PL196606B1 - Sposób umożliwiający zmniejszenie częstości homologicznych zdarzeń rekombinacyjnych, sposób wytwarzania wadliwych rekombinacyjnych adenowirusów, defektywny adenowirus i linia komórkowa - Google Patents
Sposób umożliwiający zmniejszenie częstości homologicznych zdarzeń rekombinacyjnych, sposób wytwarzania wadliwych rekombinacyjnych adenowirusów, defektywny adenowirus i linia komórkowaInfo
- Publication number
- PL196606B1 PL196606B1 PL340601A PL34060198A PL196606B1 PL 196606 B1 PL196606 B1 PL 196606B1 PL 340601 A PL340601 A PL 340601A PL 34060198 A PL34060198 A PL 34060198A PL 196606 B1 PL196606 B1 PL 196606B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- leu
- cheese
- ala
- ctg
- gcc
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 title claims description 34
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 title claims description 34
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 46
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 44
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 76
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 claims description 43
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 23
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 7
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 6
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 claims description 5
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 claims description 4
- HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N His-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N 0.000 claims description 4
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 4
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 claims description 4
- GFHOSBYCLACKEK-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GFHOSBYCLACKEK-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 4
- UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N 0.000 claims description 4
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 claims description 4
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 claims description 4
- SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N Ala-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N 0.000 claims description 3
- KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N 0.000 claims description 3
- LHRCZIRWNFRIRG-SRVKXCTJSA-N Cys-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O LHRCZIRWNFRIRG-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 3
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims description 3
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 3
- ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N Leu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N 0.000 claims description 3
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 3
- CSYVXYQDIVCQNU-QWRGUYRKSA-N Phe-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O CSYVXYQDIVCQNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 3
- MVFQLSPDMMFCMW-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MVFQLSPDMMFCMW-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 3
- DLRZGNXCXUGIDG-KKHAAJSZSA-N Val-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DLRZGNXCXUGIDG-KKHAAJSZSA-N 0.000 claims description 3
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims description 3
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 claims description 3
- DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N leu-asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 3
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 claims description 3
- NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 claims description 2
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 2
- AREBLHSMLMRICD-PYJNHQTQSA-N Ile-His-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N AREBLHSMLMRICD-PYJNHQTQSA-N 0.000 claims description 2
- IGUOAYLTQJLPPD-DCAQKATOSA-N Leu-Asn-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IGUOAYLTQJLPPD-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 2
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 2
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 claims description 2
- LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N Thr-Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N 0.000 claims description 2
- RIFVTNDKUMSSMN-ULQDDVLXSA-N Tyr-His-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O RIFVTNDKUMSSMN-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims description 2
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000005886 chromosome breakage Effects 0.000 claims description 2
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 claims description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 claims description 2
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 claims 2
- 108010036320 valylleucine Proteins 0.000 claims 2
- SSSROGPPPVTHLX-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SSSROGPPPVTHLX-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 1
- RIQBRKVTFBWEDY-RHYQMDGZSA-N Arg-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RIQBRKVTFBWEDY-RHYQMDGZSA-N 0.000 claims 1
- VUGWHBXPMAHEGZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VUGWHBXPMAHEGZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- GKWFMNNNYZHJHV-SRVKXCTJSA-N Asp-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O GKWFMNNNYZHJHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- UYNXBNHVWFNVIN-HJWJTTGWSA-N Ile-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)CC1=CC=CC=C1 UYNXBNHVWFNVIN-HJWJTTGWSA-N 0.000 claims 1
- 241000283162 Inia geoffrensis Species 0.000 claims 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N Leu-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N 0.000 claims 1
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims 1
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N Pro-Trp Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)[O-])C(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N 0.000 claims 1
- MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N 0.000 claims 1
- BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N 0.000 claims 1
- UKBSDLHIKIXJKH-HJGDQZAQSA-N Thr-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UKBSDLHIKIXJKH-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims 1
- QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N 0.000 claims 1
- ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N Thr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N 0.000 claims 1
- REJRKTOJTCPDPO-IRIUXVKKSA-N Thr-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O REJRKTOJTCPDPO-IRIUXVKKSA-N 0.000 claims 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims 1
- HSVPZJLMPLMPOX-BPNCWPANSA-N Tyr-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSVPZJLMPLMPOX-BPNCWPANSA-N 0.000 claims 1
- ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims 1
- AUEJLPRZGVVDNU-STQMWFEESA-N Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-STQMWFEESA-N 0.000 claims 1
- 108010017893 alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010084094 alanyl-alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims 1
- 239000010437 gem Substances 0.000 claims 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 claims 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 claims 1
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 claims 1
- IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N valinyl-arginine Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010021889 valylvaline Proteins 0.000 claims 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract description 89
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 65
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 58
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 58
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract description 44
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 101150057615 Syn gene Proteins 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 101150088856 pix gene Proteins 0.000 description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 102100026041 Acrosin Human genes 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 3
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- LWUWMHIOBPTZBA-DCAQKATOSA-N Ala-Arg-Lys Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LWUWMHIOBPTZBA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N Ala-Leu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBALDZKOTNSBFM-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DBALDZKOTNSBFM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 3
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- KOVXHANYYYMBRF-IRIUXVKKSA-N Tyr-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O KOVXHANYYYMBRF-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N 0.000 description 2
- 101100165660 Alternaria brassicicola bsc6 gene Proteins 0.000 description 2
- -1 ApoAIV Proteins 0.000 description 2
- XVLLUZMFSAYKJV-GUBZILKMSA-N Arg-Asp-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XVLLUZMFSAYKJV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 101100499295 Bacillus subtilis (strain 168) disA gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SOFSRBYHDINIRG-QTKMDUPCSA-N His-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O SOFSRBYHDINIRG-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N His-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WRLPVDVHNWSSCL-MELADBBJSA-N Leu-His-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N WRLPVDVHNWSSCL-MELADBBJSA-N 0.000 description 2
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101150007210 ORF6 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101100226894 Phomopsis amygdali PaGT gene Proteins 0.000 description 2
- RTQKBZIRDWZLDF-BZSNNMDCSA-N Pro-Pro-Trp Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)O)CCN1C(=O)[C@@H]1CCCN1 RTQKBZIRDWZLDF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- HXMJXDNSFVNSEH-IHPCNDPISA-N Trp-Cys-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)N HXMJXDNSFVNSEH-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- ZNFPUOSTMUMUDR-JRQIVUDYSA-N Tyr-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZNFPUOSTMUMUDR-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- DMWNPLOERDAHSY-MEYUZBJRSA-N Tyr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DMWNPLOERDAHSY-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)[NH3+] ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N Arg-His Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- MMGCRPZQZWTZTA-IHRRRGAJSA-N Arg-His-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N MMGCRPZQZWTZTA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XMGVWQWEWWULNS-BPUTZDHNSA-N Arg-Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N XMGVWQWEWWULNS-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- SYZWMVSXBZCOBZ-QXEWZRGKSA-N Asn-Val-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N SYZWMVSXBZCOBZ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N Asp-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 101100066633 Caenorhabditis elegans fgt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- HZISRJBYZAODRV-XQXXSGGOSA-N Glu-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HZISRJBYZAODRV-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- 102100033366 Glutathione hydrolase 1 proenzyme Human genes 0.000 description 1
- 101710205562 Glutathione hydrolase 1 proenzyme Proteins 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- FFYYUUWROYYKFY-IHRRRGAJSA-N His-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FFYYUUWROYYKFY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701149 Human adenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701096 Human adenovirus 7 Species 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- FXJLRZFMKGHYJP-CFMVVWHZSA-N Ile-Tyr-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N FXJLRZFMKGHYJP-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- OXKYZSRZKBTVEY-ZPFDUUQYSA-N Leu-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O OXKYZSRZKBTVEY-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- MQWISMJKHOUEMW-ULQDDVLXSA-N Phe-Arg-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MQWISMJKHOUEMW-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710143509 Pre-histone-like nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- SSSFPISOZOLQNP-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SSSFPISOZOLQNP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JFBJPBZSTMXGKL-JYJNAYRXSA-N Pro-Met-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JFBJPBZSTMXGKL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- NBDHWLZEMKSVHH-UVBJJODRSA-N Pro-Trp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@@H]3CCCN3 NBDHWLZEMKSVHH-UVBJJODRSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 101100038645 Streptomyces griseus rppA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- KRPKYGOFYUNIGM-XVSYOHENSA-N Thr-Asp-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O KRPKYGOFYUNIGM-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- SMDQRGAERNMJJF-JQWIXIFHSA-N Trp-Cys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)=CNC2=C1 SMDQRGAERNMJJF-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- FGJWNBBFAUHBEP-IHPCNDPISA-N Tyr-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N FGJWNBBFAUHBEP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- YKCXQOBTISTQJD-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N YKCXQOBTISTQJD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Battery Electrode And Active Subsutance (AREA)
- Control Of Motors That Do Not Use Commutators (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Ticket-Dispensing Machines (AREA)
Abstract
1. Sposób umo zliwiaj acy zmniejszenie cz esto sci homologicznych zdarze n rekombinacyjnych wewn atrz- albo zewn atrzcz asteczkowych pomi edzy chromosomalnym kwasem nukleinowym komórki zawieraj acym region E1 genomu adenowirusa, jak równie z obszar oskrzydlaj acy, i pozachromosomal- nym kwasem nukleinowym zawieraj acym genom adenowirusa defektywny dla regionu E1, znamienny tym, ze sekwencja co najmniej jednego z dwóch kwasów nukleinowych jest sekwencj a koduj ac a i jest zdegenerowana. PL PL PL PL
Description
(21) Numer zgłoszenia: 340601 (51) Int.Cl.
C12N 15/86 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C12N 7/01 (2006.01)
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 17.11.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
17.11.1998, PCT/FR98/02453 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
27.05.1999, WO99/25861 PCT Gazette nr 21/99
| Sposób umożliwiający zmniejszenie częstości homologicznych zdarzeń (54) rekombinacyjnych, sposób wyWvarzania v^^<diw^^<^h rekombinacyjnych adenowirusów, defektywny adenowirus i linia komórkowa | |
| (30) Pierwszeństwo: 17.11.1997,FR,97/14383 | (73) Uprawniony z patentu: AVENTIS PHARMA S.A.,Antony Cedex,FR (72) Twórca(y) wynalazku: Joel Crouzet,Sceaux,FR |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: | Jean-Jacques Robert,Sceaux,FR |
| 12.02.2001 BUP 04/01 | Emmanuelle Vigne,Ivry sur Seine,FR Patrice Yeh,Gif sur Yvette,FR |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | |
| 31.01.2008 WUP 01/08 | (74) Pełnomocnik: Urszula Bartnik, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. |
(57) 1 . Soosbb umożliwiająyy zmniejseenie zęęstocci homologizzncch ddareeń rekombincyyjycch wewnątrz- albo zewnątrzcząsteczkowycC pomiędzy cCromosomalnym kwasem nukleinowym komórki zawierającym region E1 genomu adenowirusa, jak również obszar oskrzydlający, i pozacCromooomalnym kwasem nukleinowym zawierającym genom adenowirusa defektywny dla regionu E1, znamienny tym, że sekwencja co najmniej jednego z dwóch kwasów nukleinowych jest sekwencją kodującą i jest zdegenerowana.
PL 196 606 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób umożliwiający zmniejszenie częstości homologicznych zdarzeń rekombinacyjnych, sposób wytwarzania wadliwych rekombinacyjnych adenowirusów, defektywny adenowirus i linia komórkowa.
Rekombinacja między kwasami nukleinowymi jest zjawiskiem dobrze znanym w biologii molekularnej. Rekombinacja jest mechanizmem molekularnym, dzięki któremu tworzone są nowe kombinacje materiału genetycznego, przyczyniając się do ewolucji darwinowskiej przez dostarczenie źródła materiału do selekcji naturalnej. Rekombinacja genetyczna wymagająca wysokiej homologiczności sekwencji między uczestniczącymi kwasami nukleinowymi jest generalnie nazywana rekombinacją homologiczną. Podczas rekombinacji homologicznej powstaje wymiana informacji genetycznej między dwoma regionami kwasu nukleinowego, wymiana, która może być obustronna („crossing over”) lub nie obustronna (konwersja).
Podczas mejozy rekombinacja homologiczna jest odpowiedzialna za ponowny skład informacji genetycznej i odgrywa ważną rolę w poprawnej segregacji chromosomów. Podczas mitozy rekombinacja homologiczna uczestniczy w naprawianiu DNA. Może ona wprowadzać przeszeregowanie genomowe, takie jak delecje i duplikacje, gdy angażuje rozproszone regiony homologiczne, lub też ściśnięcie albo rozszerzenie, gdy chodzi o sekwencje powtórzone tandemowo.
Mechanizm, dzięki któremu powstaje rekombinacja homologiczna został częściowo wyjaśniony. Tak więc u bakterii rekombinacja homologiczna zaczyna się etapem w którym bierze udział koniec jednoniciowy (Holliday, 1964; Meselson,1975). U eukariotów odwrotnie większość wyników sugeruje mechanizm pękania podwójnej nici (DSB „double-strand break”) (Szostak i in.,1983). DSBs wydają się być początkiem dwóch zasadniczych mechanizmów rekombinacji homologicznej: jeden, konserwatywny, według którego wszystkie sekwencje kwasów nukleinowych uczestniczących w rekombinacji są obecne w produktach rekombinacji (Szostak i in.,), drugi, niekonserwatywny, podczas którego niektóre sekwencje są tracone. W somatycznych komórkach ssaków większość rekombinacji homologicznych przez DSB wydaje się zachodzić według procesu niekonserwatywnego (Lin i in. 1990, Jeong-Yu,1992).
Wraz ze stałym rozwojem biotechnologii prowadzi się coraz większą eksploatację DNA: produkcję białek rekombinowanych, tworzenie zwierząt transgenicznych, terapię genową i komórkową itd. W tych różnych dziedzinach powstawanie zjawiska niekontrolowanej rekombinacji może w pewnych wypadkach stanowić niedogodność.
Tak więc, podczas produkcji białek rekombinowanych zjawisko rekombinacji w plazmidzie wykazującym ekspresję (rekombinacja wewnątrzcząsteczkowa) może np. prowadzić do wycięcia kasetki ekspresji transgenu, a więc do utraty i może też być początkiem wycięcia kasetki ekspresji trwale zintegrowanej z genomem produkcyjnej komórki gospodarza i w ten sposób powodować utratę stabilności.
Inny przykład niepożądanych efektów związanych z powstawaniem zjawiska rekombinacji homologicznej może mieć miejsce podczas konstrukcji i produkcji wektorów, w szczególności wektorów wirusowych. Wektory wirusowe (adenowirus, retrowirus, wirus adenozwiązany, wirus opryszczki itd.) stanowią szczególnie skuteczne narzędzia do przesyłania kwasów nukleinowych do komórek in vitro, ex vivo lub in vivo. W celu konstrukcji defektywnych wektorów wirusowych prowadzi się generalnie w genomie delecję regionów zasadniczych dla replikacji wirusa dzikiego i zastępuje korzystnym kwasem nukleinowym. W celu produkcji i powielenia tych wirusów trzeba dostarczyć grupy do transkomplementacji (albo z plazmidem, albo w postaci zintegrowanej z genomem komórki produkcyjnej, albo przy użyciu wirusa pomocniczego). Otóż w pewnych wypadkach zjawisko rekombinacji homologicznej zachodzi między defektywnym genomem wirusa i grupami komplementacji, odtwarzając replikacyjne cząstki wirusa. Tak więc wektory pochodne adenowirusów są generalnie wytwarzane w linii komplementacji (linia 293 lub pochodna), z którą zintegrowała się część genomu adenwirusa. Dokładniej linia 293 zawiera lewy koniec (około 11-12%) genomu adenowirusa serotypu 5 (Ad5), zawierający lewy ITR, region kapsydacji i region E1, obejmujący E1a, E1b i część regionów kodującą białko pIX i IVa2. Ta linia jest zdolna do transkomplementacji rekombinowanych adenowirusów defektywnych w regionie E1, to znaczy pozbawionych całości lub części regionu E1, potrzebnej do replikacji. Niemniej istnieją strefy homologii między regionem adenowirusa zintegrowanym z genomem linii i DNA wirusa rekombinowanego, który chcemy wyprodukować. Z tego względu w czasie produkcji mogą powstawać różne zjawiska rekombinacji, tworzące replikacyjne cząstki wirusa, zwłaszcza adenowirusów
PL 196 606 B1 typu E1+. Jak wskazano na fig. 1 może chodzić o zwykłe zjawisko rekombinacji, po którym następuje pękanie chromosomu (fig. 1A) lub podwójnej rekombinacji (fig. 1B). Te dwa typy modyfikacji prowadzą do zastąpienia lewej części DNA rekombinowanego, pozbawionego funkcjonalnego regionu E1, przez odpowiednią część obecną w genomie komórki, która niesie kopię funkcjonalną regionu E1. Zresztą biorąc pod uwagę wysokie miano rekombinowanego wektora produkowane przez linię 293, istnieje duże prawdopodobieństwo, że to zjawisko będzie miało miejsce. W istocie stwierdzono, że liczne partie rekombinowanych adenowirusowych wektorów defektywnych były skażone replikacyjnymi cząstkami wirusa.
Obecność cząstek replikacyjnych w partiach wirusa stanowi dużą niedogodność przy zastosowaniu do transferu genów in vitro lub in vivo (zagrożenie rozmnożeniem wirusa i niekontrolowanym rozsianiem).
Ten sam typ problemów istnieje przy tworzeniu retrowirusów defektywnych. A więc w konstruowanych retrowirusach defektywnych generalnie poddaje się delecji wirusowe regiony kodujące (gag, poi i env), które są wnoszone przez linię produkcyjną w celu trans. Tutaj też dla pewnych opisanych linii istnieją strefy pokrycia między genomem retrowirusa defektywnego i grupami komplementacji niesionymi przez komórki. W szczególności jest to wypadek komórek PA317, Psi2 itd. Może wtedy zajść zjawisko rekombinacji homologicznej na poziomie tych stref, tworząc cząstki replikacyjne.
Dla zmniejszenie zjawiska rekombinacji homologicznej w uprzednim stanie techniki wskazywano różne podejścia, które wszystkie opierają się na tej samej zasadzie: zastąpieniu lub zniesieniu regionów homologicznych. Tak więc pewne plazmidy, pozwalające na ekspresję genów korzystnych, wnoszą regiony homologiczne do genomu komórki gospodarza. Może tu chodzić w szczególności o region promotora, gen markerowy lub początek replikacji. Dla zmniejszenia zagrożenia rekombinacji proponowano dotąd zastąpienie tych regionów innymi, niehomologicznymi (promotor różny itd). Z drugiej strony dla ograniczenia ryzyka rekombinacji w sposobach produkcji wektorów wirusowych sugerowano usuwanie sekwencji homologicznych między genami komplementacji i defektywnym genomem wirusowym.
Tak więc zgłoszenie patentowe WO97/00326 opisuje linię komórkową do produkcji adenowirusa, oznaczoną PER, zawierającą ograniczoną jednostkę genomu adenowirusa niosącą region E1. W tej linii flankujące sekwencje homologiczne wobec genomu wirusa defektywnego są zmniejszone, co pozwala na ograniczenie ryzyka rekombinacji homologicznej między nimi. Tak samo zgłoszenie patentowe WO95/11984 opisuje konstrukcję rekombinowanego adenowirusa niosącego delecję regionu E1, rozszerzoną o część genu pIX. W tym wypadku to już nie jest region komplementacji, który zmodyfikowano (zmniejszono), ale delecja wniesiona do genomu defektywnego, która została rozszerzona. Wynikiem jest też zmniejszenie ryzyka rekombinacji, nawet jeśli przetrwały regiony homologii.
Jednakże jeśli te podejścia umożliwiają zmniejszenie zagrożenia rekombinacji między komórką i genomem wirusa, a więc ryzyka wyprodukowania partii wirusa skażonych cząstkami replikacyjnymi, nie pozwalają one na ich całkowitą eliminację i/lub wymagają konstrukcji, a więc legalizacji nowych linii komórkowych, co jest bardzo trudne. Ponadto zastępowanie regionów innymi nie jest bardzo zadowalające, zwłaszcza pod względem skuteczności. Niniejszy wynalazek rozwiązuje te trudności. Niniejsze zgłoszenie opisuje nowy sposób pozwalający na zmniejszenie zjawiska rekombinacji homologicznej między- i wewnątrzcząsteczkowej. Wynalazek opisuje też adenowirus defektywny nieskażony cząstkami replikacyjnymi. Nowe konstrukcje wirusowe są zdolne do powielania w istniejących liniach produkcyjnych najskuteczniejsze pod względem miana, przy mocno zmniejszonym ryzyku utworzenia cząstek replikacyjnych.
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu umożliwiającego zmniejszenie częstości homologicznych zdarzeń rekombinacyjnych wewnątrz- albo zewnątrzcząsteczkowych pomiędzy chromosomalnym kwasem nukleinowym komórki zawierającym region E1 genomu adenowirusa jak również obszar oskrzydlający, i pozachromosomalnym kwasem nukleinowym zawierającym genom adenowirusa defektywny dla regionu E1, polegający na tym, że sekwencja co najmniej jednego z dwóch kwasów nukleinowych jest sekwencją kodującą i jest zdegenerowana.
Korzystnie w sposobie według wynalazku sekwencja jest zdegenerowana w odniesieniu do 1 pary zasad z co najmniej wszystkich 20 par zasad. Sekwencja może być też zdegenerowana w odniesieniu do 1 pary zasad z co najmniej wszystkich 10 par zasad, ewentualnie sekwencja jest zdegenerowana we wszystkich możliwych położeniach.
Degeneracja następuje w zależności od użycia kodonów komórki dopełniającej.
PL 196 606 B1
W sposobie według wynalazku, sekwencja genomu defektywnego adenowirusa dla obszaru E1 jest zdegenerowana na poziomie genu pIX, lub ewentualnie sekwencja genomu defektywnego adenowirusa dla obszaru E1 jest poza tym zdegenerowana na poziomie genu IVa2.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania wadliwych rekombinacyjnych adenowirusów drogą wprowadzania do komórki linii 293 albo pochodnej linii 293 genomu defektywnego rekombinacyjnego adenowirusa, polegający na tym, że wprowadza się genom, który zawiera, delecję w obszarze E1, i degenerację w genach pIX i IVa2.
Przedmiotem wynalazku jest również defektywny w odniesieniu do regionu E1 rekombinacyjny adenowirus, którego genom zawiera co najmniej jeden region kodujący, charakteryzujący się tym, że sekwencja wspomnianego regionu jest zdegenerowana, i degeneracja wspomnianej sekwencji umożliwia redukcję częstości rekombinacji homologicznych wewnątrz- i zewnątrzcząsteczkowych pomiędzy chromosomalnym kwasem nukleinowym komórki zawierającym region E1 genomu adenowirusa jak również region oskrzydlający i kwasem nukleinowym wspomnianego rekombinacyjnego adenowirusa defektywnego dla regionu E1.
Korzystnie adenowirus zawiera region zdegenerowany który jest regionem kodującym i zawiera gen pIX.
Korzystnie, sekwencja zdegenerowana zawierająca gen pIX jest sekwencją SEQ ID No 1. Region zdegenerowany adenowirusa według wynalazku korzystnie zawiera geny pIX i IVa2, przy czym bardziej korzystnie gen IVa2 występuje w pozycji genomowej innej niż jego pozycja początkowa. W bardziej korzystnym wykonaniu gen IVa2 jest usytuowany na poziomie regionu E4. Region zdegenerowany jest zdefiniowany sekwencją SEQ ID No 3.
Region zdegenerowany w adenowirusie według wynalazku zawiera delecję w obszarze E1.
Zdegenerowana sekwencja genu pIX w adenowirusie według wynalazku jest sekwencją o numerze SEQ ID No 1.
Przedmiotem wynalazku jest także linia komórkowa 293 albo pochodna linii 293, zawierająca defektywny adenowirus dla obszaru E1, charakteryzująca się tym, że sekwencja chromosomowego kwasu nukleinowego komórki, zawierająca obszar E1 oraz obszar oskrzydlający wymienionego defektywnego adenowirusa, albo sekwencja pozachromosomowego kwasu nukleinowego zawierająca genom wymienionego adenowirusa jest sekwencją kodującą i jest sekwencją zdegenerowana.
Etapem początkowym i ważnym rekombinacji homologicznej jest rozpoznanie między dwoma partnerskimi kwasami nukleinowymi (rekombinacja międzycząsteczkowa) lub między dwoma regionami kwasu nukleinowego (rekombinacja wewnątrzcząsteczkowa). Ten etap jest wynikiem bezpośredniej interakcji między dwoma regionami homologicznymi. Rekombinacja homologiczna między dwoma kwasami nukleinowymi opiera się więc na istnieniu identyczności lub dużej homologiczności sekwencji między dwoma regionami tych kwasów nukleinowych i generalnie zależy ona od dwóch czynników: stopnia homologii i długości homologii (to jest regionów homologicznych niesionych przez jeden lub dwa kwasy nukleinowe). Ponadto na częstość rekombinacji homologicznej mogą też wpływać pewne szczególne regiony kwasów nukleinowych. A więc zaobserwowano, że pewne regiony są zdolne do rekombinacji z częstością większą niż przeciętna. Określono poza tym, że te zlokalizowane wariacje częstości mogą być spowodowane szczególnymi sekwencjami, takimi jak miejsca CHI u E.coli lub miejsca M26 u S. pombe (Gangloff i in.,1994).
W przeciwieństwie do strategii proponowanych w uprzednim stanie techniki sposób według wynalazku nie stosuje supresji stref homologicznych między partnerskimi kwasami nukleinowymi. Sposób według wynalazku polega oryginalnie na modyfikacji sekwencji co najmniej jednego z dwóch kwasów nukleinowych, będących partnerami rekombinacji, tak aby zmniejszyć homologię istniejącą między tymi dwoma kwasami nukleinowymi.
Pierwszy przedmiot wynalazku jak opisano dotyczy więc sposobu pozwalającego na zmniejszenie częstości zjawiska rekombinacji homologicznej wewnątrz- lub międzycząsteczkowej między kwasami nukleinowymi, charakteryzujący się tym, że sekwencja co najmniej jednego z kwasów nukleinowych, będących partnerami rekombinacji, zostaje tak zdegenerowana, aby zmniejszyć homologię z jednym lub drugim(i) partnerem(ami).
Przez „zmniejszenie częstości zjawiska rekombinacji homologicznej” między kwasami nukleinowymi rozumie się w sensie wynalazku każde obniżenie wspomnianej częstości w stosunku do częstości obserwowanej dla odpowiednich kwasów nukleinowych niemodyfikowanych. To zmniejszenie można łatwo zmierzyć klasycznymi testami znanymi fachowcowi (w szczególności testami „marker rescue” lub testami tworzenia replikacyjnych cząstek wirusowych). Korzystnie termin „zmniejszenie”
PL 196 606 B1 obejmuje istotną obniżkę częstości rekombinacji homologicznej, korzystnie o co najmniej jedną jednostkę logarytmiczną.
Przez rekombinację homologiczną międzycząsteczkową rozumie się rekombinację homologiczną między dwoma odrębnymi kwasami nukleinowymi (lub między dwoma regionami dwóch kwasów nukleinowych). Przez rekombinację homologiczną wewnątrzcząsteczkową rozumie się rekombinację homologiczną między dwoma regionami tego samego kwasu nukleinowego. Ponadto kwasy nukleinowe będące partnerami w rekombinacji homologicznej mogą być kwasami nukleinowymi pozachromosomowymi, chromosomowymi lub połączeniem obu (to jest kwasem nukleinowym chromosomowym i kwasem nukleinowym pozachromosomowym). Kwasy nukleinowe pozachromosomowe mogą być plazmidami, wektorami, episomami, genomami wirusa itd.
Sposób według wynalazku jest szczególnie przystosowany do zmniejszania częstości zjawiska rekombinacji homologicznej międzycząsteczkowej między kwasem nukleinowym chromosomowym i kwasem nukleinowym pozachromosomowym.
Sposób według wynalazku obejmuje generalnie następujące etapy:
(i) identyfikację regionu lub regionów odpowiedzialnych za rekombinację homologiczną, (ii) modyfikację tego regionu lub tych regionów, (iii) weryfikację sekwencji, (iv) syntezę zmodyfikowanej sekwencji (oznaczonej jako syngen), (v) zastąpienie oryginalnej sekwencji przez syngen.
(i) Identyfikacjj regionów odpowiedzialnychza rekombinację homologiczną między kwasami nukleinowymi dokonuje się każdą znaną metodą. W szczególności odkąd zaobserwowano zjawisko rekombinacji, regionów, które są za nią odpowiedzialne, można poszukiwać przez analizę sekwencyjną: poszukiwanie regionów homologicznych między kwasami nukleinowymi (międzycząsteczkowe) lub w kwasie nukleinowym (wewnątrzcząsteczkowe).
Gdy sekwencje zaangażowane w rekombinacji są zidentyfikowane, określa się region, zawierający całość lub część tych sekwencji, do użycia w etapie (ii) poniżej, to znaczy modyfikacji.
(ii) Modyfikacja sekwencji
Uznaje się generalnie, że homologia powinna być bardzo wysoka w regionie dostatecznie długim, aby zjawisko rekombinacji mogło mieć miejsce z istotną częstością. W szczególności dane literaturowe sugerują, że dla powstania takich zjawisk jest wymagany skończony region homologii o długości co najmniej równym około 200 pb. W istocie, nawet jeśli rekombinacja może zajść w regionie bardziej ograniczonym, jej częstość jest dużo mniejsza i nie regularna. Ponadto w takim regionie, którego homologia jest ograniczona o 19% wydaje się, że częstość rekombinacji jest zmniejszona 1000 razy (Waldman i Liskay, 1987).
Sekwencję można zmodyfikować w różny sposób. Gdy chodzi o sekwencje kodującą, można wprowadzić modyfikacje polegające na degeneracji kodu genetycznego. Tak więc sekwencja jest zakłócona i wtedy zmniejsza się homologia, ale produkt ekspresji jest ten sam.
Wynalazek polega więc w szczególności na takiej modyfikacji sekwencji, aby przeszkodzić dobieraniu dwóch regionów homologicznych. Modyfikacja pozwala na zmniejszenie długości i stopnia homologii między dwoma odnośnymi regionami.
Korzystnie w sposobie według wynalazku sekwencja kwasu nukleinowego jest degenerowana na poziomie regionu zaangażowanego w rekombinacji homologicznej w ilości 1 pary zasad na co najmniej 20 par zasad. Korzystniej jest ona degenerowana w ilości 1 pary zasad na co najmniej 10 par zasad.
Według szczególnego wariantu wynalazku sekwencja jest degenerowana we wszystkich możliwych pozycjach.
Degenerowanie sekwencji według wynalazku realizuje się korzystnie w zależności od użytku kodonów komórki lub organizmu, w którym powinien być użyty kwas nukleinowy. W wypadku wektora wirusowego, którego produkcję prowadzi się w linii komórek ludzkich, szczególnie interesujące jest degenerowanie sekwencji sprzyjające zalecanemu użytkowi kodonów u człowieka, gdy ten wybór jest możliwy (patrz przykłady).
Ponadto można wnieść dodatkowe modyfikacje do sekwencji kwasu nukleinowego. Tak więc w regionach nie kodujących można zmniejszyć wymiary pewnych elementów (sekwencje regulatorowe ekspresji, promotory) lub modyfikować te elementy, albo podstawiać pewne inne elementy regionami heterologicznymi.
PL 196 606 B1
Według szczególnego wariantu wynalazku i gdy strefa homologii rozciąga się na kilka genów, można z jednej strony zmniejszyć strefę homologii, degenerując sekwencję jednego lub kilku genów, a z drugiej strony modyfikując pozycję genomową pewnych genów obecnych w strefie homologii, to znaczy umieszczając te geny w genomie adenowirusa i w innej pozycji genomowej niż ich pozycja początkowa. Sekwencja genów, których pozycja genomowa jest zmodyfikowana, może być ponadto zdegenerowana. Korzystnie jedna sekwencja genów, które nie są przemieszczone, jest zdegenerowana.
(iii) Weryfikacja sekwencji
Weryfikację przeprowadza się metodami informatycznymi, pozwalającymi na wykrycie obecności elementów regulacji, struktur drugorzędowych itd, zdolnych do interferencji z aktywnością syngenu. Patrz przykłady.
(iv) Synteza syngenu
Syngen można syntetyzować każdą metodą znaną fachowcowi, a zwłaszcza stosując syntetyzatory kwasów nukleinowych.
(v) Zastąpienie sekwencji pierwotnej przez syngen
Syngen już zsyntetyzowany wprowadza się następnie do kwasu nukleinowego w zastępstwie sekwencji pierwotnej. Ten etap można również wykonać zgodnie z metodami klasycznej biologii molekularnej dobrze znanymi fachowcowi.
Jedno z zastosowań sposobu według wynalazku polega na produkcji wektorów, zwłaszcza wektorów wirusowych, pozbawionych cząstek wirusowych kompetentnych dla replikacji (RCV). Z tego względu sposób z wynalazku ma szczególniej na celu zmniejszenie częstości zjawiska rekombinacji homologicznej między chromosomowym kwasem nukleinowym kodującym grupy komplementacji wirusa defektywnego i pozachromosomowym kwasem nukleinowym zawierającym genom wymienionego wirusa defektywnego.
Odnośny wirus może być korzystnie adenowirusem, retrowirusem, wirusem adenozwiązanym (AAV) lub też wirusem opryszczki. Jest to szczególniej adenowirus.
A więc szczególna postać realizacji wynalazku stanowi sposób zmniejszania częstości zjawiska rekombinacji homologicznej między chromosomowym kwasem nukleinowym zawierającym region E1 genomu adenowirusa oraz region flankujący i pozachromosomowym kwasem nukleinowym zawierający genom adenowirusa defektywnego w regionie E1.
Korzystnie w tym szczególnym sposobie sekwencja degenerowana według wynalazku zawiera gen pIX genomu adenowirusa defektywnego w regionie E1. Jeszcze korzystniej sekwencja degenerowana zawiera geny pIX i IVa2 genomu adenowirusa.
Według innego wariantu realizacji sekwencja zdegenerowana zawiera gen pIX genomu adenowirusa, a sekwencję genu IVa2 przemieszczono z jej naturalnego miejsca do regionu E4.
Sposób według wynalazku jest szczególnie przystosowany do produkcji rekombinowanych adenowirusów defektywnych w regionie E1 w linii komórkowej 293 lub w pochodnej linii komórkowej.
Jak wskazano poprzednio, linia komórkowa 293 zawiera w swym genomie lewą część genomu adenowirusa, obejmującą zwłaszcza region E1 i region flankujący położony poniżej (3') regionu E1, niosący zwłaszcza gen pIX i część genu IVa2. To dokładnie w tym regionie flankującym powstają rekombinacje homologiczne tworzące adenowirusy kompetentne do replikacji (ACR). Przez „pochodną linię komórkową” rozumie się w sensie wynalazku linię komórkową, niosącą region E1 adenowirusa i region flankujący zdolny do powstania rekombinacji z wirusem defektywnym. Może to być region krótszy od tego, który jest obecny w 293 (np. ograniczony do pIX) lub region dłuższy. Linia pochodna może też być linią zbudowaną z komórek 293, przez wprowadzenie dodatkowych sekwencji komplementacji (takich jak E4).
W Z tego względu wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania adenowirusów rekombinowanych defektywnych przez wprowadzenie, do komórki linii 293 lub do pochodnej komórki, genomu wymienionego adenowirusa rekombinowanego defektywnego, charakteryzującego się tym, że wymieniony genom niesie:
- delecję regionu E1
- degenerację w genach pIX i/lub IVa2.
Wynalazek dotyczy poza tym każdego wektora wirusowego, którego genom zawiera co najmniej jeden region ze zdegenerowaną sekwencją. Może to być zwłaszcza retrowirus (niosący sekwencje zdegenerowane w genach gag, pol i/lub env), AAV (niosący sekwencje zdegenerowane w genach rep i/lub cap) lub też adenowirus.
PL 196 606 B1
Korzystnie jest to adenowirus, którego genom niesie zdegenerowany gen pIX. Korzystnie sekwencja zdegenerowana genu pIX jest sekwencją ID Nr 1 lub sekwencją ID Nr 4. Jeszcze korzystniej adenowirus zawiera ponadto modyfikację pozycji w genomie genu IVa2. Gen ten jest korzystnie położony na poziomie regionu E4.
Według innej postaci realizacji jest to adenowirus, którego geny pIX i IVa2 są zdegenerowane. Korzystnie sekwencja naturalna genu pIX jest zastąpiona przez sekwencję SEQ ID Nr 1 lub sekwencję SEQ ID Nr 4, a sekwencja zdegenerowana genu IVa2 jest sekwencją SEQ ID Nr 2 lub sekwencją SEQ ID Nr 5. Korzystnie sekwencja naturalna genów pIX i IVa2 jest zastąpiona przez sekwencję SEQ ID Nr 3.
Według innej postaci realizacji jest to adenowirus, którego geny pIX i IVa2 są zdegenerowane i który zawiera ponadto modyfikacje sekwencji promotorowej genu pIX i/lub zastąpienie sekwencji poliadenylowania tych genów. Korzystnie jest to adenowirus zawierający sekwencję SEQ ID Nr 8.
Adenowirus niesie korzystnie poza tym co najmniej jedną delecję regionu E1. Korzystniej adenowirusy są defektywne przynajmniej w całości lub części regionów E1 i E3. Mogą to być również adenowirusy rekombinowane defektywne w regionach E1 i E4 w całości lub części i ewentualnie w regionie E3. Zresztą ten adenowirus może być różnego serotypu. Biorąc pod uwagę adenowirusy pochodzenia ludzkiego, można wymienić przede wszystkim adenowirusy klasyfikowane w grupie C.
Jeszcze korzystniej wśród różnych serotypów adenowirusa ludzkiego zaleca się w ramach niniejszego wynalazku stosowanie adenowirusów typu 2 lub 5 (Ad 2 lub Ad 5). Wśród różnych adenowirusów pochodzenia zwierzęcego zaleca się stosowanie w ramach wynalazku adenowirusów pochodzenia psiego, a zwłaszcza wszystkich szczepów adenowirusów CAV2 [szczep manhattan lub A26/61 (np. ATCC VR-800)]. Inne adenowirusy pochodzenia zwierzęcego wymienia się zwłaszcza w zgłoszeniu WO94/26914 włączonym do niniejszego jako odnośnik. Strategie konstrukcji adenowirusów oraz miejsc nadających się do użycia przy wprowadzeniu genów, mających znaczenie, do tych wektorów opisano szczegółowo w uprzednim stanie wiedzy, a szczególniej w WO95/02697, WO96/10088, WO96/13596 lub też WO96/22378.
Według postaci szczególnie korzystnej, w rekombinowanych adenowirusach z niniejszego wynalazku region E1 jest zdezaktywowany przez delecję fragmentu PvuII-Bg1II, rozciągającego od nukleotydu 454 do nukleotydu 3328, w sekwencji adenowirusa Ad5. Ta sekwencja jest dostępna w literaturze i również w bazie danych (patrz zwłaszcza Genebank nr M73260). W innej zalecanej postaci realizacji region E1 jest zdezaktywowany przez delecję fragmentu Hinfll-Sau3A, rozciągającego się od nukleotydu 382 do nukleotydu 3446.
Korzystnie rekombinowane adenowirusy z wynalazku zawierają ponadto heterologiczną sekwencję kwasów nukleinowych, dla której są poszukiwane transfer i/lub ekspresja w komórce, narządzie lub organizmie.
W szczególności heterologiczna sekwencja DNA może zawierać jeden lub kilka genów leczniczych i/lub jeden lub kilka genów kodujących peptydy antygenowe.
Genem leczniczym, który może być tak przesyłany, jest każdy gen, którego transkrypcja i ewentualnie transdukcja w komórce docelowej tworzy produkty o działaniu leczniczym.
Mogą to być w szczególności geny kodujące produkty białkowe o działaniu leczniczym. Tak kodowany produkt białkowy może być białkiem, peptydem, aminokwasem itd. Ten białkowy produkt może być homologiczny wobec komórki docelowej (to znaczy produkt, który normalnie wykazuje ekspresję w komórce docelowej, gdy ona nie wykazuje żadnej patologii). W tym wypadku ekspresja białka pozwala np. złagodzić niepożądaną ekspresję w komórce lub ekspresję białka nieaktywnego lub słabo aktywnego z powodu modyfikacji lub też nadekspresję wymienionego białka. Gen leczniczy może też kodować mutanta białka komórkowego, mającego zwiększoną stabilność, zmodyfikowaną aktywność itd. Produkt białkowy może również być heterologiczny wobec komórki docelowej. W tym wypadku białko wykazujące ekspresję może np. uzupełniać lub wnosić brakującą aktywność do komórki, pozwalając jej na zwalczanie patologii.
Wśród produktów leczniczych w sensie niniejszego wynalazku można wymienić szczególniej enzymy, pochodne krwi, hormony, limfokiny: interleukiny, interferony, TNF itd. (FR 9203120), czynniki wzrostu, neuroprzekaźniki lub ich prekursory, albo enzymy syntetyczne, czynniki troficzne: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, VEGF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 itd; apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE itd. (FR 93 05125), dystrofina lub minidystrofina (FR 9111947), geny supresorowe guzów: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev itd. (FR 93 04745), geny kodujące czynniki zaangażowane w koagulacji: czynniki VII,
PL 196 606 B1
VIII, IX itd. gen kodujący białko GAX, geny samobójcze: kinaza tymidynowa, dezaminazocytozyna itd., geny kodujące przeciwciała o pojedynczym łańcuchu (scFv).
Genem leczniczym może być też gen lub sekwencja nonsensowna, której ekspresja w komórce docelowej pozwala na kontrolę ekspresji genów lub transkrypcji komórkowych mRNA. Takie sekwencje mogą być np. transkrybowane w komórce docelowej, do RNA uzupełniających mRNA komórkowe i blokować w ten sposób ich transdukcję w białku według metody opisanej w opisie patentowym EP 140 308.
Jak podano wyżej heterologiczna sekwencja DNA może też zawierać jeden lub kilka genów kodujących peptyd antygenowy zdolny do tworzenia u człowieka odpowiedzi immunologicznej. W tej szczególnej postaci stosowania wynalazek umożliwia więc wykonanie szczepionek pozwalających uodpornić człowieka zwłaszcza na drobnoustroje lub wirusy. Mogą to być szczególniej specyficzne peptydy antygenowe wirusa Epsteina-Barra, wirusa HIV, wirusa zapalenia wątroby B (EP 185 573), wirusa pseudowścieklizny lub też specyficzne dla guzów (EP 259 212).
Generalnie heterologiczna sekwencja kwasów nukleinowych zawiera też region promotorowy transkrypcji funkcjonalnej w zakażonej komórce. Może to być region promotorowy naturalnie odpowiedzialny za ekspresję rozważanego genu, gdy jest on zdolny do funkcjonowania w zakażonej komórce. Mogą to być również regiony o różnym pochodzeniu (odpowiedzialne za ekspresję innych białek lub nawet syntetyczne). Mogą to być zwłaszcza sekwencje promotorowe genów eukariotycznych lub wirusowych. Mogą to być np. sekwencje promotorowe pochodzące z genomu komórki, którą chce się zakazić. Mogą to być ponadto sekwencje promotorowe pochodzące z genomu wirusa, włączając używanego adenowirusa. Pod tym względem można np. wymienić promotory genów E1A, MLP, CMV, RSV itd. Poza tym te promotorowe regiony można modyfikować, dodając sekwencje aktywacji, regulacji lub pozwalających na ekspresję tkankowo-specyficzną albo większościową. Poza tym gdy heterologiczny kwas nukleinowy nie zawiera sekwencji promotorowych, może być wstawiony do genomu wirusa defektywnego poniżej takiej sekwencji.
Ponadto heterologiczna sekwencja kwasów nukleinowych może też zawierać, w szczególności powyżej genu leczniczego, sekwencję sygnałową kierującą syntetyzowany produkt leczniczy na drogi wydzielania komórki docelowej. Ta sygnałowa sekwencja może być naturalną sekwencją sygnałową produktu leczniczego, ale może to być również każda inna sekwencja sygnałowa funkcjonalna albo sztuczna sekwencja sygnałowa.
Ciągle w postaci szczególnie korzystnej, wektory z wynalazku posiadają poza tym funkcjonalny gen E3 pod kontrolą promotora heterologicznego. Bardziej korzystnie wektory posiadają część genu E3, umożliwiającą ekspresję białka gp19K. To białko pozwala w istocie na uniknięcie tego, że wektor adenowirusowy stanowi przedmiot reakcji odpornościowej, która (i) ograniczałaby jego działanie i (ii) mogłaby mieć niepożądane efekty wtórne.
Te rekombinowane wektory można stosować do przesyłania kwasów nukleinowych do komórek in vitro, ex vivo lub in vivo.
Defektywnego adenowirusa według wynalazku można wykorzystać do utworzenia kompozycji farmaceutycznej zawierającej jeden lub kilka adenowirusów rekombinowanych, takich jak opisano poprzednio. Kompozycje farmaceutyczne z wynalazku można zestawiać w celu podawania drogą miejscową, doustną, pozajelitową, donosową, dożylną, domięśniową, podskórną, śródoczną, transdermalną itd.
Taka kompozycja farmaceutyczna zawiera zaróbki dopuszczalne farmaceutycznie dla preparatu do wstrzyknięć. Mogą to być w szczególności roztwory soli (fosforanu monosodowego, disodowego, chlorku sodu, potasu, wapnia lub magnezu itd. albo mieszanin takich soli), sterylne, izotoniczne, albo kompozycje suche, zwłaszcza liofilizowane, które po dodaniu zależnie od przypadku wody jałowej albo fizjologicznego roztworu soli, pozwalają na utworzenie roztworów do wstrzyknięć.
Dawki wirusów używanych do wstrzyknięć można dostosować zależnie od różnych parametrów, a zwłaszcza zależnie od używanego trybu podawania, odnośnej patologii, genu, wykazującego ekspresję lub też poszukiwanego okresu leczenia. Ogólnie biorąc, dawki rekombinowanych adenowirusów według wynalazku stosowane w preparatach i podawane wynoszą 104 - 1014 pfu/ml, a korzystnie 106 - 1010 pfu/ml. Termin pfu („plaque forming unit”) odpowiada sile zakażającej roztworu wirusa i określa się przez infekcję odpowiedniej hodowli komórkowej i pomiar zwykle po 5 dniach liczby łysinek zainfekowanych komórek. Metody określania miana pfu roztworu wirusów są dobrze udokumentowane w literaturze.
PL 196 606 B1
Legenda figur:
Fig. 1: Zjawiska rekombinacji między adenowirusem i linią 293
Fig. 2: Schematyczna struktura syngenu
Fig. 3: Mapa restrykcyjna plazmidu pJJ 105
Fig. 4: Mapa restrykcyjna plazmidu pJJ 110
Fig. 5: Mapa restrykcyjna plazmidu pJJ 206
Fig. 6: Konstrukcja wirusa defektywnego niosącego syngen w zastępstwie regionu naturalnego
Fig. 7: Struktura i mapa restrykcyjna oligonukleotydów, oligosyngen I i oligosyngen II
Fig. 8: Naturalna sekwencja nukleotydowa i sekwencja zdegenerowana genu pIX (SEQ ID Nr 1) oraz odpowiednia sekwencja aminokwasów
Fig. 9: Naturalna sekwencja nukleotydowa i sekwencja zdegenerowana genu IVa2 (SEQ ID Nr 2) oraz odpowiednia sekwencja aminokwasów
Fig. 10: Sekwencja nukleotydowa syngenu # 1 (SEQ ID Nr 3)
Fig. 11: Schematyczne przedstawienie homologii między genomem komórki 293 i rekombinowanymi wektorami Ad5. Wektor Ad5p53 wykazuje sekwencję ciągłej homologii 898 nukleotydów z genomem komórek 293 poniżej regionu E1. Wprowadzenie mutacji punktowych zmniejsza maksymalną długość homologii ciągłej do 92 nukleotydów w wypadku syngenu # 1 (AV1.7#1CMV p53) i do 29 nukleotydów w wypadku syngenu # 2 (AV1.7#2CMV lacZ)
Fig. 12: Wykrywanie ACR w wektorach Ad5p53 i AV1.7#1p53 po 7 kolejnych powieleniach w komórkach 293.
Ogólne metody biologii molekularnej
Metody klasycznie stosowane w biologii molekularnej, takie jak ekstrakcja preparatywna plazmidowego DNA, odwirowanie plazmidowego DNA z gradientem chlorku cezu, elektroforeza na żelu agarozowym lub akrylamidowym, oczyszczanie fragmentów DNA przez elektroelucję, ekstrakcja białek fenolem lub mieszaniną fenol-chloroform, wytrącanie DNA w środowisku soli etanolem lub izopropanolem, przekształcenie w Escherichia coli itd. są dobrze znane fachowcowi i obszernie opisane w literaturze [T.Maniatis i in., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y.,1982; Ausubel F.M. i in.(wyd.), „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, 1987].
Plazmidy pIC-20R (Invitrogen) i pBS (Stratagen) pochodzą z handlu.
W celu związania fragmenty DNA można rozdzielić zależnie od ich wymiarów przez elektroforezę na żelu agarozowym lub akrylamidowym, ekstrahować fenolem lub mieszaniną fenol/chloroform, wytrącić etanolem, po czym inkubować w obecności ligazy DNA faga T4 (Biolabs) zgodnie z zaleceniami dostawcy.
Wypełnienie wystających końców 5' można przeprowadzić przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E.coli (Biolabs) zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Zniszczenie wystających końców 3' przeprowadza się w obecności polimerazy DNA faga T4 (Biolabs) stosowanej zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Zniszczenie wystających końców 5' przeprowadza się przez traktowanie kierowane nukleazą S1.
Mutagenezę kierowaną in vitro przez syntetyczne oligodezoksynukleotydy można przeprowadzić według metody przedstawionej przez Taylora i in. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764], stosując zestaw rozprowadzany przez Amersham.
Enzymatyczne powielenie fragmentów DNA metodą zwaną PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, R.K.Saiki i in., Science 230 (1985) 1350-1354; K.B. Mullis i F.A. Faloona. Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] można przeprowadzić przy użyciu „DNA thermal cycler” (Perkin Elmer Cetus) zgodnie ze specyfikacją producenta.
Weryfikację sekwencji nukleotydowych można wykonać metodą przedstawioną przez Sangera i in. [Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74 (1977) 5463-5467], stosując zestaw rozprowadzany przez Amersham.
Używane linie komórkowe
- Linia nerki płodu ludzkiego 293 (Graham i in., J. Gen.Virol.36 (1977) 59). Ta linia zawiera zwłaszcza część lewą genomu ludzkiego adenowirusa Ad5 (12%) zintegrowaną ze swym genomem.
P r z y k ł a d I: Rekombinacja homologiczna w adenowirusie
Obserwację, że genom adenowirusa można poddać rekombinacji genetycznej podano ponad 25 lat temu (Williams i Ustacelibi, 1971). Jednakże mechanizmy, na których opiera się ta rekombinacja, są dość słabo wyjaśnione. Zaproponowano pogląd, że rekombinacja i replikacja mogą być
PL 196 606 B1 wewnętrznie związane i pewne dane sprzyjają modelowi rekombinacji, w którym replikacja produkowałaby specyficzne substraty potrzebne do częstych rekombinacji obserwowanych podczas zakażenia adenowirusem. Jedną z kwestii jest dowiedzieć się, czy białka wirusowe lub komórkowe uczestniczą w tworzeniu produktów pośrednich rekombinacji i w ich rozdzieleniu na końcowe produkty rekombinowane. Pod tym względem żaden z testowanych genów wirusowych nie okazał się zaangażowany w zjawisku rekombinacji: E1b, E4, E1a, E3 (Epstein,1991: Weinberg i in.,1986;Young,1995). Tak samo nie można było ukazać żadnego białka komórkowego. Dla mechanizmu rekombinacji w genomie adewirusa zaproponowano ostatecznie dwa modele, oba przewidujące tworzenie rozszerzonych heterodupleksów (Ahern i in.,1991;Young,1995).
Regiony odpowiedzialne za rekombinację homologiczną między genomem defektywnym a linią komórkową zlokalizowano zwłaszcza na poziomie genów pIX i IVa2 genomu adenowirusa. Strukturę tego regionu obecną w genomie defektywnym przedstawiono na fig. 2.
Wykonano modyfikacje sekwencji genomu adenowirusa zaangażowanej w rekombinacji z genomem komórkowym. Dokładniej, zmodyfikowano sekwencję naturalną genów pIX i IVa2 przez wprowadzenie mutacji cichych, pozwalających na zmniejszenie homologiczności z sekwencją naturalną bez wpływania na strukturę produktów ekspresji tych genów.
Otrzymana sekwencja oznaczona jako syngen jest używana do zastępowania odpowiedniej sekwencji naturalnej adenowirusa w celu skonstruowania wirusa defektywnego.
1. Identyfikacja regionów odpowiedzialnych za rekombinację
Badania kartograficzne wykazały, że część genomu adenowirusa obecna w genomie komórek 293 odpowiada lewej części genomu adenowirusa i stanowi jego około 12% czyli 4300 pb (Aiello i in.,1979; Spector i in.,1983). Wykonano także uzupełniające doświadczenia kartograficzne przez PCR i wykazano, że pozycja 4420 była obecna w genomie 293. Ta pozycja 4420 została wybrana do następnych doświadczeń jako prawa granica strefy homologii, a więc prawa granica syngenu. Z przyczyn technicznych klonowania modyfikowany fragment rozciąga się do pozycji 4445, gdzie wprowadzono miejsce klonowania.
Lewy koniec syngenu został wybrany w elementach regulacji ekspresji genu pIX i zwłaszcza w pozycji -56 genu pIX. Istotnie wykazano, że promotor genu pIX mógł być zmniejszony do regionu o 56 nukleotydach. Aktywność tego regionu zawierającego miejsce wiązania SP1 i kasetka TATA jest porównywalna z aktywnością fragmentu o 250 nukleotydach (Babiss i in.,1991; Matsui i in.,1989).
Strefa homologii została więc określona jako rozciągająca się od pozycji 3520 do pozycji 4445 genomu wirusa defektywnego (patrz fig. 2).
2. Planowanie zmodyfikowanych sekwencji
Tablica użycia kodonów w genomie adenowirusa Ad5 została wykonana przez zgłaszającego i zastosowana do określenia optymalnego użycia kodonów do ekspresji białek wirusa. Tabelę tę otrzymano, łącząc dane otrzymane z analizy 10 białek adenowirusa: pIX, Hexon, pIII, pVII, 52-55k, pPol, pTP, DBP, 23K i 19k (patrz tabela). Otrzymane wyniki porównano następnie z tabelą użycia kodonów ludzkich otrzymaną z analizy 1952 genów obecnych w bazie Genbank przy stosowaniu programu GCG.
Ustalono więc kolejność pod względem korzyści stosowania kodonów dla modyfikowania sekwencji kodującej genów pIX i IVa2:
• Gdy kodon stosowany w sekwencji naturalnej nie jest kodonem zalecanym jest on użyty w syngenie.
• Gdy kodon stosowany w sekwencji naturalnej jest kodonem zalecanym, to wtedy używa się drugiego kodonu zalecanego.
• W pewnych przypadkach np. przy wprowadzaniu miejsca restrykcji, można użyć trzeciego kodonu zalecanego, w szczególności gdy jego częstość jest dostatecznie bliska częstości drugiego zalecanego kodonu.
Poniższa tabela podaje częstość użycia kodonów u człowieka i u adenowirusa (AdV) z uszeregowaniem pod względem korzyści u człowieka (kolumna A), uszeregowaniem pod względem korzyści u adenowirusa (kolumna B) i utrzymanym wyborem do syntezy syngenu (kolumna C).
PL 196 606 B1
T a b e l a 1: Częstość użycia kodonów
| ADV5 | Ludzki | A | B | C | |||||
| F | TTT | Phe | 2,3 | 54,2% | 1,5 | 43,0% | 1 | 2 | - |
| F | TTC | 1,9 | 45,85% | 2,1 | 57,0% | 2 | 1 | - | |
| L | TTA | Leu | 0,1 | 1,4% | 0,6 | 6,0% | 6 | 6 | 6 |
| L | TTG | 1,2 | 14,2% | 1,1 | 12,0% | 4 | 4 | 4 | |
| L | CTT | Leu | 1,3 | 15,6% | 1,1 | 12,0% | 3 | 3 | 3 |
| L | CTC | 1,7 | 20,5% | 1,9 | 20,0% | 2 | 2 | 2 | |
| L | CTA | 1,1 | 12,6% | 0,6 | 7,0% | 5 | 5 | 5 | |
| L | CTG | 3 | 35,6% | 4 | 43,0% | 1 | 1 | 1 | |
| P | CCT | Pro | 1,2 | 18,4% | 1,8 | 29,0% | 4 | 2 | 2 |
| P | CCC | 2,7 | 39,9% | 2,1 | 33,0% | 1 | 1 | 1 | |
| P | CCA | 1,3 | 18,7% | 1,7 | 27,0% | 3 | 3 | 3 | |
| P | CCG | 1,5 | 23,0% | 0,1 | 11,0% | 2 | 4 | 4 | |
| T | ACT | Thr | 1,1 | 17,7% | 1,3 | 23,0% | 2 | 3 | 2 |
| T | ACC | 3,3 | 55,0% | 2,2 | 38,0% | 1 | 1 | 1 | |
| T | ACA | 0,8 | 12,8% | 1,5 | 27,0% | 4 | 2 | 4 | |
| T | ACG | 0,9 | 14,5% | 0,1 | 12,0% | 3 | 4 | 3 | |
| A | GCT | Ala | 1,2 | 13,7% | 2 | 28,0% | 3 | 2 | 2 |
| A | GCC | 4 | 45,7% | 2,8 | 40,0% | 1 | 1 | 1 | |
| A | GCA | 1,1 | 12,6% | 1,6 | 22,0% | 4 | 3 | 3 | |
| A | GCG | 2,4 | 27,9% | 0,7 | 10,0% | 2 | 4 | 4 | |
| C | Cys | TGT | 0,3 | 21,5% | 1 | 41,8% | 2 | 2 | 2 |
| C | TGC | 1,1 | 78,5% | 1,4 | 58,2% | 1 | 1 | 1 | |
| * | end | TGA | 0,3 | 61,9% | |||||
| W | Trp | TGG | 1,3 | 100,0% | 1,5 | 100,0% | |||
| R | Arg | CGT | 0,8 | 10,4% | 0,5 | 9,3% | 3 | 6 | 6 |
| R | CGC | 4,1 | 52,4% | 1,1 | 19,4% | 1 | 3 | 1 | |
| R | CGA | 0,6 | 7,0% | 0,6 | 10,0% | 5 | 5 | 5 | |
| R | CGG | 1,1 | 13,9% | 1 | 18,6% | 2 | 4 | 2 |
PL 196 606 B1 cd. tabeli 1
| S | Ser | AGT | 0,4 | 6,6% | 1 | 13,6% | 6 | 5 | 6 |
| S | AGC | 2,1 | 32,6% | 1,9 | 24,7% | 1 | 1 | 1 | |
| R | Arg | AGA | 0,5 | 6,2% | 1,2 | 21,0% | 6 | 2 | 4 |
| R | AGG | 0,8 | 10,2% | 1,2 | 21,7% | 4 | 1 | 3 | |
| G | Gly | GGT | 1 | 17,7% | 1,4 | 18,3% | 4 | 4 | 4 |
| G | GGC | 2,4 | 41,3% | 2,5 | 33,2% | 1 | 1 | 1 | |
| G | GGA | 1,3 | 21,5% | 1,9 | 25,7% | 2 | 2 | 2 | |
| G | GGG | 1,1 | 19,4% | 1,7 | 22,8% | 3 | 3 | 3 | |
| I | ATT | Ile | 1,3 | 34,6% | 1,5 | 35,0% | 2 | 2 | 2 |
| I | ATC | 1,6 | 43,8% | 2,3 | 52,0% | 1 | 1 | 1 | |
| I | ATA | 0,8 | 21,6% | 0,7 | 14,0% | 3 | 3 | 3 | |
| M | ATG | Met | 2,6 | 100,0% | 2,2 | 100,0% | |||
| V | GTT | Val | 0,8 | 13,1% | 1 | 17,0% | 3 | 3 | 3 |
| V | GTC | 1,4 | 22,2% | 1,5 | 25,0% | 2 | 2 | 2 | |
| V | GTA | 0,8 | 12,5% | 0,6 | 10,0% | 4 | 4 | 4 | |
| V | GTG | 3,3 | 52,2% | 2,9 | 48,0% | 1 | 1 | 1 | |
| Y | TAT | Tyr | 0,8 | 21,6% | 1,2 | 41,7% | 2 | 2 | 2 |
| Y | TAC | 3 | 78,4% | 1,7 | 58,3% | 1 | 1 | 1 | |
| * | TAA | end | 0,1 | 23,8% | |||||
| * | TAG | 0,1 | 16,7% | ||||||
| H | CAT | His | 0,5 | 21,3% | 1,4 | 59,3% | 2 | 1 | - |
| H | CAC | 1,7 | 78,7% | 1 | 40,7% | 1 | 2 | - | |
| Q | CAA | Gln | 1,1 | 27,4% | 1,2 | 26,7% | 2 | 2 | 2 |
| Q | CAG | 3 | 72,6% | 3,3 | 73,3% | 1 | 1 | 1 | |
| N | AAT | Asn | 1,2 | 24,5% | 1,6 | 43,5% | 2 | 2 | 2 |
| N | AAC | 3,6 | 75,5% | 2,1 | 56,5% | 1 | 1 | 1 | |
| K | AAA | Lys | 1,4 | 35,2% | 2,2 | 39,8% | 2 | 2 | 2 |
| K | AAG | 2,5 | 64,8% | 3,4 | 60,2% | 1 | 1 | 1 | |
| D | GAT | Asp | 1,6 | 29,2% | 2,1 | 44,2% | 2 | 2 | 2 |
| D | GAC | 3,9 | 70,8% | 2,7 | 55,8% | 1 | 1 | 1 | |
| E | GAA | Glu | 2,4 | 37,0% | 2,8 | 41,5% | 2 | 2 | 2 |
| E | GAG | 4,1 | 63,0% | 3,9 | 58,5% | 1 | 1 | 1 |
PL 196 606 B1 cd. tabeli 1
| S | TCT | Ser | 0,8 | 11,7% | 1,4 | 18,0% | 4 | 3 | 3 |
| S | TCC | 1,7 | 27,0% | 1,7 | 23,2% | 2 | 2 | 2 | |
| S | TCA | 0,6 | 9,6% | 1,1 | 14,7% | 5 | 4 | 4 | |
| S | TCG | 0,9 | 13,6% | 0,4 | 5,9% | 3 | 6 | 5 |
W pierwszym przykładzie precyzującym syngen (syngen # 1) wprowadzono następujące modyfikacje:
- W promotorze pIX: zmniejszono możliwie najbardziej sekwencję: pozostały fragment zawiera tylko 56 nukleotydów zamiast 135 nukleotydów w wektorze pierwotnym. Wniesiono modyfikację dodatkową, modyfikując 9 nukleotydów położonych między miejscem wiązania SP1 i kasetką TATA.
- W genie pIX: wszystkie pozycje zdegenerowano, gdy to było możliwe, zgodnie z regułą określoną wyżej, bez modyfikacji powstałej sekwencji aminokwasów (SEQ ID Nr 1). Porównanie sekwencji naturalnej i sekwencji zdegenerowanej oraz struktura produktu ekspresji tych sekwencji znajduje się na fig. 8. Według innej strategii tylko pozycja (pb) w 10 jest zdegenerowana. Ciągle według strategii alternatywnej tylko pozycja w 20.
- W przedziale regionu między pIX i IVa2: sekwencja tego regionu o 59 nukleotydach nie została zmodyfikowana w tym przykładzie.
- W genie IVa2: sekwencja kodująca genu IVa2 została zdegenerowana zgodnie z regułą określoną wyżej, co 20 pb, bez modyfikacji powstałej sekwencji aminokwasów (patrz SEQ ID Nr 2). Sekwencja naturalna, sekwencja zdegenerowana i powstała sekwencja aminokwasów znajdują się na fig. 9. Według innej strategii pozycja (pb) w 10 jest zdegenerowana lub nawet wszystkie pozycje, ciągle bez modyfikacji powstałej sekwencji aminokwasów.
Strukturę syngenu opisano schematycznie na fig. 2. Sekwencję syngenu # 1 przedstawiono na fig. 10 i przez sekwencję SEQ ID Nr 3.
Inny przykład syngenu stanowi syngen # 2, w którym:
- Sekwencję promotorową genu pIX zastąpiono sekwencją zmodyfikowaną, jaką opisano w SEQ ID Nr 6.
- Sekwencję genu pIX zastąpiono zgodnie z sekwencją opisaną w SEQ ID Nr 4 bez modyfikacji powstałej sekwencji aminokwasów.
- Sekwencję genu IVa2 zastąpiono zgodnie z sekwencją opisaną w SEQ ID Nr 5 bez modyfikacji powstałej sekwencji aminokwasów.
- Region poliadenylowania zastąpiono regionem, który spełnia te same funkcje w adenowirusie typu 7 (Ad 7); adenowirus z podgrupy B, którego używa się jako wektora do przesyłania genów (Abrahamsen i in.,1997,J.Virol.71,8946-8951). Tę sekwencję opisano w sekwencji SEQ ID Nr 7.
Całą zmodyfikowaną sekwencję nazwano syngen # 2 i oznaczono jako sekwencję SEQ ID Nr 8.
3. Weryfikacja sekwencji syngenów
Podstawowe właściwości sekwencji naturalnych i syngenów zweryfikowano na drodze analizy informatycznej. Ta weryfikacja ma na celu poszukiwanie w syngenach ewentualnej obecności szczególnych struktur, a zwłaszcza:
• miejsc będących donorami lub akceptorami składania (programy SpliceView i/lub Splice Net), • miejsc poliadenylowania (program Hcpolya), • potencjalnych miejsc wiązania czynników transkrypcji (program Transfac), • regionów zdolnych do tworzenia szczególnych struktur drugorzędowych typu bezpośrednich powtórzeń, szpilki (program Sigscan, BNL), włączając odpowiednie RNA (RNA folding), • miejsc konsensusowych typu CHI lub M26.
Gdy te sekwencje są zidentyfikowane, można ewentualnie zastąpić odpowiednie zasady zgodnie ze strategią określoną przedtem w punkcie 2.
4. Konstrukcjawirusów ddfektywnyyh, niosąccyhsynggn # 1, z zastęępwaniem oodpwieenieeg regionu naturalnego
1. Materiał wyjściowy:
• Syngen # 1 (SEQ ID Nr 3), • oligonukleotydy Syngen I i Syngen II odpowiadające odpowiednio końcom 5' i 3' syngenu # 1 podano w fig. 7, • plazmid pJJ105 (fig. 3),
PL 196 606 B1 • plazmid pJJ110 (fig. 4), • plazmid pIC-20R (Invitrogen), • plazmid pSyngen: syngen klonowany w pBS (Stratagene).
2. Konstrukcja genomu wirusa defektywnego
Strategię konstrukcji opisano na fig.6.
Plazmid pJJ110 jest trawiony przez Xbal i powstałe fragmenty Xbal o 4,8 i 5,0 kb wiąże się w celu utworzenia plazmidu pJJ201. Plazmid pJJ201 jest następnie trawiony przez BstEII i Xmal, wypełniony i związany w celu utworzenia plazmidu pJJ202. Dwa miejsca BstEII i Xmal są zachowane.
Produkt powielenia przez PCR odpowiadający fragmentowi 1 genu IVa2 (Fgt1 IVa2, fig. 6) tworzy się, stosując oligosyngen I i oligosyngen II oraz plazmid pJJ105 jako matrycę.
Sekwencja oligosyngenu I (SEQ ID Nr 9)
AACTGCAGGCCGGCCACTAGTCGCGATGTTCCCAGCCATATCCC
Sekwencja oligosyngenu II (SEQ ID Nr 10)
CCGCTCGAGGTGACCGCTAGCCATTATGGACGAATGC
Powielony fragment wstawia się w miejsce Smal pIC-20R w celu utworzenia pJJ203. Fragment przyległy do genu IVa2 plazmidu pJJ105 (fragment 2, identyfikowany jako Fgt2 IVa2 na fig. 6) wycina się przez Nsil/BstEII, po czym wstawia w odpowiednie miejsca pJJ203 w celu utworzenia pJJ204. Syngen następnie trawi się Fsel/NruI (fig. 6) i wstawia między odpowiednie miejsca pJJ204 w celu utworzenia pJJ205.
Kompletny fragment (syngen#1-Fgt1+2 IVa2) z pJJ205 trawi się przez Sse 83871/BstEII i wstawia w odpowiednie miejsca pJJ202 w celu utworzenia pJJ206 (fig. 5).
Ten fragment stosuje się następnie do wytworzenia plazmidu prokariotycznego, zawierającego zmodyfikowany genom adenowirusa (defektywny w E1 i ewentualnie E3), zawierający syngen # 1 zgodnie z metodą opisaną u Crouzeta i in., (PNAS (94)1414-1419(1997)). Otrzymany plazmid transfekuje się następnie do komórek 293 dla wytworzenia odpowiednich wirusów.
Przeprowadzono doświadczenie dla porównania zagrożenia ACR (adenowirusem kompetentnym do replikacji) podczas rozmnażania za pomocą komórki 293 dla dwóch wirusów AV1.7#1CMVp53 i Ad5CMVp53.
Wektor (AV1.7#1CMVp53) zaopatrzony w sekwencję SEQ ID Nr 3 (syngen # 1) i wyposażony w kasetkę ekspresji p53 (CMV-p53-poliASV40) skonstruowano według Crouzeta i in.(PNAS(94)1414 -1419(1997)).
Ad5CMVp53 zawiera regiony z pIX-IVa2 od Ad5 (nie modyfikowane). Kasetka ekspresji p53 jest izogeniczna dla dwóch wirusów. Oba wirusy AV1.7#1CMVp53 i Ad5CMVp53 mają podobną zdolność produkcyjną w komórce 293. Dla każdego z wirusów oczyszczono 5 łysinek na komórce 293. 2x5 łysinek powielono w ciągu 7 kolejnych pasaży. Z tego powielenia 2x5 próbek z pasażu 7 analizowano w doświadczeniu wykrywania ACR. Doświadczenie przeprowadzono trzykrotnie. Wyniki znajdują się na fig. 12.
Metoda wykrywania ACR jest metodą ilościową, pozwalającą na policzenie łysinek, których ilość odpowiada ilości ACR w dawce testowanej próbki. Daną dawkę wirusa próbki (klasycznie 3x1010 pv) stosuje się do zakażenia warstwy komórkowej komórki nietranskomplementacyjnej (cad nie wykazuje ekspresji E1 w obecności komórki A549), na której osadzona jest warstwa agarowa. Po 14 dniach obserwuje się tworzenie łysinki w warstwie, gdy wyjściowa dawka infekująca zawiera ACR.
Wyniki doświadczenia wykrywania ACR przeprowadzonego trzykrotnie są następujące: 0 RCA dla AV1.7#1CMVp53 i 6 RCA dla Ad5CMVp53. Ten wynik jest statystycznie istotny, gdy stosuje się porównawczą metodę statystyczną, odwołującą się do warunkowego prawdopodobieństwa obserwacji. Obserwuje się statystycznie istotne polepszenie na korzyść wektora AV1.7#1CMVp53 w sensie zmniejszenia zagrożenia ACR podczas rozmnażania w komórce 203 tego wektora w porównaniu z wektorem klasycznym. Całość tych wyników pozwala na wykazanie, że obecność syngenu nie wpływa na miano produkowanych wirusów, że partie wirusów zawierających syngen # 1 są pozbawione skażenia przez ACR.
5. Funkcjonalność wirusów defektywnychniosących syngen# 2, zastępującyodpowiedni region naturalny
Skonstruowano tak samo podobny wektor z syngenem # 2 i wyposażono w kasetkę ekspresji LacZ (CMV-LacZ): AV1.7#2CMV lacZ. Zdolność produkcyjną tego wektora porównano z wektorem wyposażonym w kasetkę LacZ (RSV LacZ), którego regiony pIX i IVa2 nie zostały zmodyfikowane
PL 196 606 B1 (sekwencja dzikiego Ad5) : AV1.0 RSV lacZ. Zdolności produkcyjne tych dwóch wektorów
AV1.7#2CMV lacZ i AV1.0 RSV lacZ przetestowano równolegle w komórkach 293.
Wyniki znajdują się w tabeli poniżej.
| AV1.7#2CMV lacZ | AV1.0 RSV lacZ | |
| Miano hodowli 1 (pv/ml) | 1,12 1012 | 1,50 1012 |
| Miano hodowli 2 (pv/ml) | 1,52 1012 | 1,82 1012 |
| Zdolność produkcyjna (uv/komóykę) testowana na hodowli 2 | 10133 | 12133 |
| Zdolność produkcyjna (tnu/komóykę) testowana na hodowli 2 | 203 | 207 |
Wyniki te pokazują, że syngen # 2 wykazujący homologię bardziej ograniczoną niż syngen # 1 i który zawiera poza cichymi mutacjami na poziomie genu pIX i IVa2, modyfikacje na poziomie regionów nie kodujących (to jest na poziomie promotora genu pIX i nakładających się sekwencji poliadenylowania pIX i IVa2); taki syngen, gdy jest wprowadzony w zastępstwie dzikich sekwencji adenowirusa typu 5, okazuje się żywotny i zapewnia wysoką zdolność produkcyjną.
6. Konstrukcja wirusówddfektywnyyh, w któryyhjeenąsekwencjęnaturalnąggnuplX zzstępuje się sekwencją zdegenerowaną opisaną jako SEQ ID Nr 1 i część regionu homologicznego odpowiadająca genowi IVa2 jest przemieszczona do regionu E4
Według innego wariantu wykonania jedną sekwencję naturalną genu pIX zastępuje się sekwencją zdegenerowaną opisaną jako SEQ ID Nr 1 i część regionu homologicznego odpowiadająca genowi IVa2 jest przemieszczona do regionu E4. Olonowanie genu IVa2 opisano w zgłoszeniu WO96/10088 włączonym tutaj jako odnośnik.
Skonstruowano pierwszy plazmid nazwany pIE11, który zawiera 3 następujące regiony klonowane w plazmidzie co1E1 nośniku genów OanR i SacB:
- produkt PCR wykonany na Ad5 z primerami:
5'-atcgatcgATAACAGTCAGCCTTACC-3'.
5'-agctgaattcCATCATCAATAATATACC-3';
Ten produkt PCR zawiera ITR prawy i promotor od E4 do ATG z orf1, nie włączone (nukleotydy 35525 do 35937)
- cDNA genu IVa2 opisany w zgłoszeniu WO/9610088
- fragment XcmI-EcoRV z Ad5 zawierający sekwencje potrzebne do składania orf6 od E4 i sekwencji kodującej orf6 do miejsca EcoRV.
cDNA z IVa2 w plazmidzie pIE11 jest poprzedzony nadwyżkowym ATG. To miejsce jest zniszczone w plazmidzie pIE11 przez mutagenezę kierowaną przy użyciu zestawu Transformer Site-directed mutagenesis z Clontech w celu utworzenia plazmidu pIE12, w którym ten ATG został zniszczony.
Plazmid pIE12c pochodny plazmidu pIE12 zawiera genom adenowirusa 5 modyfikowany następująco: przemieszczenie genu IVa2 z jego naturalnego miejsca do regionu E4, zastąpienie orf1-4 z E4, na korzyść cDNA z IVa2, delecja E3, insercja kasetki RSV-lacZ na miejscu E1. Plazmid pIE12c otrzymano przez rekombinację z plazmidem pXL27883Gal, jaki opisano w zgłoszeniu WO96/10088, stosując technologię opisaną u Crouzeta i in. (PNAS(94)1414-1419(1997)) włączoną tutaj jako odnośnik.
Po trawieniu enzymatycznym przez PacI, plazmid pIE12c podlega transfekcji do 293 i otrzymany wirus powielono. Obserwuje się, że profil restrykcyjny wirusa AdIE12 jest tym, jaki oczekiwano.
Przeprowadzone analizy wyprodukowanych partii wirusa pozwalają na wykazanie, że obecność zdegenerowanej sekwencji genu pIX na miejscu sekwencji naturalnej i przemieszczenie genu IVa2 do regionu E4 nie wpływa na miano produkowanych wirusów i że partie wirusa są pozbawione skażenia ACR, gdy są one testowane w warunkach opisanych poprzednio.
PL 196 606 Β1
Odnośniki bibliograficzne
Ahern i in. (1991) PNAS 88:105
Aiello i in. (1979) Virol. 94:460
Babiss i Yales (1991) J.Virol. 65:598
Epstein (1991) J.Virol.65:4475
Gangloff i in. (1994) Experientia 50:261
Holliday (1964) Genet.Res. 5:282-304
Jeong-Yu i Carroll (1992) Mol.Cell Biol. 12(1):112-9
Lin i in. (1990) Mol.Cell Biol.10(1):103-12
Matsui (1989) Mol.Cell.Biol. 9:4265
Meselson M. Radding C. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:358-361
Spector (1983) Virol. 130:533
Szostak i in. (1983) Cell 33:25-35
Waldman i Liskay (1987) PNAS 84(15)5340-4
Weinberg (1986) J.Virol 57:833
Williams i Ustacelibi (1971) J.Gen.Virol. 13:345
Young (1995) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 199:89
PL 196 606 B1
WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJE. OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) ULICA: 20, avenue Raymond Aron {C} MIASTO: ANTONY (D) KRAJ: FRANCJA (F) KOD POCZTOWY: 92165 . (G) TELEFAX: 01.55.71.72.91 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Metoda zmniejszania zjawiska rekombinacji homologicznej (iii) LICZBA SEKWENCJI:
(iv) POSTAĆ ODCZYTYWALNA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-D0S (D) OPROGRAMOWANE: Patentln Realase #1,0,
Wersja #1,30 (OEB)
2) INFORMACJE O SEQ ID nr 1:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 424 pary zasad (B) TYP: nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNE: brak (iv) NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1.,424 (xi) OPUS SEKWENCJI: SEQ ID Nr 1:
ΑΤΟ TCC ACG AAT TCC TTT GAC GGC TCC ATC GTC TCC AGC TAC CTG ACC 8
Met Ser Thr Asn Ser Phe Asp Gly Ser Tle Val Ser Ser Tyr Leu Thr
10 15
PL 196 606 Β1
| ACC CGG ATG CCT | CCC TGG | GCT GGC GTC CGC CAA AAC GTC ATG GGA AGC | 96 | |||||||||||||
| Thr | Arg | Met | Pro 20 | Pro | Trp | Ala Gly | Val 25 | Arg | Gin | Asn | Val Met 30 | Gly Ser | ||||
| TCC | ATC | GAC | GGC | AGG | CCT | GTG | CTC | CCT | GCC | AAT | AGC | ACC | ACT | CTG | ACT | 144 |
| Ser | Tle | Asp Gly | Arg | Pro | Val | Leu | Pro | Ala | Asn | Ser | Thr | Thr | Leu | Thr | ||
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| TAT | GAA | ACT | GTC | AGC | GGC | ACC | CCA | CTG | GAA | ACC | GCC | GCA | AGC | GCT | GCA | 192 |
| Tyr | GlU | Thr | Val | Ser | Gly | Thr | Pro | Leu | Glu | Thr | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GCC | AGC | GCT | GCC | GCC | GCT | ACT | GCT | CGG | GGC | ATC | GTC | ACC | GAT | TTC | GCC | 240 |
| Ala | Ser | Ala | Ala | Ala | Ala | Thr | Ala | Arg | Gly | Ile | Val | Thr | Asp | Phe | Ala | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| TTT | CTC | TCC | CCT | CTG | GCC | TCC | AGC | GCT | GCC | AGC | CGC | AGC | TCT | GCT | CGG | 288 |
| Phe | Leu | Ser | Pro | Leu | Ala | Ser | Ser | Ala | Ala | Ser | Arg | Ser | Ser | Ala | Arg | |
| 65 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| GAC | GAT | AAA | CTG | ACC | GCC | CTG | CTG | GCT | CAG | CTG | GAC | AGC | CTG | ACT | AGG | 336 |
| Asp | Asp | Lys | Leu | Thr | Ala | Leu | Leu | Ala | Gin | Leu | Asp | Ser | Leu | Thr | Arg | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| GAG | CTG | AAC | GTG | GTG | AGC | CAA | CAA | CTC | CTG | GAC | CTC | CGG | CAA | CAA | GTG | 384 |
| Glu | Leu | Asn | Vai | Val | Ser | Gin | Gin | Leu | Leu | Asp | Leu | Arg | Gin | Gin | Val | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| AGC | GCT | CTC | AAA | GCC | TCT | AGC | CCA | CCT | AAC | GCC | GTT | TAA | A | 424 | ||
| Ser | Ala | Leu | Lys | Ala | Ser | Ser | Pro | Pro | Asn | Ala | Val | * | ||||
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| (2} | INFORMACJE | ! 0 . | SEQ | ID | Nr : | ł: |
<i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 357 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNE: brak (i v) NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY:
(A) NAZW KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..354 <xi) OPIS SEKWENCJI: SBQ ID Nr 2:
PL 196 606 Β1
| ATC Ile 1 | GCG AAC CTA AAA ATA CAG TCC AAG ATG CAT CTG ATA | TCC Ser | CCA Pro 15 | CGT Arg | 48 | |||||||||||
| Ala | Asn Leu Lys 5 | Ile Gin Ser | lys | Met 10 | His | Leu | Ile | |||||||||
| ATG | CAC | CCC | TCC | CAG | CTT | AAC | CGC | TTC | GTA | AAC | ACT | TAC | ACC | AAG | GGA | 96 |
| Met | His | Pro | Ser | Gin | Leu | Asn | Arg | Phe | Val | Asn | Thr | Tyr | Thr | Lys | Gly | |
| 20 | . 25 | 30 | ||||||||||||||
| CTG | CCC | CTG | GCA | ATC | AGC | CTG | CTA | CTG | AAA | GAC | ATT | TTC | AGG | CAC | CAC | 144 |
| Leu | Pro | Leu | Ala | Ile | Ser | Leu | Leu | Leu | Lys | Asp | Ile | Phe | Arg | His | His | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| GCC | CAG | CGG | TCC | TGC | TAC | GAC | TGG | ATT | ATC | TAC | AAC | ACC | ACT | CCG | CAG | 192 |
| Ala | Gin | Arg | Ser | Cys | Tyr | Asp | Trp | Ile | Ile | Tyr | Asn | Thr | Thr | Pro | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| CAT | GAA | GCT | CTC | CAG | TGG | TGC | TAC | CTC | CAT | CCC | AGA | GAC | GGG | CTT | ATG | 240 |
| His | Glu | Ala | Leu | Gin | Trp | Cys | Tyr | Leu | His | Pro | Arg | Asp | Gly | Leu | Met | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| CCT | ATG | TAT | CTG | AAC | ATC | CAG | AGC | CAC | CTT | TAC | CAC | GTC | CTC | GAA | AAA | 288 |
| Pro | Met | Tyr | Leu | Asn | Ile | Gin | Ser | His | Leu | Tyr | His | Val | Leu | Glu | Lys | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| ATA | CAC | AGG | ACC | CTG | AAC | GAC | CGA | GAC | CGC | TGG | TCT | CGG | GCC | TAC | CGC | 336 |
| Ile | His | Arg | Thr | Leu | Asn | Asp | Arg | Asp | Arg | Trp | Ser | Arg | Ala | Tyr | Arg | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| GCG | CGG | AAA | ACC | CCT | AAA | TAA | 357 | |||||||||
| Ala | Arg | Lys | Thr | Pro | Lys | |||||||||||
| 115 |
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr 3:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 941 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNE: brak (iv) NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE: 1..941
PL 196 606 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr 3:
| GGCCGGCCGT CGACTGTGTG GGCGTGGCTT AAGGGTGGGA AAGAATATAT AAGGTGGGGG | |||||
| TCTTATGTAG | TTTTGTATCT | GTTTTGCAGC | AGCCGCCGCC | GCCATGTCCA | CGAATTCCTT |
| TGACGGCTCC | ATCGTCTCCA | GCTACCTGAC | CACCCGGATG | CCTCCCTGGG | CTGGCGTCCG |
| CCAAAACGTC | ATGGGAAGCT | CCATCGACGG | CAGGCCTGTG | CTCCCTGCCA | ATAGCACCAC |
| TCTGACTTAT | GAAACTGTCA | GCGGCACCCC | ACTGGAAACC | GCCGCAAGCG | CTGCAGCCAG |
| CGCTGCCGCC | GCTACTGCTC, | GGGGCATCGT | CACCGATTTC | GCCTTTCTCT | CCCCTCTGGC |
| CTCCAGCGCT | GCCAGCCGCA | GCTCTGCTCG | GGACGATAAA | CTGACCGCCC | TGCTGGCTCA |
| GCTGGACAGC | CTGACTAGGG | AGCTGAACGT | GGTGAGCCAA | CAACTCCTGG | ACCTCCGGCA |
| ACAAGTGAGC | GCTCTCAAAG | CCTCTAGCCC | ACCTAACGCC | GTTTAAAACA | ΪΑΑΑΤΑΑΑΑΑ |
| ACCAGACTCT | GTTTGGATTT | GGATCAAGCA | AGTGTCTTGC | TGTCTTTATT | TAGGAGTTTT |
| CCGCGCGCGG | TAGGCCCGAG | ACCAGCGGTC | TCGGTCGTTC | AGGGTCCTGT | GTATTTTTTC |
| GAGGACGTGG | TAAAGGTGGC | TCTGGATGTT | CAGATACATA | GGCATAAGCC | cgtctctggg |
| ATGGAGGTAG | CACCACTGGA | GAGCTTCATG | CTGCGGAGTG | GTGTTGTAGA | TAATCCAGTC |
| GTAGCAGGAC | CGCTGGGCGT | GGTGCCTGAA | AATGTCTTTC | AGTAGCAGGC | TGATTGCCAG |
| GGGCAGTCCC | TTGGTGTAAG | TGTTTACGAA | GCGGTTAAGC | TGGGAGGGGT | GCATACGTGG |
| GGATATGAGA | TGCATCTTGG | ACTGTATTTT | TAGGTTCGCG | A |
(2) INFORMACJE O SEQ ID Cr 4:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 423 pary zasad (B) TYP: nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZEK: cDNA (iii) HIPOTETYCZNE: brak (iv) NONSENSOWNE: brak (xx) CECHY:
(A) NAZWKUCZ: COS (B) POŁOŻENIE: 1..423
PL 196 606 Β1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr 4:
| ATG Met 1 | AGC ACG AAT | TCG Ser 5 | TTT GAC Phe Asp | GGA AGC Gly Ser | ATC GTC AGC TCA TAC TTG ACC | 48 | ||||||||||
| Ser | Thr | Asn | Ile 10 | Val | Ser | Ser | Tyr | Leu 15 | Thr | |||||||
| ACG | CGC | ATG | CCT | CCC | TGG | GCC | GGG | GTG | CGC | CAG | AAT | GTC | ATG | GGC | TCC | 96 |
| Thr | Arg | Met. | Pro | Pro | Trp | Ala | Gly | Val | Arg | Gin | Asn | Val | Met | Gly | Ser | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| AGC | ATT | GAC | GGT | CGC | CCT | GTC | CTG | CCT | GCA | AAC | TCT | ACC | ACT | TTG | ACC | 144 |
| Ser | Ile | Asp | Gly | Arg | Pro | Val | Leu | Pro | Ala | Asn | Ser | Thr | Thr | Leu | Thr | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| TAC | GAA | ACC | GTG | TCT | GGC | ACG | CCG | TTG | GAA | ACT | GCA | GCA | TCC | GCC | GCC | 192 |
| Tyr | Glu | Thr | Val | Ser | Gly | Thr | Pro | Leu | Glu | Thr | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GCT | AGC | GCC | GCT | GCA | GCT | ACC | GCC | CGC | GGG | ATC | GTG | ACT | GAT | TTT | GCT | 240 |
| Ala | Ser | Ala | Ala | Ala | Ala | Thr | Ala | Arg | Gly | Ile | Val | Thr | Asp | Phe | Ala | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| TTT | CTG | AGC | CCG | CTT | GCC | AGC | AGT | GCA | GCC | TCC | CGT | TCA | TCT | GCC | CGC | 288 |
| Phe | Leu | Ser | Pro | Leu | Ala | Ser | Ser | Ala | Ala | Ser | Arg | Ser | Ser | Ala | Arg | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| GAT | GAC | AAA | TTG | ACG | GCT | CTT | CTG | GCT | CAG | CTG | GAT | TCT | TTG | ACT | CGG | 336 |
| Asp | Asp | Lys | Leu | Thr | Ala | Leu | Leu | Ala | Gin | Leu | Asp | Ser | Leu | Thr | Arg | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| GAA | CTT | AAC | GTC | GTT | TCT | CAG | CAA | CTG | TTG | GAC | CTG | CGC | CAG | CAA | GTT | 384 |
| Glu | Leu | Asn | Val | Val | Ser | Gin | Gin | Leu | Leu | Asp | Leu | Arg | Gin | Gin | Val | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| TCT | GCC | CTC | AAG | GCT | TCT | TCG | CCT | CCC | AAT | GCC | GTT | ..TAA | 423 | |||
| Ser | Ala | Leu | Lys | Ala | Ser | Ser | Pro | Pro | Asn | Ala | Val | * | ||||
| 130 | 135 | 140 |
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr 4:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 141 aminokwasów (33) TYP: aminokwas (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr 4:
| Met | Ser | Thr | Asn | Ser | Phe Asp Gly Ser | Ile | Val | Ser | Ser | Tyr | Leu | Thr |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||
| Thr | Arg | Met | Pro | Pro | Trp Ala Gly Val | Arg | Gin | Asn | Val | Met | Gly | Ser |
| 20 | 25 | 30 |
PL 196 606 B1
| Ser | Ile | Asp | Gly | Arg | Pro | Val | Leu | Pro | Ala | Asn | Ser | Thr | Thr | Leu | Thr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Tyr | Glu | Thr | Val | Ser | Gly | Thr | Pro | heu | Glu | Thr | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ala | Ser | Ala | Ala | Ala | Ala | Thr | Ala | Arg | Gly | ile | Val | Thr | Asp | Phe | Ala |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Phe | Leu | Ser | Pro | Leu | Ala | Ser | Ser | Ala | Ala | Ser | Arg | Ser | Ser | Ala | Arg |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asp | Asp | Lys | Leu | Thr | Ala | Leu | heu | Ala | Gin | Len | Asp | Ser | Leu | Thr | Arg |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Glu | Leu | Asn | Val | Val | Ser | Gin | Gin | Leu | Leu | Asp | Leu | Arg | Gin | Gin | Val |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ser | Ala | Leu | Lys | Ala | Ser | Ser | Pro | Pro | Asn | Ala | Val | * | |||
| 130 | 135 | 140 |
(2} INFORMACJE O SEQ ID Nr 5:
(i) CECHY -SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 270 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) IIOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNE: brak (iv) NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY:
(A) NAZWBLUCZ: CDS (BS POŁOŻENIE: 1..270 <xi) OPIS SEKWENCJ: SEQ ID Nr 5:
| ACC Thr 1 | AAG GGC CTG CCC CTC | GCA ATC AGC TTG CTA CTC: AAA GAC ATT TTT | 48 | |||||||||||||
| Lys Gly Leu | Pro Leu 5 | Ala Ile | Ser | Leu Leu 10 | Leu | Lys | Asp Ile Phe 15 | |||||||||
| AGG | CAT | CAC | GCC | CAG | CGC | TCC | TGT | TAC | GAC | TGG | ATC | ATC | TAC | AAT | ACC | 96 |
| Arg | His | Kis | Ala | Gin | Arg | Ser | Cys | Tyr | Asp | Trp | He | He | Tyr | Asn | Thr | |
| 20 | 25 | 30 |
PL 196 606 B1
| ACC CCG CAG CAT | GAA GCC | CTG CAG TGG TGC TAC CTG CAC | CCC AGA GAC Pro Arg Asp | 144 | ||||||||||||
| Thr | Pro Gin 35 | His | Glu | Ala | Leu | Gin Trp Cys 40 | Tyr | Leu | His 45 | |||||||
| GGG | CTG | ATG | CCC | ATG | TAT | CTG | AAT | ATC | CAG | AGT | CAC | CTT | TAT | CAC | GTC | 192 |
| Gly | Leu | Met | Pro | Met | Tyr | Leu | Asn | Ile | Gin | Ser | His | Leu | Tyr | His | Val | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| CTG | GAA | AAA | ATA | CAT | AGG | ACC | CTC | AAC | GAC | CGA | GAT | CGC | TGG | TCC | CGG | 240 |
| Leu | Glu | Lys | Ile | His | Arg | Thr | Leu | Asn | Asp | Arg | Asp | Arg | Trp | Ser | Arg | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| GCC | TAT | CGC | GCG | CGC | AAA | ACC | CCT | AAA | TAA | 270 | ||||||
| Ala | Tyr | Arg | Ala | Arg | Lys | Thr | Pro | Lys | * |
90 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr 5:
(i) CECHY SEKWSNNCI:
(A) DŁUGOŚĆ: 90 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) KONFIGURACJA: linóowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWNNJI: SEQ ID Nr 5
Thr.Lys Gly Leu ' Pro Leu Ala Ile Ser Leu Leu Leu Lys Asp Ile Phe
5 10 15
Arg His His Ala Gin Arg Ser Cys Tyr Asp Trp Ile Ile Tyr Asn Thr
25 30
Thr Pro Gin His Glu Ala Leu Gin Trp Cys Tyr Leu His Pro Arg Asp 35 40 45
Gly Leu Met Pro Met Tyr Leu Asn Ile Gin Ser His Leu Tyr His Val 50 55 60 Leu Glu Lys Ile His Arg Thr Leu Asn Asp Arg Asp Arg Trp Ser Arg 65 70 75 80
Ala Tyr Arg Ala Arg Lys Thr Pro Lys * 85 90 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr 6:
(i) CECHY SEKWNNCI:
(A) DŁUGOŚĆ: 103 pary zasad (B) TYP: nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
PL 196 606 B1 (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZEK: inny kwas nukleinowy (iii) HIPOTETYCZNE: brak (iv) NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY:
(A) NAZWA KLUCZ: “ (B) POŁOŻENIE: 1..103 (xi) OPIS SEKWENCI: SEQ ID Nr 6:
GGCCGGCCGT CGACTGTGTG GGCGTGGCAT AAGGGTGGGA AAGAATATAT 50
AAGGTCGGGG TCTCATCTAG TCTTGTATCT GATTTGCAGT AGCCGCCGCC 100
ACC 103 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr 7:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 52 pary zasad (B) TYP: nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) KCUFIGURACIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZEK: cDNA (iii) HIPOTETYCZNE: brak (iv) NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY:
(A) NAZWAKLUCZ: (B) POŁOŻENIE: 1..52 (xi) OPIS SEKWENCJ: SEQ ID Nr 7:
AGATCTCAAA TCAATAAATA AAG^AATACT TGTTATAAAA ACAAATGAAT 50
GT 52 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr 8:
(i) CECHY SEKWEHCI:
(A) DŁUGOŚĆ: 847 par zasad
PL 196 606 B1 (B) TYP: nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW; pojedyncza (D) KONFIGURACJA: linowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (iii) HIPOTETYCZNE; brak (iv) NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY:
(A) NAZWKLUCZ: (B) POŁOŻENIE; 1..847 (xi) OPIS SEKWECJI: SEQ ID Nr 8:
| GGCCGGCCGT | CGACTGTGTG | GGCGTGGCAT | AAGGGTGGGA | AAGAATATAT | AAGGTCGGGG | 60 |
| TCTCATCTAG | TCTTGTATCT | GATTTGCAGT | AGCCGCCGCC | ACCATGAGCA | CGAATTCGTT | 120 |
| TGACGGAAGC | ATCGTCAGCT | CATACTTGAC | CACGCGCATG | CCTCCCTGGG | CCGGGGTGCG | 180 |
| CCAGAATGTC | ATGGGCTCCA | GCATTGACGG | TCGCCCTGTC | CTGCCTGCAA | ACTCTACCAC | 240 |
| TTTGACCTAC | GAAACCGTGT | CTGGCACGCC | GTTGGAAACT | GCAGCATCCG | CCGCCGCTAG | 300 |
| CGCCGCTGCA | GCTACCGCCC | GCGGGATCGT | GACTGATTTT | GCTTTTCTGA | GCCCGCTTGC | 360 |
| CAGCAGTGCA | GCCTCCCGTT | CATCTGCCCG | CGATGACAAA | TTGACGGCTC | TTCTGGCTCA | 420 |
| GCTGGATTCT | TTGACTCGGG | AACTTAACGT | CGTTTCTCAG | CAACTGTTGG | ACCTGCGCCA | 480 |
| GCAAGTTTCT | GCCCTCAAGG | CTTCTTCCCC | TCCCAATGCC | GTTTAAAGAT | CTCAAATCAA | 540 |
| TAAATAAAGA | AATACTTGTT | ATAAAAAGAA | ATGAATGTTT | ATTTAGGGGT | TTTGCGCGCG | 600 |
| CGATAGGCCC | GGGACCAGCG | ATCTCGGTCG | TTGAGGGTCC | TATGTATTTT | TTCCAGGACG | 660 |
| TGATAAAGGT | GACTCTGGAT | ATTCAGATAC | ATGGGCATCA | GCCGGTCTCT | GGGGTGCAGG | 720 |
| TAGCACCACT | GCAGGGCTTC | ATGCTGCGGG | GTGGTATTGT | AGATGATCCA | GTCGTAACAG | 780 |
GAGCGCTGGG CGTGATGCCT AAAAATGTCT TTGAGTAGCA AGCTGATTGC GAGGGGCAGG S40
CCCTTGG 847 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr 9:
(i) CECHY SEKWETCCI:
(A) DŁUGOŚĆ: 44 pary zasad
PL 196 606 B1 (B) TYP; nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: linóowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (iii) HIPOTETYCZNE: brak (iv 3 NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY:
(A) NAZWKLUCZ: (B) POŁOŻENIE: 1.4 4 (xi) OPIS SEKWNCCI: SEQ ID Nr 9:
AACTGCAGGCCGGCCACTAGTCGCGATGTTCCCAGCCATATCCC (2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr 10:
(i) CECHY SEKWENCJE:
(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: J.inóowa (ii) TYP inny kwas nukleincwy (ϋί) HIPOTETYCZNE: brak (iv) NONSENSOWNE: brak (ix) CECHY;
(A) NAZW KLUCZ: (B) POŁOŻENIE: 1..37 (xi) OPIS SEKWNNJI: SEQ ID Nr 10:
CCGCTCGAGGTGACCGCTAGCCATTATGGACGAATGC
PL 196 606 B1
Claims (18)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób ur^c3^li^ić^jć^cic< zmniejszenie częstości homologicznych zdarzeń rekombinacyjnych wewnątrz- aibs enwyątzezeąztnzekswczh osmisazc zhzsmszsmaiycm kwaznm nrkininswcm ksmózki eawinzajązcm rngisn E1 gnnsmr aannswirrza, jak równinż sbzear szkrecaiajązc, i oszazhrsmszsmaincm kwaznm nrkininswcm eawinrajązcm gnnsm aannswirrza anfnktywnc aia rngisnr E1, znamienny tym, żn znkwnnzja zs najmninj jnanngs e awózh kwazów nrkininswczh jnzt znkwnnzją ksarjązą i jnzt eangnnnrswana.
- 2. SF^oszówenH-ig zes^z. 1, z znmieenntym. żż sóńweńyjsj sńtzeangńyjzwanyw oSnieńieńiu as 1 parc eazaa e zs najmninj wzecztkizh 20 par eazaa.
- 3. Spogóówenług zes^z. 1. zznmieenntym. żż sóńweńyjsj sńtzeangńyjzwesyw oSnieńieńiu as 1 parc eazaa e zs najmninj wzecztkizh 10 par eazaa.
- 4. Sposób wenług zestrz. 1, zznmieenn tym, żż sóńweńyjs j s^ zeengńyjzwesy we weózstt kizh msżiiwczh osłsżnniazh.
- 5. Spogóó w€^n^^g z^szz. ty zzamieeny ttyn, żż dangńyjzajs w zelenżygci os urżzia ksasnów ksmórki asonłniająznj.
- 6. Spogóó wenług ozsz-z. 1, tym, żż uóńweńyjs zgńymu Zańeńtyweyng zaańywirrza aia sbzearg E1 jnzt eangnnnrswana na oseismin gnnr oIX.
- 7. Spogóó wenług zzstrz. 6, zzamieena tt/m, żż uóńweńcjs zgńymu Zańeńtyweyno zaańywirrza aia sbzearg E1 jnzt osea tym eangnnnrswana na oseismin gnnr IVa2.
- 8. Sposób wejwerzzsie wadliwech uekombinaczjnn,ch aaenywiezrów drosą wprzwaaaasie do ksmórki iinii 293 aibs oszhsannj wcminnisnnj iinii 293 gnnsmr wcminnisnngs anfnktywnngs rnksmbinazcjnngs aannswirrza, znamienny tym, żn wcminnisnc gnnsm eawinra:- aninzjs w sbzearen E1,- angnnnrazjs w gnnazh oIX i IVa2.
- 9. Deńeńtywey w zdnieńieńiu do rzniegu E1 rzkombieyazjny adenowim-ir, któreno gemm zewinra zs najmninj jnann rngisn ksarjązc, znamienny tym, żn znkwnnzja wzosmnianngs rngisnr jnzt eangnnnrswana, i angnnnrazja wzosmniannj znkwnnzji rmsżiiwia rnarkzjs zesztsCzi rnksmbinazji hsmsisgizenczh wnwnątre- i znwnątrzzząztnzzkswczh osmisaec zhrsmszsmaincm kwaznm nrkininswcm ksmórki eawinrajązcm rngisn E1 gnnsmr aannswirrza jak równinż rngisn szkrzcaiajązc i kwaznm nrkininswcm wzosmnianngs rnksmbinazcjnngs aannswirrza anfnktywnngs aia rngisnr E1.
- 10. Adańywirzrwenługzzstrz. ż, zznmieenatym. żż renios zZangńyjzwesyj s^ 1zniogym żoarjązcm i eawinra gnn oIX.
- 11. Adańywirzrwenług zz-zz. 10, zznmieenatym. żż sóńweńcjszZangńyjzwesyzzwiejzjncz gnn oIX jnzt znkwnnzją SEQ ID Ns 1.
- 12. Aannswirrz wnałrg eaztre. 9, znamienny tym, żn rngisn eangnnnrswanc eawinra gnnc oIX i IVa2.
- 13. AAenowiezr went-ir zasti^. 11 albo 11, znamienna tym, że pona-to ggn IVa— w^^^tt^f^i^rj5 w oseczji gnnsmswnj innnj niż jngs oseczja oszeątkswa.
- 14. AAamwirzg wenług zzstrz. 11, 0^0116™^ tym, żż o^n I Va2 j s^ 1ιrójugwesy nn pos.omie rngisnr E4.
- 15. AAańywirzr wenług οζ-^. 11, ozamieena lym, żż 1zniog żZangńy-zwesyj s^ oZańiniowenc znkwnnzją SEQ ID Ns 3.
- 16. AAańywirzrwenługzzstrz. 11 olbb 11l olbb 11, olbo 11, olbo 11, olbo 11, zznmieenatym. żn zawinra aninzjs w sbzzarzn E1.
- 17. AAańywirzr wenług ozstrz. 10 olbb 1ty ozamieena tym, żż oZangńyjzwesy uóńweńcjs cjgnr oIX jnzt znkwnnzją SEQ ID Ns 1.
- 18. Lida komórZowe 099 alt^o poshoSrιy I inii 099, zewierajiscz dańeńtywey aaamwirzg dla oszzarr E1, znamienna tym, żn znkwnnzja zhrsmszsmswngs kwazr nrkininswngs ksmórki, zawinrająza sbzzar E1 sraz sbzzar szkrzcaiajązc wcminnisnngs anfaktywnngs aannswirrza, aibs znkwnnzja oszazhrsmszsmswngs kwazr nrkininswngs zawinrająza gnnsm wcminnisnngs aannswirrza jnzt znkwnnzją ksarjązą i jnzt znkwnnzją zangnnnrswaną.PL 196 606 B1RysunkiZjawisko pojedynczej rekombinacji i pękania chromosomuDziki typFig.PL 196 606 Β1UlU)FigPL 196 606 B1251 Sali·257 BamHi·PL 196 606 Β1402 Xbal ·3073 Xbal · 3C-73 SW3I ·3745 ΑϊγΙΙ ·Fig·PL196 606 Β1402 Xbai ·4819 Sali ·Fig· 5PL 196 606 B1UlBstEII *UZ >«ΛO oδ £3CU .c *ϋ (0 _ tn — fO zN Ul . o >iZ M > <ΰ '-λ Oj O OTT — o<u tnOmFig·PL 196 606 Β1 i-ι ωc υο υΕ<Ε<υ υο <υ ββ •η >ι □Μ +J ωφΜΟ <ΟΕ-1 <<u U u O o 0 E-< << E- ·ΦΟ.(0SΛ-Ω ’Ο'ΜΖ3Ω ζw οζ >coI οϋΟ <Ε α(β •π υβΦΦVI οr-r y-jCO u(0Ο co u<0U O 0 U 0 < E-< O 0 U 0 U 0 H < · E-> < 0 0 E-* < < E- 0 0 0 0 0 0 0 0 T-t E* < — cy 0 0 · < E- < 0 0 KO < H — τ—t 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 — 0 0 · 0 0 — σ> σ\ cn σ>0 0 — co < E- 0 0 0 0 — LD e < 0 0 — CD ΓΠ < E-1 < E^ ·<rco •Hu.PL 196 606 B1PL 196 606 Β11/1ATG TCC ATG AGC Met ser31/11 GTC TCC 'GTG AGC val ser61/21 CCC TGG CCA TGG pro trp91/31 GGA AGC GGC TCC gly ser121/41 CCT GCC CCC GCA pro ala151/51 ACT GTC ACC GTG thr val181/61 GCA AGC GCC TCC ala serDegeneracja w pIX ACG AAT TCC TTT GAC GGC TCC ATC ACC AAC TCG TTT GAT GGA AGC ATT thr asn ser phe asp gly ser ile AGC TAC CTG ACC AC£ CG£ ATG CCT TCA TAT TTG ACA ACG CGC ATG CCC ser tyr leu . thr thr arg met pro C-CT GGC GTC CGC CAA AAC GTC ATG GCC GGG GTG CGT CAG AAT GTG ATG ala gly val arg gin asn val met TCC ATC GAC GGC AGG CCT GTG CTC AGC ATT GAT GGT CGC CCC GTC CTG ser ile asp giy arg pro val leu AAT AGC ACC ACT CTG ACT TAT GAA AAC TCT ACT ACC TTG ACC TAC GAG asn ser thr thr leu thr tyr glu AGC GGC ACC CCA CTG GAA ACC GCC TCT GGA ACG CCG TTG GAG ACT GCA ser gly thr pro leu glu thr ala GCT GCA GCC AGC GCT GCC GCC GCT GCC GCC GCT TCA GCC GCT GCA GCC ala ala ala ser ala ala ala alaFig. 8aPL 196 606 Β1211/71 ACT GCT CGG GGC ATC GTC ACC GAT TTC GC£ ACC GCC CGC GGG ATT GTG ACT GAC TTT GCT thr ala arg giy ile val thr asp phe ala 241/81 TTT CTC TCC CCT CTG GCC T£C AG£ GCT GCC TTC CTG AGC CCG CTT GCA AGC AGT GCA GCT phe leu ser pro leu ala ser ser ala ala 271/91 AGC CGC AGC TCT GC2 .CGG GAC GAT AAA £TG TCC CGT TCA TCC GCC CGC GAT GAC AAG TTG ser arg ser ser ala arg asp asp lys leu 301/101 ACC GCC CTG CTG GCT CAG £TG GA£ AGC £TG ACG GCT CTT TTG GCA CAA TTG GAT TCT TTG thr ala leu leu ala gin leu asp ser leu 331/111 ACT AGG GAG CTG AAC GTG GT£ AGC CAA CAA ACC CGG GAA CTT AAT GTC GTT TCT CAG CAG thr arg glu leu asn val val ser gin gin 361/121 CTC <3TG GAC CTC CGG CAA CAA GTG AGC GCT CTG TTG GAT CTG CGC CAG CAG GTT TCT GCC leu leu asp leu arg gin gin val ser ala 391/131 CTC AAA GCC TCT AGC CCA CCT AA£ GCC GTT CTG AAG GCT TCC TCC CCT CCC AAT GCG GTT leu lys ala ser ser pro pro asn ala val421/141TAATAAFig. 8bPL 196 606 Β1Degeneracja w IVa21/1 TC GCG AAC CTA AAA ATA CAG TCC AAG ATG TA GCC AAC ,CTA AAA ATA CAG TCC AAG ATG ile ala asn leu lys ile gin ser lys met 31/11 CAT CTG ATA TCC CCA CGT ATG CAC CCC TCC CAT CTC ATA TCC CCA CGT ATG CAC CCA TCC his leu ile ser pro arg met his pro ser61/21 CAG CTT AAC CGC TTC GTA AAC ACT TAC ACC CAG CTT AAC CGC TTT GTA AAC ACT TAC ACC gin leu asn arg phe val asn thr tyr thr 91/31 AAG GGA CTG CCC CTG GCA ATC AGC CTG CTA AAG GGC CTG CCC X UJ GCA ATC AGC TTG CTA lys gly leu pro leu ala ile ser leu leu121/41CTG AAA GAC ATT TTC AGG CAC CAC GCC CAG CTG AAA GAC ATT TTT AGG CAC CAC GCC CAG leu lys asp ile phe arg his his ala gin151/51 CGG TCC TGC TAC GAC TGG ATT ATC TAC AAC CGC TCC TGC TAC GAC TGG ATC ATC TAC AAC arg ser cys tyr asp trp ile ile tyr asn 181/61 ACC ACT CCG CAG CAT GAA GCT CTC CAG TGG ACC ACC CCG CAG CAT GAA GCT CTG CAG TGG thr thr pro gin his glu ala leu gin trpFig. 9aPL 196 606 B1 211/71 TGC TGC cys TAC TAC tyr CTC CTC leu CAT CAC his CCC ccc pro AGA AGA arg GAC GAC asp GGG GGG gly CTT CTT leu ATG ATG met 241/81 CCT ATG TAT CTG AAC ATC CAG AGC CAC CTT CCC ATG TAT CTG AAC ATC CAG AGT CAC CTT pro met tyr leu asn ile gin ser his leu271/91TAC CAC GTC CTC GAA 'AAA ATA CAC AGG ACC TAC CAC GTC CTG GAA AAA ATA CAC AGG ACC tyr his val leu glu lys ile his arg thr 301/101 CTG CTC leu AAC AAC asn GAC GAC asp CGA CGA arg GAC GAC asp CGC CGC arg TGG TGG trp TCT TCC ser CGG CGG arg GCC GCC ala 331/111 TAC CGC GCG CGG AAA ACC CCT AAA TAA TAC CGC GCG CGC AAA ACC CCT AAA TAA tyr arg ala arg lys thr pro lys OCHFig- 9bPL 196 606 B1 oΓΧ ri o«&SYNGENI=*£ — > O E- u o < u o < E- Ł < e- U o Jm u O o o u 2 U o < < u u u E- o u o E- O E- u u u E- u E- u o < u U α E- e- < U E- U E- E* u U E- U u E- O U E- o U U U U U O <O u E- < u O u □ U u o E- E- u u u U U o u £· E- U M < o u O O u <u U U u u u E- 95 e- u < U £U — u o E- U U u E- < U o u U 6- e- u u U < u < u *-l u u 2 u < u u u <2 u E- u u o < < u u u U u E-« 2 E- u o W u 2 E- E- u u o t* U u β u o u o β o u u 2 X - — e* E- E- 2 2 u U ce E- u u E- U 0 < u o U 1—< U u 2 u E- . U w •c M _ u E- U u 2 U < < u &* < U u E- s- U E- u U < P- u U u E- — u U u U C3 tj 2 *c £-· E- E- 2 u E- u _j£_ 2 u e- U 2 o o U u u u u o o u o o y u u «4 u £ C3 o P-4 u E- E u E- □ E- o u β O E- o σ u U u u u X — u 2 u u u 2 u o o e- 2 <r-i u < u o u β E- u o E- M — U o o < O U < u E- U U u E- E- e- u o U U u E- U < u u i- u O u Φ u f- f- E- o 9) u E- u U o k — u U u E- o σ» oo oo αu oo su oΕυOU uo <u uΕυ ouΕυO <o ou <ΕΟ <UΕυUUU <U oEu o<u eo ooΕυ □ΕυUU □u u<oΕυPL 196 606 B1Dra o o «* Γ» E- 0 0 u e« 0 0 o 0 P s 0 e- U u U e- 0 0 0 o u 0 i E-<< u 0 u 0 «e 0 0 F· 0 <U 0 0 U e- 0 <0 0 e- 0 0 0 u & o 0 e* u <0 0 0 0 0 e- 0 0 0 e- e- 0 e- 0 E- 0 6- 6- 0 0 < 0 0 0 < e* e« 0 0 •i e« 0 0 & <0 0 e- 0 o <e- 0 0 0 0 t-> 6« 0 e- 0 E* E- <0 e« 5 0 0 6- 0 0 eh o o o CB CD CD Ι- 0 Ο O 0 < o 0 < E- o e-> l·· O u O o U u o u < < < 0 0 0 u < < w 0 E* 0 S 3 σ\ < Eh U E- 0 Z —— 0 E- 0 0 0 £ < 0 o < 0 < E- 0 o 0 E* 0 Eh Eh £ 0 0 < ł-M 0 0 Θ <e- Eh <· U 0 Łt o 03 0 Ł < — 0 Ł E* Eh e**· 0 0 <e- < Eh Eh 0 0 0 0 Eh E- 0 0 0 0 <0 0 0 E« < 0 0 0 Eh < 0 £h 0 0 0 0 Eh Eh 0 Eh w <0 < • 0 E- 0 0 0 Eh Eh 0 0 z — <E- 0 0 < 0 <0 < 0 £ U Eh E-· 0 0 < Eh 0 t* << 0 0 0 < 0 < 0 0 0 Eh 0 0 Eh Eh Eh Eh 0 0 0 0 < Eh <0 0 Eh 0 Eh << tC 0 0 £ σ 0 ic Eh < ię 0 e« 0 0 0 Eh 0 o 0 0 < 0 <0 CM 0 0 0 <0 Eh 0 l·· s> 0 0 < ł—1 0 Eh cc oFig,PL 196 606 Β1 ησιCM •ΗΜOSOO fii) eo toa.LO *eX X x X X x^ X X X X X X 5-^j X X X X es r5® i cn cooCs χχχχχχχχX X X X X X,X-X.x X X X X XX X 1 XV«« iii*en mc.UJFig. ΠPL 196 606 Β1 <JP moo enII 44 υ 5 (0 Ό Η fi fi 0 φ 4-1 1—1 44 Φ Φ •fi 5 s 0 Oj N 44 44 0 U >1 >1 υ fi nf •o N 0) Ό r-1 0 0 44 44 0 0 I Oj co O 44 in Oj Φ Oj fi r~ fi * U tn r—1 PS >Φ M •fi 44 fi fi U cd n fi in >1 •N Oj 0 Ό ΙΓ) 44 fi >1 Ό 5 cn 0 Φ 44 •H O <0 fi Φ fil ŁO O o o 44 N Ł. 42 Ό u Ό O o o fi O. cd 2 © U o o 5 'tn o O r* o o o n Q > « < o o o cd •H fi fi fi cd 5 <d X >1 •H fi fi 44 Φ >Ί 1“ł Φ co o o o •H U! 'fi s CU CM o Φ N 0 Oj > U o O o Ό (fl N u •H 44 ΙΛ FM o CS U Ό 'tn . Χ*Ί O u • o o o Ό ni Φ N fi Ή Ό •n 44 O Ό •H 44 fi fi U 44 >1OOjOOj + * ω o inΦ fi <dO +J tn (U td •H 0 xn 0 S fi 44 m cn fi 'fi Φ rfi -H td 42 Ή 0 N Ό T3 0 Φ Oj N 0 fi Ό Oj £ td 1 fi dP Oj tn 0 V Cn Oj Φ & 0 Φ 44 fi fi •N fi Ό fi fi td S td* Φ •H cn •H fi 44 td •H Ό fi td >1 ffl Φ td fi fi td N g U >1 N 44 fi tn 44 >1 O 44 td • .· +4 •fi * 44 <U r-H CN CO •fi tó • • • 44 44 Ό 'tn SW 'tn tn ' 'cn 0 0 0 <tf 0 Q Q Q N r—1 CJ H tn ·γ-> o td td n & •fi fi rfi <D td tnFigiPL 196 606 B1Departament Wydawnictw UP RP
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9714383A FR2774699B1 (fr) | 1997-11-17 | 1997-11-17 | Methode de reduction des evenements de recombinaison homologue |
| PCT/FR1998/002453 WO1999025861A2 (fr) | 1997-11-17 | 1998-11-17 | Vecteurs adenoviraux et methode de reduction des evenements de recombinaison homologue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL340601A1 PL340601A1 (en) | 2001-02-12 |
| PL196606B1 true PL196606B1 (pl) | 2008-01-31 |
Family
ID=9513447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL340601A PL196606B1 (pl) | 1997-11-17 | 1998-11-17 | Sposób umożliwiający zmniejszenie częstości homologicznych zdarzeń rekombinacyjnych, sposób wytwarzania wadliwych rekombinacyjnych adenowirusów, defektywny adenowirus i linia komórkowa |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6410298B1 (pl) |
| EP (1) | EP1032695B1 (pl) |
| JP (1) | JP4376454B2 (pl) |
| KR (2) | KR20070103483A (pl) |
| CN (1) | CN1201013C (pl) |
| AT (1) | ATE393234T1 (pl) |
| AU (1) | AU759531B2 (pl) |
| BR (1) | BR9814210A (pl) |
| CA (1) | CA2309315C (pl) |
| CZ (1) | CZ299797B6 (pl) |
| DE (1) | DE69839403T2 (pl) |
| FR (1) | FR2774699B1 (pl) |
| HU (1) | HU226018B1 (pl) |
| IL (2) | IL135983A0 (pl) |
| NO (1) | NO329784B1 (pl) |
| PL (1) | PL196606B1 (pl) |
| WO (1) | WO1999025861A2 (pl) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2799472B1 (fr) | 1999-10-07 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| US7653769B2 (en) * | 2006-12-14 | 2010-01-26 | International Business Machines Corporation | Management of devices connected to infiniband ports |
| US6821775B1 (en) * | 2000-02-11 | 2004-11-23 | Genvec, Inc. | Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor |
| US6591543B2 (en) * | 2000-04-14 | 2003-07-15 | Kenneth P. Sabine | Top water lure with highly active propeller |
| KR20010064682A (ko) * | 2000-07-01 | 2001-07-11 | 김재호 | Ｅ1ｂ가 감쇠된 아데노바이러스를 이용한 ｃｄ／5－ｆｃ및 ｈｓｖ－1 ｔｋ／ｇｃｖ의 이중 자멸 유전자 시스템 |
| DE10045687B4 (de) * | 2000-09-15 | 2006-07-06 | MICROMUN Privates Institut für Mikrobiologische Forschung GmbH Biotechnikum Greifswald | Expressionskassetten und Adenovirusvektoren |
| US20030087438A1 (en) * | 2001-11-02 | 2003-05-08 | Genvec, Inc. | E1-revertant-free adenoviral composition |
| US20030158112A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-08-21 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Selective induction of apoptosis to treat ocular disease |
| WO2004050027A2 (en) * | 2002-12-02 | 2004-06-17 | Genvec, Inc. | Materials and methods for treating ocular-related disorders |
| CA2559436A1 (en) * | 2004-03-12 | 2005-09-29 | Genvec, Inc. | Materials for treating vascular leakage in the eye |
| US20060188481A1 (en) * | 2005-02-22 | 2006-08-24 | Saitama Medical School | Methods for prophylactically or therapeutically treating an animal for an ocular-related disorder |
| US8420103B2 (en) * | 2007-01-30 | 2013-04-16 | Transgene S.A. | Papillomavirus vaccines |
| JP5474767B2 (ja) * | 2007-05-15 | 2014-04-16 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム | 多重遺伝子発現のためのベクター |
| DK3093345T3 (da) | 2007-07-26 | 2019-06-24 | Uniqure Ip Bv | Baculovirusvektorer omfattende gentagne kodende sekvenser med differentielle foretrukne kodoner |
| AU2009317517B2 (en) * | 2008-11-21 | 2014-12-04 | Bavarian Nordic A/S | Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences |
| WO2010085660A2 (en) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Roger Williams Hospital | Viral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same |
| WO2012021730A2 (en) * | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Genvec, Inc. | Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| KR101427200B1 (ko) * | 2011-11-24 | 2014-08-07 | 주식회사 바이로메드 | 아데노바이러스 생산 신규 세포주 및 그의 용도 |
| US9014637B1 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-21 | Intel Corporation | Dynamic switching frequency control of an on-chip or integrated voltage regulator |
| CN108203706B (zh) * | 2017-11-30 | 2021-03-26 | 陕西师范大学 | 一种用于提高高容量腺病毒包装效率的辅助腺病毒 |
| CN112877358B (zh) * | 2021-02-07 | 2023-02-03 | 上海市第一人民医院 | 一种基于5型腺病毒序列的重组质粒及应用 |
| CN119432919B (zh) * | 2024-11-12 | 2025-07-01 | 北京因美未来生物医药科技有限公司 | 减少复制型腺病毒污染的病毒载体及构建方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2726285B1 (fr) * | 1994-10-28 | 1996-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation |
| DK0843731T3 (da) * | 1995-03-24 | 2008-06-09 | Genzyme Corp | Adenovirusvektorer til genterapi |
| ATE445705T1 (de) * | 1995-06-15 | 2009-10-15 | Crucell Holland Bv | Verpackungssysteme für humane rekombinante adenoviren zur gentherapie |
-
1997
- 1997-11-17 FR FR9714383A patent/FR2774699B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-11-17 BR BR9814210-0A patent/BR9814210A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 KR KR1020077020673A patent/KR20070103483A/ko not_active Ceased
- 1998-11-17 KR KR1020007005333A patent/KR100796060B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-17 JP JP2000521224A patent/JP4376454B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-17 DE DE69839403T patent/DE69839403T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 HU HU0101827A patent/HU226018B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 AT AT98955679T patent/ATE393234T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 CZ CZ20001791A patent/CZ299797B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 WO PCT/FR1998/002453 patent/WO1999025861A2/fr not_active Ceased
- 1998-11-17 PL PL340601A patent/PL196606B1/pl unknown
- 1998-11-17 US US09/530,378 patent/US6410298B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 EP EP98955679A patent/EP1032695B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 CN CNB98810749XA patent/CN1201013C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-17 IL IL13598398A patent/IL135983A0/xx active IP Right Grant
- 1998-11-17 CA CA2309315A patent/CA2309315C/fr not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-05-03 AU AU31294/00A patent/AU759531B2/en not_active Ceased
- 2000-05-04 IL IL135983A patent/IL135983A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-15 NO NO20002504A patent/NO329784B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20010032146A (ko) | 2001-04-16 |
| JP4376454B2 (ja) | 2009-12-02 |
| HUP0101827A2 (hu) | 2001-09-28 |
| HU226018B1 (en) | 2008-03-28 |
| CZ20001791A3 (cs) | 2000-08-16 |
| IL135983A0 (en) | 2001-05-20 |
| CN1278302A (zh) | 2000-12-27 |
| US6410298B1 (en) | 2002-06-25 |
| EP1032695A2 (fr) | 2000-09-06 |
| CA2309315A1 (fr) | 1999-05-27 |
| KR100796060B1 (ko) | 2008-01-21 |
| AU759531B2 (en) | 2003-04-17 |
| CZ299797B6 (cs) | 2008-11-26 |
| WO1999025861A2 (fr) | 1999-05-27 |
| DE69839403T2 (de) | 2009-05-28 |
| WO1999025861A3 (fr) | 1999-07-01 |
| AU3129400A (en) | 2000-12-14 |
| BR9814210A (pt) | 2000-10-03 |
| HUP0101827A3 (en) | 2003-08-28 |
| CA2309315C (fr) | 2011-06-14 |
| DE69839403D1 (de) | 2008-06-05 |
| FR2774699A1 (fr) | 1999-08-13 |
| PL340601A1 (en) | 2001-02-12 |
| EP1032695B1 (fr) | 2008-04-23 |
| NO20002504L (no) | 2000-05-15 |
| NO20002504D0 (no) | 2000-05-15 |
| CN1201013C (zh) | 2005-05-11 |
| KR20070103483A (ko) | 2007-10-23 |
| JP2003504004A (ja) | 2003-02-04 |
| FR2774699B1 (fr) | 2003-10-03 |
| IL135983A (en) | 2008-11-26 |
| ATE393234T1 (de) | 2008-05-15 |
| NO329784B1 (no) | 2010-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL196606B1 (pl) | Sposób umożliwiający zmniejszenie częstości homologicznych zdarzeń rekombinacyjnych, sposób wytwarzania wadliwych rekombinacyjnych adenowirusów, defektywny adenowirus i linia komórkowa | |
| RU2219241C2 (ru) | Дефектный рекомбинантный аденовирусный вектор (варианты) | |
| KR100379569B1 (ko) | 개기원의아데노바이러스벡터및유전자치료에서이의사용방법 | |
| EP0972063B1 (en) | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof | |
| JP3816952B2 (ja) | 治療遺伝子と免疫保護遺伝子とを含む欠陥アデノウイルス | |
| JP2022023074A (ja) | 腫瘍選択的ｅ１ａおよびｅ１ｂ変異体 | |
| US20090156796A1 (en) | Metastatic colon cancer specific promoter and uses thereof | |
| JP2002507382A (ja) | 組織特異的複製および遺伝子発現のためのベクター | |
| JPH09509578A (ja) | 組み込み可能な組み換えアデノウィルス、それらの製造及びそれらの治療的利用 | |
| WO1998039467A2 (en) | Adenovirus vectors specific for cells expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof | |
| JP2004536572A (ja) | 新規ベクター構築物 | |
| SK110097A3 (en) | Method for preparing a recombinant adenovirus genome | |
| US6200798B1 (en) | Defective recombinant adenoviruses with inactivated IVa2 gene | |
| MXPA97001766A (en) | Defective recombinant adenovirus with a vat iva2 inactiv | |
| WO1999061034A1 (en) | Improved vectors | |
| CN110684743A (zh) | 特异性杀伤肿瘤细胞的病毒和肿瘤治疗药物 | |
| JP2009535031A5 (pl) | ||
| US7011976B1 (en) | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof | |
| WO2002053760A2 (en) | Chimeric cytolytic viruses for cancer treatment | |
| US7264818B2 (en) | BAV packaging regions and E1 transcriptional control regions | |
| MXPA00004646A (en) | Adenovirus vectors and method for reducing homologous recombination phenomena | |
| US20040214162A1 (en) | PAV regions for encapsidation and E1 transcriptional control | |
| FR2729674A1 (fr) | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants | |
| EP1918380A2 (en) | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof | |
| CA2282708A1 (en) | Adenovirus vectors specific for cells expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof |