym wzorze, to znaczy 5,7-dwuhydroksy-3-(4-hydroksyfenylo)-6-metoksy-4H-1-benzopiran-4-on, wykazuje zasadniczo takie same działania jak wyciąg całkowity.

Składnik ten, tj. tektorygenina, oprócz w Belamcanda chinensis znajduje się w dalszych roślinach irysa, takich jak np. Iris germanica, I. tectorum, I. illyrica, I. dichotoma.

Z taksonomicznego punktu widzenia zaszeregowanie Belamcanda chinensis przedstawia się następująco:

Rząd:	Liliales
Rodzina:	Iridaceae
Rodzaj:	Belamcanda
Gatunek	Belamcanda chinensis (Leman) DC.= Pardanthus chinensis (L.) Ker-Gawler a także
Ixia chinensis L. (=Gemmingia chinensis (L.) O. Kuntze)

W celu wytwarzania wyciągów korzystnie stosuje się kłącza, łodygi, liście i/lub działki okwiatu.

Podstawowe omówienie fitochemiczne Belamcanda chinensis i jej składników nastąpiło w dysertacji Pani A. Nenninger: (LMU Monachium, 1997) pod tytułem „Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen von Belamcanda chinensis, einer Arzneipflanze der TCM und anderer Irisarten”.

Za pomocą środków leczniczych wytworzonych według wynalazku istnieje po raz pierwszy do dyspozycji środek z Cimicifuga racemosa i Belamcanda chinensis i innych gatunków irysa oraz środek na bazie tektorygeniny, które funkcjonują jak zupełne substancje antagonistyczne wobec receptora estrogenu w kościach, układzie sercowo-naczyniowym i mózgu.

Dalsze zalety i cechy niniejszego wynalazku wynikają z omówienia danych doświadczalnych oraz na podstawie rysunku.

Ukazuje on:

fig. 1: Porównanie wodnej i organicznej fazy Cimicifuga racemosa. Krzywe rugowania reprezentatywnego testu receptor estrogenu - wiązanie się ligandów. Stężenie roztworu wyjściowego jest równe 17,66 mg/ml. Następują rozcieńczenia 1:2, 1:4 itd. do 1:64,

PL 194 096 B1 fig. 2: Surowica LH przed i 2 godziny po dożylnym wstrzyknięciu wyciągu z Belamcanda chinensis, E2 i środka nadającego postać lekowi. Wyciąg z Belamcanda chinensis ma zdolność obniżania podwyższonego poziomu surowicy LH podobną jak E2, fig. 3: Działania Cimicifuga racemosa i E2 na masę macicy (fig. 3a) i poziom LH we krwi (fig. 3b) u szczurów z usuniętymi jajnikami, po siedmiodniowym leczeniu podskórnym; (średnia wartość + SEM, n=8, *= p<0,05 vs. Cremophor jako środek nadający postać lekowi);

fig. 3a: Masa macicy; fig. 3b: Stężenia LH we krwi;

fig. 4a: Działania Cimicifuga racemosa i E2 u szczurów z usuniętymi jajnikami, po siedmiodniowym leczeniu podskórnym; (średnia wartość + SEM, n=8, *=p<0,05 vs. Cremophor jako środek nadający postać lekowi) na ekspresję mRNA dla E2-receptora α w przedoptycznym regionie podwzgórza;

fig. 4b: Ekspresja mRNA dla IGF1 i C3 w macicy szczurów z usuniętymi jajnikami, po 7 dniach podawania podskórnego; i fig. 4c: Ekspresja mRNA dla kolagenu 1 (Coll1) i osteokalcyny w kościach szczurów z usuniętymi jajnikami, po 7 dniach podawania podskórnego.

Doświadczalne stwierdzenia estrogenicznego działania Cimicifuga racemosa i Belamcanda chinensis

Stwierdzanie selektywnego działania estrogenicznego prowadzono stopniowo w szeregu różnych kompleksowych układów testowych.

1. Próby in vitro

1.1 Próby in vitro dla Cimicifuga racemosa

Rozpoznanie estrogenoidowej struktury składników przez przeciwciało skierowane przeciwko 17p-estradiolowi (=E2) pokazano in vitro. Wyciąg Cimicifuga racemosa doprowadza się do sucha. Przez międzyfazowe rozproszenie w dwuchlorometanie i wodzie nagromadzono substancje o różnej polarności. Powinowactwo wiązania się składników obu faz określono in vitro na receptorach estrogenu z macicy świni. Cytosolowe receptory estrogenu z macicy świń wyodrębniano weług standartowych procedur i stosowano do eksperymentów wypierania ligandów.

Stwierdzono przy tym, że estrogenoidowe struktury np. z Cimicifuga racemosa nie są natury hydrofilowej lecz lipofilowej, gdyż można je z wyciągu ekstrahować rozpuszczalnikiem organicznym. Substancje, które znajdują się w fazie ekstrahowanej organicznie, wiążą się około dziesięciokrotnie silniej z przeciwciałem niż substancje pozostające w fazie wodnej.

Jeszcze większą jest różnica między tymi obiema fazami w teście wiązania się estradiol-receptor. Podobieństwo wiążącej się substancji z estradiolem musi być tak duże, żeby w bezkomórkowym preparacie mogła zachodzić selektywna - kompetycyjna interakcja z receptorem estradiolu. W tym układzie testowym faza wodna nie wykazuje żadnej aktywności, natomiast faza organiczna wiąże się bardzo silnie z receptorem.

Wyniki są pokazane na fig. 1.

1.2 Belamcanda chinensis in vitro

Z innych badań wiadomo, że wyciągi z Belamcanda chinensis wykazują również składniki, które rozpoznaje przeciwciało przeciwko 17p-estradiolowi i które wiążą się z receptorem 17p-estradiolu (porównaj Nenninger, jak podano wyżej). Nieoczekiwanie twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili jednak, że wyciągi te na różne układy narządów oddziaływują różnie estrogenowo i że nie działają one uterotropowo.

2. Próby in vivo

Stwierdzenie estrogenowego działania u szczurów z usuniętymi jajnikami

Wiązanie się z receptorem E2 jest bardzo selektywne; nie można jednak wypowiedzieć się, czy dołączające się procesy w komórce sprzyjają czy hamują, tj. czy substancja jest agonistyczna czy antagonistyczna. Właściwość tę można określić tylko w odpowiednich układach komórkowych albo w całym ustroju zwierzęcia.

Szczur z usuniętymi jajnikami jest uznanym modelem dla kobiety pomenopauzalnej, u której endogenne wytwarzanie estradiolu uległo załamaniu. Dzięki doprowadzeniu z zewnątrz 17p~estradiolu lub substancji, które działają estrogenoidowo, dochodzi do odrestaurowania wrażliwych na estrogen parametrów anatomiczno-morfologicznych, takich jak przyrost masy macicy, i do wystąpienia zrogowaciałych komórek nabłonkowych, tj. komórek nabłonkowych Scholla na nabłonku pochwy, lub zmian hormonalnych, takich jak obniżenie poziomu-LH we krwi leczonych zwierząt.

PL 194 096 B1

Wszystkie, następnie omówione próby przeprowadzono na szczurach rasy Sprague-Dawley z usuniętymi jajnikami (= szczury-ovx), wykazujących masę 240-280 g.

2.1 Jednorazowe podanie Belamcanda chinensis

Wystąpienie estradioloidowego działania wyciągu z Belamcanda chinensis następuje bardzo szybko. Już po jednokrotnym dożylnym podaniu środka nadającego postać lekowi, estradiolu i wyciągu z Belamcanda chinensis szczurom-ovx ustaje pulsowalność wobec E2 jak i wobec Belamcanda chinensis. W przebiegu wartości średniej wynikają wyraźne zahamowania poziomu surowicy-LH, zarówno w porównaniu z wartościami wstępnymi jak i w porównaniu ze sprawdzianowymi zwierzętami leczonymi Cremophor'em. Cremophor jest emulgatorem na bazie polietoksylowanych pochodnych oleju rącznikowego.

Wyniki zestawiono na fig. 2.

W macicy zwierząt po upływie 6 godzin od wstrzyknięcia wyciągu z Belamcanda chinensis nie zmieniona jest ekspresja macicznych genów-VEGF, -IGF1 i -C3 w porównaniu ze sprawdzianami, podczas gdy wstrzyknięcie estradiolu ma w następstwie wyraźne podwyższenie genowej ekspresji tych trzech protein regulowanych estrogenem. Na konstytucjonalnie podległy ekspresji gen-CCO nie wywiera wyraźnego wpływu żadne z tych traktowań.

Wyniki badań wskazują, że składniki Belamcanda chinensis w podwzgórzowych strukturach estrogeno-recepcyjnych powodują zahamowanie generatora impulsów-GnRH i tym samym mają działania agonistyczne wobec estrogenu. Dzięki temu przysadkowe wydzielanie-LH wyraźnie hamuje się zarówno przez składniki w Belamcanda chinensis jak i przez estradiol. W przeciwieństwie do estradiolu składniki w Belamcanda chinensis nie mają żadnego działania uterotropowego. Estradiol wyraźnie reguluje ekspresję genów VEGF, IGF1 i C3, tj. efekt, którego nie obserwuje się w warunkach Balamcanda chinensis.

Przeprowadzenie ostrej próby działania dożylnego wstrzyknięcia wyciągu z Belamcanda chinensis szczurom (np.8 zwierząt/grupę) w przeddzień próby wszczepiano w warunkach narkozy eterowej cewnik żyły szyjnej. W dniu próby pobierano 6 próbek krwi w odstępach 10-minutowych. Bezpośrednio po pobraniu 6-tej próbki dożylnie wstrzykiwano 62,5 mg wyciągu Belamcanda chinensis lub 10 pg 17p-estradiolu (E2) bądź rozpuszczalnik (5%) Cremophor w izotonicznym NaCl 1 ml) i w ciągu dalszych 2 godzin pobierano w odstępach 10-minutowych próbki krwi. Po upływie 6 godzin od dożylnego podania zwierzęta dekapitowano, pozyskiwano krew i pobierano macicę, ważono i zamrażano w ciekłym azocie.

2.2 Jednorazowe podanie tektorygeniny

Po jednorazowym podaniu tektorygeniny określono czasowy przebieg wywierania wpływu na poziom-LH we krwi i estradiolopodobną immunoreaktywność. Stężenie tektorygeniny we krwi zwierząt, określone za pomocą E2-RLA, odpowiadało po upływie 20 minut około 100 pg równoważnika estradiolu.

Tektorygenina wywołuje szybkie obniżenie poziomu-LH. Przy tym kinetyka osiągniętego w obecności tektorygeniny obniżenia-LH odpowiada, aż do momentu upływu 60 minut od podania dożylnego, obnizeniu-LH w obecności estradiolu, jednak następnie nie prowadzi do żadnego dalszego obniżania, lecz powoli wzrasta ponownie.

Przeprowadzenie: szczurom-ovx w narkozie eterowej na 24 godziny przed rozpoczęciem prób wkłada się cewnik w żyłę szyjną zewnętrzną według metody Harms'a i Ojeda'ego (Harms PG; Ojeda SR: A rapid and simpleprocedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. J. Appl. Physiol. (1974) 36: 391-392). Koniec węża przełożono do kieszeni skórnej w karku. Aby dla uzyskania próbek krwi nie musieć poruszać zwierząt, przedłużano cewnik wężem silikonowym. Cewnik i wąż spłukano roztworem Ringera, zawierającym 50 IU heparyny/ml.

Od zwierząt w 10-minutowych odstępach pobierano próbki krwi rzędu 100 pl, a pobraną objętość zastępowano roztworem Ringer/heparyna. Po 6-tej próbce aplikuje się dożylnie 1,0 ml danego roztworu testowego. Jako roztwory testowe stosowano: 2% Cremophor (=roztwór środka nadającego postać lekowi), tektorygenina 7 mg/ml środka nadającego postać lekowi, 17p-estradiol 10 pg/ml środka nadającego postać lekowi. Pobieranie krwi następowało w 10-minutowych odstępach w ciągu dalszych 140 minut.

Tak uzyskanymi próbkami krwi napełniano naczynko reakcyjne Eppendorfa o pojemności 0,5 ml, zawierające 10 pl roztworu heparyny (5000 lU/ml, Liquemin), odwirowywano w ciągu 10 minut przy 10000* g, i osocze przechowywano w temperaturze -20°C aż do przeprowadzenia testu radioimmunologicznego. RlAs dla LH i prolaktyny bazują na przeciwsurowicach, preparatach referencyjnych i pre6

PL 194 096 B1 paratach jodowania NIH (Bethseda, Maryland, Stany Zjednoczone Ameryki). Stężenie estradiolu i krzyżowo reagujących izoflawonów mierzono za pomocą RIA firmy DPC, Bad Neuheim.

2.3 Działanie wyciągu z Belamcanda chinensis po podawaniu w ciągu 7 dni

Oddziaływania powtarzanych dawek estradiolu, wyciągu z Belamcanda chinensis i środka nadającego postać lekowi na masę całkowitą, masę macicy, poziom hormonu i genową aktywację macicy i kości badano na szczurach z usuniętymi jajnikami po codziennej podskórnej aplikacji w ciągu 7 dni.

Średnie masy ciała zwierząt traktowanych Cremophor'em i Belamcanda chinensis nie różnią się, natomiast zwierzęta traktowane za pomocą E2 były wyraźnie lżejsze. Również masy macicy zwierząt traktowanych Cremophor'em i Belamcanda chinensis nie różnią się wyraźnie, natomiast traktowanie za pomocą E2 więcej niż potraja masę macicy.

Poziomy surowicy-LH w przypadku zwierząt traktowanych za pomocą Belamcanda chinensis były nieznaczne, ale w porównaniu ze sprawdzianami Cremophor'owymi wyraźnie zredukowane; wyraźniejsza była redukcja przez estradiol.

W macicznym ekstrakcie-mRNA estradiol po jednotygodniowym traktowaniu wyraźnie podwyższał genową ekspresję VEGF do 149% wartości sprawdzianowej. W obecności wyciągu z Belamcanda chinensis ekspresja ta była lekko, ale nie wyraźnie podwyższona. Na ekspresję nie regulowanego estrogenowo, konstytucjonalnego genu dla cytochromooksydazy (Cytochrom C Oxidase = CCO) nie był wywierany wpływ.

W ekstraktach z głowy kości udowej określano ekspresję kolagen—1 Α1—, osteokalcyna- -IGF1oraz TGFp-mRNA. Estradiol jak i Belamcanda chinensis wyraźnie inhibitują tę ekspresję wszystkich 4 genów bez wywierania wpływu na konstytucjonalny gen-CCO.

Różne działanie estradiolu i Belamcanda znajduje bardzo dobitny wyraz po siedmiodniowym traktowaniu. Wyciąg z Belamcanda chinensis ma agonistyczny względem estradiolu wpływ na przysadkowe wydzielanie-LH wskutek zahamowania generatora impulsów-GnRH oraz na genową ekspresję czterech estrogenowo regulowanych genów w kościach. Natomiast nie istnieje żadne działanie estrogenowe na macicę: ani masa macicy ani estrogenowo regulowany gen-VEGF nie ulegają wpływowi wyciągu z Belamcanda chinensis. W przeciwieństwie do tego estradiol prowadzi do nabrzmienia macicy i do aktywacji genu-VEGF.

Przeprowadzenie podskórnych prób działania codziennego wstrzyknięcia w ciągu 7 dni:

Każdorazowo 8 zwierzętom w grupie doświadczalnej (łącznie 24) codziennie między godziną 08.00 a 09.00 podskórnie wstrzykiwano 62,5 mg wyciągu z Belamcanda chinensis bądź 10 pg estradiolu lub rozpuszczalnik (5% Cremophor, 1 ml). Po upływie 6 godzin od ostatniej aplikacji zwierzęta dekapitowano i z każdego zwierzęcia pobierano aortę, macicę i główkę lewej kości udowej, oczyszczano i zamrażano w ciekłym azocie.

W próbkach krwi określano LH i immunoreaktywność estradiolu.

2.4 Powtarzane podawanie Cimicifuga racemosa

Najwcześniej po upływie 14 dni od usunięcia jajników zwierzęta otrzymywały podskórne wstrzyknięcie danej substancji badanej w dawce 62,5 mg Cimicifuga racemosa/szczur albo 8 pg estradolu/szczur raz dziennie rano w ciągu 7 dni. Obie substancje były rozpuszczone w 5% Cremophofu, zwierzęta sprawdzianowe otrzymywały tylko środek nadający postać lekowi.

Po zdekapitowaniu zwierząt preparowano mózg, macicę i kość udową dla pozyskania mRNA. W krwi tych zwierząt określano stężenie-LH za pomocą RIA. Ekspresję estrogenowo regulowanych genów w wyżej omówionych narządach określano za pomocą półilościowej RT-PCR.

Macice zwierząt traktowanych estradiolem są więcej niż trzykrotnie cięższe od macic zwierząt traktowanych za pomocą Cimicifuga racemosa i środka nadającego postać lekowi, które w swych wartościach średnich praktycznie nie różnią się. Oznacza to, że składniki Cimicifuga racemosa na mają żadnego wpływu na macicę zwierząt. Obowiązuje to również dla pochwy, gdzie w przypadku zwierząt traktowanych za pomocą Cimicifuga racemosa i środka nadającego postać lekowi nie występuje zrogowacenie tkanki nabłonka, zupełnie przeciwnie niż u zwierząt traktowanych estradiolem.

Poziom-LH u zwierząt traktowanych środkiem nadającym postać lekowi pozostają wysokie, natomiast wyraźnie obniżają się one zarówno dzięki estradiolowi jak i dzięki Cimicifuga racemosa.

Wyniki pokazano na fig. 3a i 3b.

PL 194 096 B1

Masy macicy (wilgotne)

	Cremopho (sprawdzian)	Cimicifuga racemosa	E2
Liczba zwierząt	8	8	8
Wartość średnia (ml)	185,6	192,3	702,1
SD	18,81	22,53	194,97
SEM	6,65	7,97	68,92

Stężenia-LH we krwi

	Cremophor (sprawdzian)	Cimicifuga racemosa	E2
Liczba zwierząt	8	8	8
Wartość średnia (ng/ml)	16,9	12,5	7,83
SD	3,99	3,4	5,57
SEM	1,41	1,2	1,97

Jako dalsze znaczniki dla działania estrogenowego mierzono aktywację mRNA z estrogenowo indukowalnych protein. Badano przy tym tkankę z macicy, z tkanki kostnej (kość udowa) i z przedoptycznego regionu podwzgórza.

W podwzgórzu zarówno Cimicifuga racemosa jak i E2 stymulują ekspresję mRNA dla estrogenowego receptora α (fig. 4a). Również w tkance kostnej zachowuje się Cimicifuga racemosa tak, jak estrogen, i zmniejsza analogicznie do estradiolu ekspresję mRNA dla swoistego kościom kolagenu 1 i dla genu osteokalcyny (fig. 4b).

W przeciwieństwie do tego nie obserwuje się żadnego działania Cimicifuga racemosa na estrogenowo regulowane geny w macicy. Tylko estradiol podwyższa mRNA dla IGF1 i czynnika komplementarnego C3 (fig. 4c).

Te wyniki badań dowodzą, że składniki Cimicifuga racemosa selektywnie działają na poszczególne narządy: wyciąg ten działa estrogenowo w podwzgórzu (ekspresja E2-recepptora α, uwolnienie LH) i w kościach, co wykazano przez ekspresję tych genów dla kolagenu 1 i osteokalcyny. W przeciwieństwie do estradiolu jednak Cimicifuga racemosa nie wykazuje żadnego działania na macicę, jak to pokazuje brakujące działanie na masę macicy i na ekspresję genów dla IGF1 i C3.

Za pomocą doświadczeń przeprowadzonych in vitro i in vivo można wykazać, że wyciągi z Cimicifuga racemosa i z Belamcanda chinensis wywierają działanie estrogenowe. Nieoczekiwanie stwierdzono, że wyciągi z tych leków działają organoselektywnie na ośrodkowy układ nerwowy, kości i naczynia, lecz nie na macicę i tym samym znakomicie nadają się do profilaktyki i leczenie niedoborów estrogenu bez wywierania negatywnego wpływu na błonę śluzową macicy.

Identyczne efekty osiąga się dzięki tektorygeninie zawartej w Belamcanda.

Tym samym są po raz pierwszy do dyspozycji środki lecznicze, które wykazują estrogenoidowe działanie, lecz bez działania uterotropowego.

Tego rodzaju środki lecznicze można stosować do leczenia i/lub profilaktyki schorzeń sercowo-naczyniowych, zwłaszcza miażdżycy, osteoporozy oraz dolegliwości okołomenopauzalnych i pomenopauzalnnych, takich jak np. uderzenia gorącą.

Jako rodzaje aplikacji wchodzą w rachubę przed wszystkim aplikacja doustna, dożylna i podskórna.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie wyciągów z roślin irysa (Iridaceae * kosaćcowate) do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego, o braku działania uterotropowego lub przynajmniej o pomijalnym działaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych niedoborem estrogenu, zwłaszcza miażdżycy naczyń, i osteoporozy.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się wyciągi wytworzone z Belamcanda chinensis.
3. Zastosowanie wyciągów z Cimicifuga racemosa do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego, o braku działania uterotropowego lub przynajmniej o pomijalnym działaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych niedoborem estrogenu, zwłaszcza miażdżycy naczyń, i osteoporozy.
4. Zastosowanie wyciągów, zawierających tektorygeninę i/lub glikozyd tektorygeniny albo wyciągów wzbogaconych tektorygeniną i/lub glikozydem tektorygeniny, do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego, o braku działania uterotropowego lub przynajmniej o pomijalnym działaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych niedoborem estrogenu, zwłaszcza miażdżycy naczyń, i osteoporozy.
5. Zastosowanie tektorygeniny i/lub jej glikozydów do wytwarzania estrogenoidowego organoselektywnego środka leczniczego, o braku działania uterotropowego lub przynajmniej o pomijalnym działaniu uterotropowym, do leczenia lub profilaktyki stanów uwarunkowanych niedoborem estrogenu, wybranych spośród miażdżycy naczyń, osteoporozy.