PL195844B1

PL195844B1 - Sekwencja DNA, sekwencja RNA, sposób skriningu osobnika, peptyd synałowy, peptyd, przeciwciało, próba immunologiczna, sposób diagnozowania predyspozycji podwyższonego poziomu cholesterolu, zastosowanie czynnika przeciwdziałającego wpływowi zmutowanego genu i zastosowanie czynnika skierowanego na naprawę zmutowanej sekwencji

Info

Publication number: PL195844B1
Application number: PL98341362A
Authority: PL
Inventors: Markku Koulu; Matti Karvonen; Ullamari Pesonen; Matti Uusitupa
Original assignee: Phase One Pharma Oy Ltd
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2007-10-31
Also published as: AU752138B2; HUP0100674A2; PL341362A1; RU2219186C2; CN1211486C; CN1282338A; HUP0100674A3; AU1673599A; US6046317A; KR20010033351A; NO20003116L; US7084242B2; CA2314614A1; NZ514067A; BR9813813A; WO1999032518A1; NZ504633A; NO20003116D0; EE200000356A; US20030093821A1

Abstract

1. Sekwencja DNA zawierajaca sekwencje nukleotydowa kodujaca czesc sygnalowa preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnalowi czesci peptydu wspomnianego preproNPY zastapiony jest prolina, przy czym sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49, T jest zastapio- ne przez C. 5. Sposób skriningu osobnika dla oceny czy osobnik ten jest nosicielem zmutowanego genu NPY zawierajacego se- kwencje nukleotydowa kodujaca czesc preproneuropeptyd Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygna- lowej czesci wspomnianego preproNPY jest zastapiony prolina, znamienny tym, ze dostarcza sie próbke biologiczna osobnika skriningowanego oraz dostarcza sie próbke do wykrywania w tej próbce obecnosci i) prawidlowego genu NPY lub ii) mu- tanta genu NPY, przy czym mutant genu NPY zawiera sekwen- cje DNA kodujaca czesc sygnalowa preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspo- mnianego preproNPY zastapiony jest prolina, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastapione przez C. 8. Peptyd obejmujacy peptyd sygnalowy jak zdefiniowano w zastrz. 7, zwiazany z jakimkolwiek produktem rozszczepienia preproNPY, przy czym wspomniany peptyd sygnalowy jest peptydem sygnalowym preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspomnianego preproNPY zastapiony jest prolina, przy czym wspomniany peptyd sygnalowy kodowany jest przez sekwencje DNA zawie- rajaca nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastapione przez C. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA, sekwencja RNA, sposób skriningu osobnika, peptyd sygnałowy, peptyd, przeciwciało, próba immunologiczna, sposób diagnozowania predyspozycji podwyższonego poziomu cholesterolu, zastosowanie czynnika przeciwdziałającego wpływowi zmutowanego genu i zastosowanie czynnika skierowanego na naprawę zmutowanej sekwencji. Wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodującej mutanta ludzkiego preproneuropeptydu Y (preproNPY), mutanta peptydu sygnałowego jako takiego lub związanego z jakimkolwiek innym produktem odszczepienia preproNPY, sposobów oznaczania w próbce biologicznej wspomnianej sekwencji DNA lub wspomnianego peptydu.

Neuropeptyd Y (NPY) jest 36 aminokwasowym hormonem peptydowym licznie występującym zarówno w ośrodkowym jak i obwodowym układzie nerwowym. NPY gra główną rolę w podwzgórzowej regulacji pobierania pokarmów i w wydatkowaniu energii. Ośrodkowe podawanie NPY znacząco pobudza pobieranie pokarmu a wlew ciągły powoduje rozwój otyłości, hyperinsulinemii i oporności na insulinę u zwierząt doświadczalnych. Względnie niewiele wiadomo o roli NPY w otyłości u ludzi i w chorobach metabolicznych.

Neuropeptyd Y (NPY), przedstawiciel rodziny peptydów, jest neuroprzekaźnikiem szeroko rozpowszechnionym zarówno w ośrodkowym jak i obwodowym układzie nerwowym^1,2. NPY przypisywano wiele funkcji regulatorowych, włączając w to pobieranie pokarmu^3,4,5, zmniejszanie niepokoju^6,7, wydzielanie hormonów przysadkowych^8,9,10, termogenezę¹¹ i uwalnianie insuliny¹².

U zwierząt NPY gra ważną rolę w podwzgórzowej regulacji bilansu energetycznego. Po ośrodkowym podaniu NPY stymuluje znacząco pobieranie pokarmu¹³. Obniża on także wydatkowanie energii przez obniżenie termogenezy brązowej tkanki tłuszczowej i uruchamia zapasy energetyczne przez podwyższanie aktywności lipazy lipoproteinowej w białej tkance tłuszczowej. Ciągła infuzja śródkomorowa NPY powoduje rozwój otyłości i oporności na insulinę¹³. Brak pożywienia znacząco podwyższa podwzgórzową aktywność NPY, podczas gdy ponowne podanie pożywienia obniża ją i podwzgórzowe neurony NPY są kontrolowane przez sprzężenia zwrotne sygnałów hormonów obwodowych, takich jak 14,15,16 insulina i leptyna^14,15,16. W rezultacie poziomy podwzgórzowej ekspresji mRNA preproNPY i NPY są podwyższone u otyłych szczurów fa/fa Zucker¹⁷, które mają uszkodzone sygnalizowanie leptynowe związane z punktową mutacją w genie receptora leptyny¹⁸. U ludzi, stężenie NPY w płynie mózgowordzeniowym u pacjentów z anoreksją jest podwyższone co jest zgodne z domniemaną kompensato19 rową aktywnością mechanizmów NPY¹⁹. Co ważniejsze, pacjenci z anoreksją wykazują także pod20,21 wyższony poziom cholesterolu^20,21. Jakkolwiek nie ma dostępnych danych literaturowych wiążących gen NPY lub NPY jako taki z metabolizmem cholesterolu lub poziomem cholesterolu w surowicy.

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowi części peptydu wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49, T jest zastąpione przez C.

Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku składa się nukleotydów 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C. Również korzystnie tą sekwencję DNA stanowi cDNA.

Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja RNA zawierająca sekwencję RNA odpowiadającą sekwencji DNA zawierającej sekwencję nukleotydową kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowej części peptydu wspomnianego preproNPY jest zastąpiony proliną, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób skriningu osobnika dla oceny czy osobnik ten jest nosicielem zmutowanego genu NPY zawierającego sekwencje nukleotydową kodującą część preproneuropeptyd Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowej części wspomnianego preproNPY jest zastąpiony proliną, polegający na tym, że dostarcza się próbkę biologiczną osobnika skriningowanego oraz dostarcza się próbkę do wykrywania w tej próbce obecności i) prawidłowego genu NPY lub ii) mutanta genu NPY, przy czym mutant genu NPY zawiera sekwencję DNA kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

PL 195 844 B1

Korzystnie stosuje się próbkę, która jest każdą próbką zawierającą informację o sekwencji DNA zdefiniowanej w zastrz. 1.

Przedmiotem wynalazku jest również peptyd sygnałowy preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowej części wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy kodowany jest przez sekwencję DNA zawierającą nukleotydy 30do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

Przedmiotem wynalazku jest także peptyd obejmujący peptyd sygnałowy jak zdefiniowano powyżej, związany z jakimkolwiek produktem rozszczepienia preproNPY, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy kodowany jest przez sekwencję DNA zawierającą nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

Następnie, przedmiotem wynalazku jest przeciwciało zdolne do wiązania peptydu sygnałowego jak powyżej, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy kodowany jest przez sekwencję DNA zawierającą nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało zdolne do wiązania peptydu sygnałowego obejmującego peptyd sygnałowy zdefiniowany powyżej, związany z jakimkolwiek produktem rozszczepienia preproNPY, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy kodowany jest przez sekwencję DNA zawierającą nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

Przedmiotem wynalazku jest także próba immunologiczna do oceny peptydów według wynalazku charakteryzująca się tym, że próba biologiczna jest poddana działaniu przeciwciała zdolnego do wiązania się z wspomnianym peptydem.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób diagnozowania predyspozycji podwyższonego poziomu cholesterolu w surowicy lub cholesterolu LDL u osobnika ludzkiego, polegający na tym, że obejmuje oznaczanie czy wspomniany osobnik posiada polimorfizm części peptydu sygnałowego ludzkiego preproNPY, przy czym wspomniany polimorfizm obejmuje podstawienie leucyny w pozycji 7 na prolinę w części sygnałowej peptydu wspomnianego preproNPY, a wspomniany polimorfizm stanowi wskaźnik predyspozycji do podwyższonego poziomu cholesterolu w surowicy lub cholesterolu LDL.

Następnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czynnika przeciwdziałającego wpływowi zmutowanego genu NPY do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia ludzi z diagnozą predyspozycji wzrostu w surowicy poziomu cholesterolu lub cholesterolu LDL, w którym to zastosowaniu wspomniany zmutowany gen NPY zawiera sekwencję DNA kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowej części peptydu wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

Korzystnie, w zastosowaniu według wynalazku wspomnianym czynnikiem jest farmaceutyczny środek do modulowania syntezy, uwalniania lub metabolizmu endogennego NPY lub do oddziaływania w specyficzny sposób na miejsca oddziaływania NPY poprzez modulujące wpływy NPY na specyficzne białka receptorowe NPY. Bardziej korzystnie, wspomnianym czynnikiem jest farmaceutyczny środek do modulowania ekspresji genu prawidłowego lub zmutowanego genu NPY.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie czynnika skierowanego na naprawę zmutowanej sekwencji NPY u człowieka do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej użytecznej w leczeniu wspomnianego człowieka, z diagnozą predyspozycji podwyższonego poziomu w surowicy cholesterolu lub cholesterolu LDL do zapobiegania podwyższonemu poziomowi w surowicy cholesterolu lub cholesterolu LDL, przy czym wspomniany zmutowany gen NPY zawiera sekwencję DNA kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 części sygnałowej peptydu wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

PL 195 844 B1

Wynalazek został zilustrowany na następujących figurach.

Figura 1a ilustruje schematycznie molekularną budowę ludzkiego genu NPY, peptydu preproNPY i dojrzałego peptydu NPY.

Figura 1b pokazuje sekwencję nukleotydową ludzkiego genu NPY. Górny przypadek wskazuje sekwencję egzonową a w przypadku niższym sekwencję intronową. Numery akcesyjne banku genomowego są podane w nawiasach. Strzałka pokazuje pozycję w której T w prawidłowym genie zastąpione jest przez C w celu otrzymania mutanta genu. Podkreślona sekwencja w Egzonie 2 jest sekwencją kodującą peptyd sygnałowy o 28 aminokwasach (Egzon 1 jest sekwencją SEQ ID NO: 1, egzon 2 jest SEQID NO: 2, egzon 3 jest SEQID NO: 3 i egzon 4 jest SEQID NO: 4).

Figura 1c pokazuje sekwencję nukleotydową ludzkiego mRNA preproNPY (SEQ ID NO: 5 z sekwencją białkową umieszczoną w SEQ ID NO: 6). Strzałka pokazuje pozycję w której prawidłowy mRNA -t w celu otrzymania mutanta mRNA zastąpiono, przez -c.

Figura 2 pokazuje a) całkowity cholesterol w osoczu w stanie głodu, b) cholesterol LDL, c) cholesterol HDL i d) cholesterol VLDL u osobników otyłych, w której wypełnione słupki przedstawiają osobniki homozygotyczne Leu7/Leu7 (n=120) w peptydzie sygnałowym preproNPY i puste słupki reprezentują osobniki heterozygotyczne Leu7/Pro7 (n=21) lub homozygotyczne w stosunku do Pro7/Pro7 w peptydzie sygnałowym preproNPY, i

Figura 3 pokazuje a) całkowity cholesterol w osoczu w stanie głodu, b) cholesterol LDL, c) cholesterol HDL i d) cholesterol VLDL u osobników z normalną wagą, w której wypełnione słupki reprezentują osobniki homozygotyczne Leu7/Leu 7 (n=56) w peptydzie sygnałowym preproNPY i puste słupki reprezentują osobniki heterozygotyczne Leu7/Pro7 (n=8) lub homozygotyczne w stosunku do Pro7/Pro7 w peptydzie sygnałowym preproNPY.

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek jest częścią programu wynalazczego w celu zbadania genetycznego podłoża metabolizmu energetycznego i otyłości. Przedstawiamy tutaj raczej powszechny polimorfizm w części peptydu sygnałowego genu NPY. Nieoczekiwanie stwierdzono, że ten polimorfizm z Leu7 na Pro związany jest ze znaczącym podwyższeniem poziomów, zarówno całkowitego jak i cholesterolu LDL u osobników o prawidłowym ciężarze jak i otyłych, osobników niediabetycznych, podczas gdy nie stwierdzono powiązania z metabolizmem energetycznym lub otyłością.

Sekwencja DNA albo mutanta peptydu sygnałowego albo wspomnianego peptydu związanego z jakimkolwiek innym produktem odszczepienia preproNPY może być stosowana do skriningowania osobnika w celu oznaczenia czy wspomniany osobnik jest nosicielem mutanta genu NPY.

Oznaczenie może być przeprowadzone zarówno jako analiza DNA zgodnie z dobrze znanymi metodami które obejmują bezpośrednie sekwencjonowanie DNA prawidłowego lub zmutowanego genu NPY specyficzną w stosunku do allelu amplifikację stosując reakcję polimerazy łańcuchowej (PCR) umożliwiającej wykrycie prawidłowej lub też zmutowanej sekwencji NPY, albo pośrednie wykrywanie prawidłowego lub zmutowanego genu NPY różnymi metodami biologii molekularnej obejmującymi między innymi metodę PCR- polimorfizmu konformacji nici pojedynczej (SSCP) lub żelową elektroforezę denaturująca (DGGE). Oznaczenie prawidłowego lub zmutowanego genu NPY może być także wykonane stosując metodę restrykcji polimorfizmu długich fragmentów, która jest szczególnie wygodna do genotypowania dużej liczby próbek.

Oznaczanie można także wprowadzić jako badanie poziomu RNA analizując ekspresję RNA w tkance stosując różne metody. Próbki specyficzne wobec allelu mogą być przeznaczone do hybrydyzacji. Hybrydyzację można wykonać stosując próbę Northern blot, próbę zabezpieczenie RNazy lub metodami hybrydyzację in situ. RNA pochodzące z normalnego lub zmutowanego genu NPY można także analizować przez przemianę najpierw tkankowego RNA w cDNA i następnie amplifikację cDNA metodą PCR specyficznej wobec allelu.

Alternatywnie oznaczanie można prowadzić również jako próbę immunologiczną w której próbka jest kontaktowana z przeciwciałem zdolnym do wiązania peptydu sygnałowego lub wspomnianego peptydu związanego z jakimkolwiek innym produktem odszczepienia preproNPY.

Przeciwciała mogą być namnażane przeciwko prawidłowemu lub zmutowanemu preproNPY a szczególnie przeciwko prawidłowej lub zmutowanej części peptydu sygnałowego NPY. Wytwarzanie przeciwciał można wykonać na zwierzętach doświadczalnych in vivo w celu otrzymania przeciwciał poliklonalnych lub in vitro stosując linie komórkowe w celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych.

Osobnik ludzki z diagnozą na predyspozycji podwyższonych poziomów cholesterolu lub cholesterolu LDL w surowicy może być leczony dla zapobieżenia podwyższenia cholesterolu lub cholestePL 195 844 B1 rolu LDL w surowicy u wspomnianego osobnika przez podanie temu osobnikowi skutecznej ilości czynnika przeciwdziałającego wpływowi zmutowanego genu NPY. Można to przeprowadzić na drodze specyficznej terapii genowej mającej na celu naprawę zmutowanej sekwencji NPY lub przy zastosowaniu farmakoterapii, które mają na celu modulację syntezy, uwalniania lub metabolizmu endogennego NPY lub interakcję w specyficzny sposób z miejscami docelowymi NPY przez zmianę działania NPY na specyficzne białkowe receptory NPY. Obecnie sklonowano i scharakteryzowano pięć różnych podtypów receptorów NPY (receptory Y1-Y5) i zsyntetyzowano cząsteczki leku specyficznie współdziałającego z tymi receptorami. Opisana farmakoterapia nie jest ograniczona jedynie do tych wymienionych receptorów i mechanizmów ale także dotyczy innych receptorów NPY i związanych z nim wykrytych mechanizmów.

Wpływ zmutowanej sekwencji NPY na funkcję genu NPY można badać u zwierząt transgenicznych. Transgeniczne zwierzę może być wytworzone przy zastosowaniu celowej metodologii rekombinacji homologicznej. Zarówno prawidłowa jak i zmutowana sekwencja ludzkiego peptydu sygnałowego NPY (lub jakiejkolwiek sekwencji DNA obejmującej sekwencję nukleotydową kodującą pełny preproneuropeptyd Y (preproNPY) lub jej część kodującą sekwencję aminokwasową dojrzałego mysiego lub dojrzałego ludzkiego peptydu NPY w którym albo i) aminokwas leucyna w pozycji 7 części peptydu sygnałowego wspomnianego preproNPY została podstawiona przez prolinę lub ii) aminokwas leucyna w pozycji 7 peptydu sygnałowego wspomnianego preproNPY jest niezmieniona) będzie wprowadzona do sekwencji genu NPY dla zastąpienia endogennej sekwencji peptydu sygnałowego. Pod tymi warunkami endogenny NPY funkcjonuje w pewnym stopniu prawidłowo, ale synteza preproNPY jest regulowana przez prawidłową albo zmutowaną sekwencję ludzkiego peptydu NPY. Ten transgeniczny model można stosować do badania w bardzo specyficzny sposób fizjologicznego znaczenia zmutowanego genu NPY. Dostarczał on będzie także idealnego przedklinicznego modelu do badania i skriningu nowych cząsteczek leków przeznaczonych do modyfikowania wpływu zmutowanego genu NPY.

Wynalazek jest opisany szczegółowo w następujących przykładach doświadczalnych.

Regiony kodujące genu NPY były skriningowane na możliwe warianty sekwencji u 90 fińskich osobników stosując analizę polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (SSCP). Alleliczne powiązanie polimorfizmu zidentyfikowanych Leu7 na Pro z otyłością i metabolicznymi parametrami analizowano w dwóch niezależnych badanych populacjach po genotypowaniu 141 otyłych, niediabetycznych osobników (badanie I) i 64 osobników o normalnym ciężarze (badanie II) stosując metodę restrykcji długości polimorfizmu (RFLP).

Badania osobnicze dla skriningu SSCP genu NPY.

Próbki DNA z 90 przypadkowo wybranych populacji otyłych Finów w badaniu I stosowano do skriningu genu NPY dla wariantów sekwencji egzonowych.

Badanie osobników dla analiz powiązania i częstości genotypu.

Badanie l

141 (29 mężczyzn i 112 kobiet) osobników otyłych w badaniu redukcji ciężaru posiadających prawidłową wątrobę, nerki i funkcje tarczycy (Uusitupa i wsp. 1996) było włączonych w badania powiązania wariantu sekwencji NPY z parametrami fenotypu. Żaden z osobników nie miał cukrzycy, historii nadmiernego spożycia alkoholu ani leków o których wiadomo, że zmieniają podstawowy poziom metaboliczny (BMR), cholesterol (oprócz jednego osobnika który pobierał czynnik betablokujący) lub metabolizm glukozy. Ich średnia wieku ± SD wynosiła 43 ± 8 lat i średni indeks masy ciała (BMI) 34,7, zakres 28-43 kg/m². Wszystkie pomiary fenotypowe były wykonane rano po 12-godzinnym poście standardowymi metodami. Pomiary obejmowały ciężar ciała, BMI, procent tłuszczu, współczynnik oddechowy (RQ), BMR, stosunek tali do bioder (WHR), leptynę osoczową w poście, poziomy glukozy, insuliny, cholesterolu i trójglicerydu. Główna charakterystyka osobników w badaniu Ijest przedstawio22,23 na w Tabeli 1. Metody analityczne opisano szczegółowo gdzie indziej^22,23. Dziennik diety był dostępny dla wszystkich otyłych osobników z szczegółowymi danymi dziennego spożycia poszczególnych pokarmów zawierających węglowodany, białka, tłuszcze i cholesterol.

Badanie II

Początkowo przypadkowa próbka populacji kontrolnej, wiek 45-64 lata, była wybrana w latach

1979-1981 z populacji rejestrów regionu Kuopio, Finlandia przez zastosowanie tabel przypadkowych numerów, biorąc pod uwagę rozmieszczenie populacji w społecznościach wiejskich i miejskich. Z 183 osób, z którymi skontaktowano się początkowo ostatecznie dokonano rekrutacji 144 osób. Prawidłowy ₂ ciężar osobników (BMI< 27 kg/m²) wybrano spośród osobników kontrolnych do niniejszych badań (Badanie II) i prowadzono przez 10 lat. Razem przebadano 64 (26 mężczyzn i 38 kobiet) normoglike6

PL 195 844 B1 micznych, niediabetycznych zdrowych Finów. Osobnicy kontrolni byli powtórnie badani po 5 i 10 latach od pierwszego badania w latach odpowiednio 1985-1986 i 1991-1992. Główna charakterystyka populacji w badaniu IIw tych odpowiednich punktach czasowych jest przedstawiona w Tabeli 2. Protokół był zaaprobowany przez komisję etyki Uniwersytetu Kuopio i Helsinki. Badanie II populacji opisano szczegółowo poprzednio²⁴.

Badanie PCR-SSCP

Ludzki gen NPY podzielony jest na cztery egzony, pierwszy zawierający regiony nietranslacyjne, drugi egzon kodujący peptyd sygnałowy (reszty 1-28 aminokwasowe) i reszty aminokwasowe

29-63 dojrzałego NPY, trzeci egzon kodujący reszty 64-90 i czwarty egzon, który zawiera hepatopep25 tyd o zakończeniu karboksylowym w proNPY i nietranslacyjny region 3' (Figura 1a)²⁵. Pary primerów PCR i odpowiednie temperatury topnienia PCR (Ta) do amplifikacji czterech pól egzonowych w genie NPY były następujące: para 15'

TTGGGGTGTGGGTGGCTC (SEQ ID NO: 7) i 5'

CCTAGACAGACGGGTCGTAGCA (SEQ ID NO: 8), przy Ta=65°C, para 2 5'

CCCGTCCGTTGAGCC TTCTG (SEQ ID NO: 9) i

5' CGGTCCCGCGGTCCC (SEQ ID NO: 10) Ta= 67°C, para 3 5'

AAAAGACTTTTTTT TTTCCAG (SEQ ID NO: 11) i 5'

AATGTCCCCATCACAAG (SEQ ID NO: 12) Ta= 51°C i para 4 5'

CCTTACAT GCTTTGCTTCTTA (SEQ ID NO: 13) i 5'

GATTTTTCATTGAGGAGGAT (SEQ ID NO: 14) przy Ta=51°C.

Reakcja PCR (całkowity 5 ml) zawierała 10° ng genomowego DNA (izolowanego albo z pełnej 33 krwi albo z unieśmiertelnionej linii komórkowej limfoblastów), 1,0 mM dNTPs, 30nM ³³P-dCTP, 2,5 mM każdego primera 0,25 U polimerazy AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus,Norwalk, CT). Warunki PCR były optymalizowane stosując PCT Optimizer™ (Invitrogen, San Diego, CA). Próbki amplifikowano w GeneAmp PCT System 9600 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 30 cykli zawierających po 30 sekund w 94°C, 30 sekund w optymalnej temperaturze topnienia i 30 sekund w 72°C. Następnie przeprowadzano etap wydłużenia przez 7 minut w 72°C. Amplifikowane próbki mieszano z buforem SSCP zawierającym 95% formamid, 10 mM NaOH, 0,05% cyjanol ksylenu i 0,05% błękitu bromofenolowego (całkowita objętość 25 ml). Przed załadowaniem, próbki denaturowano 5 minut w 95°C i trzymano 5 minut na lodzie. Trzy ml tej mieszaniny nakładano na żel MDE™ (FMC, BioProducts, Rockland, MA). Elektroforezę SSCP-żel przeprowadzano w dwóch różnych warunkach: 6% żelu MDE w +4°C i 3% żelu MDE z 10% glicerolem w temperaturze pokojowej. Elektroforeza przebiegała w stałej mocy 5W przez 20 godzin. Żel suszono i przeprowadzono autoradiografię poprzez ekspozycję na filmie Kodak BIO MAK MR przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.

Sekwencjonowanie

Nienormalnie migrujący pasek w SSCP sekwencjonowano za pomocą zestawu Thermo Cycle Sequenase™ (Amersham Life Science, Inc. Cleveland, OH).

Genotypowanie

Primery stosowane do genotypowania osobników w badaniu I i II były takie jakie stosowano dla amplifikacji PCR egzonu 2. W egzonie 2 podstawienie T(1128) przez C(1128) generuje miejsce Bsi E I (New England Biolabs, Inc. Beverly, MA). Trawienie było analizowane elektroforetycznie na 2% żelu agarozowym.

Parametry osocza na czczo i pomiary antropometryczne

Glukozę we krwi analizowano metodą glukozowo-oksydazową (Glox: Kabi Ab, Stockholm, Sweden). Insulina w surowicy była analizowana radioimmunologicznie (antysurowica M 8309: Novo Industries, Copenhagen, Denmark). Współczynnik zmienności wtej metodzie wynosił 5,4% a czułość wynosiła 2 mU/l. Lipidy w osoczu i lipoproteinach oznaczano w próbkach po poście dwunastogodzinnym. Lipoproteidy oddzielano poprzez ultrawirowanie przy gęstości 1,006 w celu usunięcia VLDL, a następnie strącano frakcję podsączu za pomocą siarczanu dekstranu i chlorku magnezowego. Metody enzymatyczne stosowano do oznaczenia cholesterolu i trójglicerydów w pełnym osoczu i w warstwie górnej po ultrawirowaniu VLDL, a nadsącz po strąceniu LDL. LDL obliczano jako różnica pomiędzy całkowitym osoczem i sumą VLDL i HDL. Zmienność wewnątrz próby dla całkowitego cholesterolu, cholesterolu HDL i trójglicerydów wynosiła odpowiednio 1,3%, 0,95% i 3,1%, a pomiędzy próbami wynosiła odpowiednio 3,3%, 1,9% i 5,2%. Wzrost w pozycji stojącej mierzono bez butów z dokładnością do 0,5 cm, wagę ciała tych osobników na boso i ubranych w spodenki mierzono na elektrycznej wadze (model 707: Seca, Hamburg, Germany). Obliczano współczynnik masy ciała (BMI) (waga ciała

PL 195 844 B1 ₂

[kg]/wzrost[m²]). Dla oznaczenia stosunku talia/biodra, obwód w talii mierzono na poziomie pomiędzy niższymi bocznymi krawędziami żebrowymi i grzebieniem biodrowym. Obwód bioder mierzono na poziomie krętarza większego poprzez spojenie łonowe. Spoczynkowy wydatek energetyczny mierzono pośrednią metodą kalorymetryczną (Deltatrac, TM Datex, Heisinki, Finland) stosując skomputeryzowany układ przepływowo-gazowy, układ analizatora wyciąg-gaz wyciągowy, który był skalibrowany dokładną mieszanką gazową przed każdym pomiarem. Metoda ta została pierwotnie opisana 29 w szczegółach²⁹.

Analiza statystyczna ₂

Rozkład częstości genotypu testowano dla równowagi Hardy-Weinberg metodą analizy X². Wszystkie obliczenia dotyczące analiz powiązania były przeprowadzone stosując wersję 6.0 programu SPSS/WIN (SPSS, Chicago, IL). Statystyczne różnice w parametrach fenotypu pomiędzy dwiema grupami były ocenione stosując test Studenta. W badaniu I wielokrotne porównania pomiędzy parametrami genotypu i fenotypu wykonano bez formalnych poprawek dla testowania wielokrotnego. W badaniu II powzięliśmy a priori hipotezę, że polimorfizm związany jest z poziomem cholesterolu w osoczu i dlatego żadne inne statystyczne porównania nie były przeprowadzone poza zbadanymi na czczo poziomami całkowitego cholesterolu LDL, HDL i VLDL.

Wyniki

Skrining SSCP dający w wyniku wykrycie podstawienia cytozyny przez tymidynę (1128) prowadzące do zmiany aminokwasu leucyny na prolinę zmienia przy reszcie 7 hydrofobowej części peptydu sygnałowego preproNPY. Częstość polimorfizmu allelu Leu 7 do Pro wynosiła 0,08, zarówno osobników o wadze prawidłowej jak i dla otyłych. Osobnicy otyli posiadający allel Pro 7 mieli znacząco wyższy całkowity osoczowy poziom cholesterolu LDL i VLDL i niższy poziom cholesterolu HDL, w porównaniu do odpowiednich wartości u osobników z genotypem Leu//Leu 7. Odpowiednie wartości wynosiły 6,2 ±1,1 vs, 5,3 + 0,9 mmol/l (P=0,0001), 4,2 ±1,0 vs, 3,5 ± 0,8 mmol/l (P=0,0003), 0,9 ± 0,6 vs, 0,7 ± 0,5 mmol/l (p=0,042) i 1,1 ± 0,3 vs, 1,2 ± 0,3 mmol/l (P=0,041). Różnice te nie mogą być wytłumaczone przez jednoczesne odkrycie czynników obejmujących wiek, płeć, palenie papierosów, zażywanie leków lub fenotypy apoE. Polimorfizm Leu 7 do Pro w genie NPY nie był związany z jakąkolwiek otyłością odnośnie parametrów obejmujących wagę, BMI, stosunek talia do bioder, masa tłuszczu, podstawowa szybkość metabolizmu lub inne metaboliczne parametry takie jak poziomy glukoz, insuliny, leptyny lub trójglicerydu w osoczu na czczo u osobników otyłych. Istotne powiązanie allelu Pro 7 z wyższymi poziomami całkowitego cholesterolu w osoczu (p=0,035) i cholesterolu LDL (p=0,036) zostało potwierdzone u osobników o normalnej wadze w badaniu II.

Skrining SSCP rejonów egzonowych genu NPY

Pojedyncze egzony zawierające cały region kodujący genu NPY były skriningowane pod względem mutacji przez SSCP. Zidentyfikowany polimorfizm był 1)T(1128) do C(1128), 2)A(1258) to C(1258), 3)T(5671) do 0(5671), i 4)T(8233) do A(8233). Numerowanie polimorfizmu jest zgodne z Minth i wsp. 1986, gdzie polimorfizmy 2 i 3 były już stwierdzone.

Częstotliwości genotypu

Wszystkie częstotliwości alleliczne są w równowadze Hardy-Weinberg. Częstotliwość polimorfizmu allelu stwierdzonego T(1128) do C(1128) wynosiła 0,078 u otyłych Finów (n=141) i 0,077 u Finów o normalnej wadze (n=64). Nie stwierdzono żadnych różnic w jakiejkolwiek dystrybucji allelicznej pomiędzy tymi dwiema populacjami.

Analiza asocjacji

Badanie I:

Genotyp homozygoty Pro7/Pro7 stwierdzono tylko u jednego osobnika, który był włączony do grupy heterozygot. Analiza powiązania pomiędzy genotypem Pro7/Leu7 osobników (obejmująca jeden genotyp Pro7/Pro7) i osobników z dzikim typem genotypu Leu7/Leu7 ujawniła bardzo znaczące różnice poziomów w całkowitym cholesterolu w osoczu na czczo 6,2 ± 1,1 vs. 5,3 ± 0,9 mmol/l (P=0,0001), cholesterol LDL 4,2 ± 1,0 vs. 3,5 ± 0,8 mmol/l (P=0,0003), i cholesterol VLDL 0,9 ± 0,6 vs. 0,7 ± 0,5 mmol/l (P=0,042) i cholesterolu HDL: 1,1± 0,3 vs. 1,2 ± 0,3 mmol/l (P=0,041) (Figura 2). Różnice pozostawały znacząco wysokie jeśli analizę przeprowadzono osobno u otyłych mężczyzn (całkowity cholesterol, cholesterol LDL, cholesterol VLDL i cholesterol HDL) i u otyłych kobiet (całkowity cholesterol i cholesterol HDL). Spożycie wszystkich tłuszczy, nasyconych kwasów tłuszczowych, nienasyconych kwasów tłuszczowych lub cholesterolu dietetycznego nie różniło się w obu grupach genotypowych. Stopień otyłości także nie wyjaśnia tych spostrzeżeń. Pomiędzy tymi różnymi grupami nie było także różnic w rozkładzie fenotypów apolipoproteina-E (dane nie przedstawione).

PL 195 844 B1

Badanie II

Jeden osobnik był homozygotą Pro7/Pro7 i był analizowany razem z heterozygotami. U osobników o prawidłowym ciężarze poziomy całkowitego cholesterolu i cholesterolu LDL w osoczu na czczo były znacząco wyższe u osobników posiadających allel Pro7 niż u osobników z genotypem Leu7/Leu7, w każdym z trzech pomiarów. Całkowity cholesterol w osoczu na czczo 7,4 ± 0,6 vs. 6,7 ± 0,9 mmol/l (P=0,035), cholesterol LDL 5,2 ± 0,6 vs. 4,5 ± 0,9 mmol/l (P=0,036). Nie było statystycznie znamiennych różnic w poziomach cholesterolu VLDL (0,8 ± 0,5 vs. 0,7 ± 0,4 mmol/l) ani w cholesterolu HDL (1,3 ± 0,4 vs. 1,5 ± 0,3 mmol/l (Figura 3).

Dyskusja

Obecne badanie dostarcza pierwszego dowodu, że polimorfizm w genie NPY Leu7 do Pro7 związany jest z niekorzystnym klinicznie poziomem cholesterolu w osoczu i poziomem cholesterolu LDL zarówno u osobników z prawidłowym ciężarem jak i niediabetycznych otyłych osobników. Wskazuje to, że NPY może mieć uprzednio nierozpoznaną rolę w regulacji metabolizmu cholesterolu u człowieka i jest jednym z silniejszych genetycznie czynników dotąd zidentyfikowanych, wpływających na poziomy cholesterolu w osoczu.

Główną obserwacją niniejszych badań jest to, że zidentyfikowany polimorfizm leucyna7 do proliny w części peptydu sygnałowego genu NPY jest powiązana u Finów w sposób znaczący z podwyższonym poziomem całkowitego cholesterolu i cholesterolu LDL. Ponadto, u osobników otyłych podwyższony był także cholesterol VLDL a cholesterol HDL był obniżony u osobników z allelem Pro7. Główne spostrzeżenie było początkowo poczynione u osobników otyłych niediabetycznych i było następnie powtórzone u osobników o normalnej wadze. Częstotliwość allelu tego wariantu sekwencji wynosiła około 8% w populacji fińskiej. Obserwowane powiązania nie mogą być wytłumaczone innymi współwystępującymi czynnikami o których wiadomo, że wpływają na metabolizm cholesterolu takimi jak wiek, otyłość, płeć, palenie tytoniu, leki lub fenotyp apoE. Ponadto, jest również bardzo nieprawdopodobne, że to powiązanie mogło by wynikać z błędu stratyfikacji u badanych osobników, ponieważ są oni wszyscy rodowitymi Finami z raczej podobnym genetycznym podłożem. Dlatego polimorfizm genu NPY leucyna 7 do proliny powinien być rozważany jako ważny nowy genetyczny wyznacznik dla wysokiego poziomu cholesterolu i cholesterolu LDL w osoczu.

Polimorfizm leucyna 7 do proliny jest zlokalizowany w części peptydu sygnałowego preproNPY. Peptyd sygnałowy, który jest odszczepiony od dojrzałego NPY gra ważną rolę jako kierujący właściwym pofałdowaniem i upakowaniem tego peptydu w retikulum endoplazmatycznym podczas syntezy i transportu do pęcherzyków wydzielniczych. Zazwyczaj peptyd sygnałowy składa się z motywu hydrofobowego tak jak jest w przypadku preproNPY. Leucyna jak wiadomo tworzy a-helisę, podczas gdy prolina zazwyczaj wprowadza przerwy i skręty do części a-helikalnej szkieletu peptydowego. Jakkolwiek nie mamy danych biochemicznych jak ten polimorfizm leucyna 7 do proliny modyfikuje syntezę preproNPY, można spekulować że wewnątrzkomórkowy przebieg syntezy preproNPY jest uszkodzony, co następnie może prowadzić do zmienionej aktywności NPY. Jednakże, dalsze badania wyjaśniające szczegóły tego mechanizmu są konieczne.

Całkowity poziom cholesterolu w osoczu i poziom cholesterolu LDL wynosił średnio 0,9 i 0,7 mml/l, był wyższy u otyłych i nie otyłych osobników fińskich posiadających allel Pro7 w porównaniu do tych posiadających genotyp Leu7/Leu7. Ponadto, stwierdzono u tych osobników tendencję do podwyższenia cholesterolu VLDL i obniżenia cholesterolu HDL. Wpływ tych genetycznych nieprawidłowości na poziom cholesterolu jest większy niż przy allelu apo E 4³⁰, i ma taką samą wielkość (14%), która mogła być otrzymana w najlepszym razie na drodze dietetycznej terapii obniżenia cholesterolu u wolno żyjących osobników fińskich.

Jaka jest zatem przyczyna podwyższenia w osoczu całkowitego cholesterolu i cholesterolu LDL u tych osobników reprezentujących 8% populacji fińskiej. Z powodu że układ żołądkowo-jelitowy jest 31,32 gęsto unerwiony przez nerwy zawierające NPY^31,32 można spekulować że NPY mógłby być związany z absorpcją cholesterolu w diecie i osobnik z allelem Pro7 mógłby mieć podwyższoną absorpcję cholesterolu to z drugiej strony mogłoby powodować „down” regulację aktywności receptora B/E (LDL) w wątrobie i podwyższenie LDL i jego prekursora w surowicy np. VLDL. Ponieważ nie stwierdzono znaczących nieprawidłowości w poziomach VLDL lub trójglicerydu u zmienionych osobników my uważamy, że pierwotny defekt nie może dotyczyć syntezy lub katabolizmu VLDL. Ciekawym jest jednak, że ośrodkowy NPY podnosi ekspresję mRNA lipazy proteinowej i wzmaga enzymatyczną aktywność w białym tłuszczu faworyzując odkładanie się tłuszczu. Dlatego, rola aktywności lipazy proteinowej nie może być całkowicie wykluczona. Bardziej prawdopodobnym wytłumaczeniem podwyższenia poziomu

PL 195 844 B1 cholesterolu w osoczu jest jednak obniżona ilość aktywności receptorów LDL które są znane jako regulujące stężenie LDL w osoczu i w mniejszym stopniu także cząstek IDL i VLDL. Otyłość jako taka wydaje się nie modyfikować wpływu polimorfizmu leucyna 7 do proliny na poziomy lipidów ponieważ różnice w wartościach lipidów pomiędzy zmutowanymi i normalnymi osobnikami były podobne u osobników otyłych i o prawidłowym ciężarze. Warto zaznaczyć także, że nie ma także dowodów doświadczalnych potwierdzających jakikolwiek z tych dyskutowanych powyżej mechanizmów, który mógłby łączyć tą szczególną genetyczną nieprawidłowość w NPY z metabolizmem cholesterolu.

Jak stwierdzono poprzednio ApoF-fenotyp 4 jest także związany jak wiadomo z wysokim całkowitym poziomem cholesterolu i cholesterolu LDL w osoczu, co stwierdzono poprzednio w naszych badaniach²². ApoF-fenotyp 4 był równomiernie rozmieszczony w obu grupach NPY i nie stwierdzono w związku polimorfizmu peptydu sygnałowego NPY z różnicami w poziomach cholesterolu w osoczu.

Stwierdzony polimorfizm w genie NPY leucyna 7 do proliny, jak wydaje się na podstawie obecnych badań, nie wiąże się z żadnym z parametrów otyłości takich jak ciężar, BMI, WHR, BMR lub RQ. Częstotliwość allelu w zmutowanych allelach była podobna u kontrolnych osobników z prawidłowym ciężarem i u osobników otyłych niediabetycznych. Wynik ten jest zgodny z ostatnimi badaniami przeprowadzonymi na francuskiej populacji w której markery flankujące genu NPY nie wiązały się z jakimikolwiek cechami otyłości.

Niniejsze badania dostarczają pierwszego dowodu, że polimorfizm w genie NPY leucyna 7 do proliny wiąże się z klinicznym niekorzystnym cholesterolem osoczowym i poziomami lipoprotein zarówno u niediabetycznych osobników o prawidłowym ciężarze jak i u osobników otyłych. Wskazuje to, że NPY może mieć uprzednio nieznaną rolę w kontrolowaniu metabolizmu cholesterolu u człowieka i jest jednym z najsilniejszych czynników genetycznych jak dotąd zidentyfikowanych wpływających na poziomy cholesterolu w osoczu. Ponadto, mechanizmy NPY mogą dostarczać potencjalnych przesłanek do produkcji nowych leków.

Sposoby według niniejszego wynalazku mogą być włączone w postaci rozmaitych przedmiotów wynalazków, tylko kilka z nich jest ujawnionych w niniejszym opisie. Jest oczywistym dla specjalisty w danej dziedzinie, że inne postacie istnieją i nie odbiegają od ducha niniejszego wynalazku. Dlatego, opisane postacie wynalazku stanowią jedynie jego ilustrację i nie powinny być rozumiane w sposób ograniczający.

Tabela 1.

Demograficzna i kliniczna charakterystyka 141 otyłych osobników w zależności od obecności lub nieobecności mutacji Leu(7) do Pro(7) w genie NPY. Wartości są średnią ±SD.

Charakterystyka	Bez mutacji	Z mutacją	Wartość P
wiek, lata	40,7 ±6,2	41,2± 8,1	ns
płeć, F/M	95/25	17/4	ns
BMI, kg/m²	34,7 ± 3,8	35,7 ± 3,3	ns
WHR	0,93 ± 0,08	0,94 ± 0,08	ns
BMR, kcal/d*	1635 ± 142	1639 ±131	ns
fs-insulina, pmol/l	94,8 ±45,3	97,7 ± 53,5	ns
fs-glukoza, mmol/l	5,5 ± 0,7	5,5 ± 0,8	ns
fs-leptyna, ng/l**	32,9 ± 12,8	26,3 ±4,9	ns
skurczowe ciśnienie krwi, mm Hg	130,7 ± 14,8	128,6 ± 13,2	ns
rozkurczowe ciśnienie krwi, mm Hg	87,4 ± 10,8	84,7 ±6,6	ns

* W przeliczeniu na masę wolną od tłuszczy i wiek, ** Poziom leptyny był dostępny od 69 osobników.

PL 195 844 B1

Tabel a 2.

Demograficzna i kliniczna charakterystyka 64 osobników o prawidłowym ciężarze w badaniach na początku i w powtórzonych (w czasie 1979-1981) w zależności od obecności lub nieobecności mutacji Leu(7) do Pro(7) w genie NPY. Wartości są średnią ± SD.

Charakterystyka	Bez mutacji	Z mutacją
wiek, lata	55,8 ±2,0	55,1 ± 1,8
płeć, F/M	31/25	7/1
BMK, kg/m²	24,3 ±2,0	24,9 ± 1,8
WHR	0,87 ± 0,08	0,85 ± 0,05
fs-insulina, pmol/l	65,4 ±44,4	84,0 ±42,6
fs-glukoza, mmol/l	4,9 ± 0,63	4,5 ± 0,57
skurczowe ciśnienie krwi, mm Hg	142,4 ± 17,6	151,1 ± 16,1
rozkurczowe ciśnienie krwi, mm Hg	86,8 ± 9,0	91,1 ± 8,4

BIBLIOGRAFIA

1. Gray TS, Morley JE Neuropeptide Y: anatomical distribution and possible function in mammalian nervoussystem.Nature. 1986 Feb 3; 38(5): 389-401

2. Lundberg JM, Terenius L, Hokfelt T, Martling CR, Tatemoto K, Mutt V, Polak J, Bloom S, Goldstein M. Neuropeptide Y (NPY)-like immunoreactivity in peripheral noradrenergic neurons and effects of NPY on sympathetic function. Acta Physiol Scand 1982 Dec; 116(4): 477-480

3. Clark JT, Kalra PS, Kalra SP. Neuropeptide Y stimulates feeding but inhibits sexual behaviorinrats. Endocrinology 1985 Dec; 11(6): 2435-2442

4. Levine AS, Morley JE Neuropeptide Y: a potent inducer of consummatory behavior in rats. Peptides 1984 Nov: 5(6): 1025-1029

5. Stanley BG, Leibowitz SF Neuropeptide Y injected in the paraventricular hypothalamus: a powerful stimulant of feeding behavior. Proc Natl Acad Sci USA 1985 Jun; 82(1 1): 3940-3943

6. Heilig M, McLeod S, Brot M, Heinrichs SC, Menzaghi F, Koob GF, Britton KT. Anxiolytic-like action of neuropeptide Y: mediation by Y1 receptors in amygdala, and dissociation from food intake effects. Neuropsychopharmacology 1993 Jun; 8(4): 357-363

7. Wahlestedt C, Pich EM, Koob GF, Yee F, Heilig M. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptorsby antisense oligodeoxynucleotides. Science 1993 Jan 22; 259(5094): 528-531

8. Wahlestedt C, Skagerberg G, Ekman R, Heilig M, Sundler F, Hakanson R. Neuropeptide Y (NPY) inthe area of the hypothalamic paraventricular nucleus activates the pituitary - adrenocortical axisinthe rat. Brain Res1987 Aug 4; 417(1): 33-38

9. McDonald JK, Lumpkin MD, Samson WK, McCann SM. Neuropeptide Y affects secretion of luteinizing hormone and growth hormone in ovariectomized rats. Proc Natl Acad Sci USA 1985 Jan: 82(2): 561-564

10. Sahu A, Kalra SP, Crowley WR, Kalra PS. Testosterone raises neuropeptide-Y concentration in selected hypothalamic sites and in vitro release from the medial basal hypothaiamus of castrated male rats. Endocrinology 1989 Jan: 124(1) 410-414

11. MenendezJA, McGregorIS, HealeyPA, AtrensDM, LeibowitzSF. Metaboliceffectsofneuropeptide Y injections into the paraventricularnucleus of the hypothalamus. Brain Res 1990 May 14; 516(1): 8-14

12. Moltz JH, McDonald JK. Neuropeptide Y: direct and indirect action on insulin secretion in the rat. Peptides 1985 Nov; 6(6): 1155-1159

13. Zrejevski N, Cusin I, Vettor R, Rohner-Jeanrenaud F, Jeanrenaud B. Chronic intracerebroventricular NPY admisteration to normal rats mimics hormonal and metabolic changes of obesity. Endocrinology 133: 1753-1758

PL 195 844 B1

14. Sanu A, Sninsky CA, Kalra PS, Kalra SP. Neuropeptide-Y concentration in microdissected hypothalamic regionsand in vitro release from the medial basal hypothalamus-preoptic area of streptozotocin-diabetic rats with an without insulin substitution therapy. Endocrinology 1990 Jan; 126(1): 192-198

15. Stephens TW, Basinski M, Bristow PK, Bue-valleskey JM, Burgett SG, Craft L, Hale J, Hoffmann J, Hsiung HM, Kriauciunas A, et al. The role of neuropeptide Y in the antiobesity action of the obese geneproduct. Nature 1995 Oct 12; 377(6549): 530-532

16. Schwartz MW, Baskin DG, Bukowski TR, Kuijper JL, Foster D, Lasser G, Prunkard DE, Porte D Jr, Woods SC, Seeley RJ, Weigle DS. Specificity of leptin action on elevated blood glucose levels anhypothalamic neuropeptide Y gene expression in ob/ob mice. Diabetes 1996 Apr; 45(4): 531-535

17. Pesonen U, Huupponen R, Rouru J, Koulu M. Hypothalamic neuropeptide expression after food restriction in Zucker rats: evidence of persistent neuropeptide Y gene activation. Brain Res Mol Brain Res 1992 Dec; 16(3-4): 255-260

18. Chua SC Jr, White DW, Wu-Peng XS, Liu SM, Okada N, Kershaw EE, Chung WK, PowerKehoe L, Chua M, Tartaglia LA, Leibei RL. Phenotype of fatty due to Gln269Pro mutation in the leptinreceptor (Lepr). Diabetes 1996 Aug; 45(8): 1141-1143

19. Kaye WH, Berrettini W, Gwirtsman H, George D.T.1990 Altered cerebrospinal fluid neuropeptide Y and peptide YY immunoreactivity in anorexia and bulimia nervosa. Arch.Gen.Psychiatry 47: 548-556.

20. Mordasini R, Klose G, Greten H. Secondary type II hyperlipoproteinemia in patients with anorexia nervosa. Metabolism 1978 Jan; 27(1): 71-79

21. Sanchez-muniz FJ, Marcos A, Varela P. Serum Lipids and apolipoprotein B values, blood pressure and pulse rate in anorexia nervosa. EurJ Clin Nutr 1991 Jan; 45(1): 33-36

22. Uusitupa MI, Karhunen L, Rissanen A, Franssila-Kallunki A, Niskanen L, Kervinen K, Kesaniemi YA. Apolipoprotein E phenotype modifies metabolic and hemodynamicabnormalities related to central obesity in women. Am J Clin Nutr 1996 Aug; 64(2): 131-136

23. Sipilainen R, Uusitupa M, Heikkinen S, Rissanen A, Laakso M. Polymorphism of the b3-adrenergic receptor gene affects basal metabolic rate in obese Finns. 1997. Diabetes 46: 77-80

24. Uusitupa M, Siitonen O, Aro A, Pyorala K. Prevalence of coronary heart disease, left ventricular failure and hypertension in middle-aged, newly diagnosed type 2 (non-insulin-dependent) diabetic subjects. Diabetologia 1985 Jan; 28(1): 22-27

25. Minth CD, Andrews PC, Dixon JE. Characterization, sequence, and expression of the cloned human neuropeptide Y gene. JBiol Chem 1986 Sep 15; 261(26): 11974-11979

26. Roschlau P, Bernt E, Gruber W. Enzymatische Bestimmung des Gesamtcholesterins im Serum.Z Klin Chem Biochem1974.12: 403-407

27. Wahlenfield AW. Triglycerides. Determination afterenzymatic hydrolysis. In: Bergmeyer HU (ed)Methodsinenzymaticanalysis. AcademicPress. New York. pp 1631-1835

28. Uusitupa M, Siitonen O, Penttila I, Aro A, Pyorala K. Proteinuria in newly diagnosed type II diabeticpatients. Diabetes Care 1987 Mar; 10(2): 191-194

29. Karhunen L, Franssila-Kallunki A, Rissanen A, Kervinen K, Kesaniemi YA, Uusitupa M, Determinants of resting energy expenditure in obese non-diabetic caucasian women. Int J Obes Relat Metab Disord 1997 Mar; 21(3): 197-202

30. Ehnholm C, Lukka M, Kuusi T, Nikkila E, Utermann G. Apolipoprotein E polymorphism inthe Finnish population: gene frequencies and relation tolipoprotein concentrations. J Lipid Res1986 Mar;

27(3): 227-235

31. Lundberg JM, Terenius L, Hokfelt T, Goldstein M. High levels of neuropeptide Y in peripheralnoradrenergic neurons invariousmammalsincludingman. Neurosci Lett 1983 Dec 2; 42(2) 161-172

32. Wang YN, McDonald JK,WyattRJ.Immunocytochemical localization of neuropeptide Y-like immunoreactivity in adrenergic and non-adrenergic neurons of the rat gastrointestinal tract. Peptides

1987 Jan; 8(1): 145-151

33. Roche C, Boutin P, Dina C, Gyapay G, Basdevant A, Hager J, Guy-Grand B, Clement K, Froguel P. Genetic studies of neuropeptide Y and neuropeptide Y receptors Y1 and Y5 regions in morbidobesity. Diabetologia 1997 Jun; 40(6): 671-675.

Claims

1. Sekwencja DNA zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowi części peptydu wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ IDNO 2, w której w pozycji 49, Tjest zastąpione przez C.

2. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja ta składa się nukleotydów 30 do 112 sekwencji SEQ IDNO 2, w której w pozycji 49 Tjest zastąpione przez C.

3. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomnianą sekwencję DNA stanowi cDNA.

4. Sekwencja RNA zawierająca sekwencję RNA odpowiadającą sekwencji DNA zawierającej sekwencję nukleotydową kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowej części peptydu wspomnianego preproNPY jest zastąpiony proliną, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49Tjest zastąpione przez C.

5. Sposób skriningu osobnika dla oceny czy osobnik ten jest nosicielem zmutowanego genu NPY zawierającego sekwencje nukleotydową kodującą część preproneuropeptyd Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowej części wspomnianego preproNPY jest zastąpiony proliną, znamienny tym, że dostarcza się próbkę biologiczną osobnika skriningowanego oraz dostarcza się próbkę do wykrywania w tej próbce obecności i) prawidłowego genu NPY lub ii) mutanta genu NPY, przy czym mutant genu NPY zawiera sekwencję DNA kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49Tjest zastąpione przez C.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że dostarcza się próbę, która jest każdą próbą zawierającą informację o sekwencji DNA zdefiniowanej w zastrz. 1.

7. Peptyd sygnałowy preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowej części wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy kodowany jest przez sekwencję DNA zawierającą nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQIDNO 2, w której w pozycji 49Tjest zastąpione przez C.

8. Peptyd obejmujący peptyd sygnałowy jak zdefiniowano w zastrz. 7, związany z jakimkolwiek produktem rozszczepienia preproNPY, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy kodowany jest przez sekwencję DNA zawierającą nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

9. Przeciwciało zdolne do wiązania peptydu sygnałowego jak zdefiniowano w zastrz. 7, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniany peptyd sygnałowy kodowany jest przez sekwencję DNA zawierającą nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ IDNO 2, w której w pozycji 49Tjest zastąpione przez C.

10. Przeciwciało zdolne do wiązania peptydu sygnałowego zdefiniowanego w zastrz. 8.

11. Próba immunologiczna do oceny peptydu jak zdefiniowano w zastrz. 7 lub 8, znamienna tym, że próba biologiczna jest poddawana działaniu przeciwciała zdolnego do wiązania się z wspomnianym peptydem.

12. Sposób diagnozowania predyspozycji podwyższonego poziomu cholesterolu w surowicy lub cholesterolu LDL u osobnika ludzkiego, znamienny tym, że obejmuje oznaczanie czy wspomniany osobnik posiada polimorfizm części peptydu sygnałowego ludzkiego preproNPY, przy czym wspomniany polimorfizm obejmuje podstawienie leucyny w pozycji 7 na prolinę w części sygnałowej peptydu wspomnianego preproNPY, a wspomniany polimorfizm stanowi wskaźnik predyspozycji do podwyższonego poziomu cholesterolu w surowicy lub cholesterolu LDL.

13. Zastosowanie czynnika przeciwdziałającego wpływowi zmutowanego genu NPY do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia ludzi z diagnozą predyspozycji wzrostu w surowicy poziomu cholesterolu lub cholesterolu LDL, znamienne tym, że wspomniany zmutowany gen NPY zawiera sekwencję DNA kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 sygnałowej części peptydu wspomnianego preproNPY zastąpiony jest

PL 195 844 B1 proliną, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że wspomnianym czynnikiem jest farmaceutyczny środek do modulowania syntezy, uwalniania lub metabolizmu endogennego NPY lub do oddziaływania w specyficzny sposób na miejsca oddziaływania NPY poprzez modulujące wpływy NPY na specyficzne białka receptorowe NPY.

15. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że wspomnianym czynnikiem jest farmaceutyczny środek do modulowania ekspresji genu prawidłowego lub zmutowanego genu NPY.

16. Zastosowanie czynnika skierowanego na naprawę zmutowanej sekwencji NPY u człowieka do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej użytecznej w leczeniu wspomnianego człowieka, z diagnozą predyspozycji podwyższonego poziomu w surowicy cholesterolu lub cholesterolu LDL jak zdefiniowano w zastrz. 12 do zapobiegania podwyższonemu poziomowi w surowicy cholesterolu lub cholesterolu LDL, przy czym wspomniany zmutowany gen NPY zawiera sekwencję DNA kodującą część sygnałową preproneuropeptydu Y (preproNPY) w którym aminokwas leucyna w pozycji 7 części sygnałowej peptydu wspomnianego preproNPY zastąpiony jest proliną, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera nukleotydy 30 do 112 sekwencji SEQ ID NO 2, w której w pozycji 49 T jest zastąpione przez C.

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Koulu, Markku

Karvonen, Matti Pesonen, Ullamari Uusitupa, Matti (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Cząsteczka DNA kodująca mutanta preproneuropeptydu Y, mutant peptydu sygnałowego i ich zastosowanie