JPH09509578A - 組み込み可能な組み換えアデノウィルス、それらの製造及びそれらの治療的利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 感染細胞のゲノム中に組み込まれることができるカセットを含む組み換えアデノウィルス、それらの製造、それらを含む製薬学的組成物、ならびに該アデノウィルスの利用が開示されている。カセットは特にＡＡＶの少なくとも１つの逆方向末端反復塩基（ＩＴＲ）及び異種ＤＮＡ配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 組み込み可能な組み換えアデノウィルス、それらの製造及びそれらの治療的利用 本発明はウィルス起源の組み換えベクター及びそれらの治療的利用に関する。 さらに特定的には、本発明は感染細胞のゲノム中に組み込まれることができるカ セットを含む組み換えアデノウィルスに関する。本発明はこれらのベクターの製 造、それらを含む製薬学的組成物、ならびに試験管内、生体外及び生体内におけ る遺伝子の転移のための、特に遺伝子及び細胞療法の枠内におけるそれらの利用 にも関する。 遺伝子及び細胞療法は、細胞又は冒された臓器中への遺伝情報の導入により欠 失又は異常（突然変異、異常発現など）を修正する、又は治療的に重要なタンパ ク質の発現を保証することにある。この遺伝情報は試験管内で臓器から抽出され る細胞中に導入され、次いで改変された細胞を体内に再導入するか、あるいは生 体内に直接、適した組織中に導入されることができる。この遺伝情報の転移のた めの種々の方法が記載されているが、その中にＤＮＡ及びＤＥＡＥ−デキストラ ンの（Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｌ．１（１９６７）８９１）、 ＤＮＡ及び核タンパク質の（Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡ及び脂質の（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ，ＰＮＡＳ ８４（１９８７）７４１３）、ＤＮＡ及びポリリシンの複合体、リ ポソームの利用（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５ ５（１９８０）１０４３１）などを含む種々 のトランスフェクション法がある。 より最近、遺伝子の転移のためのベクターとしてのウィルスの利用が、これら の物理化学的トランスフェクション法のための有望な代替えとして現れた。これ に関し、種々のウィルス、特にレトロウィルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど） 、ＨＳＶウィルス、アデノ−伴生ウィルス及びアデノウィルスがある種の細胞集 団に感染する能力に関して調べられてきた。しかし今日までに開発されたウィル スベクターは、細胞及び／又は体内への遺伝子の転移に関連する困難を、満足で きる程すべて解決することを可能にしない。かくして遺伝子の転移のために魅力 的な性質（高力価、低病原性を与える可能性）を有するアデノウィルスは染色体 外ウィルスである。この故に、分裂中の細胞において、組み換えウィルスは世代 を経て希釈され、結局娘細胞から完全に消失する。他方、レトロウィルスベクタ ー又はアデノ−伴生ウィルス（ＡＡＶ）から誘導されるベクターはそれらが感染 する細胞のゲノム中に組み込まれることができるが、それらは大量に製造するこ とも、例えば大きなトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を挿入することもで きない。 本発明はこれらの問題に有利な回答を与える。本発明は実際に、遺伝子療法に おいて用いることができ、組み換えアデノウィルスベクターの感染性を有し、感 染細胞又は臓器のゲノム中への異種配列の組み込みを可能にするる組み換えベク ターの開発に存する。 本発明の第１の主題はさらに特定的に、感染細胞のゲノム中に組み込まれるこ とができるカセットを含む欠失組み換えアデノウィルスに関する。 一般にカセットは、最も多くの場合アデノウィルスに関して異種であ る所望のＤＮＡ配列、及び感染細胞のゲノム中へのその組み込みを可能にする要 素を含む。組み込みを可能にする要素はウィルス起源のものが有利である。かく して本発明のベクターは２種類のウィルス：アデノウィルス及び組み込み可能な ウィルスの性質を結合させている。 本発明のベクターは、それらを高力価で製造することができ、病原性でなく、 広い宿主範囲を有し、大きな異種ＤＮＡ配列を挿入することができ、感染細胞の ゲノム中に該配列を組み込むことができるので、特に有利である。 さらに本発明のベクターは細胞又は体に転移させることが望まれているＤＮＡ 配列が撒き散らされる危険を制限することを可能にする。該細胞がゲノム中に組 み込まれると、それはもはや切り出したり、感染性ウィルス粒子中に挿入したり できない。 さらに本発明のベクターは有利なことに、ウィルス遺伝子を完全に含まないＤ ＮＡ配列を細胞に転移させることを可能にする。事実、ゲノム中への組み込みを 可能にするカセットは、ウィルス起源のいずれのコード配列も完全に含まないこ とができるき。導入することができる唯一のウィルス領域は組み込みのための要 素である。 さらに本発明のベクターは用いられる構築物に依存して、感染細胞のゲノムの 正確な部位に、及び細胞毒性なく異種ＤＮＡ配列を組み込むことを可能にする。 カセットの組み込みを可能にする要素は１つ又はそれ以上の逆方向末端反復塩 基配列を含むのが好ましい。カセットの組み込みを可能にする要素は、アデノ− 伴生ウィルス（ＡＡＶ）の１つ又はそれ以上の逆方向末端反復塩基配列を含むの がさらに好ましい。 従って本発明の好ましい主題は、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復塩基 配列及び１つの異種ＤＮＡ配列を含むカセットを含む欠失組み換えアデノウィル スに関する。 事実、出願人は特に有利な方法で、上記で定義された本発明のウィルスベクタ ーの構築のためにＡＡＶ（アデノ−伴生ウィルス）の組み込み性を用いることが 可能であることを示した。 ＡＡＶはアデノウィルスと同様に、気道の良性病原性ウィルスである。ヘルパ ーウィルスの不在下で、ＡＡＶはヒト細胞のゲノムの好ましい部位中に（染色体 １９の領域）、プロウィルスの形態で安定して組み込まれる性質を有する。ＡＡ Ｖのゲノムはクローニングされ、配列決定され、特性化されている。それは４７ ００の塩基から成り、各末端に約１４５塩基の逆方向末端反復塩基領域（ＩＴＲ ）を含む。ゲノムの残りは包膜化機能（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃ ｔｉｏｎ）を有する２つの必須の領域：ウィルス複製及びウィルス遺伝子の発現 に含まれるｒｅｐ遺伝子を含むゲノムの左部分；ウィルスキャプシドタンパク質 をコードするｃａｐ遺伝子を含むゲノムの右部分に分けられる。 ＡＡＶの逆方向末端反復塩基領域（ＩＴＲ）はウィルスのための複製起点とし て働き、感染細胞のゲノム中へのウィルスの組み込みも担う。今回、１つ又はそ れ以上のこれらのＩＴＲを組み換えアデノウィルスに導入し、標的細胞の染色体 上への異種ＤＮＡ配列の組み込みを目指し、かくして時間を経た発現の安定性を 強化することが可能であることが示された。事実、出願人は、これらの配列をア デノウィルスのゲノム中に導入できること、それらがアデノウィルスの状況にお いてそれらの機能を保存していること、及び遺伝子又は細胞療法においてそれら を用い、 アデノウィルスを介して導入される配列をヒト細胞中に安定して組み込むことが できることを示した。さらに本発明のこれらのハイブリッドウィルスは、アデノ ウィルスの力価（ＡＡＶの場合に得られる力価よりずっと高い）に匹敵する力価 で製造することができ、多数の治療的用途を可能にする。 第１の実施態様において、本発明の組み込みカセットは異種ＤＮＡ配列に連結 されたＡＡＶ ＩＴＲを１つだけ含む。事実、異種配列の組み込みの誘導には１ つのＡＡＶ ＩＴＲで十分なことが示された。この実施態様の場合、ＩＴＲは異 種ＤＮＡ配列の下流又は上流に置かれることができる（図１ａ及び１ｂ）。 有利には、本発明のアデノウィルスは端で２つのＡＡＶ ＩＴＲに接する少な くとも１つの異種ＤＮＡ配列を含んだカセットを含む（図１ｃ）。この実施態様 は、組み込み効率が非常に高いので特に有利である。 上記の通り、ＡＡＶゲノムはその２つの末端に位置する２つのＩＴＲを含み、 １つの５’ＩＴＲは左の末端に位置し、１つの３’ＩＴＲは右の末端に位置する 。これらのＩＴＲの配列は同一であり、それらは互いに対して反対の方向に配向 している。さらにいくつかの場合にはＩＴＲの構造は転位により改変され得るが 、基本組成は変化しない。本発明のベクターの製造のために、いずれの１つ又は それ以上のこれらのＩＴＲを用いることもできる。 本発明の特に有利な実施態様の場合、カセットはその端でＡＡＶ５’ＩＴＲ及 び３’ＩＴＲに接する異種ＤＮＡ配列を含む。 ＡＡＶ ＩＴＲは種々の方法で得ることができる。最初に従来の分子生物学法 によりそれらをＡＡＶのゲノムから単離することができる（特 にＷＯ９１／１８０８８、ＷＯ９３／０９２３９を参照されたい）。上記の通り 、これらの配列は約１４５ｂｐを有し、ＡＡＶゲノムの末端に位置し、適した制 限酵素を用いて切り出すことができる。これに関し、それらは特にＡＡＶ１、Ａ ＡＶ２、ＡＡＶ３及びＡＡＶ４などの種々のＡＡＶ血清型から単離することがで きる。さらにＩＴＲの配列は既知であり、それらを核酸合成機を用いて人工的に 合成することもでき、又は混合法により得ることもできる（ゲノムからの単離、 次いで合成法により伸長）。最後にこれらのＩＴＲはそれらの機能を強化する、 それらの寸法を減じる、組み込み後のそれらの安定性又はそれらの組み組み特異 性を向上させるなどの目的で、当該技術分野（分子生物学、化学、酵素学など） における熟練者に既知のいずれの方法によっても改変することもできる。特にそ れらを従来の分子生物学法に従って突然変異、欠失及び／又は塩基対の付加によ り改変することができる。 別の場合、本発明のアデノウィルスにおいて用いられるＩＴＲはＡＡＶ−２ ＩＴＲである。 本発明で用いられるＩＴＲは、細胞のゲノム中への組み込みのために必要で十 分な配列のみを含むことができる（絶対ＩＴＲ（ｓｔｒｉｃｔ ＩＴＲ））。Ａ ＡＶに関しては、絶対ＩＴＲはゲノムのいずれかの側に位置する１４５ｂｐに対 応する（配列番号４）。しかし用いられるＩＴＲは、配列及び／又は欠失がカセ ットの組み込み能力を抑制しない限り、追加の配列、例えばＡＡＶゲノムの隣接 配列、及び／又は欠失を含むこともできる。かくしてそれらはもっと長いフラグ メント（例えば最高１０００ｂｐ）の形態で単離することができ、それらはカセ ットの組み込み能力を抑制しなければそのまま用いることができ、あるいはその 寸法を減じるためにあらかじめ消化することができる（例えば配列番号１〜３＋ ５を参照されたい）。 選ばれた配列が染色体中への組み込みを可能にできるか否かを決定するために 、例えばヒト細胞系（例えばＨｅｌａ又は２９３）を一方で調べられるべき配列 の間又は調べられるべき配列のそばにｎｅｏＲ型選択可能遺伝子を有するプラス ミドを用いて、他方で該配列を含まずに同じ選択可能遺伝子を有する標準プラス ミドを用いてトランスフェクションし、抗生物質Ｇ４１８を加えることによりク ローンを選択し、次いで両方の型のトランスフェクションの間で、得られるクロ ーンの数を比較することができる。該配列が有用であるためには、試験配列を用 いて得られる組み込み頻度が、単なる選択により得られる頻度より大きくなけれ ばならない。 配列の組み込み能力を調べる他の方法は、一方で調べられるべき配列の間にマ ーカー遺伝子（例えばβｇａｌ）を有するプラスミドを用いて、他方で該配列を 含まずに同じマーカー遺伝子を有する標準プラスミドを用いて同じ系をトランス フェクションし、継代の経過の間に２つのトランスフェクションの間で酵素活性 を比較することである；標準トランスフェクションにおいて活性が指数的に低下 し、他においてより安定に残ることが必要である。これに関し、βｇａｌを発現 する「組み込み」細胞を、固定の後にＸｇａｌ染色により突き止めることができ る。 いずれのＩＴＲ配列が用いられても、それがウィルスのコード配列を含まない のが特に有利である。実際にこれは、ウィルスメッセンジャーの全体又は一部、 あるいは毒性又は免疫原性であるかもしれないタンパク質をコードすることがで きるウィルス領域を細胞のゲノム中に導入す ることを避けることができるようにする。 従って本発明のベクターの製造のために、ウィルスのコード配列を含まない１ つ又はそれ以上のＩＴＲを用いるのが特に好ましい。 本発明のカセットの場合、異種ＤＮＡ配列及びＩＴＲは、感染細胞のゲノム中 へのカセットの組み込みを可能にするように配置されなければならない。それら は直接結合させることができ、あるいはカセットの組み込み性を変化させない配 列により隔てられることができる。特にこれは１つ又はそれ以上の制限部位、構 築の間に用いられるプラスミドから誘導される領域（例えばバクテリアプラスミ ド）又はいずれかの中性領域などであることができる。 上記の通り、本発明のアデノウィルスは感染細胞のゲノム中への異種ＤＮＡ配 列の組み込みを可能にするカセットを含む。異種ＤＮＡ配列は、細胞又は生物中 へのその転移が望まれているいずれの配列であることもできる。 別の場合、異種ＤＮＡ配列は治療的遺伝子を含む。本発明の目的の場合、治療 的遺伝子は特に、治療効果を有するタンパク質産物をコードするいずれの遺伝子 をも意味すると理解される。かくしてコードされるタンパク質産物はタンパク質 、ペプチドなどであることができる。このタンパク質産物は標的細胞に関して同 種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）であることができる（すなわち標的細胞が疾患を有 していない場合に、標的細胞において正常に発現される産物）。この場合、タン パク質の発現は、例えば細胞における不十分な発現、あるいは改変のために不活 性又は活性の弱いタンパク質の発現を補填する、あるいは別の場合該タンパク質 を過剰発現することを可能にする。治療的遺伝子は安定性が向上した、 又は活性が改変されたなどの細胞タンパク質の突然変異体をコードすることもで きる。タンパク質産物は標的細胞に関して異種であることもできる。この場合、 発現されるタンパク質は例えば細胞において不足している活性を補足する、又は 与え、細胞が疾患と戦うことができるようにする、あるいは免疫応答を刺激する ことができる。 本発明の目的のための治療的産物の中で、さらに特定的に酵素、血液誘導体、 ホルモン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（ ＦＲ ９３０３１２０）、成長因子（エリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−Ｃ ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）、神経伝達物質又はそれらの前駆体又は合成酵素、ト ロフィック因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂ ＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィンなど；アポリポタンパ ク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど（ＦＲ ９３ ０５１２５）、 ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＦＲ ９１１１９４７）、嚢胞性繊維 症に伴うタンパク質ＣＦＴＲ、腫瘍サプレッサー遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ １Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（ＦＲ ９３ ０４７４５）、凝固に含まれる因 子をコードする遺伝子：因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＤＮＡ修復に含まれる遺 伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）などを挙げるこ とができる。 治療的遺伝子は、標的細胞におけるその発現が遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡ の転写の調節を可能にする遺伝子又はアンセンス配列であることもできる。その ような配列は、例えば特許ＥＰ １４０ ３０８に記載されている方法に従い、 標的細胞において細胞ｍＲＭＡに相補的なＲＮＡに転写され、かくしてそれらの タンパク質への翻訳を阻止すること ができる。アンチセンスも標的ＲＮＡを選択的に破壊することができるリボザイ ムをコードする配列を含むことができる（ＥＰ ３２１ ２０１）。 治療的遺伝子は、人間又は動物において免疫応答を起こすことができる抗原性 ペプチドをコードする１つ又はそれ以上の配列を含むこともできる。本発明のこ の特定の実施態様の場合、組み換えアデノウィルスはワクチンの製造のために、 あるいは特に微生物、ウィルス又は癌に対して人間又は動物に適用される免疫療 法治療を行うために用いることができる。これは特に、エプスタイン・バールウ ィルス、ＨＩＶウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス（ＥＰ １８５ ５７３）、仮性狂 犬病ウィルスに特異的な、あるいは別の場合、腫瘍に特異的な（ＥＰ ２５９ ２１２）抗原性ペプチドであることができる。 さらに有利なことに、異種ＤＮＡ配列は治療的遺伝子に加えてマーカー遺伝子 、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子又はｎｅｏ遺伝子を含むことができる。カ セットが２つの遺伝子（特に治療的遺伝子及びマーカー遺伝子）を含む本発明の アデノウィルスは、それらの構築が非常に容易になるので、特に有用である。 異種ＤＮＡ遺伝子は細胞又は所望の臓器において治療的遺伝子の発現を可能に する配列も含むのが好ましい。これは、これらの配列が感染細胞において機能す ることができる場合に、考慮されている遺伝子の発現を自然に担っている配列で あることができる。これは起源の異なる配列であることもできる（他のタンパク 質の発現を担う、又は合成的なものでも）。特にこれは真核又はウィルス遺伝子 のプロモーター配列であることができる。例えばこれは感染することが望まれて いる細胞のゲノム から誘導されるプロモーター配列であることができる。同様に、ウィルスのゲノ ムから誘導されるプロモーター配列であることができる。これに関し、例えばＥ １Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＬＴＲ−ＲＳＶ遺伝子などのプロモーターを挙げること ができる。さらに、これらの発現配列を活性化配列、調節配列又は問題の遺伝子 に組織発現特異性を与える配列の付加により改変することができる。 さらに異種ＤＮＡ配列は合成される治療的産物を標的細胞の分泌経路において 方向付けるシグナル配列を含むこともできる。このシグナル配列は治療的産物の 自然のシグナル配列であることができるが、他の機能的シグナル配列又は人工の シグナル配列であることもできる。 本発明の欠失組み換えアデノウィルスは、標的細胞において自律的に複製され ることができないアデノウィルスである。従って一般に本発明の枠内で用いられ る欠失アデノウィルスのゲノムは、少なくとも感染細胞における該ウィルスの複 製に必要な配列を含まない。これらの領域は（完全に、又は部分的に）除去する か、又は非−機能性とされるか、又は他の配列により、特にカセットにより置換 されることができる。それにもかかわらず欠失ウィルスはそのゲノムの、ウィル ス粒子の莢膜化に必要な配列を保存しているのが好ましい。 構造及び性質が幾分異なる種々のアデノウィルス血清型が存在する。これらの 血清型の中で、本発明の枠内において２又は５型ヒトアデノウィルス（Ａｄ２又 はＡｄ５）、あるいは動物起源のアデノウィルス（出願ＷＯ９４／２６９１４を 参照されたい）の利用が好ましい。本発明の枠内で用いることができる動物起源 のアデノウィルスの中で、イヌ、ウシ、ネズミ（例：Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄ ｅ ｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリ又は別の場合サル（例：ＳＡＶ ）起源のアデノウィルスを挙げることができる。動物起源のアデノウィルスはイ ヌアデノウィルスが好ましく、ＣＡＶ２アデノウィルス［例えばＭａｎｈａｔｔ ａｎ又はＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］がより好ましい。 ヒト又はイヌ、あるいは混合起源のアデノウィルスが本発明の枠内で用いられ るのが好ましい。 本発明の欠失組み換えアデノウィルスは当該技術分野における熟練者に既知の いずれの方法を用いても製造することができる（Ｌａｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ． ，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５、ＥＰ １８５ ５７３：Ｇｒａｈａｍ ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特にそれらはアデノウィルス及び 、中でもカセットを有するプラスミドの間の相同的組み換えにより製造すること ができる。相同的組み換えは、該アデノウィルス及びプラスミドを適した細胞系 中にコトランスフェクションした後に起こる。用いられる細胞系は好ましくは（ ｉ）該要素により形質転換されることができ、（ｉｉ）欠失アデノウィルスゲノ ム部分を補足することができる配列を、好ましくは組み換えの危険を避けるため に組み込まれた形態で含まなければならない。細胞系の例として、特にＡｄ５ア デノウィルスのゲノムの左部分（１２％）をゲノム中に組み込んで含むヒト胚腎 臓系２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１ ９７７）５９）を挙げることができる。アデノウィルスから誘導されるベクター の構築のための戦術も出願番号ＷＯ９４／２６９１４及びＦＲ２，７０７，６６ ４に記載されており、それらは引用することにより本出願の内容となる。 次いで増殖したアデノウィルスを回収し、実施例に示される通り従来の分子生 物学法に従って精製する。 本発明に従って製造される組み換えアデノウィルスは、問題の遺伝子の試験管 内、生体外又は生体内における転移に用いることができる。試験管内において、 それらは細胞系に遺伝子を転移させ、例えば組み換えタンパク質を製造できるよ うにすることができる。生体外において、それらは生物から集められ、場合によ り選択され、増殖された細胞の集団全体に、生物にそれらを再投与するのに望ま しい性質をこれらの細胞に与える目的で、遺伝子を転移させるために用いること ができる。生体内においてそれらは、場合により１種又はそれ以上の製薬学的ビ ヒクルと組み合わされた精製溶液の直接投与により遺伝子を転移させるために用 いることができる。 これに関し、本発明は１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルス を含む製薬学的組成物にも関する。これらの製薬学的組成物は局所的、経口的、 非経口的、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内又は経皮的投与などのために調製 することができる。本発明の製薬学的組成物は注射用調剤の場合に製薬学的に許 容され得るビヒクルを含むのが好ましい。これは特に等張無菌溶液、あるいは場 合に依存して無菌水又は生理食塩水を加えると注射用溶液が調製され得る乾燥、 特に凍結−乾燥組成物であることができる。 注射に用いられる欠失組み換えアデノウィルスの投薬量は、種々のパラメータ ーに従って、特に用いられる投与様式、関連する病理学、発現されるべき遺伝子 、あるいは別の場合、所望の治療の持続時間に従って調節することができる。一 般に本発明の組み換えアデノウィルスは１０⁴ 〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの投薬量の形態 で調製され、投与される。ｐｆｕ（プラーク形成単位）という用語はウィルス溶 液の感染力に対応し、適した細胞培養に感染させ、一般に４８時間後に感染細胞 のプラークの数を測定することにより決定される。ウィルス溶液のｐｆｕ力価の 決定法は文献において十分に実証されている。 かくして本発明は細胞中への遺伝子の転移のための非常に有効な手段を提供す る。本発明のベクターは遺伝病（ミオパシー、嚢胞性繊維症、ＳＣＩＤなど）、 中枢神経系の病状（アルツハイマー、パーキンソンなど）、心臓血管疾患（血友 病、アテローム性動脈硬化症）、ＡＩＤＳ、癌などの多数の用途において用いる ことができる。 本発明のベクターは分裂中の細胞中への遺伝子の転移の場合に最も特別に有利 である。事実、アデノウィルスベクターの感染能力及びカセットの組み込み性の ために、本発明のベクターは分裂中の細胞に、世代を越えて安定な性質を与える ことを可能にする。これらの型の細胞の好ましい例は特に造血細胞（幹細胞、先 祖（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）など）、及び癌細胞である。最も特定的に、本発 明のベクターはＣＤ３４細胞中への遺伝子の転移に用いることができる。 これに関し、本発明は上記のアデノウィルスにより改変された哺乳類細胞にも 関する。さらに好ましくはこれはヒト細胞であり、さらにより好ましくは造血細 胞、特にＣＤ３４又は腫瘍細胞から選ばれる。 さらに本発明のベクターはヒト細胞及び動物細胞（ヒツジ、ウシ、家畜（イヌ 、ネコなど）、ウマ、サカナなど）の両方の改変に用いることができる。 かくして本発明は、遺伝子及び、感染細胞の全体又は一部のゲノム中へのその 組み込みを可能にする要素を含んだカセットを含む上記で定義されたベクターの 投与を含む、生体内における該遺伝子の投与のための特に有効な方法を提供する 。 その端で２つのＡＡＶ ＩＴＲに接する異種ＤＮＡ配列を含んだカセットを含 む本発明のアデノウィルスは、組み換えＡＡＶの製造に用いることもできる。実 際にはＡＡＶは、複製のためにヘルパーウィルスの存在を必要とする。これは特 にアデノウィルス、ヘルペスウィルス又はワクシニアウィルスであることができ る。そのようなヘルパーウィルスの不在下で、ＡＡＶは感染細胞のゲノムにおい て潜伏形態で留まるが、複製することはできない。この理由で、組み換えＡＡＶ は一般にヘルパーウィルス（特にアデノウィルス）に感染した細胞系中への、Ａ ＡＶカセット（その端でＩＴＲに接する遺伝子）を有するプラスミド及び莢膜化 遺伝子を有するプラスミド（ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド）のコトランスフェクシ ョンにより製造される。この方法は３つのパートナー：ヘルパーウィルス、ＡＡ Ｖプラスミド及びｒｅｐ／ｃａｐプラスミドを含む。本発明の故にこの方法は２ つのパートナーに簡略化されることができる。事実、本発明のアデノウィルスは ヘルパーウィルス及びＡＡＶプラスミドの両方の役割を果す。かくして本発明の 別の用途は組み換えＡＡＶの製造法にあり、その方法に従うと生産的細胞が上記 のアデノウィルスに感染させられ、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を有するプラスミド でトランスフェクションされる。この方法の変法に従うと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺 伝子も生産的細胞の共感染に用いられるウィルス（特にアデノウィルス）により 運ばれることができる。この変法は、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドのトラ ンスフェクションのための段階をｒｅｐ／ｃａｐウィルスによる感染で置換する ことを可能にし、その方がより有効なので、ずっと有利である。さらに好ましい 変法実施態様に従うと、本発明の方法はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をそのゲノム中 に組み込んで含む生産的系を必要とする。この変法の場合、本発明のウィルスに よる感染のための１段階で十分である。異種ＤＮＡ／ＡＡＶ ＩＴＲカセットに 加えてｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の発現のためのカセットを含む本発明のウィルス を用いることもできる。この実施態様に従うと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を強力 な、及び／又は誘導性のプロモーターの調節下に置くことができる。アデノウィ ルスはＥ４領域以外のウィルス遺伝子全体が欠失しており、それをＥ４領域以外 のゲノム全体を有する他のアデノウィルスと細胞２９３中に共感染させるのが有 利である。この実施態様は特に有利である。事実、用いられるＥ４ウィルスはす べての異種ＤＮＡに関して同じである。さらにウィルスの構築はＥ４、ＰＳＩ配 列及びアデノウィルスのＩＴＲを有するプラスミド（プラスミドｐＥ４ＩＴＲ、 ＦＲ ２，７０７，６６４を参照されたい）を含み、それは容易に取り扱うこと ができ、それにｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにＡＡＶ ＩＴＲによりフラン キングされた異種ＤＮＡが導入される。かくしてこの戦術は、細胞集団の一部し か含まず、従ってあまり高くないＡＡＶ力価を与えるｒｅｐ／ｃａｐプラスミド のトランスフェクションと対照的に、すべての細胞に２つのウィルスを伝播する ことを可能にする。 以下の実施例を用いて本発明をさらに十分に記載するが、実施例は例示であり 、制限ではないと考えられるべきである。図に対する説明 図１：本発明のカセットの略図 図２：ベクターｐＸＬ２３７３の図 図３：ベクターｐＸＬ２３７３の構築 図４：ベクターｐＸＬ２３８４の図 図５：ベクターＭ１３ ＩＴＲ ＦＬの構築 図６：ベクターｐＩＴＲＦＬの図 図７：ベクターｐＸＬ２３８８の図 図８：ベクターｐＸＬ２３８９の図 図９：ベクターｐａｐｏＡＩ ＩＴＲＡＡＶの図一般的分子生物学法 分子生物学において従来用いられてきた方法、例えばプラスミドＤＮＡの調製 的（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）抽出、塩化セシウム勾配中におけるプラスミドＤ ＮＡの遠心、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、［欠文］フェノール 又はフェノール−クロロホルム、食塩水媒体中におけるＤＮＡのエタノール又は イソプロパノール沈降、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ｉ）における形質転換などは当該技術分野における熟練者に周知であり、文献に 広く記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ ．（ｅｄｓ），“ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ ｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２−及びｐＵＣ−型プラスミド、ならびにＭ１３系列のファージは 市販のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ）。 連結のために、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気 泳動によりそれらの寸法に従って分離し、フェノール又はフェノール／クロロホ ルム混合物を用いて抽出し、エタノールを用いて沈降させ、次いで供給者の勧告 に従ってファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュ ベートすることができる。 突出５’末端の充填は、Ｅ．コリ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ） のクレノウフラグメントを用い、供給者の規格書に従って行うことができる。突 出３’末端の破壊はファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存 在下で、それを製造者の勧告に従って用いて行う。突出５’末端の破壊はＳ１ヌ クレアーゼを用いた調節された処理により行われる。 試験管内における合成オリゴデオキシヌクレオチドによる特定部位の突然変異 誘発はＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１ ３ （１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒｓ ｈａｍにより販売されているキットを用いて行うことができる。 いわゆるＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ３０ （１９８５）１３５０−１３５４：Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆａｌ ｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５ ０］によるＤＮＡフラグメントの酵素 増幅は、ＤＮＡ熱サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、製造者の規格に従って行うことができる。 ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］により 開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍにより販売されているキットを用いて 行うことができる。実施例 実施例１： ＡＡＶ２のＩＴＲの間に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有 するプラスミドの構築 この実施例は、マーカー遺伝子（βｇａｌ）にフランキングする２つのＩＴＲ 領域及びポリアデニル化部位を有し、組み換えによる組み換えアデノウィルスの 製造のための中間体として働く、ｐＸＬ２３７３と称されるベクターの構築を記 載する。 プラスミドｐＸＬ２３７３（図２）は特に −ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ（長末端反復） −核局在化のための配列を有するエシェリキア・コリｌａｃＺ遺伝子、及び −ＳＶ４０初期領域のポリアデニル化シグナル を含むフラグメントを含み、該フラグメントはＡＡＶ２からの２つの短縮（ｔｒ ｕｎｃａｔｅｄ）ＩＴＲ配列の間に挿入されている。用いられるＩＴＲの配列を 配列番号１及び２に示す。 ベクターｐＸＬ２３７３は相同的組み換えを可能にするアデノウィルス領域も 含む。 ベクターｐＸＬ２３７３は以下の方法で構築された（図３）：ラウス肉腫ウィ ルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ（長末端反復）、核局在化のための配列を有するエシェ リキア・コリｌａｃＺ遺伝子及びＳＶ４０初期領域のポリアデニル化シグナルを 有するＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＲｓＶ−βｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒ ｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９ ０（１９９２）６２６）からＸｂａＩ−ＫｐｎＩフラグメントの形態で単離した 。次いでこのフラグメントをプラスミドｐＡＩＣＭＶＩＸＣＡＴ．３（Ｐｈｉｌ ｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ，印刷中）の対応する部位において挿入した。この段階はこのフラグメ ントをＡＡＶ２の最初の６５０塩基対と最後の１９１塩基対（ｂｐ）の間に挿入 することを可能にする。得られるプラスミドをｐＸＬ２３５９と呼んだ（図３ａ ）。 ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、エシェリキア・コリｌａｃＺ遺伝子及 び核局在化のための配列、ならびにＳＶ４０初期領域のポリアデニル化シグナル 、ならびにＡＡＶの最後の１９１ｂｐを含むｐＸＬ２３５９のＸｂａＩ−ＢｇＩ ＩＩフラグメントをｐＢＳＫＳ＋の対応する部位に挿入し、プラスミドｐＸＬ２ ３６０を生成した。このサブクローニングは、この同じフラグメントをＸｂａＩ −ＳｍａＩフラグメントの形態で単離することを可能にする。次いでＰＸＬ２３ ６０のＸｂａＩ−ＳｍａＩフラグメントをｐＲＳＶ−βｇａｌの適合性ＸｂａＩ −ＥｃｏＲＶ部位において挿入し、ベクターｐＸＬ２３６４を得た（図３ａ）。 プラスミドｐｓｕｂ２０１はＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏ ｌ ６１（１９８７）３０９６）に記載されている。ＡＡＶか らの配列４４８４〜４６７５を有するこのプラスミドのＸｂａＩ−ｐｖｕＩＩフ ラグメントをｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶ部位 に挿入し、プラスミドｐＸＬ２３６２を生成した。最後に、ｐＸＬ２３６２のＳ ｐｅＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＸＬ２３６４の適合性ＸｂａＩ部位中に導入 した（図３ｂ）。 得られるプラスミドをｐＸＬ２３７３と称した（図２）。カセットの組み込み を可能にするこのベクターの能力を、Ｈｅｌａ及び２９３細胞系中へのトランス フェクションにより調べる。実施例２： ＡＡＶ２ ＩＴＲの間に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有 するプラスミドの構築 この実施例は、マーカー遺伝子（βｇａｌ）にフランキングする２つのＩＴＲ 領域及びポリアデニル化部位を有し、組み換えにより組み換えアデノウィルスを 製造するための中間体として働く、ｐＸＬ２３８４と称されるベクターの構築を 記載する。 プラスミドｐＸＬ２３８４（図４）は特に −ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ（長末端反復） −核局在化のための配列を有するエシェリキア・コリｌａｃＺ遺伝子、及び −ＳＶ４０初期領域のポリアデニル化ジクナル を含むフラグメントを含み、該フラグメントはＡＡＶ２からの２つのＩＴＲ配列 の間に挿入されている。用いられるＩＴＲの配列を配列番号２及び３に示す。 ベクターｐＸＬ２３８４は相同的組み換えを可能にするアデノウィルス領域も 含む。 ベクターｐＸＬ２３８４は以下のフラグメント： −組み換えのために役立つＡｄ５タンパク質ＩＸの一部を有するｐＲＳＶβｇ ａｌのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩフラグメント、及び −ＥｃｏＲＶ部位からのｌａｃＺ遺伝子の３’領域、ＳＶ４０初期領域のポリ アデニル化シグナル、ＡＡＶからのＩＴＲ領域及びＡＡＶ２からの左のＩＴＲの 上流に位置する４７ｂｐを有するｐＸＬ２３６０（実施例１）のＥｃｏＲＶ−Ｋ ｐｎＩフラグメント をｐＸＬ２３７３（実施例１）のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ部位に挿入することにより 得た。 このベクターの地図を図４に示す。カセットの組み込みを可能にするこのベク ターの能力をＨｅｌａ及び２９３細胞系中へのトランスフェクションにより調べ る。実施例３： ＡＡＶ２からの絶対ＩＴＲの間に挿入されたβ−ガラクトシダーゼを 有するプラスミドの構築 上記のプラスミドにおいて、用いられるＩＴＲ配列は左のＩＴＲの下流又は右 のＩＴＲの上流に４６ｂｐの伸長、及び／又は左のＩＴＲの５’における９ｂｐ の欠失を含む（配列番号１〜３を参照されたい）。この実施例はＡＡＶ２からの 絶対ＩＴＲの間に挿入された問題の遺伝子を含むプラスミドの構築を記載する。 さらに特定的には、この実施例はマーカー遺伝子（βｇａｌ）にフランキングす る２つの絶対ＩＴＲ領域及びポリアデニル化部位を有し、組み換えによる組み換 えアデノウィルスの製造のための中間体として働く、ｐＩＴＲＦＬと称されるベ クターの構築を記載する。 プラスミドｐＩＴＲＦＬ（図６）は特に： −ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ（長末端反復）、 −核局在化のための配列を有するエシェリキア・コリｌａｃＺ遺伝子、及び −ＳＶ４０初期領域のポリアデニル化シグナル を含んだフラグメントを含み、該フラグメントはＡＡＶ２からの２つの絶対ＩＴ Ｒ配列の間に挿入されている。用いられるＩＴＲ配列を配列番号４に示す。 ベクターｐＩＴＲＦＬは相同的組み換えを可能にするアデノウィルス領域も含 む。 ベクターｐＩＴＲＦＬは以下の方法で構築された：以下のオリゴデオキシヌク レオチドを用いて絶対ＩＴＲ配列を構築した： オリゴデオキシヌクレオチド配列４２５９及び配列４２６０をハイブリッド形 成させ、それらの末端において半−ＸｂａＩ部位及び半−ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ 図５）を生成する。次いでこれらのオリゴデオキシヌクレオチドをＭ１３ｍｐ１ ８の対応する部位の間に導入し、得られるバクテリオファージをＭ１３ＩＴＲ５ ’と呼ぶ（図５）。一方でオリゴデオキシヌクレオチド配列４５６０及び配列４ ５６１、ならびに他方で配列４２６３及び配列４２６４を対としてハイブリッド 形成させ、Ｍ１３ｍｐ１８のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位の間に導入し、 得られるバクテリオファージをＭ１３ＩＴＲ３’と呼ぶ。ＡＡＶ ＩＴＲの５’ 領域からＡｈａＩＩ部位まで（ＡＡＶ配列における領域１〜６３）を含むＭ１３ ＩＴＲ５’のＫｐｎＩ−ＡｈａＩＩフラグメント、ならびにＩＴＲの３’領域（ 領域６４〜１４５）を含むＡｈａＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＭ１３ｍｐ１ ８のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位中に導入し、ベクターＭ１３“ＩＴＲＦＬ”を得 る。ＡＡＶ ＩＴＲの配列全体（塩基１〜１４５）を含むＭ１３“ＩＴＲＦＬ” のＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩフラグメントをｐＸＬ２３８４のユニークＢｇＩＩＩ− ＳｐｅＩ部位の間に導入し、プラスミドｐＲＳＶβｇａｌ ＩＴＲｌｓｓプラス ミドを得る。最後にＡＡＶ ＩＴＲの配列全体（塩基１〜１４５）を含むＭ１３ “ＩＴＲＦＬ”のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩフラグメント及びＡｄ５タンパク質Ｉ Ｘを有するｐＸＬ２３８４のＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩフラグメントをｐＲＳＶβｇ ａｌＩＴＲｌｓｓの適合性ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ部位の間に導入し、ｐＩＴＲＦＬ を得る（図６）。実施例４： ＡＡＶ２からのＩＴＲの間に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子 及びｎｅｏＲ遺伝子を有するプラスミドの構築 この実施例は２つの遺伝子（βｇａｌ及びｎｅｏＲ）にフランキングする２つ のＩＴＲ領域、ならびにポリアデニル化部位を有し、組み換えによる組み換えア デノウィルスの製造のための中間体として働く、ｐＸＬ２３８８と称されるベク ターの構築を記載する。 プラスミドｐＸＬ２３８８（図７）は特に： −ＳＶ４０プロモーターの調節下でネオマイシンに対する耐性を与える遺伝子 （ｎｅｏＲ）、及びそれに続くＳＶ４０ ウィルスポリアデニル化シグナル、 −ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）からのＬＴＲ（長末端反復）、 −核局在化のための配列を有するエシェリキア・コリｌａｃＺ遺伝子、及び −ＳＶ４０初期領域のポリアデニル化シグナル を含んだフラグメントを含み、該フラグメントはＡＡＶ２からの２つのＩＴＲ配 列の間に挿入されている（配列番号２及び３に示されている配列）。 ベクターｐＸＬ２３８８は相同的組み換えを可能にするアデノウィルス領域も 含む。 ベクターｐＸＬ２３８８は以下の通りにして構築した：ＳＶ４０プロ モーターの調節下でネオマイシンに対する耐性を与える遺伝子（ｎｅｏＲ）、な らびにＳＶ４０ウィルスポリアデニル化シグナルを有するＤＮＡフラグメントを プラスミドｐＭＡＭｎｅｏｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＢａｍＨＩフラグメ ントの形態で単離した。次いでこのフラグメントをプラスミドｐＢＳ ＫＳ＋（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ部位中に導入し、このフラグメントのいず れかの側に新しい制限部位を導入した。かくして得られるプラスミドをｐＸＬ２ ３６３と呼ぶ。 ＳＶ４０プロモーターの調節下でネオマイシンに対する耐性を与える遺伝子（ ｎｅｏＲ）、ならびにＳＶ４０ウィルスポリアデニル化シグナルを有するＤＮＡ フラグメントを、次いでｐＸＬ２３６３からＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメント の形態で単離し、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ 部位中に導入し、プラスミドｐＸＬ２３７２を得た。 ＳＶ４０プロモーターの調節下でネオマイシンに対する耐性を与える遺伝子（ ｎｅｏＲ）、ならびにＳＶ４０ウィルスポリアデニル化シグナルを有するＤＮＡ フラグメントを、次いでｐＸＬ２３７２からＳｐｅＩフラグメントの形態で単離 し、ｐＸＬ２３８４（実施例２）のＳｐｅＩ部位中に導入し、プラスミドｐＸＬ ２３８８を得た（図７）。アデノウィルス配列の間に挿入されたＳＶ４０プロモ ーターの調節下におけるネオマイシンに対する耐性のための遺伝子及びＲＳＶプ ロモーターの調節下におけるｌａｃＺｎｌｓ遺伝子を有するが、ＡＡＶ ＩＴＲ 配列が欠けている標準プラスミドｐＸＬ２４２９も構築した。ＳＶ４０プロモー ターの調節下におけるネオマイシン耐性遺伝子の配列をＳｐｅＩ−消化プラスミ ドｐＸＬ２３８８から得、このフラグメントをｐＲＳＶＧＡＬＬ ＸのＳｐｅＩ部位中に挿入し、ｐＸＬ２４２９を得る。 カセットの組み込みを可能にするこのベクターの能力をＨｅｌａ及び２９３細 胞株へのトランスフェクションにより調べる。細胞２９３株（１００ｍｍの皿で 培養された２ １０６細胞）をリン酸カルシウム法に従ってプラスミドｐＸＬ２ ３８８及びｐＸＬ２４２９を用いてトランスフェクションする。トランスフェク ションの翌日、培地を変える。７２時間後、細胞を収穫し、非選択培地中におけ る１／１０及び１／５０の希釈の後に培養する。７２時間後、培地を変え、４０ ０マイクログラム／ｍ１でゲネチシンを含む選択培地を適用する。クローンがこ の培地における２週間の培養の後に現れ、クローンの出現の頻度がプラスミドｐ ＸＬ２４２９の場合よりプラスミドｐＸＬ２３８８の場合に１００倍高いことが 観察され、細胞ゲノム中に形質転換遺伝子を組み込むＩＴＲの能力を反映してい る。実施例５： ＡＡＶ２ ＩＴＲの間に挿入された融合遺伝子Ｓｈ ｂｌｅ：ｌａｃ Ｚを有するプラスミドの構築 この実施例は１つの融合遺伝子（Ｓｈ ｂｌｅ：ｌａｃＺ）にフランキングす る２つのＩＴＲ領域を有し、組み換えにより組み換えアデノウィルスを製造する ための中間体として働く、ｐＸＬ２３８９と称されるベクターの構築を記載する 。 プラスミドｐＸＬ２３８９（図８）は特に、ＳＶ４０プロモーターの調節下で 、フレオマイシンに対する（又はゼオマイシンに対する）耐性に関する遺伝子及 びｌａｃＺリポーター遺伝子の間の融合遺伝子、及びそれに続くＳＶ４０ウィル スポリアデニル化シグナルを有するフラグメントを含み、該フラグメントは２つ のＡＡＶ ＩＴＲの配列（配列番号 ２及び３に示される配列）の間に挿入されている。 ベクターｐＸＬ２３８９は相同的組み換えを可能にするアデノウィルス領域も 含む。優性マーカー（Ｓｈ ｂｌｅ）及びｌａｃＺリポーター遺伝子を有する融 合遺伝子は、３．５ｋｂ以下の寸法を有する迅速に同定可能な表現型（Ｘ−ｇａ ｌ上で青色）を伴う優性表現型を得ることを可能にする。この理由で、２つのＡ ＡＶ ＩＴＲの間に挿入される領域は４．３ｋｂ以下の寸法を有する。 ベクターｐＸＬ２３８９は以下の方法で構築された：ＳＶ４０プロモーター及 びＳｈ ｂｌｅ：：ｌａｃＺ融合遺伝子の初め（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）を有する プラスミドｐＵＴ５９３（Ｃａｙｌａ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ）のＳｐｅＩ−Ｎｄｅ Ｉフラグメントを単離し、次いでｐＸＬ２３８４（実施例２）のＳｐｅＩ−Ｎｄ ｅＩ部位に間に挿入した。かくして得られるプラスミドをｐＸＬ２３８９と称し た（図８）。カセットの組み込みを可能にするこのベクターの能力をＨｅｌａ及 び２９３細胞系中へのトランスフェクションにより調べる。実施例６： ＡＡＶ２ ＩＴＲの間に挿入されたアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子を 有するプラスミドの構築 アポリポタンパク質ＡＩは２４３アミノ酸から成るタンパク質であり、２６７ 残基のプレプロペプチドの形態で合成され、２８，０００ダルトンの分子質量を 有する。それは人間の場合、肝臓及び小腸で特異的に合成され、それはＨＤＬ粒 子の必須タンパク質を構成する（タンパク質としてのそれらの質量の７０％）。 それは血漿中に豊富である（１．０〜１．２ｇ／ｌ）。生物化学的に最も特性化 されたその活性はレシチン−コレステロールアシル−トランスフェラーゼ（ＬＣ ＡＴ）の活性化であ るが、特に細胞コレステロールの流出の刺激などの多数の他の活性がそれに帰せ られている。人間においてアポリポタンパク質ＡＩＩ及びＡＩの２つの血漿濃度 の比率（ＡＩＩ／ＡＩ）が冠動脈の危険（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｒｉｓｋ）と非常 に密接に関連しているので、アポリポタンパク質ＡＩの生理学的役割はアポリポ タンパク質ＡＩＩにより相殺されるように思われる。形質転換マウスにおけるこ のアポリポタンパク質の発現のみが標準マウスと比較して、大動脈における脂質 沈着物の表面積を４０倍減少させることを可能にするので、アポリポタンパク質 ＡＩは、おそらくコレステロールの逆輸送と連結してアテローム性動脈硬化症に 対する耐性において主要な役割を果す（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｓ ｃｉｅｎｃｅ，印刷中）。１８６３ｂｐの長さのその遺伝子がクローニングされ 、配列決定された（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（９）（１９８３）３９１７）。さらにａｐｏＡＩの種々の自然 の変異体が先行技術において記載されている。 相同的組み換えによりａｐｏＡＩ遺伝子を発現する組み換えアデノウィルスを 生成するために用いられるプラスミドは以下の通りに構築した： プラスミドｐａｐｏＡＩ ＩＴＲ ＡＡＶの構築（図９）： プラスミドｐａｐｏＡＩ ＩＴＲ ＡＡＶは特に、すべてＡＡＶ ＩＴＲの間 に挿入された、ＲＳＶプロモーターの調節下でプレプロａｐｏＡＩをコードする ｃＤＮＡ、ＳＶ４０ウィルスポリアデニル化シグナル、ならびに相同的組み換え を可能にするアデノウィルス領域を含む。それは以下の方法で構築された：特に 左のＩＴＲ及びアデノウィルス５莢膜化配列、ならびにＲＳＶウィルスＬＴＲを 有するＤＮＡフラグメントを プラスミドｐＸＬ２３８４（実施例２）のＸｍｎＩ−ＣｌａＩフラグメントの形 態で単離し、プレプロａｐｏＡＩをコードするｃＤＮＡ及びＳＶ４０ウィルスポ リアデニル化シグナルを有するＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＸＬ２２４４ （ＦＲ ０５１２５）からＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの形態で単離した 。次いでこれらの２つのフラグメントをプラスミドｐＸＬ２３８４のＸｍｎＩ− ＢａｍＨＩ部位中に挿入し、プラスミドｐａｐｏＡＩ ＩＴＲ ＡＡＶを生成し た。この最後の段階の間に、ｌａｃＺ領域、続いてＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを除去 した。 カセットの組み込みを可能にするこのベクターの能力をＨｅｌａ及び２９３細 胞系中へのトランスフェクションにより調べる。実施例７： プラスミドｐＸＬ２６２９の構築 この実施例はｌａｃＺマーカー遺伝子にフランキングする２つのＩＴＲ領域及 びポリアデニル化部位を有し、組み換えによる組み換えアデノウィルスの製造の ための中間体として働くベクターｐＸＬ２６２９の構築を記載する。このプラス ミドは左のＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５）によりプラスミドｐＸＬ２３８４ と異なる。プラスミドｐＸＬ２３５９（実施例１）をＨｉｎｆＩで消化し、その 末端をバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑化し、次い でＰｓｔＩで再消化した：ＡＡＶ ＩＴＲを有する約２００ｂｐのフラグメント （配列図）を単離し、プラスミドｐＢＳＫＳ＋中にＰｓｔＩ及びＳｍａＩ部位（ 平滑末端）において導入した。かくして構築されるプラスミドはｐＸＬ２５８０ である。プラスミドｐＸＬ２５８１は、ｐＸＬ２３８４のＢｇｌＩＩ−ＳｐｅＩ 部位において２つのオリゴヌクレオチド配列４６７４及び配列４６７５を挿入す ることによりｐＸＬ２３８４から誘導する；従っ てそのプラスミドはｐＸＬ２３８４の左のＡＡＶ ＩＴＲの代わりに、細胞２９ ３において２つの線状化プラスミドの連結混合物のトランスフェクションのため の方法により組み換えアデノウィルスＡｄＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶＢｇａｌを構築 するのに用いることができるユニークＢｓｔＢＩ部位を有する。 プラスミドｐＸＬ２６２９は以下の方法で構築した：プラスミドｐＸＬ２５８ ０をＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩで消化し、完全ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む約１７０ ｂｐのフラグメントを、ＢｇｌＩＩであらかじめ線状化されたプラスミドｐＸＬ ２５８１中に導入した。実施例８： アデノウィルスＡｄ ＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶβＧａｌの製造 この実施例は細胞のゲノム中への遺伝子の組み込みを可能にするカセットを含 む欠失組み換えアデノウィルスの構築を記載する。さらに特定的には、Ａｄ Ｉ ＴＲｓＡＡＶＲＳＶβＧａｌと称されるこのアデノウィルスはβｇａｌ遺伝子を 囲む２つのＡＡＶ ＩＴＲを含んだカセットを含む。このアデノウィルスは、ア デノウィルスＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によりコードされる機能をトランス 配列で（ｉｎ ｔｒａｎｓ）与えるヘルパー細胞（系２９３）中に、組み換えの ためのプラスミドｐＸＬ２３８４を欠失アデノウィルスベクターと共にコトラン スフェクションすることにより得た。 さらに正確には、アデノウィルスＡｄ ＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶβｇａｌは以下 の方法に従う、アデノウィルスＡｄＲＳＶβＧａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅ ｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）及びプラスミドｐＸＬ２３８４の間の 生体内における相同的組み換えにより製造した：酵素ＸｍｎＩを用いて線状化さ れたプラスミドｐＸＬ２３８４、及びＣｌａＩを用いて線状化されたアデノウィ ルスＡｄＲＳＶβＧａｌをリン酸カルシウムの存在下で系２９３においてコトラ ンスフェクションさせ、組み換えさせる。かくして生成される組み換えアデノウ ィルスをプラーク精製により選択する。単離の後、組み換えアデノウィルスを細 胞系２９３において増幅させ、約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する非精製組み 換え欠失アデノウィルスを含む培養上澄み液に導く。精製のために、ウィルス粒 子を既知の方法に従って塩化セシウム勾配上で遠心する（特にＧｒａｈａｍ ｅ ｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７３）４５６を参照されたい）。 アデノウィルスＡｄ ＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶβｇａｌは２０％グルセロール中 で−８０℃において保存する。実施例９： アデノウィルスＡｄ△ＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶβｇａｌの製造 この実施例は細胞のゲノム中への遺伝子の組み込みを可能にするカセットを含 む欠失組み換えアデノウィルスの構築を記載する。さらに特定的には、Ａｄ △ ＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶβＧａｌと称されるこのアデノウィルスはβｇａｌ遺伝子 を囲む２つの切断ＡＡＶ ＩＴＲを含んだカセットを含む。このアデノウィルス は、アデノウィルスＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によりコードされる機能をト ランス配列で与えるヘルパー細胞（系２９３）中に、組み換えのためのプラスミ ドｐＸＬ２３７３を欠失アデノウィルスベクターと共にコトランスフェクション することにより得た。 用いられる方法はアデノウィルスＡｄ ＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶβＧａｌの製造 のために実施例７に記載された方法と同じである。アデノウィルスＡｄ △ＩＴ ＲｓＡＡＶＲＳＶβＧａｌは２０％グリセロール中で−８０℃において保存され る。実施例１０： アデノウィルスＡｄ ＩＴＲＦＬの製造 この実施例は細胞のゲノム中への遺伝子の組み込みを可能にするカセットを含 む欠失組み換えアデノウィルスの構築を記載する。さらに特定的には、Ａｄ Ｉ ＴＲＦＬと称されるこのアデノウィルスはβｇａｌ遺伝子を囲むＡＡＶからの２ つの絶対ＩＴＲを含んだカセットを含む。このアデノウィルスは、アデノウィル スＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によりコードされる機能をトランス配列で与え るヘルパー細胞（系２９３）中に、組み換えのためのプラスミドｐＩＴＲＦＬを 欠失アデノウィルスベクターと共にコトランスフェクションすることにより得た 。 用いられる方法はアデノウィルスＡｄ ＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶβＧａｌの製造 のために実施例７に記載された方法と同じである。アデノウィルスＡＤ ＩＴＲ ＦＬは２０％グリセロール中で−８０℃において保存される。実施例１１： アデノウィルスＡｄ ａｐｏＡＩＩＴＲＡＡＶの製造 この実施例は細胞のゲノム中への遺伝子の組み込みを可能にするカセットを含 む欠失組み換えアデノウィルスの構築を記載する。さらに特定的には、ＡｄＡＩ ＩＴＲＡＡＶと称されるこのアデノウィルスはプレプロａｐｏＡＩ遺伝子を囲 む２つの切断ＡＡＶ ＩＴＲを含んだカセットを含む。このアデノウィルスは、 アデノウィルスＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によりコードされる機能をトラン ス配列で与えるヘルパー細胞 （系２９３）中に、組み換えのためのプラスミドｐａｐｏＡＩ ＩＴＲ ＡＡＶ を欠失アデノウィルスベクターと共にコトランスフェクションすることにより得 た。 用いられる方法はアデノウィルスＡｄ ＩＴＲｓＡＡＶＲＳＶβＧａｌの製造 のために実施例８に記載された方法と同じである。アデノウィルスＡＤ ａｐｏ ＡＩ ＩＴＲＡＡＶは２０％グリセロール中で−８０℃において保存される。実施例１２： アデノウィルスＡｄ２６２９の製造 この実施例はβｇａｌ遺伝子を囲む２つのＡＡＶ ＩＴＲを含んだカセットを 有する組み換えアデノウィルスＡｄ２６２９の構築を記載する。このアデノウィ ルスは、アデノウィルスＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によりコードされる機能 をトランス配列で与えるヘルパー細胞（系２９３）中に、プラスミドｐＸＬ２６ ２９を欠失アデノウィルスベクターと共にコトランスフェクションすることによ り得た。 さらに正確には、Ａｄ２６２９アデノウィルスは以下の方法に従うアデノウィ ルスｄ１３２４及びプラスミドｐＸＬ２６２９の間の生体内における相同的組み 換えにより製造した：ＸｍｎＩにより線状化されたプラスミドｐＸＬ２６２９及 びＣｌａＩにより線状化されたアデノウィルスｄ１３２４をリン酸カルシウムの 存在下で系２９３中にコトランスフェクションさせ、組み換えさせる。かくして 生成される組み換えアデノウィルスをプラーク精製により選択する。単離の後、 組み換えアデノウィルスを２９３細胞系において増幅し、約１０９〜１０１０ｐ ｆｕ／ｍｌの力価を有する非精製欠失望組み換えアデノウィルスを含む培養上澄 み液を得る。精製のために、ウィルス粒子を既知の方法に従って塩化セシウ ム勾配上で遠心する（特にＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５ ２（１９７３）４５６を参照されたい）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/43 ＡＡＭ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 38/46 ＡＡＢ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ 48/00 ＡＤＵ 9051−4Ｃ 37/24 ＡＢＤ Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ 37/465 ＡＡＭ 7/00 9051−4Ｃ 37/54 ＡＡＢ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ペリコーデ， ミシエル フランス・エフ−28320エクロスヌ・リユ ドシヤルトル31 (72)発明者 ビニユ， エマニユエル フランス・エフ−94200イブリ−シユール −セーヌ・リユジヤン−ル−ガルー60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．感染細胞のゲノム中に組み込まれることができるカセットを含む欠失組み 換えアデノウィルス。 ２．カセットが異種ＤＮＡ配列及びゲノム中へのその組み込みを可能にする要 素を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のアデノウィルス。 ３．カセットの組み込みを可能にする要素がウィルス起源のものであることを 特徴とする請求の範囲第２項に記載のアデノウィルス。 ４．カセットが少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復塩基配列（ＩＴＲ）及 び１つの異種ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求の範囲第３項に記載のアデ ノウィルス。 ５．ＡＡＶ ＩＴＲが異種ＤＮＡ配列の下流又は上流に置かれることを特徴と する請求の範囲第４項に記載のアデノウィルス。 ６．カセットがその端で２つのＡＡＶ ＩＴＲに接する少なくとも１つの異種 ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求の範囲第４項に記載のアデノウィルス。 ７．ＩＴＲが絶対ＩＴＲ又は、組み込み能力を抑制しない付加領域又は欠失を 有するＩＴＲであることを特徴とする請求の範囲第４〜６項の１つに記載のアデ ノウィルス。 ８．ＩＴＲがＡＡＶ−２ ＩＴＲであることを特徴とする請求の範囲第３〜７ 項の１つに記載のアデノウィルス。 ９．異種ＤＮＡ配列が治療的遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第１〜 ８項のいずれか１つに記載のアデノウィルス。 １０．治療的遺伝子が治療的効果を有するタンパク質産物をコードす る遺伝子、１種又はそれ以上の抗原性ペプチドをコードする遺伝子、あるいはア ンチセンス遺伝子又は配列であることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の アデノウィルス。 １１．治療的遺伝子が酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン：インター ロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、成長因子（エリスロポイエチン、Ｇ−Ｃ ＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）、神経伝達物質又はそれらの前駆体、あ るいは合成酵素、トロフィック因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、Ｇ ＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィンな ど；アポリポタンパク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど、ジストロ フィンもしくはミニジストロフィン、嚢胞性繊維症に伴うタンパク質ＣＦＴＲ、 腫瘍サプレッサー：Ｐ５３、Ｒｂ、ＲａｐｌＡ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ、凝固に含 まれる因子：因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＤＮＡ修復に含まれる遺伝子、自殺 遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）から選ばれるタンパク質産 物をコードすることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のアデノウィルス。 １２．異種ＤＮＡ配列がプロモーターの調節下における治療的遺伝子を含むこ とを特徴とする請求の範囲第９〜１１項に記載のアデノウィルス。 １３．プロモーターが構成的、調節的及び／又は組織−特異的プロモーターで あることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のアデノウィルス。 １４．プロモーターがウィルスのプロモーターであることを特徴とする請求の 範囲第１３項に記載のアデノウィルス。 １５．プロモーターがＥｌＡ、ＭＬＰ、ＣＭＶ及びＬＴＲ−ＲＳＶプロモータ ーから選ばれることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のアデノウィルス。 １６．異種ＤＮＡ配列が治療的遺伝子及びプロモーターの間に分泌配列も含む ことを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のアデノウィルス。 １７．異種ＤＮＡ配列が治療的遺伝子及びマーカー遺伝子、好ましくはβ−ガ ラクトシダーゼ遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第１〜１６項の１つに 記載のアデノウィルス。 １８．そのゲノムの、少なくとも標的細胞におけるその複製に必要な領域を含 まないことを特徴とする請求の範囲第１〜１７項の１つに記載のアデノウィルス 。 １９．Ａｄ５又はＡｄ２型ヒトアデノウィルス、あるいはＣＡＶ−２型イヌア デノウィルスであることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載のアデノウィル ス。 ２０．１種又はそれ以上の請求の範囲第１〜１９項の１つに記載の欠失組み換 えアデノウィルスを含む製薬学的組成物。 ２１．注射可能な形態であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の製 薬学的組成物。 ２２．１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの 欠失組み換えアデノウィルスを含むことを特徴とする請求の範囲第２０又は２１ 項に記載の製薬学的組成物。 ２３．請求の範囲第１〜１９項の１つに記載のアデノウィルスにより改変され ていることを特徴とする哺乳類細胞。 ２４．ヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の 細胞。 ２５．造血細胞、特にＣＤ３４又は腫瘍細胞であることを特徴とする請求の範 囲第２４項に記載の細胞。 ２６．組み換えＡＡＶの製造のための請求の範囲第６項に記載のアデノウィル スの利用。 ２７．生産的細胞を請求の範囲第６項に記載のアデノウィルスに感染させ、ｒ ｅｐ及びｃａｐ遺伝子を有するプラスミドを用いてトランスフェクションするこ とを特徴とする請求の範囲第２６項に記載の利用。 ２８．生産的細胞を請求の範囲第６項に記載のアデノウィルス、ならびにｒｅ ｐ及びｃａｐ遺伝子を有するアデノウィルスに共感染させることを特徴とする請 求の範囲第２６項に記載の利用。 ２９．生産的細胞がこれらのゲノム中に組み込まれたｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子 を含み、請求の範囲第６項に記載のアデノウィルスに感染させられることを特徴 とする請求の範囲第２６項に記載の利用。 ３０．生産的細胞が細胞２９３であることを特徴とする請求の範囲第２６〜２ ９項に記載の利用。 ３１．さらにｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子のための発現カセットを含むことを特徴 とする請求の範囲第６項に記載のアデノウィルス。 ３２．Ｅ４領域以外のウィルス遺伝子全体が欠けていることを特徴とする請求 の範囲第３１項に記載のアデノウィルス。