PL195883B1 - Nowe pochodne benzotriazolu, sposób ich otrzymywania oraz środki lecznicze o działaniu przeciwwirusowym - Google Patents

Abstract

1. Nowe analogi benzotriazolu o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza niezależnie wodór, brom, metyl, a X oznacza propyl, chloroetyl, hydroksyetyl lub 1-b-D-rybofuranozyl. 2. Sposób otrzymywania związków o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza niezależnie wodór, brom, metyl, a X oznacza propyl, chloroetyl, hydroksyetyl lub 1-b-D-rybofuranozyl, znamienny tym, że gdy X oznacza propyl, chloroetyl, hydroksyetyl, alkilowanie 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazolu prowadzi się w acetonitrylu w obecności 1,8-diazobicyklo-4-undecen-7-enu (DBU), w 50°C, gdy X oznacza 1-b-D-rybofuranozyl w kondensacji nukleozydowej rybozydów benzotriazoli stosuje się jako katalizator triflurometylosulfonian trimetylosililu (triflan). 3. Środki lecznicze o działaniu przeciwko wirusom Flaviviridae zawierające substancje czynne oraz znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i/lub środki pomocnicze, znamienne tym, że jako składnik czynny zawierają związek o wzorze ogólnym 1a albo 1b, w którym R oznacza niezależnie wodór, brom, metyl, a X oznacza propyl, chloroetyl, hydroksyetyl lub 1-b-D-rybofuranozyl.

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne benzotriazolu o wzorach ogólnych 1a i 1b, gdzie R oznacza niezależnie wodór, brom lub metyl, a X oznacza wodór, propyl, chloroetyl, hydroksyetyl lub 1-b-D-rybofuranozyl, wykazujące aktywność w stosunku do NTPazy/helikazy wirusów RNA(+) z rodziny Flaviviridae.

Związki będące przedmiotem wynalazku mają w szczególności właściwości inhibitorowe w stosunku do wirusów RNA(+) z rodziny Flaviviridae, takich jak wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus Zachodniego Nilu (WNV), wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV) i wirus dengi (DEN), będące rezultatem inhibicji wirusowej NS3 NTPazy/helikazy. Ze względu na kluczową rolę w cyklu replikacyjnym wiusów Flaviviridae ich NS3 NTPaza/helikaza jest kluczowym obiektem docelowym chemioterapii przeciwwirusowej (Seng-Lai Tan i wsp., Nature Reviews/Drug Discovery 2002,1,867-881; Borowski i wsp., Acta Biochim. Polon. 2002, 49, 597-614).

Przedmiotem wynalazku są również środki lecznicze zawierające znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze, znamienne tym, że jako składniki czynne zawierają pochodne benzotriazolu o wzorach ogólnych 1a albo 1b wykazujące aktywność przeciwko wirusom RNA (+) z rodziny Flaviviridae.

W dotychczasowym stanie wiedzy znane są następujące pochodne benzotriazolu:

4,5,6,7-tetrabromobenzotriazol (TBBT), 1-metylo-4,5,6,7-tetrabromobenzotriazol, 2-metylo-4,5,6,7-tetrabromobenzotriazol, 1-etylo-4,5,6,7-tetrabromobenzotriazol, 2-etylo-4,5,6,7-tetrabromobenzotriazol (Wiley i Hussung, J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 4395-4400), 4,5,6,7-tetrachlorobenzotriazol (TCBT) (Wiley i wsp., J. Am. Chem. Soc., 1955, 77, 5105-5108), 5,6-dichloro-1-b-D-rybofuranozylo-benzotriazol, 5,6-dichloro-1-a-D-rybofuranozylo-benzotriazol, 5,6-dichloro-2-b-D-rybofuranozylo-benzotriazol, 5,6-dichloro-2-a-D-rybofuranozylo-benzotriazol (US Patent 3,138,582, 1964; Szyszka i wsp., Biochim. Biophys. Res. Commun. 1995, 208, 418-424; Dobrowolska i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1991, 1080, 221-226; Borowski i wsp., Eur. J. Biochem., 2003, 270, 1645-1653). Dotychczas nie były znane ich właściwości lecznicze i biomedyczne. Spośród nich 4,5,6,7-tetrachlorobenzotriazol oraz 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazol inhibują NTPazę/helikazę wirusów z rodziny Flaviviridae takich jak HCV i WNV (Borowski i wsp., Eur. J. Biochem. 2003, 270, 1645-1653).

Związki te wykazują aktywność przeciwko wirusom RNA(+) z rodziny Flaviviridae opartą na mechanizmie inhibicji wirusowej RNA NTPazy/helikazy.

Istotą wynalazku są nowe pochodne benzotriazoli o wzorach ogólnych 1a i 1b.

N-podstawione pochodne benzotriazolu otrzymuje się poprzez alkilowanie 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazolu, w obecności 1,8-azabicyklo-4-undecen-7-enu (DBU), w temperaturze 50°C.

Ogólna metoda otrzymywania rybozydów benzotriazoli polega na tym, że podstawiony benzotriazol pododaje się sililowaniu w roztworach heksametylodisilazanu (HMDS) i trimetylochlorosilanu (TCS) w temperaturze wrzenia. Po ochłodzeniu odparowuje się nadmiar środków sililujących i do pozostałości dodaje się roztwór 1-O-acetylo-2,3,5-tri-O-benzoilorybozy (ABR) w acetonitrylu, a następnie triflan, jako katalizator. Przebieg reakcji kontroluje się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym. Po zakończeniu reakcji przeprowadza się ekstrakcję za pomocą nasyconego roztworu kwaśnego węglanu sodu i chloroformu. Oddzieloną warstwę organiczną suszy się nad bezwodnym siarczanem sodu i zatęża pod próżnią. Produkt kondensacji poddaje się odblokowaniu metanolem nasyconym amoniakiem, a powstały rybozyd benzotriazolu oczyszcza się przez krystalizację lub metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące wynalazek, nie ograniczające jego zakresu.

Przykład 1.

Otrzymywanie 1-b-D-rybofuranozylo-4,5,6,7-tetrabromobenzotriazolu

Zawiesinę 435 mg (1 mmol) 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazolu w 7 mL HMDS i 0.7 mLTCS ogrzewano pod chłodnicą zwrotną do wrzenia przez 3 godziny. Otrzymano klarowny roztwór, który zatężono na wyparce pod próżnią. Następnie dodano roztwór 1 mmol ABR w 10 mL acetonitrylu oraz 0.25 mL triflanu. Przebieg kondensacji kontrolowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej w solwencie toluen:chloroform:octan etylu, 7:1:2. Po zakończeniu reakcji roztwór wylano do mieszaniny chloroformu z kwaśnym węglanem sodu i ekstrahowano chloroformem. Warstwę organiczną suszono bezw. siarczanem sodu i odparowano pod próżnią do sucha. Pozostałość poddano odblokowaniu za pomocą metanolu nasyconego amoniakiem. Roztwór odparowano i produkt oczyszczano przez krystalizację z etanolu lub drogą chromatografii na płytkach preparatywnych z żelem

PL 195 883 B1 krzemionkowym. Wydajność 60%; Rf 0.33 (CHCI3: MeOH 9:1); T.t. 202-204°C; Spektroskopia masowa m/z (MH⁺) 567.800 dla C11H10Br4N3O4 (teoretyczne MH⁺ 567.831); UV: lmax (e) (pH 2) 277 nm (15200), 289 nm (15100), 307 nm (11070); (pH 6) 278 nm (10900), 289 nm (10900), 310 nm (6550), (pH 12) 278 nm (10800), 290 nm (11000) 309 nm (7060).

Przykład 2.

Otrzymywanie 1-propylo- i 2-propylo-4,5,6,7-tetrabromobenzotriazolu

215 mg TBBT (0.5 mmola) rozpuszczono w 4 mL acetonitrylu, dodano 0.24 mL 1,8-diazobicyclo-4-undecen-7-en (DBU) i 220 mL CH3(CH2)2I (2.5 mmola), mieszano i lekko ogrzewano do 50°C. Następnie dodano DBU (0.12 mL) i 110 mL jodku propylu i dalej ogrzewano w 50°C. Mieszaninę reakcyjną zatężono i produkty rozdzielono na płytkach preparatywnych z żelem krzemionkowym w solwencie heksan:chloroform (1:1). Otrzymano 1-propyloTBBT z wydajnością 31.4% oraz 2-propyloTBBT z wydajnością 53%.

1-propyloTBBT: Rf 0.56 (heksan:chloroform 1:1); T.t. 144-146°C; Spektroskopia masowa m/z (MH⁺) 477.7255 dla C9H8Br4N3 (teoretyczne MH⁺ 477.800); UV: lmax (e) (pH 2); 283 nm (9600), 293 nm (10030), 309 nm (8200); (pH 6) 283 nm (9100), 293 nm (9200), 309 nm (7200); (pH 12) 284 nm (9200), 293 nm (9400), 308 nm (7500).

2-propyloTBBT: Rf 0.77 (heksan:chloroform 1:1); T.t. 103-105°C; Spektroskopia masowa m/z (MH⁺) 477.7397 dla C9H8Br4N3 (teoretyczne MH⁺ 477.800); UV: lmax (e) (pH 2); 286 nm (7700), 302 nm (10200), 313 nm (12000), 326 nm (9400); (pH 6) 286 nm (8600), 301 nm (10900), 311 nm (11700), 326 nm (7200); (pH 12) 286 nm (8600), 2301 nm (10900), 310 nm (11800), 326 nm (7700).

Przykład 3.

Otrzymywanie 1-i 2-hydroksyetylo-4,5,6,7-tetrabromobenzotriazolu

435 mg TBBT (1 mmol) rozpuszczono w 8 mL acetonitrylu, dodano 0.48 mL DBU i 100 mL BrCH2CH2OH (1.4 mmola), mieszano i lekko ogrzewano do 50°C. Następnie dodano kolejne porcje DBU 0.24 mL i 100 mL BrCH2CH2OH i ogrzewano. Mieszaninę reakcyjną zatężono i produkty rozdzielono na płytkach preparatywnych z żelem krzemionkowym w solwencie chloroform:metanol (9:1). Otrzymano 1-hydroksyetyloTBBT z wydajnością 29%, oraz 2-hydroksyetyloTBBT z wydajnością 28%.

1-hydroksyetyloTBBT: Rf 0.08 (heksan:chloroform 1:1), 0.73 ( CHCI3: MeOH 95:5); T.t. 180183°C; Spektroskopia masowa m/z (MH⁺) 479.7056 dla C8H6Br4N3O (teoretyczne MH⁺ 479.769); UV: lmax (e) (pH 2) 274 nm (7600), 280 nm (8500), 291 nm (8900), 309 nm (6200), 321 nm (3900), (pH 6) 274 nm (7800); 280 nm (8600), 291 nm (8900), 307 nm (6300), 320 nm (4300), (pH 12) 274 nm (7900), 280 nm (8700), 291 nm (9200), 309 nm (6600), 319 nm (4600);

2-hydroksyetyloTBBT: Rf 0.03 (heksan:chloroform 1:1), 0.79 (CHCI3: MeOH 95:5); T.t. 190192°C; Spektroskopia masowa m/z (MH⁺) 479.7397 (teoretyczne MH⁺ 479.769); UV: lmax(e) (pH 2) 283 nm (9800), 298 nm (13500), 308 nm (14200), 319 nm (8200), (pH 6) 288 (11200); 293 nm (12100), 299 nm (14100), 307 nm (14700), 321 nm (7200), (pH 12) 286 (10700), 292 nm (12000), 298nm (13700), 307 nm (14400), 321 nm (7000).

Przykład 4.

Oznaczanie aktywności przeciwwirusowej

Badanie będącej przedmiotem wynalazku aktywności przeciwwirusowej (ED50) prowadzi się stosując wirus WNV (ATCC, szczep VR-82) oraz komórki Vero E6. Komórki hoduje się na 24-miejscowych płytkach i poddaje działaniu różnych stężeń odpowiednich benzotriazoli o wzorach 1a i 1b, w których R oznacza niezależnie wodór, brom, metyl, rozpuszczonych w medium. Roztwór podstawowy otrzymuje się przez ich rozpuszczenie w sulfotlenku dimetylowym, wodzie lub mieszaninie woda-sulfotlenek dimetylowy.

Komórki Vero E6 hoduje się w medium RPMI-1640 zawierającym 10% cielęcej surowicy płodowej (Gibco), 100 mg/mL ampicyliny i 80 mg/mL gentamycyny. Komórki w logarytmicznej fazie wzrostu zakażono wirusem WNV (ATCC szczep VR-82) jak to uprzednio opisano (Wengler i wsp., Virology 1990,177, 795-801).

₅

W celu oznaczenia aktywności przeciwwirusowej badanych związków 5 x 10⁵ komórek zawiesza się w 1 mL medium RPMI-1640 i osadza w 24-miejscowej płytce hodowlanej, inkubuje przez 24 h i dodaje do kompletnego medium. W celu zakażenia komórek dodaje się virusowe inoculum w medium i adsorbuje przez 3 h w 37°C. Następnie inoculum usuwa się przemywając komórki dwukrotnie przy użyciu medium i dodatkowo inkubuje przez 2 dni w obecności wyżej wymienionych związków w warunkach wyżej opisanych.

PL 195 883 B1

Kinetykę replikacji wirusów mierzy się przy użyciu ilościowego oznaczania RNA wirusa WNV jak podano poniżej.

Ilościowe oznaczenie wirusowego RNA.

Medium z płytek usuwa się, jednokomórkowe warstwy przemywa się świeżym medium, a preparatykę RNA prowadzi stosując „RNeasy RNA preparation kit (Qiagen) wg procedury zalecanej przez producenta. Wirusowy RNA jest ilościowo oznaczany drogą obserwacji rzeczywistego czasu działania 5'-nukleazy w układzie RT-PCR.

Do amplifikacji fragmentu 151 par zasad w rejonie NS3 wirusa WNV stosuje się primery Wn S1 (5'-TGC TGA TAT GAT TGA CCC TTT TCA-3') i Wn AS1 (5'-AGT GTA AGT AAT GCC TCC AAA CAA-3'). Produkty PCR oznacza się przy użyciu próbki WnP1 (5'-TTC GCA AGA GGT GGA CAG CCA-3'). Koniec 3' próbki znakuje się przy użyciu TAMRA (6-karboksylo-N,N,N',N'-tetrametylorodamina) i fosforyluje, żeby zapobiec elongacji podczas PCR. Koniec 5' próbki znakuje się FAM (6karboksylofluoresceina). RT-PCR przeprowadza się stosując „Platinum RT-PCR ThermoScript OneStep System (Life Technologies) zalecany przez producenta. Mieszanina reakcyjna zawiera 280 nanomoli primerów WnS1 i WnAS1, 140 nanomoli próbki WnP1, i 40 mg/mL BSA w 20 mL buforu używanego do reakcji.

Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,8 mL „ThermoScript Reverse Transcriptase/Platinum Taq enzyme mix i 2 mL otrzymanego roztworu RNA. Obróbkę termiczną przeprowadza się w aparacie „LightCyclerTM(Roche Molecular Biochemicals). Obejmuje ona odwrotną transkrypcję w 50°C przez 20 min, denaturację w 95°C przez 5 min, oraz 45 cykli w 95°C przez 5 s i w 60°C przez 20 s (Wittner i wsp., Biotechnique, 1977, 22, 176-181). Podczas przebiegu PCR próbkę WnP1 trawi się dzięki aktywności 5'-nukleolitycznej Taq DNA polimerazy, specyficznie przyłączającej się do nagromadzonego produktu PCR z udziałem wirusa WNV (Holland i wsp., Proc., Natl., Acad., Sci. 1991, 88, 7276-7280). Trawienie próbki uwalnia FAM z barwnika TAMRA powodując wzrost specyficznej dla FAM fluorescencji w procesie PCR (Litvak i wsp., PCR Methods and Applications 1995, 4, 357-362). Fluorescencję FAM mierzy się w kanale detekcyjnym F1 (530 nm) i dzieli przez wartość fluorescencji zmierzonej w kanale F2 (640 nm). W celu uzyskania standartu dla realno-czasowego PCR przed preparatyką RNA silnie pozytywny roztwór podstawowy wirusa rozcieńcza się negatywnym lizatem komórkowym. Ilość wirusowego RNA w jednej jednostce PCR jest określana jako najmniejsze możliwe rozcieńczenie, które może być amplifikowane w pięciu na pięć replikacyjnych reakcji. Procedura ilościowego oznaczania wirusowego RNA została uprzednio opisana (De Silva i wsp., Biochemica 1998, 2, 12-15).

Związki ujęte wzorami ogólnymi 1a i 1 b wykazują aktywność przeciwwirusową skorelowaną z aktywnością inhibitorową (IC50) w stosunku do NTPazy/helikazy wirusów Flaviviridae rzędu 3-14 mM z DNA jako substratem oraz 3-77 m M z RNA jako substratem.

Claims (3)

1. Nowe analogi benzotriazolu o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza niezależnie wodór, brom, metyl, a X oznacza propyl, chloroetyl, hydroksyetyl lub 1-b-D-rybofuranozyl.

2. Sposób otrzymywania związków o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza niezależnie wodór, brom, metyl, a X oznacza propyl, chloroetyl, hydroksyetyl lub 1-b-D-rybofuranozyl, znamienny tym, że gdy X oznacza propyl, chloroetyl, hydroksyetyl, alkilowanie 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazolu prowadzi się w acetonitrylu w obecności 1,8-diazobicyklo-4-undecen-7-enu (DBU), w 50°C, gdy X oznacza 1-b -D-rybofuranozyl w kondensacji nukleozydowej rybozydów benzotriazoli stosuje się jako katalizator triflurometylosulfonian trimetylosililu (triflan).

3. Środki lecznicze o działaniu przeciwko wirusom Flaviviridae zawierające substancje czynne oraz znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i/lub środki pomocnicze, znamienne tym, że jako składnik czynny zawierają związek o wzorze ogólnym 1a albo 1b, w którym R oznacza niezależnie wodór, brom, metyl, a X oznacza propyl, chloroetyl, hydroksyetyl lub 1-b-D-rybofuranozyl.