PL196107B1

PL196107B1 - Preparation designed for detection of antibiotics and sulphonamides, particularly in fluids, identification of penicillin and sulphonamides as well as method for test plate preparation and method for standardization of bacterial test strain

Info

Publication number: PL196107B1
Application number: PL357920A
Authority: PL
Inventors: Barbara Kawiorska; Barbara Koterska; Ewa Urbańska
Original assignee: Lab Analiz Mleka Lab Mlek Sp Z
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2007-12-31
Also published as: PL357920A1

Abstract

1. Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, zawierający substancje odżywcze, żelifikator, szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis, znamienny tym, że składa się z pięciu składników, z których - pierwszy składnik, użyty w ilości 2,5-3,7 g do przygotowania 70-120 ml pożywki testowej, jest komponentem odżywczym o składzie: 13,51% wag 24,32% wag 8,11% wag 80% wag - drugi składnik, użyty w ilości 0,03-0,08 g do przygotowania pożywki testowej jest liofilizowanym szczepem testowym Bacillus stearothermophilus var calidolactis o stężeniu przetrwalników 1 x 108 - 5 x 108 CFU/fiolkę - trzeci składnik jest odczynnikiem uwadniającym użytym w ilości 70-120 ml do przygotowania pożywki testowej, zawierającym trimethoprim w stężeniu 0,03-0,13 mg/ml lub odczynnikiem suchym użytym w ilości 3-13 mg, do którego dodaje się wodę destylowaną w ilości 70-120 ml - czwarty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 ml do 10 ml badanej próbki - piąty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.1. A preparation for detecting the presence of antibiotics and sulfonamides, especially in a liquid material, identifying penicillins and sulfonamides and quantitatively determining penicillins in this material, containing nutrients, a gelifier, a test strain of Bacillus stearothermophilus var calidolactis, characterized in that it consists of five components, of which - the first component, used in the amount of 2.5-3.7 g to prepare 70-120 ml of test medium, is a nutrient component with the composition: 13.51% by weight 24.32% by weight 8.11% by weight 80% by weight - the second component, used in the amount of 0.03-0.08 g to prepare the test medium is a lyophilized test strain of Bacillus stearothermophilus var calidolactis with a spore concentration of 1 x 108 - 5 x 108 CFU/vial - the third the first component is a hydrating reagent used in the amount of 70-120 ml to prepare the test medium, containing trimethoprim at a concentration of 0.03-0.13 mg/ml or a dry reagent used in the amount of 3-13 mg, to which 70-120 ml of distilled water is added - the fourth component is an auxiliary substance for the identification of penicillins, especially penicillinase with an activity of 1000 U/vial, used in the form of a solution with an activity of 100 U/ml and added in the amount of 0.4 ml to 10 ml of the test sample - the fifth component is an auxiliary substance for the identification of sulfonamides, especially p-aminobenzoic acid, analytical grade, in the amount of 1 g/vial used in the amount of 1 ml of a 1% solution to 10 ml of the test sample.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)196107 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 357920 ^{(51) Int.Cl.} (12) PATENT DESCRIPTION (19) PL (11) 196107 (13) B1 (21) Application number: 357920 ^{(51) Int.Cl.}

C12Q 1/04 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 20.12.2002C12Q 1/04 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01) (22) Date of notification: 20.12.2002

Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, a także sposób przygotowywania płytki testowej do badań i sposób standaryzacji szczepu testowegoPreparation for detecting the presence of antibiotics and sulfonamides, especially in liquid material, identification of penicillins and sulfonamides and quantitative determination of penicillins in this material, as well as the method of preparing the test plate for research and the method of standardizing the test strain

(43) Zgłoszenie ogłoszono: 28.06.2004 BUP 13/04 (43) Application was announced: 28.06.2004 BUP 13/04 (73) Uprawniony z patentu: Laboratorium Analiz Mleka LAB-MLEK Spółka z o.o.,Olsztyn,PL (73) The right holder of the patent: LAB-MLEK Milk Analysis Laboratory Limited liability company, Olsztyn, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.12.2007 WUP 12/07 (45) The grant of the patent was announced: 31.12.2007 WUP 12/07 (72) Twórca(y) wynalazku: Barbara Kawiorska,Olsztyn,PL Barbara Koterska,Olsztyn,PL Ewa Urbańska,Olsztyn,PL (72) Inventor (s): Barbara Kawiorska, Olsztyn, PL Barbara Koterska, Olsztyn, PL Ewa Urbańska, Olsztyn, PL

ekstrakt drożdżowy aminobak ekstrakt mięsny agar w ilości 4%wag w ilości 12% wag w ilości 4% wag w ilości 54% wag (57) 1. Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, zawierający substancje odżywcze, żelifikator, szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis, znamienny tym, że składa się z pięciu składników, z którychAminobak yeast extract meat extract agar in the amount of 4 wt.% in the amount of 12 wt.% in the amount of 4 wt.% in the amount of 54 wt.% (57) 1. Preparation for detecting the presence of antibiotics and sulfonamides, especially in liquid material, identification of penicillins and sulfonamides and quantitative determination of penicillins in this material, containing nutrients, gelifikator, test strain Bacillus stearothermophilus var calidolactis, characterized by the fact that it consists of five components, of which

- pierwszy składnik, użyty w ilości 2,5-3,7 g do przygotowania 70-120 ml pożywki testowej, jest komponentem odżywczym o składzie:- the first component, used in the amount of 2.5-3.7 g to prepare 70-120 ml of the test medium, is a nutrient component with the following composition:

13,51% wag 24,32% wag 8,11% wag 80% wag13.51 wt.% 24.32 wt.% 8.11 wt.% 80 wt.%

- drugi składnik, użyty w ilości 0,03-0,08 g do przygotowania pożywki testowej jest liofilizowanym szczepem testowym Bacillus stearothermophilus var calidolactis o stężeniu przetrwalników 1 x 10⁸ - 5 x 10⁸ CFU/fiolkę- the second component, used in an amount of 0.03-0.08 g to prepare the test medium, is a lyophilized test strain of Bacillus stearothermophilus var calidolactis with a spore concentration of 1 x 10 ⁸ - 5 x 10 ⁸ CFU / vial

- trzeci składnik jest odczynnikiem uwadniającym użytym w ilości 70-120 ml do przygotowania pożywki testowej, zawierającym trimethoprim w stężeniu 0,03-0,13 mg/ml lub odczynnikiem suchym użytym w ilości 3-13 mg, do którego dodaje się wodę destylowaną w ilości 70-120 ml- the third component is a hydrating reagent used in an amount of 70-120 ml to prepare the test medium containing trimethoprim at a concentration of 0.03-0.13 mg / ml or a dry reagent used in an amount of 3-13 mg, to which is added distilled water in amount of 70-120 ml

- czwarty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 ml do 10 ml badanej próbki- the fourth component is an auxiliary substance for the identification of penicillins, especially penicillinase with an activity of 1000 U / vial, used in the form of a solution with an activity of 100 U / ml and added in the amount of 0.4 ml to 10 ml of the test sample

- piąty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.- the fifth component is an auxiliary substance for the identification of sulfonamides, especially p-aminobenzoic acid p.a. in the amount of 1 g / vial used in the amount of 1 ml of 1% solution to 10 ml of the test sample.

PL 196 107 B1PL 196 107 B1

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, a także sposób przygotowywania płytki testowej do badań i sposób standaryzacji szczepu testowego. Wynalazek jest przydatny do wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczenia zanieczyszczeń materiałów płynnych substancjami antybakteryjnymi, takimi jak antybiotyki i sulfonamidy, występującymi przykładowo w mleku, a także w serach, mięsie i płynach ustrojowych (np. mocz) pod warunkiem przygotowania próbki tych materiałów w postaci płynnej i o obojętnym odczynie (pH 7 ± 0,1), czyli w sposób powszechnie stosowany do przygotowywania próbki do posiewów mikrobiologicznych.The subject of the invention is a preparation for detecting the presence of antibiotics and sulfonamides, especially in a liquid material, identification of penicillins and sulfonamides and quantitative determination of penicillins in this material, as well as a method of preparing a test plate for testing and a method of standardizing the test strain. The invention is useful for the detection, identification and quantification of contamination of liquid materials with antibacterial substances such as antibiotics and sulfonamides, for example in milk, as well as in cheese, meat and body fluids (e.g. urine), provided that a sample of these materials is prepared in liquid form. and neutral (pH 7 ± 0.1), i.e. in a manner commonly used to prepare a sample for microbiological inoculation.

Znane są testy dyfuzyjno-wskaźnikowe do wykrywania antybiotyków jak i sulfonamidów. W testach tych jako wskaźniki stosuje się barwniki, np. purpurę bromokreozolową, zmieniające kolor pożywki pod wpływem kwasu wytwarzanego przez szczep testowy, np. Bacillus stearothermophilus var calidolactis. Testy tego typu najczęściej są produkowane w probówkach, np. Delvotest Sp, BR-test As i inne. Wynik obecności antybiotyków lub sulfonamidów odczytuje się na podstawie zabarwienia pożywki. Testy dyfuzyjno-wskaźnikowe znane są z opisów patentowych EP 0 005 891, EP 0 601 001 A1, WO 96/23901. W opisach tych przedstawiono rozwiązania wykorzystujące różne szczepy, stężenie tych szczepów, stosowanie różnych dodatków do zwiększenia czułości szczepów na sulfonamidy lub obniżenie ich czułości na penicylinę.Diffusion-tracer tests for the detection of antibiotics and sulfonamides are known. Dyes, e.g., bromocreosol purple, which change the color of the medium under the influence of the acid produced by the test strain, e.g. Bacillus stearothermophilus var calidolactis, are used as indicators in these tests. Tests of this type are most often produced in test tubes, eg Delvotest Sp, BR-test As and others. The result for the presence of antibiotics or sulfonamides is read by the color of the medium. Diffusion tracer tests are known from EP 0 005 891, EP 0 601 001 A1, WO 96/23901. These descriptions describe solutions using different strains, the concentration of these strains, the use of various additives to increase the sensitivity of the strains to sulfonamides or to reduce their sensitivity to penicillin.

I tak z opisu patentowego EP 0 005 891 znane jest rozwiązanie dotyczące testu wskaźnikowego do wykrywania antybiotyków i sulfonamidów, w którym przetrwalniki Bacillus stearothermophilus var calidolactis, w koncentracji 10⁵-10⁸ spor/ml i trimethoprim w koncentracji 10-120 mg/l co jest równoznaczne z 0,01-0,12 mg/ml, wprowadzane są do roztworu agaru. Bliżej nie sprecyzowane składniki odżywcze i barwnik wskaźnikowy dodawane są do roztworu agaru przed żelifikacją lub po żelifikacji w formie tabletek lub krążka bibułowego.Thus, EP 0 005 891 describes a solution for an indicator test for the detection of antibiotics and sulfonamides, in which Bacillus stearothermophilus var calidolactis spores at a concentration of 10 ⁵ -10 ⁸ spores / ml and trimethoprim at a concentration of 10-120 mg / l co is equivalent to 0.01-0.12 mg / ml, are introduced into the agar solution. Nutrients and indicator dye are added to the agar solution before gelling or after gelling in the form of tablets or paper discs.

W opisie patentowym EP 0 601 001 A1 przedstawiono rozwiązanie dotyczące testu wskaźnikowego i z zastosowaniem co najmniej dwóch wskaźników redox, szczepów Bacillus stearothermophilus lub Streptococcus thermophilus w stężeniu 10⁵-10⁹ CFU/ml pożywki. Zwiększenie czułości testu na sulfonamidy i penicyliny osiągnięto przez stosowanie trimethoprimu, ortometoprimu i tetrxoprimu nie podając ich stężenia, a osłabienie czułości na penicyliny, do wartości narzuconej Dyrektywami Unii Europejskiej, osiągnięto przez stosowanie cysteiny.EP 0 601 001 A1 describes a solution for an indicator test and with the use of at least two redox indicators, Bacillus stearothermophilus or Streptococcus thermophilus strains in a concentration of 10 ⁵ -10 ⁹ CFU / ml of medium. Increasing the sensitivity of the test to sulfonamides and penicillins was achieved by using trimethoprim, orthometoprim and tetrxoprim without specifying their concentration, and the reduction of sensitivity to penicillins, to the value imposed by the European Union Directives, was achieved by the use of cysteine.

W opisie patentowym WO 96/23901 wskazano na stosowanie szczepów Bacillus stearothermopilus var calidolactis C 953 i Streptococcus thermophilus 101 w stężeniu 2 x 10⁷ -3 x 10⁸ CFU/ml pożywki.WO 96/23901 describes the use of Bacillus stearothermopilus var calidolactis C 953 and Streptococcus thermophilus 101 strains in a concentration of 2 x 10 ⁷ -3 x 10 ⁸ CFU / ml of medium.

Z Official Journal of the European Communities No L 93 s 39 znane są metody wykrywania obecności penicylin i sulfonamidów na podstawie tworzenia strefy braku wzrostu wokół miejsca naniesienia badanej próbki na testową płytkę Petriego z pożywką testową zawierającą szczep testowy Bacillus stearothermophilus. Opisane są też tam metody identyfikacji penicylin i ich ilościowego oznaczenia.Methods for detecting the presence of penicillins and sulfonamides from the Official Journal of the European Communities No L 93 s 39 are known by creating a zone of no growth around the application site of the test sample on a Petri test dish with a test medium containing the Bacillus stearothermophilus test strain. It also describes methods for penicillin identification and quantification.

W znanych metodach brak jest gwarancji standaryzacji oznaczeń, co może prowadzić do błędów i różnej czułości metod w różnych laboratoriach. Stosowanie w tych znanych metodach peptonu-tryptonu, w obecności trimethoprimu powoduje częściowe hamowanie wzrostu szczepu testowego atym samym niedostateczną czułość tych metod na sulfonamidy.The known methods do not guarantee standardization of the determinations, which can lead to errors and different sensitivity of the methods in different laboratories. The use of peptone-tryptone in these known methods in the presence of trimethoprim partially inhibits the growth of the test strain, and thus insufficient sensitivity of these methods to sulfonamides.

Celem wynalazku jest opracowanie takiego składu preparatu do badań metodą oceny hamowania wzrostu szczepu i takiego jego przygotowania, który zagwarantuje wyeliminowanie substancji hamujących wzrost szczepu testowego, zapewni standardowość, zwłaszcza pod względem koncentracji szczepu testowego, a tym samym powtarzalność wyników w różnych laboratoriach oraz wymaganą czułość zarówno wobec antybiotyków jak i sulfonamidów, a równocześnie preparat będzie łatwy w stosowaniu w laboratoriach.The aim of the invention is to develop such a composition of the test preparation by the method of evaluating the inhibition of the growth of the strain and its preparation, which will guarantee the elimination of substances inhibiting the growth of the test strain, ensure standardization, especially in terms of the concentration of the test strain, and thus the reproducibility of the results in various laboratories and against antibiotics and sulfonamides, and at the same time the preparation will be easy to use in laboratories.

Istota wynalazku w zakresie preparatu polega na tym, że składa się z pięciu składników, z którychThe essence of the invention in terms of the formulation consists in the fact that it consists of five components, of which

ekstrakt drożdżowy w ilości 4%wag - 13,51% wag aminobak w ilości 12% wag - 24,32% wag ekstrakt mięsny w ilości 4% wag - 8,11% wag agar w ilości 54% wag -80% wag4 wt% yeast extract - 13.51 wt% 12 wt% aminobac - 24.32 wt% meat extract 4 wt% - 8.11 wt% 54 wt% agar -80 wt%

PL 196 107 B1PL 196 107 B1

- drugi składnik, użyty w ilości 0,03-0,08 g do przygotowania pożywki testowej jest liofilizowanym szczepem testowym Bacillus stearothermophilus var calidolactis o stężeniu przetrwalników 1 x 10⁸ 5 x 10⁸ CFU/fiolkę- the second component, used in an amount of 0.03-0.08 g to prepare the test medium, is a lyophilized test strain of Bacillus stearothermophilus var calidolactis with a spore concentration of 1 x 10 ⁸ 5 x 10 ⁸ CFU / vial

Istota wynalazku w zakresie odmiany preparatu polega na tym, że składa się z trzech składników, z którychThe essence of the invention in the scope of the formulation variety consists in the fact that it consists of three components, of which

- pierwszym składnikiem jest zżelifikowana pożywka testowa na płytce Petriego, będąca mieszaniną o składzie ekstrakt drożdżowy..................... 0,10 g -0,50 g aminobak.................................... 0,30 g -0,90 g ekstrakt mięsny........................... 0,10 g -0,30 g agar ( żelifikator)......................... 1 g -2 g trimethoprim................................ 3 mg -10 mg liofilizowany szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis....- the first component is a gelled test medium on a petri dish, which is a mixture of the composition yeast extract ..................... 0.10 g -0.50 g amine mushroom .. .................................. 0.30 g -0.90 g meat extract ..... ...................... 0.10 g -0.30 g agar (gelling agent) ............... .......... 1 g -2 g trimethoprim ................................ 3 mg -10 mg lyophilized test strain Bacillus stearothermophilus var calidolactis ....

..........1-2 x 10⁵ CFU woda............................................ 1 00 ml.......... 1-2 x 10 ⁵ CFU water ................................ ............ 1 00 ml

- drugi składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 do 10 ml badanej próbki- the second component is an auxiliary substance for the identification of penicillins, especially penicillinase with an activity of 1000 U / vial, used in the form of a solution with an activity of 100 U / ml and added in an amount of 0.4 to 10 ml of the test sample

- trzeci składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.- the third component is an auxiliary substance for the identification of sulfonamides, especially p-aminobenzoic acid p.a. in the amount of 1 g / vial used in the amount of 1 ml of 1% solution to 10 ml of the test sample.

Istota wynalazku w zakresie sposobu standaryzacji szczepu testowego polega na tym, że szczep Bacillus stearothermophilus var calidolactis namnaża się na pożywce namnażającej o składzie:The essence of the invention in terms of the method of standardization of the test strain consists in the fact that the Bacillus stearothermophilus var calidolactis strain is multiplied on the multiplication medium with the following composition:

ekstrakt mięsny................................... 0,2 -0,6 g ekstrakt drożdżowy............................. 1,0 -3,8 g pepton, zwłaszcza Peptobak................. 2 - 6g enzymatyczny hydrolizat kazeiny.........3,4 -6,4 g chlorek sodowy NaCl..............................3 -4 g chlorek manganawy MnCl2 x H2O.......0,02 -0,04 g agar........................................................10 -20 g woda destylowana................................. 1 000 ml i wykonuje się zmyw powierzchniowy hodowli za pomocą zbuforowanej 0,1% wody peptonowej, po czym uzyskaną zawiesinę pasteryzuje się w temperaturze 85°C przez 10 min, oznacza się liczbę przetrwalników i oblicza się ilość ml zawiesiny, którą należy wprowadzić do fiolki liofilizacyjnej aby uzyskać koncentrację przetrwalników 1 x 10⁸ -5 x 10⁸ CFU/fiolkę, wyliczoną ilość ml zawiesiny przenosi się do fiolki i liofilizuje, a następnie oznacza się koncentrację przetrwalników w fiolce i na tej podstawie wylicza się ilość ml odczynnika uwadniającego, korzystnie roztworu trimothioprimu, którą należy dodać do fiolki, miesza się wszystkie składniki aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny wodnej i przenosi taką ilość ml zawiesiny do pożywki testowej przeznaczonej do oznaczania antybiotyków i sulfonamidów aby uzyskać koncentrację przetrwalników 1-2 x 10⁵ CFU w 1 ml tej pożywki, która to koncentracja stanowi o standardowości szczepu testowego.meat extract ................................... 0.2 -0.6 g yeast extract ... .......................... 1.0 -3.8 g peptone, especially Peptobak ............ ..... 2 - 6 g enzymatic hydrolyzate of casein ......... 3.4 -6.4 g sodium chloride NaCl ................... ........... 3 -4 g manganese chloride MnCl2 x H2O ....... 0.02 -0.04 g agar .............. .......................................... 10 -20 g distilled water .. ............................... 1000 ml and the culture surface wash is made with 0.1% buffered peptone water, then the obtained suspension is pasteurized at a temperature of 85 ° C for 10 min, the number of spores is determined and the amount of ml of suspension that should be introduced into a lyophilization vial is calculated to obtain a spore concentration of 1 x 10 ⁸ -5 x 10 ⁸ CFU / vial, calculated the amount of ml of suspension is transferred to the vial and lyophilized, and then the concentration of spores in the vial is determined, and on this basis the amount of ml of the rehydrating reagent is calculated it, preferably the trimothioprim solution to be added to the vial, mix all the ingredients until a homogeneous aqueous suspension is obtained and transfer such an amount of ml of the suspension to the test medium for the determination of antibiotics and sulfonamides to obtain a spore concentration of 1-2 x 10 ⁵ CFU per 1 ml of this medium, which concentration determines the standard of the test strain.

Istota wynalazku w zakresie sposobu przygotowywania płytki testowej do badań, zawierającej preparat według wynalazku, polega na tym, że komponent odżywczy rozpuszcza się w 95-100 ml odczynnika uwadniającego, upłynnia się go przez ogrzewanie w temperaturze około100°C, ustala się pH tak, aby po sterylizacji było 6,8 ± 0,1, przeprowadza się sterylizację otrzymanego materiału w temperaturze 121°C przez 15 min, ochładza się do temperatury 55-60°C, dodaje się jednorodną zawiesinę liofilizowanego szczepu testowego, tak, aby uzyskać w pożywce testowej koncentrację przetrwalni4The essence of the invention in terms of the method of preparing a test plate containing the formulation according to the invention is that the nutrient component is dissolved in 95-100 ml of the hydrating reagent, it is liquefied by heating at a temperature of about 100 ° C, the pH is adjusted so that after sterilization it was 6.8 ± 0.1, the obtained material is sterilized at a temperature of 121 ° C for 15 min, it is cooled to a temperature of 55-60 ° C, a homogeneous suspension of the lyophilized test strain is added, so as to obtain in the test medium persistent concentration 4

PL 196 107 B1 ₅ ków 1-2 x 10⁵ CFU/ml postępując sposobem według wynalazku i uzyskaną pożywkę testową wylewa się do płytki Petriego, otrzymując w ten sposób płytkę testową do oznaczania antybiotyków i sulfonamidów w badanym materiale.GB 196 107 B1 ₅ NEB 1-2 x 10 ⁵ CFU / ml following the present invention and the resulting test medium poured into a Petri dish, thus obtaining a test plate for the determination of antibiotics and sulfonamides in the material.

Istota wynalazku w zakresie sposobu przygotowywania płytki testowej do badań, zawierającej odmianę preparatu według wynalazku, polega na tym, że do 100 ml wody dodaje się składniki pożywki testowej preparatu według odmiany wynalazku, z tym, że trimethoprim dodaje się w postaci wodnego roztworu trimethoprimu o stężeniu 5 mg/ml sporządzonego po uprzednim rozpuszczeniu trimethoprimu w 95%-owym alkoholu etylowym, następnie upłynnia się w temperaturze około 100°C, ustala się pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,8 ± 0,1, sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 15 min, ochładza się do temperatury 55-60°C, dodaje się zawiesinę przetrwalników szczepu testowego otrzymanego według wynalazku, dokładnie miesza się i rozlewa po 10 ml do płytek Petriego i pozostawia do zestalenia.The essence of the invention in terms of the method of preparing a test plate for tests containing a formulation variant according to the invention, consists in adding to 100 ml of water the components of the test medium of the formulation according to the invention variant, but trimethoprim is added in the form of an aqueous solution of trimethoprim with a concentration of 5 mg / ml prepared after dissolving trimethoprim in 95% ethyl alcohol, then liquefying at a temperature of about 100 ° C, the pH after sterilization is adjusted to 6.8 ± 0.1, and sterilized at 121 ° C C for 15 min, cool to 55-60 ° C, add the spore suspension of the test strain obtained according to the invention, mix thoroughly and pour 10 ml into petri dishes and leave to solidify.

Wynalazek pozwala na szybkie i równoczesne określenie w warunkach laboratoryjnych obecności w materiale płynnym tak antybiotyków jak i sulfonamidów, identyfikację tych substancji, a także pozwala na określenie w badanym materiale ilości obecnych penicylin. Badanie przeprowadzone z wykorzystaniem preparatów według wynalazku ze względu na standardowość pozwala na osiągnięcie powtarzalnych wyników badań w różnych laboratoriach, przy równoczesnym zapewnieniu odpowiedniej czułości w zakresie oznaczania zarówno antybiotyków jak i sulfonamidów. Zaletą wynalazku jest obniżenie kosztów związanych z użyciem szczepu testowego, czyli liofilizowanego szczepu testowego Bacillus stearothermophilus var calidolactis, a to wskutek 10-krotnego zmniejszenia dodatku szczepu dzięki zastosowaniu peptonu aminobaku, nie zawierającego zanieczyszczeń hamujących wzrost szczepu testowego zamiast tryptonu. Dwie odmiany preparatu zaspakajają różne zapotrzebowanie laboratoriów: na preparat do bezpośredniego użycia, lecz mniej trwały lub na preparat o długiej trwałości, stanowiący rezerwę do użycia w przypadkach spornych, np. pomiędzy producentem mleka a zakładem skupującym mleko.The invention allows for quick and simultaneous determination in laboratory conditions of the presence of both antibiotics and sulfonamides in a liquid material, identification of these substances, and also allows to determine the amount of penicillins present in the tested material. The test carried out with the use of the preparations according to the invention, due to their standardization, allows to achieve reproducible test results in various laboratories, while ensuring appropriate sensitivity in the determination of both antibiotics and sulfonamides. The advantage of the invention is the reduction of the costs associated with the use of the test strain, i.e. the lyophilized test strain Bacillus stearothermophilus var calidolactis, due to the 10-fold reduction in the addition of the strain due to the use of aminobaku peptone, which does not contain impurities that inhibit the growth of the test strain instead of tryptone. Two varieties of the preparation satisfy different needs of laboratories: for a preparation for direct use, but less durable, or for a preparation with long-lasting durability, constituting a reserve for use in disputable cases, e.g. between a milk producer and a milk purchasing plant.

Przedmiot wynalazku zostanie dokładniej opisany w poniższych przykładach.The subject of the invention will be described in more detail in the following examples.

P r zy k ł a d 1Example 1

W przykładzie jest przedstawiony preparat według wynalazku i jego przygotowanie do wykrywania antybiotyków i sulfonamidów w mleku.The example shows a preparation according to the invention and its preparation for the detection of antibiotics and sulfonamides in milk.

Do sporządzenia komponentu odżywczego, wchodzącego w skład preparatu według wynalazku, użyto:To prepare the nutrient component of the formulation according to the invention, the following were used:

ekstrakt drożdżowy w ilości 0,30 g aminobak 0,60 g ekstrakt mięsny 0,15 g agar 2 gyeast extract in the amount of 0.30 g, aminobook, 0.60 g, meat extract, 0.15 g, agar, 2 g

Składniki te wymieszano i szczelnie zamknięto.These ingredients were mixed and sealed.

Następnie przygotowano liofilizowany szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis. W tym celu wykonano kilkustopniowe namnożenie szczepu, spasteryzowano hodowlę, oznaczono w niej liczbę przetrwalników i poddano liofilizacji. Namnażanie wykonano na pożywce namnażającej o składzie:A lyophilized test strain of Bacillus stearothermophilus var calidolactis was then prepared. For this purpose, the multiplication of the strain was carried out in several stages, the culture was pasteurized, the number of spores was determined and freeze-dried. The multiplication was performed on the multiplication medium with the following composition:

ekstrakt mięsny meat extract 0,4 g 0.4 g ekstrakt drożdżowy yeast extract 1,7 g 1.7 g pepton Peptobak peptone Peptobak 4,0 g 4.0 g enzymatyczny hydrolizat kazeiny enzymatic casein hydrolyzate 5,4 g 5.4 g chlorek sodowy NaCl sodium chloride NaCl 3,5 g 3.5 g chlorek manganawy MnCl2 x H2O manganese chloride MnCl2 x H2O 0,03 g 0.03 g agar agar 20,0 g 20.0 g woda destylowana distilled water 1000 ml 1000 ml Pożywkę rozlano do probówek oraz do butli Roux, sterylizowano w temperaturze 121°C przez The medium was poured into test tubes and Roux bottles, sterilized at 121 ° C for

min. i ustalono pH pożywki tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,5 do 6,7. Szczep najpierw namnażano na skosie z pożywką namnażającą w temperaturze 55°C przez 24-48 godzin. Uzyskaną hodowlę powierzchniową szczepu na skosie zmywano zbuforowaną wodą peptonową i uzyskaną zawiesinę pasteryzowano w temperaturze 85°C przez 10 min. Następnie pożywkę namnażającą w butlach Roux szczepiono spasteryzowaną zawiesiną i dalej postępowano identycznie jak w przypadku hodowli na skosie. W spasteryzowanej zawiesinie z butli Roux oznaczono liczbę przetrwalników i rozlewano do fiolek liofilizacyjnych taką ilość zawiesiny, aby po liofilizacji, w każdej fiolce koncentracja przetrwalniPL 196 107 B1 ków była 1 x 10⁸ -5 x 10⁸ CFU. Ponownie oznaczono koncentrację przetrwalników w liofilizacie celem dokładnej ich standaryzacji w pożywce testowej przygotowywanej do przeprowadzenia oznaczenia antybiotyków i sulfonamidów w badanym materiale.min. and the pH of the medium was adjusted to be 6.5 to 6.7 after sterilization. The strain was first propagated on a slant with the cultivation medium at 55 ° C for 24-48 hours. The obtained surface culture of the strain on the slant was washed with buffered peptone water and the resulting suspension was pasteurized at 85 ° C for 10 min. Then, the cultivation medium in Roux bottles was inoculated with the pasteurized suspension and the procedure was followed identically as in the case of the slant culture. In the pasteurized suspension from the Roux bottle, the number of spores was determined and the amount of suspension was poured into lyophilization vials such that after lyophilization, the concentration of survivors in each vial was 1 x 10 ⁸ -5 x 10 ⁸ CFU. The concentration of spores in the lyophilisate was again determined in order to precisely standardize them in the test medium prepared for the determination of antibiotics and sulfonamides in the tested material.

Dalej, przygotowano odczynnik uwadniający, potrzebny do uwodnienia komponentu odżywczego i liofilizowanego szczepu. W tym celu do 99 ml wody destylowanej dodawano 1 ml stężonego roztworu trimethoprimu zawierającego 5 mg tego składnika w 1 ml i szczelnie zamknięto. Stężony roztwór przygotowano przez rozpuszczenie 5 mg trimethoprimu w 5 ml 96% etanolu i uzupełnienie wodą destylowaną do 1000 ml.Further, a hydrating reagent needed to hydrate the nutrient component and the lyophilized strain was prepared. For this, 1 ml of concentrated trimethoprim solution containing 5 mg of this component in 1 ml was added to 99 ml of distilled water and sealed. The concentrated solution was prepared by dissolving 5 mg of trimethoprim in 5 ml of 96% ethanol and making up to 1000 ml with distilled water.

Przygotowano także penicylinazę o aktywności 1000 U/fiolkę i kwas p-aminobenzoesowy cz.d.a. (PABA) w ilości 1 g.Penicillinase with the activity of 1000 U / vial and p-aminobenzoic acid p.a. were also prepared. (PABA) in the amount of 1 g.

Przystąpiono do przygotowania płytek testowych, czyli płytek Petriego o średnicy 9 cm zawierających pożywkę testową. Najpierw przygotowano pożywkę testową. W tym celu komponent odżywczy rozpuszczono w 100 ml odczynnika uwadniającego, upłynniano go przez ogrzewanie w temperaturze około 100°C i pH ustalono tak, aby po sterylizacji było 6,8 ± 0,1. Przeprowadzono sterylizację otrzymanego materiału w temperaturze 121°C przez 15 min i ochłodzono go do temperatury 55-60°C. Następnie dodawano jednorodną zawiesinę liofilizowanego szczepu testowego tak, aby uzyskać w pożywce testowej koncentrację przetrwalników 1-2 x 10⁵ CFU/ml. W przypadku, gdy fiolka zawierała przetrwalniki w ilości 1 x 10⁸ CFU, to jej zawartość zawieszano w 2,5 ml odczynnika uwadniąjącego i do 100 ml pożywki dodawano 0,5 ml zawiesiny przetrwalników. Tak przygotowaną pożywkę testową o standardowej zawartości przetrwalników rozlewano po 10 ml na płytkę Petriego o średnicy 9 cm i pozostawiono do żelifikacji. Uzyskano warstwę pożywki o grubości około 2 mm. Płytki pakowano w woreczki polietylenowe, szczelnie zamykano i przechowywano do 14 dni w temperaturze 4-6°C.The preparation of test plates, i.e. Petri dishes with a diameter of 9 cm, containing the test medium, was started. First, the test medium was prepared. For this purpose, the nutrient component was dissolved in 100 ml of the rehydrating reagent, liquefied by heating at a temperature of about 100 ° C, and the pH was adjusted to be 6.8 ± 0.1 after sterilization. The obtained material was sterilized at 121 ° C for 15 minutes and cooled to 55-60 ° C. Then added a homogeneous suspension of the lyophilized test strain so as to obtain in an assay medium the concentration of spores of 1-2 x 10 ⁵ CFU / ml. In the case where the vial contained 1 x 10 ⁸ CFU spores, its content was suspended in 2.5 ml of the hydrating reagent and 0.5 ml of the spore suspension was added to 100 ml of the medium. The test medium prepared in this way with a standard spore content was poured 10 ml into a petri dish with a diameter of 9 cm and allowed to gelatinize. A medium layer thickness of about 2 mm was obtained. Plates were packed in polyethylene bags, sealed and stored for up to 14 days at 4-6 ° C.

Badaną próbkę mleka nanoszono na powierzchnię pożywki testowej w płytce testowej za pomocą mikropipety do studzienek. W warstwie pożywki testowej na płytce Petriego o średnicy 9 cm wycinano 6 studzienek o średnicy 10 ± 1 mm i nanoszono 0,1 ml spasteryzowanej, badanej próbki mleka oraz próbkę kontrolną bez substancji hamujących. Inkubowano w temperaturze 65 ± 1°C przez 3,5-4 godzin. Obecność substancji hamujących oceniano na podstawie powstawania stref hamowania. W przypadku obecności antybiotyków w badanym mleku strefy hamowania były przezroczyste, aw przypadku obecności sulfonamidów stwierdzono w obrębie strefy hamowania większe lub mniejsze przerzedzenie wzrostu, a nie całkowite zahamowanie wzrostu.The test milk sample was applied to the surface of the test medium in the test plate by means of a well micropipette. In the layer of the test medium in a petri dish with a diameter of 9 cm, 6 wells with a diameter of 10 ± 1 mm were cut out and 0.1 ml of the pasteurized test milk sample and a control sample without inhibitory substances were applied. Incubated at 65 ± 1 ° C for 3.5-4 hours. The presence of inhibitory substances was assessed on the basis of the formation of inhibition zones. In the case of the presence of antibiotics in the tested milk, the zones of inhibition were transparent, and in the case of the presence of sulfonamides within the inhibition zone, greater or less thinning of growth, rather than complete growth inhibition, was found within the inhibition zone.

Dla przeprowadzenia identyfikacji penicylin, na przygotowaną płytkę testową nanoszono: badaną próbkę mleka, próbkę mleka po reakcji z penicylinazą, próbkę nie zawierającą substancji hamujących oraz roztwór zawierający 0,004 mg penicyliny w 1 ml mleka. Wcześniej, do 10 ml próbki mleka dodawano 0,4 ml roztworu penicylinazy o stężeniu 100 U/ml, dokładnie wymieszano i pozostawiono na 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie płytki inkubowano w temperaturze 65°C przez 3,5-4 godzin i po tym czasie odczytywano wyniki na płytce testowej. Jeśli stwierdzono brak strefy hamowania wokół krążka lub studzienki z próbką mleka z penicylinazą, a strefa taka występowała dla badanej próbki mleka i była zbliżona do strefy wokół krążka kontrolnego z 0,004 mg penicyliny w 1 ml, to substancja hamująca w próbce odpowiadała penicylinie sodu lub potasu o stężeniu co najmniej 0,004 mg/ml.To identify penicillins, the following were applied to the prepared test plate: a test sample of milk, a sample of milk after reaction with penicillinase, a sample containing no inhibitory substances and a solution containing 0.004 mg of penicillin in 1 ml of milk. Previously, 0.4 ml of a penicillinase solution with a concentration of 100 U / ml was added to 10 ml of the milk sample, mixed thoroughly and left for 30 minutes at room temperature. The plates were then incubated at 65 ° C for 3.5-4 hours after which time the results were read on the test plate. If there was no inhibition zone around the disc or well with penicillinase milk sample, and such zone was present for the tested milk sample and was similar to the zone around the control disc with 0.004 mg penicillin in 1 ml, then the inhibitory substance in the sample corresponded to sodium or potassium penicillin by at a concentration of at least 0.004 mg / ml.

Jeżeli w badanej próbce nie wykryto penicylin, tzn. stwierdzono strefę hamowania pomimo dodania do próbki penicylinazy, to dalsze badanie prowadzono w kierunku obecności sulfonamidów. Wtym celu na przygotowaną płytkę testową nanoszono próbkę po reakcji z kwasem p-aminobenzoesowym (PABA), próbkę badaną i próbkę kontrolną nie zawierającą substancji hamujących. Wcześniej, do 10 ml próbki badanego mleka dodawano 1 ml 1% roztworu PABA i dokładnie mieszano. Płytki inkubowano w temp. 65°C przez 3,5-4 godzin i po tym czasie odczytywano wyniki. Jeżeli strefa hamowania wzrostu lub przerzedzenia wzrostu występowała wokół studzienki z badaną próbką bez dodatku kwasu p-aminobenzoesowego, a nie stwierdzono po jego dodatku, to próbka zawiera sulfonamidy.If no penicillins were detected in the test sample, i.e. a zone of inhibition was found despite the addition of penicillinase to the sample, further testing was carried out for the presence of sulfonamides. For this purpose, the sample after reaction with p-aminobenzoic acid (PABA), the test sample and the control sample without inhibitory substances were applied to the prepared test plate. Previously, 1 ml of 1% PABA solution was added to a 10 ml sample of the test milk and thoroughly mixed. The plates were incubated at 65 ° C for 3.5-4 hours and the results were read after this time. If a zone of growth inhibition or growth thinning was present around the well with the test sample without p-aminobenzoic acid addition, and not found after its addition, the sample contains sulfonamides.

Ilościowe oznaczenie zawartości penicylin w badanej próbce mleka przeprowadzono poprzez mierzenie suwmiarką średnic otrzymanych stref hamowania i porównanie wyniku z krzywą wzorcową. Ilość penicyliny odczytywano z tej krzywej. Dla każdej partii preparatu według wynalazku przygotowywano krzywą wzorcową. Wykonywano ją przez nanoszenie na płytkę testową próbek mleka z dodatkiem standardu penicyliny G-potasowej w stężeniu 0,002; 0,004; 0,008; 0,016; 0,032 i 0,064 mg/ml i zmierzeniu średnicy strefy hamowania wzrostu szczepu dla każdego stężenia.The quantitative determination of the penicillin content in the tested milk sample was carried out by measuring the diameters of the obtained zones of inhibition with a caliper and comparing the result with the standard curve. The amount of penicillin was read from this curve. A standard curve was prepared for each batch of the formulation according to the invention. It was performed by applying to the test plate milk samples with the addition of the G-potassium penicillin standard at a concentration of 0.002; 0.004; 0.008; 0.016; 0.032 and 0.064 mg / ml and measuring the diameter of the zone of inhibition of growth of the strain for each concentration.

PL 196 107 B1PL 196 107 B1

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

W przykładzie przedstawiona jest odmiana preparatu według wynalazku i jego przygotowanie do wykrywania antybiotyków i sulfonamidów w mleku. Postępowanie przy identyfikacji antybiotyków i sulfonamidów jest takie samo, zatem w przykładzie tym zostanie opisana różnica w przygotowaniu płytki testowej, w porównaniu z opisanym postępowaniem z przykładu 1.The example shows a formulation variant according to the invention and its preparation for the detection of antibiotics and sulfonamides in milk. The procedure for identifying antibiotics and sulfonamides is the same, so this example will describe the difference in the preparation of the test plate compared to the procedure described in example 1.

Zgodnie z wynalazkiem, płytkę testową przygotowano przez dodanie do 100 ml wody składników pożywki testowej o składzie:According to the invention, a test plate was prepared by adding to 100 ml of water the components of the test medium having the following composition:

ekstrakt drożdżowy 0,30 g aminobak 0,40 g ekstrakt mięsny 0,15 g trimethoprim, w postaci wodnego roztworu, 1 ml i o stężeniu 5 mg/ml agar 2,0 gyeast extract 0.30 g aminobook 0.40 g meat extract 0.15 g trimethoprim, in the form of an aqueous solution, 1 ml at a concentration of 5 mg / ml 2.0 g agar

Wodny roztwór trimethoprimu sporządzono po uprzednim rozpuszczeniu trimethoprimu w 95%owym alkoholu etylowym. Składniki pożywki testowej upłynniono w temperaturze około 100°C i ustalono pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,8 ± 0,1. Przeprowadzono sterylizację w temperaturze 121°C przez 15 min i ochłodzono do temperatury 55-60°C. Dodano zawiesinę liofilizowanego szczepu testowego Bacillus stearotherophilus var calidlactis, wykonaną jak w przykładzie 1 w takiej ilości, aby ₅ otrzymać standardową koncentrację przetrwalników w pożywce wynoszącą 1-2 x 10⁵ CFU/ml, dokładnie wymieszano i rozlano do płytek Petriego o średnicy 9 cm po 10 ml i pozostawiono do zestalenia. Płytki tak przygotowane szczelnie zamykano i przechowywano do 14 dni.An aqueous solution of trimethoprim was prepared after dissolving trimethoprim in 95% ethanol. The components of the test medium were liquefied at a temperature of about 100 ° C and the pH was adjusted to be 6.8 ± 0.1 after sterilization. Sterilization was performed at 121 ° C for 15 min and cooled to 55-60 ° C. A suspension of the lyophilized test strain Bacillus stearotherophilus var calidlactis, made as in Example 1 in an amount _{of 5} to obtain a standard concentration of spores in the medium of 1-2 x 10 ⁵ CFU / ml, mixed thoroughly and poured into Petri dishes of 9 cm diameter when 10 ml and allowed to solidify. The plates prepared in this way were tightly closed and stored for up to 14 days.

Wykrywanie obecności antybiotyków i sulfonamidów, przy użyciu tak przygotowanych płytek testowych, wykonano tak jak w przykładzie 1, podobnie jak i określenie ilości obecnych penicylin.Detection of the presence of antibiotics and sulfonamides, using the test plates prepared in this way, was performed as in Example 1, as was the determination of the amount of penicillins present.

Opisane w przykładzie 1 i 2 procedury przygotowania płytek testowych do badania pozwalają na wykonanie badania materiału płynnego w takim zakresie jak wykrycie obecności antybiotyków i sulfonamidów z czułością wymaganą w Dyrektywach Unii Europejskiej. Badania porównawcze, wykonane przy użyciu metod zalecanych przez normy, przykładowo unijne, oraz z zastosowaniem wynalazku, wykazały, że badanie wykonane z użyciem wynalazku, w zakresie czułości wobec antybiotyków i sulfonamidów, powtarzalności wyników i standaryzacji wielokrotnie były lepsze. Ponadto rozwiązanie według wynalazku pozwala na wygodę w pracy laboratoryjnej i na szybkie otrzymanie wiążących wyników oraz 10-krotnie mniejsze zużycie najdroższego składnika, czyli szczepu testowego. Preparat opisany w przykładzie pierwszym jest trwały i może być przechowywany przez 18 miesięcy w temperaturze 4-6°C, zaś drugi preparat, opisany w przykładzie 2, ma krótszą trwałość, do około 2 tygodni, przeznaczony jest do bezpośredniego użycia, natomiast jest wygodniejszy w użyciu, gdyż jego postać jest od razu przydatna do użycia, bez dodatkowych czynności laborantów.The procedures for the preparation of test plates for testing described in example 1 and 2 allow the testing of liquid material to the extent such as detection of the presence of antibiotics and sulfonamides with the sensitivity required by the European Union Directives. Comparative tests carried out using the methods recommended by standards, for example EU standards, and with the use of the invention, showed that the test carried out with the use of the invention, in terms of sensitivity to antibiotics and sulfonamides, reproducibility of results and standardization were many times better. In addition, the solution according to the invention allows for convenience in laboratory work and for quick obtaining of binding results and 10 times lower consumption of the most expensive component, i.e. the test strain. The preparation described in Example 1 is stable and can be stored for 18 months at 4-6 ° C, while the second preparation described in Example 2 has a shorter shelf life, up to about 2 weeks, is intended for direct use, while it is more convenient to use. use, because its form is immediately usable, without any additional activities by the lab technicians.

Claims

Patent claims

........... 1-2 x 10 ⁵ CFU water ............................... ............ 1 00 ml

- the second component is an auxiliary substance for the identification of penicillins, especially penicillinase with an activity of 1000 U / vial, used in the form of a solution with an activity of 100 U / ml and added in an amount of 0.4 to 10 ml of the test sample

- the third component is an auxiliary substance for the identification of sulfonamides, especially p-aminobenzoic acid p.a. in the amount of 1 g / vial used in the amount of 1 ml of 1% solution to 10 ml of the test sample.

1. Preparation for detecting the presence of antibiotics and sulfonamides, especially in a liquid material, identification of penicillins and sulfonamides and quantitative determination of penicillins in this material, containing nutrients, gelifikator, Bacillus stearothermophilus var calidolactis test strain, characterized by the fact that it consists of five components, which

- the first component, used in the amount of 2.5-3.7 g to prepare 70-120 ml of the test medium, is a nutrient component with the following composition:

Aminobak yeast extract meat extract agar in the amount of 4 wt.% in the amount of 12 wt.% in the amount of 4 wt.% in the amount of 54 wt.%

% 13.51 wt.% 24.32 wt.%

8.11 wt.% 80 wt.%

- the second component, used in an amount of 0.03-0.08 g to prepare the test medium, is a lyophilized test strain of Bacillus stearothermophilus var calidolactis with a spore concentration of 1 x 10 ⁸ 5 x 10 ⁸ CFU / vial

- the third component is a hydrating reagent used in an amount of 70-120 ml to prepare the test medium containing trimethoprim at a concentration of 0.03-0.13 mg / ml or a dry reagent used in an amount of 3-13 mg, to which is added distilled water in amount of 70-120 ml

PL 196 107 B1

- the fourth component is an auxiliary substance for the identification of penicillins, especially penicillinase with an activity of 1000 U / vial, used in the form of a solution with an activity of 100 U / ml and added in the amount of 0.4 ml to 10 ml of the test sample

- the fifth component is an auxiliary substance for the identification of sulfonamides, especially p-aminobenzoic acid p.a. in the amount of 1 g / vial used in the amount of 1 ml of 1% solution to 10 ml of the test sample.

2. Preparation for detecting the presence of antibiotics and sulfonamides, especially in liquid material, identification of penicillins and sulfonamides and quantitative determination of penicillins in this material, containing nutrients, gelifikator, Bacillus stearothermophilus var calidolactis test strain, characterized by the fact that it consists of three components, which

- the first component is a gelled test medium on a petri dish, which is a mixture of the composition yeast extract ..................... 0.10 g -0.50 g amine mushroom .. .................................. 0.30 g -0.90 g meat extract ..... ...................... 0.10 g -0.30 g agar (gelling agent) ............... ......... 1 g -2 g trimethoprim ................................ 3 mg - 10 mg lyophilized test strain Bacillus stearothermophilus var calidolactis .......

3. A method of standardizing the test strain Bacillus stearothermophilus var calidolactis, which is a component of a preparation according to claim 1, A method according to claims 1 and 2, characterized in that the strain Bacillus stearothermophilus var calidolactis is multiplied on the multiplication medium with the following composition:

meat extract ................................. 0.2 - 0.6 g yeast extract ..... ........................ 1, 0 -3.8 g peptone, especially Peptobak .............. .. 2 - 6 g enzymatic hydrolyzate of casein ......... 3.4 -6.4 g sodium chloride NaCl ..................... ...... 3 -4 g manganese chloride MnCl2x H2O ....... 0.02 -0.04 g agar .................... .................................. 10 -20 g distilled water .......... ..................... 1000 ml and a surface wash of the culture is made with 0.1% buffered peptone water, after which the obtained suspension is pasteurized at a temperature of 85 ° C for 10 min, the number of spores is determined and the amount of ml of suspension is calculated, which must be introduced into the lyophilization vial to obtain a spore concentration of 1 x 10 ⁸ - 5 x 10 ⁸ CFU / vial, the calculated amount of ml of suspension is transferred to a vial and lyophilized, and then the concentration of spores in the vial is determined, and on this basis the amount of ml of the hydrating reagent is calculated, zystnie trimothioprimu solution to be added to the vial, mix all of the ingredients until a uniform aqueous slurry, and transfers an amount ml of the suspension to the assay medium designed for the determination of antibiotics and sulphonamides to obtain a spore concentration of 1-2 x 10 ⁵ CFU in 1 ml of the medium, which concentration determines the standard of the test strain.

A method for preparing a test plate containing a formulation according to claim 1; A method according to claim 1, characterized in that the nutrient component is dissolved in 95-100 ml of a hydrating reagent, it is liquefied by heating at a temperature of about 100 ° C, the pH is adjusted so that after sterilization it is 6.8 ± 0.1, sterilization is carried out the material obtained at 121 ° C for 15 min, cooled to 55-60 ° C, an homogeneous suspension of the lyophilized test strain is added to obtain a spore concentration of 1-2 x 10 ⁵ CFU / ml in the test medium, following the method according to claim . 3 and the obtained test medium is poured into a petri dish, thereby obtaining a test plate for the determination of antibiotics and sulfonamides in the test material.

PL 196 107 B1

5. A method of preparing a test plate containing a formulation according to claim 1; A formulation according to claim 2, wherein the components of the test medium of the formulation according to claim 2 are added to 100 ml of water. 2, except that trimethoprim is added as a 5 mg / ml aqueous solution of trimethoprim prepared after dissolving trimethoprim in 95% ethanol, then liquefying at about 100 ° C, adjusting the pH so that after sterilization is 6.8 ± 0.1, sterilize at 121 ° C for 15 min, cool to 55-60 ° C, add a spore suspension of the test strain obtained according to claim 1. 3, mixed thoroughly and poured 10 ml into petri dishes and allowed to solidify.