PL195985B1 - Przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposóbdiagnostyczny in vitro - Google Patents

Przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposóbdiagnostyczny in vitro

Info

Publication number
PL195985B1
PL195985B1 PL98340465A PL34046598A PL195985B1 PL 195985 B1 PL195985 B1 PL 195985B1 PL 98340465 A PL98340465 A PL 98340465A PL 34046598 A PL34046598 A PL 34046598A PL 195985 B1 PL195985 B1 PL 195985B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
vasp
antibody
phosphoserine
phosphorylation
serine
Prior art date
Application number
PL98340465A
Other languages
English (en)
Other versions
PL340465A1 (en
Inventor
Martin Eigenthaler
Heinz Hoschützky
Ulrich Walter
Original Assignee
Vasopharm Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19749091A external-priority patent/DE19749091C1/de
Application filed by Vasopharm Gmbh filed Critical Vasopharm Gmbh
Publication of PL340465A1 publication Critical patent/PL340465A1/xx
Publication of PL195985B1 publication Critical patent/PL195985B1/pl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5064—Endothelial cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

1. Przeciwcialo monoklonalne 16C2, wytwarzane przez linie komórek hybrydom o numerze dostepu DSM ACC 2330, lub jego fragment, zdolne do wiazania fosfoproteiny stymulowanej czynni- kami rozszerzajacymi naczynia (VASP) tylko wtedy, gdy VASP wystepuje w postaci fosforylowanej w pozycji seryny 239 (VASP z fosfoseryna w pozycji 239). 2. Zastosowanie przeciwciala 16C2 lub jego fragmentu, zdefiniowanego w zastrz. 1, jako srod- ka diagnostycznego. 10. Linia komórek hybrydom DSM ACC 2330, wytwarzajaca przeciwcialo monoklonalne 16C2. 11. Zestaw diagnostyczny, znamienny tym, ze zawiera przeciwcialo 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1. 12. Sposób diagnostyczny in vitro, znamienny tym, ze stosuje sie przeciwcialo 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1, do okreslania stanu fosforylacji VASP z fosfoseryna w pozycji 239 i/lub interakcji VASP z bialkami wmateriale biologicznym, albo do wplywania na stan fosforylacji VASP z fosfoseryna w pozycji 239 i/lub interakcje VASP z bialkami w materiale biologicznym. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposób diagnostyczny in vitro.
Choroby układu naczyniowego są odpowiedzialne za wiele chorób przewlekłych i zagrażających życiu, takich jak zawał mięśnia sercowego, udar, zamykanie światła tętnic i wiele postaci niewydolności nerek.
Komórki śródbłonkowe, które, między innymi, kontrolują układ krzepnięcia krwi, funkcjonalny stan trombocytów oraz migrację komórek nacieku zapalnego i nowotworowych do ścian naczyń, stan skurczu i wzrost komórek mięśni gładkich, awięc również ciśnienie krwi i strukturę ścian naczyń, a także nowe unaczynianie, są szczególnie ważne dla regulacji układu naczyniowego. Wiele ztych funkcji ścian naczyń ulega zakłóceniu w ciężkich chorobach naczyniowych, ataka sytuacja może w końcu prowadzić do zawału mięśnia sercowego, udaru i wielu postaci niewydolności nerek.
Śródbłonek wytwarza ważne substancje prostacyklinę (PGI2) i tlenek azotu (NO), który jest również znany jako śródbłonkowy czynnik rozluźniający (EDRF), hamujące zarówno trombocyty, jak i komórki mięśni naczyń. Te czynniki śródbłonkowe, jak prostacyklina (PGI2) lub EDRF, np. NO, kontrolują funkcje śródbłonka.
Zatem wcelu leczenia chorób, które są związane z zaburzeniami czynności śródbłonka w specyficzny sposób, konieczne jest ustalenie parametrów biochemicznych, które umożliwiają diagnozowanie i kontrolowanie przebiegu zaburzeń czynności śródbłonka.
Pożądane jest, aby było możliwe jak najwcześniejsze rozpoznawanie zaburzeń czynności śródbłonka, to jest na etapie, na którym nie ujawniło się jeszcze samo nieodwracalne uszkodzenie, takie jak zmiany miażdżycowe, spowodowane przez zaburzenia czynności śródbłonka.
Identyfikacja zaburzeń czynności śródbłonka na wczesnym etapie umożliwia opracowanie nowych podejść terapeutycznych, które mogą spowodować zwrot w leczeniu zaburzeń czynności śródbłonka.
Metodami, które są znane do określania czynności śródbłonka in vivo są inwazyjne metody detekcji, takie jak angiografia ilościowa, albo nieinwazyjne metody obrazowania. Do wad tych metod należy to, że badania te prowadzi się bezpośrednio w organizmie pacjenta oraz to, że są one trudne do ilościowej oceny i bardzo kosztowne.
Dlatego też istnieje zapotrzebowanie na dostępne metody biochemiczne/immunobiologiczne, umożliwiające szybkie i proste określanie czynności śródbłonka w materiale biologicznym ex vivo, np. w próbkach komórek lub próbkach krwi, za pomocą rutynowych badań w laboratorium.
Czynnościami śródbłonka są te czynności, które mogą być regulowane przez czynniki śródbłonkowe, takie jak prostacyklina (PGI2) lub EDRF, np. NO.
Ostatnio odkryto, wyizolowano i scharakteryzowano z punktu widzenia genetyki molekularnej ludzką VASP (fosfoproteinę stymulowaną czynnikami rozszerzającymi naczynia), która podlega fosforylacji w trombocytach i komórek ścian naczyń w odpowiedzi na hormony i leki hipotensyjne (rozszerzające naczynia) (Haffner i in., EMBO J. 14, 19-27, 1995).
VASP jest ważnym składnikiem szlaku przekazywania sygnałów ANF/NO/cGMP/kinaza białkowa zależna od cGMP, bardzo istotnym pod względem fizjologicznym, patofizjologicznym i farmakologicznym, a także składnikiem szlaku przekazywania sygnałów cAMP/kinaza białkowa zależna od cAMP (U. Walter, Blick 1/97 Wϋrzburg University, str. 79-81, 1997). VASP jest eksprymowanawprawie wszystkich komórkach ludzkich i zwierzęcych, a szczególnie wysokie stężenie stwierdzonowtrombocytach, komórkach naczyń mięśni gładkich oraz fibroblastach. Whodowanych komórkach VASP jest związana zkontaktami ogniskowymi (miejscami kontaktu komórka/macierz), kontaktami komórka/komórka, mikrowłókienkami idynamicznymi regionami błonowymi (np. krawędzi wiodącej) (Walteriin., Agents and Actions 455, 255-268, 1995).
Fosforylacja VASPwukładzie naczyniowym jest skorelowanazhamowaniem adhezji/agregacji trombocytów, hamowaniem skurczu/migracji mięśni gładkich oraz zhamowaniem parakomórkowej przepuszczalności śródbłonka.
VASP ulega fosforylacji idefosforylacji wtrzech różnych miejscach (seryna 157, seryna 239 itreonina 278, patrz Horstrupiin.,Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)). Serynę 239 niekiedy oznacza
PL 195 985 B1 się również jako serynę 238, zwłaszcza wtedy, gdy w numeracji nie uwzględnia się pierwszej reszty metioniny VASP.
Seryna 239 VASP ulega fosforylacji w nienaruszonych ludzkich komórkach naczyniowych (trombocytach, komórkach śródbłonkowych i komórkach mięśni gładkich) w odpowiedzi na fizjologiczne i farmakologiczne donory NO oraz inhibitory trombocytów i czynniki rozszerzające naczynia.
Fosforylacja seryny 239 VASP przebiega w szczególności z udziałem zależnych od cGMP kinaz białkowych, które są aktywowane za pośrednictwem cGMP przez ważne hormony, takie jak peptydy natriuretyczne lub substancje i leki uwalniające NO. Fosforylacja seryny 239 VASP przebiega ponadto z udziałem zależnych od cAMP kinaz białkowych, które są aktywowane przez hormony i leki podwyższające poziom cAMP.
Podczas gdy kinazy białkowe zależne od cAMP zasadniczo fosforylują serynę w pozycji 157, fosforylują one również serynę w pozycji 239 VASP. Stwierdzono również, że fosforylacja VASP w pozycji seryny 157 jest ściśle skorelowana z hamowaniem wiązania fibrynogenu z glikoproteiną IIb-IIIa ludzkich płytek krwi (Hostrup i in., Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)).
Określenie stopnia, w jakim VASP została sfosforylowana w materiale biologicznym, np. w ekstraktach tkanek lub komórek, a zwłaszcza określenie stopnia fosforylacji VASP w pozycji 239 i/lub pozycji 157, byłoby ważnym parametrem biochemicznym, którego pomiar powinien umożliwić opracowanie układu diagnostycznego do wykrywania hormonów lub leków zwiększających poziom cGMP i/lub zwiększających poziom cAMP, takich jak przedsionkowy czynnik natriuretyczny (ANF), guanylina, substancje ileki uwalniających NO, a ponadto umożliwiać wyciąganie wniosków dotyczących czynności śródbłonka in vivo.
Przeciwciała, które specyficznie wiążą się z odwracalnie fosforylowanymi białkami, opisano w opisie patentowym US nr 5599681, publikacji WO 93/21230 oraz w publikacji U. Walter, Blick 1/97
Wiirzburg University, str. 79-81, 1997.
W szczególności istniała potrzeba opracowania reagentów do ocenianiaimodulowania czynności śródbłonka, a zwłaszcza przeciwciał przeciw VASP (fosfoproteinie stymulowanej czynnikami rozszerzającymi naczynia), które wiążą się z VASP tylko wtedy, gdy VASP jest fosforylowana, oraz komórek hybrydom, które są przydatne do wytwarzania takich przeciwciał.
Wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego 16C2, wytwarzanego przez linię komórek hybrydom o numerze dostępu DSM ACC 2330, lub jego fragmentu, zdolnych do wiązania fosfoproteiny stymulowanej czynnikami rozszerzającymi naczynia (VASP) tylko wtedy, gdy VASP występuje w postaci fosforylowanej w pozycji seryny 239 (VASP z fosfoseryną w pozycji 239).
Wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciała 16C2 lub jego fragmentu, zdefiniowanego powyżej, jako środka diagnostycznego.
Korzystnie jakościowo i/lub ilościowo oznacza się VASP z fosfoseryną wpozycji 239 wmateriale biologicznym.
Wszczególnościmateriałbiologicznystanowiąludzkietrombocytylubludzkakrew.
VASP z fosfoseryną w pozycji 239 zazwyczaj oznacza się metodąWestern blotting albometodą cytometrii przepływowej.
Przeciwciało 16C2 lub jego fragment jest przydatne szczególnie gdy wykrywa się substancje, które wpływają na poziom cGMP i/lub cAMP wmateriale biologicznym, określa się aktywność czyn n ików śródbłonka in vivo, albo wykrywa zaburzenia czynności śródbłonka.
Wynalazek dotyczy także linii komórek hybrydom DSM ACC 2330, wytwarzającej przeciwciało monoklonalne16C2.
Wynalazek dotyczy ponadto zestawu diagnostycznego, charakteryzującego się tym, że zawiera przeciwciało 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane powyżej.
Wynalazek dotyczy też sposobu diag nostyczn ego in vitro, polegającego na tym, że stosuje się przeciwciało 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane powyżej, do określania stanu fosforylacji VASP z fosfoseryną w pozycji 239 i/lub interakcji VASP z białkami wmateriale biologicznym, albo do wpływania na stan fosforylacji VASP zfosfoseryną w pozycji 239 i/lub interakcję VASP z białkami wmateriale biologicznym.
W sposobach diagnostycznych można stosować przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalneifragmenty przeciwciał. Wszczególności użyteczne jest przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez linię komórek hybrydom 1 6C2, a zwłaszcza Mab 16C2.
PL 195 985 B1
Dla oceny czynności śródbłonka przydatny jest sposób określania stanu fosforylacji VASP, zgodnie z którym materiał biologiczny kontaktuje się z przeciwciałem przeciw VASP (fosfoproteinie stymulowanej czynnikami rozszerzającymi naczynia), które wiąże się z VASP jako antygenem tylko wtedy, gdy VASP jest fosforylowana.
W jakościowym sposobie oznaczania przeciwciała przeciw VASP ponadto określa się ilość przeciwciała przeciw VASP, które wiąże się z materiałem biologicznym. Konkretnie stosuje się metodę Western blotting, polegającą na rozdzielaniu VASP przez elektroforezę i kontaktowanie VASP z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana. Stosuje się również metodę cytometrii przepływowej, polegającą na kontaktowaniu próbki z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana.
Przeciwciała przeciw VASP są użyteczne w sposobach diagnozy, polegających przykładowo na kontaktowaniu próbki z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana, oraz ocenie stanu fosforylacji VASP. W sposobie tym jakościowo określa się fosforylację VASP w próbce, szczególnie gdy przeciwciało wiąże się zVASP z fosfoseryną w pozycji 239 lub VASP z fosfoseryną w pozycji 157. Próbkę mogą stanowić ludzkie trombocyty lub ludzka pełna krew.
Przeciwciała przeciw VASP są użyteczne w sposobach wykrywania markerów czynności śródbłonka. W tym celu przydatny jest sposób wykrywania substancji, które wpływają na poziom cGMP i/lub cAMP, polegający na testowaniu próbki pochodzącej od pacjenta, któremu podano substancję wpływającą na poziomy cGMP i/lub cAMP, kontaktowaniu próbki z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się zVASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana, oraz ocenie stanu fosforylacji VASP w stosunku do próbki kontrolnej.
Przeciwciała przeciw VASP stosuje się w sposobie wykrywania zaburzeń czynności śródbłonka, polegającym na kontaktowaniu próbki pochodzącej od pacjenta z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się zVASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana, oraz ocenie stanu fosforylacji VASP w stosunku do próbki kontrolnej.
Do realizacji opisanych sposobów diagnostycznych przydatny jest zestaw diagnostyczny, który zawiera przeciwciało przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana.
Wynalazek umożliwia realizację sposobów leczenia pacjentów cierpiących na zaburzenia czynności śródbłonka, w których pacjentowi podaje się terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana.
Wynalazek pozwala na opracowanie sposobów biochemicznych/immunobiologicznych, umożliwiających jakościowe i/lub ilościowe określanie stanu fosforylacji VASP wmateriale biologicznym, w szybki i prosty sposób.
W opisie przeciwciała oznaczają zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i przeciwciała monoklonalne (Mab) oraz ich fragmenty, a także fragmenty SCFV, albo inne syntetyczne lub zrekombinowane domeny białkowe, które specyficznie rozpoznają fosforylowane regiony w VASP.
Fragmenty przeciwciał obejmują jakąkolwiek część przeciwciała, która jest zdolna do wiązania docelowego antygenu, w tym przypadku VASP, lub jego określonej części. Fragmenty przeciwciał obejmują w szczególności fragmenty F(ab')2, Fab, Fab' iFv. Można je wytwarzać z przeciwciała z jakiejkolwiek grupy, ale zazwyczaj wytwarza się je z IgG lub IgM. Można je wytwarzać zwykłymi technikami rekombinacji DNA, albo stosując klasyczną metodę, przez trawienie proteolityczne papainą lub pepsyną. Patrz Current Protocols in Immunology, rozdział 2, red. Coligan i in. (John Wiley & Sons 1991-1992).
Masa cząsteczkowa fragmentów F(ab')2 zazwyczaj wynosi około 110 kDa (IgG) lub około 150 kDa (IgM) i zawierają one dwa regiony wiążące antygen, połączone w regionie zawiasowym mostkiem(ami) disulfidowym(ymi). We fragmentach tych nieobecna jest prawie cała, jeśli nie cała, część Fc. Masa cząsteczkowa fragmentów Fab' wynosi zazwyczaj około 55 kDa (IgG) lub około 75kDa (IgM) i można je otrzymać np. przez zredukowanie mostka(ów) disulfidowego(ych) fragmentu F(ab')2. Otrzymaną(e) wolną grupę(y) sulfhydrylową(e) można stosować do dogodnego sprzęgania fragmentów Fab' z innymi cząsteczkami, takimi jak reagenty umożliwiające detekcję (np. enzymy). Fragmenty Fab są jednowartościowe i zazwyczaj ich masa cząsteczkowa wynosi około 50 kDa (z każdego źródła). Fragmenty Fab zawierają regiony zmienne (VL i VH) oraz stałe (CL i CH) wiążącej antygen części przeciwciała z odpowiednio łańcucha lekkiego (L) i ciężkiego (H). Części H i L połączone są wewnątrzcząsteczkowym mostkiem disulfidowym.
PL 195 985 B1
Masa cząsteczkowa fragmentów Fv zazwyczaj wynosi około 25 kDa (bez względu na źródło) i zawierają one regiony zmienne obu łańcuchów, lekkiego i ciężkiego (odpowiednio VL i VH). Zazwyczaj łańcuchy VL iVH są utrzymywane razem tylko przez oddziaływania niekowalencyjne, z więc łatwo ulegają dysocjacji. Ich zaletami są jednakże niewielkie rozmiary, oraz to, że zachowują one takie same właściwości wiążące jak większe fragmenty Fab. Zatem opracowano sposoby sieciowania łańcuchów VL i VH, z użyciem np. aldehydu glutarowego (lub innych chemicznych środków sieciujących), międzycząsteczkowych wiązań disulfidowych (poprzez wprowadzenie cystein) i łączników peptydowych. Otrzymany FV jest jednołańcuchowy (to jest SCFV).
Jeden korzystny sposób polega na tworzeniu SCFV metodami rekombinacyjnymi, które umożliwiają wytwarzanie FV o nowych specyficznościach poprzez mieszanie i dopasowywanie łańcuchów zmiennych z różnych źródeł przeciwciał. W typowym sposobie należy dostarczyć zrekombinowany wektor, który zawiera odpowiednie elementy regulujące, kierujące ekspresją regionu kasety. Region kasety powinien zawierać DNA kodujący łącznik peptydowy, z dogodnymi miejscami do tworzenia białek fuzyjnych zarówno na końcu 5', jak i 3' łącznika. DNA kodujący region(y) zmienny(e), będący(e) przedmiotem zainteresowania, można sklonować w wektorze z wytworzeniem białek fuzyjnych z łącznikiem, w ten sposób tworząc SCFV.
W przykładowym podejściu alternatywnym, DNA kodujące dwa FV można zligować z DNA kodującym łącznik, a uzyskaną trójskładnikową fuzję można bezpośrednio zligować ze znanym wektorem ekspresyjnym. DNA SCFV, wytworzone którąkolwiek ztych metod, mogą być eksprymowane w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych, w zależności od wybranego wektora.
Korzystne są przeciwciała monoklonalne i ich fragmenty, które wiążą się z VASP jako antygenem tylko wtedy, gdy VASP występuje w postaci fosforylowanej.
Szczególnie korzystne są ponadto przeciwciała monoklonalne i ich fragmenty, które wiążą się z VASP, bądź peptydami obejmującymi sekwencję peptydową wokół seryny 239 VASP, jako antygenem, tylko wtedy, gdy seryna w pozycji 239 jest fosforylowana (VASP z fosfoseryną w pozycji 239).
W opisie określenie VASP należy również rozumieć jako oznaczające pochodne VASP, to jest funkcjonalnie równoważne reszty, mutanty, fragmenty lub warianty VASP, np. VASP z fosfoseryną w pozycji 239, która jest dodatkowo fosforylowana w pozycji seryny 157 i/lub treoniny 278, a także np. mutanty glikozylacyjne i inne produkty modyfikacji kowalencyjnych i elementy strukturalne, które są ważne dla interakcji białko/białko.Wopisie określenie VASP obejmuje zarówno VASP ludzką, jak i VASP z innych gatunków, a zwłaszcza ssaków, takich jak szczur, mysz, królik, pies, świnia lub małpa.
Przeciwciała można wytwarzać znanymi sposobami, np. zgodnie z techniką opisaną przez Kohlera i Milsteina (Kohler i Milstein, Nature 256, 495, 1975). Zazwyczaj, jeśli pożądana jest specyficzność opartana stanie fosforylowania, indukuje się powstawanie przeciwciał przeciw fosforylowanym postaciom VASP. Wyizolowane przeciwciała można przeszukiwać stosując zwykłe metody sprawdzania specyficzności. Korzystnie indukuje się powstawanie przeciwciał przeciw peptydowym fragmentom VASP, które zawierają serynę 157, serynę 239 i/lub treoninę 278.
Długość antygenowego peptydu VASP nie jest ważna, pod warunkiem, że jest on zdolny do wywoływania odpowiedzi humoralnej. Typowe peptydy antygenowe mają długość mniejszą niż około aminokwasów. Pewne korzystne peptydy mają długość mniejszą niż około 20 aminokwasów. Naj239 korzystniejsze peptydy mają długość około 6-12 aminokwasów. Korzystne peptydy to KLRKVS239KQ
239 lub RKVS239KQE. Korzystnie peptyd jest fosforylowany w pozycji seryny 157, seryny 239 i/lub treoniny278. Peptydy można otrzymywać rekombinacyjnie. Zazwyczaj wytwarza się je drogą rozkładu proteolitycznego VASP, albo syntezy in vitro, oraz fosforylacji.
Korzystnesąponadtoprzeciwciałamonoklonalne,którewykazują wymienione powyżej właściwości iktóre można stosować wcytometrii przepływowej. Wymaga to, aby specyficzność nowych przeciwciał była zachowywana nawet wtedy, gdy antygen poddaje się warunkom, które mogą zmieniać jego konformację, czego należy oczekiwać na etapach utrwalania, które zazwyczaj stosuje się wcytometrii przepływowej. Nowe przeciwciała można np. badać pod względem ich przydatności do stosowania w cytometrii przepływowej po prostu przez ich sprawdzenie.
Szczególniekorzystnejestprzeciwciałomonoklonalne 16C2.
Nowe przeciwciała można wytwarzać stosując metody, które są znane fachowcom.
W szczególności odnośnie wytwarzania przeciwciał monoklonalnych można wymienić wytwarzanie komórek hybrydom z zastosowaniem techniki opisanej przez Kohlera iMilsteina (Kohler iMilstein,
Nature 256, 495, 1975). Specyficzność oczyszczonych przeciwciał można sprawdzać np. stosując poniższe metody testowe.
PL 195 985 B1
a) Western blotting z użyciem zrekombinowanej VASP, którą w różnym stopniu fosforylowano kinazą białkową zależną od cAMP lub zależną od cGMP, w związku z czym musi być tylko możliwe obserwowanie dodatniego sygnału pochodzącego od fosforylowanej VASP.
b) Western blotting z użyciem ekstraktów komórek, np. komórek Pkt2, które stransfekowano ludzką VASP, bądź VASP, którą mutowano w różny sposób i w której w każdym przypadku zmutowano i wten sposób wyeliminowano jedno z trzech miejsc fosforylacji (S157A) VASP, (S239A) VASP i (T278A) VASP, oraz, w każdym przypadku, ludzką kinazą białkową zależną od cGMP. Odpowiednie są te przeciwciała, w których dodatnie sygnały na błotach Western zostały wyeliminowane przez mutację S239A, ale nie przez pozostałe dwie mutacje.
c) Western blotting z użyciem ludzkich trombocytów, które poddano działaniu różnych czynników rozszerzających naczynia (np. prostacykliny lub donorów NO), bądź aktywatorów kinazy białkowej zależnej od cAMP lub kinazy białkowej zależnej od cGMP. Przeciwciało jest wtedy odpowiednie, jeśli w ekstrakcie wykrywa się tylko specyficzny prążek fosforylowanej VASP. Przeciwciała można również przeszukiwać w analogiczny sposób stosując fibroblasty ludzkie, a także trombocyty szczurze i mysie.
d) Badania immunofluorescencyjne z użyciem utrwalonych ludzkich trombocytów i komórek śródbłonkowych. Dodatni sygnał obserwuje się, gdy VASP występuje w postaci fosfoproteiny.
Uzyskano linię komórek hybrydom, które wytwarzają nowe przeciwciała monoklonalne, w szczególności linię komórek hybrydom 16C2 wytwarzających przeciwciało monoklonalne 16C2, które jest szczególnie korzystne.
Linię komórek hybrydom 16C2 wytwarzających przeciwciało monoklonalne 16C2, zdeponowano 6 listopada 1997 r. w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (niemiecka kolekcja mikroorganizmów i hodowli komórkowych), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy, na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego pod następującym numerem: DSM ACC2330.
Nowe przeciwciała są odpowiednie do jakościowego i/lub ilościowego, korzystnie ilościowego, określania zarówno fosforylacji VASP, która zachodzi w warunkach in vitro, jak i tej, która zachodzi w warunkach in vivo, korzystnie do określania fosforylacji seryny 239 i/lub seryny 157 VASP, a zwłaszcza do określania fosforylacji seryny 239 VASP.
Ilościowe metody z zastosowaniem przeciwciał są dobrze znane i można je znaleźć, np. wCurrent Protocols in Immunology, powyżej. Należą do nich testy immunoenzymatyczne (ELISA), testy radioimmunologiczne (RIA) i podobne.
Nowe przeciwciała są ponadto odpowiednie do jakościowego i/lub ilościowego, korzystnie ilościowego, oznaczania w materiale biologicznym fosforylowanej VASP, korzystnie VASP z fosfoseryną w pozycji 239 i VASP z fosfoseryną w pozycji 157, szczególnie korzystnie VASP z fosfoseryną w pozycji 239.
Materiał biologiczny oznacza np. ekstrakty komórkowe, ekstrakty tkankowe, skrawki komórkowe, komórki tkanek i komórki, takie jak trombocyty, leukocyty, komórki śródbłonkowe, komórki mięśni gładkich i fibroblasty. Materiał biologiczny może pochodzić od ludzi albo od innych ssaków, takich jak szczur, mysz, królik, pies, świnia lub małpa. Korzystny jest materiał biologiczny pochodzenia ludzkiego.
Nowe przeciwciała można stosować do ilościowego oznaczania w materiale biologicznym fosforylowanej VASP, w szczególności VASP z fosfoseryną w pozycji 157 i/lub VASP z fosfoseryną w pozycji 239, poprzez ilościowe oszacowanie autoradiogramów blotów Western zgodnie z metodami znanymi fachowcom, np. z zastosowaniem programu NIH gel blotting Image 1.6, albo metodą immunofluorescencji.
Z uwagi na korelację, która istnieje pomiędzy fosforylacją seryny 239 i seryny 157 VASP a aktywnością kinaz białkowych zależnych od cGMP i/lub zależnych od cAMP, nowe przeciwciała są również odpowiednie do stosowania jako środki do diagnozowania szlaków sygnałów cGMP i szlaków sygnałów cAMP, w szczególności do diagnozowania szlaków sygnałów cGMP.
Zastosowanie nowych przeciwciał do oznaczania VASP z fosfoseryną w pozycji 239 w materiale biologicznym metodami Western blotting i immunofluorescencji umożliwia również opracowanie metod diagnostycznych do wykrywania substancji, hormonów lub leków zwiększających poziom cGMP. Przykładami, które można wymienić, są ANF, guanylina, substancje lub leki uwalniające NO. Przykładowo można monitorować przebieg choroby i terapię donorami NO, co, między innymi, dostarcza informacje dotyczące mogącego się rozwinąć zjawiska tolerancji na azotany.
PL 195 985 B1
Z uwagi na korelację, jaka istnieje pomiędzy fosforylacją seryny 157 VASP a aktywnością kinaz białkowych zależnych od cAMP, nowe przeciwciała można również stosować jako środki do diagnozowania substancji, hormonów i leków zwiększających poziom cAMP.
Można zatem również stosować nowe przeciwciała lub ich fragmenty w diagnostyce i/lub terapii.
Nowe sposoby diagnostyczne są sposobami, które można stosować w laboratorium, poza organizmem człowieka (ex vivo).
Nowe przeciwciała można stosować do określania stopnia fosforylacji VASP w materiale biologicznym, który pochodzi z różnych gatunków. Przykładowo można wymienić człowieka, szczura, mysz, królika, psa, świnię lub małpę. Korzystnie stosuje się nowe przeciwciała do oznaczania fosforylowanej VASP w materiale biologicznym pochodzącym od człowieka, szczura, myszy lub psa. Szczególnie korzystnie stosuje się nowe przeciwciała do oznaczania fosforylowanej VASP w materiale biologicznym pochodzącym od człowieka.
Nowe przeciwciała lub ich fragmenty można również stosować w czujnikach biologicznych. Czujniki biologiczne są znane fachowcom. Szczególnie korzystny jest sposób, w którym stosuje się drugi składnik pary ulegającej specyficznemu wiązaniu, taki jak przeciwciało, lektyna lub receptor. Wtym przypadku, wcelu wykrywania i oceny ilościowej, jeden ze składników pary ulegającej specyficznemu wiązaniu może zawierać wykrywalny znacznik. Znaczniki te znane są fachowcom imogą nimi być, np. chromofor, luminofor, fluorofor, enzym, izotop promieniotwórczy lub barwna bądź bezbarwna cząstka. Korzystny jest sposób, w którym nieznakowany składnik pary ulegającej specyficznemu wiązaniu sprzęga się bezpośrednio lub pośrednio, np. poprzez inne przeciwciało lub mostek biotyna/awidyna, z fazą stałą, metodami znanymi fachowcom.
Nowe przeciwciała lub ich fragmenty można również znakować promieniotwórczo metodami znanymi fachowcom, tak że można je stosować do immunoscyntygrafii albo do immunoterapii. Ponadto te przeciwciała monoklonalne można stosować jako nośniki związków aktywnych i wykorzystywać do leczenia chorób, które są wywoływane zaburzeniami czynności śródbłonka.
Po analizie całej sekwencji nukleotydowej genów V przeciwciała monoklonalnego 16C2, technicznie możliwe jest również wytworzenie konstruktów przeciwciała przez np. wstawienie regionów hiperzmiennych do szkieletu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego (Jones i in., Nature 321, 522-525, 1986; Verhoyen i in., Science 239, 1534-1536, 1988).
Korzystne jest ilościowe oznaczanie związanego z antygenem przeciwciała w płytkach krwi metodą cytometrii przepływowej, np. prowadzonej z użyciem próbek pełnej krwi, które zostały, jeśli to było właściwe, utrwalone z zastosowaniem metod znanych fachowcom. Metody cytometrii przepływowej są znane fachowcom i można je przeprowadzać w sposób opisany np. wG. Otten i M.W. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19.
Określanie fosforylacji VASP metodą cytometrii przepływowej, w szczególności fosforylacji seryny 239 VASP, z użyciem nowych przeciwciał, nie ogranicza się do trombocytów ludzkich, i można ją również określać w przypadku innych rodzajów komórek, takich jak limfocyty, monocyty, leukocyty, komórki śródbłonkowe i komórki mięśni gładkich.
Zastosowanie cytometrii przepływowej do określania za pomocą nowych przeciwciał fosforylacji VASP, w szczególności VASP z fosfoseryną w pozycji 239, w świeżo pobranych ludzkich trombocytach, umożliwia oznaczanie ex vivo aktywności in vivo czynników śródbłonkowych, takich jak NO i prostacyklina, a zatem ocenę czynności śródbłonka lub zaburzeń czynności śródbłonka w zaburzeniach sercowo-naczyniowych, jakie występują np. w miażdżycy, nadciśnieniu, cukrzycy, niewydolności serca i niewydolności nerek.
Określanie za pomocą nowych przeciwciał fosforylacji VASP, w szczególności fosforylacji seryny 239 VASP, umożliwia kontrolowanie leczenia wymienionych powyżej chorób. Można również określać powstawanie oporności na leczenie, takiej jak tolerancja na azotany.
Nowe przeciwciała można również stosować jako środki terapeutyczne, ponieważ wpływają one wmaterialebiologicznym na stan fosforylacji VASP i/lub jej interakcję z białkami.
Można również stosować preparaty farmaceutyczne, zawierające co najmniej jedno z nowych przeciwciał.
Nowe preparaty można stosować dojelitowo (doustnie), pozajelitowo (dożylnie), doodbytniczo lub lokalnie (miejscowo). Można je podawać w postaci roztworów, proszków (tabletek lub kapsułek, wtym mikrokapsułek), preparatów liposomowych, kompleksów z lipidami, zawiesin koloidalnych, roztworów do iniekcji lub czopków. Substancjami pomocniczymi odpowiednimi do postaci tego rodzaju są
PL 195 985 B1 zwykle stosowanewfarmacji ciekłe lub stałe wypełniacze i rozcieńczalniki, rozpuszczalniki, emulgatory, środki poślizgowe, środki korygujące smak, barwniki i/lub substancje buforujące. Jako odpowiednią dawkę podaje się 0,1-100 mg/kg masy ciała. Podajesię je korzystnie wjednostkowych postaciach dawkowanych, zawierających co najmniej skuteczną dzienną ilość nowych przeciwciał, np.
30-3000 mg.
Dawka dzienna, którą się będzie podawać, zależy od masy i ciała, wieku, płci i stanu osobnika będącego ssakiem. Jednakże mogą być również wymagane wyższe lub niższe dawki dzienne. Dawkę dzienną można podawać albo jednorazowo w postaci pojedynczej jednostkowej postaci dawkowanej, albo w postaci kilku mniejszych jednostkowych postaciach dawkowanych, bądź kilkakrotnie, we wcześniej określonych odstępach, w postaci podzielonych dawek.
W celu wytwarzania preparatów farmaceutycznych, nowe przeciwciała można wprowadzać do terapeutycznie obojętnych zaróbek organicznych lub nieorganicznych. Przykładami takich zaróbek dla tabletek, powlekanych tabletek itwardych kapsułek żelatynowych są laktoza, skrobia kukurydziana ijej pochodne, łójikwas stearynowy lub jego sole. Zaróbkami odpowiednimi do wytwarzania roztworów są woda, poliole, sacharoza, cukier inwertowany i glukoza. Zaróbkami odpowiednimi do roztworów do iniekcji są woda, alkohole, poliole, gliceryna ioleje roślinne. Zaróbkami odpowiednimi do czopków są oleje roślinneioleje utwardzone, woski, tłuszcze i półstałe poliole. Preparaty farmaceutyczne mogą również zawierać środki konserwujące, rozpuszczalniki, środki stabilizujące, środki zwilżające, emulgatory, środki słodzące, barwniki, środki smakowo-zapachowe, sole do zmiany ciśnienia osmotycznego, bufory, środki powlekające, przeciwutleniacze i, jeśli jest to właściwe, inne związki terapeutycznie czynne.
Środki farmaceutyczne wytwarza się sposobem, w którym co najmniej jednemuznowych przeciwciał nadaje się postać odpowiednią do podawania razem z farmaceutycznie odpowiednią ifizjologicznie tolerowaną zaróbką oraz, jeśli jest to właściwe, innymi odpowiednimi związkami aktywnymi, dodatkamiisubstancjami pomocniczymi.
Diagnostyczny sposób określania fosforylacji VASP,korzystnie fosforylacji seryny 239 VASP, można realizować zużyciem innych specyficznych sond, takich jak przeciwciała poliklonalne, fragmenty SCFV lub inne syntetyczne lub zrekombinowane domeny białkowe, które specyficznie rozpoznają fosforylowane sekwencje w VASP, w szczególności w VASP z fosfoseryną w pozycji 239.
Ponadto diagnostyczny sposób określania fosforylacji seryny 157 i/lub fosforylacji treoniny 278 VASP, można realizować zużyciem specyficznych sond, takich jak przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, fragmenty SCFV lub inne syntetyczne lub zrekombinowane domeny białkowe, które specyficznie rozpoznają sekwencje wVASP zawierające fosforylowaną serynę 157 i/lub treoninę278.
Poprzez wiązanie z peptydami bogatymi wprolinę, takimi jak zyksyna lub winkulina, ijednoczesne wiązanie jej własnej domeny bogatejwaminokwas prolinę, z profiliną, VASP umożliwia tworzenie włókienkowej aktyny, przy czym VASP działa jako cząsteczka adaptorowa. Zakłócenie tej interakcji białko/białko może prowadzić do wadliwej agregacji trombocytów lub skurczu naczyń. Tak więc tworzenie mostków aktyna/miozyna jest warunkiem wstępnym, wymaganym dla skurczu np. mięśni gładkich. Stwierdzono, że fosforylacja VASP w pozycji seryny 157 skorelowana jest zhamowaniem receptora fibrynogenu, glikoproteiny Ilb/Illa (Horstrupiin., Eur. J. Biochem., 225, 21-27, 1994). Określanie fosforylacji VASPwpozycji seryny 157 umożliwia więc systematyczne poszukiwania substancji lub leków, które wpływają na oddziaływania VASP zjej wewnątrzkomórkowymi składnikami wiążącymiisą np. odpowiednie do leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego związanychzuszkodzeniem naczyń.
Szczególnie korzystne są rozwiązania opisane w przykładach realizacji.
Poniższeprzykładysłużądoobjaśnieniawynalazku.
Przykład 1
Izolowanie przeciwciała monoklonalnego przeciw VASP z fosfoseryną w pozycji 239
Peptyd fosforylowany ipeptyd niefosforylowany, zktórych oba obejmują sekwencję peptydu KLRKVS239KQ lubRKVS239KQE wokół seryny 239, syntetyzuje sięzużyciem syntezatora peptydów Applied Biosystems (model 431A) zgodnie z metodą chemiczną wykorzystującą Fmoc, która jest znana fachowcom.
Fosfoserynę wfosforylowanym peptydzie wprowadza się podczas syntezy peptydu stosując Fmoc-serynę [PO(Obzl)OH-OH] z Calbiochem. Peptydyobudowie potwierdzonej metodą spektrometrii
PL 195 985 B1 masowej oczyszcza się stosując chromatografię z odwróconymi fazami i kolumnę VYDAC 218TP (czystość > 98%).
Po aktywacji kwasem bromooctowym i estrem N-hydroksysukcynimidowym kwasu bromooctowego (Sigma), przygotowane wten sposób peptydy sprzęga się z tiolowaną KLH (hemocyjaniną skrzypłocza, nanoTools). Samice myszy Balb/c (6 tygodniowe) immunizuje się podskórnie 4 razy w odstępach 14 dni KLH-fosfopeptydem (10 mg/mysz) zawierającym kompletny adiuwant Freunda w pierwszej iniekcji i niekompletny adiuwant w3 kolejnych iniekcjach. Następnie (2 tygodnie później) myszy otrzymują iniekcje przypominające 10 mg immunogenu wPBS (soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami) w trzech kolejnych dniach. W 1 dzień po ostatniej iniekcji przypominającej myszy uśmierca się i usuwa się śledzionę. Komórki śledziony izoluje się i poddaje fuzji z nie wytwarzającymi przeciwciał komórkami szpiczaka (np. PAI-Zellen, J.W. Stocker i in. (1982) Res. Disclosure, 21713) stosując ustaloną metodologię Kohlera/Milsteina.
Do testowania komórek hybrydom pod względem ich zdolności do wydzielania przeciwciał przeciw VASP zfosfoseryną w pozycji 239 stosuje się różne metody przeszukiwania z użyciem fosforylowanego/niefosforylowanego peptydu, jak również fosforylowanej/niefosforylowanej zrekombinowanej ludzkiej VASP.
Do testu z użyciem fosforylowanego/nieufosforylowanego peptydu, peptydy te sprzęga się kowalencyjniez płytkami DNA-BIND-ELISA (z Costar) i supernatanty hybrydom przeszukuje się stosując metodę ELISA.
Supernatanty, które rozpoznają fosfopeptyd, dodatkowo sprawdza się pod względem ich zdolności do rozpoznawania w pełni fosforylowanej, zrekombinowanej (układ E. coli) ludzkiej VASP, ale nie odpowiedniej zdefosforylowanej VASP.
Przeciwciała monoklonalne z supernatantów komórek hybrydom, które zidentyfikowano opisanymi powyżej metodami jako dodatnie, można korzystnie oczyszczać zwolnych od surowicy hodowli komórekhybrydom metodątiofilowej chromatografii adsorpcyjnej (POROS 50-OH, nanoTools).
Stosując różne metody sprawdzania, można było zidentyfikować i scharakteryzować jedno z wyizolowanych przeciwciał (klon 16C2) jako mysie przeciwciało monoklonalne klasy IgG1k, które rozpoznaje VASP tylko, gdy białko to fosforylowane jest w pozycji seryny 239. W warunkach tych przeciwciało 16C2 nie rozpoznaje innych białek i innych miejsc fosforylacji VASP.
Przeciwciała monoklonalne, które specyficznie rozpoznają VASP z fosfoseryną w pozycji 157 lub VASPzfosfotreoninąwpozycji 278, można izolować sposobem analogicznym do opisanego powyżej, jako antygen zużyciem fosforylowanych peptydów, które obejmują odpowiednio znane sekwencje peptydowe wokół seryny 157 lub treoniny 278 białka VASP.
Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych rozpoznających VASP fosforylowaną wpozycji Ser239opisanorównieżwSmolenskii i n . , J . Bi o l . Ch e m . , 237, 32, 20029-20035 (1998) .
Przykład 2
Określanie fosforylacji seryny 239 VASP metodą cytometrii przepływowej
Określanie fosforylacji seryny 239 VASPwprzemywanych trombocytach ludzkich
Przygotowuje się trombocyty ludzkie i stymuluje się fosforylację VASP przez inkubację z substancjami naczyniowe czynnymi wopisany sposób (Eigenthaler i in., Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). Reakcję przerywa się przez utrwalanie formaldehydem ostężeniu końcowym około 3,5% wtemperaturze pokojowej wciągu 10 minut. Po (ewentualnej) procedurze przemywania, komórki permeabilizuje się z użyciem Tritonu X-100, a następnie przemywa. Wybarwianie osiąga się przez inkubację z odpowiednim przeciwciałem, które jest albo bezpośrednio znakowane fluorescencyjnie, albo wybarwione z użyciem drugiego przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie. Dogodnie wtym celu używa się 0,5-5 mg, korzystnie 1-2 mg na ml pierwszego przeciwciała. Przykładowo gdy jako pierwsze przeciwciało stosuje się przeciwciało monoklonalne 16C2, odpowiednie jest stężenie 1,7 mg/ml. Następnie określa się wiązanie przeciwciała 16C2 i analizuje wcytometrze przepływowym w sposób opisany np. wG. Otten i W.M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current ProtocolsinImmunology,5.4.1-5.4.19.
Przykład 3
Zastosowanie metody Western blotting do oznaczania fosforylacji seryny 239 VASP w ekstraktach komórkowych
Równolegle z cytometrią przepływową (przykład 2) stosuje się Western blotting do określania fosforylacji VASP w ekstraktach komórkowych metodami znanymi fachowcom i opisanymi np. wEigenthaler i in. (Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). Wskazane stężenie stosowanego
PL 195 985 B1 przeciwciała wynosi 0,1 - 5, korzystnie 0,5 - 1,0 mg/ml, zależnie od ilości VASP wbadanej próbce. Przykładowo dla trombocytów ludzkichitrombocytów szczurzych korzystne jest stosowanie 0,5 mg przeciwciała/ml, podczas gdy dla komórek śródbłonka ludzkiej pępowiny korzystne jest stosowanie 1,0 mg przeciwciała/ml. Wzasadzie analiza wcelu określania fosforylacji seryny 239 VASP wekstraktach komórkowych metodą Western blotting oraz metodą cytometrii przepływowej zużyciem utrwalonych komórek daje identyczne wyniki.
Przykład 4
Określanie fosforylacji seryny 239 VASPwpełnej krwi lub osoczu bogatymwpłytki krwi (PRP)
Pełną krew lub PRP inkubuje się z substancjami naczyniowo czynnymi i inkubację przerywa się przez utrwalanie formaldehydem o stężeniu końcowym około 3,5% w temperaturze pokojowej w ciągu minut. PRP przygotowuje się z pełnej krwi w sposób opisany wEigenthaler i in. (Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). Trombocyty wPRP osadza się przez odwirowanie i ponownie przeprowadza w stan zawiesiny w buforze fizjologicznym (Eigenthaler i in., 1 992, patrz powyżej). Trombocyty permeabilizuje się, a następnie wybarwia w sposób opisany powyżej dla przemywanych trombocytów.
Przykład 5
Przebieg czasowy stymulacji fosforylacji seryny 239 VASP w przemywanych trombocytach ludzkich po podziałaniu nitroprusydkiem sodu (SNP)
Trombocyty ludzkie poddano działaniu 100 mM SNP. Pobierano próbki komórek w czasie 0, 1, 3 i5 minut. Przeciwciało 16C2 zastosowano do określania fosforylacji seryny 239 równolegle drogą analizy ekstraktów pobranych próbek komórek metodą Western blotting oraz metodą cytometrii przepływowej przeprowadzonej zużyciem trombocytów ludzkich, które utrwalono i permeabilizowano wsposób opisany powyżej. Autoradiogramy blotów Western analizowano ilościowo z zastosowaniem programu NIH gel-blotting image 1.6.
Wzrost wiązania przeciwciało 1 6C2/VASP z fosfoseryną w pozycji 239 (% wzrost (wartość dla 5minuty = maksymalny wpływ = 100%))przedstawionowtabeli 1.
Tabela 1
t (min) Wzrost (%) Trombocyty Cytometria Ekstrakty komórkowe Western blotting
0 0 0
1 62,5 83,5
3 89,3 95,2
5 100,0 100,0
Przykład 6
Zastosowanie przeciwciała 16C2 do określania fosforylacji zrekombinowanej VASP przez kinazę białkową zależną od cAMP lub kinazę białkową zależną od cGMP
Oczyszczoną, zrekombinowaną VASP znakowaną heksahistydyną (25 mg/ml) sfosforylowano katalityczną podjednostką (11 mg/ml) kinazy białkowej zależnej od cAMP (cAPK) lub oczyszczoną kinazą białkową zależną od cGMP (cGPK; 24 mg/ml).
W określonym czasie pobierano próbki zmieszaniny reakcyjnej, natychmiast mieszano je zzawierającym SDS roztworem przerywającym reakcję, gotowano i frakcjonowano z zastosowaniem SDS-PAGE. Fosforylację VASP określano przez wybarwianie błękitem Coomassiego oraz metodą Western blotting z użyciem poliklonalnego przeciwciała przeciw VASP (M4, Halbrilgge M. i in., J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990), które można otrzymać z Alexis Corporation, Alte Hauensteinsh^e 4, CH-4448 Laufelfingen, Szwajcaria), albo monoklonalnego przeciwciała 16C2 przeciw VASP. Prążek poniżej prążka VASP przy wybarwianiu błękitem Coomassiego to cAPK, podczas gdy ten powyżej prążka VASP to cGMP-PK. Analiza metodą SDS-PAGE wykazała zmianę pod względem migracji VASPz46 do 50 kDAwwyniku fosforylacji seryny 157, którą preferencyjnie prowadzi cAPK. Fosforylację seryny 239 (wykrywaną przez przeciwciało 16C2)preferencyjnieprowadzicGMP-PK.
PL 195 985 B1
Przykład 7
Określanie fosforylacji transfekowanej VASP, zawierającej różne mutacje miejsc fosforylacji, w komórkach Ptk2
Fosforylację transfekowanej ludzkiej VASPimutantów VASP badanowkomórkach Ptk2. VASP typu dzikiegoimutantami VASP,zktórych każdy zawierał zmutowane (zinaktywowane) miejsca fosforylacji (zmiana seryny 157, seryny 238 lub treoniny 277), wraz z ludzką kinazą zależną od cGMP 1β, stransfekowano komórki Ptk2 i prowadzono ekspresję pod kontrolą promotora CMV. Komórki Ptk2 posiadały bardzo mało endogennego VASPikinazy białkowej zależnej od cGMP.Wdwa dni po transfekcji komórki inkubowanowciągu 30 minutz30 mM 8pCPT-cGMP,anastępnie wyizolowano ekstrakty komórkowe. Fosforylację VASP wtych ekstraktach komórkowych badano następnie na błotach Western z użyciem przeciwciała poliklonalnego M4 i przeciwciała monoklonalnego 16C2. Zależna od fosforylacji zmiana VASPz46 kDa na 50 kDa nie występowała, gdy zinaktywowano serynę 157(mutacja S157A). Sygnał rozpoznawany przez przeciwciało 16C2 nie występował, gdy zinaktywowano serynę 239 (S239A). W tych analizach VASP zawierająca mutację w pozycji treoniny 277 zachowywała się jak VASP typu dzikiego.
Przykład 8
Określanie fosforylacji VASPwtrombocytach ludzkich po stymulacji różnymi środkami rozszerzającymi naczyniaianalogami cAMP/cGMP
Przemytetrombocytyludzkie(0,7x109 komórek/ml) inkubowano z 1 mMPg-l2 (prostacykliną), 0,5 mM 5,6-DCl-cBIMPS (przenikającym przez błony analogiem cAMP), 10 mM SNP (nitroprusydkiem sodu) lub 1 mM8pCPTcGMP(przenikającymprzezbłonyanalogiemcGMP).Pookreślonym czasie pobierano próbki (2,8 x 107 komórek), mieszano je zroztworem przerywającym z SDS i gotowano, a następnie badano pod względem fosforylacji VASP metodą Western blotting. AnalizyprzeprowadzonozużyciemprzeciwciałapoliklonalnegoM4lubprzeciwciałamonoklonalnego16C2.Fosforylacjęseryny157określonoilościowona podstawieprzesunięciaprążkaVASPz46 do 50 kDa, podczas gdy fosforylację seryny 239 określono ilościowo na podstawie sygnału dawanegoprzezprzeciwciało16C2.
Przykład 9
FosforylacjaVASPwtrombocytachszczura
Trombocyty szczura (0,7 x 109 komórek/ml) inkubowanowciągu 5 minutz100 mM nitroprusydkiem sodu (SNP), z10 mM prostaglandyną E1 (PgE1) albo bez żadnegoztych dodatków. Ekstrakty tych trombocytów szczura analizowano metodą Western blotting. Blot wykazał, że zależne od fosforylacji przesunięcie VASP z46 kDa do 50 kDa (fosforylacja seryny 157) oraz zależny od fosforylacji sygnał, jaki daje przeciwciało 16C2 (fosforylacja seryny 239) miały także miejsce wtrombocytach szczura. Podobne wyniki uzyskano również z użyciem trombocytów myszy.
Przykład 10
Immunofluorescencyjne badania VASP ifosfo-VASP przeprowadzone z użyciem trombocytów ludzkich
Trombocyty ludzkie (w osoczu bogatym w płytki krwi, PRP) osadzono na szkiełku przedmiotowymiumożliwiono im przyłączanie i rozprzestrzenienie w ciągu 45 minut. Trombocyty te inkubowano następnie na szkiełku przedmiotowymwciągu 15 minut bez (AiC) lubz100 mM 8pCPTcGMP (BiD). Następnie komórki natychmiast utrwalono 4% paraformaldehydemipermabilizowanozużyciem 0,2% Tritonu X-100. Inkubowano je następniezprzeciwciałem poliklonalnym M4 (1:1000) lub przeciwciałem monoklonalnym 16C2,anastępnie zwykłymi drugimi przeciwciałami. Fotografie wykazują pojawianie się zależnego od fosforylacji sygnału, gdy stosuje się przeciwciało 16C2, podczas gdy sygnał dla przeciwciała poliklonalnego M4 (w immunofluorescencji suma VASP 46 kDai50 kDa, ponieważ nie występuje frakcjonowanie) jest niezależny od fosforylacji.

Claims (12)

1. Przeciwciało monoklonalne 16C2, wytwarzane przez linię komórek hybrydom o numerze dostępu DSM ACC 2330, lub jego fragment, zdolne do wiązania fosfoproteiny stymulowanej czynnikami rozszerzającymi naczynia (VASP) tylko wtedy, gdy VASP występuje w postaci fosforylowanej w pozycji seryny 239 (VASP z fosfoseryną w pozycji 239).
2. Zastosowanie przeciwciała 16C2 lub jego fragmentu, zdefiniowanego w zastrz. 1, jako środka diagnostycznego.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jakościowo i/lub ilościowo oznacza się VASP z fosfoseryną w pozycji 239 w materiale biologicznym.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że materiał biologiczny stanowią ludzkie trombocyty lub ludzka krew.
5. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, znamienne tym, że VASP z fosfoseryną w pozycji 239 oznacza się metodą Western blotting.
6. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, znamienne tym, że VASP z fosfoseryną w pozycji 239 oznacza się metodą cytometrii przepływowej.
7. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że wykrywa się substancje, które wpływają na poziom cGMP i/lub cAMP w materiale biologicznym.
8. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że określa się aktywność czynników śródbłonka in vivo.
9. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że wykrywa się zaburzenia czynności śródbłonka.
10. Linia komórek hybrydom DSM ACC 2330, wytwarzająca przeciwciało monoklonalne 16C2.
11. Zestaw diagnostyczny, znamienny tym, że zawiera przeciwciało 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1.
12. Sposób diagnostyczny in vitro, znamienny tym, że stosuje się przeciwciało 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1, do określania stanu fosforylacji VASP z fosfoseryną w pozycji 239 i/lub interakcji VASP z białkami w materiale biologicznym, albo do wpływania na stan fosforylacji VASP z fosfoseryną w pozycji 239 i/lub interakcję VASPz białkami w materiale biologicznym.
PL98340465A 1997-11-07 1998-11-06 Przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposóbdiagnostyczny in vitro PL195985B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19749091A DE19749091C1 (de) 1997-11-07 1997-11-07 Antikörper gegen phosphoryliertes VASP (Vasodilator-Stimuliertes Phosphoprotein), Hybridomzellen zu dessen Herstellung sowie dessen Anwendung
US7937598P 1998-03-26 1998-03-26
PCT/EP1998/007103 WO1999024473A1 (en) 1997-11-07 1998-11-06 Antibodies against phosphorylated vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL340465A1 PL340465A1 (en) 2001-02-12
PL195985B1 true PL195985B1 (pl) 2007-11-30

Family

ID=26041380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL98340465A PL195985B1 (pl) 1997-11-07 1998-11-06 Przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposóbdiagnostyczny in vitro

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6649421B1 (pl)
EP (1) EP1042368B1 (pl)
JP (1) JP5031140B2 (pl)
KR (1) KR100513418B1 (pl)
CN (1) CN1188426C (pl)
AT (1) ATE248189T1 (pl)
AU (1) AU753557B2 (pl)
BR (1) BR9813988A (pl)
CA (1) CA2308604C (pl)
CZ (1) CZ299889B6 (pl)
ES (1) ES2205593T3 (pl)
HU (1) HU222411B1 (pl)
PL (1) PL195985B1 (pl)
RU (1) RU2218178C2 (pl)
TR (1) TR200001265T2 (pl)
WO (1) WO1999024473A1 (pl)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10029210A1 (de) * 2000-06-14 2002-01-31 Vasopharm Biotech Gmbh & Co Kg Testsystem sowie dessen Verwendung
US7176037B2 (en) * 2000-07-13 2007-02-13 The Scripps Research Institute Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation
US6951947B2 (en) * 2000-07-13 2005-10-04 The Scripps Research Institute Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation
EP1182263A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-27 Evotec OAI AG Process for detecting threonine/serine kinase activity
US20030162230A1 (en) 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
WO2002050121A1 (fr) * 2000-12-13 2002-06-27 Taisho Pharmaceutical Co.,Ltd. Nouvel anticorps
CA2445420A1 (en) 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
US7619059B2 (en) 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
JP2007529718A (ja) * 2004-03-12 2007-10-25 ザ スクリップス リサーチ インスティチュート 蛋白質活性の検出および定量のための蛍光シグナル発光型生細胞バイオセンサー分子ならびに色素
CN103102411A (zh) * 2009-06-11 2013-05-15 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法
FR2946756A1 (fr) 2009-06-12 2010-12-17 Biocytex Dosage en sang total d'un biomarqueur intracellulaire appartenant a une voie de signalisation cellulaire- utilisation pour mesurer l'activation d'une population cellulaire determinee
EP3509613A4 (en) * 2016-09-07 2020-12-02 Vanderbilt University VASOACTIVE POLYPEPTIDE FOR THE RELAXATION OF SMOOTH MUSCLES
CN112730826A (zh) * 2020-12-23 2021-04-30 中南大学湘雅三医院 一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113238062B (zh) * 2021-07-13 2021-09-28 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法
CN114002440B (zh) * 2021-12-30 2022-04-01 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
CN120254291B (zh) * 2025-06-05 2025-10-17 中国质量检验检测科学研究院 一种检测非洲猪瘟病毒中和抗体的便携式免疫层析装置及其应用
CN120248113B (zh) * 2025-06-05 2025-12-02 北京赛斯维德生物科技有限公司 一种磷酸化VASP-Ser 239蛋白抗体及其应用
CN120271704B (zh) * 2025-06-05 2025-11-11 北京赛斯维德生物科技有限公司 一种识别vasp的抗体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993021230A1 (en) 1992-04-10 1993-10-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Activation-state-specific phosphoprotein immunodetection

Also Published As

Publication number Publication date
KR100513418B1 (ko) 2005-09-09
CZ299889B6 (cs) 2008-12-29
HUP0004099A3 (en) 2002-01-28
JP5031140B2 (ja) 2012-09-19
US6649421B1 (en) 2003-11-18
EP1042368B1 (en) 2003-08-27
PL340465A1 (en) 2001-02-12
BR9813988A (pt) 2000-09-26
HUP0004099A1 (en) 2001-03-28
JP2001522865A (ja) 2001-11-20
ES2205593T3 (es) 2004-05-01
WO1999024473A1 (en) 1999-05-20
CA2308604C (en) 2009-12-15
EP1042368A1 (en) 2000-10-11
HU222411B1 (hu) 2003-06-28
US20040063914A1 (en) 2004-04-01
TR200001265T2 (tr) 2000-09-21
AU1871299A (en) 1999-05-31
AU753557B2 (en) 2002-10-24
RU2218178C2 (ru) 2003-12-10
KR20010031830A (ko) 2001-04-16
ATE248189T1 (de) 2003-09-15
CA2308604A1 (en) 1999-05-20
CZ20001684A3 (cs) 2000-11-15
CN1279691A (zh) 2001-01-10
CN1188426C (zh) 2005-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6649421B1 (en) Antibodies against phoshorylated VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use
EP0267611B1 (en) Antibody against interleukin-1
EP0739488A1 (en) Antagonists to insulin receptor tyrosine kinase inhibitor
EP0673389A1 (en) Antibodies for gm-csf receptor and uses thereof
AU4286000A (en) Use of heparin-binding antagonists in the inhibition of bradykinin release
KR19990067153A (ko) 프로스타글란딘 디 신타아제에 특이적인 단일클론항체
KR940010021B1 (ko) 인체 심방의 나트륨 이뇨성 펩티드에 대한 모노클론 항체
DE69331585T2 (de) Monoklonaler antikörper spezifisch für das fk-506-bindende protein, methode zur bestimmung des gehaltes an fk-506-bindendem protein in einer probe und reagenzsatz dafür
US7541149B1 (en) Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP
EP1388543A2 (en) Antibodies against phosphorylated VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use
DK174151B1 (da) Monoklonalt antistof, hybridoma og reagens til immunoanalyse af alfa-hANP
MXPA00004331A (en) Antibodies against phosphorylated vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use
DE69817616T2 (de) Antikörper gegen vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridomzellen für deren gewinnung, und deren verwendung
US20080279856A1 (en) Inhibition of Bradykinin Release
US20030166568A1 (en) Organic compounds
JPH06153981A (ja) Ｌａｃｉの免疫学的測定方法、それに用いるキット並びにモノクローナル抗体
JPH08313524A (ja) トロンビンレセプター発現量または活性化量の測定方法
HK1033325A (en) Antibodies against phosphorylated vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use
JPWO1997016461A1 (ja) プロスタグランジンｄ合成酵素に特異的なモノクローナル抗体

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20101106