PL196107B1 - Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, a także sposób przygotowywania płytki testowej do badań i sposób standaryzacji szczepu testowego - Google Patents

Abstract

1. Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, zawierający substancje odżywcze, żelifikator, szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis, znamienny tym, że składa się z pięciu składników, z których - pierwszy składnik, użyty w ilości 2,5-3,7 g do przygotowania 70-120 ml pożywki testowej, jest komponentem odżywczym o składzie: 13,51% wag 24,32% wag 8,11% wag 80% wag - drugi składnik, użyty w ilości 0,03-0,08 g do przygotowania pożywki testowej jest liofilizowanym szczepem testowym Bacillus stearothermophilus var calidolactis o stężeniu przetrwalników 1 x 108 - 5 x 108 CFU/fiolkę - trzeci składnik jest odczynnikiem uwadniającym użytym w ilości 70-120 ml do przygotowania pożywki testowej, zawierającym trimethoprim w stężeniu 0,03-0,13 mg/ml lub odczynnikiem suchym użytym w ilości 3-13 mg, do którego dodaje się wodę destylowaną w ilości 70-120 ml - czwarty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 ml do 10 ml badanej próbki - piąty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)196107 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 357920 ^{(51) Int.Cl.}

C12Q 1/04 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 20.12.2002

Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, a także sposób przygotowywania płytki testowej do badań i sposób standaryzacji szczepu testowego

(43) Zgłoszenie ogłoszono: 28.06.2004 BUP 13/04	(73) Uprawniony z patentu: Laboratorium Analiz Mleka LAB-MLEK Spółka z o.o.,Olsztyn,PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.12.2007 WUP 12/07	(72) Twórca(y) wynalazku: Barbara Kawiorska,Olsztyn,PL Barbara Koterska,Olsztyn,PL Ewa Urbańska,Olsztyn,PL

ekstrakt drożdżowy aminobak ekstrakt mięsny agar w ilości 4%wag w ilości 12% wag w ilości 4% wag w ilości 54% wag (57) 1. Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, zawierający substancje odżywcze, żelifikator, szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis, znamienny tym, że składa się z pięciu składników, z których

- pierwszy składnik, użyty w ilości 2,5-3,7 g do przygotowania 70-120 ml pożywki testowej, jest komponentem odżywczym o składzie:

13,51% wag 24,32% wag 8,11% wag 80% wag

- drugi składnik, użyty w ilości 0,03-0,08 g do przygotowania pożywki testowej jest liofilizowanym szczepem testowym Bacillus stearothermophilus var calidolactis o stężeniu przetrwalników 1 x 10⁸ - 5 x 10⁸ CFU/fiolkę

- trzeci składnik jest odczynnikiem uwadniającym użytym w ilości 70-120 ml do przygotowania pożywki testowej, zawierającym trimethoprim w stężeniu 0,03-0,13 mg/ml lub odczynnikiem suchym użytym w ilości 3-13 mg, do którego dodaje się wodę destylowaną w ilości 70-120 ml

- czwarty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 ml do 10 ml badanej próbki

- piąty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.

PL 196 107 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, a także sposób przygotowywania płytki testowej do badań i sposób standaryzacji szczepu testowego. Wynalazek jest przydatny do wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczenia zanieczyszczeń materiałów płynnych substancjami antybakteryjnymi, takimi jak antybiotyki i sulfonamidy, występującymi przykładowo w mleku, a także w serach, mięsie i płynach ustrojowych (np. mocz) pod warunkiem przygotowania próbki tych materiałów w postaci płynnej i o obojętnym odczynie (pH 7 ± 0,1), czyli w sposób powszechnie stosowany do przygotowywania próbki do posiewów mikrobiologicznych.

Znane są testy dyfuzyjno-wskaźnikowe do wykrywania antybiotyków jak i sulfonamidów. W testach tych jako wskaźniki stosuje się barwniki, np. purpurę bromokreozolową, zmieniające kolor pożywki pod wpływem kwasu wytwarzanego przez szczep testowy, np. Bacillus stearothermophilus var calidolactis. Testy tego typu najczęściej są produkowane w probówkach, np. Delvotest Sp, BR-test As i inne. Wynik obecności antybiotyków lub sulfonamidów odczytuje się na podstawie zabarwienia pożywki. Testy dyfuzyjno-wskaźnikowe znane są z opisów patentowych EP 0 005 891, EP 0 601 001 A1, WO 96/23901. W opisach tych przedstawiono rozwiązania wykorzystujące różne szczepy, stężenie tych szczepów, stosowanie różnych dodatków do zwiększenia czułości szczepów na sulfonamidy lub obniżenie ich czułości na penicylinę.

I tak z opisu patentowego EP 0 005 891 znane jest rozwiązanie dotyczące testu wskaźnikowego do wykrywania antybiotyków i sulfonamidów, w którym przetrwalniki Bacillus stearothermophilus var calidolactis, w koncentracji 10⁵-10⁸ spor/ml i trimethoprim w koncentracji 10-120 mg/l co jest równoznaczne z 0,01-0,12 mg/ml, wprowadzane są do roztworu agaru. Bliżej nie sprecyzowane składniki odżywcze i barwnik wskaźnikowy dodawane są do roztworu agaru przed żelifikacją lub po żelifikacji w formie tabletek lub krążka bibułowego.

W opisie patentowym EP 0 601 001 A1 przedstawiono rozwiązanie dotyczące testu wskaźnikowego i z zastosowaniem co najmniej dwóch wskaźników redox, szczepów Bacillus stearothermophilus lub Streptococcus thermophilus w stężeniu 10⁵-10⁹ CFU/ml pożywki. Zwiększenie czułości testu na sulfonamidy i penicyliny osiągnięto przez stosowanie trimethoprimu, ortometoprimu i tetrxoprimu nie podając ich stężenia, a osłabienie czułości na penicyliny, do wartości narzuconej Dyrektywami Unii Europejskiej, osiągnięto przez stosowanie cysteiny.

W opisie patentowym WO 96/23901 wskazano na stosowanie szczepów Bacillus stearothermopilus var calidolactis C 953 i Streptococcus thermophilus 101 w stężeniu 2 x 10⁷ -3 x 10⁸ CFU/ml pożywki.

Z Official Journal of the European Communities No L 93 s 39 znane są metody wykrywania obecności penicylin i sulfonamidów na podstawie tworzenia strefy braku wzrostu wokół miejsca naniesienia badanej próbki na testową płytkę Petriego z pożywką testową zawierającą szczep testowy Bacillus stearothermophilus. Opisane są też tam metody identyfikacji penicylin i ich ilościowego oznaczenia.

W znanych metodach brak jest gwarancji standaryzacji oznaczeń, co może prowadzić do błędów i różnej czułości metod w różnych laboratoriach. Stosowanie w tych znanych metodach peptonu-tryptonu, w obecności trimethoprimu powoduje częściowe hamowanie wzrostu szczepu testowego atym samym niedostateczną czułość tych metod na sulfonamidy.

Celem wynalazku jest opracowanie takiego składu preparatu do badań metodą oceny hamowania wzrostu szczepu i takiego jego przygotowania, który zagwarantuje wyeliminowanie substancji hamujących wzrost szczepu testowego, zapewni standardowość, zwłaszcza pod względem koncentracji szczepu testowego, a tym samym powtarzalność wyników w różnych laboratoriach oraz wymaganą czułość zarówno wobec antybiotyków jak i sulfonamidów, a równocześnie preparat będzie łatwy w stosowaniu w laboratoriach.

Istota wynalazku w zakresie preparatu polega na tym, że składa się z pięciu składników, z których

- pierwszy składnik, użyty w ilości 2,5-3,7 g do przygotowania 70-120 ml pożywki testowej, jest komponentem odżywczym o składzie:

ekstrakt drożdżowy w ilości 4%wag - 13,51% wag aminobak w ilości 12% wag - 24,32% wag ekstrakt mięsny w ilości 4% wag - 8,11% wag agar w ilości 54% wag -80% wag

PL 196 107 B1

- drugi składnik, użyty w ilości 0,03-0,08 g do przygotowania pożywki testowej jest liofilizowanym szczepem testowym Bacillus stearothermophilus var calidolactis o stężeniu przetrwalników 1 x 10⁸ 5 x 10⁸ CFU/fiolkę

- trzeci składnik jest odczynnikiem uwadniającym użytym w ilości 70-120 ml do przygotowania pożywki testowej, zawierającym trimethoprim w stężeniu 0,03-0,13 mg/ml lub odczynnikiem suchym użytym w ilości 3-13 mg, do którego dodaje się wodę destylowaną w ilości 70-120 ml

- czwarty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 ml do 10 ml badanej próbki

- piąty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.

Istota wynalazku w zakresie odmiany preparatu polega na tym, że składa się z trzech składników, z których

- pierwszym składnikiem jest zżelifikowana pożywka testowa na płytce Petriego, będąca mieszaniną o składzie ekstrakt drożdżowy..................... 0,10 g -0,50 g aminobak.................................... 0,30 g -0,90 g ekstrakt mięsny........................... 0,10 g -0,30 g agar ( żelifikator)......................... 1 g -2 g trimethoprim................................ 3 mg -10 mg liofilizowany szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis....

..........1-2 x 10⁵ CFU woda............................................ 1 00 ml

- drugi składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 do 10 ml badanej próbki

- trzeci składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.

Istota wynalazku w zakresie sposobu standaryzacji szczepu testowego polega na tym, że szczep Bacillus stearothermophilus var calidolactis namnaża się na pożywce namnażającej o składzie:

ekstrakt mięsny................................... 0,2 -0,6 g ekstrakt drożdżowy............................. 1,0 -3,8 g pepton, zwłaszcza Peptobak................. 2 - 6g enzymatyczny hydrolizat kazeiny.........3,4 -6,4 g chlorek sodowy NaCl..............................3 -4 g chlorek manganawy MnCl2 x H2O.......0,02 -0,04 g agar........................................................10 -20 g woda destylowana................................. 1 000 ml i wykonuje się zmyw powierzchniowy hodowli za pomocą zbuforowanej 0,1% wody peptonowej, po czym uzyskaną zawiesinę pasteryzuje się w temperaturze 85°C przez 10 min, oznacza się liczbę przetrwalników i oblicza się ilość ml zawiesiny, którą należy wprowadzić do fiolki liofilizacyjnej aby uzyskać koncentrację przetrwalników 1 x 10⁸ -5 x 10⁸ CFU/fiolkę, wyliczoną ilość ml zawiesiny przenosi się do fiolki i liofilizuje, a następnie oznacza się koncentrację przetrwalników w fiolce i na tej podstawie wylicza się ilość ml odczynnika uwadniającego, korzystnie roztworu trimothioprimu, którą należy dodać do fiolki, miesza się wszystkie składniki aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny wodnej i przenosi taką ilość ml zawiesiny do pożywki testowej przeznaczonej do oznaczania antybiotyków i sulfonamidów aby uzyskać koncentrację przetrwalników 1-2 x 10⁵ CFU w 1 ml tej pożywki, która to koncentracja stanowi o standardowości szczepu testowego.

Istota wynalazku w zakresie sposobu przygotowywania płytki testowej do badań, zawierającej preparat według wynalazku, polega na tym, że komponent odżywczy rozpuszcza się w 95-100 ml odczynnika uwadniającego, upłynnia się go przez ogrzewanie w temperaturze około100°C, ustala się pH tak, aby po sterylizacji było 6,8 ± 0,1, przeprowadza się sterylizację otrzymanego materiału w temperaturze 121°C przez 15 min, ochładza się do temperatury 55-60°C, dodaje się jednorodną zawiesinę liofilizowanego szczepu testowego, tak, aby uzyskać w pożywce testowej koncentrację przetrwalni4

PL 196 107 B1 ₅ ków 1-2 x 10⁵ CFU/ml postępując sposobem według wynalazku i uzyskaną pożywkę testową wylewa się do płytki Petriego, otrzymując w ten sposób płytkę testową do oznaczania antybiotyków i sulfonamidów w badanym materiale.

Istota wynalazku w zakresie sposobu przygotowywania płytki testowej do badań, zawierającej odmianę preparatu według wynalazku, polega na tym, że do 100 ml wody dodaje się składniki pożywki testowej preparatu według odmiany wynalazku, z tym, że trimethoprim dodaje się w postaci wodnego roztworu trimethoprimu o stężeniu 5 mg/ml sporządzonego po uprzednim rozpuszczeniu trimethoprimu w 95%-owym alkoholu etylowym, następnie upłynnia się w temperaturze około 100°C, ustala się pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,8 ± 0,1, sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 15 min, ochładza się do temperatury 55-60°C, dodaje się zawiesinę przetrwalników szczepu testowego otrzymanego według wynalazku, dokładnie miesza się i rozlewa po 10 ml do płytek Petriego i pozostawia do zestalenia.

Wynalazek pozwala na szybkie i równoczesne określenie w warunkach laboratoryjnych obecności w materiale płynnym tak antybiotyków jak i sulfonamidów, identyfikację tych substancji, a także pozwala na określenie w badanym materiale ilości obecnych penicylin. Badanie przeprowadzone z wykorzystaniem preparatów według wynalazku ze względu na standardowość pozwala na osiągnięcie powtarzalnych wyników badań w różnych laboratoriach, przy równoczesnym zapewnieniu odpowiedniej czułości w zakresie oznaczania zarówno antybiotyków jak i sulfonamidów. Zaletą wynalazku jest obniżenie kosztów związanych z użyciem szczepu testowego, czyli liofilizowanego szczepu testowego Bacillus stearothermophilus var calidolactis, a to wskutek 10-krotnego zmniejszenia dodatku szczepu dzięki zastosowaniu peptonu aminobaku, nie zawierającego zanieczyszczeń hamujących wzrost szczepu testowego zamiast tryptonu. Dwie odmiany preparatu zaspakajają różne zapotrzebowanie laboratoriów: na preparat do bezpośredniego użycia, lecz mniej trwały lub na preparat o długiej trwałości, stanowiący rezerwę do użycia w przypadkach spornych, np. pomiędzy producentem mleka a zakładem skupującym mleko.

Przedmiot wynalazku zostanie dokładniej opisany w poniższych przykładach.

P r zy k ł a d 1

W przykładzie jest przedstawiony preparat według wynalazku i jego przygotowanie do wykrywania antybiotyków i sulfonamidów w mleku.

Do sporządzenia komponentu odżywczego, wchodzącego w skład preparatu według wynalazku, użyto:

ekstrakt drożdżowy w ilości 0,30 g aminobak 0,60 g ekstrakt mięsny 0,15 g agar 2 g

Składniki te wymieszano i szczelnie zamknięto.

Następnie przygotowano liofilizowany szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis. W tym celu wykonano kilkustopniowe namnożenie szczepu, spasteryzowano hodowlę, oznaczono w niej liczbę przetrwalników i poddano liofilizacji. Namnażanie wykonano na pożywce namnażającej o składzie:

ekstrakt mięsny	0,4 g
ekstrakt drożdżowy	1,7 g
pepton Peptobak	4,0 g
enzymatyczny hydrolizat kazeiny	5,4 g
chlorek sodowy NaCl	3,5 g
chlorek manganawy MnCl2 x H2O	0,03 g
agar	20,0 g
woda destylowana	1000 ml
Pożywkę rozlano do probówek oraz do butli Roux, sterylizowano w temperaturze 121°C przez

min. i ustalono pH pożywki tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,5 do 6,7. Szczep najpierw namnażano na skosie z pożywką namnażającą w temperaturze 55°C przez 24-48 godzin. Uzyskaną hodowlę powierzchniową szczepu na skosie zmywano zbuforowaną wodą peptonową i uzyskaną zawiesinę pasteryzowano w temperaturze 85°C przez 10 min. Następnie pożywkę namnażającą w butlach Roux szczepiono spasteryzowaną zawiesiną i dalej postępowano identycznie jak w przypadku hodowli na skosie. W spasteryzowanej zawiesinie z butli Roux oznaczono liczbę przetrwalników i rozlewano do fiolek liofilizacyjnych taką ilość zawiesiny, aby po liofilizacji, w każdej fiolce koncentracja przetrwalniPL 196 107 B1 ków była 1 x 10⁸ -5 x 10⁸ CFU. Ponownie oznaczono koncentrację przetrwalników w liofilizacie celem dokładnej ich standaryzacji w pożywce testowej przygotowywanej do przeprowadzenia oznaczenia antybiotyków i sulfonamidów w badanym materiale.

Dalej, przygotowano odczynnik uwadniający, potrzebny do uwodnienia komponentu odżywczego i liofilizowanego szczepu. W tym celu do 99 ml wody destylowanej dodawano 1 ml stężonego roztworu trimethoprimu zawierającego 5 mg tego składnika w 1 ml i szczelnie zamknięto. Stężony roztwór przygotowano przez rozpuszczenie 5 mg trimethoprimu w 5 ml 96% etanolu i uzupełnienie wodą destylowaną do 1000 ml.

Przygotowano także penicylinazę o aktywności 1000 U/fiolkę i kwas p-aminobenzoesowy cz.d.a. (PABA) w ilości 1 g.

Przystąpiono do przygotowania płytek testowych, czyli płytek Petriego o średnicy 9 cm zawierających pożywkę testową. Najpierw przygotowano pożywkę testową. W tym celu komponent odżywczy rozpuszczono w 100 ml odczynnika uwadniającego, upłynniano go przez ogrzewanie w temperaturze około 100°C i pH ustalono tak, aby po sterylizacji było 6,8 ± 0,1. Przeprowadzono sterylizację otrzymanego materiału w temperaturze 121°C przez 15 min i ochłodzono go do temperatury 55-60°C. Następnie dodawano jednorodną zawiesinę liofilizowanego szczepu testowego tak, aby uzyskać w pożywce testowej koncentrację przetrwalników 1-2 x 10⁵ CFU/ml. W przypadku, gdy fiolka zawierała przetrwalniki w ilości 1 x 10⁸ CFU, to jej zawartość zawieszano w 2,5 ml odczynnika uwadniąjącego i do 100 ml pożywki dodawano 0,5 ml zawiesiny przetrwalników. Tak przygotowaną pożywkę testową o standardowej zawartości przetrwalników rozlewano po 10 ml na płytkę Petriego o średnicy 9 cm i pozostawiono do żelifikacji. Uzyskano warstwę pożywki o grubości około 2 mm. Płytki pakowano w woreczki polietylenowe, szczelnie zamykano i przechowywano do 14 dni w temperaturze 4-6°C.

Badaną próbkę mleka nanoszono na powierzchnię pożywki testowej w płytce testowej za pomocą mikropipety do studzienek. W warstwie pożywki testowej na płytce Petriego o średnicy 9 cm wycinano 6 studzienek o średnicy 10 ± 1 mm i nanoszono 0,1 ml spasteryzowanej, badanej próbki mleka oraz próbkę kontrolną bez substancji hamujących. Inkubowano w temperaturze 65 ± 1°C przez 3,5-4 godzin. Obecność substancji hamujących oceniano na podstawie powstawania stref hamowania. W przypadku obecności antybiotyków w badanym mleku strefy hamowania były przezroczyste, aw przypadku obecności sulfonamidów stwierdzono w obrębie strefy hamowania większe lub mniejsze przerzedzenie wzrostu, a nie całkowite zahamowanie wzrostu.

Dla przeprowadzenia identyfikacji penicylin, na przygotowaną płytkę testową nanoszono: badaną próbkę mleka, próbkę mleka po reakcji z penicylinazą, próbkę nie zawierającą substancji hamujących oraz roztwór zawierający 0,004 mg penicyliny w 1 ml mleka. Wcześniej, do 10 ml próbki mleka dodawano 0,4 ml roztworu penicylinazy o stężeniu 100 U/ml, dokładnie wymieszano i pozostawiono na 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie płytki inkubowano w temperaturze 65°C przez 3,5-4 godzin i po tym czasie odczytywano wyniki na płytce testowej. Jeśli stwierdzono brak strefy hamowania wokół krążka lub studzienki z próbką mleka z penicylinazą, a strefa taka występowała dla badanej próbki mleka i była zbliżona do strefy wokół krążka kontrolnego z 0,004 mg penicyliny w 1 ml, to substancja hamująca w próbce odpowiadała penicylinie sodu lub potasu o stężeniu co najmniej 0,004 mg/ml.

Jeżeli w badanej próbce nie wykryto penicylin, tzn. stwierdzono strefę hamowania pomimo dodania do próbki penicylinazy, to dalsze badanie prowadzono w kierunku obecności sulfonamidów. Wtym celu na przygotowaną płytkę testową nanoszono próbkę po reakcji z kwasem p-aminobenzoesowym (PABA), próbkę badaną i próbkę kontrolną nie zawierającą substancji hamujących. Wcześniej, do 10 ml próbki badanego mleka dodawano 1 ml 1% roztworu PABA i dokładnie mieszano. Płytki inkubowano w temp. 65°C przez 3,5-4 godzin i po tym czasie odczytywano wyniki. Jeżeli strefa hamowania wzrostu lub przerzedzenia wzrostu występowała wokół studzienki z badaną próbką bez dodatku kwasu p-aminobenzoesowego, a nie stwierdzono po jego dodatku, to próbka zawiera sulfonamidy.

Ilościowe oznaczenie zawartości penicylin w badanej próbce mleka przeprowadzono poprzez mierzenie suwmiarką średnic otrzymanych stref hamowania i porównanie wyniku z krzywą wzorcową. Ilość penicyliny odczytywano z tej krzywej. Dla każdej partii preparatu według wynalazku przygotowywano krzywą wzorcową. Wykonywano ją przez nanoszenie na płytkę testową próbek mleka z dodatkiem standardu penicyliny G-potasowej w stężeniu 0,002; 0,004; 0,008; 0,016; 0,032 i 0,064 mg/ml i zmierzeniu średnicy strefy hamowania wzrostu szczepu dla każdego stężenia.

PL 196 107 B1

P r z y k ł a d 2

W przykładzie przedstawiona jest odmiana preparatu według wynalazku i jego przygotowanie do wykrywania antybiotyków i sulfonamidów w mleku. Postępowanie przy identyfikacji antybiotyków i sulfonamidów jest takie samo, zatem w przykładzie tym zostanie opisana różnica w przygotowaniu płytki testowej, w porównaniu z opisanym postępowaniem z przykładu 1.

Zgodnie z wynalazkiem, płytkę testową przygotowano przez dodanie do 100 ml wody składników pożywki testowej o składzie:

ekstrakt drożdżowy 0,30 g aminobak 0,40 g ekstrakt mięsny 0,15 g trimethoprim, w postaci wodnego roztworu, 1 ml i o stężeniu 5 mg/ml agar 2,0 g

Wodny roztwór trimethoprimu sporządzono po uprzednim rozpuszczeniu trimethoprimu w 95%owym alkoholu etylowym. Składniki pożywki testowej upłynniono w temperaturze około 100°C i ustalono pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,8 ± 0,1. Przeprowadzono sterylizację w temperaturze 121°C przez 15 min i ochłodzono do temperatury 55-60°C. Dodano zawiesinę liofilizowanego szczepu testowego Bacillus stearotherophilus var calidlactis, wykonaną jak w przykładzie 1 w takiej ilości, aby ₅ otrzymać standardową koncentrację przetrwalników w pożywce wynoszącą 1-2 x 10⁵ CFU/ml, dokładnie wymieszano i rozlano do płytek Petriego o średnicy 9 cm po 10 ml i pozostawiono do zestalenia. Płytki tak przygotowane szczelnie zamykano i przechowywano do 14 dni.

Wykrywanie obecności antybiotyków i sulfonamidów, przy użyciu tak przygotowanych płytek testowych, wykonano tak jak w przykładzie 1, podobnie jak i określenie ilości obecnych penicylin.

Opisane w przykładzie 1 i 2 procedury przygotowania płytek testowych do badania pozwalają na wykonanie badania materiału płynnego w takim zakresie jak wykrycie obecności antybiotyków i sulfonamidów z czułością wymaganą w Dyrektywach Unii Europejskiej. Badania porównawcze, wykonane przy użyciu metod zalecanych przez normy, przykładowo unijne, oraz z zastosowaniem wynalazku, wykazały, że badanie wykonane z użyciem wynalazku, w zakresie czułości wobec antybiotyków i sulfonamidów, powtarzalności wyników i standaryzacji wielokrotnie były lepsze. Ponadto rozwiązanie według wynalazku pozwala na wygodę w pracy laboratoryjnej i na szybkie otrzymanie wiążących wyników oraz 10-krotnie mniejsze zużycie najdroższego składnika, czyli szczepu testowego. Preparat opisany w przykładzie pierwszym jest trwały i może być przechowywany przez 18 miesięcy w temperaturze 4-6°C, zaś drugi preparat, opisany w przykładzie 2, ma krótszą trwałość, do około 2 tygodni, przeznaczony jest do bezpośredniego użycia, natomiast jest wygodniejszy w użyciu, gdyż jego postać jest od razu przydatna do użycia, bez dodatkowych czynności laborantów.

Claims (5)

Zastrzeżenia patentowe
1. ...........1-2 x 10⁵ CFU woda........................................... 1 00 ml

   - drugi składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 do 10 ml badanej próbki

   - trzeci składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.

   1. Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, zawierający substancje odżywcze, żelifikator, szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis, znamienny tym, że składa się z pięciu składników, z których

   - pierwszy składnik, użyty w ilości 2,5-3,7 g do przygotowania 70-120 ml pożywki testowej, jest komponentem odżywczym o składzie:

   ekstrakt drożdżowy aminobak ekstrakt mięsny agar w ilości 4%wag w ilości 12% wag w ilości 4% wag w ilości 54% wag

   13,51% wag 24,32% wag

   8,11% wag 80% wag

   - drugi składnik, użyty w ilości 0,03-0,08 g do przygotowania pożywki testowej jest liofilizowanym szczepem testowym Bacillus stearothermophilus var calidolactis o stężeniu przetrwalników 1 x 10⁸ 5 x 10⁸ CFU/fiolkę

   - trzeci składnik jest odczynnikiem uwadniającym użytym w ilości 70-120 ml do przygotowania pożywki testowej, zawierającym trimethoprim w stężeniu 0,03-0,13 mg/ml lub odczynnikiem suchym użytym w ilości 3-13 mg, do którego dodaje się wodę destylowaną w ilości 70-120 ml

   PL 196 107 B1

   - czwarty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji penicylin, zwłaszcza penicylinazą o aktywności 1000 U/fiolkę, użytą w postaci roztworu o aktywności 100 U/ml i dodawaną w ilości 0,4 ml do 10 ml badanej próbki

   - piąty składnik jest substancją pomocniczą do identyfikacji sulfonamidów, zwłaszcza kwasem p-aminobenzoesowym cz.d.a. w ilości 1 g/fiolkę użytym w ilości 1 ml 1% roztworu do 10 ml badanej próbki.
2. 2. Preparat do wykrywania obecności antybiotyków i sulfonamidów, zwłaszcza w materiale płynnym, identyfikacji penicylin i sulfonamidów oraz ilościowego oznaczania penicylin w tym materiale, zawierający substancje odżywcze, żelifikator, szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis, znamienny tym, że składa się z trzech składników, z których

   - pierwszym składnikiem jest zżelifikowana pożywka testowa na płytce Petriego, będąca mieszaniną o składzie ekstrakt drożdżowy..................... 0,10 g -0,50 g aminobak.................................... 0,30 g -0,90 g ekstrakt mięsny........................... 0,10 g -0,30 g agar (żelifikator)........................ 1 g -2 g trimethoprim................................ 3 mg -10 mg liofilizowany szczep testowy Bacillus stearothermophilus var calidolactis.......
3. 3. Sposób standaryzacji szczepu testowego Bacillus stearothermophilus var calidolactis, będącego składnikiem preparatu według zastrz. 1 i 2, znamienny tym, że szczep Bacillus stearothermophilus var calidolactis namnaża się na pożywce namnażającej o składzie:

   ekstrakt mięsny.................................0,2 - 0,6 g ekstrakt drożdżowy............................. 1 ,0 -3,8 g pepton, zwłaszcza Peptobak................ 2 - 6 g enzymatyczny hydrolizat kazeiny.........3,4 -6,4 g chlorek sodowy NaCl........................... 3 -4 g chlorek manganawy MnCl2x H2O.......0,02 -0,04 g agar...................................................... 10 -20 g woda destylowana............................... 1000 ml i wykonuje się zmyw powierzchniowy hodowli za pomocą zbuforowanej 0,1% wody peptonowej, po czym uzyskaną zawiesinę pasteryzuje się w temperaturze 85°C przez 10 min, oznacza się liczbę przetrwalników i oblicza się ilość ml zawiesiny, którą należy wprowadzić do fiolki liofilizacyjnej aby uzyskać koncentrację przetrwalników 1 x 10⁸ - 5 x 10⁸ CFU/fiolkę, wyliczoną ilość ml zawiesiny przenosi się do fiolki i liofilizuje, a następnie oznacza się koncentrację przetrwalników w fiolce i na tej podstawie wylicza się ilość ml odczynnika uwadniającego, korzystnie roztworu trimothioprimu, którą należy dodać do fiolki, miesza się wszystkie składniki aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny wodnej i przenosi taką ilość ml zawiesiny do pożywki testowej przeznaczonej do oznaczania antybiotyków i sulfonamidów aby uzyskać koncentrację przetrwalników 1-2 x 10⁵ CFU w 1 ml tej pożywki, która to koncentracja stanowi o standardowości szczepu testowego.
4. 4. Sposób przygotowywania płytki testowej do badań, zawierającej preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że komponent odżywczy rozpuszcza się w 95-100 ml odczynnika uwadniającego, upłynnia się go przez ogrzewanie w temperaturze około 100°C, ustala się pH tak, aby po sterylizacji było 6,8 ± 0,1, przeprowadza się sterylizację otrzymanego materiału w temperaturze 121°C przez 15 min, ochładza się do temperatury 55-60°C, dodaje się jednorodną zawiesinę liofilizowanego szczepu testowego tak, aby uzyskać w pożywce testowej koncentrację przetrwalników 1-2 x 10⁵ CFU/ml postępując sposobem według zastrz. 3 i uzyskaną pożywkę testową wylewa się do płytki Petriego, otrzymując w ten sposób płytkę testową do oznaczania antybiotyków i sulfonamidów w badanym materiale.

   PL 196 107 B1
5. 5. Sposób przygotowywania płytki testowej do badań, zawierającej preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że do 100 ml wody dodaje się składniki pożywki testowej preparatu według zastrz. 2, z tym, że trimethoprim dodaje się w postaci wodnego roztworu trimethoprimu o stężeniu 5 m g/ml sporządzonego po uprzednim rozpuszczeniu trimethoprimu w 95%-owym alkoholu etylowym, następnie upłynnia się w temperaturze około 100°C, ustala się pH tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,8 ± 0,1, sterylizuje się w temperaturze 121°C przez 15 min, ochładza się do temperatury 55-60°C, dodaje się zawiesinę przetrwalników szczepu testowego otrzymanego według zastrz. 3, dokładnie miesza się i rozlewa po 10 ml do płytek Petriego i pozostawia do zestalenia.