PL196076B1 - Bakteria atenuowana, szczepionka, bakteria do zastosowania, enterotoksyczna komórka E. Coli i zastosowanie bakterii - Google Patents

Bakteria atenuowana, szczepionka, bakteria do zastosowania, enterotoksyczna komórka E. Coli i zastosowanie bakterii

Info

Publication number
PL196076B1
PL196076B1 PL343246A PL34324699A PL196076B1 PL 196076 B1 PL196076 B1 PL 196076B1 PL 343246 A PL343246 A PL 343246A PL 34324699 A PL34324699 A PL 34324699A PL 196076 B1 PL196076 B1 PL 196076B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gly
ala
asp
bacterium
asn
Prior art date
Application number
PL343246A
Other languages
English (en)
Other versions
PL343246A1 (en
Inventor
Steven Neville Chatfield
Original Assignee
Peptide Therapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peptide Therapeutics Ltd filed Critical Peptide Therapeutics Ltd
Publication of PL343246A1 publication Critical patent/PL343246A1/xx
Publication of PL196076B1 publication Critical patent/PL196076B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/03—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

1. Bakteria atenuowana nieodwracalna mutacja knock-out w kazdym z genów, genie aroC, genie ompF i genie ompC, przy czym bakterie stanowi bakteria wybrana z rodzaju Escherichia, Sal- monella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella lub Brucella. 10. Szczepionka obejmujaca atenuowana bakterie i odpowiedni nosnik, znamienna tym, ze zawiera bakterie jak zdefiniowano w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik lub roz- puszczalnik. 12. Enterotoksygeniczna komórka E.coli jak zdefiniowano w zastrz. 3, do zastosowania w spo- sobie szczepienia ludzi lub zwierzat przeciwko biegunce. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest bakteria atenuowana, szczepionka, bakteria do zastosowania, enterotoksyczna komórka E. Colii zastosowanie bakterii.
Zasadą na której opiera się szczepienie jest indukcja odpowiedzi immunologicznej u gospodarza wten sposób dostarczając ochrony przeciwko obciążeniu patogenem. Można to osiągnąć przez zaszczepienie żywymi atenuowanymi szczepami tego patogenu, to znaczy szczepem posiadającym zredukowaną wirulencję takim, że nie powoduje on choroby wywoływanej przez patogen wirulentny.
Klasycznie wybiera się stosując jedną z dwóch różnych metod żywe atenuowane szczepy bakteryjne i wirusy. Wytwarzane także były mutanty albo przez traktowanie organizmu chemicznymi związkami mutagennymi lub przez powtarzanie pasaży tych organizmów in vitro. Jakkolwiek, zastosowanie tych metod daje wzrost szczepów atenuowanych, w których rodzaj atenuacji jest niejasny. Szczepy te są szczególnie trudne do scharakteryzowania w odniesieniu do możliwego powrotu do dzikiego typu szczepu, ponieważ atenuacja może dotyczyć pojedynczej (i łatwo odwracalnej) lub wielokrotnej mutacji. Ponadto trudno jest otrzymać szczepy, które posiadają optimum imunogenicznych właściwości, ponieważ występują zdarzenia wielokrotnych mutacji i szczepy z wielokrotną mutacją mogą być potrzebne do zastosowania do dostarczenia ochrony przeciwko patogenowi.
Stosując nowoczesną technikę genetyczną można obecnie skonstruować genetycznie zdefiniowane atenuowane bakteryjne szczepy, w których można wytworzyć trwałe delecje atenuujące. Ilość miejsc ukierunkowanych mutacji Salmonella było wytworzonych stosując ten typ technologii (2, 4, 5, 9, 12, 16, 17, 18). Stwierdzono, że mutacje dużej ilości genów są atenuujące, włączając wto geny aroi(na przykład aroA, aroC, aroD i aroE), pur, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crpi phoP.
Mutanty aroA Salmonella zostały obecnie dobrze scharakteryzowane i wykazano, że są one doskonałymi żywymi szczepionkami przeciwko salmonellozie dla wielu gatunków zwierząt. Ponadto wcelu zmniejszenia możliwości powrotu do wirulencji przez zajście rekombinacji mutacje były wprowadzane do dwóch niezależnych genów, takich jak aroA/purA i aroA/aroC. Identyczne mutacje u zaadaptowanych szczepów gospodarza Salmonella, takich jak S.typhi (człowiek) i S.dublin (bydło) dawało w rezultacie wytworzenie wielu pojedynczych kandydatów dawki szczepionki, która udowodniła swoje powodzenie w klinice (8,11)i w leczeniu (10).
Szczep Salmonella typhimurium zawierający trwałe mutacje wompC i ompF jest opisany w Chatfield iwsp. (1991) (odnośnik 21). Kiedy był podawany doustnie myszą BALB/c szczep był atenuowany, z50% dawką letalną (LD50) zredukowaną około 1000-krotnie. Jednak przy podawaniu dożylnym LD50 było zredukowane tylko około 10-krotnie wykazując znaczenie poryn w zapewnieniu bakteriom zdolność infekowania drogą doustną.
Ekspresja genów ompC i ompF regulowana jest przez ompR. Pickard iwsp. (1994, odnośnik 13) opisują klonowanie operonu onpB, zawierającego geny ompR i envZ, z banku kosmidu Salmonella typhi Ty2 i charakterystykę za pomocą analizy sekwencji DNA. Dane dotyczące sekwencji DNA stosowano wcelu zidentyfikowania odpowiednich miejsc restrykcji do wygenerowania określonych delecji o517 bp wewnątrz otwartej ramki odczytu genu ompR. Delecję wprowadzono na drodze rekombinacji homologicznej do chromosomów dwóch szczepów S.typhi, które już zawierały określone delecje w genach aroC i aroD. Mutanty onpR S.typhi ujawniały znaczny spadek ekspresji poryn wompC i ompF, jak przedstawiono w badaniu zewnętrznej błony preparatów. Wykazano także, że dwuskładnikowy układ regulujący ompR envZ gra ważną rolę w regulacji syntezy polisacharydu Vi w S.typhi.
W badaniach na zwierzętach stosowano atenuowaną S.typhimurium jako nośnik do dostarczania heterologicznych antygenów do układu immunologicznego (3, 6, 15). Daje to potencjalny rozwój multiwalentnych szczepionek do zastosowania u ludzi (7).
Tak więc przedmiotem wynalazku jest bakteria atenuowana nieodwracalną mutacją knock-out w każdym z genów, genie aroC, genie ompF i genie ompC, przy czym bakterię stanowi bakteria wybrana z rodzaju Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella lub Brucella.
Korzystnie, bakterię według wynalazku stanowi szczep Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella enteriditis, Salmonella choleraesuis, Salmonella dublin, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia enterocolitica, Bordetella pertussis lub Brucella abortus.
Bardziej korzystnie bakterią jest szczep enterotoksygeniczny E.coli (ETEC).
PL 196 076 B1
Bakteria według wynalazku jest ponadto atenuowana mutacją w czterech genach, którymi bardziej korzystnie są aroA, aroD, aroE, pur, htrA, galE, cya, crp, phoP lub surA.
W dalszym korzystnym wariancie mutacja w każdym genie jest mutacją wyznaczoną, a w jeszcze innym wariancie mutacja w każdym genie jest delecją całej sekwencji kodującej.
Bakteria według wynalazku, została genetycznie zmodyfikowana w celu ekspresji antygenu heterologicznego, przy czym korzystnie ekspresja antygenu jest prowadzona promotorem nirB lub promotorem htrA.
Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka obejmująca atenuowana bakterię i odpowiedni nośnik, charakteryzująca się tym, że zawiera bakterię atenuowaną nieodwracalną mutacją knock-out w każdym z genów, genie aroC, genie ompF i genie ompC, przy czym bakterię stanowi bakteria wybrana z rodzaju Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella lub Brucella oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozpuszczalnik.
Przedmiotem wynalazku jest także bakteria, jak zdefiniowano powyżej, do stosowania w sposobie szczepienia ludzi lub zwierząt.
Przedmiotem wynalazku jest również enterotoksygeniczna komórka E.coli jak zdefiniowano powyżej do stosowania w sposobie szczepienia ludzi lub zwierząt przeciwko biegunce.
Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bakterii atenuowanej nieodwracalną mutacją knock-out w każdym z genów, genie aroC, genie ompF i genie ompC, przy czym bakterię stanowi bakteria wybrana z rodzaju Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella lub Brucella, do wytwarzania leku do szczepienia ludzi lub zwierząt.
Wynalazek dostarcza atenuowanej bakterii na drodze nieodwracalnej mutacji w każdym zgenów aroC, ompF i ompC. Wynalazek dostarcza także szczepionki dostarczającej tą bakterię.
Uważa się, że połączenie mutacji aroC/ompF/ompC daje szczepionkę posiadającą najlepsze właściwości. Na przykład uważa się, że połączenie aroC/ompF/ompC może przewyższać połączenie aroC/ompR z dwóch powodów:
1. Mutacja ompR może powodować wyższy poziom atenuacji niż połączenie mutacji ompF/ompC, ponieważ ompR może regulować wiele genów innych niż ompF i ompC, które są ważne dla przeżycia bakterii in vivo. Dlatego zatem połączenie ompF/ompC może pozwalać bakterii na przeżycie w zaszczepionym gospodarzu przez dłuższy czas i na wyższym poziomie dając lepszą ochronę.
2. Mutacja ompR może powodować redukcję immunogeniczności w porównaniu do połączenia mutacji ompF/ompC, ponieważ ompR może regulować ekspresję antygenów ważnych dla immunogeniczności.
Bakterie, które są użyteczne do wytworzenia szczepionki według wynalazku są generalnie takimi, które zakażają drogą doustną. Bakterie te mogą być tymi, które dokonują inwazji i rosną wkomórkach eukariotycznych i/lub kolonizują powierzchnie błon śluzowych. Bakterie te generalnie należą do bakterii Gram-ujemnych.
Bakterie mogą być z rodzaju Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella lub Brucella. Przykładami takich bakterii są Escherichia coli - przyczyna biegunki u ludzi; Salmonella typhimurium - przyczyna salmonellozy u wielu gatunków zwierząt; Salmonella typhi -przyczyna duru u ludzi; Salmonella enteriditis - przyczyna zatrucia żywnością u ludzi; Salmonella choleraesuis - przyczyna salmonellozy u świń; i Salmonella dublin - przyczyna zarówno układowej jak i biegunkowej u bydła; zwłaszcza u nowo urodzonych cieląt; Haemophilus influenza - przyczyna zapalenia opon; Neisseria gonorrohoeae - przyczyna rzeżączki; Yersinia enterocolitica - przyczyna zespołu chorób u ludzi od zapalenia żołądka i jelit do śmiertelnej choroby posocznicy; Bordetella pertussis - przyczyna kokluszu; i Brucella abortus - przyczyna poronień i bezpłodności u bydła i stanów znanych jako gorączka falująca u ludzi.
Szczepy E.coli i Salmonella są szczególnie użyteczne w wynalazku. O ile Salmonella może być stosowana jako szczepionka przeciwko infekcjom Salmonella zgodnie ze swoimi właściwościami, to atenuowana Salmonella podawana doustnie może być stosowana jako nośnik heterologicznych antygenów z jednego organizmu do układu immunologicznego drogą doustną. Salmonella jest silnym immunogenem ijest zdolna do stymulowania układowej i miejscowej odpowiedzi komórkowej jak też odpowiedzi w postaci przeciwciała. Układy do kierowania ekspresją heterologicznych antygenów Salmonella in vivo są znane; na przykład promotory nirB i htrA są znane jako skuteczne czynniki kierujące ekspresją antygenu in vivo.
Wynalazek może być zastosowany w stosunku do E.coli („ETEC”) powodującej toksemię jelitową. ETEC jest klasą E.coli, która powoduje biegunkę. Kolonizują one proksymalne jelito cienkie. Standardowym szczepem ETEC jest szczep o numerze ATCC H10407.
PL 196 076 B1
Zakażenia przez ETEC są jedną z najczęstszych przyczyn biegunki podróżnej powodującej 3-9 milionów przypadków na rok spośród odwiedzających kraje rozwijające się. W endemicznych miejscach zakażenia ETEC są ważną przyczyną biegunki odwadniającej u niemowląt i małych dzieci, dając w skali całego świata 800000 zgonów na rok, poniżej piątego roku życia. W krajach rozwijających się przypadki zakażenia ETEC prowadzące do chorób klinicznych spadają z wiekiem, wskazując, że odporność na infekcje ETEC może być osiągnięta. W przeciwieństwie do tego, ludzie z krajów uprzemysłowionych, którzy odwiedzają tereny endemiczne są bardzo wrażliwi na zakażenia ETEC. Jakkolwiek, wraz z przedłużającymi się lub powtarzającymi wizytami na terenach endemicznych wrażliwość na zakażenia ETEC zmniejsza się sugerując, że zastosowanie atenuowanego ETEC w szczepionce może dać dobre wyniki.
Twórcy wybrali do pracy nietoksygeniczny szczep ETEC nazwany E1392/75/2A. E1392/75/2A pojawił się spontanicznie z toksycznego mutanta przez delecje genów toksyczności. W badaniach u ludzi szczepienie doustne żywym szczepem E1392/75/2A dawało 75% ochrony przed zakażeniem wyrażającym toksynę ETEC z innego serotypu. Jednakże, jako efekt uboczny szczepionki, u około 15% zaszczepionych pojawiła się biegunka. Zatem, szczep ten wymaga atenuacji do zredukowania efektu ubocznego zanim będzie można go uznać za potencjalną szczepionkę; i wynalazek dostarcza środków do osiągnięcia takiej atenuacji.
SEQ ID nr 1 pokazuje sekwencje genu aroC w E.coli, SEQ IDnr3 pokazuje sekwencje genu ompC w E.coli i SEQ IDnr5 pokazuje sekwencje genu ompF w E.coli.
W celu utworzenia szczepów zawierających mutacje dodatkowe w stosunku do aroC, ompC iompF do bakterii według wynalazku można wprowadzić jedną lub więcej dalszych mutacji. Takie dodatkowe mutacje mogą być (i) atenuującymi mutacjami w genie innym niż aroC, ompC i ompF, (ii) mutacją dostarczającą in vivo selekcji komórek utrzymujących plazmid (na przykład plazmid z ekspresją heterologicznego antygenu), lub (iii) mutacją zapobiegającą ekspresji genu toksycznego.
Następną atenuującą mutacją może być mutacja, o której już wiadomo, że była atenuującą. Takie mutacje obejmują mutacje w genie aro (na przykład aroA, aroD i aroE), pur, htrA, ompR, galE, cya, crp, phoP i surA (patrz na przykład odnośnik 2, 4, 5, 9, 12, 13, 16, 17i18).
Mutacja dostarczająca selekcji utrzymywanego plazmidu może być wykonana poprzez mutowanie genu, który jest zasadniczy dla przeżycia bakterii. Plazmid niosący ten zasadniczy gen jest następnie wprowadzany do tej bakterii, w ten sposób jedynie komórki niosące ten plazmid mogą przeżyć. Może być użyteczne wtedy gdy plazmid zawiera, na przykład heterologiczny antygen, który ulega ekspresji bakterii.
W celu zapobieżenia ekspresji genu toksycznego można wykonać mutację dla zredukowania jakiegokolwiek efektu ubocznego spowodowanego przez szczepienie tą bakterią. Na przykład, w przypadku szczepienia szczepem E.coli, takim jak ETEC pożądanym może być zmutowanie genów ciepłochwiejnej toksyny (LT) lub ciepłostałej toksyny (ST) w taki sposób, że nie ulegają one ekspresji.
Mutacje wprowadzane do szczepionki bakteryjnej generalnie pozbawiają całkowicie dany gen funkcji. Można to osiągnąć albo przez całkowite zniesienie syntezy jakiegoś polipeptydu z danego genu lub przez wykonanie mutacji, która powoduje syntezę peptydu niefunkcjonującego. W celu zniesienia syntezy peptydu albo cały gen, albo jego koniec 5' może być poddany delecji. Delecja lub insercja w obrębie sekwencji kodującej genu może być zastosowana w celu wykreowania genu, który syntetyzuje jedynie nie funkcjonujący polipeptyd (na przykład polipeptyd, który zawiera jedynie sekwencję N-końcową białka typu dzikiego). Mutacje te są mutacjami nieodwracalnymi. Są one mutacjami, które wykazują, gdy bakteria ta jest stosowana w szczepionce, zasadniczo brak powrotu do typu dzikiego. Takie mutacje obejmują insercję i delecję. Insercje i delecje są korzystnie duże, typowo o długości co najmniej 10 nukleotydów, na przykład od 10 do 600 nukleotydów. Korzystnie, cała sekwencja kodująca jest poddana delecji.
Zastosowana w szczepionce bakteria, korzystnie zawiera jedynie zdefiniowane mutacje, to znaczy mutacje, które są scharakteryzowane. Jest jasnym, że niepożądane jest zastosowanie jako szczepionka tej bakterii, która ma nie scharakteryzowane mutacje w swoim genomie, ponieważ istniało by ryzyko, że te nie scharakteryzowane mutacje mogą dostarczać tej bakterii takich własności, która mogłaby wywoływać niepożądany efekt uboczny.
Mutacje atenuujące mogą być wprowadzane sposobami dobrze znanymi fachowcom w danej dziedzinie (odnośnik 14). Odpowiednie metody obejmują, klonowanie sekwencji DNA dzikiego typu genu do wektora, na przykład plazmidu i wprowadzanie dającego się wyselekcjonować markera do klonowanej sekwencji DNA lub deletowanie części sekwencji DNA dające w wyniku jej dezaktywacji.
PL 196 076 B1
Delecja może być wprowadzana przez, na przykład cięcie sekwencji DNA stosując enzymy restrykcyjne, które tną w dwóch miejscach lub poza sekwencją kodującą i ligację razem dwóch końców pozostałej sekwencji. Plazmid niosący zinaktywowaną sekwencję DNA może być wprowadzany do bakterii znanymi technikami, takimi jak elektroporacja i koniugacja. Następnie, możliwe jest poprzez odpowiednie wyselekcjonowanie zidentyfikowanie mutanta, w którym ta zinaktywowana sekwencja DNA została zrekombinowana z chromosomem bakterii iten dziki typ sekwencji DNA staje się niefunkcjonalny na drodze rekombinacji homologicznej.
Ekspresja antygenów heterologicznych
Atenuowana bakteria według wynalazku może być genetycznie przebudowana wcelu wywołania ekspresji antygenu, który nie jest ekspresjonowany w bakterii natywnej („antygen heterologiczny”), tak więc bakteria atenuowana działa tu jako nośnik heterologicznego antygenu. Antygen może być z innego organizmu, wten sposób szczepionka dostarcza ochrony przeciwko temu innemu organizmowi. Wielowartościowa szczepionka może być wytwarzana nie tylko dostarczając odporności przeciwko wirulentnemu rodzicowi atenuowanej bakterii ale także dostarcza odporności przeciwko innym organizmom. Ponadto, atenuowana bakteria może być modyfikowana wcelu ekspresji więcej niż jednego heterologicznego antygenu, w którym to przypadku antygeny heterologiczne mogą być ztego samego lub z różnych organizmów.
Heterologicznym antygenem może być pełne białko lub część białka zawierającego epitop. Antygen może być z innej bakterii, wirusa, drożdży lub grzybów. Zwłaszcza, sekwencja antygenowa może pochodzić z E.coli (na przykład ETEC), tężca, wirusa zapalenia wątroby typu A, B lub C, ludzkiego wirusa nieżytu nosa takiego jak typu 2 lub typu 14, wirusa opryszczki zwykłej, wirusa zapalenia rogów przednich rdzenia typu 2 lub 3, wirusa pryszczycy, wirusa grypy, wirusa Coxackie lub Chlamydia trachomatis. Użyteczne antygeny obejmują nietoksyczne składniki ciepłochwiejnej toksyny E.coli, antygeny toksyny E.coli K88, antygeny czynnika kolonizacji ETEC, białko p.69 z B.pertusis i fragment C toksyny tężca.
Czynnik kolonizacji ETEC ijego składniki są pierwszymi kandydatami ekspresji jako antygeny heterologiczne. Wcelu wywołania choroby biegunkowej, szczepy patogeniczne ETEC muszą być zdolne do zasiedlenia jelita i wytworzenia enterotoksyn. Dla większości szczepów ETEC zidentyfikowano czynniki kolonizacji, które są wymagane do adhezji do błony śluzowej jelita. Prawie we wszystkich przypadkach CFs podlegają ekspresji jako fimbrie na zewnętrznej powierzchni bakterii. Duża ilość Cfs została zidentyfikowana jako należące głównie do CFAI, CRAII (łącznie CS1, CS2, CS3)i CFAIV (łącznie CS4, CS5, CS6).
Szczepionka dla ETEC będzie dostarczać idealnej ochrony przeciwko szeregowi antygenowych czynników kolonizacyjnych zapewniając ochronę przeciwko różnym szczepom. Aby to osiągnąć potrzebna byłaby ekspresja wielu czynników kolonizacyjnych w jednym szczepie. Alternatywnie, takie same atenuacje można by wykonać w zakresie różnych szczepów ETEC, każdy z innym czynnikiem kolonizacyjnym. To mogłoby wiązać się z delecją toksyn z takiego szczepu.
DNA kodujące antygen heterologiczny ulega ekspresji z promotora, który jest aktywny in vivo. Jak wykazano dwa promotory działają dobrze w Salmonella, są nimi promotor nirB (19, 20) i promotor htrA (20). W celu ekspresji antygenowego czynnika kolonizacji ETEC mogą być stosowano dzikie typy promotorów.
Konstrukt DNA zawierający promotor związany operacyjnie z DNA kodującym heterologiczny antygen może być wykonany i wprowadzony do atenuowanej bakterii stosując techniki konwencjonalne. Transformanty zawierające konstrukt DNA mogą być wyselekcjonowane na przykład w badaniach przesiewowych dla dającego się wyróżnić markera wtym konstrukcie. Bakteria zawierająca ten konstrukt może być hodowana in vitro przed uformowaniem jej do podawania do gospodarza w celach szczepienia.
Szczepionkę można opracowywać stosując znane techniki dla przygotowywania atenuowanych szczepionek bakteryjnych. Szczepionka jest korzystnie utworzona do podawania doustnego, na przykład w postaci okapsułkowanego liofilizatu. Takie kapsułki mogą być dostarczone w otoczce dojelitowej zawierającej, na przykład Eudragate, „S” (znak towarowy), Eudragate „L” (znak towarowy), octan celulozy, ftalan celulozy lub hydroksypropylometyloceluloza. Kapsułki te mogą być stosowane jako takie lub alternatywnie liofilizowany materiał może być odtworzony przed podaniem, na przykład jako zawiesina. Odtwarzanie korzystnie jest skuteczne w buforze o odpowiednim pH, zapewniającym żywotność tej bakterii. Wcelu zabezpieczenia atenuowanej bakterii i szczepionki przed kwasotą żołądka, przed każdym podaniem szczepionki, korzystnie podaje się preparat dwuwęglanu sodowego.
PL 196 076 B1
Alternatywnie szczepionka może być przygotowana do podawania dojelitowego, śródnosowego i domięśniowego.
Szczepionka może być stosowana w szczepieniu gospodarza ssaczego, zwłaszcza człowieka ale także gospodarza zwierzęcego. Infekcjom spowodowanym przez mikroorganizm, zwłaszcza przez patogen, można dlatego zapobiegać podając skuteczną dawkę szczepionki przygotowanej zgodnie z wynalazkiem. Zastosowane dawkowanie będzie ostatecznie sprawą lekarza klinicysty, ale będzie zależne od różnych czynników, włączając w to rozmiar i ciężar gospodarza oraz rodzaj wytworzonej szczepionki. Jednakże dla 70 kg, dorosłego gospodarza ludzkiego, dogodnym może być dawkowanie obejmujące podawanie doustne w ilości od 107 do 1011 bakterii na dawkę.
Krótki opis rysunków
Figura 1 pokazuje układ do konstruowania określonych delecji w genach docelowych przez rozszczepienie (splicing) na drodze mutagenezy z nałożoną przedłużoną PCR.
Figura 2 pokazuje spodziewane sekwencje genów docelowych po rekombinacji i selekcji delecji.
Figura 3 pokazuje klonowanie kasetek delecyjnych w plazmidzie pCVD442.
Figura 4 pokazuje analizę SDS-PAGE zewnętrznych błon przygotowanych ze szczepów ETEC w warunkach niskiej (pożywka-L bez soli) i wysokiej (pożywka-L bez soli + 15% sacharozy) osmolarności. M = markery; Próba 1 = PTL010; Próba 2 = PTL002; Próba 3 = PTL003; Próba 4 = DaroCDompC; Próba 5 = DompF.
Figura 5 pokazuje ekspresję CS1 i CS3 u szczepów z delecją po hodowli na agarze CFA. Równa liczba komórek z każdego szczepu była nakładana na żel SDS-PAGE 15% i poddawana analizie Western blotted z monospecyficznymi przeciwciałami poliklonalnymi anty-CS1 lub anty-CS3. Kontrolami dla specyficzności przeciwciała były lizaty z całych komórek TG1 z ekspresją większości białek fimbrii dla CS1, lub oczyszczone z CS3, główne białko fimbrii. Pasek M, tęcza markerów o niskiej masie cząsteczkowej; pasek 1, indukowane komórki TG1 zawierające pKK223; pasek 2, indukowane komórki TG1 zawierające pKKCs1; pasek 3, szczep CS1-ETEC; pasek 4, PTL010; pasek 5, PTL001; pasek 6, PTL002; pasek 7, PTL003; pasek 8, oczyszczone główne białko fimbrii CS3.
Figura 6 pokazuje Southern blot loci mutanta. Chromosomalny DNA był ekstrahowany z dzikiego typu ETEC (E1392/75-2A), PTL001 (htrA aroC), PTL002 (aroC ompR) i PTL003 (aroC ompC ompF) jak wykazano, trawiony endonukleazą restrykcyjną EcoRV i poddawane elektroforezie o pulsującym polu przez 1% agarozę. DNA filtrowano z żelu na membranach nylonowych Hybond N+ (Amersham) i hybrydyzowano z sondami DNA pochodzącymi z regionu aroC, htrA, ompR, ompC, lub ompF jak wykazano. Układ prążków jest zgodny z regionem mutanta, który był poddany delecji.
Figura 7 pokazuje odpowiedzi IgA u ochotników, którym podano szczepionkę według wynalazku.
P r zyk ł a d I
Budowa i charakterystyka szczepu według wynalazku
Projektowanie delecji i budowy plazmidów pCVDDAroC, pCVDDOmpC i pcVDDOmpF
Delecje były zaprojektowane w celu usunięcia całej otwartej ramki odczytu z genu docelowego. Stosując sekwencję genomową E.coli jako wzorca, startery PCG były zaprojektowane w celu wzmocnienia fragmentów o 500-600 par zasad flankujących docelową otwartą ramkę odczytu (patrz Tabela 1 dla sekwencji startera). Splicing przez wydłużenie pętli stosując PCG zastosowano w celu połączenia dwóch sekwencji flankujących, tworząc produkt PCG z delecją całego genu (Fig. 1). Dziki typ sekwencji otaczający miejsce delecji i przewidywana sekwencja po delecji są przedstawione na Fig. 2.
Dla każdego genu w rejon rozszczepienia wprowadzano dwa różne miejsca restrykcyjne (patrz Tabela 2 poniżej). Były one stosowane do identyfikacji klonów delecyjnych. Startery PCG przy każdym końcu fragmentu PCG wprowadzały unikalne miejsca restrykcyjne, które były stosowane w celu wklonowania tego fragmentu do miejsca klonowania wielokrotnego w pCVD442 (Fig. 3).
Produkty PCG były oczyszczane na żelu stosując zestaw do ekstrakcji żelowej Qiagen (znak towarowy) i trawione odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi przed ligacją do samobójczego plazmidu pCVD442 (22) trawionego tym samym enzymem i traktowanego alkaliczną fosfatazą dla zapobieżenia samoligacji wektora (Fig. 3). Mieszanka ligacyjna była przenoszona do SY327lpir i nakładana na płytki z L-Ampiciliną (100 mg/ml) Plazmidy z opornych na ampicilinę transformantów były badane na obecność kasetek delecyjnych poprzez trawienie restrykcyjne.
Wygenerowano następujące plazmidy:
pCVDDAroC pCVDDOmpC pcVDDOmpF
PL 196 076 B1
Samobójczy plazmid pCVD442 może replikować jedynie w komórkach niosących gen pir. Wprowadzony do szczepów non-pir pCVD442 nie jest zdolny do replikacji i oporność na ampicilinę nadawana przez ten plazmid, może być jedynie utrzymana jeżeli plazmid ten jest zintegrowany w chromosomie przez pojedynczą rekombinację homologiczną. Plazmid ten ma także gen sacB, kodujący polimeru b-D-fruktozy, która jest toksyczna dla Gram ujemnych bakterii w obecności sacharozy. Może on być stosowany do selekcji klonów, które uległy wtórnej rekombinacji, w których ten samobójczy plazmid jest usunięty. Komórki takie będą oporne na sacharozę ale będą wrażliwe na ampicilinę.
Konstrukcja i charakterystyka szczepu DAroCDOmpCDOmpF
Sekcja ta przedstawia w ogólnym zarysie chronologię konstruowania i historię szczepu DAroCDOmpCDOmpF. W sekcji tej „ETEC” dotyczy zwłaszcza szczepu E1392/75/2A lub jego pochodnych.
Delecyjny DAroCDOmpCDOmpF był wprowadzany do E1392/75/2A w następującym porządku:
DAroC DAroCDOmpC DAroCDOmpCDOmpF
Budowa ETECDAroC
1) E1392/75/2A z oryginalnego banku szczepów był nakładany na L-Agar.
2) Z tych komórek przygotowywano elektroporacyjnie kompetentne komórki. 100 ml porcje zamrażano.
3) pCVDDAroC oczyszczano z komórek SY327pir stosując midiprep Qiagen Qiafilter (znak towarowy). Plazmid był zatężany około 10-krotnie w precypitacji etanolowej. Budowa pCVDDAroC opisano poniżej.
4) 5 ml zatężonego plazmidu mieszano ze 100 ml odmrożonych komórek i wykonywano elektroporację. Wszystkie transformanty nakładano na płytki z L-Ampiciliną (50 mg/ml) i inkubowano przez noc w 37°C.
5) Wyhodowano pojedyncze oporne na ampicilinę kolonie.
6) Kolonie nakładano pasami na płytkę L-Ampicilinową (100 mg/ml) i hodowano przez noc w 37°C („płytka merodiploidalna”).
7) PCR przy zastosowaniu starterów TT19i TT20 (specyficzne dla genu aroC)i kolonie pobrane z płytki merodiploidu amplifikowano dwupasmowo, w rozmiarze odpowiadającym do tego jaki dawał szczep dziki i gen DaroC. Sekwencje starterów są przedstawione w Tabeli 1 poniżej.
8) Kolonie z płytki z merodiploidem były hodowane przez 7 godzin w a) pożywce z L-Ampiciliną (100 mg/ml)i b) w Pożywce-L. Kolonie wyhodowane na L-Ampicilinie były bankiem szczepów.
9) Kolejne rozcieńczenia hodowli w pożywce-L były umieszczane na:
a) L-agarze bez soli
b) L-agarze bez soli + 5% sacharoza.
Płytki inkubowano przez noc w 30°C.
10) Obliczenie kolonii wykazało, że więcej niż 104 kolonii wyrosło na L-agarze niż na L-agarze + 5% sacharoza wskazując, że sacharoza działała selekcyjnie.
11) Kolonie oporne na sacharozę były badane przesiewowe na obecność genu DAroC PCR-m. Kolonie wybrane do badania przesiewowego były nakładane na płytki L-agar i hodowane przez noc w 37°C. Płytka ta była przechowywana w 4°C aż do przeprowadzenia następnego testu.
12) Tylko 50% z 90 testowanych kolonii posiadało DAroC.
13) Kolonietestowano pod względem wzrostu na:
a) płytce zminimalną pożywką M-9
b) płytce zminimalną pożywką M-9 + Aromix
c) L-Amp (100 mg/ml)
Kolonie DAroC nie powinny rosnąć na minimalnej pożywce M-9 bez Aromix lub na L-Am p.
Aromix jest mieszanką następujących związków aromatycznych:
Substancja Stężenie końcowe (% w/v)
fenyloalanina 0,004
tryptofan 0,004
tyrozyna 0,004
kwas p-aminobenzoesowy 0,001
kwas dihydroksybenzoesowy 0,001
PL 196 076 B1
Związki te są wytwarzane w bakterii typu dzikiego, lecz mutacja aroC zapobiega ich syntezie.
14) Domniemane 13/14 kolonie DAroC wymagały Aromix do wzrostu na pożywce minimalnej M-9 i były wrażliwe na ampicilinę.
15) Testowano 3 kolonie (nr 1, 2, 3) na obecność genu głównego białka fimbrii CS1, metodą PCR, stosując startery MGR169 i MGR170. Wszystkie 3 kolonie dawały produkty PCR o spodziewanej wielkości (700 bp.). Sekwencje tych starterów pokazano w Tabeli 1.
16) Kolonie 1, 2 i 3 z badanej przesiewowe głównej płytki nanoszono pasmowo na L-agar i hodowano przez noc w 37°C. Komórki ztych płytek były stosowane do posiewu probówek z bankiem szczepu.
17) Kolonia 1, przechowywana w banku szczepu, stosowana była do dalszej pracy.
18) Dla stałego przechowywania, kroplą z tacy z bankiem szczepu posiewano 1 ml Pożywki-L, hodowano przez 4 godziny z mieszaniem w 37°C i stosowano do wykonania skosów agarowych, które były stosowane do wytworzenia liofilizowanych próbek zapasowych. Liofilizowane próbki E1392/75/2ADAroC oznaczano jako PTL004. 20 ml Pożywki-L dodawano do reszty 1 ml hodowli i hodowlę inkubowano przez noc w 30°C. 1 ml całonocnej hodowli przenoszono do każdego z trzech kriofiolek i przechowywano w ciekłym azocie.
Budowa ETECDAroCDOmpr
1) Przygotowywanie plazmidu DNA pCVDDOmpC dla elektroporacji:
Kolonia SY327lpir niosąca pCVDDOmpC była hodowana przez noc w 37°C w 100 ml pożywki L-Ampicilina (100 mg/ml). Plazmid DNA był oczyszczony stosując 2 midipreps Qiagen Qiafilter (znak towarowy). DNA było następnie zatężane przez precipitację etanolową. Konstrukcje pCVDDOmpC opisano poniżej.
2) Przygotowanie komórek elektrokompetentnych:
Komórki pCVDDAroC z tacy banku szczepu, wytworzone w etapie 17 w poprzedniej sekcji, były nakładane pasmami na L-agar, hodowane w 37°C przez noc i następnie przechowywane w 4°C nie więcej niż tydzień przed zastosowaniem do zaszczepienia hodowli do wytworzenia komórek elektrokompetentnych.
3) Na komórkach pCVDDAroC wykonano elektroporację za pomocą 5 ml stężonego DNA pCVDDOmpC, i wszystkie transformanty nakładano na pojedynczą płytkę L-Ampicilina (50 mg/ml) i hodowano przez noc w 37°C.
4) Otrzymano 17 opornych na ampicilinę kolonii (domniemane merodiploidy ETECDAroC/ /pCVDDOmpC).
5) Kolonie te nakraplano na wzorcową płytkę L-Ampicilina (100 mg/ml) i stosowano jako wzorce dla PCR ze starterami TT7/TT8. Wzorcową płytkę hodowano w temperaturze pokojowej przez sobotę i niedzielę. Sekwencje starterów są podane w Tabeli 1 poniżej.
6) Pojedyncza kolonia nr 8 posiadała gen DOmpC.
7) Kolonie hodowano przez 5 godzin w Pożywce-L.
8) Kolejne rozcieńczenia hodowli w Pożywce-L były umieszczane na:
a) L-agarze bez soli
b) L-agarze bez soli + 5% sacharoza.
Płytki inkubowano przez noc w 30°C.
9) Kolonie liczono wskazując, że więcej niż 104 kolonii wyrosło na L-agarze niż na L-agarze + 5% sacharoza pokazując, że sacharoza działała selekcyjnie.
10) 45 opornych na sacharozę kolonii badano przesiewowe na obecność DompC za pomocą PCR stosując startery TT7 i TT8. Gen DompC posiadało 9 kolonii, lecz większość posiadała ślady w. t. genu ompC. Sekwencje tych starterów podane są w tabeli poniżej.
11) W celu dalszego scharakteryzowania domniemanych kolonii ETECDAroCOmpC hodowano jew 1 ml Pożywki-L przez 5 godzin i nakładano na:
a) L-Agar + 100 mg/ml Ampiciliny
b) L-Agar
c) L-Agar + 5% sacharoza
Kolonie DOmpC powinny być oporne na sacharozę i wrażliwe na ampicilinę.
12) Tylko kolonia (nr 1) była wrażliwa na ampicilinę i oporna na sacharozę.
13) Kolonia 1 była sprawdzana na obecność genów DaroC, DompC i CS1 za pomocą PCR z starterami TT19/TT20, TT7/TT8 i MGR169 i 170. Sekwencje tych starterów są przedstawione w Tabeli 1 poniżej.
PL 196 076 B1
14) Kolonia 1 dawała pojedynczy produkt PCR o spodziewanej wielkości dla genów DaroC, DompC i CS1.
15) Kolonie były przechowywane jako bank szczepu
16) Dla stałego przechowywania, kroplą z tacy z banku szczepu posiewano 1ml Pożywki-L, hodowano przez 4 godziny z mieszaniem w 37°C i stosowano do wykonania skosów agarowych, które były liofilizowane. Liofilizowane próbki E1392/75/2ADAroCDOmpC oznaczano jako PTL008. 20 ml Pożywki-L dodawano do reszty 1ml hodowli i hodowlę inkubowano przez noc w 30°C. 1ml całonocnej hodowli przenoszono do każdej z trzech kriofiolek i przechowywano w ciekłym azocie.
Budowa ETECDAroCDOmpCDOmpF
W celu wprowadzenia pCVD D OmpF do E1392/75/2ADAroCD OmpC zastosowano konjugację.
1) Donorowe komórki koniugacyjne SM10lpir transformowano za pomocą pCVDDOmpC. Budowa plazmidu pCVDDOmpC jest przedstawiona poniżej.
2) Komórki ETECDAroCDOmpC były koniugowane z komórkami SM10lpir/pCVDDOmpC. Plazmid pCVD442 obejmuje transferowe sekwencje ori, które pozwalają na przeniesienie ze szczepu dawcy zawierającego transferowane geny RP4 (na przykład SM10lpir) do szczepu biorcy (na przykład ETEC). Komórki ETECDaroCDompC i szczep E.coli SM10lpir niosące rekombinantowy
PcvdDompF był nakładany jako krzyżujące się prążki na płytki L-agar w celu pokrycia powierzchni 2 około 10 cm2. Płytki inkubowano w37°C w ciągu 20 godzin, następnie wyrosłą hodowlę zmywano stosując 4ml Pożywki-L i zawiesinę nakładano na agar McConkey'a (Difco) zawierający streptomycynę w ilości 20 mg ml-1 i ampicilinę w ilości 300 mg ml-1. Płytki inkubowano przez noc w37°C i otrzymane kolonie sprawdzano pod kątem merodiploidu za pomocą PCR stosując odpowiednie oligonukleotydy jako startery.
3) Domniemane transkonjuganty ETC badano przesiewowe. 10 kolonii pobierano z płytek agarowych McConey'a i hodowano przez noc na agarze L-Ampicilina (100 mg/ml). Obecność genu DOmpF sprawdzano za pomocą PCR z starterami TT1/TT2. Sekwencje tych starterów są podane w Tabeli 1 poniżej.
4) Kolonie hodowano przez 5 godzin w Pożywce-L.
5) Kolejne rozcieńczenia hodowli w Pożywce-L były umieszczane na: a) L-agarze bez soli b) L-agarze bez soli + 5% sacharoza.
Płytki inkubowano przez noc w 30°C.
5
6) Kolonie liczono wskazując, że więcej niż 105 kolonii wyrosło na L-agarze niż na L-agarze +5% sacharoza wskazując, że sacharoza działała selekcyjnie.
7) Kolonie oporne na sacharozę były badane przesiewowe dla genu DompF za pomocą PCR z starterami TT1/TT2. Sekwencje tych starterów są podane w Tabeli 1 poniżej. Przesiane kolonie hodowano przez noc na L-Agarze. 3 kolonie z 47 miały gen DompF bez oznak dzikiego typu genu ompF.
8) Dalsza charakterystyka domniemanych kolonii ETECDAroCDOmpCDOmpF, były one umieszczane na:
a) L-Agar + 100 mg/ml Ampiciliny b) L-Agar
c) L-Agar + 5% sacharoza
Kolonie DompF powinny być oporne na sacharozę i wrażliwe na ampicilinę.
9) Wszystkie trzy kolonie DompF były wrażliwe na ampicilinę i oporne na sacharozę.
10) Kolonie były bankiem szczepu i jedna kolonia była wybrana jako wzorzec.
11) Dla przechowywania ciągłego, kroplą z wzorca zaszczepiano 1ml Pożywki-L, hodowano przez 4 godziny z mieszaniem w 37°C i stosowano do wykonania skosów agarowych, które były liofilizowane. Liofilizowane próbki E1392/75/2ADaroCDompCDompF oznaczano jako PTL003. 20 ml Pożywki-L dodawano do reszty 1 ml hodowli i hodowlę inkubowano przez noc w 30°C. 1ml całonocnej hodowli przenoszono do każdej z trzech kriofiolek i przechowywano w ciekłym azocie.
Charakterystyka E1392/75/2ADAroCDOmpCDOmpF
1) Wymagania hodowlane:
Pobrane z wzorca komórki, wytworzone w etapie 10 poprzedniej sekcji, były nanoszone w postaci prążków na płytkę L-Agar. W tym samym czasie 8 ml Pożywki-L zaszczepiano dla preparatu chromosomalnego DNA do badania metodą Southern blots. Zarówno płytka jak i płynna hodowla rosły przez noc w 37°C.
PL 196 076 B1
Komórki z porośniętej płytki były zbierane i przenoszone do następujących pożywek gdzie rosły przez noc w 37°C.
Pożywka Wzrost
L-Amp nie
pożywka minimalna M9 nie
pożywka minimalna M9 + Aromix tak
M9 + sulfatiazol (100 mg/ml) nie
M9 + sulfatiazol (100 mg/ml) + Aromix tak
L-Agar + 50 mg/ml streptomycyny tak
L-Agar + 5% sacharozy tak
Jak spodziewano się, komórki były Amp wrażliwe. Komórki te były oporne na sacharozę, strep-
tomycynę i sulfatiazol lecz wymagały Aromix'u do wzrostu na pożywce minimalnej.
2) Badanie PTL003 za pomocą LPS:
a) Liofilizowaną fiolkę z PTL003 otworzono przez rozbicie. Hodowle zawieszono ponownie w Pożywce-L i nakładano na L-agar dla hodowli. Pewną ilość komórek zdrapywano i przechowywano w banku szczepu.
b) Większą ilość komórek zdrapywano i analizowano profil LPS. Nie stwierdzono widocznych różnic pomiędzy profilem LPS dla PTL003 a oryginalnym szczepem E1392/75/2A.
3) Potwierdzenie delecji metodą PCR:
a) Zdrapane komórki były pobrane z płytki wykonanej w punkcie 2a i naniesione pasmowo na L-Agar i hodowane przez noc.
b) Świeżo wyrosłe komórki stosowano w PCG z starterami, które flankują następujące geny: aroC, htrA, ompC, ompF, ompR.
c) Jak wykazano, PTL003 posiadał delecję w genach aroC, ompC i ompF, ale nie posiadał w htrA i ompR.
4) Analiza profilu białek błonowych zewnętrznych z PTL 003:
Frakcje białek błon zewnętrznych przygotowano ze szczepów PTL010 (E1392/75/2A) i szczepów delecyjnych PTL002 i PTL003. Badano także szczep z pojedynczą delecją ompF oraz szczep z delecją aroCi ompC. Szczepy rosły w warunkach niskiej osmolarności (Pożywka-L bez soli) i wysokiej osmolarności (Pożywka-L bez soli + 15% sacharozy). Zwykle białkowy produkt OmpF jest wyrażany przy niskiej osmolarności, podczas gdy, produkt OmpC jest wyrażany przy wysokiej osmolarności. Produkty OmpC iOmpF mają podobną ruchliwość elektroporetyczną. Zarówno przy wysokiej jak i niskiej osmolarności szczep PTL003 jest pozbawiony białek w regionie OmpC/OmpF kiedy porównuje się go z dzikim typem szczepu - E1392/75/2A lub ze szczepami delecyjnymi DAroCDOmpC lub DOmpF. Wyniki są przedstawione na Fig. 4.
5) Ekspresja fimbrii CS1 i CS3 na agarze CFA:
Ekspresja fimbrii CS1 i CS3 w szczepach delecyjnych została zbadana. Równe ilości (2 A600nm jednostek) szczepów bakteryjnych PTL010, PTL001, PTL002 i PTL003 rosnące przez noc w37°C na agarze CFA były poddane SDS PAGEi analizowane metodą Western blotting za pomocą monospecyficznych poliklonalnych przeciwciał przeciwko CS1 lub CS3. Fimbrie CS1i CS3 były wyrażane prawie jednakowo równo w czterech szczepach (Fig. 5).
CFAII negatywna pochodna w stosunku do E1392/75/2A była wytworzona i stosowana jako kontrola. Była ona wykonana przez specyficzne konserwowanie plazmidów kodujących CS ze szczepu E1392/75/2A ETEC. Krótki fragment DNA był amplifikowany zgenu cooB stosując PCR z oligonukleotydami CSA01 i CSA02 jako starterami i ligowany do wektora plazmidowego pGEM-T Easy (znak towarowy, Promega) zaprojektowanego do klonowania produktów PCR. Fragment ten subklonowano w pCVD442 z racji miejsc restrykcyjnych enzymów SalI i Sphl. Pochodna pCVD442-cooB była wprowadzona do szczepu E1392/75/2A ETEC na drodze koniugacji SM10lpir. Transkoniuganty oporne na ampicilinę są najprawdopodobniej wynikiem fuzji pochodnej pCVD442-cooB z plazmidem niosącym cooB. Takie transkoniuganty były następnie hodowane na L-agarze uzupełnionym 5% sacharozą w celu wyselekcjonowania pCVD442 z brakiem genu sacB. Otrzymane kolonie były testowane na wrażliwość na ampicilinę, i PCR-em stosując startery CSA001 i CSA002. Trzy kolonie E1392/75/2A były włączone jako kontrola pozytywna wte reakcje PCR. Dwie kolonie oporne na sacharozę, które nie dawały produktu w reakcji PCR były nanoszone pasmowo na świeży L-agar uzupełniony 5% sacharozą wcelu otrzymania czystych hodowli. Następnie hodowle te rosły na pożywce-L w37°C przez około 16 godzin i przechowywano je w banku szczepu w -70°C. Utratę plazmidu kodującego
PL 196 076 B1
CS1 potwierdzono analizą profili plazmidowych tych pochodnych stosując elektroforezę na żelu agarozowym. Potwierdzono, że dwie hodowle były CS1 negatywne, lecz wciąż były CS3+.
6) Southern blotting dla PTL003:
Struktura mutantów delecyjnych. Całkowite DNA ekstrahowane z hodowli trzech mutantów delecyjnych wyhodowanych z zapasów banku szczepów, trawiono endonukleazą restrykcyjną EcoRV i strawione DNA poddano elektroforezie na żelu agarozowym w pulsującym polu. DNA przenoszono metodą odciśnięcia z żeli na nylonowe błony Hybond N+ (znak towarowy) i hybrydyzowano z odpowiednią sondą DNA zgodnie z procedurami standardowymi. Wyniki (Fig. 6) wykazały, że hybrydyzujące chromosonalne fragmenty DNA tych mutantów są krótsze niż dzikich typów, zgodnie z mutacjami, które są delecyjne.
Potwierdzenie nieobecności ciepłostałych (ST) i ciepłochwiejnych (LT) genów toksyny w szczepie E1392/75/2A E.coli. Wtym celu geny ST i LT-AB stosowano jako sondy DNA przeciw całemu DNA z E1392/75/2A. Całkowite DNA z pozytywnego w stosunku do toksyny szczepu E1393/75 ETEC włączono jako kontrola pozytywna, podczas gdy z laboratoryjnego szczepu JM109 E. coli włączono jako negatywna. Błony, na których wykonano hybrydyzację trzymano pod HyperfilmECL (znak towarowy) przez 1 godzinę w celu otrzymania maksymalnej wielkości sygnału. Sondy przygotowywano stosując PCG zDNA plazmidowym wyekstrahowanym z E1392/75-2A jako wzorzec i z oligonukleotydami EST01 i EST02 jako starterami dla ST lub LT-R1 i LT-03 dla LT-AB. Nie stwierdzono znaczącej hybrydyzacji z całkowitym DNA stosując sondę LT-AB albo ST, pomimo otrzymania bardzo intensywnego sygnału kontroli pozytywnej całkowitego DNA.
Potwierdzenie nieobecności sekwencji pCVD442 z chromosomu mutantów delecyjnych. Plazmid pCVD442 znakowano i hybrydyzowano do całkowitego DNA z mutantów delecyjnych PTL001, PTL002 i PTL003 trawionych za pomocą EcoRV. Całkowite DNA z szczepu E1392/75-2A włączono jako kontrolę. Otrzymano złożony wzór hybrydyzujących fragmentów DNA. Jednak, nie stwierdzono tam znaczących różnic pomiędzy wzorem otrzymanym ztypu dzikiego i z mutantów, wskazując, że prawdopodobnie nie pozostawiono resztkowych sekwencji nukleotydowych pCVD442 w genomach tych mutantów. Złożony wzór fragmentów hybrydyzujących był najprawdopodobniej wynikiem hybrydyzowania sondy pCVD442 ze składnikami plazmidowego DNA szczepu E1392/75-2A i pochodnych mutanta.
Tabela 1 Startery PCR
Nazwa Cel Zastosowanie Sekwencje (5'-3')
1 2 3 4
TT1 ompF Starter A do klonowania ATC TGT TTG TTG AGC TCA GCA ATC TAT TTG CAA CC
TT2 ompF Starter B do klonowania TTT TTT GCC AGC ATG CCG GCA GCC ACG CGT AGT G
TT3 ompF Starter C do klonowania CTC GAG GCT TAG CTC TAT TTA TTA CCC TCA TGG
TT4 ompF Starter D do klonowania GAG CTA AGC CTC GAG TAA TAG CAC ACC TCT TTG
TT7 ompC Starter A do klonowania TTG CTG GAA AGT CGA CGG ATG TTA ATT ATT TGT G
TT8 ompC Starter B do klonowania GGC CAA AGC CGA GCT CAT TCA CCA GCG GCC CGA CG
TT9 ompC Starter C do klonowania GCT AAG CCT CGA GTA ATC TCG ATT GAT ATC CG
TT10 ompC Starter D do klonowania CTC GAG GCT TAG CGT TAT TAA CCC TCT GTT A
PL 196 076 B1 cd. tabeli 1
1 2 3 4
TT19 aroC Starter A do klonowania CCG CGC TCG CTC TAG AGT GAA CTG ATC AAC AAT A
TT20 aroC Starter B do klonowania ATG CGC GCG AGA GCT CAA CCA GCG TCG CAC TTT G
TT21 aroC Starter C do klonowania CTC GAG GCA TGC TGA ATA AAA CCG CGA TTG
TT22 aroC Starter D do klonowania GCA TGC CCT CGA GGG CTCC GTT ATT GTT GTG
MGR169 CS1 Wiązanie w sekwencji CS1 TGA TTC CCT TTG TTG CGA AGG CGA A
MGR170 CS1 Wiązanie w sekwencji CS1 ATT AAG ATA CCC AAG TAA TAC TCA A
LT-R1 LT-AB Patrz tekst GCT TTT AAA GGA TCC TAG TT
LT-03 LT-AB Patrz tekst GGT TAT CTT TCC GGA TTG TC
EST01 ST Patrz tekst CAT GTT CCG GAG GTA ATA TGA A
EST02 ST Patrz tekst AGT TCC CTT TAT ATT ATT AAT A
CSA01 CS1 Patrz tekst TGG AGT TTA TAT GAA ACT AA
CSA02 CS1 Patrz tekst TGA CTT AGT CAG GAT AAT TG
CS3-01 CS3 Patrz tekst ATA CTT ATT AAT AGG TCT TT
CS3-02 CS3 Patrz tekst TTG TCG AAG TAA TTG TTA TA
Tabel a 2
Gen docelowy Miejsca stosowane do klonowania w pCVD442 Miejsca wprowadzone dla celów skriningu
Miejsce 1 Miejsce 2 Miejsce 3 Miejsce 4
aroC Xbal SacI Xhol Sphl
htrA SalI Sphl Xhol Xbal
ompC SalI SacI Blpl Xhol
ompF SacI Sphl Blpl Xhol
omR SalI SacI Blpl Sphl
PL 196 076 B1
Przykład 2
Bezpieczeństwo i immunogeniczność atenuowanego szczepu szczepionki z enterotoksygenicznej E.coli (DaroC/DompC/DompF) u ochotników
Badania były zaprojektowane wcelu oceny kandydata żywego atenuowanego szczepu szczepionki z enterotoksygenicznej E.coli, nazwanego DaroC/DompC/DompF PTL003 opisanego powyżej.
Przygotowywanie serii posiewów szczepionki
Szczep bakteryjny nakładano na agar MacConkey'a dla czystości i potwierdzenia tożsamości, ido posiewu zastosowano 5 kolonii w kolbach zawierających 200 ml bulionu luria. Po 8 godzinach inkubacji w 37°C, 30 ml sterylnego glicerolu dodawano do bulionu hodowlanego i przygotowywano porcje próbek (1ml na fiolkę). Sto takich fiolek mrożono w -70°C. Fiolki te stanowiły serię posiewową dla szczepu szczepionki.
Czystość serii posiewowej była zapewniana przez wyselekcjonowanie dziesięciu przypadkowych fiolek i testowanie ich na czystość bakteryjną i nieobecność grzybów. Dodatkowe trzy fiolki testowano wcelu określenia liczby bakterii w fiolce stosując standartowe metody obliczania na płytce kolejnymi rozcieńczeniami pożywki hodowlanej.
Przygotowywanie szczepionki
Szczepionka była przygotowywana na świeżo przed każdym szczepieniem i wszystkie etapy przygotowywania posiewu prowadzono w komorze bezpieczeństwa. Dzień przed szczepieniem, na powierzchni płytek z agarem luria naniesiono 0,2 ml stosując sterylne bawełniane waciki wcelu przygotowania warstwy bakterii. Ten sam bulion hodowlany był nanoszony pasmowo na płytki agarowe MacConkey'a i luria dla czystości. Płytki agarowe inkubowano w 37°C przez 18 godzin w zapieczętowanym pojemniku z taśmą wskaźnika odporną na manipulacje wcelu zapewnienia, że płytki nie były naruszone w czasie inkubacji. Po inkubacji, warstwę bakterii zbierano do 5 ml sterylnej soli buforowanej fosforanem (PBS), i mierzono gęstość optyczną zawiesiny. Odpowiednią objętość tej zawiesiny, odpowiadającą pożądanej dawce, nanoszono następnie do słoi z dawkami jednostkowymi z30 ml buforu dwuwęglanowego i podawano ochotnikom. Dodatkową dawkę szczepionki przygotowywano i przetrzymywano w laboratorium i natychmiast po zaszczepieniu ochotników, aktualną liczbę bakterii w każdej dawce szczepionki zatwierdzano, stosując standardową procedurę zliczania kolonii w dziesięciokrotnie rozcieńczonej szczepionce.
Procedura dla rozcieńczania bakterii była ustalona w czasie poprzednich badań stosując warstwy hodowli przygotowane i inkubowane dokładnie, tak jak wykonano je dla preparatów szczepionkowych podawanych ochotnikom. Zawiesiny były wykonane i liczbę żywotnych bakterii zliczano przez liczenie kolonii w seryjnych rozcieńczeniach i odnoszono do ocenionej gęstości optycznej. Opierając się na tych wstępnych badaniach rozwinięto standardową procedurę przygotowywania i zatwierdzania prawidłowych rozcieńczeń bakterii w celu otrzymania ustalonej dawki.
Przygotowywanie buforu
Stosowano bufor stanowiący dwuwęglan sodu w wodzie. Dla każdej dawki szczepionki przygotowywano 150 ml wody dejonizowanej zawierającej 2 gramy dwuwęglanu sodu i sterylizowano przez sączenie. Do 50 ml sterylnych fiolek wprowadzano 30 ml buforu i do tych fiolek dodawano dawkę bakterii szczepionki. Pozostałe 120 ml buforu umieszczano w osobnych sterylnych słojach. W czasie szczepienia ochotników najpierw podawano 120 ml buforu i następnie w minutę później, 30 ml buforu zawierającego tą szczepionkę.
Harmonogram szczepienia
Grupy ochotników badano według zwiększającej się dawki.
Pierwsza grupa ochotników otrzymała dawkę około 5x107 bakterii, druga ochotników otrzymała dawkę około 5x109, a trzecia grupa ochotników otrzymała dawkę około 5x108.
Ochotnikom podawano Ciprofloksacynę 500 mg BID przez trzy dni, rozpoczynając od czwartego dnia. Byli oni wypisani w6 dniu, mając dla bezpieczeństwa wykonaną hematologię i badania chemiczne. Surowicę zachowano dla pomiarów przeciwciała.
W dniu 9i14 ochotnicy powrócili na badania ambulatoryjne i w czasie przerwy wykonano wywiad i pobrano próbkę krwi do badań serologicznych. Ogólnie, krew zebrano na badania serologiczne 3-krotnie (40 ml) przed szczepieniem i w dniu 9i14 po szczepieniu.
PL 196 076 B1
Procedury badań laboratoryjnych
Hodowano do dwóch próbek kałowych każdego dnia w czasie pobytu ochotników w szpitalu. Do oceny hodowli wacik kałowy był umieszczany w ośrodku do przenoszenia Cary Blair i brany do laboratorium, gdzie był zaszczepiany wprost na agarze MacConkey'a i na agarze MacConkey'a zawierającym selektywne dla szczepu szczepionki antybiotyki. Pięć koloni wykazywało aglutynację przy zastosowaniu antysurowicy specyficznej dla szczepu szczepionki. Dla oceny hodowli (pierwsza próbka każdego dnia) próbki kałowe były ważone i rozpuszczane w PBS w serii 10-krotnych rozcieńczeń aż do 10-4 i następnie 100 ml każdego rozcieńczenia rozpylano na agarze MacConkey'a z antybiotykami. Spodziewane kolonie były potwierdzane przez aglutenację surowicą anty-O.
Surowicę zbierano i przechowywano do następnych badań na przeciwciało przeciwko antygenom CFA IIw teście ELISA i bakteriobójcze przeciwciała przeciwko szczepowi szczepionki.
Monojądrzaste komórki krwi obwodowej, oddzielano, od zebranej do cytrynianu krwi pełnej i przemywano. Komórki te hodowano w gęstości 107 komórek na ml w medium do hodowli tkankowej RPMI w 37°C przez 48 godzin. Po 48 godzinach nadsącz przenoszono do kriofiolek i zamrażano w -20°C aż do badania na przeciwciało IgGi IgA w CFA IIw teście ELISA.
T a b el a 3
Podsumowanie procedur protokołu
Dzień (dzień szczepienia jest dniem 0) Przed -1 0 1 2 3 4 5 6 9 14
Nabór/badania przesiewowe x
HCG (mocz) x x
Szkolenie/zgoda x
Hospitalizacja x x x x x x x x
Szczepienie x
Wizyta w ambulatorium x x x
Ilościowa ocena hodowli kałowych x x x x x x x x x x
Jakościowa ocena hodowli kałowych x x x x x x x x x x
Serologia x x x
CBM/Chem panel x x
Cyprofloksacyna 500 mg BID przez 3 dni x x x
Wyniki:
Nie obserwowano objawów przy wszystkich aktualnych dawkach - 6,8 x 107 i 3,7 x 108 cfu. Przy dawce większej - 4,7 x 109, 1/6 ochotników doświadczyła biegunki i 2/6 miała średnie skurcze brzucha. Wydalanie bakterii było widoczne u wszystkich ochotników przy poziomie dawki 5 x 109 cfu od pierwszego dnia po szczepieniu aż do tego dnia jak podano w protokole, Cyprofloksacyna była podawana na 4 dzień po szczepieniu. Wskazuje to na dobrą kolonizację jelitową, która jest wskaźnikiem możliwości indukowania dobrej odpowiedzi immunologicznej. Przy dwóch niższych dawkach, szczep szczepionkowy był odzyskiwany z wszystkich ochotników, przynajmniej jeden raz w czasie szczepienia ale czas trwania wydalania był zredukowany w porównaniu do obserwowanego przy najwyższej dawce.
W czasie składania niniejszego zgłoszenia badanie odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez szczepionkę było niepełne. Jednakże, przeanalizowano odpowiedzi IgA anty-CFA II w hodowlach supernatantów PBMNC oczyszczonych z krwi biorców przy najwyższej dawce szczepionki w dniu 0 (przed szczepieniem) i w dniach 7 i 10 po szczepieniu. Supernatanty analizowano w teście ELISA na płytkach do badań pokrytych oczyszczonym antygenem CFA II. Wartości OD próbek,
PL 196 076 B1 obserwowane od dnia 7i dnia 10, były znacząco wyższe niż te z próbek przed szczepieniem, wskazując indukcję specyficznej wobec IgA odpowiedzi wtych punktach czasowych. Jak spodziewano się, odpowiedzi te pokazują szczyt działania wdniu 7 i redukcję wdniu 10 zgodnie z naprowadzaniem, piętnowanych komórek B wydzielających IgA, zkrwi do miejsc efektorowych śluzówki jelita związanej z tkanką limfatyczną.
Wykazano, że atenuowany żywy szczep ETEC (DaroC/DompC/DompF), jest dobrze tolerowany u dorosłych, zdrowych ochotników i dobrze kolonizuje jelito w sposób zgodny z jego użytecznością jako szczepionki doustnej wcelu ochrony przeciwko biegunce podróżnej. Wykazano także powstawanie specyficznej odpowiedzi immunologicznej śluzówki.
Referencje
1. Bacon, G.A., Burrows, T.W.i Yates, M. (1950) Br.J.Exp. Pathol., 31, 714-24
2. Chatfield, S.N., Charles, I.G., Makoff, A.J.i wsp. 5 (1992a) Biotech. 10, 888-892
3. Chatfield, S.N., Strahan, K., Pickard, D., Charles, I.G., Hormaeche, C.E. i Dougan, G. (1992b) Microbiol. Pathog., 12, 145-151
4. Curtiss III, R.i Kelly, S.M. (1987) Infect. Immun. 55, 3035-3043
5. Dougan, G., Chatfield, S., Pickard, D., Bester, J., O'Callaghan, D. i Maskell, D. (1988) J.Inf.Dis. 158, 1329-1335
6. Fairweather, N.F., Chatfield, S.N., Makoff, A.J.i wsp. (1990) Infect.Immun. 58, 1323-1329
7. Gomaz-Duarte, O.G., Galen, J., Chatfield, S.N. (1995) Vaccine, 13:1596-1602
8. Hohmann, E.L., Oletta, C.A., Killeen, K.P. i Miller, S.I. (1996) Yaccine 14, 19-24
9. Hone, D., Morona, R., Attridge, S.i Hackett, J. (1987) J.Infect.Dis., 156/167-1
10. Jones, P.W., Dougan, G., Haywood, C., MacKensie, N., Collins, P. i Chatfield, S.N. (1991) Vaccine 9, 29-36
11. Levine, M.M., Galen, J., Barry, E.i wsp. (1995) J.Biotech, 44, 193-196
12. Miller, S.I., Kukral, A.M.i Mekalanos, J.J. (1989), Proc.Nat.Acad.Sci., USA 86, 5054-5058
13. Pickard, D., Li, J.L., Roberts, M., Maskell, D., Hone, D., Levine, M., Dougas, G. i Chatfield, S. (1994) Infection and Immunity 62, 3984-3993
14. Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA
15. Strugnell, R.A., Dougan, G., Chatfield, S.N.i wsp. (1992) Infect.Immun., 60, 3994-4002
16. EP-B-0322237 (Dougan i wsp.)
17. EP-B-0400958 (Dougan i wsp.)
18. EP-B-0524205 (Dougan i wsp.)
19. WO 92/15689 (Charlesi wsp.)
20. Everest, P., Allen, J., Papakonstantinopoulou, A., Mastroeni, P., Roberts, M. i Dougan, G. (1995) FEMS Microbiol. Letts., 126, 97-101
21. Chatfield, S.N., Dorman, C.J., Hayward, C. and Dougan, G. (1991) Infection and Immunity 59, 449-452
22. Donnenberg, M.S.i Kaper, J.B. (1991) Infection and Immunity 59, 4310-4317
PL 196 076 B1
WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: PEPTIDE THERAPEUTICS LIMITED (B) ULICA: 100 Fulbourn Road (C) MIASTO: Cambridge (D) STATE:
(E) KRAJ: Wielka Brytania (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CB1 9PT (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Atenuowana bakteria użyteczna w szczepionkach (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 6 (iv) POSTAĆ ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Wydanie #1.0, Patentln Version 1.30 (EPO) (v) AKTUALNE DANE ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1690 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:
PL 196 076 B1 (A) ORGANIZM: aroC z E.coli (ix) CECHA (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 492,.1562 (jci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 1:
GTCGACGCGG TGGATATCTC TCCAGACGCG CTGGCGGTTG CTGAACAGAA CATCGAAGAA 60 CACGGTCTGA TCCACAACGT CATTCCGATT CGTTCCGATC TGTTCCGCGA CTTGCCGAAA 120
GTGCAGTACG ACCTGATTGT CACTAACCCG CCGTATGTCG ATGCGAAGAT ATGTCCGACC 180
TGCCAAACAA TACCGCCACG AGCCGGAACT GGGCCTGGCA TCTGGCACTG ACGGCCTGAA 240
ACTGACGCGT CGCATTCTCG GTAACGCGGC AGATTACCTT GCTGATGATG GC6TGTTGAT 300
TTGTGAAGTC GGCAACAGCA TGGTACATCT TATGGAACAA TATCCGGATG TTCCGTTCAC 360
CTGGCTGGAG TTTGATAACG GCGGCGATGG TGTGTTTATG CTCACCAAAG AGCAGCTIAT 420
TGCCGCACGA GAACATTTCG CGATTTATAA AGAHAAGTA AACACGCAAA CACAACAATA 480
ACGGAGCCGT G ATG GCT GGA AAC ACA ATT GGA CAA CTC TTT CGC GTA ACC 530
Met Ala Gly Asn Thr Ile Gly Gin Leu Phe Arg Val Thr 1 5 10 .
ACC TTC GGC GAA TCG CAC GGG CTG GCG CTC GGC TGC ATC GTC GAT GGT 578
Thr Phe Gly Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly Cys Ile Val Asp Gly
20 ' 25
GTT CCG CCA GGC ATT CCG CTG ACG GAA GCG GAC CTG CAA CAT GAC CTC 626
Val Pro Pro Gly He Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gin His Asp Leu 30 35 40 45
GAC CGT CGT CGC CCT GGG Aa TCG CGC TAT ACC ACC CAG CGC CGC GAG 674
Asp Arg Arg Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Gin Arg Arg Glu
55 60
CCG GAT CAG GTC AAA ATT CTC TCC GGT GIT TTT GAA GGC GTT ACT ACC 722
Pro Asp Gin Val Lys Ile Leu Ser Gly Va1 Phe Glu Gly Val Thr Thr
70 75
GGC ACC AGC ATT GGC KG TTG ATC GAA AAC ACT GAC CAG CGC TCT aG 770
PL 196 076 B1
Gly Thr Ser Ile Gly Leu Leu Ile Glu Asn Thr Asp Gin Arg Ser Gin 80 85 go
GAT TAC AGT GCG ATT AAG GAC GTT TTC CGT CCA GGC CAT GCC GAT TAC 818
Asp Tyr Ser Ala Ile Lys Asp Val Phe Arg Pro Gly His Ala Asp Tyr
95 100 105
ACC TAC GAA CAA AAA TAC GGT CTG CGC GAT TAT CGC GGC GGT GGA CGT 866
Thr Tyr Glu Gin Lys Tyr Gly Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Arg
110 115 120 125
TCT TCC GCC CGC GAA ACC GCC ATG CGC GTG GCG GCA GGA GCT AK GCC 914
Ser Ser Ala Arg Glu Thr Ala Met Arg Val Ala Ala Gly Ala Ile Ala
130 135 140
AAA AAA TAT CTC GCC GAG AAA TH GGT AK GAA ATC CGT GGC TGC CTG 962
Lys Lys Tyr Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ile Arg Gly Cys Leu
145 150 155
ACC CAG ATG GGC GAC AK CCG CTG GAT ATC AAA GAC TGG TCG CAG GTC 1010
Thr Gin Met Gly Asp Ile Pro Leu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Gin Val
160 165 170
GAG CAA AAT CCG πτ KT TGC CCG GAC CCC GAC AAA ATC GAC GCG KA 1058
Glu Gin Asn Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys Ile Asp Ala Leu
175 180 185
GAC GAG KG ATG CGT GCG CTG AAA AAA GAG GGC GAC TCC ATC GGC GCT 1106
Asp Glu Leu Met Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser Ile Gly Ala
190 195 200 205
AAA GTC ACC GTT GTT GCC AGT GGC GTT CCT GCC GGA CTT GGC GAG CCG 1154
Lys Va1 Thr Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro
GTC TTT GAC CGC CTG GAT GCT GAC ATC GCC CAT GCG CTG ATG AGC ATC 1202
Val Phe Asp Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ala His Ala Leu Met Ser Ile
PL 196 076 B1
225 230 235
AAC GCG GTG AAA GGC GTG GAA ATT GGC GAC GGC TTT GAC GTG GTG GCG 1250
Asn Ala Val Lys Gly Val Glu Ile Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala
240 245 250
CTG CGC GGC AGC CAG AAC CGC GAT GAA ATC ACC AAA GAC GGT TTC CAG 1298
Leu Arg Gly Ser Gin Asn Arg Asp Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe Gin
255 260 265
AGC AAC CAT GCG GGC GGC ATT CTC GGC GGT ATC AGC AGC GGG CAG CAA 1346
Ser Asn His Ala Gly Gly Ile Leu Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gin Gin
270 275 280 285
ATC AK GCC CAT ATG GCG CTG AAA CCG ACC TCC AGC ATT ACC GTG CCG 1394
Ile Ile Ala His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser Ile Thr Val Pro
290 295 300
GGT CGT ACC ATT AAC CGC TTT GGC GAA GAA GTT GAG ATG ATC ACC AAA 1442
Gly Arg Thr Ile Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met Ile Thr Lys
305 310 315
GGC CGT CAC GAT CCC TGT GTC GGG ATC CGC GCA GTG CCG ATC GCA GAA 1490
Gly Arg His Asp Pro Cys Val Gly Ile Arg Ala Val Pro Ile Ala Glu
320 325 330
GCG AAT GCT GGC GAT CGT TTT AAT GGA TCA CCT GTT ACG GCA ACG GGC 1538
Ala Asn Ala Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly
335 340 345
GCA AAA TGC CGA TGT GAA GAC TGA TATTCCACGC TGGTAAAAAA TGAATAAAAC 1592 Ala Lys Cys Arg Cys Glu Asp *
350 355
CGCGATTGCG CTGCTGGCTC TGCTTGCCAG TAGCGCCAGC CTGGCAGCGA CGCCGTGGCA 1652
AAAAATAACC CAACCTGTGC CGGGTAGCGC CAAATCGA 1690
PL 196 076 B1 (2) INFORMACJA O SEQ ID NR 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) (B) (D) DŁUGOŚĆ: 356 aminokwasy TYP: aminokwas TOPOLOGIA: liniowa
ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
xi) OPIS 'SEKWENCJI: SEQ ID nr: 2
Met Ala Gly Asn Thr Ile Gly Gin Leu Phe Arg Val Thr Thr Phe Gly 15 10 15
Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly Cys Ile Val Asp Gly Val Pro Pro 20 25 30
Gly Ile Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gin His Asp Leu Asp Arg Arg 35 40 45
Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Gin Arg Arg Glu Pro Asp Gin 50 55 60
Val Lys Ile Leu Ser Gly Val Phe Glu Gly Val Thr Thr Gly Thr Ser 65 70 75 80
Ile Gly Leu Leu Ile Glu Asn Thr Asp Gin Arg Ser Gin Asp Tyr Ser 85 90 95
Ala Ile Lys Asp Val Phe Arg Pro Gly His Ala Asp Tyr Thr Tyr Glu 100 105 . 110
Gin Lys Tyr Gly Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Arg Ser Ser Ala 115 120 125
Arg Glu Thr Ala Het Arg Val Ala Ala Gly Ala Ile Ala Lys Lys Tyr 130 135 140
PL 196 076 B1
Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ile Arg Gly Cys Leu Thr Gin Met
145 150 155 160
Gly Asp Ile Pro Leu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Gin Val Glu Gin Asn
165 170 175
Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys Ile Asp Ala Leu Asp Glu Leu 180 185 190
Met Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser Ile Gly Ala Lys Val Thr 195 200 205
Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro Val Phe Asp 210 215 220
Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ala His Ala Leu Met Ser Ile Asn Ala Val
225 230 235 240
Lys Gly Val Glu Ile Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala Leu Arg Gly
245 250 255
Ser Gin Asn Arg Asp Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe Gin Ser Asn His 260 265 270
Ala Gly Gly Ile Leu Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gin Gin Ile Ile Ala 275 280 285
His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser Ile Thr Val Pro Gly Arg Thr 290 295 300
Ile Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met Ile Thr Lys Gly Arg His 305 310 315 320
Asp Pro Cys Val Gly Ile Arg Ala Val Pro Ile Ala Glu Ala Asn Ala 325 330 335
PL 196 076 B1
Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly Ala Lys Cys 340 345 350
Arg Cys Glu Asp * 355 (2) INFORMACJA O SEQ ID NR 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1713 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iv) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:
(A) ORGANIZM: ompC z E.coli (ix) CECHA ' (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 491..1594 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 3:
GTTAACAAGC GTTATAGTTT TTCTGTGGTA GCACAGAATA ATGAAAAGTG TGTAAAGAAG 60
GGTAAAAAAA ACCGAATGCG AGGCATCCGG TTGAAATAGG GGTAAACAGA CATTCAGAAA 120
TGAATGACGG TAATAAATAA AGTTAATGAT GATAGCGGGA GTTATTCTAG TTGCGAGTGA 180
AGGTTTTGTT TTGACATTCA GTGCTGTCAA ATACTTAAGA ATAAGTTATT GATTTTAACC 240
TTGAATTATT ATTGCTTGAT GTTAGGTGCT TATTTCGCCA TTCCGCAATA ATCTTAAAAA 300
GTTCCCTTGC ATTTACATTT TGAAACATCT ATAGCGATAA ATGAAACATC TTAAAAGTTT 360
PL 196 076 B1
TAGTATCATA TTCGTGTTGG ATTATTCTGC ATI 11IGGGG AGAATGGACT TGCCGACTGA 420
TTAATGAGGG TTAATCAGTA TGCAGTGGCA TAAAAAAGCA AATAAAGGCA TATAACAGAG 480
GGTTAATAAC ATG AAA GTT AAA GTA CTG TCC CTC CTG GTC CCA GCT CTG 529
Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu
360 365 370
CTG GTA GCA GGC GCA GCA AAC GCT GCT GAA GTT TAC AAC AAA GAC GGC 577
Leu Va1 Ala Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly
375 380 385
AAC AAA TTA GAT CTG TAC GGT AAA GTA GAC GGC CTG CAC TAT TTC TCT 625
Asn Lys Leu Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser
390 395 400
GAC AAC AAA GAT GTA GAT GGC GAC CAG ACC TAC ATG CGT CK GGC TTC 673
Asp Asn Lys Asp Va1 Asp Gly Asp Gin Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe
405 410 415
AAA GGT GAA ACT CAG GTT ACT GAC CAG CTG ACC GGT TAC GGC CAG TGG 721
Lys Gly Glu Thr Gin Val Thr Asp Gin Leu Thr Gly Tyr Gly Gin Trp
420 425 430
GAA TAT CAG ATC CAG GGC AAC AGC GCT GAA AAC GAA AAC AAC TCC TGG 769
Glu Tyr Gin Ile Gin Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp
435 440 445 450
ACC CGT GTG GCA TTC GCA GGT CTG AAA TTC CAG GAT GTG GGT TCT TTC 817
Thr Arg Va1 Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gin Asp Val Gly Ser Phe
455 460 465
GAC TAC GGT CGT AAC TAC GGC GTT GTT TAT GAC GTA ACT TCC TGG ACC 865
Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr
470 475 480
PL 196 076 B1
GAC GTA CTG CCA GAA TTC GGT GGT GAC ACC TAC GGT TCT GAC AAC TTC
Asp Val Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe
485 490 495
ATG CAG CAG CGT GGT AAC GGC TTC GCG ACC TAC CGT AAC ACT GAC TTC
Met Gin Gin Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe
500 505 510
TTC GGT CTG GTT GAC GGC CTG AAC TTT GCT GTT CAG TAC CAG GGT AAA
Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gin Tyr Gin Gly Lys
515 520 525 530
AAC GGC AAC CCA TCT GGT GAA GGC TTT ACT AGT GGC GTA ACT AAC AAC
Asn Gly Asn Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn
535 540 545
GGT CGT GAC GCA CTG CGT CAA AAC GGC GAC GGC GTC GGC GGT TCT ATC 1105
Gly Arg Asp Ala Leu Arg Gin Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile
550 555 560
ACT TAT GAT TAC GAA GGT HC GGT ATC GGT GGT GCG ATC TCC AGC TCC 1153
Thr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser
565 570 575
AAA CGT ACT GAT GCT CAG AAC ACC GCT GCT TAC ATC GGT AAC GGC GAC 1201
Lys Arg Thr Asp Ala Gin Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp
580 585 590
CGT GCT GAA ACC TAC ACT GGT GGT CTG AAA TAC GAC GCT AAC AAC ATC 1249
Arg Ala Glu Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile
595 600 605 610
TAC CTG GCT GCT CAG TAC ACC CAG ACC TAC AAC GCA ACT CGC GTA GGT 1297
Tyr Leu Ala Ala Gin Tyr Thr Gin Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly
615 620 625
TCC CTG GGT TGG GCG AAC AAA GCA CAG AAC TTC GAA GCT GTT GCT CAG 1345
PL 196 076 B1
Ser Leu Gly Trp Ala Asn Lys Ala Gin Asn Phe Glu Ala Val Ala Gin
630 635 640
TAC CAG TTC GAC TTC GGT CTG CGT CCG TCC CTG GCT TAC CTG CAG TCT
Tyr Gin Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gin Ser
645 650 655
AAA GGT AAA AAC CTG GGT CGT GGC TAC GAC GAC GAA GAT ATC CTG AAA
Lys Gly Lys Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys
660 665 670
TAT GTT GAT GTT GGT GCT ACC TAC TAC TTC AAC AAA AAC ATG TCC ACC
Tyr Val Asp Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr
675 680 685 690
TAC GTT GAC TAC AAA ATC AAC CTG CTG GAC GAC AAC CAG TTC ACT CGT 1537
Tyr Val Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gin Phe Thr Arg
695 700 705
GAC GCT GGC ATC AAC ACT GAT AAC ATC GTA GCT CTG GGT CTG GTT TAC 1585
Asp Ala Gly Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr
710 715 720
LAG TTC TAA TCTCGATTGA TATCGAACAA GGGCCTGCGG' GCCCTTTTTT 1634
Gin Phe *
725
CATTGTTTTC AGCGTACAAA CTCAGTTTTT TGGTGTACTC TTGCGACCGT TCGCATGAGG 1694
ATAATCACGT ACGGAAATA 1713 (2) INFORMACJA O SEQ ID NR 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 367 aminokwasów (B) TYP: aminokwas
PL 196 076 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 4
Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu 1 5
Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val ) 20
Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly 35 40
Asp Val Asp Gly Asp Gin Thr Tyr 50 55
Thr Gin Val Thr Asp Gin Leu Thr 65 70
Ile Gin Gly Asn Ser Ala Glu Asn 85
Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gin 100
Arg Asn Tyr Gly Val Va1 Tyr Asp 115 120
Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr 130 135
Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr 145 150
Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val 165
Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala 10 15
Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu 25 30
Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys 45
Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu 60
Gly Tyr Gly Gin Trp Glu Tyr Gin
75 80
Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val
90 95
Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly
105 110
Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu
125
Gly Ser Asp Asn Phe Met Gin Gin 140
Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu 155 160
Gin Tyr Gin Gly Lys Asn Gly Asn 170 175
PL 196 076 B1
Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp
180 185 190
Ala Leu Arg Gin Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp
195 200 205
Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr
210 215 220
Asp Ala Gin Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu
225 230 235 240
Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala
245 250 255
Ala Gin Tyr Thr Gin Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly
260 265 270
Trp Ala Asn Lys Ala Gin Asn Phe Glu Ala Val Ala Gin Tyr Gin Phe
275 280 285
Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gin Ser Lys Gly Lys
290 295 300
Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Val Asp
305 310 315 320
Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp
325 330 335
Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gin Phe Thr Arg Asp Ala Gly 340 345 350
Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr Gin Phe * 355 360 365
PL 196 076 B1 (2) INFORMACJA O SEQ ID NR 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1808 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:
(A) ORGANIZM: ompE z E.coli (ix) CECHA (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 457..1545 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 5:
AAAACTAATC CGCATTCTTA TTGCGGATTA GTTI11 ICH AGCTAATAGC ACAATTTTCA 60
TACTATTTTT TGGCATTCTG GATGTCTGAA AGAAGATTTT GTGCCAGGTC GATAAAGTTT 120
CCATCAGAAA CAAAATTTCC GTTTAGTTAA TTTAAATATA AGGAAATCAT ATAAATAGAT 180
TAAAATTGCT GTAAATATCA TCACGTCTCT ATGGAAATAT GACGGTGTTC ACAAAGTTCC 240
TTAAATTTTA CTTTTGGTTA CATATTTTTT CTTTTTGAAA CCAAATCTTT ATCTTTGTAG 300
CACTTTCACG GTAGCGAAAC GTTAGTTTGA ATGGAAAGAT GCCTGCAGAC ACATAAAGAC 360
ACCAAACTCT CATCAATAGT TCCGTAAATT TTTATTGACA GAACTTATTG ACGGCAGTGG 420
CAGGTGTCAT AAAAAAAACC ATGAGGGTAA TAAATA ATG ATG AAG CGC AAT ATT 474
Met Met Lys Arg Asn Ile
5
PL 196 076 B1
CTG GCA GTG ATC Leu Ala Val Ile GTC CCT GCT CTG TTA GTA GCA GGT ACT GCA AAC GCT Leu Val Ala Gly Thr Ala Asn Ala 522
Va1 Pro Ala Leu
10 15 20
GCA GAA ATC TAT AAC AAA GAT GGC AAC AAA GTA GAT CTG TAC GGT AAA 570
Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Val Asp Leu Tyr Gly Lys
25 30 35
GCT GTT GGT CTG CAT tat τπ TCC AAG GGT AAC GGT GAA AAC AGT TAC 618
Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly Asn Gly Glu Asn Ser Tyr
40 45 50
GGT GGC AAT GGC GAC ATG ACC TAT GCC CGT CK GGT KT AAA GGG GAA 666
Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu
55 60 65 70
ACT CAA ATC AAT TCC GAT CTG ACC GGT TAT GGT CAG TGG GAA TAT AAC 714
Thr Gin Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr Gly Gin Trp Glu Tyr Asn
75 80 85
TTC CAG GGT AAC AAC TCT GAA GGC GCT GAC GCT CAA ACT GGT AAC AAA 762
Phe Gin Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp Ala Gin Thr Gly Asn Lys
90 95 100
ACG CGT CTG GCA TTC GCG GGT CTT AAA TAC GCT GAC GK GGT TCT KC 810
Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Val Gly Ser Phe
105 110 115
GAT TAC GGC CGT AAC TAC GGT GTG GTT TAT GAT GCA CTG GGT TAC ACC 858
Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Ala Leu Gly Tyr Thr
120 125 130
GAT ATG CTG CCA GAA TTT GGT GGT GAT ACT GCA TAC AGC GAT GAC KC 906
Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Asp Asp Phe
135 140 145 150
TTC GTT GGT CGT GTT GGC GGC GTT GCT ACC TAT CGT AAC TCC AAC KC 954
PL 196 076 B1
Phe Val Gly Arg Va1 Gly Gly Val Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Asn Phe
155 160 165
TTT GGT CTG GTT GAT GGC CTG AAC TTC GCT GTT CAG TAC CTG GGT AAA
Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gin Tyr Leu Gly Lys
170 175 180
AAC GAG CGT GAC ACT GCA CGC CGT TCT AAC GGC GAC GGT GTT GGC GGT
Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly
185 190 195
TCT ATC AGC TAC GAA TAC GAA GGC τπ GGT ATC GTT GGT GCT TAT GGT
Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Val ‘ Gly Ala Tyr Gly
200 205 210
GCA GCT GAC CGT ACC AAC CTG CAA GAA GCT CAA CCT CH GGC AAC GGT
Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gin Glu Ala Gin Pro Leu Gly Asn Gly
215 220 225 230
AAA AAA GCT GAA CAG TGG GCT ACT GGT CTG AAG TAC GAC GCG AAC AAC
Lys Lys Ala Glu Gin Trp Ala Thr Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn
235 240 245
ATC TAC CTG GCA GCG AAC TAC GGT GAA ACC CGT AAC GCT ACG CCG ATC
Tie Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr Arg Asn Ala Thr Pro Ile
250 255 260
ACT AAT AAA TTT ACA AAC ACC AGC GGC HC GCC AAC AAA ACG CAA GAC 1290
Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe Ala Asn Lys Thr Gin Asp
265 270 275
GTT CTG TTA GTT GCG CAA TAC CAG TTC GAT TTC GGT CTG CGT CCG TCC 1338
Val Leu Leu Val Ala Gin Tyr Gin Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser
280 285 290
ATC GCT TAC ACC AAA TCT AAA GCG AAA GAC GTA GAA GGT ATC GGT GAT 1386
Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp Val Glu Gly Ile Gly Asp
PL 196 076 B1
295 300 305 310
GTT GAT CTG GTG AAC TAC TTT GAA GTG GGC GCA ACC TAC TAC TTC AAC 1434
Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn
315 320 325
AAA AAC ATG TCC ACC TAT GTT GAC TAC ATC ATC AAC CAG ATC GAT TCT 1482
Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile Ile Asn Gin Ile Asp Ser
330 335 340 '
GAC AAC AAA CTG GGC GTA GGT TCA GAC GAC ACC GTT GCT GTG GGT ATC 1530
Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp Thr Val Ala Val Gly Ile
345 350 355
GTT TAC CAG TTC TAA TAGCACACCT CTTTGTTAAA TGCCGAAAAA ACAGGACTTT 1585
Val Tyr Gin Phe *
360
GGTCCTGTTT TTTTTATACC TTCCAGAGCA ATCTCACGTC TTGCAAAAAC AGCCTGCGTT 1645
TTCATCAGTA ATAGTTGGAA TTTTGTAAAT CTCCCGTTAC CCTGATAGCG GACTTCCCTT 1705
CTGTAACCAT AATGGAACCT CGTCATGTTT GAGAACATTA CCGCCGCTCC TGCCGACCCG 1765
AiTCTGGGCC TGGCCGATCT GTTTCGTGCC GATGAACGTC CCG 1808 (2) INFORMACJA O SEQ ID NR. 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 362 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 6
PL 196 076 B1
Met Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val
1 5 10 15
Ala Gly Thr Ala Asn Ala Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys
20 25 30
Val Asp Leu Tyr Gly Lys Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly
35 40 45
Asn Gly Glu Asn Ser Tyr Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg
50 55 60
Leu Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gin Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Gly Gin Trp Glu Tyr Asn Phe Gin Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp
85 90 95
Ala Gin Thr Gly Asn Lys Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr
100 105 110
Ala Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr 115 120 125
Asp Ala Leu Gly Tyr Thr Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr 130 135 140
Ala Tyr Ser Asp Asp Phe Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Ser Asn Phe Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala
165 170 175
Val Gin Tyr Leu Gly Lys Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn 180 185 190
Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly
PL 196 076 B1
195 200
Ile Val Gly Ala Tyr Gly Ala Ala 210 215
Gin Pro Leu Gly Asn Gly Lys Lys 225 230
Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr 245
Arg Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asn 260
Ala Asn Lys Thr Gin Asp Val Leu 275 280
Phe Gly Leu Arg Pro Ser Ile Ala 290 295
Val Glu Gly Ile Gly Asp Val Asp 305 310
Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn 325
Ile Asn Gin Ile Asp Ser Asp Asn 340
Thr Val Ala Val Gly Ile Val Tyr 355 360
205
Asp Arg Thr Asn Leu Gin Glu Ala 220
Ala Glu Gin Trp Ala Thr Gly Leu 235 240
Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr 250 255
Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe 265 270
Leu Val Ala Gin Tyr Gin Phe Asp 285
Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp
300
Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly
315 320
Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile
330 335
Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp
350
G1 n Phe *

Claims (13)

1. Bakteria atenuowana nieodwracalną mutacją knock-out w każdym z genów, genie aroC, genie ompF i genie ompC, przy czym bakterię stanowi bakteria wybrana z rodzaju Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella lub Brucella.
2. Bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją szczep Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella enteriditis, Salmonella choleraesuis, Salmonella dublin, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia enterocolitica, Bordetella pertussis lub Brucella abortus.
3. Bakteria według zastrz. 2, znamienna tym, że jest szczepem enterotoksygenicznym E.coli (ETEC).
4. Bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że jest ponadto atenuowana mutacją w czterech genach.
5. Bakteria według zastrz. 4, znamienna tym, że czterema genami są aroA, aroD, aroE, pur, htrA, galE, cya, crp, phoP lub surA.
6. Bakteria według zastrz. 4 albo 5, znamienna tym, że mutacja w każdym genie jest mutacją wyznaczoną.
7. Bakteria według zastrz. 4, znamienna tym, że mutacja w każdym genie jest delecją całej sekwencji kodującej.
8. Bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że została genetycznie zmodyfikowana wcelu ekspresji antygenu heterologicznego.
9. Bakteria według zastrz. 8, znamienna tym, że ekspresja antygenu jest prowadzona promotorem nirB lub promotorem htrA.
10. Szczepionka obejmująca atenuowaną bakterię i odpowiedni nośnik, znamienna tym, że zawiera bakterię jak zdefiniowano w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozpuszczalnik.
11. Bakteria, jak zdefiniowano w zastrz. 1 do zastosowania w sposobie szczepienia ludzi lub zwierząt.
12. Enterotoksygeniczna komórka E.coli jak zdefiniowano w zastrz. 3, do zastosowania w sposobie szczepienia ludzi lub zwierząt przeciwko biegunce.
13. Zastosowanie bakterii jak zdefiniowano w zastrz. 1 do wytwarzania leku do szczepienia ludzi lub zwierząt.
PL343246A 1998-03-25 1999-03-25 Bakteria atenuowana, szczepionka, bakteria do zastosowania, enterotoksyczna komórka E. Coli i zastosowanie bakterii PL196076B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9806449.6A GB9806449D0 (en) 1998-03-25 1998-03-25 Attenuated bacteria useful in vaccines
PCT/GB1999/000935 WO1999049026A1 (en) 1998-03-25 1999-03-25 Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the aroc, ompf and ompc genes, useful as vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL343246A1 PL343246A1 (en) 2001-07-30
PL196076B1 true PL196076B1 (pl) 2007-12-31

Family

ID=10829280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL343246A PL196076B1 (pl) 1998-03-25 1999-03-25 Bakteria atenuowana, szczepionka, bakteria do zastosowania, enterotoksyczna komórka E. Coli i zastosowanie bakterii

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6902906B1 (pl)
EP (1) EP1066376B1 (pl)
JP (1) JP4516210B2 (pl)
KR (1) KR100628657B1 (pl)
AT (1) ATE296881T1 (pl)
AU (1) AU763683B2 (pl)
CA (1) CA2323576C (pl)
CZ (1) CZ301520B6 (pl)
DE (1) DE69925585T2 (pl)
DK (1) DK1066376T3 (pl)
ES (1) ES2244182T3 (pl)
GB (1) GB9806449D0 (pl)
HU (1) HU225644B1 (pl)
NO (1) NO327609B1 (pl)
NZ (1) NZ507077A (pl)
PL (1) PL196076B1 (pl)
PT (1) PT1066376E (pl)
WO (1) WO1999049026A1 (pl)
ZA (1) ZA200004987B (pl)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7138237B1 (en) 2000-05-19 2006-11-21 Cedars-Sinai Medical Center Diagnosis, prevention and treatment of Crohn's disease using the OmpC antigen
DE60213948T2 (de) * 2001-01-18 2007-03-08 Newcastle University Ventures Ltd. Biosensor mit kovalent gebundenen membranüberspannenden proteinen
GB0121998D0 (en) 2001-09-11 2001-10-31 Acambis Res Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
US7357935B2 (en) * 2003-05-14 2008-04-15 Wyeth Avian E. coli vaccine for protection against colibacillosis
US7297338B2 (en) * 2003-05-14 2007-11-20 Wyeth Avian vaccine composition for the protection of poultry against disease and infection caused by E. coli and Salmonella
EP1981536A4 (en) * 2006-02-01 2012-03-14 Gotovax Ab COLONIZATIONAL FACTOROUS ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI IN RECOMBINANT BACTERIA
JP2008054614A (ja) * 2006-09-01 2008-03-13 Nippon Inst For Biological Science 鶏大腸菌由来弱毒変異株、鶏大腸菌対策用ワクチン、免疫方法及び鶏用ワクチンベクター
EP2517723B1 (en) * 2006-09-18 2019-11-06 The Board of Trustees of The University of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses
CA2704457A1 (en) * 2007-10-30 2009-05-07 Walter Bottje Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium
NZ585777A (en) 2007-11-01 2012-09-28 Univ Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria
NZ601609A (en) 2010-01-21 2014-08-29 Univ Arkansas Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses
AU2011264772B2 (en) 2010-06-09 2015-07-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Vaccine and methods to reduce Campylobacter infection
WO2014037445A1 (en) * 2012-09-05 2014-03-13 Lohmann Animal Health Gmbh Preparation of live vaccines
AU2013311675A1 (en) * 2012-12-07 2015-05-21 Lohmann Animal Health Gmbh Preparation of live vaccines
US9603915B2 (en) 2013-02-14 2017-03-28 The Board of Trustees of the University of Akansas Compositions and methods of enhancing immune responses to Eimeria or limiting Eimeria infection
KR102239207B1 (ko) 2013-03-15 2021-04-09 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소 장내 병원균에 대한 면역 반응을 증진시키는 조성물 및 방법
TWI843057B (zh) 2016-05-03 2024-05-21 阿肯色州大學董事會 包含免疫刺激性及抗原性多肽的酵母菌疫苗載體以及其使用方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8730037D0 (en) 1987-12-23 1988-02-03 Wellcome Found Vaccines
GB8912330D0 (en) 1989-05-30 1989-07-12 Wellcome Found Live vaccines
DE69012784D1 (de) 1990-02-06 1994-10-27 Pasteur Institut Transformiertes Shigella.
GB9007194D0 (en) 1990-03-30 1990-05-30 Wellcome Found Live vaccines
EP0574466B1 (en) * 1991-03-05 1999-05-19 The Wellcome Foundation Limited Expression of recombinant proteins in attenuated bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
US6902906B1 (en) 2005-06-07
CZ301520B6 (cs) 2010-03-31
NO327609B1 (no) 2009-08-31
AU3045899A (en) 1999-10-18
ZA200004987B (en) 2001-10-31
DE69925585D1 (de) 2005-07-07
ES2244182T3 (es) 2005-12-01
CZ20003470A3 (cs) 2001-07-11
ATE296881T1 (de) 2005-06-15
JP2002507414A (ja) 2002-03-12
CA2323576A1 (en) 1999-09-30
PT1066376E (pt) 2005-10-31
EP1066376A1 (en) 2001-01-10
HU225644B1 (en) 2007-05-02
PL343246A1 (en) 2001-07-30
CA2323576C (en) 2010-12-07
GB9806449D0 (en) 1998-05-27
HUP0105430A2 (hu) 2002-04-29
KR100628657B1 (ko) 2006-09-26
KR20010042175A (ko) 2001-05-25
JP4516210B2 (ja) 2010-08-04
EP1066376B1 (en) 2005-06-01
WO1999049026A1 (en) 1999-09-30
NO20004781D0 (no) 2000-09-25
HUP0105430A3 (en) 2004-10-28
NZ507077A (en) 2002-10-25
DE69925585T2 (de) 2006-07-13
DK1066376T3 (da) 2005-10-03
NO20004781L (no) 2000-11-08
AU763683B2 (en) 2003-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1335661C (en) Non-reverting shigella live vaccines
KR100202771B1 (ko) 미생물감염에대한숙주의예방적치료용백신
KR0139950B1 (ko) 무병원성 미생물 및 이의 용도
US8465755B2 (en) Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens
US8889121B2 (en) Bacterium comprising a regulated rfaH nucleic acid
EP0500699B1 (en) Cross-protective salmonella vaccines
US20040101531A1 (en) Immunogenic compositions and vaccines comprising carrier bacteria that secrete antigens
AU763683B2 (en) Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the aroC, ompF and ompC genes, useful as vaccines
US5855880A (en) Avirulent microbes and uses therefor
JP2002521345A (ja) 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン
US5747309A (en) Bacterial vaccines using vaccine strains of pathogenic bacteria
CA2244807A1 (en) Salmonella typhimurium vaccine
Ahmed et al. Protection of adult rabbits and monkeys from lethal shigellosis by oral immunization with a thymine-requiring and temperature-sensitive mutant of Shigella flexneri Y
JP2004337175A (ja) 無毒性微生物及びその使用：サルモネラ
WO2005001069A1 (en) Genetic marker for live bacterial vaccines
US6905691B1 (en) Vaccines containing attenuated bacteria
EP1037664B1 (en) Vaccines containing attenuated bacteria
EP0358692B1 (en) Cholera vaccines
MXPA00009354A (en) Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the aroc, ompf and ompc genes, useful as vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20130325