PL194813B1

PL194813B1 - Sposób jednoczesnego testowania wielu próbek różnych substancji pod względem ich zdolności wzmagania bądź hamowania procesu biologicznego

Info

Publication number: PL194813B1
Application number: PL341655A
Authority: PL
Inventors: Bruce A. Beutel; Mark E. Schurdak; Martin J. Voorbach; David J. Burns; Mary K. Joseph
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2007-07-31
Also published as: PT1038179E; CA2310684C; DE69835537T2; CA2310684A1; ES2270539T3; EP1038179A2; SK286095B6; DK1038179T3; HUP0100207A2; JP4558197B2; HUP0100207A3; NO326662B1; TW555967B; NO20002079L; KR20010024709A; CZ299740B6; HK1032996A1; CZ20002078A3; CN101256187A; ATE336001T1

Abstract

1. Sposób jednoczesnego testowania wielu próbek róznych substancji pod wzgledem ich zdol- nosci wzmagania badz hamowania procesu biologicznego, znamienny tym, ze: a) osadza sie w sposób uporzadkowany niewielkie objetosci kazdej z wiecej niz 96 próbek po- szczególnych substancji na plaskie, porowate podloze zawierajace lub niosace jednolicie rozprowa- dzony odczynnik testowy w taki sposób, iz kazda poszczególna substancja usytuowana jest na przy- pisanym jej, poszczególnym obszarze i tozsamosc kazdej z substancji mozna okreslic na podstawie jej miejsca osadzenia oraz pozostawia sie osadzone próbki umozliwiajac ich powolna dyfuzje w pla- skim, porowatym podlozu, przy czym próbki poruszaja sie niezaleznie, b) obserwuje sie oddzialywanie kazdej substancji z odczynnikiem testowym, które koreluje sie ze zdolnoscia badanej substancji do wzmagania lub hamowania procesu biologicznego. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób jednoczesnego testowania wielu próbek różnych substancji pod względem ich zdolności wzmagania bądź hamowania procesu biologicznego.

Wysokowydajny skrining w układzie ciągłym (CF-HTS) wykorzystuje co najmniej jedno porowate podłoże i umożliwia jednoczesne przeszukiwanie dużej liczby związków chemicznych pod względem szerokiego zakresu aktywności biologicznej lub chemicznej w przemyśle farmaceutycznym. Ponadto CF-HTS jest użyteczny przy wykonywaniu wieloetapowych testów (multi-step assays).

Testy biochemiczne i biologiczne zaprojektowane są w celu testowania aktywności w szerokim zakresie układów, obejmujących zarówno oddziaływania białko - białko, katalizę enzymatyczną, wiązanie niskocząsteczkowych kofaktorów, do funkcji komórkowych. W skriningu wysokowydajnym (HTS) testy te wykorzystywane są do testowania wielkiej liczby związków chemicznych w celu wykrycia uprzednio nieznanych biologicznych lub biochemicznych aktywności wspomnianych związków chemicznych.

Testy homogenne versus heterogenne

Wszystkie rodzaje testów biologicznych można podzielić na dwie zasadnicze klasy: testy homogenne i testy heterogenne. W testach homogennych wszystkie odczynniki dodawane są razem i wyniki mierzone są lub interpretowane bez dodatkowych manipulacji. Na przykład komórki rosnące na szalce Petriego mogą być wystawione na działanie związku chemicznego. Jeżeli wspomniany związek chemiczny jest toksyczny dla komórek, strefa przejaśnienia wskazuje na toksyczność, co można zaobserwować bez konieczności stosowania dodatkowych manipulacji. Na przykład, można również wykorzystać komórki eksprymujące białko zmieniające kolor komórek. W przypadku komórek eksprymujących beta-galaktozydazę (b-gal) i wzrastających na agarze zawierającym x-gal, komórki stają się mniej lub bardziej niebieskie w zależności od tego, jak wiele białka b-gal ulega ekspresji. Można zatem skonstruować test homogenny dla badania dowolnego procesu biologicznego wpływającego na ekspresję genu reporterowego, takiego jak gen beta-galaktozydazy. Kolejny przykład testu homogennego obejmuje test wykorzystujący substrat zmieniający kolor lub fluorescencję pod wpływem działania enzymu. Również, technologie takie jak zbliżeniowy test scyntylacyjny (Scintillation Proximity Assay, SPA firmy Amersham) mierzą bezpośrednio wiązanie wyznakowanego radioaktywnie liganda do białka lub dowolnej substancji wiążącej ligand związanej z kuleczkami zawierającymi mieszaninę scyntylacyjną. Wymienione wyżej przykłady są przykładami testów homogennych, ponieważ nie wymagają żadnych dodatkowych etapów poza dodaniem odczynników przed ostatecznym pomiarem, detekcją lub odczytem sygnału.

Z drugiej strony testy heterogenne składają się co najmniej z dwu etapów, ponieważ obejmują procesy do pewnego stopnia zasadniczo niezgodne, które nie mogą być połączone w jednym procesie. Na przykład wiele testów heterogennych wymaga dodania odczynników w określonym porządku czasowym (np. gdy niektóre odczynniki przeszkadzały by w zachodzeniu początkowych etapów testu, lecz jednocześnie są konieczne do przeprowadzenia etapów końcowych). Typowe przykłady testów heterogennych obejmują testy, w których odczynniki wywołujące sygnał nie są dodawane bezpośrednio w celu uzyskania wyniku testu na obecność lub stężenie produktu reakcji. Innym typowym etapem testów heterogennych jest etap płukania. Często wymaganym jest dodatek nadmiaru odczynników testowych, które następnie muszą być odpłukane przed kolejnymi etapami testu, aby umożliwić przebieg reakcji bez wysokiego sygnału tła. Na przykład w teście wiązania radioliganda, wyznakowany ligand jest najpierw inkubowany z białkiem związanym z podłożem stałym, lecz tylko niewielka ilość liganda w rzeczywistości wiąże się z ograniczoną liczbą miejsc białkowych. Po inkubacji, a przed wykonaniem dokładnego pomiaru ilości związanego radioaktywnego liganda, nadmiar niezwiązanego liganda musi zostać odpłukany. Płukanie można wykonać na wiele różnych sposobów, włączając w to filtrację, cykle płukania i dekantacji, precypitację i oddzielanie faz i/lub wirowanie.

Wiele biologicznych i biochemicznych procesów można mierzyć jedynie za pomocą metod heterogennych. Ponadto, pomimo istnienia sposobów na zaadoptowanie innych procesów biologicznych i biochemicznych do testów homogennych, to wspomniane inne procesy muszą być ekonomicznie opłacalne i/lub muszą wykorzystywać odczynniki łatwiej dostępne, niż ma to miejsce w przypadku testów heterogennych. Z dostępnych handlowo istnieje wiele metod i zestawów do prowadzenia testów homogennych, jak np. SPA (Amersham), Fluorescence Polarization (Jolley i wsp) i Time Resolved Fluorescence (Packard i wsp). Jednakże zastosowanie wspomnianych rodzajów metod zawsze pociąga za sobą dodatkowe koszty i czas. Dla wielu testów sposoby heterogenne są lepiej ustawione

PL 194 813 B1 i ich przeprowadzenie następuje stosunkowo szybko. Z tych powodów sposoby heterogenne takie jak

ELISA, wiązanie z filtrem, RIA, komórkowy test lucyferazy itp. są powszechnie stosowane. Niektóre ze wspomnianych metod będą opisane w szczegółach poniżej.

Wysokowydajny skrining (HTS)

W ciągu ostatnich lat przemysł farmaceutyczny zwiększał zastosowanie wysokowydajnego skriningu bibliotek związków chemicznych w celu znajdowania potencjalnych nowych leków. Termin HTS opisuje sposób w którym wiele poszczególnych związków chemicznych testowanych jest równolegle, tak że wielka liczba testowanych związków przeszukiwana jest pod względem biologicznych aktywności jednocześnie lub prawie jednocześnie. Najbardziej rozpowszechniona technika obejmuje wykorzystanie mikropłytki 96-cio studzienkowej. Układ ten umożliwia jednoczesne prowadzenie 96 niezależnych testów na pojedynczej płytce plastikowej o wymiarach 8 x 12 cm, obejmującej 96 studzienek reakcyjnych. Do studzienek można dodać odczynniki reakcyjne o objętości typowo od 50 do 500 ml. Format 96 studzienkowy jest bardzo popularny i handlowo dostępnych jest wiele pasujących do niego instrumentów, materiałów, pipet, robotów, urządzeń do przemywania i odczytywania płytek, umożliwiających łatwe prowadzenie testów zarówno homogennych, jak heterogennych.

Dotychczas czyniono wysiłki w celu miniaturyzacji HTS, poprzez zmniejszanie wymiarów studzienki. Zmniejszenie wymiarów poszczególnej studzienki, umożliwia zwiększenie ilości studzienek na płytce, co umożliwia prowadzenie większej liczby równoległych testów. Ponadto, zmniejszenie objętości reakcyjnej pozwala na zmniejszenie kosztów odczynników w przeliczeniu na test. Ponadto, ponieważ możliwe jest jednoczesne prowadzenie większej liczby testów o mniejszej objętości, można jednocześnie testować więcej związków w celu znalezienia potencjalnych leków. Jak dotychczas miniaturyzacja doprowadziła do niewielkiego polepszenia technologii 96 studzienkowej, dostarczając płytek 384 studzienkowych (format 96 x 4). Patrz: Comley i wsp J Biomol Screening 2(3), 171 - 178, 1997. Opisano również płytki testowe o większej gęstości, włączając w to układ 9600 studzienkowy. Jednakże miniaturyzacja pociąga za sobą właściwe sobie koszty i ograniczenia.

Wspomniane koszty i ograniczenia wynikają bezpośrednio z trzech podstawowych składników miniaturyzacji formatu testu. Po pierwsze, wymaganym jest zmniejszenie pojemników testowych (probówek, studzienek, zagłębień). Ponadto, niezbędnym jest dokładne rozdzielenie odczynników testowych do mniejszych i w większej liczbie studzienek (zwykle, rozdzielanie wykonywane jest za pomocą robota, jednocześnie rozdzielającego odczynniki do wielu studzienek). Po trzecie, wymagana jest możliwość odczytu wyniku testu w układzie wysokiego upakowania studzienek.

Biorąc pod uwagę wymagania równoległości wykonania niezależnych testów, każdy z wymienionych składników stawia właściwe sobie wyzwania i ograniczenia użyteczności oraz ekonomicznej opłacalności miniaturyzacji. Na przykład nowy, mniejszy format wymaga zastosowania całkowicie nowej metody rozdzielania odczynników lub wymaga instrumentów odczytujących wynik, posiadających rozdzielczość, czułość i budowę zgodną ze zminiaturyzowanym formatem. Wraz ze zmniejszaniem wielkości każdej studzienki, wytwarzanie układu pojemników, rozdzielanie odczynników na coraz to mniejsze objętości oraz odczytywanie wyniku testu stają się coraz to bardziej skomplikowane, czasochłonne i kosztowne. Ponadto, mniejsza objętość próbki zwiększa również statystyczny rozrzut różnych wartości pomiędzy próbkami ze względu na naturalną niedokładność w rozdzielaniu niewielkich objętości i mierzeniu słabych sygnałów. Ponadto, po zmniejszeniu wielkość próbki poniżej pewnej granicy, coraz większą rolę zaczynają odgrywać zjawiska takie jak parowanie i napięcie powierzchniowe, co dodatkowo pomnaża koszty i wewnętrzną złożoność nowych, zminiaturyzowanych testów.

Przemysł farmaceutyczny oczekuje opracowania „testów o dowolnym formacie” lub testów w których nie istnieją fizyczne bariery pomiędzy próbkami. Zwykle bierze się pod uwagę testowanie niewielkich kropelek w układzie bezstudzienkowym, choć nikt dotąd nie opracował i nie ujawnił zastosowania „testów dowolnego formatu” w wysokowydajnym skriningu z wykorzystaniem kolekcji składników dyskretnych.

Przeszukiwanie bibliotek kombinatorycznych - metody przenikania w żelu

Wykorzystanie chemii kombinatorycznej umożliwia szybkie przygotowanie milionów związków chemicznych związanych z podłożem stałym (zazwyczaj z kuleczkami). Jakkolwiek format 96 studzienkowy wykorzystywany jest do przeszukiwania bibliotek opartych na kuleczkach, układ ten uznawany jest za nieefektywny, ponieważ (1) każda kuleczka niesie jedynie niewielką ilość związku chemicznego, (2) liczba związków do przetestowania jest ogromna i (3) kuleczki są trudne do manipulacji w płytkach 96 studzienkowych.

PL 194 813 B1

W celu uniknięcia problemów właściwych dla przeglądania bibliotek kombinatorycznych w formacie 96 studzienkowym, donoszono o wykorzystaniu prostych testów homogennych, które można zaklasyfikować jako „testy dowolnego formatu”. Na przykład test z wykorzystaniem komórek barwnikowych (melanocytów) w prostym teście homogennym do przeszukiwania kombinatorycznych bibliotek peptydowych przedstawili Jayawickreme i wsp. PNAS USA 191, 1614 - 18, 1994. Według autorów komórki umieszcza się w agarozie na płytkach Petriego, następnie na powierzchni agaru umieszcza się kuleczki niosące związki kombinatoryczne i następnie częściowo uwalnia związki z kuleczek. Związki aktywne uwidaczniane są jako ciemne obszary pigmentowe w wyniku ich lokalnej dyfuzji do żelu i wywołaniu przez związki aktywne zmiany koloru komórek.

Innym przykładem jest niedawno opublikowana praca Daniela Chelskyego „Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches”, zgłoszona na First Annual Conference of The Society of Biomolecular Screening, Philadelphia, 7 - 10 listopada 1995. Chelsky posłużył się prostym homogennym testem enzymatycznym dla anhydrazy węglanowej umieszczonym wewnątrz żelu agarozowego tak, aby enzym w żelu mógł powodować zmianę koloru żelu. Następnie kuleczki niosące bibliotekę kombinatoryczną (sprzężoną z kuleczkami poprzez fotolinker) umieszczane były wewnątrz żelu, a częściowe uwalniane związków następowało poprzez naświetlenie światłem ultrafioletowym. Związki hamujące enzym obserwowano jako lokalne strefy hamowania, obdarzone mniej intensywnym kolorem. Ostatnim przykładem jest metoda podana przez Salmona i wsp. (Molecula Diversity 2, 57 - 63, 1996), podobna do metody Jayawickreme i wsp., w której biblioteki kombinatoryczne przeszukiwane są pod kątem związków wykazujących efekty cytotoksyczne wobec komórek nowotworowych rosnących w żelu.

Podane trzy przykłady są odmianami znanego testu żelowego wykrywającego związki antybakteryjne lub przeciwrakowe. Są one również podobne do grupy testów immunologicznych, w których oddziaływanie pomiędzy przeciwciałem i antygenem mierzone jest w żelu. Choć wspomniane testy przenikania w żelu są dobrze przystosowane do przeszukiwania kuleczkowych bibliotek kombinatorycznych, nie donoszono dotychczas o rozszerzeniu tego układu testowego na testy heterogenne czy biblioteki nie kuleczkowe.

Zwyczajowa wiedza zniechęca badaczy do testowania próbek w układzie ciągłym, który dopuszczałby mieszanie się próbek. Spośród znanej, ograniczonej liczby rodzajów testów oraz obaw związanych z równoczesnym przebiegiem testu dla wielu próbek w formacie ciągłym, dotychczas stosowano tylko testy wykorzystujące biblioteki związane z kuleczkami. W związku ze wspomnianymi ograniczeniami badacze przyjęli, że format 96 studzienkowy jest lepiej przystosowany do testów heterogennych i przeszukiwania bibliotek niezwiązanych z kuleczkami. Pożądane jest jednak, by można było prowadzić testy heterogenne w formacie dowolnym. Jak również pożądane jest, by można było prowadzić testowanie poszczególnych związków w formacie ciągłym.

Istotą obecnego wynalazku jest więc sposób jednoczesnego testowania wielu próbek różnych substancji pod względem ich zdolności wzmagania bądź hamowania procesu biologicznego, który charakteryzuje się tym, że w etapie a) osadza się w sposób uporządkowany niewielkie objętości każdej z więcej niż 96 próbek poszczególnych substancji na płaskie, porowate podłoże zawierające lub niosące jednolicie rozprowadzony odczynnik testowy w taki sposób, iż każda poszczególna substancja usytuowana jest na przypisanym jej, poszczególnym obszarze i tożsamość każdej z substancji można określić na podstawie jej miejsca osadzenia oraz pozostawia się osadzone próbki umożliwiając ich powolną dyfuzję w płaskim, porowatym podłożu, przy czym próbki poruszają się niezależnie, zaś w etapie b) obserwuje się oddziaływanie każdej substancji z odczynnikiem testowym, które koreluje się ze zdolnością badanej substancji do wzmagania lub hamowania procesu biologicznego.

Korzystnie, w etapie (a) osadza się w sposób uporządkowany niewielkie objętości każdej z więcej niż 96 próbek poszczególnych substancji na płaskie podłoże w taki sposób, iż każda poszczególna substancja usytuowana jest na przypisanym jej, poszczególnym obszarze i tożsamość każdej z substancji można określić na podstawie jej miejsca osadzenia, kolejno kontaktuje się podłoże z porowatym podłożem zawierającym lub niosącym jednolicie rozprowadzony odczynnik testowy i umożliwia się niektórym z substancji dyfuzję do porowatego podłoża w taki sposób, iż przestrzenne umiejscowienie każdej z dyfundujących substancji można skorelować z miejscem na płaskim podłożu, na którym pierwotnie osadzono daną substancję i następnie przeprowadza się etap (b).

Korzystnie, w etapie (a) osadza się w sposób uporządkowany niewielkie objętości każdej z więcej niż 96 próbek poszczególnych substancji na płaskie podłoże w taki sposób, iż każda

PL 194 813 B1 poszczególna substancja usytuowana jest na przypisanym jej, poszczególnym obszarze i tożsamość każdej z substancji można określić na podstawie jej miejsca osadzenia, kolejno kontaktuje się płaskie podłoże z pierwszym porowatym podłożem zawierającym lub niosącym jednolicie rozprowadzony pierwszy odczynnik testowy i umożliwia się częściową dyfuzję każdej z substancji do porowatego podłoża w taki sposób, iż przestrzenne umiejscowienie każdej z dyfundujących substancji można skorelować z jej miejscem na płaskim podłożu, na którym pierwotnie ją osadzono, następnie kontaktuje się pierwsze porowate podłoże z drugim podłożem zawierającym lub niosącym drugi jednolicie rozprowadzony odczynnik testowy i umożliwia się dyfuzję drugiego odczynnika testowego do pierwszego porowatego podłoża lub umożliwia się dyfuzję każdej z substancji i pierwszego odczynnika testowego do drugiego podłoża, przy czym w drugim przypadku zapewnia się taki przebieg dyfuzji, że umiejscowienie każdej z substancji w drugim podłożu można skorelować z miejscem na płaskim podłożu, na którym pierwotnie osadzono substancje i w końcu przeprowadza się etap (b).

Korzystnie, w etapie (a) osadza się w sposób uporządkowany niewielkie objętości każdej z więcej niż 96 próbek poszczególnych substancji na pierwsze płaskie, porowate podłoże zawierające lub niosące jednolicie rozprowadzony pierwszy odczynnik testowy w taki sposób, że każda poszczególna substancja usytuowana jest na przypisanym jej, poszczególnym obszarze i tożsamość każdej z substancji można określić na podstawie jej miejsca osadzenia, kolejno kontaktuje się porowate podłoże z drugim płaskim podłożem zawierającym lub niosącym jednolicie rozprowadzony drugi odczynnik testowy i umożliwia się dyfuzję drugiego odczynnika testowego do pierwszego porowatego podłoża lub umożliwia się dyfuzję każdej substancji i pierwszego odczynnika testowego do lub na drugie podłoże, przy czym w drugim przypadku zapewnia się taki przebieg dyfuzji, że umiejscowienie każdej z substancji w lub na drugim podłożu można skorelować z miejscem na pierwszym porowatym podłożu, na którym pierwotnie osadzono substancje i w końcu przeprowadza się etap (b).

Korzystnie jednym z jednolicie rozprowadzanych odczynników testowych jest makrocząsteczka, enzym, nieoczyszczony ekstrakt biologiczny, organella albo też nienaruszone komórki.

Korzystniej, jednolicie rozprowadzonym odczynnikiem testowym są nienaruszone komórki naniesione na jedną powierzchnię płaskiego porowatego podłoża.

Korzystnie, w etapie (b) oddziaływanie obserwuje się poprzez kontaktowanie porowatego podłoża z roztworem lub płynną zawiesiną odczynnika lub porowatym podłożem zawierającym odczynnik, co w obu przypadkach wspomaga wizualizację białka, którego ekspresja w nienaruszonych komórkach stanowi badany proces biologiczny.

Korzystnie, pierwszym odczynnikiem testowym jest znaczony ligand, a drugim odczynnikiem testowym jest unieruchomiony receptor specyficzny względem liganda.

Korzystnie, drugie płaskie podłoże przemywa się w celu usunięcia znaczonego liganda, który przedyfundował na lub do drugiego płaskiego podłoża, lecz nie uległ związaniu z unieruchomionym receptorem.

Korzystnie, drugie płaskie podłoże kontaktuje się z roztworem lub płynną zawiesiną odczynnika lub porowatym podłożem zawierającym odczynnik, co w obu przypadkach wspomaga wizualizację znaczonego liganda nie usuniętego w czasie etapu przemywania.

Rozwiązanie według wynalazku, wysokowydajny skrining w układzie ciągłym (CF-HTS), z powodzeniem wprowadza zasadę dowolnego formatu do dowolnego testu homogennego lub heterogennego, który można wykonać w formacie 96 studzienkowym. Ponadto CF-HTS jest użyteczny do przeszukiwania bibliotek kombinatorycznych w teście heterogennym, a nie tylko homogennym. Ponadto CF-HTS nadaje się do przeglądania poszczególnych związków bez dodatkowych kosztów i komplikacji związanych z miniaturyzacją. Udowodniono, że uwagi dotyczące możliwości wymieszania odczynników reakcyjnych i wyników testu są nieuzasadnione.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest uwidoczniony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia próbki w teście gELISA na nie porowatym podłożu kontaktującym się jedną stroną z porowatym podłożem żelowym zawierającym odczynnik testowy, który z kolei kontaktuje się z nie porowatym podłożem zawierającym kolejny odczynnik testowy, fig. 2 przedstawia usunięcie podłoża zawierającego próbki testowe gELISA i podłoże porowate, a następnie płukanie i dodanie płynu lub roztworu odczynnika w celu utworzenia kompleksu reporterowego na nie porowatym podłożu odczynnikowym, fig. 3 przedstawia wizualizację testu gELISA poprzez kontaktowanie podłoża reporterowego z porowatym, żelowym podłożem zawierającym substrat reporterowy, fig. 4 przedstawia w jaki sposób podłoże ligandowe nakładane jest na powierzchnie filtra (membrany) po stronie przeciwległej do tej, zawierającej komórki, fig. 5 obrazuje to, co powierzchnia filtra zawierającego komórki może wytworzyć

PL 194 813 B1 gdy następuje wizualizacja testu, fig. 6 przedstawia wyniki testu VanA przeprowadzonego z wykorzystaniem różnych stężeń znanych inhibitorów działających w sposób zależny od dawki, fig. 7 przedstawia wynik testu EF-3 z zastosowaniem różnych stężeń znanego inhibitora, fig. 8 przedstawia eksperyment kontrolny testu gELISA dla badania oddziaływań białko - białko, fig. 9 przedstawia wynik testu gELISA „hamowania” oddziaływań białko - białko, fig. 10 przedstawia zależne od dawki wiązanie wyznakowanego radioaktywnie ITAM do unieruchomionego LCK, fig. 11 wykreśla wartości pikseli wobec stężenia ITM w celu przedstawienia typowej krzywej wiązania receptora z ligandem, fig. 12 przedstawia eksperyment kontrolny dla oddziaływania ligandu z komórką (ligandem jest wyznakowana radioaktywnie IL-8), fig. 13 przedstawia „hamowanie” oddziaływania IL-8 z komórką, fig. 14 przedstawia test dla inhibitorów neuraminidazy, zaś fig. 15 przedstawia jednoczesne testowanie 10080 poszczególnych związków pod względem hamowania neuraminidazy.

Zasadniczym pomysłem stojącym za CG-HTS jest umieszczenie próbek testowych w obrębie porowatego podłoża.

Sposób obejmuje umieszczenie jednego lub więcej składników testowych wewnątrz, na powierzchni lub na spodzie podłoża, takiego jak żel, kartka plastikowa (membrana), filtr lub inne użyteczne do manipulowania formy podłoża. Gdy próbki wprowadzone są do porowatego podłoża dyfundują one wystarczająco wolno tak, że test można prowadzić bez niebezpieczeństwa wymieszania próbek testowych. Zatem układ CF-HTS rozdziela próbki testowe wykorzystując zasadę dyfuzji, a nie nieprzepuszczalną barierę. Gdyby test przebiegał zbyt długo, doszłoby do ewentualnego wymieszania próbek i wyników testowych. Jednakże, w kontrolowanych warunkach CF-HTS umożliwia jednoczesne indywidualne przeszukiwanie bardzo dużej liczby, gęsto upakowanych próbek testowych, bez konieczności wypełniania poszczególnych studzienek, lub pojemników reakcyjnych roztworami lub składnikami testowymi.

Ponadto, manipulując podłożami niosącymi składniki reakcyjne można prowadzić nawet skomplikowane testy heterogenne stosując ten format testu. Manipulowanie podłożami w testach heterogennych jest całkowicie nowym wynalazkiem i czyni CF-HTS równie adaptybilnym, co format 96 studzienkowy, pod względem zdolności do prowadzenia skriningu szerokiego zakresu procesów biologicznych i biochemicznych. Jak również CF-HTS pozwala osiągnąć korzyści właściwe miniaturyzacji formatu, bez towarzyszących jej zwykle niedogodności.

W teście formatu CF-HTS można stosować szeroki zakres podłoży i składników testowych. Podłoża obejmują w sposób nieograniczający żele zbudowane z agarozy, akryloamidu i innych materiałów żelowych, membrany, filtry i plastiki. Podłoża mogą być zbudowane z materiałów zawierających w sposób nieograniczający polistyren, polipropylen i inne plastiki, papier szklany, papier, szkło, krzemionkę, poliwęglan, poliester, PVC i polietylen. Podłoża mogą być nieprzepuszczalnymi ciałami stałymi, ciałami stałymi porowatymi, takimi jak filtry lub żelami. Składniki testowe obejmują w sposób nieograniczający makrocząsteczki takie jak kwasy nukleinowe, białka i inne syntetyczne lub naturalne makrocząsteczki, komórki, lizaty komórkowe, ekstrakty biologiczne, organelle i inne kompleksowe związki organiczne, jak również mieszaniny oraz związki niskocząsteczkowe, takie jak bufory, sole, inhibitory, substraty, peptydy, barwniki, nukleotydy, kofaktory, jony i rozpuszczalniki.

Test CF-HTS jest testem, w którym wiele próbek testowych lub związków rozdzielonych jest raczej na zasadzie dyfuzji, niż przez zastosowanie nieprzepuszczalnych barier. Istotnym składnikiem jest wprowadzenie wielu (więcej niż jednej) próbek testowych na lub do porowatego podłoża, które fakultatywnie zawiera jeden lub więcej składników testowych. Porowate podłoża testowe obejmujące składnik(i) testowe przygotowuje się poprzez dodanie, wymieszanie, rozpuszczenie, rozprowadzenie lub przepłukanie składników do podłoży. Podłoża porowate przygotowuje się również poprzez sprzęganie, powlekanie, wiązanie, utrwalanie, stosowanie linkerów, konjugację lub przyłączanie składników testowych w lub na powierzchnię podłoża. Ponadto, porowate podłoże przygotowuje się również poprzez tworzenie cienkiego filmu z roztworu lub płynu na podkładce zbudowanej z komórek, enzymu lub innych unieruchomionych składników testowych. Porowate podłoża wykorzystywane są do kontrolowania porządku i/lub czasu działania dodawanego składnika testowego oraz czasu trwania mieszania i dyfuzji po zmieszaniu składników testowych.

Podłoża nie porowate również można przygotować poprzez sprzęganie, powlekanie, wiązanie, utrwalanie, stosowanie linkerów, konjugację lub przyłączanie składników testowych w lub na powierzchnię podłoża nie porowatego. Zastosowanie podłoża nie porowatego w teście CF-HTS powoduje przestrzenne unieruchomienie jednego lub więcej składników testowych.

PL 194 813 B1

Gdy składniki testowe wprowadzone są na powierzchnię podłoża, składniki testowe przyłączają się poprzez oddziaływania kowalencyjne lub nie kowalencyjne, oddziaływania specyficzne lub nie specyficzne z podłożami traktowanymi lub nie traktowanymi odpowiednio w celu ułatwienia przyłączania się składników testowych. Po przyłączeniu składnik testowy jest przestrzennie unieruchamiany do celów testu. W tym przypadku, albo próbki testowe muszą być zdolne do dyfuzji poprzez podłoże aby osiągnąć składniki testowe i/lub podskładniki lub produkty składników testowych muszą być zdolne do dyfuzji poprzez podłoże, by osiągnąć próbki testowe.

Co najmniej jedno porowate podłoże obejmujące próbki testowe stosuje się w jednym lub więcej etapów wymienionych poniżej:

(1) Kontaktowanie powierzchni porowatego podłoża z co najmniej jednym innym (porowatym lub nie porowatym) podłożem, w taki sposób, że próbki i/lub jeden lub więcej składnik testowy może dyfundować poprzez płaszczyznę kontaktu.

(2) Rozdzieleń ie dwu lub więcej podłoży w celu zatrzyma nia oddziaływań ia skład n ików i/lub próbek.

(3) Kontakkowarn^pc^o^i^r^^c^łini dwu i ub więcee podłoży, w taki sposób, że skkadniki testowemogą ze sobą oddziaływać.

(4) Przemywanie, ppukanie lub eluowanie podłoża płynnymi buforami lub innymi rozpuszczalnl· kami w celu usunięcia niezwiązanych i/lub nie specyficznie związanych składników testowych.

(5) Rozdzielanie, wylewanie. dodawanie lub przepływanie skkadników lessowych w na podłoże lub filtrowanie wymienionych składników poprzez podłoże.

(6) Obrazowanie, odczytywanie. skanowanie, detekcja lub innego rodzaju wizuallzacja sygnałów radiometrycznych, fluorescencyjnych, spektrofotometrycznych lub elektromagnetycznych obecnych w lub na jednym lub więcej podłoży.

CF-HTS dostarcza wiele korzyści w porównaniu z poprzednimi układami testowymi. Brak wyodrębnionych studzienek eliminuje konieczność jednoczesnego i dokładnego rozdzielania składników testowych lub odczynników do studzienek. Zamiast tego, składniki testowe rozdzielane są i mieszane przez ogólne rozdzielanie homogenne. Ponieważ składniki testowe przygotowywane są jako homogenne roztwory ogólne lub podłoża, istnieje tylko niewielkie odchylenie statystyczne pomiędzy próbkami. W porównaniu z tym układem, format 96 studzienkowy generuje dużą rozpiętość różnic statystycznych pomiędzy próbkami.

Ponadto układ CF-HTS dostarcza wyjątkowo gęstego upakowania wielu związków, które mają być przeszukiwane. Nawet jeśli obserwowane wyniki pozytywne uległy do pewnego stopnia wymieszaniu, wystarczy po prostu przetestować ponownie składniki znajdujące się w okolicach sygnału pozytywnego. Zatem, jeśli jest możliwe ograniczenie 10000 próbek testowych do 50 próbek kandydujących zlokalizowanych naokoło strefy sygnału pozytywnego, to nie stanowi trudności rozpoznanie właściwej próbki spośród 50 kandydujących, stosując nawet starą technologię 96 studzienkową.

Rozdzielanie i suszenie poszczególnych składników na plastikowych membranach w wysoce upakowanym układzie i zastosowanie CF-HTS, pozwala przezwyciężyć wszystkie krytyczne elementy miniaturyzacji. Format ten nie wymaga nowych plastików lub innych materiałów dla osiągnięcia miniaturyzacji, ponieważ miniaturyzację osiąga się poprzez ograniczenie ilości próbki dyfundującej w podłożu. Format ten nie wymaga również mikrorozdzielaczy do rozdzielania odczynników testowych, ponieważ cały test przebiega w „jednej, gigantycznej studzience”, gdzie odczynniki i roztwory rozdzielane są w sposób ogólny. Jedynie testowane próbki należy rozdzielać przy użyciu mikrorozdzielacza. Ponadto, format ten generuje dużo mniej statystycznych odchyleń, ponieważ obserwuje się jedynie pojawianie się zlokalizowanych stref heterogennych w obrębie homogennego podłoża. Nie istnieje konieczność odczytywania i porównywania wielu różnych studzienek. Ponadto, oprócz wszystkich spodziewanych korzyści z miniaturyzacji (koszty, wydajność, zużycie odczynników, zużycie składników testowych) format CF-HTS dostarcza również zaskakujących korzyści, takich jak możliwość prowadzenia większości etapów testu w sposób ciągły, bez rozdzielania.

Zasadniczym aspektem CF-HTS jest obserwacja, iż składniki testowe i próbki testowe nie dyfundują szybko w poziomie nawet na powierzchni styku dwu podłoży. Na przykład, gdy żel agarozowy umieszczony jest na plastikowej membranie, na powierzchni rozdziału faz powierzchni żelowej występuje dość płynu. Gdy konieczne jest oddziaływanie pomiędzy składnikiem testowym w żelu i składnikiem testowym na płytce (np. takim jak w przykładzie testu ELISA), jest szczególnie istotne by składnik zlokalizowany w żelu był zdolny do dyfuzji na płytkę. Jednakże, w CF-HTS wymaganym jest, by towarzysząca dyfuzja w poziomie była zasadniczo wolniejsza tak, aby oddziaływanie na płytkę ograniczone

PL 194 813 B1 było do wyjściowego położenia składnika zlokalizowanego w żelu. Ta sama zasada stosuje się do innych powierzchni styku podłoże -podłoże, pomiędzy żelami, filtrami lub powierzchniami (lub innymi podłożami) w dowolnych kombinacjach. Odkrycie, iż dyfuzję można kontrolować, co zasadniczo dotyczy wszystkich rodzajów powierzchni rozdziału faz podłoża, jest nieoczekiwane i sprzeczne z potoczną wiedzą.

Korzystny sposób wprowadzania próbek testowych lub składników do podłoża (takiego jak żel lub zwilżony filtr) polega na rozdzielaniu i suszeniu małych objętości każdej próbki na powierzchni, takiej jak powierzchnia membrany plastikowej w taki sposób, że próbki nie mogą mieszać się, pokrywać i każda zajmuje wyznaczoną pozycję. Gdy membrana plastikowa umieszczana jest na podłożu, próbki rozpuszczają się i ulegają dyfuzji do podłoża w miejscach odpowiadających miejscom ich wstępnego umieszczenia na membranie.

Alternatywną metodą rozdzielania próbek w odpowiedni szyk jest rozdzielanie próbek na porowate podłoże takie jak filtr, gdzie objętość próbki rozdzielanej jest wystarczająco mała by sąsiednie próbki nie nakładały się na siebie na podłożu. Podczas kontaktu z innym porowatym podłożem zawierającym więcej płynu, składniki dyfundują rozpoczynając reakcję testową.

Korzystną metodą wprowadzania związków kombinatorycznych sprzężonych z kuleczkami do podłoża jest rozprowadzanie kuleczek w sposób przypadkowy lub w sposób uporządkowany na powierzchnię, taką jak powierzchnia membrany plastikowej. Kuleczki traktowane są następnie w celu uwolnienia (odcięcia) związków testowych jeżeli są one przyłączone kowalencyjnie do kuleczek poprzez labilny linker (przecinane pod działaniem światła, czy kwasem w postaci gazowej - sposobami dobrze znanymi specjalistom). Każdy związek jest następnie w sposób niekowalencyjny powiązany z obszarem zajmowanym przez kuleczkę z którą był wyjściowo związany i następnie suche składniki mogą być wprowadzane do lub na podłoże.

Alternatywnym sposobem wprowadzania poszczególnych (dyskretnych) związków do podłoża jest przepłukiwanie lub inny niekowalencyjny sposób przyłączania poszczególnych związków do lub na kuleczki. Stosując tą metodę można zmieszać dużą liczbę związków już osadzonych na kuleczkach tak, że każda kuleczka nadal zachowuje unikalne składniki z nią związane. Następnie mieszanina kuleczek jest rozprowadzana na powierzchnię lub wprowadzana do podłoża. Procedura ta eliminuje konieczność posługiwania się niewielkimi objętościami płynów.

Gdy wyjściowy układ próbek wprowadzony na podłoże w teście CF-HTS posiada wysoką gęstość upakowania, taką iż poszczególna strefa aktywności przestrzennie nakłada się na wyjściowe położenie więcej niż jednej próbki, to każda z tych próbek jest potencjalnie źródłem obserwowanej aktywności. Dla wysokich wyjściowych gęstości upakowania będzie tym więcej składników kandydujących dla każdej strefy, im więcej składników obecnych jest w konkretnej strefie. Składniki mogą dyfundować równocześnie, lecz każdy z nich posiada swój własny przestrzenny gradient i nie miesza się w sposób ilościowy w dowolnym położeniu. Zatem centrum strefy będzie w sposób precyzyjny odpowiadało dokładnemu położeniu składnika aktywnego obecnego w wyjściowym układzie. W praktyce trafienia są na tyle rzadkie, że powtórne testowanie wielu próbek w celu potwierdzenia identyfikacji składników aktywnych dla każdej strefy aktywności nie sprawia żadnych trudności.

Alternatywnym zastosowaniem wynalazku jest wprowadzenie fizycznych barier (takich jak zastosowanie formatu nieciągłego, w dokładnym znaczeniu tego słowa) w obręb podłoży testowych w celu ograniczenia dystansu na jaki mogą dyfundować próbki testowe. Na przykład dwa żele zawierające enzym i substrat mogą zostać pocięte skalpelem na wiele dyskretnych kawałków. Następnie dwa żele można kontaktować ze sobą tak, że substrat i enzym dyfundują w obrębie pociętych fragmentów żelu. Próbki testowe mogą zostać następnie wprowadzone do każdego fragmentu żelu tak, że testy są całkowicie od siebie niezależne, bez możliwości dyfuzji składników. Zastosowanie to w sposób efektywny eliminuje pewne korzyści z formatu CF-HTS, poprzez wprowadzenie statystycznego zróżnicowania próbek testowych oraz przez określenie objętości, a zatem ograniczenie sygnału dla układów o wysokim upakowaniu. Jednak to zastosowanie nadal dzieli korzyści wynikające z formatu heterogennego testu wykorzystującego podłoże, w którym składniki testowe nie muszą być rozdzielane na wiele równoległych naczynek reakcyjnych, a zatem eliminuje niebezpieczeństwo częściowego wymieszania próbek.

gELISA

Test ELISA jest testem heterogennym, wykrywającym wiązanie pomiędzy ligandem w roztworze a unieruchomionym receptorem. ELISA wymaga mieszania wielu odczynników oraz etapów przemywania, które są trudne do wykonania w formacie 96 studzienkowym. Trudności zwiększają się jeszcze

PL 194 813 B1 przy zastosowaniu formatu o gęstszym upakowaniu próbek, np. w formacie 384 studzienkowym.

Wynalazcy zastosowali sposób CF-HTS do wykrywania wiązania pomiędzy ligandami a unieruchomionymi receptorami docelowymi (gELISA).

Receptor jest dowolną cząsteczką zdolną do wiązania się z inną cząsteczką. Przykładami nie ograniczającymi receptora są: białka, peptydy, kwasy nukleinowe, węglowodany i inne kompleksy wymienione w przykładach poniżej. Receptor jest unieruchomiony na jednym z możliwych podłoży (np. na płytce Petriego, płytce plastikowej (np. firmy Nunc), na membranach lub filtrach posiadających zdolność wydajnego wiązania cząsteczki docelowej (np. nitroceluloza, nylon, PVDF (z firmy Millipore, Corning Costar, Schleicher & Schuell, BioRad) lub membrany modyfikowane, takie jak membrany SAM (z firmy Promega). Porowate podłoże zawierające ligand (podłoże ligandowe) (np. żel agarozowy lub porowata membrana) przygotowane jest w taki sposób, że ligand do unieruchamiania receptora jest rozprowadzony na lub w podłożu. Składniki testowe lub próbki rozdzielane są bezpośrednio na podłoże ligandowe lub alternatywnie na lub do podłoża zawierającego próbkę testową (np. polistyren (Tekra), poliwinylolidyna (np. z firmy Dow Brands) lub na dowolne giętkie membrany lub kartki plastikowe. Podłoże testowe kontaktowane jest z podłożem ligandowym, umożliwiając dyfuzję próbki do podłoża ligandowego. Po odpowiednim czasie inkubacji podłoże ligandowe kontaktowane jest z podłożem receptorowym, a ligand i próbki wchodzą w oddziaływanie i ewentualnie reagują z receptorem w wyniku dyfuzji (fig. 1 przedstawia unieruchomiony receptor R wiążący się z biotynylowanym ligandem Lb). W czasie inkubacji ligandy wiążą się z unieruchomionym receptorem, chyba że próbka hamuje wiązanie receptora z ligandem.

Po odpowiednim czasie inkubacji, podłoże zawierające receptor jest usuwane i przemywane odpowiednim buforem w celu usunięcia niezwiązanych lub związanych niespecyficznie liganda i próbek. Podłoże receptorowe jest następnie namaczane w roztworze zawierającym odczynniki testowe oddziałujące z ligandem (np. przeciwciało, awidynę lub streptoawidynę w przypadku biotynylowanego liganda) i wykrywane albo bezpośrednio (np. w wyniku fluorescencji lub emisji radioaktywności) lub pośrednio (np. stosując konjugaty peroksydazy z korzenia chrzanu (HRP), alkalicznej fosfatazy (AP) lub betagalaktozydazy) (fig. 2 przedstawia konjugat awidyny z HRP, AHRP, przyłączony do biotynylowanego liganda). Po odpowiednim okresie inkubacji podłoże receptorowe usuwane jest z roztworu i przemywane w celu usunięcia niezwiązanego lub związanego niespecyficznie odczynnika. W przypadku bezpośredniej detekcji sygnału podłoże jest wizualizowane z wykorzystaniem odpowiedniej metody (np. skanera spektrofotometrycznego, kamery CCD, filmu fotograficznego, fosfoimagera lub scyntylatora). Sygnały pośrednie (np. HRP lub AP) wymagają dodatkowego etapu wywołania sygnału, poprzez rozdzielenie substratów lub innych koniecznych składników reakcyjnych do lub na porowate podłoże i umieszczenie tego podłoża tak, by kontaktowało się z podłożem receptorowym. Enzym (np. HRP lub AP) reaguje następnie z substratem (fig. 3). Alternatywnie, wytrącony substrat wprowadzany jest do roztworu zamiast podłoża. Dowolna metoda wizualizacji prowadzi do ujawnienia obszaru reakcji wiązania liganda i receptora, podczas gdy obszary w których wiązanie liganda i receptora jest hamowane, nie dają widocznej reakcji.

Wiązanie między komórką a ligandem

CF-HTS można również stosować do wykrywania hamowania wiązania liganda do receptora komórkowego. W układzie tradycyjnym, składnik testowy, wyznakowany radioaktywnie ligand i komórka eksprymująca odpowiadający ligandowi receptor, mieszane są w naczynku takim jak studzienka. Następnie wymagany jest czas wystarczający do wiązania liganda z receptorem, jeżeli reakcja ta nie została zahamowana przez składnik testowy. Składniki niezwiązane lub związane niespecyficznie są następnie usuwane i mierzona jest radioaktywność związana z komórkami. Wynalazcy zaadoptowali metodę CF-HTS do wykrywania hamowania wiązania ligandów do komórek.

Komórki eksprymujące pożądany receptor wzrastają lub są wysiewane na podłoże (podłoże komórkowe), takie jak (w sposób nieograniczający) żele, filtry lub membrany (np. membrany do hodowli komórkowych Transwell firmy Corning Costar) lub membrany chemotaktyczne (Neuro Probe). Podłoże porowate (np. żel agarozowy lub porowata membrana) przygotowane jest w taki sposób, iż ligand odpowiadający receptorowi jest rozprowadzany na lub do podłoża (podłoże ligandowe). Badane związki lub próbki dozowane są bezpośrednio na ligand lub podłoże, lub też alternatywnie na inne podłoże (np. polistyrenowe (Tekra), poliwinylolidynowe lub inne giętkie plastikowe płytki lub membrany, podłoże ligandowe). Podłoże testowe kontaktowane jest z podłożem ligandowym, umożliwiając dyfuzję próbki do podłoża ligandowego. Po odpowiednim czasie inkubacji podłoże ligandowe kontaktowane jest z podłożem komórkowym, korzystnie od strony nie zawierającej komórek, umożli10

PL 194 813 B1 wiając kontaktowanie się w wyniku dyfuzji liganda i próbki z receptorem (fig. 4). W trakcie inkubacji wyznakowane ligandy wiążą się z unieruchomionymi komórkami, chyba że próbka hamuje wiązanie receptora z ligandem.

Po inkubacji podłoże komórkowe oddzielane jest od podłoża ligandowego i jest przemywane w odpowiednim buforze w celu usunięcia niezwiązanych lub związanych niespecyficznie liganda i próbek. Podłoże komórkowe jest następnie wizualizowane z wykorzystaniem odpowiedniej techniki (np. spektrofotometrycznie, kamerą CCD, z wykorzystaniem filmu fotograficznego lub scyntylatora) (fig. 5 przedstawia sposób uwidocznienia wyniku testu na filmie).

Jak wykazano powyżej CF-HTS oferuje wszystkie korzyści właściwe dla testów „dowolnego formatu” i można go stosować do różnych rodzajów biologicznych i biochemicznych testów, w różnych układach testowych oraz z wykorzystaniem różnych odczynników i aparatury. Ze względu na szerokie zastosowanie CF-HTS, sposób według wynalazku przedstawiono w poniższych przykładach jego wykonania.

Przykłady

Przyk ła d 1: Dwuetapowy żelowy test kolorymetryczny do wykrywania fosforanu tworzonego przez enzym oporny na wankomycynę (VanA)

VanA jest kluczowym enzymem oporności na wankomycynę i katalizuje przyłączenie D-alaniny do D-alaniny lub D-alaniny do D-mleczanu. Tradycyjnie enzym ten jest wykrywany w teście wytwarzania barwnego produktu z fosforanu, uwalnianego w czasie aktywności enzymu (VanA hydrolizuje ATP do ADP i fosforanu). D-cykloseryna hamuje VanA w sposób zależny od stężenia i jest wykorzystywana jako pozytywna kontrola w teście potencjalnego inhibitora VanA.

Żel enzymatyczny

Żel enzymatyczny przygotowano przez dodanie VanA do stopionej 1% agarozy (high melting agarose, Gibco BRL) w temperaturze 45°C w 50 mM buforze z HEPES (N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[2-etanosulfonian]), 20 mM MgCh, 20 mM KCl, pH 7,3 do końcowego stężenia VanA 2 mM. Mieszaninę agarową następnie wylano do aparatu do formowania żeli firmy BioRad i pozostawiono do stwardnienia w 2 - 8°C przez 30 minut.

Żel substratowy

Żel substratowy przygotowano przez dodanie ATP, D-alaniny i D-mleczanu do stopionej agarozy, w końcowym stężeniu odpowiednio 1 mM, 1,5 mM i 1,75 mM, i żel przygotowano tak, jak opisano to dla żelu enzymatycznego.

Podłoże zawierające próbkę (podłoże testowe)

Serię 1 ml rozcieńczeń 5000, 2000, 1000, 500, 200, 100 mM D-cykloseryny, znanego inhibitora stosowanego jako próbkę kontrolną, w mieszaninie 1:1 etanol - woda, rozprowadzono na membranę PVDC i pozostawiono do wyschnięcia przez 10 minut.

Inkubowanie enzymu z substratem w obecności inhibitora

Żel enzymatyczny kontaktowano z podłożem testowym przez 5 minut. Następnie żel zawierający substrat umieszczano na wierzchu żelu enzymatycznego i inkubowano przez 15 - 20 minut. Następnie oba żele oddzielono. Oczekiwano, że w czasie inkubacji w wyniku reakcji przyłączania substratów wytworzy się fosforan we wszystkich miejscach, za wyjątkiem tych, w których stężenie D-cykloseryny było wystarczająco wysokie by zahamować reakcję.

Wizualizacja testu

Koktajl wykrywający fosforan składający się ze świeżo przygotowanego roztworu 0,15% zieleni malachitowej i 1,4% molibdenianu amonowego w 1,33 N HCl rozprowadzono równomiernie na żele enzymatyczny i substratowy. Odczynniki te reagują z fosforanem i tworzą ciemne strefy, o intensywności barwy wprost proporcjonalnej do stężenia fosforanu. Kolor rozwijano przez 5 - 10 minut (fig. 6 przedstawia rozwijanie koloru w żelu, w którym stężenia inhibitora wahały się od 5 nmoli do 0,5 nmoli). Zabarwione na zielono żele fotografowano z wykorzystaniem systemu wizualizacji Eagle Eye (firmy Stratagene). Jak oczekiwano, stopień hamowania korespondował z mniejszą intensywnością zielonej barwy. Test można zatem stosować do poszukiwania inhibitorów VanA stosując kombinatoryczne kuleczki lub związki rozdzielone na dowolnej powierzchni, kontaktowanej następnie z żelem testowym.

Test ten wykazał również, że format żelowy odpowiedni jest do zastosowania w reakcjach wieloetapowych. Cecha ta jest konieczna, jeżeli format ten ma być stosowany w testach wieloetapowych. W tym przypadku, test VanA jest testem dwuetapowym: aktywności enzymatycznej i rozwijania koloru. Wersja homogenna (jednoetapowa) tego testu nie jest łatwo stosowalna, ponieważ

PL 194 813 B1 odczynniki niezbędne do prowadzenia reakcji barwnej zakłócają aktywność VanA i są również niezgodne z formatem żelowym. Zatem pożądane jest czasowe i przestrzenne rozdzielenie wspomnianych dwu etapów, poprzez zastosowanie wpierw enzymatycznego testu żelowego, a następnie etapu reakcji barwnej w roztworze.

P r z y k ł a d 2: Dwuetapowy test żelowy do wykrywania fosforanu tworzonego przez aktywność ATPazy czynnika EF-3 S.cerevisiae stymulowanej wiązaniem rybosomów

Gdy grzybowy czynnik elongacyjny 3 (EF-3) oddziaływuje z rybosomami, stymulowana jest aktywność fosfatazy. Wynalazcy zastosowali test CF-HTS do śledzenia tej aktywności.

Przygotowano żel enzymatyczny zawierający EF-3 (enzym bardzo wrażliwy na temperaturę) i drożdżowe rybosomy w buforze testowym EF-3. Żel substratowy zawierał 1 mM ATP w buforze testowym. Oba żele zawierały 2% DMSO w agarozie o niskim punkcie topnienia (Gibco BRL) i przygotowano je w 37°C, pozostawiając do zgęstnienia przez 30 minut w 4°C. Przygotowano serie rozcieńczeń poli-L-lizyny, inhibitora EF-3, jako kontroli pozytywnej i rozdzielono na membranę PVDC (podłoże testowe zawierające próbki). Test przeprowadzono tak, jak opisano w Przykładzie 1, stosując inkubację wstępną żelu enzymatycznego z inhibitorem na podłożu testowym. Następnie żel enzymatyczny umieszczono tak, by kontaktował się z żelem substratowym przez 20 minut. Tak jak to podano w Przykładzie 1, żele enzymatyczny i substratowy barwiono mieszaniną zieleni malachitowej i molibdenianu amonowego. Następnie żel enzymatyczny wizualizowano stosując kamerę CCD. Obszary zawierające inhibitor miały wygląd jaśniejszych stref na zielonym tle. Fig. 7 ilustruje wywoływanie barwy w żelu z rozcieńczeniami inhibitora od 5 pmoli do 200 pmoli. Wyniki obrazują hamowanie zależne od stężenia, co wskazuje, że stosując wspomniany test można odkrywać nowe inhibitory czynnika EF-3. Przykład 2 demonstruje użyteczność testu CF-HTS w przypadku wprowadzenia do testu organelli lub innych surowych ekstraktów lub mieszanin komórkowych.

P r z y k ł a d 3: Test gELISA do pośredniego wykrywania kolorymetrycznego inhibitorów oddziaływań białko - białko.

Jak wspomniano powyżej, test ELISA jest stosowany powszechnie do wykrywania hamowania oddziaływania liganda z receptorem, w warunkach immobilizacji receptora w studzienkach płytki do rozcieńczeń. Pary liganda z receptorem stosowane w teście ELISA mogą obejmować dowolne pary wiążących się wzajemnie cząsteczek, poczynając od białek i innych makrocząsteczek, aż do związków niskocząsteczkowych. Testy te są złożone, wieloetapowe i wymagają unieruchamiania receptora, inkubowania receptora z ligandem, płukania w celu usunięcia niespecyficznie związanego liganda, który w przeciwnym razie mógłby zwiększać wysoki poziom tła, wiązania odczynników wizualizujących (np. przeciwciała specyficznego wobec liganda, związanego z enzymem reporterowym) receptor związany z ligandem i tworzenia widocznego sygnału przez dostarczenie substratu enzymowi reporterowemu. Wspomniana złożoność testu ELISA sprawiła, że uznano go za niemożliwy do przekształcenia w format testu dowolnego. Niemniej jednak wynalazcy zaadoptowali wspomniany wieloetapowy test do formatu CF-HTS w celu poszukiwania wielu oddziaływań białko - białko, białko - ligand oraz innych oddziaływań wiążących ligand.

Aktywator plazminogenu typu urokinazy (uPA) wiąże się do odpowiadającego mu receptora (uPAR). Przypuszcza się, że oddziaływanie uPA/uPAR bierze udział w powstawaniu przerzutów wielu nowotworów. Wynalazcy zaadoptowali tradycyjny test ELISA uPA/uPAR do formatu CF-HTS wykorzystując oczyszczone receptory i ligandy.

Podłoże zawierające uPAR

Plastikowe płytki (7,5 x 11,5 cm z firmy Nunc) pokryto przez noc 15 ml oczyszczonego uPAR o stężeniu 118 nM w buforze fosforanowym (PBS) (Life Technologies, Grand Island, USA) w pH 7,4 i 4°C. Po pokryciu plastikowej płytki przez noc roztwór uPAR zdekantowano, a pozostałe miejsca wiążące na płytce plastikowej zablokowano stosując 15 ml PBS zawierającego 1% (w/v) kazeiny i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu, roztwór blokujący zlewano i płytkę plastikową przemywano pięć razy 20 ml buforu do płukania, składającego się z 0,05% Tween20 (monolaurynian polioksyetylenosorbitowy) w PBS. Po przepłukaniu plastikową płytkę suszono przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Płytka powinna być użyta w krótkim czasie po wyschnięciu w celu uniknięcia przesuszenia, prowadzącego do utraty aktywności.

Podłoże zawierające b-uPA

Dla celów testu stosowano uPA znakowane biotyną (b-uPA). Żele zawierające b-uPA przygotowano przez namaczanie b-uPA w agarze, w celu uniknięcia wysokich temperatur (w odróżnieniu od postępowania opisanego w Przykładzie 1 i 2, w którym wlewano odczynnik do stopionego agaru).

PL 194 813 B1

Agar przygotowano przez zmieszanie najpierw 0,1 g agarozy (Sigma, StLouis, USA) z 10 ml PBS, ogrzaniu aż do stopienia i wylaniu do aparatu do wylewania żeli o wielkości 8 x 7 x 0,075 cm³ (BioRad, Hercules, USA). Po stwardnieniu (w temperaturze pokojowej lub w 4°C) żele moczono przez noc w 4°C w 15 ml b-uPA (o stężeniu około 10 nM) w buforze testowym składającym się z PBS, 0,05% Tween-20 i 0,1% kazeiny (oba odczynniki z firmy Sigma). Żel suszono przez 20 minut w temperaturze pokojowej jak podano wyżej.

Podłoże zawierające próbki (podłoże testowe)

Ponieważ nie jest znany niskocząsteczkowy inhibitor oddziaływania uPA/uPAR, stosowano niebiotynylowany uPA (Pro-uPA) jako inhibitor kontrolny wiązania b-uPA/uPAR. Na membranę PVDC (Dowbrands, Indianopolis, USA) rozdzielano próbki o objętości 0, 0,003, 0,1, 0,3, 1 i 3 μΜ pro-uPA w buforze testowym i suszono przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.

Inkubowanie uPAR z Pro-uPA i b-uPA

Podłoże testowe umieszczono na jednej stronie żelu zawierającego buPA z wysuszonymi plamkami pro-uPA kontaktującymi się z powierzchnią żelu zawierającego b-uPA. Pro-uPA dyfundował do żelu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie drugą stronę żelu zawierającego b-uPA umieszczono na plastikowej płytce w celu umożliwienia b-uPA (ligandowi) i pro-uPA (inhibitorowi kompetytywnemu) oddziaływania z uPAR na powierzchni płytki plastikowej. Reakcję wiązania/kompetycji prowadzono w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po inkubacji plastikową płytkę oddzielono od żelu i szybko płukano 4 razy po 20 ml buforu do płukania. Jednocześnie przygotowano roztwór konjugatu awidyny i peroksydazy z korzenia chrzanu (awidyna-HRP) przez rozpuszczenie awidyny-HRP (Sigma) do rozcieńczenia 1:15,000 w buforze testowym i dodano 15 ml tego roztworu do płytki plastikowej. Reakcję prowadzono przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zlano roztwór awidyny-HRP i płytkę przepłukano jak podano wyżej. Następnie płytkę plastikową suszono przez 20 minut.

Awidyna z konjugatu awidyny z HRP wiąże się specyficznie z biotyną, tak że tylko obszary podłoża wykazujące zdolność do wiązania liganda z receptorem są zdolne do ewentualnego wybarwienia. Obszary podłoża w których wiązanie receptora z ligandem jest kompetycyjnie hamowane przez pro-uPA nie wybarwiają się.

Powstawanie koloru

Żel wywołujący kolor, zawierający kolorymetryczny substrat HRP (żel OPD) przygotowano przez rozpuszczenie tabletki chlorowodorku 2-o-fenylenodiaminy(OPD) w 7 ml rozpuszczalnika (oba z firmy Abbot kit nr 6172-30, Abbott Labs, Abbott Park, USA) i połączeniu tego roztworu z roztworem agarozy przygotowanym z 0,1 g agarozy stopionej w 3 ml wody. Końcową mieszaninę o objętości 10 ml wylano do aparatu Mini Protein II (8 x 7 x 0,075 cm) i pozostawiono do zestalenia w 4°C przez 15 minut. Żel przeniesiono następnie spomiędzy płytek szklanych do aparatu utrzymującego żel na PVDC lub giętką kartkę plastikową i pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Żel przeniesiono następnie na inną plastikową kartkę lub membranę PVCD i pozostawiono do wyschnięcia drugiej strony przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie żel OPD umieszczono na plastikowej płytce, w celu uzyskania powstawania koloru. Kilkakrotnie w czasie inkubacji żelu OPD, plastikową płytkę umieszczano na szczycie filtra o przenikalności fali światła 440 nm (Omega Optical Inc, Brattleboro, USA), który z kolei umieszczony był na płytce rozpraszającej światło, oświetlonej od góry przez źródło światła Fiber-Light (oba z Dolan-Jenner Industries Inc, Lawrence USA). Uzyskany w ten sposób obraz wizualizowano stosując kamerę CCD (Eagle Eye System, Stratagene, LaJolla, USA).

Eksperyment kontrolny

Figura 8 przedstawia eksperyment kontrolny dla Przykładu 3. Fig. 8A: fragmenty agarozowe (o powierzchni 1 cm²) przemyto w roztworze o różnym stężeniu b-uPA, jak wskazano to w opisie (za wyjątkiem roztworu 50nM, który oznaczony jest na lewej pozycji fragmentów agarozowych). Po przeprowadzeniu inkubacji fragmentów agarozowych na plastikowej płytce zawierającej unieruchomione uPAR, zostały one usunięte. Następnie płytkę plastikową przemyto i fragmenty podłoża w których doszło do wiązania b-uPA /uPAR wizualizowano jak to podano wyżej. Fig. 8B przedstawia wykres średniej wartości pikseli (pomniejszonej o tło) dla każdego fragmentu agarozowego (jak określono to analizując obraz cyfrowy z kamery CCD, stosując program NIH Image Analysis) wobec stężenia β-uPA w każdym fragmencie agarozowym w różnych czasach w trakcie rozwijania koloru. b-uPA dostarczany z żelu agarozowego wykazywał typową krzywą wiązania receptora z ligandem, z wartością K_d około 3 - 5 nM, co jest zgodne ze znanymi wartościami dla tej reakcji ustalanymi w teście

PL 194 813 B1 standardowym ELISA i innych testach mierzących wspomniany parametr kinetyczny. Fig. 8 wykazuje, iż pośredni sygnał kolorymetryczny tworzony w teście gELISA jest w sposób ilościowy zależny od stopnia oddziaływania liganda z receptorem.

Wyniki oddziaływania kompetycyjnego Pro-uPA/b-uPA

Figura 9 przedstawia hamowanie wiązania b-uPA /uPAR przez Pro-uPA. Plamki na fig. 9 wskazują obszary hamowania wiązania b-uPA /uPAR. Odpowiednio w obszarach tych nie wiąże się konjugat awidyny z HRP. W związku z tym HRP nie reaguje z substratami w żelu OPD. Fig. 9B przedstawia w odmienny sposób te same dane z obrazu z kamery CCD, wzmacniające obraz ilościowego miareczkowania, widziany gołym okiem.

P r z y k ł a d 4: Bezpośrednie wykrywanie radiometryczne hamowania oddziaływania białko - białko.

Aktywacja komórek T jest składnikiem odpowiedzi immunologicznej organizmu. W celu wywołania aktywacji komórek T, białko p561ck (LCK) musi oddziaływać z regionem ITAM (motywem związanej z immunoglobuliną opartej na tyrozynie aktywacji) cytoplazmatycznej domeny receptora antygenowego komórek T. Związki hamujące wspomniane oddziaływanie białko - białko są potencjalnymi immunosupresorami. Wynalazcy zastosowali test CF-HTS do badania wspomnianego oddziaływania białko - białko. We wspomnianym teście białko LCK jest unieruchomione na membranie.

Podłoże LCK

Biotynylowane białko LCK unieruchomiono na membranie wiążącej biotynę (membrana SAM) (Promega Corp, Madison, USA) poprzez zalanie 11 x 2 cm fragmentu membrany w 5 ml 3 mM LCK w PBS z 5 mM DTT (ditiotreitolem) na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie bufor usunięto. W ciągu kilku następnych minut membrana SAM mogła być wykorzystywana w teście.

Podłoże ITAM*

Żel zawierający wyznakowany radioaktywnie peptyd ITAM (ITAM*) przygotowano poprzez zmieszanie 0,1 g agarozy z 10 ml buforu, ogrzanie do stopienia i wylanie w aparacie do wylewania żeli (8 x 7 x 0,075 cm). ITAM* dodawano tuż przed wylaniem żelu lub alternatywnie moczono żel w roztworze ITAM* o końcowym stężeniu 10 nM.

Podłoże zawierające próbki

Próbki rozdzielano na plastikową powierzchnię lub membranę PVDC i suszono.

Inkubowanie ITAM*, LCK i próbek testowych oraz wizualizacja wyniku

Podłoże testowe kontaktowano z jedną stroną żelu ITAM* tak, że próbki testowe dyfundowały do żelu ITAM*. Następnie, drugą stronę żelu ITAM* kontaktowano z membraną SAM zawierającą unieruchomione białko LCK. Po inkubacji przez 15 - 45 minut membranę SAM usuwano, przemywano i wizualizowano stosując fosfoimager lub film. Inhibitory oddziaływania ITAM-LCK wskazywane były przez strefy o niższej radioaktywności, co odpowiada niższej intensywności sygnału na obrazie.

Eksperyment kontrolny dla testu wiązania ITEM*/LCK

Przygotowano żel agarozowy przez zmieszanie 0,1 g agarozy z 10 ml buforu, ogrzanie do stopienia i wylanie w aparacie do wylewania żeli (8 x 7 x 0,075 cm). Po zastygnięciu wycinano fragmenty o średnicy 1 cm i namaczano w 400 ml 0,1, 0,3, 1, 3, 10 i 20 nM wyznakowanego I -ITAM (Amersham, Arlington, USA) w buforu przez noc w 4°C. Fragmenty żelu usunięto następnie z roztworu i suszono przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie fragmenty żelu umieszczono na membranie SAM z unieruchomionym LCK i inkubowano przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Żele następnie usuwano i membranę przemywano 4 razy buforem. Po wysuszeniu membrany SAM wizualizowano stosując fosfoimager.

Figura 10 przedstawia zależne od stężenia wiązanie I -ITAM unieruchomionym LCK na membranie SAM.

Figura 11 przedstawia wykres średniej wartości pikseli (pomniejszonej o tło) dla każdego fragmentu agarozowego (jak to określono analizując obraz z fosfoimagera, stosując program Image Quant (Molecular Dynamics) wobec stężenia I -ITAM w każdym fragmencie agarozowym. I -ITAM dostarczany z żelu agarozowego do unieruchomionego LCM wykazywał typową krzywą wiązania receptora z ligandem.

P r z y k ł a d 5. Test genowy z wykorzystaniem reportera komórkowego w formacie żelowo-filtrowym

Komórki nerki (HEK) transfekowano plazmidem zawierającym element CRP (CREB) w obrębie promotora przyłączonego do genu kodującego lucyferazę (konstrukt genu reporterowego lucyferazy z firmy Promega). Gdy komórki transfekowane traktowano forskoliną, następowała indukcja ekspresji

PL 194 813 B1 genu reporterowego lucyferazy. Następnie, gdy dodano do komórek HEK bufor biologiczny zawierający substrat lucyferazy (lucyferyna owadzia firmy Promega) i odpowiednie kofaktory (20 mM Tricyna pH 7,8, 0,1 mM EDTA, 33 mM DTT, 0,3 mM koenzym A, 0,5 mM ATP, 1 mM MgCh), wywołało to emisje fotonów wykrywalną w konwencjonalny sposób. Wynalazcy zaadoptowali wspomniany test do formatu CF-HTS.

Podłoże komórkowe

Kulturę komórek traktowano trypsyną, przeniesiono następnie na membranę TRANSWELL (Corning Costar) (3 mikronowy filtr poliwęglanowy z plastikowym O-ringiem) i inkubowano przez noc w 37°C, 5% CO2 w obecności tkankowego podłoża hodowlanego. Następnie podłoże hodowlane usuwano z membrany i filtr z przyczepionymi do niego komórkami suszono na powietrzu przez 15 minut i wykorzystywano w teście w krótkim czasie po przygotowaniu.

Podłoże zawierające induktor (podłoże induktorowe)

Żel zawierający induktor ekspresji lucyferazy przygotowano przez dodanie 12 ml z 10 mM roztworu wyjściowego forskoliny (firmy Sigma, roztwór etanolowy) w 6 ml 1% agarozy o niskim punkcie topnienia. Żel zestalono w temperaturze pokojowej, a stężenie ostateczne forskoliny w żelu wynosiło 20 mM.

Podłoże testowe

Próbki mogące blokować indukcję wywoływaną przez forskolinę rozdzielono z dużą gęstością na membranę PVDC i wysuszono na powietrzu.

Inkubowanie odczynników i wykrywanie hamowania

Powierzchnię membrany PVDC zawierającą inhibitor inkubowano z żelem induktorowym. Następnie żel zawierający induktor (forskolinę) umieszczono na stronie nie zawierającej komórek podłoża komórkowego przygotowanego jak to podano wyżej i inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez 20 minut. Następnie żel z forskoliną usunięto i podłoże komórkowe inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez dodatkowe 4 godziny dla maksymalnej ekspresji konstruktu lucyferazy. W celu wykrycia aktywności enzymatycznej lucyferazy (lub jej hamowania) podłoże komórkowe oddzielono od plastikowego podłoża i umieszczano na płytce Petriego. Płytkę Petriego pokryto następnie substratem lucyferazy (lucyferaza owadzia firmy Promega) w buforze biologicznym z odpowiednimi kofaktorami w celu wywołania emisji światła jako sygnału. Ponieważ sygnał zlokalizowany jest w obrębie unieruchomionych komórek eksprymujących lucyferazę, inhibicja etapu indukcji prowadzi do powstania stref o niższej emisji fotonów.

P r z y k ł a d 6: Test żelowo-filtrowy formatu CF-HTS do bezpośredniego wykrywania hamowania oddziaływania pomiędzy ligandem a komórką

Wiązanie liganda z receptorem na powierzchni komórki inicjuje drogę przekazywania sygnału w komórce, która ostatecznie prowadzi do odpowiedzi funkcjonalnej komórki (np. podziału komórki czy wydzielenia biologicznie aktywnych związków). W celu regulacji odpowiedzi biologicznej komórek w stanach chorobowych, szuka się często związków hamujących wiązanie ligandów do powierzchni komórek. Zwykle stosowaną metodą oceny hamowania wiązania liganda z receptorem komórkowym jest ocena zdolności inhibitora do zmniejszenia wiązania pomiędzy znakowanym radioaktywnie naturalnym ligandem a komórkami. Sposób obejmuje inkubację komórek z wyznakowanym radioaktywnie ligandem i inhibitorem, usunięcie niezwiązanego i niespecyficznie związanego radioliganda przez przemycie i następnie mierzenie ilości związanej radioaktywności.

Interleukina 8 (IL-8) jest chemotaktyczną chemokiną wiążącą się z receptorami wielu rodzajów komórek. Wynalazcy opracowali test CF-HTS wiązania receptora komórkowego z ligandem, do wykrywania tego oddziaływania.

Podłoże komórkowe

Komórki HEK (ATCC, Bethesda, USA) eksprymujące receptor IL-8 umieszczono na membranie TRANSWELL o średnicy 75 mm (Corning Costar) do gęstości około 20 mln komórek na płytkę. Komórki pozostawiono do przyczepienia się do membrany przez noc w buforze RPMI (Life Technologies, Grand Island, USA) zawierającym 10 mM HEPES (Sigma) pH 7,2 i w 37°C. Następnie usunięto bufor i przyczepione komórki przemyto świeżym buforem w celu usunięcia pozostałych nieprzyczepionych komórek. Filtry odwrócono komórkami do dołu i umieszczono pod kątem, w celu umożliwienia wypłynięcia nadmiaru buforu i następnie suszono przez 20 minut. Tak przygotowane podłoże wykorzystywano w teście w krótkim czasie po przygotowaniu.

Podłoże ligandowe

Podłoże ligandowe przygotowano przez namoczenie z wyznakowaną I IL-8 (Amersham, Arlington, USA) żelu agarozowego przygotowanego przez zmieszanie 0,1 g agarozy z 10 ml buforu,

PL 194 813 B1 ogrzanie do stopienia i wylanie w aparacie do wylewania żeli (8 x 7 x 0,075 cm). Żel namaczano przez noc w temperaturze pokojowej na wolno mieszającej platformie (New Brunswick Scientific Co,

Edison, USA). Po przemyciu żele suszono przez 20 minut w temperaturze pokojowej tuż przed użyciem w teście.

Podłoże testowe

Ze względu na brak znanych inhibitorów wiązania IL-8 do receptora komórkowego, jako inhibitor kompetycyjny zastosowano niewyznakowaną radioaktywnie IL-8 (Genezyme Corp, Cambridge, USA) jako kontrolną próbkę w celu zaobserwowania hamowania wiązania I IL-8 do komórek HEK. 1 mikrolitr 0, 0,03, 0,1,0,3, 1, 3, 10 i 100 mM IL-8 rozdzielono na plastikową kartkę, taką jak membrana PVDC i suszono przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod próżnią.

Inkubacja

Podłoże testowe umieszczono na jednej stronie podłoża ligandowego tak, że wysuszone kropki IL-8 kontaktowały się z powierzchnią żelu. Żel odwrócono w celu umożliwienia schnięcia drugiej strony powierzchni żelu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i umożliwienia dyfuzji „inhibitora” do żelu. Następnie żel umieszczano na niezawierającej komórek stronie podłoża komórkowego. Reakcję wiązania prowadzono przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie żele usuwano i stronę membrany nie zawierającą komórek przemywano czterokrotnie buforem. Membrany pozostawiano do całkowitego wysuszenia przed oddzieleniem od ich o-ringu. Następnie membrany wizualizowano stosując albo film rentgenowski albo fosfoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA).

Figura 12 przedstawia odpowiedz zależną od stężenia I IL-8 w żelu agarozowym, dyfundującą przez podłoże komórkowe do komórek HEK eksprymującymi receptor IL-8a, i wiążącą się z nimi. Kilka 1 cm fragmentów agarozowych namaczano w buforze zawierającym różne stężenia I IL-8, tak jak to wskazano. Następnie fragmenty agarozy namoczone w buforze zawierającym ligand kontaktowano z podłożem komórkowym jak to opisano powyżej. Po inkubacji fragmenty agarozowe usuwano z podłoża komórkowego i stronę membrany nie zawierającą komórek przemywano buforem. Do zlokalizowania komórek wiążących I IL-8 stosowano fosfoimager. Dane wskazują, że bezpośrednie odczytywanie radiometryczne wyniku testu jest ilościowo zależne od reakcji liganda z receptorem. Fig. 12 wskazuje również, że obszary wiążące nie są rozmyte, a więc dyfuzja horyzontalna nie stanowi problemu w tym teście.

Figura 13 przedstawia wyniki eksperymentu hamowania kompetycyjnego. Na hamowanie wiązania pomiędzy I IL-8 a komórkami HEK wskazują obszary przejaśnione. Łatwo również zaobserwować, że hamowanie reakcji przez niewyznakowaną IL-8 jest mierzalnie zależne od dawki. Wyniki te wskazują, że inhibitor, którego przykładem jest niewyznakowana IL-8, może pokonywać podłoże testowe, hamując wiązanie I IL-8 z komórkami HEK.

P r z y k ł a d 7: Funkcjonalny test komórkowy wykorzystujący filtr

Zmiany w funkcjach komórek mierzy się często poprzez obserwowanie wpływu składników testowych lub próbek na system reporterowy wprowadzony do komórek. Przykłady obejmują obserwowanie efektów syntezy wewnątrzkomórkowych białek fluorescencyjnych, takich jak GFP (green fluorescent protein), białek pozakomórkowych, takich jak receptor czy cząsteczki adhezyjne, lub specyficznych enzymów, takich jak lucyferaza, acetylotransferaza chloramfenikolowa, czy b-galaktozydaza (Promega). Najpierw składniki testowe inkubowane są z komórkami. Następnie komórki eksprymują białko reporterowe przez odpowiedni okres czasu (minuty, godziny lub dni). Następnie poziom białka reporterowego mierzony jest sposobami bezpośrednimi (np. GFP) lub pośrednimi (np. ELISA, techniki wykorzystujące wiązanie białek do membran). Ponadto w przypadku enzymów, komórki można rozbijać w celu wyekstrahowania białka reporterowego i testowania jego aktywności enzymatycznej. Inne funkcjonalne testy komórkowe obejmują pomiar zachowania się lub lokalizacji specyficznych cząsteczek, takich jak barwników lub znakowanych radioaktywnie metabolitów w odpowiedzi na stymulację receptora lub zmianę fizjologicznego stanu komórki, takiego jak potencjał membranowy.

Test ELISA mierzący wpływ składników testowych na ekspresję wewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej I (ICAM-I) można przystosować do formatu CF-HTS w następujący sposób. Komórki śródbłonkowe eksprymujące ICAM-I przeniesiono na płytkę z poliwęglanowej membrany chemotaktycznej (Neuro Probe) do gęstości około 5000 komórek/mm². Komórki inkubowano przez noc w 37°C w pożywce. Pożywkę następnie usunięto i membrany pozostawiono do częściowego wyschnięcia przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Próbki lub związki testowane pod względem zdolności indukowania ICAM-I wysuszono na plastikowych kartkach i kontaktowano z niezawierającą komórek

PL 194 813 B1 stroną wilgotnej membrany. Związki oddziaływały z komórkami przez 1 godzinę w 37°C w komorze wilgotnościowej, następnie komórki zanurzono w pożywce i inkubowano przez 5 godzin w 37°C.

Po czasie umożliwiającym komórkom zsyntezowanie zaindukowanego białka, pożywkę usunięto z membrany i komórki inkubowano w buforze zawierającym przeciwciała anty-ICAM-I (Genzyme) sprzężone lub nie sprzężone z fluoresceiną (FITC) lub biotyną. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej bufor usunięto i komórki przemyto kilkanaście razy w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał anty-ICAM-I. W przypadku przeciwciał skonjugowanych z FITC membranę wizualizowano stosując kamerę CCD (Stratagene, Imaging Research) stosując falę wzbudzenia 485 nm i odczyt emisji 520 nm. Związki stymulujące ekspresję ICAM-I wytwarzają strefę zwiększonej fluorescencji, spowodowanej wiązaniem konjugatu FITC z przeciwciałem anty-ICAM-I do komórek. W przypadku przeciwciała sprzężonego z biotyną, komórki inkubowano w buforze zawierającym awidynę-HRP przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Bufor usuwano i niezwiązaną awidynę-HRP odpłukiwano. Membrany następnie płukano w buforze zawierającym strącalny substrat HR, taki jak tetrachlorek diaminobenzydynowy (Pierce) i obserwowano powstawanie koloru w obszarach zawierających komórki zaindukowane do ekspresji ICAM-I. W przypadku stosowania niesprzężonych przeciwciał anty-ICAM-I, stosowano drugorzędowe przeciwciało anty-anty-ICAM-I sprzężone z odpowiednim reporterem, oraz membrany płukano następnie w buforze z substratem właściwym dla zastosowanego konjugatu i obserwowano powstawanie koloru. Obrazy zapisywano stosując kamerę CCD. Wszystkie wymienione warianty (FTIC, awidyna-HRP, anty-anty-ICAM-I) stanowią alternatywne reportery, zdolne do wytworzenia takich samych, ilościowych wyników, a zatem próbki wpływające na ekspresję ICAM-I można skorelować ze strefami zmniejszonego lub zwiększonego wytwarzania sygnału.

Podłożami w zaprezentowanym teście formatu CF-HTS są membrana i plastikowa kartka. W teście nie stosuje się podłoża żelowego.

P r z y k ł a d 8: Test formatu CF-HTS wykrywający składniki hamujące neuraminidazę

Podłoże testowe

Bibliotekę 528 poszczególnych, strukturalnie spokrewnionych związków testowano w układzie CF-HTS. Do rozcieńczania składników stosowano urządzenia Packard Multiprobe MP204 DT, rozdzielające związki z naczynek do 96 studzienkowych płytek i przenoszące związki na plastikowe kartki. Składniki rozcieńczano pierwotnie od stężenia 40 mM w DMSO do 200 mM w 50% EtOH/H2) w 96 studzienkowej płytce. Próbki przenoszono następnie w 1 ml powtórzeniach na plastikowe kartki o wymiarach 8 x 8 cm tak, że próbki rozdzielone były około 5 mm przestrzenią (BioRad cat nr 1652956) do gęstości 192 próbek na kartkę. Każda plamka 1 ml zwierała zatem około 200 pmoli konkretnego składnika biblioteki. Jako kontrolę stosowano rozcieńczenia kwasu 2,3-dihydro-2-deoxy-N-acetyloneuraminowego (DANA), znanego inhibitora neuraminidazy (Boehringer Mannheim cat nr 528544). Rozcieńczenia przygotowywano ręcznie, obok składników biblioteki na każdej kartce. Kartki suszono w próżni.

Podłoże enzymatyczne

Przed przeprowadzeniem testu neuraminidazę rozcieńczano 1500 razy z 25% glicerolowego rozcieńczenia wyjściowego, stosując PBS, do upłynnionego agarowego żelu, składającego się z 1% agarozy, 50 mM cytrynianu sodu pH 6,0, 10 mM chlorku wapniowego, w 40°C. Żel uformowano w aparacie, o wymiarach 8 x 8 x 0,075 cm i zestalono w 4°C.

Podłoże substratowe

Stosowano syntetyczny substrat neuraminidazy, kwas 2'-(4metylolumbeliferylo)-alfa-D-N-acetyloneuraminowy (Sigma, cat nr M-8639) rozcieńczony w 3 mM DMSO do końcowego stężenia 30 mM w upłynnionym agarze i wylewano tak, jak podano dla podłoża enzymatycznego.

Inkubacja i detekcja

Podłoże enzymatyczne umieszczono na podłożu testowym od strony zawierającej testowane, wysuszone składniki. Następnie podłoże substratowe umieszczono na wierzchu podłoża enzymatycznego. Podłoża inkubowano następnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W tym czasie substrat z wygaszoną fluorescencją i enzym dyfundowały razem pomiędzy dwoma żelami, następnie substrat został odszczepiony przez enzym wytwarzając wzrost sygnału fluorescencyjnego. Zjawisko to obserwowano stosując światło wzbudzenia o długości fali 340 nm i obserwowano emisję światła o długości fali 450 nm. Składniki zdolne do hamowania aktywności enzymu zmniejszały wzrost intensywności fluorescencji. Jako że żel zwiększał intensywność fluorescencji w większości miejsc, obszary zawierające inhibitor enzymu, który przedyfundował do żelu z kartki plastikowej, były widoczne jako ciemniejsze obszary o mniejszej fluorescencji. Zjawisko to można łatwo śledzić stosując kamerę CCD

PL 194 813 B1 z właściwym filtrem, ograniczającym rejestrowaną długość światła wzbudzania i emisji. Identyczność składników wykazujących zdolność do hamowania enzymu określano wyznaczając położenie strefy inhibicji, w odniesieniu do podłoża testowego. Porównując fluorescencję kontroli zawierającej DANA o znanych stężeniach, szacowano ilościowo IC₅₀ każdego składnika.

Wszystkie spośród 528 składników biblioteki testowano w powtórzeniach. Całkowita objętość żelu enzymatycznego wynosiła 33 ml lub 31,25 ml na poszczególny test. Ponadto wszystkie składniki testowano jednocześnie i warunki testu były stałe, w porównaniu z tradycyjnym testem 96 studzienkowym. Ponadto, co przedstawiono na fig. 14, test był wystarczająco czuły by wykryć inhibitory w rozcieńczeniach tak małych jak 100 mM. Szacowane wartości IC50 dla związków aktywnych były zgodne z danymi dla tych samych związków uzyskanymi z zastosowaniem tradycyjnego testu 96 studzienkowego, który wymagał 200 ml roztworu na poszczególny test. Patrz Tabela wyników ilościowych. Przykłady te wykazują, iż zastosowanie wysokich gęstości próbek testowanych zmniejsza czas i ponoszone koszty. Na przykład nawet niewielkie zmniejszenie przestrzeni rozdzielającej próbki z 5 mm do 2,5 mm zwiększa 4-krotnie ilość związków testowanych w przeliczeniu na jednostkę powierzchni. W tym eksperymencie spowodowało to możliwość zmniejszenia objętości próbki testowanej poniżej 10 ml. Ponadto odczynniki nie wymagały rozpipetowywania i mogły być stosowane w dużych, niepodzielonych objętościach.

Ilościowe wyniki testu żelowego

Próbka nr	Przybliżona maksymalna wartość Ki (mM) dla żelu	Szacowana wartość IC50 (mM) dla testu 96 studzienkowego
34	100	>100
35	80	>100
36	80	42
37	100	>100
38	100	>100
39	100	>100
40	40	32
41	100	>100
42	40	50
43	100	>100
44	>200	>100
45	100	>100
46	100	>100
47	10	7,5
48	100	>100
49	100	>100
50	100	>100

PL 194 813 B1

W celu wykazania użyteczności i zalet miniaturyzacji przetestowano 10800 poszczególnych składników stosując test formatu CH-HTS z całkowitą objętością żelu 17 ml (mniej niż 2 ml na próbkę). Aparat Packard Multiprobe stosowano do rozdzielania 30 nl objętości każdej próbki rozdzielonej przestrzenią 1 mm od następnej. Składniki rozdzielano z roztworu wyjściowego w DMSO o stężeniu 5 mM, tak że na płytkę nanoszono 150 pmoli każdego składnika. Jako kontrolny inhibitor stosowano DANA. Oprócz zwykłej kontroli w postaci rozcieńczeń poza układem składników testowych, zastosowano również kontrolne rozcieńczenia w obrębie układu próbek, jako próbki ślepe, tak że były one traktowane tak samo jak składniki testowe. Kartki plastikowe suszono i stosowano w teście jak podano powyżej. Wszystkie składniki w ilości 10800 testowano jednocześnie w czasie mniejszym niż godzina. Nie było konieczności stosowania pipet i/lub posługiwania się niewielkimi objętościami płynu, za wyjątkiem etapu wstępnego rozdzielania składników testowanych. Wyjątkowo wysoka gęstość próbek nie przeszkadzała w prowadzeniu testu ani wykrywaniu inhibitora. Ponadto wysoka gęstość nie komplikowała identyfikacji dwu położonych blisko siebie związków aktywnych (obserwowanych jako jaśniejsze obszary w żelu). Patrz fig. 15.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób jednoczesnego testowania wielu próbek różnych substancjj pod względem ich zdolności wzmagania bądź hamowania procesu biologicznego, znamienny tym, że:

a) osadza się w sposób uporządkowany niewielkie objętości każdej z więcej niż 96 próbek poszczególnych substancji na płaskie, porowate podłoże zawierające lub niosące jednolicie rozprowadzony odczynnik testowy w taki sposób, iż każda poszczególna substancja usytuowana jest na przypisanym jej, poszczególnym obszarze i tożsamość każdej z substancji można określić na podstawie jej miejsca osadzenia oraz pozostawia się osadzone próbki umożliwiając ich powolną dyfuzję w płaskim, porowatym podłożu, przy czym próbki poruszają się niezależnie,

b) obserwuje się oddziaływanie każdej substancji z odczynnikiem testowym, które koreluje się ze zdolnością badanej substancji do wzmagania lub hamowania procesu biologicznego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) :

i) osadza się w sposób uporządkowany niewielkie objętości każdej z więcej niż 96 próbek poszczególnych substancji na płaskie podłoże w taki sposób, iż każda poszczególna substancja usytuowana jest na przypisanym jej, poszczególnym obszarze i tożsamość każdej z substancji można określić na podstawie jej miejsca osadzenia, ii) kontaktuje się podłoże z porowatym podłożem z^\^i^r^^j^(^'^rm lub niosącym jednollcie rozprowadzony odczynnik testowy i umożliwia się niektórym z substancji dyfuzję do porowatego podłoża w taki sposób, iż przestrzenne umiejscowienie każdej z dyfundujących substancji można skorelować z miejscem na płaskim podłożu, na którym pierwotnie osadzono daną substancję, i iii) przeprowadza się etap (b).
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a):

i) osadza się w sposób uporządkowany niewielkie objętości każdej z więcej niż 96 próbek poszczególnych substancji na płaskie podłoże w taki sposób, iż każda poszczególna substancja usytuowana jest na przypisanym jej, poszczególnym obszarze i tożsamość każdej z substancji można określić na podstawie jej miejsca osadzenia, ii) kontaktujesiępłaskie podłoże z pi^rr^^^z^rmpc^r^c^o^^tt^rm podłożemzawierającymlubniosącym jednolicie rozprowadzony pierwszy odczynnik testowy i umożliwia się częściową dyfuzję każdej z substancji do porowatego podłoża w taki sposób, iż przestrzenne umiejscowienie każdej z dyfundujących substancji można skorelować z jej miejscem na płaskim podłożu, na którym pierwotnie ją osadzono, iii) kontaktuje się pierwsze porowate podłoże z drugim podłożem zawierającym lub niosącym drugi jednolicie rozprowadzony odczynnik testowy i umożliwia się dyfuzję drugiego odczynnika testowego do pierwszego porowatego podłoża lub umożliwia się dyfuzję każdej z substancji i pierwszego odczynnika testowego do drugiego podłoża, przy czym w drugim przypadku zapewnia się taki przebieg dyfuzji, że umiejscowienie każdej z substancji w drugim podłożu można skorelować z miejscem na płaskim podłożu, na którym pierwotnie osadzono substancje, i iv) przeprowadza się etap (b).

PL 194 813 B1
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a):

i) osadza się w sposób uporządkowany niewielkie objętości każdej z więcej niż 96 próbek poszczególnych substancji na pierwsze płaskie, porowate podłoże zawierające lub niosące jednolicie rozprowadzony pierwszy odczynnik testowy w taki sposób, że każda poszczególna substancja usytuowana jest na przypisanym jej, poszczególnym obszarze i tożsamość każdej z substancji można określić na podstawie jej miejsca osadzenia, i ii) kontaktuje się porowate podłoże z drugim ρ^ε^ιτι podłożem zawierającym lub niosącym jednolicie rozprowadzony drugi odczynnik testowy i umożliwia się dyfuzję drugiego odczynnika testowego do pierwszego porowatego podłoża lub umożliwia się dyfuzję każdej substancji i pierwszego odczynnika testowego do lub na drugie podłoże, przy czym w drugim przypadku zapewnia się taki przebieg dyfuzji, że umiejscowienie każdej z substancji w lub na drugim podłożu można skorelować z miejscem na pierwszym porowatym podłożu, na którym pierwotnie osadzono substancje, i iii) przeprowadza się etap (b).
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednym z jednollcie rozprowadzanych odczynników testowych jest makrocząsteczka.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednym z jednoHcie rozprowadzanych odczynników testowych jest enzym.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednym z jednoHcie rozprowadzanych odczynników testowych jest nieoczyszczony ekstrakt biologiczny.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednym z jednoNcie rozprowadzanych odczynników testowych są organella.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednym z jednoHcie rozprowadzanych odczynników testowych są nienaruszone komórki.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że j ednoHcie rozprowadzonym odczynnikiem testowym są nienaruszone komórki naniesione na jedną powierzchnię płaskiego porowatego podłoża.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym. że w etapie (b) oddziaływanie obserwuje się poprzez kontaktowanie porowatego podłoża z roztworem lub płynną zawiesiną odczynnika lub porowatym podłożem zawierającym odczynnik, co w obu przypadkach wspomaga wizualizację białka, którego ekspresja w nienaruszonych komórkach stanowi badany proces biologiczny.
12. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że pierwszym odczynnikiem testowym jest znaczony ligand, a drugim odczynnikiem testowym jest unieruchomiony receptor specyficzny względem liganda.
13. Sposób wedługzassrz. t2, znamiennytym, że drugie ppaskke podłoże ρ^θ-^^ sśę w celu usunięcia znaczonego liganda, który przedyfundował na lub do drugiego płaskiego podłoża, lecz nie uległ związaniu z unieruchomionym receptorem.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że drugie płaskie podłoże kontaktuje się z roztworem lub płynną zawiesiną odczynnika lub porowatym podłożem zawierającym odczynnik, co w obu przypadkach wspomaga wizualizację znaczonego liganda nie usuniętego w czasie etapu przemywania.