PL194863B1 - Syntetyczne peptydy, zawierające je kompozycje, zastosowania tych peptydów oraz zestaw diagnostyczny - Google Patents

Syntetyczne peptydy, zawierające je kompozycje, zastosowania tych peptydów oraz zestaw diagnostyczny

Info

Publication number
PL194863B1
PL194863B1 PL336115A PL33611598A PL194863B1 PL 194863 B1 PL194863 B1 PL 194863B1 PL 336115 A PL336115 A PL 336115A PL 33611598 A PL33611598 A PL 33611598A PL 194863 B1 PL194863 B1 PL 194863B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
leu
asn
residue
val
ser
Prior art date
Application number
PL336115A
Other languages
English (en)
Other versions
PL336115A1 (en
Inventor
Denis Marie Bernard Chenebaux
Jean-Francois Hubert Delagneau
Stephane Jean Xavier Gadelle
Francois Yves Rieunier
Original Assignee
Bio Rad Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26233456&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL194863(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from FR9704356A external-priority patent/FR2761993B1/fr
Priority claimed from FR9802212A external-priority patent/FR2775287B1/fr
Application filed by Bio Rad Pasteur filed Critical Bio Rad Pasteur
Publication of PL336115A1 publication Critical patent/PL336115A1/xx
Publication of PL194863B1 publication Critical patent/PL194863B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

1. Syntetyczne peptydy typu monomeru o 13-33 aminokwasach lub typu dimeru o 26-66 aminokwasach, w postaci pro- stolancuchowej lub w postaci scyklizowanej za posrednictwem mostków disiarczkowych miedzy cysteinami, odpowiadajace ogólnemu wzorowi (I): ?-Z-Trp Gly Cys-T-Cys Tyr Thr Ser-O (I) w którym: - ? oznacza grupe biotynylowa, grupe biocytynylowa, atom wodoru, grupe acetylowa (CH 3CO-), lancuch alifatyczny, który moze zawierac jedna lub dwie funkcyjne grupy tiolowe, aldehydowe lub aminowe, przy czym lancuch alifatyczny jest korzystnie lancuchem alkilowym o 1-6 atomach wegla lub lancuchem alkenylowym o 2-6 atomach wegla, albo lancuchem ami- noalkilokarbonylowym o 2-6 atomach wegla, - Z oznacza sekwencje peptydowa o jednym ze wzorów (II)-(X): - ? 1-Ser-? 2- (II) - Ser-? 2- (III) -? 1-Ser- (IV) -? 1-Gln-? 2- (V) -Gln-? 2- (VI) -? 1-Gln- (VII) -? 1-Asn-? 2 (VIII) -Asn-? 2- (IX) -? 1-Asn- (X) w których: -? 1 oznacza sekwencje peptydowa o 0-9 aminokwasach oraz -? 2 oznacza sekwencje peptydowa o 0-5 aminokwasach, -T oznacza sekwencje peptydowa o wzorze (XI): ((AA 1) - (AA 2) - (AA 3) - (AA 4) - (AA 5) - (XI) w której: • (AA 1) oznacza reszte lizyny albo reszte argininy lub reszte ornityny, ……………………………………………… • (AA ) oznacza reszte glicyny lub reszte asparaginy, PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są syntetyczne peptydy, zawierające je kompozycje, zastosowania tych peptydów oraz zestaw diagnostyczny.
Syntetyczne peptydy według wynalazku mogą zostać wykorzystane w próbach biologicznych do wykrywania infekcji spowodowanych wirusem HIV-1 z grupy O, w kompozycjach i zestawach zawierających takie peptydy, jak również w próbach biologicznych stosujących takie peptydy.
Retrowirusy HIV-1 z grupy O są znane w uprzednim stanie techniki.
W opisie patentowym EP 0 345 375 i zgłoszeniu patentowym EP 0 657 532 opisane są izolaty ANT 70 i ANT 70 NA wyodrębnione od chorych Kameruńczyków. Dokumenty te opisują dokładniej antygeny i kompozycje antygenowe zawierające lizaty lub białka z tych izolatów, kwasy nukleinowe odpowiadające genomowemu RNA, metody hybrydyzacji z zastosowaniem tych kwasów nukleinowych, metody wytwarzania tych izolatów oraz sposoby wytwarzania białek p12, p16, p25, p41, gp120 tych retrowirusów.
W zgłoszeniu patentowym EP 0 591 914 opisano izolat MVP 5180/91. Izolat ten scharakteryzowany metodą Western Blot, wykazuje, tak jak poprzedni izolat, różnice w stosunku do izolatów retrowirusów HIV-1 wcześniej znanych. W zgłoszeniu patentowym EP 0 591 914 opisano dokładnie sekwencję DNA izolatu MVP 5180/91 i podano dokładną lokalizację genów gag, poi i env.
W zgłoszeniu patentowym EP 0 591 914 opisano też syntetyczne peptydy pętli V3 oraz region immunodominujący (gp41), które są przydatne do testów biologicznych, zwłaszcza do wykrywania in vitro przeciwciał HIV-1 z grupy O.
W zgłoszeniu EP 0 673 948 opisano peptydy syntetyczne lub rekombinowane utworzone z 15-50 aminokwasów (AA) i zawierające sekwencję
-VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLLXYTSVKWNTSWSGRw której X oznacza resztę cysteiny albo resztę seryny. Peptydy te są użyteczne w dziedzinie diagnostyki i służą do wykrywania infekcji spowodowanych pewnymi izolatami retrowirusów HIV-1 z grupy O.
Znane jest też zgłoszenie patentowe EP 0 727 483, w którym opisany jest izolat MVP 2901/94, który należy do retrowirusów z rodziny HIV-1 z grupy O. W zgłoszeniu tym opisano niektóre antygeny mające dobrze określone sekwencje peptydowe. Te peptydowe sekwencje odpowiadają części sekwencji gp120 i części gp41 (region immunodominujący) izolatu MVP 2901/94.
W zgłoszeniu patentowym WO 96/12809 opisane są dwa nowe izolaty należące do rodziny HIV-1 z grupy O. Są to izobaty VAU i DUR. W zgłoszeniu tym opisane są pewne sekwencje peptydowe pochodzące z dwóch wirusów cytowanych wyżej, użytecznych do wykrywania przeciwciał rozpoznających sekwencje peptydowe HIV-1 VAU lub DUR.
W zgłoszeniu patentowym WO 96/32293 opisano dwa antygeny pochodzące z sekwencji izolatu ANT 70. Jest to antygen nazwany MDLD61 i antygen MDL056, regionu immunodominującego gp41. Według tego wynalazku dla wykrycia 100% próbek z ograniczonej kolekcji surowic od chorych zakażonych wirusem HIV-1 z grupy O konieczne jest użycie kompozycji zawierających oba te peptydy, ponieważ sam każdy izolowany peptyd nie prowadzi do uzyskania zadowalających wyników.
W istocie ze względu na genetyczną zmienność wykazywaną przez izolaty wirusa z grupy O jest prawie niemożliwe zagwarantowanie serologicznego wykrycia zakażonych jednostek, gdy stosuje się antygeny pochodzące z tego samego i jedynego izolatu. Oznacza to, że jest niemożliwe otrzymanie reagentów, gwarantujących 100% czułość. W ten sposób przedstawiono po raz pierwszy ważny problem dla grupy O. Mianowicie dotyczy on niezgodności niektórych reagentów serologicznych do rozpoznawania jednostek zakażonych grupami lub podtypami szczególnie rozbieżnymi. Jest to dokładnie przypadek HIV-1 z grupy O.
W zgłoszeniu WO 96/40763 podkreślono również wielką rozbieżność grupy O. W zgłoszeniu tym opisano peptydy, które wprowadzają do naturalnej sekwencji HIV-1 typu B pewne małe zmiany (zastąpienie jednego lub dwóch aminokwasów). Według tego zgłoszenia te hybrydowe peptydy są zdolne do reagowania z przeciwciałami przeciw grupie O.
W zgłoszeniu WO 96/27013 opisano wiele nowych wirusów HIV-1 z grupy O oznaczonych BCF01, BCF02, BCF03, BCF06, BCF07, BCF08, BCF09, BCF11, BCF12, BCF13 i BCF14 oraz odpowiedni szereg peptydów z regionu dominującego gp41, nazwanych ESS/BCF02, FAN/BCF01,
PL 194 863 B1
LOB/BCF06, MAN/BCF07, NKO/BCF08, POC/BCF03, NAN/BCF11, BCF09, BCF12, BCF13 i BCF14. Pewna ilość tych peptydów jest mało dogodna w diagnostyce z powodu ich małej rozpuszczalności, zwłaszcza peptyd BCF13.
Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że pewne syntetyczne peptydy są reagentami diagnostycznymi o wyższej jakości i umożliwiają w zadowalający sposób wykrycie chorych zakażonych retrowirusami HIV-1 z grupy O. Te peptydy są złożone ze zmiennych sekwencji przyłączonych zawiasowo wokół krótkich sekwencji silnie zakonserwowanych, obecnych w izolatach retrowirusów HIV-1 z grupy O. Peptydy według wynalazku pozwalają na otrzymanie wyników dużo lepszych od uzyskanych przy użyciu syntetycznych peptydów niosących epitopy immunodominujące z gp41 (env) niektórych izolatów HIV-1 z grupy O.
W dalszej części opisu do nazywania aminokwasów używa się nomenklatury trzyliterowej.
Wynalazek dotyczy syntetycznych peptydów typu monomeru o 13-33 aminokwasach lub typu dimeru o 26-66 aminokwasach, w postaci prostołańcuchowej lub w postaci scyklizowanej za pośrednictwem mostków disiarczkowych między cysteinami, odpowiadających ogólnemu wzorowi (I):
A-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser-W (I) w którym:
- Δ oznacza grupę biotynylową, grupę biocytynylową, atom wodoru, grupę acetylową (CH3CO-), łańcuch alifatyczny, który może zawierać jedną lub dwie funkcyjne grupy tiolowe, aldehydowe lub aminowe, przy czym łańcuch alifatyczny jest korzystnie łańcuchem alkilowym o 1-6 atomach węgla lub łańcuchem alkenylowym o 2-6 atomach węgla, albo łańcuchem aminoalkilokarbonylowym o 2-6 atomach węgla,
- Z oznacza sekwencję peptydową o jednym ze wzorów (II)-(X):
-X1-Ser-X2- (II)
-Ser-X2- (III)
-X1-Ser- (IV)
-X1-Gln-X2- (V)
-Gln-X2- (VI)
-X1-Gln- (VII)
-X1-Asn-X2- (VIII)
-Asn-X2- (IX)
-X1-Asn- (X)
w których:
-X1 oznacza sekwencję peptydową o 0-9 aminokwasach oraz -Χ2 oznacza sekwencję peptydową o 0-5 aminokwasach,
-Θ oznacza sekwencję peptydową o wzorze (XI):
((AA1) - (AA2) - (AA3) - (AA4) - (AA5) - X)) w której:
· (AA1) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · (AA2) oznacza resztę glicyny lub resztę asparaginy, · (AA3) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · (AA4) oznacza resztę leucyny, albo resztę izoleucyny lub resztę glutaminy, · (AA5) oznacza resztę izoleucyny lub resztę waliny, albo resztę leucyny, albo resztę treoniny, albo resztę norleucyny lub resztę norwaliny, jednak pod warunkiem, że (AA1), (AA2), (AA3), (AA4) i (AA5) nie tworzą razem sekwencji peptydowych
-Lys Gly Lys Leu Ile- i -Lys Gly Lys Leu Val-,
- W związana z grupą -CO- seryny oznacza:
- grupę hydroksylową (-OH) lub grupę aminową (- NH2),
- grupę alkoksy zawierającą 1-6 atomów węgla,
- sekwencję peptydową o wzorze (XII):
PL 194 863 B1
- Val-S-Y (XII) gdzie Σ oznacza sekwencję o wzorze (XIII) lub o wzorze (XIV):
(ΆΆθ) -Trp Asn- (AA7) - (AA8) (XIII) (AA) -Trp His- (AA7) - (AAe) (XIV) w których:
(AA8) oznacza aminokwas różny od lizyny, (AA7) oznacza aminokwas, (AA8) oznacza resztę seryny lub treoniny, a Y związane z resztą -CO- wolnego aminokwasu AA8 oznacza grupę OH, NH2 lub grupę alkoksy zawierającą 1-6 atomów węgla,
- sekwencję peptydową o wzorze (XV):
-Val-Y XXV) w której Y związane z resztą -CO- waliny ma to samo znaczenie jak we wzorze (XII),
- lub sekwencję peptydową o wzorach (XVI)-(XVIII):
-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser-Y XVV0
Val-S-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Val-S-Y (XVH)
Val-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser Val-Y (XVIII) w których Z i Θ mają definicję podaną dla wzoru (I), Σ ma definicję podaną dla wzoru (XII), a Y związane z resztą -CO-seryny, z resztą -CO- aminokwasu AA8 lub z resztą -CO-waliny, ma to samo znaczenie jak we wzorze (XII).
Korzystne syntetyczne peptydy określone są wzorem (I), w którym (AA5) oznacza resztę waliny albo resztę leucyny, lub resztę treoniny i gdy Ω odpowiada sekwencji peptydowej o wzorze (XIII) lub (XIV), (AA6) oznacza resztę glutaminy lub resztę argininy.
Korzystne są również syntetyczne peptydy o wzorze (I), w którym:
Δ oznacza grupę biotynylową, atom wodoru lub łańcuch alifatyczny, który może zawierać jedną lub dwie funkcyjne grupy tiolowe, aldehydowe lub aminowe, przy czym łańcuch alifatyczny jest korzystnie łańcuchem alkilowym o 1-6 atomów węgla lub łańcuchem aminoalkilokarbonylowym o 2-6 atomów węgla,
Z oznacza sekwencję peptydową o wzorze (II) lub (V), w których Xi oznacza sekwencję peptydową o dwóch aminokwasach, a X2 oznacza aminokwas, albo sekwencję o wzorze (IV), w której Xi oznacza trzy aminokwasy lub sekwencję peptydową o wzorze (VIII), w której hi oznacza sekwencję peptydową o dziewięciu, ośmiu lub trzech aminokwasach, a E2 oznacza sekwencję peptydową o pięciu aminokwasach,
- Θ oznacza sekwencję peptydową o wzorze:
-Lys Gly Arg Leu Val-, lub -Arg Gly Arg Leu Val-, i -Ω oznacza grupę hydroksylową, sekwencję peptydową o wzorze (XV) lub jedną z następujących sekwencji, które odpowiadają sekwencji peptydowej o wzorze (XII):
-Val Arg Trp Asn Glu Thr-Y -Val Gln Trp Asn Glu Thr-Y lub -Val Gln Trp Asn Ser Thr-Y.
PL 194 863 B1
W powyżej określonych peptydach korzystnie Z oznacza sekwencję peptydową o wzorze:
· -Leu Leu Ser Leu· -Leu Leu Ser Ser· -Leu Leu Asn Ser· -Leu Leu Gln Ser· -Arg Leu Asn Ser· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile· -Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Serlub · -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn SerKorzystne są też syntetyczne peptydy o 2-50 aminokwasach o wzorze (Ia):
Δ-Za-Trp Gly Cys-0-Cys Tyr Thr Ser-Wa gdzie Za oznacza grupę o wzorach IIa-Xa:
- Xia-Ser-X2 (IIa)
- Ser-X2a (IIIa)
-X1a-Sera (IVa)
-Xla-Gln-X2a (Va)
-Gln-X2 (VIa)
-Xia-Gln (VIIa)
-X1a-Asn-X2a (VIIIa)
-Asn-X2a (IXa)
-Xia-Asn (Xa)
w których:
-Xia oznacza sekwencję peptydową o 1-5 aminokwasach oraz -X2a oznacza aminokwas,
-Wa oznacza sekwencję peptydową o wzorze (XII), jaką określono dla wzoru (I), lub sekwencję peptydową o wzorze (XVIIa):
Val-S-Za-Trp Gly Cys-0-Cys Tyr Thr Ser Val-S-Y (XVIIa) a
Δ, 0, S i Ψ mają te same znaczenia jak we wzorze (I).
W korzystnym wykonaniu wynalazku syntetyczne peptydy o wzorze (I) obejmują jedną z następujących sekwencji:
Sekwencja nr 2
-LLSLWGCRGRLVCTSVQWNETczyli
-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr
10
Thr Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr15 20 22
PL 194 863 Β1
Sekwencja nr 3
-LLS SWGCKGRLVCYTSVQWNETczyli
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
Thr Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr15 20 22
Sekwencja nr 4
-LLS SWGCKGRLVCYTSVQWNSRczyli
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
Thr Ser Val Gin Trp Asn Ser Thr15 20 22
Sekwencja nr 5
-LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNSTczyli
-Leu Leu Gin Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
Thr Ser Val Gin Trp Asn Ser Thr15 20 22
Sekwencja nr 8
-LLS SWGCRGRLVCYTSVQWNETczyli
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr
10
Thr Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr15 20 22
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr 20 22
PL 194 863 B1
Sekwencj a nr 9
-LLSSWGCKGRLVCYTSczyli
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
Thr Ser15
Sekwencja nr 10
-LLNSWGCKGRLVCYTSczyli
-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
Thr Ser15
Sekwencja nr 11:
-ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNETczyli
-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ser
1 5 10
Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp
15 20 25
Asn Glu Thr-
30
Sekwencja nr 12
-ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNETczyli
-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ile 1 5 10
Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp 15 20 25
Asn Glu Thr30
PL 194 863 Β1
Sekwencja nr 13:
-ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNETczyli
-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asp Leu 15 10
Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp 15 20 25
Asn Glu Thr30
Sekwencja nr 14
-LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSVczyli
-Leu Asn Gin Gin Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly 15 10
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val15 20
Sekwencja nr 15
-RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSVczyli
- Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gin Gin Arg Leu Leu Asn 1 5 10
Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val15 20 25
Sekwencja nr 16
-RLNSWGCKGRLVCYTSVczyli
-Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr
10
Thr Ser Val15
PL 194 863 B1
Peptydy te mogą być typu dimeru lub typu monomeru. Sekwencje podano według nomenklatury jedno- i trzyliterowej.
Korzystne są syntetyczne peptydy o sekwencji:
Peptyd nr 2 C^I3) : SEQ ID nr 2
LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET czyli
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr 20 22
Peptyd nr 3 (4B) : SEQ ID nr 3
LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET czyli
Leu 1 Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15
5 10
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr
20 22
Peptyd nr 4 (5B): SEQ ID nr 4
LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST czyli
Leu 1 Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15
5 10
Ser Val Gin Trp Asn Ser Thr
20 22
Peptyd nr 5 (6B): SEQ ID nr 5
LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST czyli
Leu Leu Gin Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
Ser Val Gin Trp Asn Ser Thr 20 22
PL 194 863 B1
Peptyd nr 8 (7B) : SEQ ID nr 8
LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET czyli
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
Peptyd nr 9 (12B): SEQ ID nr 9
LLSSWGCKGRLVCYTS czyli
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
Ser
Peptyd nr 10 (14B): SEQ ID nr 10
LLNSWGCKGRLVCYTS czyli
Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
Peptyd nr 11 (18B): SEQ ID nr 11
ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET czyli
Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ser Trp
1 5 10 15
Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn
20 25 30
Glu Thr
PL 194 863 B1
PL 194 863 B1
Peptyd nr 16 (23B): SEQ ID nr 16
RLNSWGCKGRLVCYTSV czyli
Arg Leu Asn Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
Ser Val
Wynalazek dotyczy również kompozycji, która zawiera jeden lub kilka syntetycznych peptydów według wynalazku o wzorze (I).
Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera peptyd nr 3 (4B) i peptyd nr 1 (2B).
W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja, która zawiera jeden lub kilka syntetycznych peptydów według wynalazku o wzorze (I), oraz jeden lub kilka rekombinowanych peptydów HIV-1 grupy O.
Wynalazek również dotyczy kompozycji zawierającej jeden lub kilka syntetycznych peptydów według wynalazku o wzorze (I) oraz jeden lub kilka rekombinowanych lub syntetycznych peptydów HIV-1 i/lub HIV-2.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania jednego lub kilku syntetycznych peptydów według wynalazku o wzorze (I) oraz zawierającej je kompozycji według wynalazku do testu immunologicznego in vitro.
Wynalazek dotyczy też zestawu diagnostycznego, który obejmuje przynajmniej jeden peptyd syntetyczny według wynalazku o wzorze (I) albo kompozycję według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzą również syntetyczne peptydy o 20-50 aminokwasach, odpowiadające ogólnemu wzorowi (I):
Δ-Z-T rp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr SerVal-SY (I) w którym:
- Δ oznacza grupę biotynylową, grupę biocytynylową, atom wodoru, grupę acetylową (CH3CO-), łańcuch alifatyczny, który może zawierać jedną lub dwie funkcyjne grupy tiolowe, aldehydowe lub aminowe, przy czym łańcuch alifatyczny jest korzystnie łańcuchem alkilowym o 1-6 atomach węgla lub łańcuchem alkenylowym o 2-6 atomach węgla,
- Z oznacza sekwencję peptydową o jednym ze wzorów (II)-(X):
- XrSer-X2- (I))
- Ser-X2- IIH)
-X1-Ser- 0V)
-X!-Gln-X2-Gln-X2- (V0
-X1-Gln- V/H)
-X1-Asn-X2- (VIII)
-Asn-X2- 0X)
-XrAsn- (X) w których:
-X1 oznacza sekwencję peptydową o 1-5 aminokwasach oraz -¾ oznacza aminokwas
-Θ oznacza sekwencję peptydową o wzorze (XI):
((AAG - (AA2) - (AA3) - (AA4) - (AA5) - (X) w której:
· (AAi) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · (AA2) oznacza resztę glicyny lub resztę asparaginy,
PL 194 863 B1 · (ΆΆβ) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · (ΆΆ4) oznacza resztę leucyny, albo resztę izoleucyny lub resztę glutaminy, · (AA5) oznacza resztę izoleucyny lub resztę waliny, albo resztę leucyny, albo resztę treoniny, albo resztę norleucyny lub resztę norwaliny, jednak pod warunkiem, że (ΆΆι), (ΆΆ2), (ΆΆ3), (ΆΆ4) i (ΆΆ5) nie tworzą razem sekwencji peptydowych,
-Lys Gly Lys Leu Ile- i -Lys Gly Lys Leu Val-,
-Σ oznacza sekwencję o wzorze (XII) lub o wzorze (XIII):
(ΆΆθ) -Trp Asn - (ΆΆ7) - (ΆΆβ) (XII) (ΆΆβ) -Trp His - (ΆΆ7) - (ΆΆβ) (XIII) w których:
(ΆΆβ) oznacza aminokwas różny od lizyny, (ΆΆ7) oznacza aminokwas, (ΆΆβ) oznacza resztę seryny lub treoniny, oraz a Ψ związane z resztą -CO- wolnego aminokwasu ΆΆβ oznacza grupę OH, grupę alkoksy zawierającą 1-6 atomów węgla, albo resztę peptydu Ω o wzorze:
Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser Yal-Σ-Ψ' w których Z, Θ i Σ mają definicję jak wyżej,
Ψ oznacza grupę OH rodnika alkoksy zawierającego 1 do 6 atomów węgla, w postaci prostołańcuchowej albo scyklizowanej za pośrednictwem mostków disiarczkowych między cysteinami, i peptyd o wzorze I połączony jest z fazą stałą.
Wynalazek dostarcza również syntetycznych peptydów typu monomeru o 13-33 aminokwasach lub typu dimeru o 26-66 aminokwasach, w postaci prostołańcuchowej lub w postaci zcyklizowanej za pośrednictwem mostków disiarczkowych między cysteinami, które odpowiadają ogólnemu wzorowi (I):
Δ-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser-Ω (I) w którym:
- Δ oznacza grupę biotynylową, grupę biocytynylową, atom wodoru, grupę acetylową (CH3CO-), łańcuch alifatyczny, mogący zawierać jedną lub dwie funkcyjne grupy tiolowe, aldehydowe lub aminowe, przy czym łańcuch alifatyczny jest korzystnie łańcuchem alkilowym o 1-6 atomach węgla lub łańcuchem alkenylowym o 2-6 atomach węgla, albo łańcuchem aminoalkilokarbonylowy6m o 2-6 atomach węgla,
- Z oznacza sekwencję peptydową o jednym ze wzorów (II)-(X):
-Xi-Ser-X2- (II)
-Ser-X2- (III)
-Xi-Ser- (IV)
-Xi-Gln-X2- (V)
-Gln-X2- (VI)
-Xi-Gln- (VII)
-XMsn-X2 (VIII)
^sn-X2- (IX)
-XMsn- (X)
w których:
-Xi oznacza sekwencję peptydową o 0-9 aminokwasach oraz -X2 oznacza sekwencję peptydową o 0-5 aminokwasach,
-Θ oznacza sekwencję peptydową o wzorze (XI):
PL 194 863 B1 ((AA,) - (AA2) - (AA3) - (AA4) - (AA5) - (XI) w której:
· (AA,) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · (AA2) oznacza resztę glicyny lub resztę asparaginy, · (AA3) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · (AA4) oznacza resztę leucyny, albo resztę izoleucyny lub resztę glutaminy, · (AA5) oznacza resztę izoleucyny lub resztę waliny, albo resztę leucyny, albo resztę treoniny, albo resztę norleucyny lub resztę norwaliny, jednak pod warunkiem, że (AA,), (AA2), (AA3), (AA4) i (AA5) nie tworzą razem sekwencji peptydowych,
-Lys Gly Lys Leu Ile- i -Lys Gly Lys Leu Val-,
- Ω związana z grupą -CO- seryny oznacza:
- grupę hydroksylową (-OH) lub grupę aminową (-NH2),
- grupę alkoksy zawierającą 1-6 atomów węgla, lub
- sekwencję peptydową o wzorze (XII) albo (XIII):
Val-(AA8)-Trp Asn-(AA-) - (AA8) OCH)
-Val-OH lub Val-NH2 (XIN) gdzie:
(AA6) oznacza aminokwas różny od lizyny, (AA7) oznacza aminokwas, (AA8) oznacza resztę seryny lub treoniny, lub sekwencję peptydową o wzorze (la):
-Z-Trp Gly Cys-C-Cys Tyr Thr Ser-Ω' (la) w których Z i Θ mają definicję podaną dla wzoru (I), a Ω oznacza grupę hydroksylową (OH), grupę aminową (NH2), grupę alkoksylową zawierającą 1-6 atomów węgla lub sekwencje peptydową o wzorze (XII) albo (XIII).
Gdy Ω, oznacza sekwencję peptydową przedstawioną jednym ze wzorów (XVI)-(XVIII), peptyd o wzorze (I) staje się dimerem, którego rozmiary mogą zmieniać się od 26 do 66 aminokwasów. Gdy Ω nie oznacza sekwencji peptydowej o jednym ze wzorów (XVI)-(XVIII), peptydy o wzorze (I) są typu monomeru i ich rozmiary mogą zmieniać się od 13 do 33 aminokwasów.
Peptydy według wynalazku mogą być w postaci prostołańcuchowej albo w postaci scyklizowanej za pośrednictwem disiarczkowych mostków między cysteinami.
Syntetyczne peptydy o wzorze (I) według wynalazku można otrzymać na drodze syntezy w fazie stałej według klasycznych metod: R.B.Merrifield, J.Am.Chem.Soc. (1963), 85, str. 2149-2154; R.C.Sheppard, w „Peptides 1971, Nesvadba H. (ed) North Holland, Amsterdam, str. 111; E.Atherton and R.L.Sheppard, w Solid phase peptide synthesis, a practical approach, IRL PRESS, (1989), Oxford Uniwersity Press, str. 25-34. Jako automatyczny syntezator można stosować syntezator 9050 Plus Pep Synthesizer z Millipore lub syntezator równoważny.
Stałe podłoże używane do syntez powinno być zgodne ze stosowaną metodą i odczynnikami. Na przykład, do syntezy w syntezatorze „9050 Plus Pep Synthesizer zaleca się użycie żywicy przystosowanej do metody zwanej „w ciągłym strumieniu; tym kryteriom odpowiadają żywice PEG PS. Podłoża te zawierają ramię („spacer) oparte na glikolu polietylenowym (PEG) położone między funkcyjną grupą kulek polistyrenowych i punktem umocowania pierwszego aminokwasu. Charakter tego punktu umocowania może się zmieniać zależnie od wybranej grupy C-terminalnej. Ω niniejszym przypadku używano różnych żywic PEG-PS.
Żywica wyjściowa i aminokwasy stosowane jako surowce są produktami dostępnymi w handlu (PerSeptive-Biosystem lub Neosystem).
Do syntez peptydów użyto następujących grup zabezpieczających łańcuchy boczne:
PL 194 863 B1
Aminokwasy Grupy zabezpieczające
Arginina 2,2,4,6,7-pentametylodihydrobenzofurano-5-sulfonyl ( Pbf )
Asparagina, glutamina Trityl (Trt)
Cysteina Trityl (Trt) lub acetamidometyl (Acm)
Seryna, treonina, tyrozyna Eter tert-butylowy (tBu)
Lizyna, tryptofan tert-butyloksykarbonyl (Boc)
Stosowanym tymczasowym zabezpieczeniem pierwszorzędowej grupy aminowej w położeniu a aminokwasów jest grupa 9-fluorenylometoksylokarbonylowa (Fmoc).
Odbezpieczenie prowadzi się 20% roztworem piperydyny w dimetyloformamidzie.
Do sprzęgania stosuje się korzystnie nadmiar diizopropylokarbodiimidu (DIPCDI) i 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt).
Po syntezie żywicę przemywa się organicznymi rozpuszczalnikami (dimetyloformamidem, potem dichlorometanem), suszy pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym traktuje się roztworem kwasu trifluorooctowego (TFA), oziębionym do temperatury 0°C i zawierającym odpowiednie „zmiatacze. Można użyć na przykład reagentu K zawierającego 82% kwasu trifluorooctowego, 5% fenolu, 5% wody, 5% tioanizolu i 3% etanoditiolu.
Po odsączeniu żywicy wytrąca się syntetyczne peptydy i przemywa eterem.
Syntetyczne peptydy oczyszcza się następnie przy użyciu chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a ich czystość określa się za pomocą spektrometrii masowej. Jako fazy stałej można użyć, na przykład, fazy Bondapak C-18. Peptydy eluuje się przez wytworzenie gradientu liniowego między dwoma roztworami buforów, pierwszego zasadniczo wodnego (na przykład woda - 0,1% TFA) i drugiego raczej organicznego (na przykład mieszaniny zawierającej 60% acetonitrylu, 39,92% wody i 0,08% TFA). Zebrane czyste frakcje łączy się, zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizuje.
W celu cyklizacji oczyszczone syntetyczne peptydy rozpuszcza się w roztworze octanu amonu (10 mM), doprowadza się pH do 8,5 przez dodanie 1M wodorotlenku amonu i roztwór intensywnie miesza. Cyklizacja jest całkowita po 18 godzinach. Następnie obniża się pH do 6, dodając kwas octowy. Scyklizowane peptydy liofilizuje się, potem oczyszcza na drodze chromatografii cieczowej z odwrotną fazą, jak to opisano poprzednio.
Immunoreaktywność peptydów według wynalazku oceniono za pomocą surowic od chorych głównie pochodzenia kameruńskiego, zakażonych retrowirusami HIV-1 z grupy O. Różne przeprowadzone testy wykazały, że peptydy według wynalazku, pojedynczo lub w kombinacji (kompozycje peptydów), umożliwiają wykrycie 100% surowic zakażonych retrowirusami HIV-1 z grupy O.
Syntetyczne peptydy według wynalazku znajdują więc zastosowanie w testach immunologicznych do wykrywania infekcji wywołanych retrowirusami HIV-1 z grupy O. Możliwe jest też stosowanie kombinacji kilku syntetycznych peptydów o wzorze (I). Te kombinacje, które mogą zawierać dwa lub więcej peptydów o wzorze (I) stanowią również część wynalazku. Korzystna jest kombinacja zawierająca peptydy nr 1 (2B) i nr 3 (4B). Poniżej przedstawiona jest sekwencja peptydu nr 1.
Peptyd nr 1 (2B): SEQ ID nr 1 LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET czyli
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr 15 10 15
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr 20 22
PL 194 863 B1
Peptyd nr 2 (3B): SEQ ID nr 2
LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET czyli
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr 20 22
Można też używać syntetycznych peptydów o wzorze (I) według niniejszego wynalazku w kombinacji z peptydami rekombinowanymi (białkami rekombinowanymi) HIV-1 z grupy O, takimi jakie można otrzymać metodami klasycznymi o sekwencjach opisanych na przykład w zgłoszeniu EP 0 591 914.
Peptydów syntetycznych według wynalazku można również używać w kombinacji z innymi peptydami syntetycznymi lub rekombinowanymi HIV-1 (białkami rekombinowanymi) i/lub HIV-2, takimi jak peptydy opisane w zgłoszeniach patentowych lub opisach patentowych EP 0 387 914, EP 0 239 425, EP 0 220 273 lub EP 0 267 802. Ta lista zgłoszeń patentowych lub opisów patentowych nie jest wyczerpująca i podano ją przykładowo.
Kompozycje zawierające jeden lub kilka peptydów syntetycznych o wzorze (I) i jeden lub kilka peptydów syntetycznych lub rekombinowanych HIV-1 lub HIV-2 znajdują zastosowanie w diagnostyce do wykrywania chorych zakażonych różnymi retrowirusami HIV.
Jeden lub kilka syntetycznych peptydów o wzorze (I), pojedynczo lub w kombinacji z peptydami rekombinowanymi HIV-1 z grupy O albo peptydami syntetycznymi lub rekombinowanymi HIV-1 lub HIV-2, mogą być wykorzystywane w testach immunologicznych.
Peptydy o wzorze (I) lub kompozycja, która zawiera co najmniej jeden peptyd o wzorze (I) umożliwia wytworzenie zestawów do wykonywania testów immunologicznych.
Następujące przykłady ilustrują wynalazek, ale nie ograniczają jego zakresu.
P r z y k ł a d 1
Wytwarzanie związku według wynalazku: peptydu nr 2 (3B) LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET czyli
LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET czyli
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys 1 5
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr 20 22
Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 10 15
Ten peptyd został zsyntetyzowany w fazie stałej. Metoda opracowana w 1963 przez Merrifielda (J.Am.Chem.Soc. (1963) 85, str. 2149-2154) polega na przyłączeniu pierwszego aminokwasu do stałego podłoża polimerowego (żywicy) przez jego grupę kwasową i wydłużeniu sekwencji peptydowej od tego pierwszego aminokwasu, przy czym peptyd podczas syntezy pozostaje przyczepiony do żywicy.
Do syntezy peptydu nr 2 użyto syntezatora „9050 Plus Pep Synthetizer, a jako żywicę stosowano żywicę Fmoc Thr (OtBu) PEG PS.
Różne etapy syntezy zestawiono w tabeli 1 poniżej:
PL 194 863 B1
T a b e l a 1
Reszta aminokwasu Zabezpieczenie NH2 Zabezpieczenie łańcuchów bocznych Metoda sprzęgania Ilość równoważników Czas sprzęgania
Glu Fmoc OtBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Asn Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Trp Fmoc Boc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Gln Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Val Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Ser Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Thr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Tyr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Cys Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Val Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Gly Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Cys Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Gly Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Trp Fmoc Boc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Ser Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-30 min
Po zakończeniu syntezy żywicę przemyto dimetyloformamidem, potem dichlorometanem i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Następnie żywicę potraktowano reagentem K (82% kwasu trifluorooctowego, 5% fenolu, 5% wody, 5% tioanizolu i 3% etanoditiolu). Peptyd nr 2 (3B) wyodrębniony przez strącenie za pomocą tlenku dietylu przemyto potem tym samym rozpuszczalnikiem. Otrzymano w ten sposób 140 mg peptydu nr 2 (3B).
Peptyd nr 2 (3B) oczyszczono następnie metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami. Jako fazy stałej użyto fazy Bondapak C-18. Peptyd eluowano gradientem liniowym dwóch roztworów buforowych, pierwszego zasadniczo wodnego (na przykład woda-0,1% TFA) i drugiego raczej organicznego (np. mieszanina zawierająca 60% acetonitrylu, 39,92% wody i 0,08% TFA). Zebrane czyste frakcje połączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizowano.
W celu cyklizacji oczyszczone syntetyczne peptydy rozpuszczono w roztworze octanu amonu (10 mM), doprowadzono pH do 8,5 przez dodanie 1M wodorotlenku amonu i roztwór intensywnie mieszano. Cyklizacja zaszła całkowicie po 18 godzinach. Następnie obniżono pH do 6, dodając kwas octowy. Scyklizowany peptyd liofilizowano, potem oczyszczono na drodze chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, jak to opisano poprzednio.
Wytwarzanie związku według wynalazku: peptydu nr 15 (22B)
Ten peptyd zsyntetyzowano jak peptyd nr 2 (3B), ale jako żywicy użyto żywicy FmocPAL PEG PS.
Różne etapy syntezy zestawiono w tabeli II poniżej:
PL 194 863 B1
T a b e l a II
Reszta aminokwasu Zabezpieczenie NH2 Zabezpieczenie łańcuchów bocznych Metoda sprzęgania Ilość równoważników Czas sprzęgania
1 2 3 4 5
Val Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Ser Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Thr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Tyr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Cys Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Val Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Gly Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Lys Fmoc Boc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Cys Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Gly Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Trp Fmoc Boc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Ser Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Asn Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Gln Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Gln Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Asn Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Thr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 równ.-45 min
Glu Fmoc OtBu DIPCDI/HoBt 5 równ.-45 min
Leu Fmoc DIPCDI/HoBt 5 równ.-45 min
Ala Fmoc DIPCDI/HoBt 5 równ.-45 min
Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HoBt 5 równ.-45 min
Po zakończeniu syntezy żywicę przemyto dimetyloformamidem, potem dichlorometanem i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Następnie żywicę potraktowano reagentem K (82% kwasu trifluorooctowego, 5% fenolu, 5% wody, 5% tioanizolu i 3% etanoditiolu). Peptyd nr 15 (22B) wyodrębniony przez strącenie za pomocą eteru etylowego został potem przemyto następnie samym rozpuszczalnikiem.
Otrzymano w ten sposób 140 mg peptydu nr 15 (22B).
Peptyd nr 15 (22B) oczyszczono następnie metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, potem scyklizowano, liofilizowano i oczyszczono, jak opisano poprzednio dla peptydu nr 2 (3B).
PL 194 863 B1
W taki sam sposób, stosując odpowiednie żywice i aminokwasy, zsyntetyzowano inne związki według wynalazku.
W tabeli III podano ciężar cząsteczkowy niektórych peptydów o wzorze (I) w postaci niecyklicznej, oznaczony za pomocą spektrometrii masowej.
T a b e l a III
Peptyd nr Ciężar cząsteczkowy (daltony)
1 (2B) 2512
2 (3B) 2583
3 (4B) 2528
4 (5B) 2586
5 (6B) 2527
9 (12B) 1772
10 (14B) 1799
11 (18B) 3752
12 (19B) 3778
13 (20B) 3780
14 (21B) 2538
15 (22B) 3222
16 (23B) 1941
P r z y k ł a d 2
Ocena immunoreaktywności peptydów według wynalazku w teście immunoenzymatycznym: Test nr 1
Użyte surowice ESS, DUR, VAU i HAD są surowicami od chorych Francuzów zakażonych retrowirusami HIV-1 z grupy O. Inne próbki surowic od chorych zakażonych retrowirusami HIV-1 z grupy O zostały otrzymano z Yaounde Pasteur Centre w Kamerunie i określono ich serotypy jako grupę O według algorytmu serologicznego opisanego w AIDS (1977), 11, str. 445-453.
Surowice HIV-negatywne (n =48) otrzymano od zdrowych ochotników.
Stosowane syntetyczne peptydy rozpuszczono w wodzie w stężeniu 1 mg/ml (roztwór macierzysty).
W etapie sensybilizacji fazy stałej (powlekanie), do każdej studzienki płytek do mikromiareczkowania Microtiter™ (NUNC) dodano 110 ml roztworu zawierającego 2 mg/ml każdego peptydu (otrzymanego przez rozcieńczenie roztworu macierzystego roztworem 0,1M buforu węglanowego). Po inkubacji w ciągu nocy w temperaturze otoczenia mikropłytki najpierw przemyto roztworem buforu TrisNaCl o pH 7,4, zawierającym 0,1% Tween® 20 i 0,001% mertiolanu sodu, po czym nasycono roztworem PBS zawierającym 0,5% Regilait™ (odwodnione odtłuszczone mleko). Po wchłonięciu roztworu do nasycania płytki ogrzewano przez 10 minut w temperaturze 50°C.
Próbki surowic rozcieńczono do 1/5 roztworem odtłuszczonego mleka (w buforze cytrynianowym z dodatkiem 0,01% czerwieni fenolowej, 0,25% chloroformu i 0,25% Kathon®), osadzono w studzienkach płytek i inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 40°C.
Po przemyciu roztworem buforu Tris NaCl o pH 7,4 zawierającym 0,1% Tween® 20 i 0,001% mertiolanu sodu, do każdej studzienki płytek dodano 100 ml roztworu koniugatu składającego się z przeciwciał kozich antyludzkich IgG i IgM znakowanych peroksydazą chrzanową, zawierającego jako konserwant 0,01% mertiolanu sodu, rozpuszczonego w roztworze buforu cytrynianowego z dodatkiem 30% glicerolu i 25% normalnej surowicy z płodu cielęcego, po czym płytki inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 40°C.
Po przemyciu roztworem buforu Tris NaCl o pH 7,4 zawierającym 0,1% Tween 20 i 0,001% mertiolanu sodu wywołano zabarwienie, dodając do każdej studzienki 100 ml o-fenylenodiaminy rozpuszczonej w nadtlenku wodoru. Potem inkubowano mikropłytki przez 30 minut w temperaturze oto20
PL 194 863 B1 czenia i w ciemności. Następnie zatrzymano reakcję barwną, dodając 100 μΙ 4N kwasu siarkowego. Absorbancję (A) oznaczono przy 490 i 620 nm.
Absorbancja względna (A490-A620) odczytana w każdej studzience jest proporcjonalna do immunoreaktywności każdego peptydu. Wskazuje to na zdolność każdego peptydu do reagowania z próbką biologiczną, z którą prowadzi się badanie. Wartość progową (cut-off) określono jako absorbancję równą 0,15. Odpowiada ona średniej z wartości ujemnych (n=48) plus 12 standardowych odchyleń.
Reaktywność peptydów według wynalazku (peptyd nr 3 (4B), peptyd nr 2 (3B)) i peptydu nr 1 (2B), w postaci cyklicznej, porównano z reaktywnością dwóch syntetycznych peptydów zawierających jako sekwencję część naturalnej sekwencji otoczki (env) izolatu VAU (retrowirus HIV-1 z grupy O) i zawierających epitop immunodominujący gp41.
Te dwa peptydy mają następujące sekwencje:
VAU 22 AA
Leu 1 Leu Asn Leu Trp 5 Gly 0ys Lys Asn Arg 10 Ala Ile 0ys Tyr Thr 15
Ser Val Lys Trp Asn Lys Thr
20 22
VAU 35 AA
Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe Ile Glu Glu Asn Glu Leu Leu
1 5 10 15
Asn Leu Trp Gly 0ys Lys Asn Arg Ala Ile 0ys Tyr Thr Ser Val
20 25 30
Lys Trp Asn Lys Thr 35
Do badania używa się tych peptydów w postaci cyklicznej. Wyniki tego badania podano w tabeli IV.
T a b e l a IV
Surowica Absorbancja
Peptyd nr 3(4B) Peptyd nr 2(3B) Peptyd nr K2B) VAU 22 AA VAU 35 AA
1 2 3 4 5 6
ESS* >** > 2,494 > >
DUR* > > > 0,118 0,872
HAD > 0,518 0,041 0,789 0,871
VAU* 1,342 > > > >
3935 > 0,893 0,307 0,138 0,227
6891 > 0,614 0,062 0,359 0,496
6512* 0,746 0,785 > 0,120 0,174
1105* 1,421 1,031 > 0,099 0,129
4021* 0,430 0,119 > 0,050 1,957
5969* > 0,282 > 2,491 >
2700 > 0,274 > > >
PL 194 863 B1 cd. tabeli IV
1 2 3 4 5 6
5453 0,555 0,081 > 1,267 1,482
5931 > > > 0,202 2,225
3136 > 0,992 0,302 > >
3653 1,352 > 0,044 1,441 1,322
2352 > > 0,205 > >
3016 > > 0,243 > >
3302 > > 0,386 > >
2294 > > 0,447 > >
3771 > > 0,544 > >
1581 > > > 1,112 0,894
5373 > > > 1,359 0,856
7443 > > > 0,920 0,574
3637 > > > 0,779 1,647
6295* 1,718 1,063 > 0,972 >
6689* 1,710 > > > >
1754 > > > 1,263 1,948
4489* > > > 1,318 1,718
4364 > > 1,382 > >
3529 > > 1,803 > >
3482 2,402 > 1,473 > >
1702 > > 1,162 > >
6487 1,017 2,687 2,889 2,891
5164 > > > > >
5766* > > > > >
3945 > > > > >
4434 > > > 2,273 >
4288* > > 2,802 2,337 N.T.***
6782 > 2,091 2,462 2,190 2,214
2313 > > > > >
2312 > > > > >
1062 > > > > >
402 > > > > >
134 > > > > >
7120 > > > > >
7212 > > > > >
6976* > > > > >
3600* > > 2,743 > >
3236 > > > > >
PL 194 863 B1 cd. tabeli IV
1 2 3 4 5 6
3235 > > > > >
2551 > > > > >
5270* > > > > >
5210 > > > > >
5149* > > > > >
4477 > > > 2,511 >
3891 > > 2,780 > >
3627* > > 2,910 > >
7258* > > 2,477 > >
7007 2,136 2,334 2,151
6697
6998
6627 > > > > >
6198* > > > > >
6165 > > 2,714 > >
7439 > > > > >
7297* > > > > >
6111 > > > > >
625 > > > > 2,885
* serotypy/genotypy ** > = sygnał silniejszy od możliwości odczytu spektrofotometru
Wyniki przedstawione w tabeli IV pokazują, że peptyd nr 3 (4B) wykazuje najlepsze działanie w odniesieniu do wyników dotyczących innych peptydów. Peptyd ten umożliwia najlepsze rozróżnienie surowic od chorych zakażonych retrowirusami HIV-1 z grupy O w porównaniu z dwoma peptydami posiadającymi część sekwencji izolatu VAU, odpowiadającą epitopowi immunodominującemu gp41. Poza tym, peptyd nr 2 (3B) i nr 1 (2B) są bardziej immunoreaktywne od peptydu VAU 22 AA, który zawiera taką samą ilość aminokwasów.
P r z y k ł a d 3
Ocena immunoreaktywności peptydów według wynalazku w teście immunoenzymatycznym: Test nr 2
Próbki surowic od chorych zakażonych retrowirusami HIV-1 z grupy O zostały otrzymano z Yaounde Pasteur Centre w Kamerunie i określono ich serotypy jako grupę O według algorytmu serologicznego opisanego w AIDS (1977), 11, str. 445-453. Próbka (Maryland), której genotyp określono, pochodziła ze Stanów Zjednoczonych. Próbki te uprzednio rozcieńczono ujemną surowicą ludzką do rozcieńczeń podanych w tabeli V, w celu dysponowania wystarczającą objętością do różnych testów immunoreaktywności.
Stosowane syntetyczne peptydy rozpuszczono w wodzie w stężeniu 1 mg/ml (roztwór macierzysty). W etapie sensybilizacji fazy stałej (powlekanie), postępowano jak opisano w przykładzie 2.
Próbki surowic rozcieńczono 1/5 roztworem odtłuszczonego mleka (w buforze cytrynianowym z dodatkiem 0,01% czerwieni fenolowej, 0,25% chloroformu i 0,25% Kathon®), osadzono w studzienkach płytek i inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 40°C.
Po przemyciu roztworem buforu Tris NaCl o pH 7,4 zawierającym 0,1% Tween® i 0,001% mertiolan sodu, do każdej studzienki płytek dodano 100 ml roztworu sprzężonych przeciwciał kozich antyludzkich IgG i IgM znakowanych peroksydazą chrzanową, zawierającego jako konserwant 0,01 % mertiolanu sodu, rozpuszczonego w roztworze buforu cytrynianowego z dodatkiem 30% glicerolu i 25% normalnej surowicy z płodu cielęcego, po czym płytki inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 40°C.
PL 194 863 B1
Po przemyciu roztworem buforu Tris NaCI o pH 7,4 zawierającym 0,1% Tween® mertiolanu sodu wywołano zabarwienie, jak opisano w przykładzie 2.
Absorbancja (DO) względna (A490-A620) odczytana w każdej studzience jest proporcjonalna do immunoreaktywności każdego peptydu, co wskazuje na zdolność do reagowania z próbką biologiczną, z którą prowadzi się test.
Reaktywność peptydów według wynalazku, (peptyd nr 10 (14B), nr 11 (18B), nr 12 (19B), nr 15 (22B), nr 16 (23B), wszystkie w postaci cyklicznej) porównano z reaktywnością trzech homologicznych syntetycznych peptydów mających jako sekwencję część naturalnej sekwencji otoczki (env) retrowirusa HIV-1 z grupy O. Peptydy te są dwoma peptydami pochodnymi izolatu VAU; peptyd VAU 22 AA i peptyd VAU 35 AA - oraz peptyd MVP 5180 (oznaczonym „MVP 5180 w tabeli V). Peptydy VAU 22 AA i VAU 35 AA (których struktura jest podana w przykładzie 2) i peptyd MVP 5180 zawierają epitop immunodominujący gp41.
Wszystkie te peptydy stosowano w postaci cyklicznej. Sekwencja peptydu MVP 5180 jest następująca:
MVP 5180
Arg 1 Leu Gln Ala Leu Glu 5 Thr Leu Ile Gin Asn Gin Gin Arg Leu
10 15
Asn Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val
20 25 30
Lys Trp Asn Thr Ser
Wyniki tego badania podano w tabeli V.
T a b e l a V
Surowica Peptydy*
nr 10 nr 11 nr 12 nr 14 nr 15 nr 16 MVP 5180 VAU 35 AA VAU 22 AA
Absorbancja (DO)
4280 do 1/50 0,022 0,686 0,201 0,286 0,689 0,033 0,382 0,013 0,021
NGO do 1/50 0,067 0,335 0,193 0,157 0,315 0,110 0,184 0,055 0,040
NJEM do 1/100 0,032 0,811 0,391 0,277 0,939 0,025 0,146 0,159 0,024
MBASSI do 1/100 1,217 1,150 0,747 2,134 2,010 2,683 0,248 0,120 0,257
WANG do 1/50 0,698 0,234 0,124 2,397 2,680 1,290 0,075 0,025 0,041
258 OUDI do 1/100 0,587 0,373 0,226 0,764 1,184 1,692 0,116 0,058 0,100
Do 15 do 1/100 1,613 0,859 2,286 3,357 3,693 3,038 0,673 0,036 0,075
DJOU do 1/100 1,268 0,482 0,419 1,998 2,088 2,166 0,203 0,022 0,042
3600 do 1/100 0,482 0,360 0,249 0,716 0,801 0,933 0,206 0,025 0,058
3613 do 1/400 1,108 0,837 0,773 1,508 1,627 1,679 0,478 0,250 0,396
6111 do 1/100 0,596 0,348 0,202 0,850 1,207 1,009 0,226 0,087 0,180
PL 194 863 B1 cd. tabeli V
625 do 1/50 0,838 0,338 0,264 2,045 2,122 1,791 0,202 0,069 0,165
Maryland do 1/400 0,524 0,370 0,285 0,734 0,844 1,229 0,241 0,054 0,168
3653 do 1/10 0,347 0,337 0,247 0,072 0,380 0,406 0,401 0,021 0,310
Faza stała* : peptyd 2mg/ml
Dla każdego testowanego peptydu próbki uszeregowano w czterech klasach (a, b, c i d) odpowiadających różnym poziomom absorbancji względnej odczytanej przy długości fali A492-A620:
· dla a: OD < 0,100 · dla b: 0,10 < OD < 0,500 · dla c: 0,500 < OD <1,000 · dla d: OD > 1,000 co umożliwiło ocenę stopnia immunoreaktywności peptydów. Peptydami najbardziej immunoreaktywnymi są te, których największa ilość próbek znalazła się w klasach odpowiadających najwyższej absorbancji.
Wyniki podano w tabeli VI
T a b e l a VI
Klasa Peptydy*
nr 10 nr 11 nr 12 nr 14 nr 15 nr 16 MVP 5180 VAU 35 AA VAU 22 AA
Ilość próbek
a 3 0 0 1 0 2 1 11 7
b 2 9 11 3 2 2 12 3 7
c 5 4 2 4 4 1 1 0 0
d 4 1 1 6 8 9 0 0 0
Faza stała*: peptyd 2 mg/ml
Wyniki wykazują, że dla wszystkich testowanych peptydów według wynalazku uzyskano lepsze wyniki, jeśli chodzi o immunoreaktywność, niż dla peptydów znanych w technice, pochodzących z naturalnych izolatów (MVP 5180, VAU). Peptydy według wynalazku nr 15 (22B), nr 14 (21B) i nr 16 (23B) okazują się najbardziej immunoreaktywne.
P r z y k ł a d 4
Ocena immunoreaktywności kompozycji zawierających peptydy według wynalazku w teście immunoenzymatycznym
W tym teście postępowano według protokołu opisanego w przykładzie 2 i stosowano te same surowice. Stosowane mikropłytki sensybilizowano cyklizowanym peptydem nr 1 (2B) albo cyklizowanym peptydem nr 3 (4B) albo kompozycją zawierającą oba te peptydy (1/1 wagowo). W każdej studzience umieszczono 100 ml roztworu zawierającego 2 mg/ml peptydu nr 1 (2B) albo 100 ml roztworu zawierającego 2 mg/ml peptydu nr 3 (4B) albo 100 ml roztworu zawierającego 1 mg/ml peptydu nr 1 (2B) i 1 mg/ml peptydu nr 3 (4B). Wyniki tego testu podano w tabeli VII
PL 194 863 B1
T a b e l a VII
Absorbancja
Surowica Peptyd nr 1 (2B) 2 mg/ml) Peptyd nr 3 (4B) (2 mg/ml) Peptyd nr 1 (2B) (1pg/ml) + Peptyd nr 3 (4B)(1pg/ml)
1 2 3 4
3529 1,803 >* >
1105 > 1421 >
3891 2,780 > >
3235 > > >
2700 > > >
5931 > > >
3935 0,307 > >
7443 > > >
1062 > > >
1754 > > >
3136 0,302 > >
6891 0,062 > >
5149 > > >
5270 > > >
2551 > > >
3600 2,743 > >
6976 > > >
4489 > > >
6165 2,714 > >
6198 > > >
6627 > > >
6998 > > >
6697 > > >
7258 2,477 > >
3627 2,910 > >
4477 > > >
3771 0,544 > >
1702 1,016 > >
2294 0,447 > >
2352 0,205 > >
3016 0,243 > >
3302 0,386 > >
3482 1,473 > >
PL 194 863 B1 cd. tabeli VII
1 2 3 4
3653 0,044 1,322 1,105
4364 1,382 > >
3637 > > >
4288 2,802 > >
5969 > > >
258 > > >
6111 > > >
625 > > >
6853 > 2,769 >
3136 0,302 > >
6689 > 0,710 >
6295 > 1,718 >
4021 > 0,430 2,381
3884 1,839 > >
6512 > 0,746 >
6487 2,687 > >
ESS 2,494 > >
HAD 0,041 > >
DUR > > >
> = sygnał silniejszy od możliwości odczytu spektrofotometru
Wyniki w tabeli VII wskazują, że kompozycje peptydów według wynalazku, gdy są stosowane w diagnostyce, umożliwiają wykrycie wszystkich surowic od chorych zakażonych retrowirusami HIV-1 z grupy O.
PL 194 863 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE ogÓLNE:
i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: Pasteur Sanofi Diagnostic
(B) ULICA: 3 boulevard raymond Poincare'
(C) MIASTO: Marnes la Coguette
(E) KRAJ:Francj a
(F) KOD: 92430
(G) TELEFON : 0153774000
(H) TELEFAX :0153774133
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 16 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: komputer kompatybilny z IMB PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr
PL 194 863 Β1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
iA) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:2:
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu VA1 Cys Tyr Thr
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:3:
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu VA1 Cys Tyr Thr
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR :4 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:4:
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr
PL 194 863 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:5:
Leu Leu Gin Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:6:
Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:7:
Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr
PL 194 863 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:8:
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Len Val Cys Tyr Thr
Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:9:
Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr
Ser (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:i0:
Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr
Ser
PL 194 863 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:II (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 32 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. , NR:11:
Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ser Trp
Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn
Glu Thr
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 32 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. . NR:12:
Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ile Trp
Gly Cys Arg Gly Arg' Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn
Glu Thr
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 32 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(xi) OPIS SEKWENCJI: : IDENTYFIKATOR SEKW. , NR:13:
Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asp Leu Trp
Gly Cys Arg Gly A_rg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn
Glu Thr
PL 194 863 Β1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:14:
Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg
Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 28 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:15:
Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp
Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:16:
Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr
Ser Val

Claims (16)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Syntetycznep eptydytypu monomeru o1 3-33a minokwasachlubtypud imeruo 26-66 a minokwasach, w enatczi ernatnłcńzbzhnwpj ldb w enatczi azpklinnwcepj nc enśrpyeiztwpm mnatków diaicrznknwpzh międnc zpatpiocmi, nyenwicycjązp ngólepmb wnnrnwi (I):
    Δ-Z-Tre Glp Cpa-Q-Cpa Tpr Thr Spr-Ω (I) w którpm:
    - Δ nnocznc grdeę bintpoplnwą, grdeę binz^poplnwą, ctnm wnynrb, grdeę czptplnwą (CH3CO-), łcńzbzh clifctpznop, którp mnżp ncwiprcć jpyeą lub ywip fdokzpjop grdep tinlnwp, clyphpynwp ldb cmienwp, ernp znpm łcńzbzh clifctpznop jpat knrnpatoip łcńzbzhpm clkilnwpm n 1-6 ctnmczh węglc ldb łcńzbzhpm clkpoplnwpm n 6-6 ctnmczh węglc, clbn łcńzbzhpm cmionclkilnkcrbnoplnwpm n 6-6 ctnmczh węglc,
    - Z nnocznc apkwpozję epetpynwą n jpyopm np wnnrów (II)-(X):
    - X,-ypr-X2- (II) - Spr-X2- (III) -X,-Spr- (IV) -X,-Glo-X2- (V) -Glo-X2- (VI) -X,-Glo- (VII) -X,-Aao-X2 (VIII) -Aao-X2- (IX) -X,-Aao- (X) w którpzh:
    -Xi nnocznc apkwpozję epetpynwą n 0-9 cmionkwcaczh nrcn -Χ2 nnocznc apkwpozję epetpynwą n 0-5 cmionkwcaczh,
    -Θ nnocznc apkwpozję epetpynwą n wnnrnp (XI):
    ((AA1) - (AA2) - (AA-) - (AA4) - (AA5) - (X)) w którpj:
    · (AA,) nnocznc rpantę linpop clbn rpantę crgioiop ldb rpantę nroitpop, · (AA2) nnocznc rpantę glizpop ldb rpantę caecrcgiop, · (AA3) nnocznc rpantę linpop clbn rpantę crgioiop ldb rpantę nroitpop, · (AA4) nnocznc rpantę lpdzpop, clbn rpantę innlpdzpop ldb rpantę gldtcmiop, · (AA5) nnocznc rpantę innlpdzpop ldb rpantę wcliop, clbn rpantę lpdzpop, clbn rpantę trpnoiop, clbn rpantę onrlpdzpop ldb rpantę onrwcliop, jpyock eny wcrdokipm, żp (AA,), (AA2), (AA3), (AA4) i (AA5) oip twnrną rcnpm apkwpozji epetpynwpzh,
    -Lpa Glp Lpa Lpd Ilp- i -Lpa Glp Lpa Lpd Vcl-,
    - Ω nwiąncoc n grdeą -CO- aprpop nnocznc:
    - grdeę hpyrnkaplnwą (-OH) ldb grdeę cmionwą (-NH2),
    - grdeę clknkap ncwiprcjązą 1-6 ctnmów węglc,
    - apkwpozję epetpynwą n wnnrnp (XII):
    - Vcl-y-YF (XH) gynip y nnocznc apkwpozję n wnnrnp (XIII) ldb n wnnrnp (XIV):
    (AAe) -Tre Aao- (AA7) - (AAe) (XIII) (AAe) -Tre Hia- (AA7) - (AAe) (XIV)
    PL 194 863 B1 w których:
    (ΆΆθ) oznacza aminokwas różny od lizyny, (AA7) oznacza aminokwas, (AA8) oznacza resztę seryny lub treoniny, a Y związane z resztą -CO- wolnego aminokwasu AA8 oznacza grupę OH, NH2 lub grupę alkoksy zawierającą 1-6 atomów węgla,
    - sekwencję peptydową o wzorze (XV):
    -Val-Y (XV) w której Y związane z resztą -CO- waliny ma to samo znaczenie jak we wzorze (XII),
    - lub sekwencję peptydową o wzorach (XVI)-(XVIII):
    -Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser-Y (XVI)
    Val-S-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Val-S-Y (XVH)
    Val-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser Val-Y (XVIII) w których Z i Θ mają definicję podaną dla wzoru (I), S ma definicję podaną dla wzoru (XII), a Y związane z resztą -CO-seryny, z resztą -CO- aminokwasu AA8 lub z resztą -CO-waliny, ma to samo znaczenie jak we wzorze (XII).
  2. 2. Syntetyycneppetyydo wzoore(I ( weeługzzstrz.1 w którym (AAA oznaczaresztęwalinyaIbb resztę leucyny, lub resztę treoniny i gdy Ω odpowiada sekwencji peptydowej o wzorze (XII) lub (XIV), (AA6) oznacza resztę glutaminy lub resztę argininy.
  3. 3. Syntetyczne peptydy o wzorze (I) według zastrz. 1, w którym:
    - Δ oznacza grupę biotynylową, atom wodoru lub łańcuch alifatyczny, który może zawierać jedną lub dwie funkcyjne grupy tiolowe, aldehydowe lub aminowe, przy czym łańcuch alifatyczny jest korzystnie łańcuchem alkilowym o 1-6 atomów węgla lub łańcuchem aminoalkilokarbonylowym o 2-6 atomów węgla,
    - Z oznacza sekwencję peptydową o wzorze (II) lub (V), w których X1 oznacza sekwencję peptydową o dwóch aminokwasach, a X2 oznacza aminokwas, albo sekwencję o wzorze (IV), w której Xi oznacza trzy aminokwasy lub sekwencję peptydową o wzorze (VIII), w której Xi oznacza sekwencję peptydową o dziewięciu, ośmiu lub trzech aminokwasach, a E2 oznacza sekwencję peptydową o pięciu aminokwasach,
    - Θ oznacza sekwencję peptydową o wzorze:
    -Lys Gly Arg Leu Val-, lub -Arg Gly Arg Leu Val-, i -Ω oznacza grupę hydroksylową, sekwencję peptydową o wzorze (XV) lub jedną z następujących sekwencji, które odpowiadają sekwencji peptydowej o wzorze (XII):
    -Val Arg Trp Asn Glu Thr-Y -Val Gln Trp Asn Glu Thr-Y lub -Val Gln Trp Asn Ser Thr-Y.
  4. 4. Syntetyycne ppep^yd o wezrzz. (I) ρ^Η^ zzsrrz. 1 albb 2 albb 3, w któiym Z ooneacz sse kwencję peptydową o wzorze :
    · -Leu Leu Ser Leu· -Leu Leu Ser Ser· -Leu Leu Asn Ser· -Leu Leu Gln Ser· -Arg Leu Asn Ser· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile· -Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Serlub · -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn SerPL 194 863 B1
  5. 5. Syntetycznepeptydyo 2-50aminokwasachwedługzastrz. 1 o wzorcre(la):
    Δ-Za-Trp Gly Cya-0-Cya Tyr Thr Spr-Ws (la) gdaid Za koochos grupę 2 wokrsch IIs-Xs:
    - Xis-ypr-X- (IIs) - ypr-X2s (IIIs) -Xis-ypr (IVs) -Bls-Glo-H-s (Vs) -Glo-X2 (VIs) -Xis-Glo (VIIs) (VIIIs) -Aao-X2s (IXs) -Xis-Aao (Xs) w których:
    -X1s kooshos apkwpohję ppptyykwą k 1-5 smiokkwsashh krso -X-s kooshos smiokkwsa,
    -Ws kooshos apkwpohję ppptyykwą k wokrop (XII), jską kkrpślkok dls wokru (I), lub apkwpohję ppptyykwą k wokrop (XVIIs):
    Vsl-y-Zs-Trp Gly Cya-0-Cya Tyr Thr Spr Vsl-S-Y (XVIIa) s
    Δ, 0, y i Ψ msją tp asmp ooshopois jsk wp wokrop (I).
  6. 6. yyotptyhoop ppptyyy k wokrop (I) wpyług osatro. 1 slbk 2, slbk 3, slbk 4, slbk 5, kbpjmująhp jpdoą o osatępująhyhh apkwpohji:
    Sekwencja nr 2
    -LLSLWGCRGRLVCTSVQWNETczyli
    -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
    Thr Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr15 20 22
    Sekwencja nr 3
    -LLS SWGCKGRLVCYTSVQWNETczyli
    -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr
    15 10
    Thr Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr15 20 22
    PL 194 863 Β1
    Sekwencja nr 4
    -LLS SWGCKGRLVCYTSVQWNSRczyli
    -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
    Thr Ser Val Gin Trp Asn Ser Thr15 20 22
    Sekwencja nr 5
    -LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNSTczyli
    -Leu Leu Gin Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
    Thr Ser Val Gin Trp Asn Ser Thr15 20 22
    Sekwencja nr 8
    -LLS SWGCRGRLVCYTSVQWNETczyli
    -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
    Thr Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr15 20 22
    Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr 20 22
    Sekwencja nr 9
    -LLSSWGCKGRLVCYTSczyli
    -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr
    15 10
    Thr Ser15
    PL 194 863 B1
    Sekwencja nr 10
    -LLNSWGCKGRLVCYTSczyli
    -Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
    Thr Ser15
    Sekwencja nr 11:
    -ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNETczyli
    -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ser 15 10
    Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp 15 20 25
    Asn Glu Thr30
    Sekwencja nr 12
    -ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNETczyli
    -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gln Gin Leu Leu Asn Ile 1 5 10 Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp 15 20 25 Asn Glu Thr- 30 Sekwencj a nr 13 :
    -ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNETczyli
    -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asp Leu 15 10
    Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp 15 20 25
    Asn Glu Thr30
    PL 194 863 Β1
    Sekwencja nr 14
    -LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSVczyli
    -Leu Asn Gin Gin Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly 15 10
    Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val15 20
    Sekwencja nr 15
    -RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSVczyli
    - Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gin Gin Arg Leu Leu Asn 1 5 10
    Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val15 20 25
    Sekwencja nr 16
    -RLNSWGCKGRLVCYTSVczyli
    -Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 15 10
    Thr Ser Val15
  7. 7. Syntetyczne peptydy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6 o sekwencji:
    Peptyd nr 2 (3B): SEQ ID nr 2
    LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET czyli
    Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr
    15 10 15
    Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr
    20 22
    PL194 863 Β1
    Peptyd nr 3 (4B): SEQ ID nr 3
    LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET czyli Leu 1 Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 5 10 Ser Val Gin Trp Asn Glu Thr 20 22
    Peptyd nr 4 (5B): SEQ ID nr 4
    LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST czyli Leu 1 Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 5 10 Ser Val Gin Trp Asn Ser Thr 20 22
    Peptyd nr 5 (6B): SEQ ID nr 5
    LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST czyli Leu 1 Leu Gin Ser Trp Gly 5 Cys Lys Gly Arg Leu Val 10 Cys Tyr Thr 15 Ser Val Gin Trp Asn Ser Thr 20 22
    Peptyd nr 8 (7B): SEQ ID nr 8
    LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET czyli
    Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 1 5 10 15
    PL 194 863 B1
    Peptyd nr 9 (12B): SEQ ID nr 9
    LLSSWGCKGRLVCYTS czyli
    Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
    Ser
    Peptyd nr 10 (14B): SEQ ID nr 10
    LLNSWGCKGRLVCYTS czyli
    Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr 15 10 15
    Peptyd nr 11 (18B): SEQ ID nr 11
    ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET czyli Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ser Trp 1 5 10 15 Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn 20 25 30
    Glu Thr
    PL 194 863 B1
    Peptyd nr 13 (20B): SEQ ID nr 13
    ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET czyli Ala 1 Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Leu Leu Asp Leu 5 10 Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Trp 15 20 25 Asn Glu Thr 30 Peptyd nr 14 (2IB): SEQ ID nr 14
    LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV czyli Leu 1 Asn Gin Arg 5 Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys 10 Lys Gly Arg 15 Leu Val Cys Tyr Thr Ser 20 Val Peptyd nr 15 (22B): SEQ ID nr 15
    RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV czyli Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gin Arg Leu Leu Asn Ser 1 5 10 15 Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val
    20 20
    Peptyd nr 16 (23B): SEQ ID nr 16
    RLNSWGCKGRLVCYTSV czyli
    Arg Leu Asn Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Va- Cys Tyr Thr 15 10 15
    Ser Val
    PL 194 863 B1
  8. 8. Kompozycja, z namienna tym, żezawierajeden lub kilka syntetycznych peptydów o wzoiore ( I) określonych w zastrz. 1.
  9. 9. Kompozycja według zastrz. 8, nnmminnnm tym, że zawiera oeotye nr 3 )4B).
  10. 10. Kompozycja, nnmminnnm tym, że zawiera jeden lub kilka syntetycznych oeotyeWw o wzorze (I) określonych w zastrz. 1, oraz jeden lub kilka rekombinowanych oeotyeWw HIV-1 grupy O.
  11. 11. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera jeden lub kilka syntetycznych oeotyóWw o wzorze )I) określonych w zastrz. 1, oraz jeden lub kilka rekombinowanych lub syntetycznych peptydWw HIV- l i/lub HIV-2.
  12. 12. Zawyozymzwiereeeyeg I uu kilkk ppetyydw synteryycyyyZ o wzzzzz (I), oZaeńlozyyZ w zzwStzyl do testu immunologicznego in vitro.
  13. 13. Zawyozymzwiekamppozyji oZaeńlozejw zzwyrz.8 albb9, albbl 0,albb1 1 ddtedyuimmpuylogicznego in vitro.
  14. 14. Zedyaw diaanyzyyycyy,znnmHennntymi. że oOejmpjeptzznajmpiejj eednppetyysynteryycy ny o wzorze )I), określony w zastry. 1, albo kompozycję określoną w zastrz. 8 albo 9, albo 10, albo 11.
  15. 15. Syntetyczne peptydy o 20-50 aminokwasach, odpowiadające ogólnemu wzorowi )I):
    Δ-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser Val-SY (I) w którym:
    - Δ oznacza grupę biotynylową, grupę biocytynylową, atom wodoru, grupę acetylową )CH3CO-), łańcuch alifatyczny, który może zawierać jedną lub dwie funkcyjne grupy tiolowe, aldehydowe lub aminowe, przy czym łańcuch alifatyczny jest korzystnie łańcuchem alkilowym o 1-6 atomach węgla lub łańcuchem alkenylowym o 2-6 atomach węgla,
    - Z oznacza sekwencję peptydową o jednym ze wzorów )II) - )X):
    - X1-Ser-X2- )II) - Ser-X2- )III) -X1-Ser- )IV) -X1-Gln-X2- )V) -Gln-X2- )VI) -X1-Gln- )VII) -X1-Asn-X2 )VIII) -Asn-X2- )IX) -X1-Asn- )X) w których:
    -X1 oznacza sekwencję peptydową o 1-5 aminokwasach oraz -X2 oznacza aminokwas
    -Θ oznacza sekwencję peptydową o wzorze )XI):
    ))AA1) - )AA2) - )AA3) - )AA4) - )AA5) - (X)) w której:
    · )AA1) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · )AA2) oznacza resztę glicyny lub resztę asparaginy, · )AA3) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · )AA4) oznacza resztę leucyny, albo resztę izoleucyny lub resztę glutaminy, · )AA5) oznacza resztę izoleucyny lub resztę waliny, albo resztę leucyny, albo resztę treoniny, albo resztę norleucyny lub resztę norwaliny, jednak pod warunkiem, że )AA0, )AA2), )AA3), )AA4) i )AA5) nie tworzą razem sekwencji peptydowych,
    -Lys Gly Lys Leu Ile- i -Lys Gly Lys Leu Val-,
    - S oznacza sekwencję o wzorze )XIII) lub o wzorne )XIII):
    PL 194 863 B1 (ΆΆθ) -Trp Asn- (AAy) - (AA8) (XII) (AA8) -Trp His- (AA7) - (AA8) (XIII) w których:
    (AA8) oznacza aminokwas różny od lizyny, (AA7) oznacza aminokwas, (AA8) oznacza resztę seryny lub treoniny, a Y związane z resztą -CO- wolnego aminokwasu AA8 oznacza grupę OH, grupę alkoksy zawierającą 1-6 atomów węgla, albo resztę peptydu Ω o wzorze
    Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser Val-S-Y' w których Z, Θ i S mają definicję jak wyżej,
    Y oznacza grupę OH rodnika alkoksy zawierającego 1 do 6 atomów węgla, w postaci prostołańcuchowej albo scyklizowanej za pośrednictwem mostków disiarczkowych między cysteinami, i peptyd o wzorze I połączony jest z fazą stałą.
  16. 16. Syntetyycne ppetyydtyyumonomeru o 13-33aminokwasaah I ub tyyudimeruo 26-66 aminokwasach, w postaci prostołańcuchowej lub w postaci zcyklizowanej za pośrednictwem mostków disiarczkowych między cysteinami, odpowiadające ogólnemu wzorowi (I):
    Δ-Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser-Ω (I) w którym:
    - Δ oznacza grupę biotynylową, grupę biocytynylową, atom wodoru, grupę acetylową (CH3CO-), łańcuch alifatyczny, mogący zawierać jedną lub dwie funkcyjne grupy tiolowe, aldehydowe lub aminowe, przy czym łańcuch alifatyczny jest korzystnie łańcuchem alkilowym o 1-6 atomach węgla lub łańcuchem alkenylowym o 6-6 atomach węgla, albo łańcuchem aminoalkilokarbonylowy6m o 6-6 atomach węgla,
    - Z oznacza sekwencję peptydową o jednym ze wzorów (II)-(X):
    - X1-Ser-X2- (II) - Ser-X2- (III) -X1-Ser- (IV) -X1-Gln-X2- (V) -Gln-X2- (VI) -X1-Gln- (VII) -X,-Asn-X2 (VIII) -Asn-X2- (IX) -X,-Asn- (X) w których
    -Χ1 oznacza sekwencję peptydową o 0-9 aminokwasach oraz -Χ2 oznacza sekwencję peptydową o 0-5 aminokwasach,
    -Θ oznacza sekwencję peptydową o wzorze (XI):
    ((AA,) - (AA2) - (AA-) - (AA4) - (AA5) - (O) w której:
    · (AA-) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · (AA2) oznacza resztę glicyny lub resztę asparaginy, · (AA3) oznacza resztę lizyny albo resztę argininy lub resztę ornityny, · (AA4) oznacza resztę leucyny, albo resztę izoleucyny lub resztę glutaminy, · (AA5) oznacza resztę izoleucyny lub resztę waliny, albo resztę leucyny, albo resztę treoniny, albo resztę norleucyny lub resztę norwaliny, jednak pod warunkiem, że (AAO, (AA2), (AA3), (AA4) i (AA5) nie tworzą razem sekwencji peptydowych,
    PL 194 863 B1
    -Lys Gly Lys Leu Ile- i -Lys Gly Lys Leu Val-,
    - Ω związana z grupą -CO- seryny oznacza:
    - grupę hydroksylową (-OH) lub grupę aminową (-NH2),
    - grupę alkoksy zawierającą 1-6 atomów węgla, lub
    - sekwencję peptydową o wzorze (XII) albo (XIII):
    Val-(AA8)-Trp Asn-(AA-) - (AA8) (XII)
    -Val-OH lub Val-NH2 (XIH) gdzie:
    (AA6) oznacza aminokwas różny od lizyny, (AA7) oznacza aminokwas, (AA8) oznacza resztę seryny lub treoniny, lub sekwencję peptydową o wzorze (Ia):
    -Z-Trp Gly Cys-Q-Cys Tyr Thr Ser-Ω' (la) w których Z i Θ mają definicję podaną dla wzoru (I), a Ω oznacza grupę hydroksylową (OH), grupę aminową (NH2), grupę alkoksylową zawierającą 1-6 atomów węgla lub sekwencje peptydową o wzorze (XII) albo (XIII).
PL336115A 1997-04-09 1998-04-06 Syntetyczne peptydy, zawierające je kompozycje, zastosowania tych peptydów oraz zestaw diagnostyczny PL194863B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9704356A FR2761993B1 (fr) 1997-04-09 1997-04-09 Peptides synthetiques utilisables dans les essais biologiques pour la detection des infections dues aux virus vih 1 groupe 0
FR9802212A FR2775287B1 (fr) 1998-02-24 1998-02-24 Peptides synthetiques consensus utilisables dans les essais biologiques pour la detection des infections dues aux virus vih 1 du groupe o
PCT/FR1998/000691 WO1998045323A1 (fr) 1997-04-09 1998-04-06 Peptides synthetiques utilisables dans les essais biologiques pour la detection des infections dues aux virus vih-1 du groupe o

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL336115A1 PL336115A1 (en) 2000-06-05
PL194863B1 true PL194863B1 (pl) 2007-07-31

Family

ID=26233456

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL336115A PL194863B1 (pl) 1997-04-09 1998-04-06 Syntetyczne peptydy, zawierające je kompozycje, zastosowania tych peptydów oraz zestaw diagnostyczny

Country Status (20)

Country Link
US (2) US7053175B1 (pl)
EP (1) EP0973802B1 (pl)
JP (1) JP3560987B2 (pl)
KR (1) KR100451312B1 (pl)
CN (1) CN1215082C (pl)
AT (1) ATE343590T1 (pl)
AU (1) AU740231B2 (pl)
BR (1) BRPI9809078B8 (pl)
CA (1) CA2286344C (pl)
CZ (1) CZ300927B6 (pl)
DE (1) DE69836265T2 (pl)
ES (1) ES2275305T3 (pl)
IL (2) IL132166A0 (pl)
NO (1) NO329149B1 (pl)
NZ (1) NZ500015A (pl)
PL (1) PL194863B1 (pl)
PT (1) PT973802E (pl)
RU (1) RU2184742C2 (pl)
TR (1) TR199902757T2 (pl)
WO (1) WO1998045323A1 (pl)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ300927B6 (cs) * 1997-04-09 2009-09-16 Bio-Rad Pasteur Syntetický peptid monomerního typu, prostredek, který ho obsahuje, zpusob imunologické in vitro kvantifikace a diagnostický kit pro použití v biologických testech pro identifikaci infekcí zpusobených viry HIV
CA2290217C (en) * 1998-11-30 2010-01-12 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Peptides for the detection of hiv-1 group o
FR2874017B1 (fr) * 2004-08-06 2006-11-24 Bio Rad Pasteur Sa Peptides vih-1 modifies et leur utilisation en detection d'anticorps anti-vih
EP2864787B1 (en) 2012-06-22 2017-11-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Human factor xiii as a normalization control for immunoassays
CN112481246B (zh) * 2020-12-16 2022-03-29 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性多肽fspankkltpkky及其制备方法和应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5204259A (en) 1988-05-06 1993-04-20 Pharmacia Genetic Engineering, Inc. Methods and systems for producing HIV antigens
ATE174382T1 (de) 1992-10-06 1998-12-15 Dade Behring Marburg Gmbh Retrovirus aus der hiv-gruppe und dessen verwendung
DE4405810A1 (de) * 1994-02-23 1995-08-24 Behringwerke Ag Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung
GB9410044D0 (en) 1994-05-19 1994-07-06 Int Murex Tech Corp Assay
DE4430972A1 (de) 1994-07-25 1996-02-01 Boehringer Mannheim Gmbh Bestimmung von spezifischem Immunglobulin unter Verwendung multipler Antigene
ATE374253T1 (de) * 1994-10-20 2007-10-15 Pasteur Institut Nukleotiden-sequenzen aus retroviren-antigenen hiv-i gruppe (oder untergruppe) o
DE19505262C2 (de) 1995-02-16 1998-06-18 Behring Diagnostics Gmbh Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung
FR2731013B1 (fr) * 1995-02-27 1997-05-16 Inst Nat Sante Rech Med Vih-1 de groupe o, fragments desdits virus, ainsi que leurs applications
WO1996027012A1 (en) 1995-03-02 1996-09-06 Akzo Nobel N.V. Specific hiv-1 group o antigens
US5569553A (en) 1995-03-08 1996-10-29 Wilson Greatbatch Ltd. Battery design for achieving end-of-life indication during electrical discharge
DE19622088A1 (de) 1996-05-31 1997-12-04 Boehringer Mannheim Gmbh Anti-HIV-Antikörper als Kontrollproben
CZ300927B6 (cs) * 1997-04-09 2009-09-16 Bio-Rad Pasteur Syntetický peptid monomerního typu, prostredek, který ho obsahuje, zpusob imunologické in vitro kvantifikace a diagnostický kit pro použití v biologických testech pro identifikaci infekcí zpusobených viry HIV
EP1003878A2 (en) 1997-07-18 2000-05-31 Innogenetics N.V. Hiv-1 group o antigens and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US7053175B1 (en) 2006-05-30
EP0973802B1 (fr) 2006-10-25
CN1256695A (zh) 2000-06-14
JP2001519800A (ja) 2001-10-23
IL132166A (en) 2006-12-10
CN1215082C (zh) 2005-08-17
KR100451312B1 (ko) 2004-10-06
US20060234213A1 (en) 2006-10-19
DE69836265T2 (de) 2007-05-31
RU2184742C2 (ru) 2002-07-10
JP3560987B2 (ja) 2004-09-02
BRPI9809078B8 (pt) 2021-05-25
WO1998045323A1 (fr) 1998-10-15
TR199902757T2 (xx) 2000-02-21
KR20010006216A (ko) 2001-01-26
ATE343590T1 (de) 2006-11-15
US7838001B2 (en) 2010-11-23
IL132166A0 (en) 2001-03-19
CZ300927B6 (cs) 2009-09-16
CA2286344C (fr) 2012-08-07
ES2275305T3 (es) 2007-06-01
BR9809078A (pt) 2000-08-01
PT973802E (pt) 2007-01-31
CA2286344A1 (fr) 1998-10-15
AU7338698A (en) 1998-10-30
DE69836265D1 (de) 2006-12-07
AU740231B2 (en) 2001-11-01
NZ500015A (en) 2001-06-29
NO994929D0 (no) 1999-10-08
CZ357599A3 (cs) 2000-06-14
NO329149B1 (no) 2010-08-30
EP0973802A1 (fr) 2000-01-26
PL336115A1 (en) 2000-06-05
BR9809078B1 (pt) 2012-12-11
NO994929L (no) 1999-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS62277400A (ja) Ｈｔｌｖ−３エンベロ−プ蛋白質
US5480966A (en) Peptides derived from the envelope glycoprotein of HIV viruses, their applications to the detection of infection caused by these viruses and to the vaccination against AIDS
EP0538283B1 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting hiv antibodies
FI101797B (fi) STLV-III-virukseen liittyvät polypeptidit, diagnostiset järjestelmät j a määritysmenetelmät
PL194863B1 (pl) Syntetyczne peptydy, zawierające je kompozycje, zastosowania tych peptydów oraz zestaw diagnostyczny
IL88963A (en) Circular synthetic peptides and their mixtures for the detection of VIH antibodies and for the formation of vaccines
FI102834B (fi) Kysteiinitioli-suojatut peptidit käytettäviksi immunologisissa määrity ksissä
US6149910A (en) Peptides for the detection of HIV-1 group O
CN1263536A (zh) 检测hiv抗体的方法及该方法中使用的抗原
MXPA99009106A (en) Synthetic peptides useful in biological assays for detecting infections caused by group o hiv-1 viruses
CN109836478A (zh) 非洲猪瘟病毒p11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用
CA2290217C (en) Peptides for the detection of hiv-1 group o
FR2761993A1 (fr) Peptides synthetiques utilisables dans les essais biologiques pour la detection des infections dues aux virus vih 1 groupe 0