PL201978B1 - Nowe sole halogenoetyloguanin jako inhibitory wirusów z rodziny Flaviviridae oraz środki lecznicze o działaniu przeciwwirusowym - Google Patents

Abstract

1. Nowe sole halogenoetyloguanin jako inhibitory wirusów z rodziny Flaviviridae będące solami litowcowymi 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza atom chloru, bromu lub jodu, a M+ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe sole halogenoetyloguanin, będące solami litowcowymi 7-halogenoetyloguanin o wzorze ogólnym 1a, w którym R oznacza chlor, brom lub jod, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy oraz sole litowcowe 9-halogenoetyloguanin o wzorze ogólnym 1b, w którym R oznacza chlor, brom lub jod, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy, wykazujące aktywność przeciwko wirusom RNA(+) z rodziny Flaviviridae.

Przedmiotem wynalazku są również środki lecznicze zawierające znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze, które jako składniki czynne zawierają sole litowcowe halogenoetyloguanin o wzorze ogólnym 1a lub 1b, w którym R oznacza chlor, brom lub jod, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy, wykazujące aktywność przeciwko wirusom RNA(+) z rodziny Flaviviridae.

Związki będące przedmiotem wynalazku mają w szczególności właściwości inhibitorowe w stosunku do wirusów RNA(+) z rodziny Flaviviridae, będące rezultatem aktywacji RNA helikazy wirusów Flaviviridae, takich jak wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus Zachodniego Nilu (WNV), wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE) i wirus dengi (DEN).

Stan wiedzy

W dotychczasowym stanie wiedzy znane są tylko następujące halogenoalkilopochodne guaniny: 7-chloroetyloguanina (Piper i wsp., J. Med. Chem. 1980, 23, 357-364, Parker i wsp., Blochem. Biophys. Res. Commun. 1986, 139. 31-36: Ramzaeva i wsp., Synth. Commun. 1989, 19, 3121-3128).

Związki te były znane i stosowane jedynie jako inhibitory fosforybozylotransferazy hypoksantynowo-guaninowej (Piper i wsp., J. Med. Chem. 1980, 23, 357-364).

Nie są dotychczas znane ich właściwości lecznicze i biomedyczne.

Związki te ponadto są nierozpuszczalne w wodzie, co w poważnym stopniu utrudnia ich zastosowanie jako leków, szczególnie przy podawaniu dożylnym i dootrzewnowym.

Nieoczekiwanie okazało się, że 9-chloroetyloguanina oraz 7-chloroetyloguanina zwiększają aktywność RNA helikazy od 220% do 850% przy stężeniu odpowiednio 250 μΜ i 200 μΜ oraz ED₅₀ 150 pM i 120 pM.

Okazało się również, że związki zwiększające aktywność rozwijającą helikazy należące do 7i 9-chloroetylo pochodnych guaniny wiążą się do allosterycznego miejsca regulacyjnego enzymu wywołując zmianę jego konformacji i jego rozwinięcie, co z kolei zwiększa dostępność substratu DNA/RNA do miejsc katalitycznych i powoduje przekształcenie dwuniciowego DNA lub RNA do jednoniciowych struktur.

Związki powyższe nie zwiększają szybkości hydrolizy ATP, ani nie zmieniają powinowactwa enzymu do ATP i mogą być stosowane w kombinacji z modulatorami aktywności NTPazy/helikazy działającymi przez bezpośrednie oddziaływanie z miejscem wiążącym ATP lub RNA. Związki według wynalazku są to nieznane do tej pory sole 7- i 9-halogenoetyloguanin o selektywnym działaniu przeciwko wirusom z rodziny Flaviviridae.

Istotą wynalazku są nowe, rozpuszczalne w wodzie sole 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza chlor, brom lub jod, a Μ⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy.

Związki te wykazują selektywną aktywność przeciwko wirusom z rodziny Flaviviridae opartą na mechanizmie aktywacji wirusowej RNA helikazy.

Ogólna metoda otrzymywania soli litowcowych 7- i 9-halogenoetyloguanin polega na tym, że 7- lub 9-halogenoetyloguaninę dodaje się mieszając do roztworu odpowiedniego wodorotlenku litowcowego (sodowego, potasowego lub litowego). Resztki nie rozpuszczonego osadu odsącza, przesącz zatęża w niskiej temperaturze, korzystnie od 0-10°C, pod próżnią od 0,01 mm Hg do 0,1 mm Hg do sucha i suszy, korzystnie nad pięciotlenkiem fosforu, pod próżnią, w wysokiej temperaturze od 120 do 140°C.

Otrzymane sole posiadają widma UV i NMR podobne do widm ich macierzystych zasad.

Środki lecznicze o działaniu przeciwko wirusom Flaviviridae według wynalazku, zawierające znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i/lub środki pomocnicze charakteryzują się tym, że jako składniki czynne zawierają sole litowcowe 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza atom chloru, bromu lub jodu, a Μ⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy.

W szczególnie korzystnej wersji środek leczniczy według wynalazku zawiera jako substancję czynną sól sodowa 7-chloroetyloguaniny.

PL 201 978 B1

Według niniejszego zgłoszenia przy zastosowaniu środków leczniczych, tj. soli litowcowych halogenoetyloguanin, nie obserwuje się żadnego znamiennego działania cytotoksycznego przy stężeniu większym od 300 μΜ przy silnym efekcie wirostatycznym (IC₅₀ 7-120 μg/ml) w komórkach Vero E6, natomiast zwiększa się rozpuszczalność w wodzie.

Środki lecznicze według wynalazku mają postać typowych preparatów farmaceutycznych, sporządzonych zgodnie z ogólnie przyjętymi technikami farmaceutycznymi, z użyciem znanych nośników i substancji pomocniczych. Postać preparatów jest dobierana zależnie od drogi podawania: preparaty mogą być stosowane w postaci przeznaczonej do wstrzykiwań, zwłaszcza do wstrzykiwań dożylnych i dootrzewnowych lub w postaci przeznaczonej do podawania doustnego, np. roztworów, emulsji, tabletek, tabletek powlekanych, tabletek dojelitowych oraz kapsułek.

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące wynalazek, nie ograniczające jego zakresu.

P r z y k ł a d I. Otrzymywanie soli litowcowych 7-halogenoetyloguanin

7-halogenoetyloguaninę dodano do równoważnej ilości 1N roztworu odpowiedniego wodorotlenku litowego, mieszano 1 h, resztki nierozpuszczonego osadu odsączono, przesącz zatężono w temperaturze 5°C, pod próżnią 0,01 mm Hg do sucha i suszono nad pięciotlenkiem fosforu, pod próżnią, w temperaturze 120°C.

Otrzymane sole posiadały widma UV i NMR podobne do widm ich macierzystych zasad.

P r z y k ł a d II. Otrzymywanie soli litowcowych 9-halogenoetyloguanin

9-halogenoetyloguaninę dodano do równoważnej ilości 1N roztworu odpowiedniego wodorotlenku sodowego, mieszano 1,5 h, resztki nie rozpuszczonego osadu odsączono, przesącz zatężono w temperaturze 10°C, pod próżnią 0,01 mm Hg do sucha i suszono nad pięciotlenkiem fosforu, pod próżnią, w temperaturze 140°C.

Otrzymane sole posiadały widma UV i NMR podobne do widm ich macierzystych zasad.

P r z y k ł a d III. Oznaczanie aktywności przeciwwirusowej

Badanie będącej przedmiotem wynalazku aktywności przeciwwirusowej (ED50) prowadzi się stosując wirus WNV (ATCC, szczep VR-82) oraz komórki Vero E6. Komórki hoduje się na 24-miejscowych płytkach i poddaje działaniu różnych stężeń 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach 1 i 2, w których R oznacza chlor, brom, jod, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy i litowy, rozpuszczonych w medium. Roztwór podstawowy otrzymuje się przez ich rozpuszczenie w sulfotlenku dimetylowym, wodzie lub mieszaninie woda-sulfotlenek dimetylowy.

Komórki Vero E6 hoduje się w medium RPMI-1640 zawierającym 10% cielęcej surowicy płodowej (Gibco), 100: g/ml ampicyliny i 80: g/ml gentamycyny. Komórki w logarytmicznej fazie wzrostu zakażono wirusem WNV (ATCC szczep VR-82) jak to uprzednio opisano (Wengler i wsp., Virology 1990, 177, 795-801).

W celu oznaczenia aktywności przeciwwirusowej badanych związków 5 x 105 komórek zawiesza się w 1 mi medium RPMI-1640 i osadza w 24-miejscowej płytce hodowlanej, inkubuje przez 24 h i dodaje do kompletnego medium. W celu zakażenia komórek dodaje się wirusowe inoculum w medium i adsorbuje przez 3 h w 37°C. Następnie inoculum usuwa się przemywając komórki dwukrotnie przy użyciu medium i dodatkowo inkubuje przez 2 dni w obecności wyżej wymienionych związków, w warunkach wyżej opisanych.

Kinetykę replikacji wirusów mierzy się przy użyciu ilościowego oznaczania RNA wirusa WNV, jak podano poniżej.

Ilościowe oznaczenie wirusowego RNA

Medium z płytek usuwa się, jednokomórkowe warstwy przemywa się świeżym medium, a preparatykę RNA prowadzi stosując „RNeasy RNA preparation kit” (Qiagen) wg procedury zalecanej przez producenta. Wirusowy RNA jest ilościowo oznaczany drogą obserwacji rzeczywistego czasu działania 5'-nukleazy w układzie RT-PCR.

Do amplifikacji fragmentu 151 par zasad w rejonie NS3 wirusa WNV stosuje się primery Wn S1 (5'-TGC TGA TAT GAT TGA CCC TTT TCA -3') i Wn AS1(5'-AGT GTA AGT AAT GCC TCC AAA

CAA-3').

Produkty PCR oznacza się przy użyciu próbki WnP1 (5'-TTC GCA AGA GGT GGA CAG CCA-3'). Koniec 3' próbki znakuje się przy użyciu TAMRA (6-karboksylo-N,N,N',N'-tetrametylorodamina) i fosforyluje, żeby zapobiec elongacji podczas PCR. Koniec 5' próbki znakuje się FAM (6-karboksylofluoresceina). RT-PCR przeprowadza się stosując „Platinum RT-PCR ThermoScript One-Step System” (Life Technologies) zalecany przez producenta.

PL 201 978 B1

Mieszanina reakcyjna zawiera 280 nanomoli primerów WnS1 i WnAS1, 140 nanomoli próbki

WnP1 i 40 μg/ml BSA w 20 μΐ buforu używanego do reakcji.

Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,8 μl „ThermoScript Reverse Transcriptase/Platinum Tag enzyme mix” i 2 μl otrzymanego roztworu RNA. Obróbkę termiczną przeprowadza się w aparacie „Light Cycer TM” (Roche Molecular Biochemicals). Obejmuje ona odwrotną transkrypcję w 50°C przez 20 min, denaturację w 95°C przez 5 min oraz 45 cykli w 95°C przez 5 s i w 60°C przez 20 s (Wittner i wsp., Biotechnigue, 1977, 22, 176-181). Podczas przebiegu PCR próbkę WnP1 trawi się dzięki aktywności 5'-nukleolitycznej Tag DNA polimerazy, specyficznie przyłączającej się do nagromadzonego produktu PCR z udziałem wirusa WNV (Holland i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 7276-7280). Trawienie próbki uwalnia FAM z barwnika TAMRA powodując wzrost specyficznej dla FAM fluorescencji w procesie PCR (Litvak i wsp., PCR Methods and Applications 1995, 4, 357-362). Fluorescencję FAM mierzy się w kanale detekcyjnym F1 (530 nm) i dzieli przez wartość fluorescencji zmierzonej w kanale F2 (640 nm). W celu uzyskania standardu dla realno-czasowego PCR przed preparatyką RNA silnie pozytywny roztwór podstawowy wirusa rozcieńcza się negatywnym lizatem komórkowym. Ilość wirusowego RNA w jednej jednostce PCR jest określana jako najmniejsze możliwe rozcieńczenie, które może być amplifikowane w pięciu na pięć replikacyjnych reakcji. Procedura ilościowego oznaczania wirusowego RNA została uprzednio opisana (De Silva i wsp., Biochemica 1998, 2, 12-15.)

P r z y k ł a d IV. Preparat soli sodowej 7-chiloroetyloguaniny w postaci proszku do przygotowywania roztworów do wstrzykiwań

Sól sodową 7-chloroetyloguaniny rozciera się w moździerzu lub młynie kulowym do drobnokrystalicznego proszku, który z kolei rozpuszcza się w apyrogennej wodzie redestylowanej mieszając i ogrzewając w taki sposób, żeby uzyskać roztwór o stężeniu 5 mg/ml.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowe sole halogenoetyloguanin jako inhibitory wirusów z rodziny Flaviviridae będące solami litowcowymi 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza atom chloru, bromu lub jodu, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy.
2. 2. Środki lecznicze o działaniu przeciw wirusowym, zwłaszcza przeciwko wirusom z rodziny Flaviviridae zawierające znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i/lub środki pomocnicze, znamienne tym, że jako składniki czynne zawierają sole litowcowe 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza atom chloru, bromu lub jodu, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy.
3. 3. Środki według zastrz. 2, znamienne tym, że jako składnik czynny zawierają sól sodową 7-chloroetyloguaniny.