PL195332B1 - Kompozycje szczepionek zawierajace kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka oraz ich zastosowania - Google Patents

Kompozycje szczepionek zawierajace kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka oraz ich zastosowania

Info

Publication number
PL195332B1
PL195332B1 PL98339735A PL33973598A PL195332B1 PL 195332 B1 PL195332 B1 PL 195332B1 PL 98339735 A PL98339735 A PL 98339735A PL 33973598 A PL33973598 A PL 33973598A PL 195332 B1 PL195332 B1 PL 195332B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
amino acid
acid residues
leu
hpv
Prior art date
Application number
PL98339735A
Other languages
English (en)
Other versions
PL339735A1 (en
Inventor
Lutz Gissmann
Martin Müller
Original Assignee
Univ Loyola Chicago
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Loyola Chicago filed Critical Univ Loyola Chicago
Publication of PL339735A1 publication Critical patent/PL339735A1/xx
Publication of PL195332B1 publication Critical patent/PL195332B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
    • Y10S977/802—Virus-based particle
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/915—Therapeutic or pharmaceutical composition
    • Y10S977/917—Vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

1. Kompozycja szczepionki zawierajaca kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka, przy czym kapsomer zawiera bialko fuzyjne, zawierajace bialko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka w sasiedztwie reszt aminokwasowych z drugiego bialka, znamienna tym, ze bialko L1 i aminokwasy z drugiego bialka sa umiejscowione tak, aby hamowac formowanie czastki wirusopodobnej. 2. Kompozycja szczepionki wedlug zastrz. 1, znamienna tym, ze bialko L1 jest kodowane wgenomie ludzkiego wirusa brodawczaka wybranego z grupy skladajacej sie z HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 oraz HPV45. 3. Kompozycja szczepionki zawierajaca kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka, przy czym kapsomer zawiera skrócone bialko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka z delecja jednej badz wielu reszt aminokwasowych, znamienna tym, ze usunieta jedna lub wiecej reszt aminokwasowych jest ko- nieczna do wytwarzania czastki wirusopodobnej. 4. Kompozycja szczepionki wedlug zastrz. 3, znamienna tym, ze kapsomer zawiera bialko fu- zyjne zawierajace skrócone bialko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka w sasiedztwie reszt aminokwa- sowych drugiego bialka. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje szczepionki zawierające kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka oraz ich zastosowania. Niniejszym przedstawione zostały również sposoby wytwarzania kapsomerów mających zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku oraz profilaktyczne i terapeutyczne sposoby ich zastosowania.
Zakażenia u ludzi pewnymi szczepami wysokiego ryzyka wirusów brodawczaka narządów płciowych (HPV) -na przykład HPV 16, 18 albo 45 - uważa się za główny czynnik ryzyka w tworzeniu się złośliwych nowotworów dróg odbytowo-rodnych. Spośród możliwych nowotworów, zdecydowanie najczęstszym jest rak szyjki macicy; według oszacowań Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), rocznie występuje niemal 500000 nowych przypadków. Z uwagi na częstość, z jaką dochodzi do tej patologii, intensywnie badano związek pomiędzy zakażeniem HPV a rakiem szyjki macicy, co doprowadziło do licznych uogólnień.
Na przykład wiadomo, że prekursorowe zmiany chorobowe w postaci wewnątrznabłonkowej neoplazji szyjki macicy (CIN), spowodowane są przez zakażenia wirusem brodawczaka [Crum, New Eng. J. Med. 310:880-883 (1984)]. DNA z genomów pewnych typów HPV, w tym na przykład ze szczepów 16, 18, 33, 35 i 45, wykryto w ponad 95% biopsji nowotworowych u pacjentów z tym schorzeniem, jak również w pierwotnych liniach komórkowych wyhodowanych z tych nowotworów. W przybliżeniu 50 do 70% komórek guzów CIN poddanych biopsji okazało się zawierać DNA pochodzące tylko z HPV 16.
Produkty białkowe wczesnych genów E6 i E7 HPV 16 i HPV 18 wykryto w liniach komórkowych raka szyjki macicy, jak również w ludzkich keratynocytach poddanych transformacji in vitro [Wettstein i wsp., w Papilloma Viruses and Human Cancer, Pfister (red.), CRC Press: Boca Raton, Floryda 1990 str. 155-179], a znaczny odsetek pacjentów z rakiem szyjki macicy posiada przeciwciała anty-E6 albo anty-E7. Wykazano, że białka E6 i E7 uczestniczą w indukcji syntezy komórkowego DNA w ludzkich komórkach, transformacji ludzkich keratynocytów i innych typów komórek, jak również w tworzeniu nowotworów u myszy transgenicznych [Arbelt i wsp., J. Virol., 68: 4358-4364 (1994); Auewarakul i wsp., Mol. Cell. Biol. 14: 8250-8258 (1994); Barbosa i wsp., J. Virol. 65:292-298 (1991); Kauri wsp., J. Gen. Virol. 70: 1261-1266 (1989); Schlegel, i wsp., EMBO J., 7: 3181-3187 (1988)]. Konstytutywna ekspresja białek E6/E7 wydaje się być konieczna w celu utrzymania stanu transformacji guzów HPVdodatnich.
Pomimo zdolności pewnych szczepów HPVdo wywoływania fenotypów nowotworowych in vivo i in vitro, inne typy HPV wywołują łagodne brodawki narządów płciowych, takie jak kłykciny kończyste są bardzo rzadko związane z nowotworami złośliwymi [Lkenberg, w Gross i wsp., (red.) Genital Papillomavirus Infections, Springer Verlag: Berlin, str., 87-112]. Do szczepów niskiego ryzyka tego typu należą na przykład HPV 6 i 11.
Najczęściej, wirusy brodawczaka narządów płciowych przenoszone są od człowieka do człowieka w czasie stosunku płciowego, co w wielu przypadkach prowadzi do trwałego zakażenia w błonie śluzowej okolicy odbytowo-płciowej. Choć obserwacja ta sugeruje, że zakażenie pierwotne wzbudza niewystarczającą odpowiedź odpornościową albo że wirus rozwinął zdolność unikania nadzoru immunologicznego, inne obserwacje sugerują, iż układ odpornościowy jest aktywny w czasie pierwotnej manifestacji, jak również w czasie progresji do nowotworu złośliwego zakażeń wirusem brodawczaka [Altmann i wsp. w Viruses and Cancer, Minson i wsp., (red.) Cambridge University Press, (1994) str. 71-80].
Na przykład, klinicznej manifestacji zakażenia pierwotnego króliczym i bydlęcym wirusem brodawczaka można zapobiec przez zaszczepienie wyciągami z brodawek albo białkami strukturalnymi wirusa [Altmann i wsp, p. wyżej; Campo, Curr. Top. In Microbiol. and Immunol. 186: 255-266 (1994); Yindle i Frazer, Curr. Top. In Microbiol. and Immunol. 186: 217-253 (1994)]. Gryzonie, uprzednio zaszczepione rekombinantami krowianki, kodującymi wczesne białka E6 albo E7 HPV 16 albo syntetycznymi peptydami E6, bądź E7są podobnie chronione przed tworzeniem guzów po inokulacji autologicznych komórek transformowanych HPV 16 [Altman i wsp, p. wyżej; Campo i wsp., p. wyżej; Yindle i Frazer i wsp., p. wyżej]. Regresję brodawek można wywołać przez transfer limfocytów od zwierząt przechodzących regresję po infekcji przez wirusy brodawczaków zwierzęcych. Wreszcie, u pacjentów w immunosupresji, takich jak na przykład biorcy przeszczepów narządowych albo osoby zakażone HIV, wzrasta częstość występowania brodawek narządów płciowych, CIN oraz raka odbytu i narządów płciowych.
PL 195 332 B1
Jak dotąd nie opisano żadnych szczepionek HPV, które zawierają białko późne L1 ludzkiego wirusa brodawczaka w postaci kapsomerów, które nadają się zarówno do celów profilaktycznych, jak i terapeutycznych. Ponieważ białko L1 nie jest obecne w złośliwych zmianach narządów płciowych, szczepienie białkiem L1 nie ma żadnego potencjału terapeutycznego dla tych pacjentów. Konstrukcja białek chimerowych, zawierających reszty aminokwasów z białka L1 i na przykład białka E6 albo E7, która dałaby kapsomery chimerowe, łączy funkcje profilaktyczne i terapeutyczne szczepionki. Sposób wytwarzania z wysoką wydajnością kapsomerów chimerowych byłby zatem szczególnie pożądany, mając na względzie możliwe zalety oferowane przez taką szczepionkę dla interwencji profilaktycznej i terapeutycznej.
Istnieje zatem w stanie techniki potrzeba opracowania kompozycji szczepionki, która mogłaby zapobiegać albo leczyć zakażenie HPV. Sposoby wytwarzania preparatów szczepionek, które pokonują problemy znane w stanie techniki, związane z wytwarzaniem w wyniku ekspresji oraz oczyszczaniem rekombinowanego białka HPV, byłby rzecz jasna użyteczne do leczenia populacji osób już zakażonych HPV, jak również użyteczne w immunizacji populacji osób podatnych na zakażenie HPV.
Przedmiotem wynalazku są kompozycje szczepionki, zawierające chimerowe kapsomery ludzkiego wirusa brodawczaka. Przedmiotem wynalazku są również ich zastosowania do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i zapobiegania zakażeniu wirusem HPV oraz zaburzeń z nim związanych. Niniejszym przedstawione zostały również sposoby terapeutyczne leczenia pacjentów zakażonych HPV, jak również sposoby profilaktyczne zapobiegania infekcji HPV u osobnika zagrożonego ryzykiem zakażenia. Ponadto ujawniono sposoby wytwarzania i oczyszczania kapsomerów i białek znajdujących zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku.
W szczególności przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki zawierająca kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka, przy czym kapsomer zawiera białko fuzyjne, zawierające białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka w sąsiedztwie reszt aminokwasowych z drugiego białka, przy czym białko L1 i aminokwasy z drugiego białka są umiejscowione tak, aby hamować formowanie cząstki wirusopodobnej. Korzystnie białko L1 jest kodowane w genomie ludzkiego wirusa brodawczaka wybranego z grupy składającej się z HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 oraz HPV45.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja szczepionki zawierająca kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka obejmujący skrócone białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka z delecją jednej, bądź wielu reszt aminokwasowych, przy czym usunięta jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest konieczna do wytwarzania cząstki wirusopodobnej. Korzystnie kapsomer zawiera białko fuzyjne obejmujące skrócone białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka w sąsiedztwie reszt aminokwasowych drugiego białka. Korzystniej białko L1 jest zakodowane w genomie ludzkiego wirusa brodawczaka, wybranego z grupy składającej się z HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 i HPV45, a najkorzystniej wirusem brodawczaka jest HPV16.
Korzystnie reszty aminokwasowe końca karboksylowego są usunięte z białka L1, korzystniej 1 do 34 reszt aminokwasowych z końca karboksylowego jest usuniętych z białka L1, a najkorzystniej 34 reszty aminokwasowe z końca karboksylowego są usunięte z białka L1. Korzystnie reszty aminokwasowe końca aminowego usunięte są z białka L1. W korzystnym wykonaniu, kompozycja szczepionki według wynalazku zawiera kapsomer, w którym wewnętrzne reszty aminokwasowe usunięte są z białka L1. Korzystnie reszty aminokwasowe usunięte z białka L1 zawierają sygnał lokalizacji jądrowej. Również korzystnie reszty aminokwasowe z drugiego białka pochodzą z białka HPV, korzystniej białko HPV jest wczesnym białkiem HPV, a najkorzystniej jest wybrane z grupy złożonej z E1, E2, E3, E4, E5, E6 i E7.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakażenia wirusem HPV oraz zaburzeń z nim związanych.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania zakażeniu wirusem HPV oraz zaburzeniom z nim związanych.
Jeden z aspektów wynalazku jest związany z profilaktycznymi szczepionkami do zapobiegania zakażeniu HPV, które zawierają strukturalne białko L1 wirusa brodawczaka. Opracowanie szczepionki tego typu napotyka znaczne przeszkody, ponieważ wirusy brodawczaka nie mogą być namnażane do odpowiednich mian w hodowlach komórkowych albo w innych układach doświadczalnych, aby zapewnić wystarczającą ilość białek wirusowych dla celów ekonomicznego wytwarzania szczepionki. Ponadto, metodologia rekombinacji w celu wywołania ekspresji białek nie zawsze jest łatwa i często powoduje niską wydajność produkcji białka. Ostatnio opisano cząsteczki wirusopodobne (ang. virus-like partic4
PL 195 332 B1 les, VLP), podobne w budowie do struktur kapsydów wirusowych, które powstają w komórkach owadzich Sf-9 podczas ekspresji białek wirusowych L1 i L2 (albo samego L1) z zastosowaniem rekombinowanego wirusa krowianki albo bakulowirusa. Oczyszczenie VLP można uzyskać bardzo prosto przez odwirowania w gradiencie CsCl albo sacharozy [Kimbauer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 99: 12180-12814 (1992); Kirnbaurer i wsp., J. Virol. 67: 6929-6936 (1994); Proso i wsp., J. Virol. 6714: 1936-1944 (1992); Sasagawa i wsp., Virology 2016: 126-195 (1995); Volpers i wsp., J. Virol. 69: 3258-3264 (1995); Zhou, i wsp., J. Gen. Virol. 74: 762-769 (1993); Zhou, i wsp., Virology 185: 251-257 (1991)]. Opis patentowy WO 93/02184 przedstawia sposób, w którym wirusopodobne cząsteczki pochodne wirusa brodawczaka stosuje się do zastosowań diagnostycznych albo jako szczepionka przeciw zakażeniom spowodowanym przez wirusa brodawczaka. Opis patentowy WO 94/00152 przedstawia wytwarzanie rekombinantu białka L1, który naśladuje konformacyjnie epitop neutralizujący na ludzkich i zwierzęcych wirionach brodawczaka.
W innym aspekcie szczepionki według wynalazku mają zastosowanie terapeutyczne i mają na celu uwolnienie od powikłań, na przykład raka szyjki macicy albo zmian prekursorowych wynikających z zakażenia wirusem brodawczaka, a tym samym stanowią alternatywę dla interwencji profilaktycznej. Szczepionki tego typu mogą zawierać wczesne białka wirusa brodawczaka, głównie E6 albo E7, które podlegają ekspresji w trwale zakażonych komórkach. Przyjmuje się, iż po podaniu szczepionki tego typu, cytotoksyczne limfocyty T mogą ulec aktywacji przeciwko trwale zakażonym komórkom w zmianach na narządach płciowych. Docelową populację dla interwencji terapeutycznej stanowią pacjenci ze związanymi z HPV zmianami na narządach płciowych o typie przednowotworowym albo nowotworowym. Zgłoszenie patentowe PCT WO 93/20844 ujawnia, że wczesne białko E7 i jego fragmenty antygenowe, pochodzące z wirusa brodawczaka HPV albo BPV, jest terapeutycznie skuteczne w wywoływaniu regresji, ale nie w zapobieganiu nowotworom związanym z wirusem brodawczaka u ssaków. Choć wczesne białka HPV wytwarzano przez rekombinowaną ekspresję w E. coli albo odpowiednich typach komórek eukariotycznych, oczyszczenie białek rekombinowanych okazało się trudne z uwagi na nieuniknioną niską rozpuszczalność i z powodu złożonych procedur oczyszczania, która ogólnie wymagają połączenia etapów, w tym chromatografii jonowymiennej, filtracji na żelu oraz chromatografii powinowactwa.
Zgodnie z rozwiązaniami według wynalazku, opracowano kompozycje szczepionki, zawierające wirusa brodawczaka, które zawierają albo (i) pierwsze białko, które jest nienaruszonym białkiem wirusa, ulegającym ekspresji jako białko fuzyjne złożone częściowo z reszt aminokwasowych drugiego białka; albo (ii) skrócone białko wirusowe; albo (iii) skrócone białko wirusowe, ulegające ekspresji jako białko fuzyjne, złożone częściowo z reszt aminokwasowych drugiego białka; albo (iv) jakieś połączenie tych trzech typów białek. Opracowane zostały kompozycje szczepionek, zawierające kapsomery bydlęcego wirusa brodawczaka (BPV) oraz ludzkiego wirusa brodawczaka. Korzystne kapsomery wirusa bydlęcego zawierają białko z bydlęcego wirusa brodawczaka typu I. Korzystne kapsomery wirusa ludzkiego zawierają białka z dowolnego ze szczepów ludzkiego wirusa brodawczaka HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 i HPV45. Najkorzystniejsze kompozycje szczepionki zawierają kapsomery zawierające białka z HPV16.
W jednym aspekcie, kapsomery z kompozycji szczepionek według wynalazku zawierają pierwsze nienaruszone białko wirusowe, ulegające ekspresji jako białko fuzyjne z dodatkowymi resztami aminokwasowymi z drugiego białka. Korzystnymi białkami wirusowymi są strukturalne białka wirusa brodawczaka L1. Kapsomery złożone z fuzji nienaruszonych białek wirusowych można wytwarzać przy użyciu białek Li i L2 razem albo samego białka L1. Korzystnie kapsomery są wytworzone całkowicie z białek fuzyjnych L1, których sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona w SEKW NR ID: 2 i kodowana przez sekwencję polinukleotydową z SEKW NR ID: 1. Reszty aminokwasowe drugiego białka mogą pochodzić z licznych źródeł (w tym reszt aminokwasowych pierwszego białka) tak długo, jak dodanie reszt aminokwasowych drugiego białka do pierwszego białka pozwala na tworzenie kapsomerów. Korzystnie dodanie reszt aminokwasowych drugiego białka zapobiega zdolności nienaruszonego białka wirusowego do tworzenia struktur cząstek wirusopodobnych; najkorzystniej reszty aminokwasowe drugiego białka ułatwiają tworzenie kapsomeru. Drugim białkiem może być dowolny ludzki antygen nowotworowy, antygen wirusowy albo antygen bakteryjny, który jest ważny dla stymulacji odpowiedzi immunologicznej w stanach chorób nowotworowych albo zakaźnych. W korzystnej postaci wykonania rozwiązań według wynalazku, drugie białko jest również białkiem wirusa brodawczaka. Korzystnie drugie białko jest produktem ekspresji wczesnego genu wirusa brodawczaka. Zaleca się jednak również, by drugie białko wybrane było z grupy E1, E2, E3, E4, E5, E6 i E7 - produktów
PL 195 332 B1 genów wczesnych zakodowanych w genomie szczepów wirusa brodawczaka HPV6, HPV11, HPV18, HPV33, HPV35 albo HPV45. Najkorzystniej drugie białko jest kodowane przez gen E7 HPV16, którego otwarta ramka odczytu podana jest w SEKW NR ID: 3. Kapsomery organizujące się z podjednostek białka fuzyjnego określa się tutaj jako kapsomery chimerowe. W jednym z przykładowych wykonań, kompozycja szczepionki złożona jest z kapsomerów chimerowych, w których reszty aminokwasowe białka L1 stanowią około 50 do 99% wszystkich reszt aminokwasowych białka fuzyjnego. W innym przykładowym wykonaniu, reszty aminokwasowe L1 stanowią około 60 do 90% wszystkich reszt aminokwasowych białka fuzyjnego; w szczególnie korzystnym przykładowym wykonaniu, aminokwasy L1 stanowią około 80% reszt aminokwasowych białka fuzyjnego.
W innym aspekcie wynalazku, opracowano kompozycje szczepionki kapsomerowej, która jest złożona ze skróconych białek wirusowych, wykazujących delecję jednej, bądź wielu reszt aminokwasowych koniecznych do tworzenia cząsteczki wirusopodobnej. Korzystnie delecja aminokwasu nie powinna hamować tworzenia kapsomerów skróconego białka, a najkorzystniej delecja ma ułatwiać tworzenie kapsomeru. Kompozycje szczepionek tego typu zawierają kapsomery złożone ze skróconego białka L1w obecności albo w nieobecności białka L2. Korzystnie kapsomery złożone są ze skróconych białek L1. Skrócone białka, znajdujące zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku obejmują te, w których jedna, bądź wiele reszt aminokwasowych zostały usunięte z końca karboksylowego białka albo jedna, bądź wiele reszt aminokwasowych zostały usunięte z końca aminowego białka, albo jedna bądź wiele reszt aminokwasowych zostały usunięte z regionu wewnętrznego (tj. nie z któregokolwiek końca) białka. Korzystnie kompozycje szczepionek kapsomerowych składają się z białek przeciętych przy końcu karboksylowym. W kompozycjach zawierających białko L1 pochodzące z HPV16, korzystne jest usunięcie 1do 34 reszt aminokwasowych z końca karboksylowego tego białka. Rozważa się również względnie krótsze delecję, których zaletą jest mniejsza modyfikacja właściwości antygenowych białek L1 i utworzonych z nich kapsomerów. Najbardziej korzystne jest jednak usunięcie z sekwencji Li 34 reszt aminokwasowych, co odpowiada aminokwasom 472 do 505 w sekwencji HPV 16 przedstawionej w SEKW NR ID: 2 kodowanym przez sekwencję polinukleotydową odpowiadającą nukleotydom 1414 do 1516 w sekwencji kodującej L1 ludzkiego HPV 16, podanej wSEKW NR ID: 1.
Gdy kompozycja szczepionki kapsomerowej jest wytworzona z białek zawierających wewnętrzną delecję, korzystne jest, aby usunięta sekwencja aminokwasów zawierała region jądrowej lokalizacji białka. W białku L1 HPV 16, sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) znajduje się od około reszty 499 do około reszty 505. Po ekspresji białek L1, w których usunięto NLS, organizowanie się struktur kapsomerów zachodzi w cytoplazmie komórki gospodarza. W konsekwencji, możliwe jest oczyszczenie kapsomerów z cytoplazmy zamiast z jądra, gdzie nienaruszone białka L1 organizują się w kapsomery. Kapsomery, które wynikają z organizowania się skróconych białek, w których dodatkowe sekwencje aminokwasowe nie zastępują usuniętych sekwencji białka, niekoniecznie muszą wykazywać charakter chimerowy.
Opracowane zostały również kompozycje szczepionki kapsomerowej, zawierającej skrócone białko wirusowe, poddawane ekspresji jako białko fuzyjne sąsiednich reszt aminokwasowych z drugiego białka. Korzystnymi skróconymi białkami wirusowymi są strukturalne białka wirusa brodawczaka L1i L2. Kapsomery złożone ze skróconych wirusowych białek fuzyjnych można wytworzyć przy użyciu składników białkowych L1i L2 razem albo samego białka L1. Korzystnymi kapsomerami znajdującymi zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku są te złożone z reszt aminokwasowych białka L1. Skrócone składniki białka wirusowego białek fuzyjnych obejmują te, w których usunięto jedną, bądź wiele reszt aminokwasowych z końca karboksylowego białka albo jedną, bądź wiele reszt aminokwasowych z końca aminowego białka, albo jedną bądź wiele reszt aminokwasowych z regionu wewnętrznego (tj. nie z któregokolwiek końca) białka. Korzystnie kompozycje szczepionki kapsomerowej zawierają białka skrócone przy końcu karboksylowym. W kompozycjach zawierających białko L1 pochodzące z HPV 16, korzystne jest usunięcie reszt aminokwasowych od 1do 34 przy końcu karboksylowym tego białka. Rozważa się również względnie krótsze delecje, których zaletą jest mniejsza modyfikacja właściwości antygenowych składnika białka L1 białka fuzyjnego oraz wytworzonych z niego kapsomerów. Najbardziej korzystne jest jednak usunięcie 34 reszt aminokwasych z sekwencji L1, odpowiadających aminokwasom 472 do 505 w sekwencji HPV 16 przedstawionej w SEKW NR ID: 2, a kodowanych przez sekwencję polinukleotydową, odpowiadającą nukleotydom 1414 do 1516 w sekwencji kodującej ludzkie białko L1HPV 16 podanej w SEKW NR ID: 1. Gdy kompozycja szczepionki
PL 195 332 B1 zawiera kapsomery składające się z białek z delecją wewnętrzną, korzystne jest, aby usunięta sekwencja aminokwasów zawierała region albo sekwencję lokalizacji jądrowej białka.
Aminokwasy drugiego białka mogą pochodzić z różnych źródeł tak długo, jak dodanie reszt aminokwasowych drugiego białka do pierwszego białka pozwala na tworzenie kapsomerów. Korzystne jest, aby dodanie reszt aminokwasowych drugiego białka promowało albo ułatwiało tworzenie kapsomeru. Reszty aminokwasowe drugiego białka mogą pochodzić z licznych źródeł, łącznie z aminokwasami z pierwszego białka. Korzystnie drugie białko jest również białkiem wirusa brodawczaka. Korzystniej drugie białko jest produktem ekspresji wczesnego genu wirusa brodawczaka. Najkorzystniej drugie białko jest wybrane z grupy produktów wczesnych genów, kodowanych przez geny wirusa brodawczaka E1, E2, E3, E4, E5, E6 i E7. W jednej z przykładowych postaci wykonania, kompozycja szczepionki według wynalazku zawiera kapsomery chimerowe, w których reszty aminokwasowe białka L1 stanowią około 50 do 99 % wszystkich reszt aminokwasowych białka fuzyjnego. W innej przykładowej postaci wykonania, reszty aminokwasowe L1 stanowią około 60 do 90% wszystkich reszt aminokwasowych białka fuzyjnego; a najkorzystniej aminokwasy L1 stanowią około 80% reszt aminokwasowych białka fuzyjnego.
Białka stosowane w kompozycji szczepionki według wynalazku są korzystnie wytwarzane metodami rekombinacji, ale w kompozycjach zawierających nienaruszone białko wirusowe, białka można izolować ze źródeł naturalnych. Nienaruszone białka wyizolowane ze źródeł naturalnych mogą być modyfikowane in vitro w celu dodatnia dodatkowych reszt aminokwasowych, aby dostarczyć białko fuzyjne przy użyciu technik modyfikacji kowalencyjnej dobrze znanych i rutynowo praktykowanych w stanie techniki. Podobnie, w kompozycjach zawierających skrócone białka, białka można wyizolować z naturalnych źródeł jako nienaruszone białko i poddać hydrolizie in vitro z zastosowaniem hydrolizy chemicznej albo trawienia enzymatycznego dowolną liczbą swoistych miejscowo albo ogólnych proteaz, a następnie zmodyfikować białko skrócone w celu dodania dodatkowych reszt aminokwasowych, jak opisano powyżej, w celu uzyskania skróconego białka fuzyjnego znajdującego zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku.
W procesie wytwarzania kapsomerów, można zastosować techniki rekombinacyjne biologii molekularnej w celu wytworzenia DNA, kodującego albo pożądane białko nienaruszone, białko skrócone albo skrócone białko fuzyjne. Metodologie rekombinacyjne wymagane do wytworzenia DNA kodującego pożądane białko są dobrze znane i rutynowo praktykowane w stanie techniki. Podręczniki laboratoryjne, na przykład Sambrook i wsp., (red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) i Ausebel i wsp. (red.), Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1997), opisują szczegółowo techniki konieczne do przeprowadzenia wymaganych manipulacji DNA. Do wytwarzania kapsomerów chimerowych na dużą skalę, można przeprowadzić ekspresję białka przy użyciu wektorów wirusowych albo eukariotycznych. Do zalecanych wektorów należą dowolne z dobrze znanych prokariotycznych wektorów ekspresji, rekombinowane bakulowirusy, wektory swoiste dla komórek COS, rekombinanty wirusa krowianki albo konstrukty ekspresyjne swoiste dla drożdży. Gdy do uzyskania kapsomerów stosuje się białka rekombinowane, białka można najpierw wyizolować z komórki gospodarza prowadzającej ekspresję, a następnie inkubować w warunkach, które pozwalają na samoorganizację w celu uzyskania kapsomerów. Alternatywnie, białka można wytwarzać przez ekspresję w warunkach, w których kapsomery tworzą się w komórce gospodarza.
Niniejszym opisane zostały procesy wytwarzania kapsomerów do zastosowania w kompozycjach szczepionek według wynalazku. W jednym ze sposobów, białka L1 poddaje się ekspresji z DNA kodującego sześć dodatkowych histydyn przy końcu karboksylowym sekwencji kodującej białko L1. Białka L1 poddawane ekspresji z dodatkowymi histydynami (białka His L1) są najkorzystniej poddawane ekspresji w E. colii można je oczyścić przy użyciu niklowej chromatografii powinowactwa. Białka His L1w lizacie komórkowym zawieszone są w buforze denaturacyjnym, na przykład w 6 M chlorowodorku guanidyny, albo w buforze o równoważnej zdolności denaturacyjnej, a następnie poddawane chromatografii niklowej. Białko wypłukane z etapu chromatografii niklowej jest poddane renaturacji, na przykład w 150 mM NaCl, 1mM CaCl2, 0,01% Triton-X 100, 10 mM HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy), pH 7,4. Korzystne organizacja kapsomerów zachodzi po dializie oczyszczonych białek, korzystnie po dializie wobec 150 mM NaCl, 25 mM Ca2+, 10% DMSO (sulfotlenek dimetylu), 0,1% Triton-X 100, 10 mM Tris [tris(hydroksymetylo)aminometan], kwasu octowego o wartości pH 5,0.
PL 195 332 B1
Tworzenie kapsomerów można monitorować metodą mikroskopii elektronowej, a w przypadkach, gdy kapsomery składają się z białek fuzyjnych, obecność różnych składników białkowych w zorganizowanym kapsomerze można potwierdzić analizą Western blot przy użyciu swoistych przeciwciał.
Opracowane zostały również sposoby terapeutycznego leczenia osób zakażonych HPV, obejmujące etap podawania pacjentowi potrzebującemu leczenia pewnej ilości kompozycji szczepionki według wynalazku, skutecznej w zmniejszaniu poziomu zakażenia HPV. Niniejszym opisano sposoby leczenia profilaktycznego osób podatnych na zakażenie HPV, obejmujące etap podawania osobie podatnej na zakażenie HPV pewnej ilości kompozycji szczepionki według wynalazku, skutecznej w zapobieganiu zakażeniu HPV. Choć zakażone osoby można łatwo zidentyfikować przy użyciu standardowych technik diagnostycznych, osoby podatne można zidentyfikować na przykład jako te wchodzące w związki seksualne z osobą zakażoną. Jednakże z uwagi na wysoką częstość zakażenia HPV, wszystkie seksualnie aktywne osoby mogą być podane na zakażenie wirusem brodawczaka.
Podawanie kompozycji szczepionki może obejmować podawanie jednego albo wielu dodatkowych składników, takich jak farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, rozcieńczalniki, adiuwanty i/lub bufory. Szczepionki można podawać jednorazowo albo wielokrotnie. Kompozycja szczepionki według wynalazku może być dostarczania różnymi drogami, do których należą na przykład droga doustna, dożylna, domięśniowa, donosowa, doodbytnicza, przezskórna, dopochwowa, podskórna i dootrzewnowa.
Kompozycje szczepionek według wynalazku oferują liczne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi preparatami szczepionki. Jako część szczepienia terapeutycznego, kapsomery mogą ułatwiać eliminację trwale zakażonych komórek i na przykład u pacjentek z CIN albo rakiem szyjki macicy. Dodatkowo, szczepionki terapeutycznego tego typu mogą również służyć celom profilaktycznym do ochrony pacjentów ze zmianami CIN przed ponownym zakażeniem. Dodatkową zaletą jest to, że kapsomery mogą uniknąć neutralizacji przez wstępnie istniejące przeciwciała antykapsydowe, a tym samym wykazywać dłuższy okres półtrwania w krążeniu w porównaniu z chimerowymi cząsteczkami wirusopodobnymi.
Kompozycje szczepionek, zawierające kapsomery chimerowe zapewniają dodatkową korzyść zwiększonej antygenowości obu składników białkowych białka fuzyjnego, z którego utworzony jest kapsomer. Na przykład w VLP składniki białkowe pierwotnego kapsomeru mogą być zagłębione w ogólnej strukturze w wyniku uwewnętrznionego rozmieszczenia w samej VLP. Podobnie, epitopy składników białkowych mogą być sterycznie niedostępne w wyniku kontaktu kapsomer z kapsomerem, a tym samym niedostępne w celu wywoływania odpowiedzi odpornościowej. Wstępne wyniki przy użyciu białek fuzyjnych L1/E7 w celu wytworzenia VLP wspierają tezę, że nie wykryto żądnej odpowiedzi typu przeciwciał przeciwko składnikowi E7. Obserwacja ta jest zgodna z uprzednimi wynikami, które wskazują, iż region końca karboksylowego L1 tworzy struktury ramienia międzypentamerowego, które umożliwiają organizowanie się kapsomerów w kapsydy [Garcia i wsp., J. Virol. 71: 2988-2995 (1997)]. Zakłada się, że w strukturze kapsomeru chimerowego, obydwa składniki białkowe podstruktury białka fuzyjnego są dostępne dla celów wywoływania odpowiedzi odpornościowej. Szczepionki kapsomerowe oferowałyby zatem dodatkową zaletę zwiększonej antygenowości wobec dowolnego składnika białkowego, w tym na przykład epitopów neutralizujących z innych białek wirusowych, ulegających ekspresji w fuzji z sekwencjami aminokwasowymi L1.
Niniejszy wynalazek przedstawiony jest w następujących przykładach. Przykład 1 opisuje konstrukcję wektorów ekspresji w celu wytworzenia fuzyjnych albo chimerowych białek wirusowych. Przykład 2 dotyczy wytwarzania rekombinowanych bakulowirusów do ekspresji białek wirusowych. Przykład 3 odnosi się do oczyszczania kapsomerów. Przykład 4 opisuje protokół immunizacji do wytwarzania surowic odpornościowych i przeciwciał monoklonalnych. Przykład 5 przedstawia test peptydowy ELLSA do ilościowej oceny formowania kapsomerów. Przykład 6 opisuje test wychwytu antygenów ELLSA do ilościowej oceny formowania kapsomerów. Przykład 7 przedstawia test hemaglutynacji w celu oceny wzbudzania przeciwciał neutralizujących.
Przykład 1
Konstrukcja genów chimerowych L1
DNA kodujący otwartą ramkę odczytu L1HPV 16 wycięto z plazmidu 16-114/k-L1/L2-pSynxtVL[Kirnbauer i wsp., J. Virol. 67: 6929-6936 (1994)], przy użyciu BglII, a otrzymany fragment wklonowano do pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA), wcześniej zlinearyzowanemu w unikalnym miejscu restrykcyjnym BamHI. Najpierw wytworzono dwa podstawowe konstrukty ekspresyjne, aby umożliwić następujące wstawienia DNA do ekspresji białka fuzyjnego. Jeden konstrukt kodował HPV 16 L1 A310, z delecją dziewięciu aminokwasów; wiadomo, iż region usunięty wykazywał homologię niskiego
PL 195 332 B1 poziomu z białkami L1 wszystkich innych wirusów brodawczaka. Drugi konstrukt, HPV 16 L1AC, kodował białko z delecją 34 aminokwasów reszt końca karboksylowego L1. Inne konstrukty zawierają miejsce restrykcyjne EcoRI w położeniu delecji w celu ułatwienia wstawienia DNA kodującego inne sekwencje białkowe. Dodanie miejsca EcoRI koduje dwa aminokwasy nie pochodzące z L1, asparaginian i izoleucynę.
A. Wytwarzanie konstruktu ekspresyjnego HPV 16 L1D310
Dwa startery (SEKW NR ID: 5 i 6) zaprojektowano w celu amplifikacji wektora pUC19 oraz kompletnej sekwencji kodującej HPV 16 L1, z wyjątkiem nukleotydów 916 do 942 w SEKW NR ID: 1. Startery zsyntetyzowano tak, by wprowadzić również unikalne miejsce restrykcyjne EcoRI (podkreślone w SEKW NR ID: 5 i 6) przy końcach produktu amplifikacji.
CCCCGATATCGCCTTTAATGTATAAATCGTCTGG SEKW NR ID: 5
CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTG SEKW NR ID: 6
Uzyskany produkt PCR trawiono EcoRI w celu otrzymania komplementarnych końców, a produkt trawienia zapętlono przez ligację. Zligowane DNA poddano transformacji do E. coli przy użyciu standardowych technik, a plazmidy z uzyskanych kolonii poddano przesiewowi na obecność miejsca restrykcyjnego EcoRI. Jeden klon, oznaczony HPV 16L1D310 zidentyfikowano jako wykazujący odpowiednią delecję dwudziestu siedmiu nukleotydów i konstrukt ten zastosowano do wstawienia fragmentów DNA kodujących inne białka HPV16 w miejscu EcoRI jak przedyskutowano poniżej.
B. Wytwarzanie konstruktów ekspresyjnych HPV16 L1AC.
Dwa startery (SEKW NR ID: 7 i 8) zaprojektowano jako komplementarne do otwartej ramki odczytu HPV16 L1 tak, że startery przylegały do siebie w celu umożliwienia amplifikacji w kierunkach odwrotnych na matrycy DNA zawierającej sekwencje kodujące HPV 16 L1w pUC19 opisanym powyżej.
AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC SEKW NR ID: 7
AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG SEKW NR ID: 8
Każdy starter wprowadził miejsce restrykcyjne EcoRI przy końcu produktu amplifikacji. W starterze typu „downstream” (SEKW NR ID: 8), po miejscu EcoRV następował kodon stop translacji TAA, umieszczony tak, że produkt amplifikacji, po ligacji końców EcoRI w celu zapętlenia, zawierałby delecję 34 aminokwasów z końca karboksylowego L1. Przeprowadzono PCR w celu amplifikacji częściowej otwartej ramki odczytu L1 oraz kompletnego wektora. Produkt amplifikacji przecięto EcoRV, zapętlono przy użyciu ligazy DNA T4 i poddano transformacji do komórek E. coli DH5a. Plazmidy z żywotnych klonów zanalizowano pod kątem obecności miejsca EcoRI, które linearyzowałoby plazmid. Jeden dodatni konstrukt, oznaczony pUCHPIGL1DC zidentyfikowano i wykorzystano do wstawienia DNA z innych białek HPV 16 przy użyciu miejsca EcoRI.
C. Insercja fragmentów DNA do HPV 16 L1 A310 i HPV16L1DC
Fragmenty DNA HPV 16 E7, kodujące aminokwasy 1-50, 1-60, 1-98, 25-75, 40-98, 50-98 wSEKW NR ID: 4 poddano amplifikacji przy użyciu starterów, które wprowadzały 5' terminalne miejsca restrykcyjne EcoRI w celu ułatwienia insercji fragmentu albo do zmodyfikowanej sekwencji HPV 16 L1 D310 albo HPV16L1DC. W różnych reakcjach amplifikacji, starter E7.1 (SEKW NR ID: 9) zastosowano w połączeniu ze starterem E7.2 (SEKW NR ID: 10) w celu wytworzenia fragmentu DNA kodującego aminokwasy 1-50 E7; ze starterem E7.3 (SEKW NR ID: 11) w celu wytworzenia fragmentu DNA kodującego aminokwasy 1-60 E7; albo ze starterem E7.4 (SEKW NR ID: 12) w celu wytworzenia fragmentu DNA kodującego aminokwasy 1-98 E7. W innych reakcjach amplifikacji, pary starterów E7.5 (SEKW NR ID: 13) oraz E7.6 (SEKW NR ID: 14) zastosowano do amplifikacji fragmentu DNA kodującego aminokwasy 25-75 E7; E7.7 (SEKW NR ID: 15) oraz E7.4 (SEKW NR ID: 12) zastosowano
PL 195 332 B1 do amplifikacji fragmentu DNA, kodującego aminokwasy 40-98 E7; a E7.8 (SEKW NR ID: 16) oraz E7.4 (SEKW NR ID: 12) zastosowano do amplifikacji fragmentu DNA, kodującego aminokwasy 50-98 E7.
Starter E7.1 SEKW NR ID: 9
AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC
Starter E7.2 SEKW NR ID: 10
TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC
Starter E7.3 SEKW NR ID: 11
TTTTGATATCCTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCC
Starter E7.4 SEKW NR ID: 12
AAAAGATATCTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCAC
Starter E7.5 SEKW NR ID: 13
TTTTGATATCGATTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG
Starter E7.6 SEKW NR ID: 14
TTTTGATATCGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC
Starter E7.7 SEKW NR ID: 15
TTTATCGATATCGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGAC
Starter E7.8 SEKW NR ID: 16
TTTTGATATCGATGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTG
Podobnie, nukleotydy z DNA kodującego białko macierzy wirusa grypy (SEKW NR ID: 17) poddano amplifikacji przy użyciu pary starterów podanej w SEKW NR ID: 19 i 20. Obydwa startery wprowadzały miejsce restrykcyjne EcoRI do produktu amplifikacji.
TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC
SEKW NR ID: 19
TTTTGATATCGTTGTTTGGATCCCCATTCCCATTG
SEKW NR ID: 20
Produkty PCR z każdej reakcji amplifikacji przecięto przy użyciu EcoRI i wstawiono do miejsca EcoRI każdej z sekwencji HPV 16L1D310 i HPV16L1DC, wcześniej zlinearyzowanych tym samym enzymem. W celu określenia orientacji wstawek w plazmidach kodujących aminokwasy 25-75 i 50-98 E7 oraz plazmidzie kodującym białko macierzy wirusa grypy, zastosowano trawienie ClaI, wykorzystując miejsce restrykcyjne, nakładające się na nowo wytworzone miejsce restrykcyjne EcoRI (GATATCGAT) i zawarte w starterze typu „upstream”. Dla trzech konstruktów ekspresyjnych, zawierających inicjacyjną metioninę HPV 16 E7, orientację wstawki określono przy użyciu miejsca restrykcyjnego NslI wewnątrz regionu kodującego E7.
Po identyfikacji konstruktów ekspresyjnych posiadających odpowiednie wstawki, rejon kodujący białko dla zarówno L1, jak i wstawionych aminokwasów wycięto jako jednostkę przy użyciu enzymów restrykcyjnych Xbal i SmaI, a wyizolowane DNA poddano ligacji w plazmid pVL1393 (Invitrogen) wcelu wytworzenia rekombinowanych bakulowirusów.
D. Eliminacja miejsc restrykcyjnych EcoRI w konstruktach ekspresyjnych
Sekwencja HPV 16 L1AC zawiera DNA z miejsca EcoRI, które powoduje translację aminokwasów nie znajdowanych normalnie w dzikich polipeptydach L1. A zatem, zaprojektowano serię kon10
PL 195 332 B1 strukcji ekspresyjnych, w których wyeliminowano sztuczne miejsce EcoRI. Sekwencja L1dla tej serii konstruktów ekspresyjnych została oznaczona HPV 16 L1DC*.
W celu wytworzenia konstruktu ekspresyjnego zawierającego sekwencję HPV 16 LlDC*, przeprowadzono dwie reakcje PCR w celu amplifikacji dwóch nakładających się fragmentów z pUC-HPVl6 L1C, kodujących aminokwasy 1-50 E7. Uzyskane fragmenty DNA nakładały się w położeniu granicznym L1/E7, ale nie zawierały dwóch miejsc restrykcyjnych EcoRI. Fragment l wytworzono przy użyciu starterów P1 (SEKW NR ID: 21) oraz P2 (SEKW NR ID: 22), a fragment 2 przy użyciu starterów P3 (SEKW NR ID: 23) i P4 (SEKW NR ID: 24).
Starter PI SEKW NR ID: 21
GTTATGACATACATACATTCTATG
Starter P2 SEKW NR ID: 22
CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC
Starter P3 SEKW NR ID: 23
CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC
Starter P4 SEKW NR ID: 24
CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG
Po pierwszych dwóch reakcjach amplifikacji, dwa oczyszczone produkty zastosowano jako matryce w innej reakcji PCR tylko przy użyciu starterów P1i P4. Uzyskany produkt amplifikacji strawiono enzymami EcoNI i HindIII, wstawiono do konstruktu ekspresyjnego HPV 16L1DC opisanego powyżej po strawieniu tymi samymi enzymami. Uzyskany konstrukt ekspresyjny różnił się od oryginalnego konstruktu HPV16L1DC z DNA kodującym L1 i aminokwasy 1-50 E7 utratą dwóch wewnętrznych miejsc restrykcyjnych EcoRI. Pierwsze miejsce EcoRV zastąpiono DNA kodującym natywne aminokwasy L1 alaninę i glicynę w tym położeniu, a drugie zastąpiono sygnałem stop translacji. Dodatkowo, konstrukt ekspresyjny, oznaczony HPV 16 L1DC* E7 1-52, zawierał 52 pierwsze aminokwasy HPV 16 E7 w rezultacie zastosowania startera P4, który koduje również reszty aminokwasowe E7, histydynę w położeniu 51 oraz tyrozynę w położeniu 52. HPV 16L1 D C* E7 1-52 zastosowano wówczas do wytworzenia dodatkowych konstruktów ekspresyjnych HPV 16L1DC, zawierających ponadto DNA, kodujące aminokwasy 1-55 E7 przy użyciu startera P1 (SEKW NR ID: 21) w połączeniu ze starterem P5 (SEKW NR ID: 25), aminokwasy 1-60 E7 z parą starterów P1i P6 (SEKW NR ID: 26) oraz aminokwasów 1-65 E7 z parą starterów P1i P7 (SEKW NR ID: 27). Dodatkowe sekwencje DNA kodujące aminokwasy w produktach amplifikacji wynikały z projektu starterów, które zawierały dodatkowe nukleotydy dla pożądanych aminokwasów.
Podobnie, HPV 16 L1DC* E7 1-70 wytworzono przy użyciu matrycowego DNA, kodującego HPV 16 L1DC* E7 1-66 oraz pary starterów P1i P8 (SEKW NR ID: 28).
PL 195 332 B1
Starter P8 SEKW NR ID: 28
CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAAC CGAAGCGTAGAGTCACACTTG
Po każdej reakcji PCR, produkty amplifikacji trawiono EcoNI i HindIII i wstawiano do HPV16L1DC, uprzednio trawionego tymi samymi enzymami. Sekwencje każdego z konstruktów określano przy użyciu narzędzia sekwencyjnego Applied Biosystems Prism 377, z zastosowaniem fluorescencyjnych dideoksynukleotydów końca łańcucha [Prober et al., Science 238: 336-341 (1987)].
Pr zykład 2
Wytwarzanie rekombinowanych bakulowirusów
Komórki Spodoptera frugiperda (Sf9) hodowano w zawieszeniu albo w hodowlach jednowarstwowych w 27°C w pożywce TNMFH (Sigma), z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM glutaminy. W celu konstrukcji rekombinowanego bakulowirusa opartego na HPV 16 L1, komórki Sf9 poddano transfekcji 10 mg plazmidu transferowego wraz z 2 mg linearyzowanego Baculo-Gold DNA (Pharmingen, San Diego, CA). Rekombinowane wirusy oczyszczono według protokołu sugerowanego przez producenta.
W celu przetestowania na ekspresję białka HPV 16 L1, 105 komórek Sf9 zakażano rekombinowanym bakulowirusem z wielokrotnością zakażenia (m.o.i.) 5 do 10. Po inkubacji przez trzy do czterech dni w 28°C, pożywkę usunięto, a komórki przepłukano PBS. Komórki poddano lizie w buforze próbkującym SDS i analizie SDS-PAGE oraz Western blot przy użyciu przeciwciał anty-HPV16 L1 i anty-HPV16 E7.
W celu określenia, które z konstruktów ekspresyjnych chimerowego białka L1 wytwarzałyby preferencyjnie kapsomery, wyciągi z komórek transfekowanych poddano wirowaniu w gradiencie. Frakcje uzyskane z gradientu analizowano na zawartość białka L1 przez Western blotting oraz na tworzenie VLP pod mikroskopem elektronowym. Wyniki przedstawiono w tabeli 1.
Wykazano, iż nienaruszone białko HPV L1, jak również każdy z produktów ekspresji HPV 16 L1D310 i HPV 16 LlDC, wytwarzały kapsomery i cząsteczki wirusopodobne w równych proporcjach. Gdy sekwencje kodujące E7 wstawiono do wektora HPV 16 L1D310, jedynie białka fuzyjne zawierające wytworzone aminokwasy E7 1-50 powodowały powstanie wykrywalnego tworzenia kapsomerów.
Gdy DNA kodujące E7 wstawiono do wektora HPV 16 LlDC, stwierdzono, iż wszystkie białka fuzyjne wytwarzały kapsomery; białka chimerowe, zawierające reszty aminokwąsowe 40-98 E7 wytwarzały najwyższy poziom struktur wyłącznie kapsomerowych.
Obydwa białka chimerowe zawierające aminokwasy 1-98 i 25-75 E7 wytwarzały głównie kapsomery, choć obserwowano również tworzenie się cząstek wirusopodobnych. Chimerowe białka zawierające aminokwasy 1-60 E7 powodowały powstanie niemal równych poziomów produkcji kapsomerów i cząstek wirusopodobnych.
Gdy sekwencje E7 wstawiono do wektora HPV 16 LlD*C, wykazano, iż wszystkie białka fuzyjne wytwarzały kapsomery. Wstawienie DNA kodującego reszty 1-52, 1-55 i 1-60 E7 wytwarzało najwyższy poziom kapsomerów, ale obserwowano równe poziomy produkcji cząstek wirusopodobnych. Choć wstawienie DNA kodującego DNA dla reszt 1-65, 1-70, 25-75, 40-98 i 1-98 E7 wywołało porównywalnie niższe poziomy albo niewykrywalne poziomy kapsydów, kapsomery produkowane były w wysokich ilościach.
T a b e l a 1
Zdolność białek chimerowych HPV 16 L1 do tworzenia kapsomerów i kapsydów
Konstrukt ekspresji L1 Wstawka Produkcja kapsomerów Produkcja kapsydów
1 2 3 4
HVP 16 L1 Brak +++++ +++++
HVP 16 L1D310 Brak +++ ++
PL 195 332 B1 ciąg dalszy tabeli 1
1 2 3 4
HVP 16 L1DC Brak ++++ ++++
HVP 16 L1D310 E7 1-98 - -
HVP 16 L1D310 E7 1-50 ++ -
HVP 16 L1D310 E7 25-75 - -
HVP 16 L1D310 E7 50-98 - -
HVP 16 L1DC E7 1-98 +++ -
HVP 16 L1DC E7 25-75 +++ -
HVP 16 L1DC E7 50-98 + +
HVP 16 L1DC E7 1-60 +++++ +++++
HVP 16 L1DC E7 40-98 ++++ -
HVP 16 L1DC Grypa +++ +
HVP 16 L1D*C E7 1-52 +++++ +++++
HVP 16 L1D*C E7 1-55 +++++ +++++
HVP 16 L1D*C E7 1-60 +++ +++++
HVP 16 L1D*C E7 1-65 ++ -
HVP 16 L1D*C E7 1-70 ++ -
Pr zy kł a d 3
Oczyszczanie kapsomerów
Komórki Trichopulsia ni (TN) High Five hodowano do gęstości około 2 x 106 komórek/ml w wolnej od surowicy pożywce Ex-Cell 405 (JRH Biosciences). Około 2 x 108 komórek peletowano przez odwirowanie w 1000 x g przez 15 minut, ponownie zawieszono w 20 ml pożywki i zakażono rekombinowanymi bakulowirusami przy m.o.i. 2 do 5 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po dodaniu 200 ml pożywki, komórki wysiano i hodowano przez 3 do 4 dni w 27°C. Po inkubacji, komórki zbierano, peletowano i ponownie zawieszano w 10 ml bufora ekstrakcyjnego.
Następujące etapy przeprowadzono w 4°C. Komórki poddano sonifikacji przez 45 sekund przy 60 watach, a uzyskany lizat komórkowy odwirowano przy 10000 rpm w wirówce Sorval SS34. Supernatant usunięto i zatrzymano, zaś uzyskaną peletę ponownie zawieszono w 6 ml bufora ekstrakcyjnego poddano sonifikacji przez dodatkowe 3 sekundy przy 60 watach i ponownie odwirowano.
Dwa supernatanty połączono, umieszczono w dwustopniowym gradiencie, zawierającym 14 ml 40% sacharozy na 8 ml roztworu CsCl (4,6 g CsCl na 8 ml w buforze ekstrakcyjnym) i odwirowano w wirówce z kołyszącym koszem Sorval AH629 przez 2 godziny przy 27000 rpm w 10°C. Region złącza pomiędzy CsCl a sacharozą wraz z całą warstwą CsCl zebrano do 13,4 ml probówek Quickseal (Beckman) i dodano bufor ekstrakcyjny w celu wyregulowania objętości do 13,4 ml. Próbki odwirowano przez noc w 50000 rpm w 20°C w wirówce Beckman 70 T1. Gradienty poddano frakcjonowaniu (1 ml na frakcję) przez przekłucie na szczycie i w dnie igłą rozmiaru 21. Frakcje zbierano z każdej probówki, a 2,5 μΐ każdej frakcji analizowano na 10% żelu poliakrylamidowym SDS i przy użyciu Western blottingu z zastosowaniem przeciwciała anty-HPVT6 L1.
Cząsteczki wirusopodobne i kapsomery rozdzielono z frakcji zidentyfikowanych powyżej przez sedymentację na gradientach sacharozy 10 do 50%. Szczytowe frakcje z gradientów CsCl zlano i poddano dializie przez 2 godziny wobec 5 mM HEPES (pH 7,5). Połowę dializatu zastosowano do wytworzenia kapsomerów przez rozłożenie nienaruszonych VLP w ciągu nocy przez dodanie EDTA (stężenie ostateczne 50 mM), EGTA (50 mM), DTT (30 mM), NaCl (100 mM) i Tris/HCl, pH 8,0, (10mM). Jako kontrolę, dodano tylko NaCl i Tris/HCl do drugiej połowy.
Do analizy kapsomerów wytworzonych z rozłożonych VLP, EDTA, EGTA i DTT (każde w ostatecznym stężeniu 5 mM) dodano do poduszeczek sacharozowych, które odwirowano przy 250000 x g
PL 195 332 B1 przez 2 do 4 godzin w 4°C. Frakcje zbierano przez przebicie probówek w dnie. Następnie rozcieńczenie 1:10 każdej frakcji zanalizowano przy użyciu testu wychwytu antygenu ELLSA.
Przykład 4
Protokół immunizacji do wytwarzania poliklonalnych surowic odpornościowych oraz przeciwciał monoklonalnych
Myszy Balb/c immunizuje się podskórnie trzy razy, co cztery tygodnie przy użyciu około 60 g chimerowych kapsomerów HPV zmieszanych 1:1 z kompletnymi bądź niekompletnymi adiuwantami
Freunda w całkowitej objętości 100 μ|. Sześć tygodni po trzeciej immunizacji, myszy uśmierca się, akrew zbiera przez przekłucie serca.
Przykład 5
Test peptydowy ELISA do szacowania i|ościowej produkcji kapsomerów
Płytki mikrotitracyjne (Dynatech) pokrywa się przez noc 50 μ| peptydu E701 [Mu||er i wsp., 1982] w stężeniu 10 μg/ml w PBS. Studzienki blokuje się przez 2 godziny w 37°C przy użyciu 100 μl bufora zawierającego 5% BSA i 0,05% Tween 20 w PBS i przemywa trzykrotnie PBS zawierającym 0,05% Tween 20. Po trzecim przepłukaniu, 50 μl surowicy rozcieńczonej 1:5000 w BSA/Tween 20/PBS dodaje się do każdej studzienki i przeprowadza inkubację przez 1 godzinę. Płytki przemywa się znów tak jak poprzednio i dodaje 50 μl koziego antymysiego koniugatu peroksydazowego w rozcieńczeniu 1:5000. Po 1 godzinie, płytki przepłukuje się i barwi przy użyciu substratu ABTS (0,2 mg/ml, kwas 2.2'-azyno-bis(3-etylobenzhiazolino-β-sulfonowy w buforze 0,1 M Na-octano-fosforanowym (pH 4,2) z 4 μl 30% H2O2 na 10 ml). Ekstynkcję mierzy się po 1 godzinie przy 490 nm na automatycznym czytniku płytek Dynatech.
Przykład 6
Test wychwytu antygenu ELLSA do ilościowego oszacowania produkcji kapsomerów
W celu umożliwienia względnej oceny ilościowej cząstek wirusopodobnych i kapsomerów we frakcjach z gradientów CsCl, zastosowano testy ELISA wychwytu antygenu. Płytki mikrotitracyjne pokrywano przez noc 50 μl/studzienkę przy rozcieńczeniu 1:500 (ostateczne stężenie 2 ng na ml w PBS) oczyszczonym przy użyciu białka A mysim przeciwciałem monoklonalnym swoistym dla HPV 16 L1 (przeciwciała 25/C, MM07 i Ritti i uzyskano od myszy immunizowanych VLP HPV 16). Płytki blokowano 5% mlekiem/PBS przez 1 godzinę a 50 μl frakcji gradientów CsCl dodawano na 1 godzinę w 37°C przy użyciu rozcieńczenia 1:300 (w 5% mleku/PBS).
Po trzech płukaniach PBS/0,05% Tween 20, 50 μl króliczej poliklonalnej surowicy odpornościowej (rozcieńczenie 1:3000 w mleku/PBS) uzyskanej przeciwko VLP HPV 16 dodano a płytki inkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Płytki przepłukano znów i dalej inkubowano z 50 μl koziego antymysiego koniugatu peroksydazowego (Sigma), rozcieńczonego do 1:5000 w PBS, zawierającym 5% mleka przez 1godzinę. Po ostatecznym wypłukaniu, płytki zabarwiono substratem ABTS przez 30 minut i zmierzono ekstynkcję przy 490 nm w automatycznym czytniku płytek Dynatech. Jako kontrolę negatywną, test zawierał również studzienki pokryte wyłącznie PBS.
W celu przetestowania przeciwciał monoklonalnych na swoistość względem kapsomerów, VLP z EDTA/DTT dodano w celu rozłożenia cząstek. Poddane obróbce preparaty cząstek testowano wteście wychwytu antygenu ELISA, a odczyty porównywano z nieobrobionymi próbkami kontrolnymi. Dla rozłożenia cząstek, 40 μl VLP inkubowano przez noc w 4°C w 500 μl buforu rozrywającego, zawierającego 30 mM DTT, 50 mM EGTA, 60 mM EDTA, 100 mM NaCl i 100 mM Tris/HCl, pH 8,0. Alikwoty poddanych obróbce i nie poddanych cząstek zastosowano w powyższym teście wychwytu ELLSA wrozcieńczeniu 1:20-1:40.
Przykład 7
Test hamowania hemaglutyniny
W celu określenia stopnia, w jakim chimerowe szczepionki kapsomerowe wywołują wytwarzanie przeciwciał neutralizujących, przeprowadza się test hamowania hemaglutynacji jak krótko opisano poniżej. Test ten oparty jest na uprzednich obserwacjach, iż cząstki wirusopodobne zdolne są do hemaglutynacji czerwonych krwinek.
Myszy immunizuje się tylko jedną spośród chimerowych szczepionek kapsomerowych, a surowice zbiera jak opisano powyżej w przykładzie 4. Jako kontrolę pozytywną, testuje się cząstki wirusopodobne HPV16 L1 (VLP) oraz bydlęce PV1 (BPV) L1 VLP, równolegle z preparatem chimerowych kapsomerów. W celu ustalenia dodatniego poziomu odniesienia, HPV16 albo BPV1 VLP najpierw inkubuje się z albo bez surowic zebranych od immunizowanych myszy, po czym dodaje się czerwone
PL 195 332 B1 krwinki. Stopień, w jakim wstępna inkubacja z surowicami mysimi hamuje hemaglutynację czerwonych krwinek jest wskazówką zdolności neutralizującej surowicy mysiej.
Doświadczenia powtarza się następnie przy użyciu chimerowych kapsomerów w celu określenia efektu neutralizującego mysich surowic na szczepionkę. Krótki protokół testu hamowania hemaglutynacji opisano poniżej.
Sto mikrolitrów heparyny (1000 jednostek usp/ml) dodaje się do 1 ml świeżej krwi mysiej. Krwinki czerwone przepłukuje się trzykrotnie PBS, po czym następuje odwirowanie i ponowne zawieszenie w objętości 10 ml. Następnie, erytrocyty ponownie zawiesza się w 0,5 ml PBS i przechowuje w 4°C do trzech dni. Do testu hemaglutyninowego, stosuje się 70 μΐ zawiesiny na studzienkę na płytce 96-studzienkowej.
Alikwoty chimerowych kapsomerów z gradientów CsCl dializuje się przez godzinę wobec 10 mM Hepes (pH 7,5) i 100 μl dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń w PBS dodaje się do mysich krwinek w płytkach 96-studzienkowych mikrotitracyjnych o zaokrąglonym dnie, które następnie inkubuje się przez 3-16 godzin w 4°C. W celu hamowania hemaglutynacji, kapsomery inkubuje się z rozcieńczeniami przeciwciał w PBS przez 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodaje do erytrocytów. Poziom hemaglutynacji erytrocytów, a stąd obecność przeciwciał neutralizujących, określa się metodami standardowymi.
We wstępnych wynikach obserwowano, że surowice mysie wytworzone przeciwko chimerowym kapsomerom zawierającym białko HPV16L1DC w połączeniu z resztami aminokwasowymi 1-98 E7, hamują hemaglutynację przez HPV16 VLP, ale nie dla BPV VLP. Surowice mysie były zatem dodatnie względem przeciwciał neutralizujących wobec ludzkich VLP, a ta różnicowa neutralizacja była najprawdopodobniej wynikiem swoistości przeciwciał wobec epitopów, przeciwko którym wytworzono przeciwciała.
Liczne modyfikacje i warianty wynalazku, jak przedstawiono w powyższych ilustrujących przykładach, mogą być prawdopodobnie otrzymane u osób biegłych w dziedzinie. W konsekwencji na wynalazek należy nałożyć tylko takie ograniczenia, jakie pojawiają się w załączonych zastrzeżeniach.
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 27 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:
(A) ADDRESAT: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) ULICA: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower (C) MIASTO: Chicago (D) STAN: Illinois (E) PAŃSTWO: Stany Zjednoczone Ameryki Północnej (F) KOD: 60606-6402 (v) POSTAĆ DO ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:
(A) TYPMEDIUM: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) DANE O ZGŁOSZENIU BIEŻĄCYM:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZŁOŻENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJA O RZECZNIKU/AGENCIE:
(A) NAZWISKO: Williams Jr., Joseph A.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 38,659 (C) NUMER ODNOŚNY/TECZKI: 27013/34028 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) TELEFON: 312-474-6300 (B) TELEFAX: 312-474-0448
PL 195 332 B1 (2) INFORMACJA O SEKW NR ID:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1518 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYPCZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (ix) CECHA:
(A) NAZWA/CECHA: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..1518 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID:1:
144
192
240
288
336
384
432
480
ATG TCT CTT TGG CTG CCT AGT GAG GCC ACT GTC TAC TTG CCT CCT GTC
Met 1 Ser Leu Trp Leu 5 Pro Ser Glu Ala Thr 10 Val Tyr Leu Pro Pro 15 Val
CCA GTA TCT AAG GTT GTA AGC ACG GAT GAA TAT GTT GCA CGC ACA AAC
Pro Val Ser Lys 20 Val Val Ser Thr Asp 25 Glu Tyr Val Ala Arg 30 Thr Asn
ATA TAT TAT CAT GCA GGA ACA TCC AGA CTA CTT GCA GTT GGA CAT CCC
Ile Tyr Tyr 35 His Ala Gly Thr Ser 40 Arg Leu Leu Ala Val 45 Gly His Pro
TAT TTT CCT ATT AAA AAA CCT AAC AAT AAC AAA ATA TTA GTT CCT AAA
Tyr Phe 50 Pro Ile Lys Lys Pro 55 Asn Asn Asn Lys Ile 60 Leu Val Pro Lys
GTA TCA GGA TTA CAA TAC AGG GTA TTT AGA ATA CAT TTA CCT GAC CCC
Val 65 Ser Gly Leu Gin Tyr 70 Arg Val Phe Arg Ile 75 His Leu Pro Asp Pro 80
AAT AAG TTT GGT TTT CCT GAC ACC TCA TTT TAT AAT CCA GAT ACA CAG
Asn Lys Phe Gly Phe 85 Pro Asp Thr Ser Phe 90 Tyr Asn Pro Asp Thr 95 Gin
CGG CTG GTT TGG GCC TGT GTA GGT GTT GAG GTA GGT CGT GGT CAG CCA
Arg Leu Val Trp 100 Ala Cys Val Gly Val 105 Glu Val Gly Arg Gly 110 Gin Pro
TTA GGT GTG GGC ATT AGT GGC CAT CCT TTA TTA AAT AAA TTG GAT GAC
Leu Gly Val 115 Gly Ile Ser Gly His 120 Pro Leu Leu Asn Lys 125 Leu Asp Asp
ACA GAA AAT GCT AGT GCT TAT GCA GCA AAT GCA GGT GTG GAT AAT AGA
Thr Glu 130 Asn Ala Ser Ala Tyr 135 Ala Ala Asn Ala Gly 140 Val Asp Asn Arg
GAA TGT ATA TCT ATG GAT TAC AAA CAA ACA CAA TTG TGT TTA ATT GGT
Glu 145 Cys Ile Ser Met Asp 150 Tyr Lys Gin Thr Gin 155 Leu Cys Leu Ile Gly 160
TGC AAA CCA CCT ATA GGG GAA CAC TGG GGC AAA GGA TCC CCA TGT ACC
528
PL 195 332 B1
576
624
672
720
768
816
864
312
960
1008
1056
1104
Cys Lys Pro Pro Ile 165 Gly Glu His Trp Gly 170 Lys Gly Ser Pro Cys 175 Thr
AAT GTT GCA GTA AAT CCA GGT GAT TGT CCA CCA TTA GAG TTA ATA AAC
Asn. Val Ala Val 180 Asn Pro Gly Asp Cys 185 Pro Pro Leu Glu Leu 190 Ile Asn
ACA GTT ATT CAG GAT GGT GAT ATG GTT GAT ACT GGC TTT GGT GCT ATG
Thr Val Ile 195 Gln Asp Gly Asp Met 200 Val Asp Thr Gly Phe 205 Gly Ala Met
GAC TTT ACT ACA TTA CAG GCT AAC AAA AGT GAA GTT CCA CTG GAT ATT
Asp Phe 210 Thr Thr Leu Gln Ala 215 Asn Lys Ser Glu Val 220 Pro Leu Asp Ile
TGT ACA TCT ATT TGC AAA TAT CCA GAT TAT ATT AAA ATG GTG TCA GAA
Cys 225 Thr Ser Ile Cys Lys 230 Tyr Pro Asp Tyr Ile 235 Lys Met Val Ser Glu 240
CCA TAT GGC GAC AGC TTA TTT TTT TAT TTA CGA AGG GAA CAA ATG TTT
Pro Tyr Gly Asp Ser 245 Leu Phe Phe Tyr Leu 250 Arg Arg Glu Gln Met 255 Phe
GTT AGA CAT TTA TTT AAT AGG GCT GGT GCT GTT GGT GAA AAT GTA CCA
Val Arg His Leu 260 Phe Asn Arg Ala Gly 265 Ala Val Gly Glu Asn 270 Val Pro
GAC GAT TTA TAC ATT AAA GGC TCT GGG TCT ACT GCA AAT TTA GCC AGT
Asp Asp Leu 275 Tyr Ile Lys Gly Ser 280 Gly Ser Thr Ala Asn 285 Leu Ala Ser
TCA AAT TAT TTT CCT ACA CCT AGT GGT TCT ATG GTT ACC TCT GAT GCC
Ser Asn 290 Tyr Phe Pro Thr Pro 295 Ser Gly Ser Met Val 300 Thr Ser Asp Ala
CAA ATA TTC AAT AAA CCT TAT TGG TTA CAA CGA GCA CAG GGC CAC AAT
Gln 305 Ile Phe Asn Lys Pro 310 Tyr Trp Leu Gln Arg 315 Ala Gln Gly His Asn 320
AAT GGC ATT TGT TGG GGT AAC CAA CTA TTT GTT ACT GTT GTT GAT ACT
Asn Gly Ile Cys Trp 325 Gly Asn Gln Leu Phe 330 Val Thr Val Val Asp 335 Thr
ACA CGC AGT ACA AAT ATG TCA TTA TGT GCT GCC ATA TCT ACT TCA GAA
Thr Arg Ser Thr 340 Asn Met Ser Leu Cys 345 Ala Ala Ile Ser Thr 350 Ser Glu
ACT ACA TAT AAA AAT ACT AAC TTT AAG GAG TAC CTA CGA CAT GGG GAG
Thr Thr Tyr 355 Lys Asn Thr Asn Phe 360 Lys Glu Tyr Leu Arg 365 His Gly Glu
PL 195 332 B1
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
1488
1518
GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CAA CTG TGC AAA ATA ACC TTA ACT
Glu Tyr Asp Leu Gin Phe Ile Phe Gin Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr
370 375 380
GCA GAC GTT ATG ACA TAC ATA CAT TCT ATG AAT TCC ACT ATT TTG GAG
Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu
385 390 395 400
GAC TGG AAT TTT GGT CTA CAA CCT CCC CCA GGA GGC ACA CTA GAA GAT
Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gin Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp
405 410 415
ACT TAT AGG TTT GTA ACC TCC CAG GCA ATT GCT TGT CAA AAA CAT ACA
Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gin Ala Ile Ala Cys Gin Lys His Thr
420 425 430
CCT CCA GCA CCT AAA GAA GAT CCC CTT AAA AAA TAC ACT TTT TGG GAA
Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu
435 440 445
GTA AAT TTA AAG GAA AAG TTT TCT GCA GAC CTA GAT CAG TTT CCT TTA
Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gin Phe Pro Leu
450 455 460
GGA CGC AAA TTT TTA CTA CAA GCA GGA TTG AAG GCC AAA CCA AAA TTT
Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gin Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe
465 470 475 480
ACA TTA GGA AAA CGA AAA GCT ACA CCC ACC ACC TCA TCT ACC TCT ACA
Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr
485 490 495
ACT GCT AAA CGC AAA AAA CGT AAG CTG TAA
Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu
500 505
(2) INFORMACJA O SEKW NR ID:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 506 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (D) TOPOLOGLA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID:2:
PL 195 332 B1
1 5 10 15
Pro Val Ser Lys 20 Val Val Ser Thr Asp 25 Glu Tyr Val Ala Arg 30 Thr Asn
Ile Tyr Tyr 35 His Ala Gly Thr Ser 40 Arg Leu Leu Ala Val 45 Gly His Pro
Tyr Phe 50 Pro Ile Lys Lys Pro 55 Asn Asn Asn Lys Ile 60 Leu Val Pro Lys
Val 65 Ser Gly Leu Gin Tyr 70 Arg Val Phe Arg Ile 75 His Leu Pro Asp Pro 80
Asn Lys Phe Gly Phe 85 Pro Asp Thr Ser Phe 90 Tyr Asn Pro Asp Thr 95 Gin
Arg Leu Val Trp 100 Ala Cys Val Gly Val 105 Glu Val Gly Arg Gly 110 Gin Pro
Leu Gly Val 115 Gly Ile Ser Gly His 120 Pro Leu Leu Asn Lys 125 Leu Asp Asp
Thr Glu 130 Asn Ala Ser Ala Tyr 135 Ala Ala Asn. Ala Gly 140 Val Asp Asn Arg
Glu 145 Cys Ile Ser Met Asp 150 Tyr Lys Gin Thr Gin 155 Leu Cys Leu Ile Gly 160
Cys Lys Pro Pro Ile 165 Gly Glu His Trp Gly 170 Lys Gly Ser Pro Cys 175 Thr
Asn Val Ala Val 180 Asn Pro Gly Asp Cys 185 Pro Pro Leu Glu Leu 190 Ile Asn
Thr Val Ile 195 Gin Asp Gly Asp Met 200 Val Asp Thr Gly Phe 205 Gly Ala Met
Asp Phe 210 Thr Thr Leu Gin Ala 215 Asn Lys Ser Glu Val 220 Pro Leu Asp Ile
Cys 225 Thr Ser Ile Cys Lys 230 Tyr Pro Asp Tyr Ile 235 Lys Met Val Ser Glu 240
Pro Tyr Gly Asp Ser 245 Leu Phe Phe Tyr Leu 250 Arg Arg Glu Gin Met 255 Phe
Val Arg His Leu 260 Phe Asn Arg Ala Gly 265 Ala Val Gly Glu Asn 270 Val Pro
Asp Asp Leu 275 Tyr Ile Lys Gly Ser 280 Gly Ser Thr Ala Asn 285 Leu Ala Ser
Ser Asn 290 Tyr Phe Pro Thr Pro 295 Ser Gly Ser Met Val 300 Thr Ser Asp Ala
Gin 305 Ile Phe Asn Lys Pro 310 Tyr Trp Leu Gin Arg 315 Ala Gin Gly His Asn 320
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gin Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr
PL 195 332 B1
325 330 335
Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu
340 345 350
Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu
355 360 365
Glu Tyr Asp Leu Gin Phe Ile Phe Gin Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr
370 375 380
Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu
385 390 395 400
Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gin Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp
405 410 415
Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gin Ala Ile Ala Cys Gin Lys His Thr
420 425 430
Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu
435 440 445
Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gin Phe Pro Leu
450 455 460
Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gin Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe
465 470 475 480
Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr
485 490 495
Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu *
500 505
(2) INFORMACJA O SEKW NR ID:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 297 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/CECHA: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..297 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID:3:
48 ATG Met 1 CAT His GGA GAT ACA CCT ACA TTG CAT His GAA TAT ATG TTA Leu GAT Asp TTG Leu 15 CAA Gin
Thr 5 Pro Thr Leu Glu 10 Tyr Met
Gly Asp
CCA GAG ACA ACT GAT CTC TAC TGT TAT GAG CAA TTA AAT GAC AGC TCA
PL 195 332 B1
Pro Glu Thr Thr 20 Asp Leu Tyr Cys Tyr 25 Glu Gin Leu Asn Asp 30 Ser Ser
GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT CCA GCT GGA CAA GCA GAA CCG GAC
144 Glu Glu Glu 35 Asp Glu Ile Asp Gly 40 Pro Ala Gly Gin Ala 45 Glu Pro Asp
AGA GCC CAT TAC AAT ATT GTA ACC TTT TGT TGC AAG TGT GAC TCT ACG
192 Arg Ala 50 His Tyr Asn Ile Val 55 Thr Phe Cys Cys Lys 60 Cys Asp Ser Thr
CTT CGG TTG TGC GTA CAA AGC ACA CAC GTA GAC ATT CGT ACT TTG GAA
240 Leu 65 Arg Leu Cys Val Gin 70 Ser Thr His Val Asp 75 Ile Arg Thr Leu Glu 80
GAC CTG TTA ATG GGC ACA CTA GGA ATT GTG TGC CCC ATC TGT TCT CAG
288 Asp Leu Leu Met Gly 85 Thr Leu Gly Ile Val 90 Cys Pro Ile Cys Ser 95 Gin
AAA CCA TAA
297
Lys Pro * (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKASEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 98 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 4:
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gin 15 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gin Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gin Ala Glu Pro Asp 35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gin Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gin 85 90 95
Lys Pro *
PL 195 332 B1 (2) INFORMACJA O SEKW NR ID:5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 34 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 5:
CCCCGATATC GCCTTTAATG TATAAATCGT CTGG (2) INFORMACJA O SEKW NR ID:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 6:
CCCCGATATC TCAAATTATT TTCCTACACC TAGTG (2) INFORMACJA O SEKW NR ID:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID:7:
AAAGATATCT TGTAGTAAAA ATTTGCGTCC TAAAGGAAAC (2) INFORMACJA O SEKW NR ID:8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 8:
AAAGATATCT AATCTACCTC TACAACTGCT AAACGCAAAA AACG
PL 195 332 B1 (2) INFORMACJA O SEKW NR ID:9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 9:
AAAAGATATC ATGCATGGAG ATACACCTAC ATTGC 35 (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 34 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 10:
TTTTGATATC GGCTCTGTCC GGTTCTGCTT GTCC (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 11:
TTTTGATATC CTTGCAACAA AAGGTTACAA TATTGTAATG GGCC (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGLA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 12:
AAAAGATATC TGGTTTCTGA GAACAGATGG GGCAC
PL 195 332 B1 (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 13:
TTTTGATATC GATTATGAGC AATTAAATGA CAGCTCAG (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 14:
TTTTGATATC GTCTACGTGT GTGCTTTGTA CGCAC (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 15:
TTTATCGATA TCGGTCCAGC TGGACAAGCA GAACCGGAC (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 16:
TTTTGATATC GATGCCCATT ACAATATTGT AACCTTTTG
PL 195 332 B1 (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 294 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/CECHA: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..294 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 17:
ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CTT ACC AGA AAC GGA TGG GAG
Met 1 Ser Leu Leu Thr 5 Glu Val Glu Thr Leu 10 Thr Arg Asn Gly Trp 15 Glu
TGC AAA TGC AGC GAT TCA AGT GAT CCT CTC ATT ATC GCA GCG AGT ATC
Cys Lys Cys Ser 20 Asp Ser Ser Asp Pro 25 Leu Ile Ile Ala Ala 30 Ser Ile
144
192
ATT GGG ATC TTG CAC TTG ATA TTG TGG ATT TTT TAT CGT CTT TTC TTC
Ile Gly Ile 35 Leu His Leu Ile Leu 40 Trp Ile Phe Tyr Arg 45 Leu Phe Phe
AAA TGC ATT TAT CGT CGC CTT AAA TAC GGT TTG AAA AGA GGG CCT TCT
Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser
55 60
240
288
ACG GAA GGA GCG CCT GAG TCT ATG AGG GAA GAA TAT CGG CAG GAA CAG
Thr 65 Glu Gly Ala Pro Glu 70 Ser Met Arg Glu Glu 75 Tyr Arg Gin Glu Gin 80
CAG AGT GCT GTG GAT GTT GAC GAT GTT CAT TTT GTC AAC ATA GAG CTG
Gin Ser Ala Yal Asp 85 Yal Asp Asp Yal His 90 Phe Yal Asn Ile Glu 95 Leu
294
GAG TAA
Glu * (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 97 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 18:
PL 195 332 B1
Met 1 Ser Leu Leu Thr 5 Glu Val Glu Thr Leu 10 Thr Arg Asn Gly Trp 15 Glu
Cys Lys Cys Ser 20 Asp Ser Ser Asp Pro 25 Leu Ile Ile Ala Ala 30 Ser Ile
Ile Gly Ile 35 Leu His Leu Ile Leu 40 Trp Ile Phe Tyr Arg 45 Leu Phe Phe
Lys Cys 50 Ile Tyr Arg Arg Leu 55 Lys Tyr Gly Leu Lys 60 Arg Gly Pro Ser
Thr 65 Glu Gly Ala Pro Glu 70 Ser Met Arg Glu Glu 75 Tyr Arg Gin Glu Gin 80
Gin Ser Ala Yal Asp Yal Asp Asp Yal His Phe Yal Asn Ile Glu Leu
90 95
Glu * (2) INFORMACJA O SEKW NR ID:19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYPCZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID:19:
TTTTGATATC GATATGGAAT GGCTAAAGAC AAGACCAATC (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 20:
TTTTGATATC GTTGTTTGGA TCCCCATTCC CATTG (2) INFORMACJA O SEKW NR ID:21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYPCZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 21:
PL 195 332 B1
GTTATGACAT ACATACATTC TATG (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKL: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 22:
CCATGCATTC CTGCTTGTAG TAAAAATTTG CGTCC (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 23:
CTACAAGCAG GAATGCATGG AGATACACC (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 24:
CATCTGAAGC TTAGTAATGG GCTCTGTCCG GTTCTG (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 25:
CATCTGAAGC TTATCAATAT TGTAATGGGC TCTGTCCG
PL 195 332 B1 (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 26:
CATCTGAAGC TTACTTGCAA CAAAAGGTTA CAATATTGTA ATGGGCTCTG TCCG (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 27:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 27:
CATCTGAAGC TTAAAGCGTA GAGTCACACT TGCAACAAAA GGTTACAATA TTGTAATGGG
CTCTGTCCG (2) INFORMACJA O SEKW NR ID: 28:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW NR ID: 28:
CATCTGAAGC TTATTGTACG CACAACCGAA GCGTAGAGTC ACACTTG

Claims (19)

1. Kompozycja szczepionki zawierająca kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka, przy czym kapsomer zawiera białko fuzyjne, zawierające białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka w sąsiedztwie reszt aminokwasowych z drugiego białka, znamienna tym, że białko L1 i aminokwasy z drugiego białka są umiejscowione tak, aby hamować formowanie cząstki wirusopodobnej.
2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że białko L1 jest kodowane w genomie ludzkiego wirusa brodawczaka wybranego z grupy składającej się z HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 oraz HPV45.
3. Kompozycja szczepionki zawierająca kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka, przy czym kapsomer zawiera skrócone białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka z delecją jednej bądź wielu reszt aminokwasowych, znamienna tym, że usunięta jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest konieczna do wytwarzania cząstki wirusopodobnej.
PL 195 332 B1
4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że kapsomer zawiera białko fuzyjne zawierające skrócone białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaka w sąsiedztwie reszt aminokwasowych drugiego białka.
5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że białko L1 jest zakodowane w genomie ludzkiego wirusa brodawczaka, wybranego z grupy składającej się z HPV6,
HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 i HPV45.
6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 5, znamienna tym, że wirusem brodawczaka jest HPV16.
7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, albo 6, znamienna tym, że reszty aminokwasowe końca karboksylowego są usunięte z białka L1.
8. Kompozycja szczepionki według zastrz. 7, znamienna tym, że 1 do 34 reszt aminokwasowych z końca karboksylowego jest usuniętych z białka L1.
9. Kompozycja szczepionki według zastrz. 8, znamienna tym, że 34 reszty aminokwasowe z końca karboksylowego są usunięte z białka L1.
10. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, albo 6, znamienna tym, że reszty aminokwasowe końca aminowego usunięte są z białka L1.
11. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, albo 6, znamienna tym, że wewnętrzne reszty aminokwasowe usunięte są z białka L1.
12. Kompozycja szczepionki według zastrz. 11, znamienna tym, że reszty aminokwasowe usunięte z białka L1 zawierają sygnał lokalizacji jądrowej.
13. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że reszty aminokwasowe z drugiego białka pochodzą z białka HPV.
14. Kompozycja szczepionki według zastrz. 13, znamienna tym, że białko HPV jest wczesnym białkiem HPV.
15. Kompozycja szczepionki według zastrz. 13, znamienna tym, że białko HPV jest wybrane z grupy składającej się z E1, E2, E3, E4, E4, E6 i E7.
16. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakażenia wirusem HPV oraz zaburzeń z nim związanych.
17. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 3 albo 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakażenia wirusem HPV oraz zaburzeń z nim związanych.
18. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania zakażeniu wirusem HPV oraz zaburzeniom z nim związanych.
19. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 3 albo 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania zakażeniu wirusem HPV oraz zaburzeniom z nim związanych.
PL98339735A 1997-10-06 1998-10-06 Kompozycje szczepionek zawierajace kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka oraz ich zastosowania PL195332B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/944,368 US6228368B1 (en) 1997-10-06 1997-10-06 Papilloma virus capsomere formulations and method of use
PCT/US1998/020965 WO1999018220A1 (en) 1997-10-06 1998-10-06 Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL339735A1 PL339735A1 (en) 2001-01-02
PL195332B1 true PL195332B1 (pl) 2007-09-28

Family

ID=25481268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL98339735A PL195332B1 (pl) 1997-10-06 1998-10-06 Kompozycje szczepionek zawierajace kapsomer ludzkiego wirusa brodawczaka oraz ich zastosowania

Country Status (21)

Country Link
US (4) US6228368B1 (pl)
EP (2) EP1690941B1 (pl)
JP (3) JP4520034B2 (pl)
KR (1) KR20010030969A (pl)
AT (2) ATE349536T1 (pl)
AU (1) AU9684698A (pl)
BR (1) BR9814606A (pl)
CA (1) CA2305382A1 (pl)
CY (1) CY1105963T1 (pl)
CZ (1) CZ302351B6 (pl)
DE (2) DE69836753T2 (pl)
DK (1) DK1021547T3 (pl)
ES (2) ES2337492T3 (pl)
HU (1) HU225893B1 (pl)
IL (3) IL135528A0 (pl)
NO (2) NO328128B1 (pl)
NZ (1) NZ503830A (pl)
PL (1) PL195332B1 (pl)
PT (1) PT1021547E (pl)
TR (1) TR200001842T2 (pl)
WO (1) WO1999018220A1 (pl)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE122007000092I1 (de) * 1994-10-07 2008-03-27 Univ Loyola Chicago Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
AU7704498A (en) * 1997-05-29 1998-12-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Human frp and fragments thereof including methods for using them
US6228368B1 (en) 1997-10-06 2001-05-08 Loyola University Of Chicago Papilloma virus capsomere formulations and method of use
US7494658B2 (en) * 1998-02-20 2009-02-24 Medigene Ag Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US20020039584A1 (en) * 1998-02-20 2002-04-04 Medigene Ag Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
US7182947B2 (en) * 1998-02-20 2007-02-27 Medigene Ag Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
CA2229955C (en) * 1998-02-20 2003-12-09 Medigene Gmbh Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
GB9806666D0 (en) * 1998-03-27 1998-05-27 Stanley Margaret Antigen preparation and use
AUPP765398A0 (en) * 1998-12-11 1999-01-14 University Of Queensland, The Treatment of papillomavirus infections
DE19905883C2 (de) * 1999-02-11 2001-05-23 Deutsches Krebsforsch Chimäre Virus-ähnliche Partikel bzw. chimäre Capsomere von BPV
FI107932B (fi) * 1999-02-16 2001-10-31 Mikael Paronen Polymeerikalvo ja menetelmä sen valmistamiseksi
US6551597B1 (en) * 1999-03-18 2003-04-22 President & Fellows Of Harvard College Vaccine compositions for human papillomavirus
DE19925235A1 (de) 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
DE19925199A1 (de) * 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
DE19925234A1 (de) * 1999-06-01 2000-12-14 Medigene Ag Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, oder CVLPs bzw. damit beladenen Zellen und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
EP1212358B1 (en) * 1999-08-25 2004-12-15 Merck & Co., Inc. Synthetic papillomavirus genes optimized for expression in human cells
CA2875298A1 (en) * 1999-12-09 2001-06-14 Medimmune, Inc. In vitro method for disassembly/reassembly of papillomavirus virus-like particles (vlps)
US6600018B1 (en) 2000-04-10 2003-07-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Secreted frizzled related protein, sFRP, fragments and methods of use thereof
US6908613B2 (en) * 2000-06-21 2005-06-21 Medimmune, Inc. Chimeric human papillomavirus (HPV) L1 molecules and uses therefor
DE10055545A1 (de) * 2000-11-09 2002-07-25 Deutsches Krebsforsch Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen
DE10059630A1 (de) * 2000-12-01 2002-06-06 Medigene Ag Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von durch humanen Papillomavirus-Typ 18-hervorgerufenem Tumor
AU2002367977B2 (en) 2001-08-13 2008-06-19 University Of Rochester Transcutaneous immunization against papillomavirus with papillomavirus virus-like particles
AU2002326093A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-10 University Of Cape Town Papillomavirus proteins and pharmaceutical compositions
US20040121465A1 (en) * 2002-02-14 2004-06-24 Novavax, Inc. Optimization of gene sequences of virus-like particles for expression in insect cells
SI1506222T1 (sl) † 2002-05-17 2009-10-31 Universty Of Cape Town Himerni L1-proteini humanega papilomavirusa 16, ki obsegajo L2-peptid, delci, podobni virusu, pripravljeni iz njih, in postopek za pripravo delcev
US8101189B2 (en) 2002-07-05 2012-01-24 Folia Biotech Inc. Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them
ES2431963T3 (es) 2002-07-05 2013-11-28 Folia Biotech Inc. Partícula viral adyuvante
SE0202897D0 (sv) * 2002-10-01 2002-10-01 Quantovir Ab Method and kit for quantitative and qualitative determination of human papillomavirus
SE0202896D0 (sv) * 2002-10-01 2002-10-01 Quantovir Ab Method for estimating the risk of carcinoma development
US7763259B2 (en) * 2003-01-10 2010-07-27 The Regents Of The University Of Colorado Therapeutic and prophylactic vaccine for the treatment and prevention of papillomavirus infection
US7172773B2 (en) * 2004-04-26 2007-02-06 Renew Life Inc. Food supplement formulation
ATE474596T1 (de) * 2004-09-10 2010-08-15 Asahi Glass Co Ltd Impfstoff gegen humanes papillomavirus zur oralen verabreichung
EP1819835B1 (en) 2004-12-08 2010-08-04 Gen-Probe Incorporated Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses
US7314630B2 (en) * 2005-01-07 2008-01-01 Yao-Xiong Hu Compounds and methods of early diagnosis of cervical cancer and genital condyloma with HPV, CHSP60 tumor suppressor H-Ras, K-Ras and PTEN derived peptides modified
WO2008134935A1 (en) 2007-04-29 2008-11-13 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. Truncated human papillomavirus type 18 l1 proteins
US9428555B2 (en) * 2007-04-29 2016-08-30 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. Truncated L1 protein of Human Papillomavirus type 16
DK2154149T3 (da) * 2007-05-29 2019-10-14 Univ Xiamen En trunkeret l1-protein af human papillomavirus 6
US8507811B2 (en) * 2009-02-02 2013-08-13 Apple Inc. Touch sensor panels with reduced static capacitance
EP2377879A1 (en) * 2010-04-14 2011-10-19 Deutsches Krebsforschungszentrum N-terminal HPV E7 fusion proteins
WO2015196112A1 (en) 2014-06-19 2015-12-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Human papilloma virus constructs
WO2016026919A1 (en) * 2014-08-20 2016-02-25 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Vaccines and manufacturing methods for treatment and prevention of disease
WO2021013067A1 (zh) * 2019-07-19 2021-01-28 神州细胞工程有限公司 嵌合的人乳头瘤病毒6型l1蛋白
US11382700B2 (en) 2020-05-08 2022-07-12 Globus Medical Inc. Extended reality headset tool tracking and control
US11510750B2 (en) 2020-05-08 2022-11-29 Globus Medical, Inc. Leveraging two-dimensional digital imaging and communication in medicine imagery in three-dimensional extended reality applications

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2194839T3 (es) 1991-07-19 2003-12-01 Univ Queensland Vacuna de papilomavirus.
GB9207701D0 (en) 1992-04-08 1992-05-27 Cancer Res Campaign Tech Papillomavirus e7 protein
EP1835029A1 (en) 1992-06-25 2007-09-19 Georgetown University Papillomavirus vaccines
US5437951A (en) * 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5618536A (en) 1992-09-03 1997-04-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chimeric papillomavirus-like particles
ATE492289T1 (de) * 1993-03-09 2011-01-15 Univ Rochester Herstellung von menschlichen papillomavirus hbv- 11 kapsidprotein l1 und virus-ähnliche partikeln
AUPM566794A0 (en) * 1994-05-17 1994-06-09 University Of Queensland, The Process and product
DE122007000092I1 (de) * 1994-10-07 2008-03-27 Univ Loyola Chicago Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
DE4435907C2 (de) 1994-10-07 1997-07-24 Lutz Prof Dr Gissmann Papillomavirusähnliche Partikel und deren Anwendung
JP3413020B2 (ja) * 1996-07-17 2003-06-03 株式会社東芝 半導体装置の製造方法
DE19712541C1 (de) 1997-03-25 1998-11-05 Deutsches Krebsforsch Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
CA2295316C (en) * 1997-07-03 2007-06-26 University Of Colorado, University Technology Corporation Homogeneous human papilloma virus capsomere containing compositions, methods for manufacture, and the use thereof as diagnostic, prophylactic or therapy
WO1999010557A1 (fr) 1997-08-26 1999-03-04 Nsk Ltd. Procede de production d'un palier a roulement
US6228368B1 (en) * 1997-10-06 2001-05-08 Loyola University Of Chicago Papilloma virus capsomere formulations and method of use

Also Published As

Publication number Publication date
IL135528A (en) 2008-06-05
NO20001768L (no) 2000-06-02
US7754430B2 (en) 2010-07-13
DE69836753D1 (de) 2007-02-08
NZ503830A (en) 2002-09-27
IL190554A0 (en) 2008-11-03
IL135528A0 (en) 2001-05-20
EP1021547A1 (en) 2000-07-26
NO20091761L (no) 2000-06-02
CZ302351B6 (cs) 2011-03-30
US7371391B2 (en) 2008-05-13
ES2337492T3 (es) 2010-04-26
JP5296665B2 (ja) 2013-09-25
JP2010095530A (ja) 2010-04-30
US20090028894A1 (en) 2009-01-29
EP1690941B1 (en) 2009-11-25
ATE449852T1 (de) 2009-12-15
CY1105963T1 (el) 2011-04-06
US6228368B1 (en) 2001-05-08
EP1690941A1 (en) 2006-08-16
US20050031636A1 (en) 2005-02-10
ES2280104T3 (es) 2007-09-01
CA2305382A1 (en) 1999-04-15
AU9684698A (en) 1999-04-27
EP1021547B1 (en) 2006-12-27
JP2001519161A (ja) 2001-10-23
ATE349536T1 (de) 2007-01-15
JP4520034B2 (ja) 2010-08-04
WO1999018220A1 (en) 1999-04-15
JP2013147507A (ja) 2013-08-01
TR200001842T2 (tr) 2000-12-21
CZ20001244A3 (en) 2001-05-16
HUP0004360A2 (en) 2001-03-28
KR20010030969A (ko) 2001-04-16
HU225893B1 (en) 2007-12-28
DE69841342D1 (de) 2010-01-07
US20060198853A1 (en) 2006-09-07
HUP0004360A3 (en) 2003-03-28
NO20001768D0 (no) 2000-04-06
PL339735A1 (en) 2001-01-02
PT1021547E (pt) 2007-02-28
BR9814606A (pt) 2002-01-02
DK1021547T3 (da) 2007-04-23
NO328128B1 (no) 2009-12-14
DE69836753T2 (de) 2007-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6228368B1 (en) Papilloma virus capsomere formulations and method of use
US5618536A (en) Chimeric papillomavirus-like particles
US6352696B1 (en) Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US6649167B2 (en) Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US7182947B2 (en) Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US7494658B2 (en) Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs
AU2003200653B2 (en) Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
AU717932B2 (en) Chimeric papillomavirus-like particles
CA2201601C (en) Chimeric papillomavirus-like particles
AU717647B2 (en) Chimeric papillomavirus-like particles
HK1094340A (en) Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
MXPA00003358A (en) Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
AU2007201791A1 (en) Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
MXPA98001583A (es) Formulaciones para vacunas de capsomero del papiloma virus.

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20111006