PL196675B1

PL196675B1 - Agonista ApoA-I, multimeryczni agoniści ApoA-I, kompleks agonista ApoA-I-lipid, kompozycje farmaceutyczne i zastosowania multimerycznych agonistów ApoA-I

Info

Publication number: PL196675B1
Application number: PL339629A
Authority: PL
Inventors: Jean-Louis Dasseux; Renate Sekul; Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Gunther Metz; Jean Dufourcq
Original assignee: Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Dasseux Jean Louis; Jean Dufourcq; Gunther Metz; Renate Sekul
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2008-01-31
Also published as: AU9779098A; AU746090B2; ES2300125T3; CN1247254C; NO20001599D0; AU2002300785B2; US6329341B1; US7307058B2; US6716816B1; JP2001518282A; EP1019073A4; ATE437648T1; US20040181034A1; AU2005201985A1; NO20001599L; HUP0002381A3; US6753313B1; US7312190B2; US6630450B1; CA2304805A1

Abstract

1. Agonista ApoA-I, znamienny tym, ze wykazuje przynajmniej oko lo 38% aktywno sci aktywacji LCAT w porównaniu z ludzk a ApoA-I i obejmuje: (i) 22 do 23 reszt peptydu lub jego analogu, który tworzy amfipatyczn a a-helis e w obecno sci lipidów i który obejmuje wzór strukturalny (I): Z 1 -X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -X 5 -X 6 -X 7 -X 8 -X 9 -X 10 -X 11 -X 12 -X 13 -X 14 -X 15 -X 16 -X 17 -X 18 -X 19 -X 20 -X 21 -X 22 -X 23 -Z 2 lub jego farmaceutycznie dopuszczaln a sól, w którym: X 1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) lub D-Pro (p); X 2 oznacza reszt e alifatyczn a; X 3 oznacza Leu (L) lub Phe (F); X 4 oznacza reszt e kwa sna; X 5 oznacza Leu (L) lub Phe (F); X 6 oznacza Leu (L) lub Phe (F); X 7 oznacza reszt e hydrofilow a; X 8 oznacza reszt e kwa sna lub zasadow a; X 9 oznacza Leu (L) lub Gly (G); X 10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G); X 11 oznacza reszt a hydrofilow a; X 12 oznacza reszt a hydrofiow a; X 13 oznacza Gly (G) lub reszt a alifatyczn a; X 14 oznacza Leu (L), Trp (W), Gly (G) lub Nal; X 15 oznacza reszt a hydrofilow a; X 16 oznacza reszt a hydrofobow a; X 17 oznacza reszt a hydrofobow a; X 18 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub reszt a zasadow a; X 19 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub reszt a zasadow a; X 20 oznacza reszt a zasadow a;…………………………………. PL PL PL PL PL PL

Description

Tło wynalazku

Cholesterol w krążeniu jest przenoszony przez lipoproteiny osocza - cząsteczki złożone z lipidu i białek, które transportują lipidy w krwi. Lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) i lipoproteiny o wysokiej gęstości są głównymi nośnikami cholesterolu. Uważa się, że LDL są odpowiedzialne za dostarczanie cholesterolu z wątroby (gdzie jest syntetyzowany lub uzyskiwany z diety) do tkanek pozawątrobowych w organizmie. Okreś lenie "odwrotny transport cholesterolu" opisuje transport cholesterolu z tkanek pozawątrobowych do wątroby, gdzie jest katabolizowany i eliminowany. Uważa się, że cząsteczki HDL osocza odgrywają główną rolę w procesie odwrotnego transportu, działając jako wymiatacze cholesterolu z tkanek.

Dowody łączące wysoki poziom cholesterolu w surowicy z chorobą wieńcową są przytłaczające. Na przykład miażdżyca naczyń jest powolnie postępującą chorobą charakteryzującą się nagromadzaniem cholesterolu w obrębie ściany tętnicy. Bardzo silne dowody wspierają koncepcję, że lipidy deponowane w uszkodzeniach miażdżycowych naczyń pochodzą przede wszystkim z LDL osocza, tak więc LDL są popularnie znane jako "zły" cholesterol. W przeciwieństwie, poziomy HDL w surowicy odwrotnie korelują z chorobą wieńcową - w istocie wysokie poziomy HDL w surowicy nie tylko chronią przed miażdżycą tętnic ale mogą w istocie powodować ustępowanie płytek miażdżycowych (np. zob. Badimon i wsp., 1992, Circulation 86 (suppl. III):86-94). Tak więc HDL są popularnie znane jako „dobry” cholesterol.

2.1. Transport cholesterolu

Układ transportu tłuszczów można podzielić na dwie ścieżki: ścieżkę egzogenną dla cholesterolu i trójglicerydów wchłoniętych w jelitach i ścieżkę endogenną dla cholesterolu i trójglicerydów wchodzących do strumienia krwi z wątroby i innych tkanek pozawątrobowych.

W ś cież ce egzogennej tł uszcze z poż ywienia są pakowane do czą stek lipoproteinowych nazywanych chylomikronami, które wchodzą do strumienia krwi i dostarczają swoje trójglicerydy do tkanki tłuszczowej (w celu zmagazynowania) i do mięśni (w celu utlenienia dla dostarczenia energii). Reszta chylomikronów, zawierających estry cholesterylowe, jest usuwana z obiegu przez specyficzny receptor spotykany tylko w komórkach wątroby. Ten cholesterol staje się wtedy dostępny ponownie dla metabolizmu komórkowego albo dla recyklizacji do tkanek pozawątrobowych jako lipoproteiny osocza.

W ś cież ce endogennej wą troba wydziela do strumienia krwi dużą czą steczkę lipoproteinową o bardzo niskiej gęstości (VLDL). Rdzeń cząstki VLDL składa się głównie z trójglicerydów zsyntezowanych w wątrobie, z mniejszą ilością estrów cholesterylu (albo zsyntezowanych w wątrobie albo zawróconych z chylomikronów). Dwa dominujące białka są eksponowane na powierzchni cząstek VLDL, a mianowicie apoproteina B-100 i apoproteina E. Gdy VLDL dochodzi do naczyń włosowatych tkanki tłuszczowej albo mięśniowej, to jego trójglicerydy są ekstrahowane dając w wyniku nowy rodzaj cząstki, o mniejszej wielkości i wzbogaconej w estry cholesterylu, lecz zatrzymującej swoje dwie apoproteiny, nazywane lipoproteiną o średniej gęstości (LDL).

U człowieka około połowa cząstek LDL jest usuwana z układu krążenia szybko (w ciągu dwóch do sześciu godzin od ich utworzenia), ponieważ wiążą się ściśle z komórkami wątroby, które ekstrahują ich cholesterol z utworzeniem nowego VLDL i kwasów żółciowych. Cząstki LDL, które nie są wchłonięte przez wątrobę, pozostają w układzie krążenia dłużej. Z czasem apoproteina E dysocjuje z krążących cząstek, przekształcając je w LDL, który zawiera apoproteinę B-100 jako jedyne białko.

Początkowo wątroba wchłania i rozkłada większość cholesterolu do kwasów żółciowych, które są produktami końcowymi metabolizmu cholesterolu. Wchłanianie cząstek zawierających cholesterol odbywa się za pośrednictwem receptorów LDL, które są obecne w wysokich stężeniach na hepatocytach. Receptor LDL wiąże zarówno apoproteinę E, jak i apoproteinę B-100, i jest odpowiedzialny za wiązanie i usuwanie zarówno cząstek LDL, jak i LDL, z układu krążenia. Jednak powinowactwo apoproteiny E do receptora LDL jest większe niż powinowactwo apoproteiny B-100. W wyniku tego cząstki

PL 196 675 B1

LDL mają o wiele dłuższy okres życia w krążeniu niż cząstki LDL, które krążą w ciągu średnio dwóch i pół dnia zanim zwiążą się z receptorami LDL w wą trobie i innych tkankach. Wysokie poziomy LDL w surowicy („zły" cholesterol) są dodatnio skorelowane z chorobą wieńcową serca. Na przykład przy miażdżycy naczyń cholesterol pochodzący z krążących LDL gromadzi się w ściankach naczyń, prowadząc do tworzenia się objętościowych płytek, które hamują przepływ krwi aż do ewentualnego utworzenia się skrzepu, czopując naczynie, co powoduje zawał serca lub udar.

Ostatecznie ilość wewnątrzkomórkowego cholesterolu uwolnionego z LDL reguluje metabolizm cholesterolu komórkowego. Nagromadzenie się cholesterolu komórkowego pochodzącego z VLDL i LDL reguluje trzy procesy. Po pierwsze, zmniejsza ono syntezę cholesterolu komórkowego przez wyłączenie syntezy reduktazy HMGCoA, kluczowego enzymu w szlaku biosyntezy cholesterolu. Po drugie, przychodzący cholesterol pochodzący z LDL promuje magazynowanie się cholesterolu przez zaktywowanie AGAT, enzymu komórkowego, który przekształca cholesterol w estry cholesterylu, które odkładają się w kropelkach magazynowych. Po trzecie, gromadzenie się cholesterolu wewnątrz komórek napędza mechanizm sprzężenia zwrotnego, który hamuje syntezę nowych receptorów LDL w komórkach. Zatem komórki regulują swoje dopełnienie receptorów LDL w taki sposób, że w celu spełnienia ich potrzeb metabolicznych doprowadzana jest do nich, bez przeciążenia, dostateczna ilość cholesterolu (w celu przeglądu patrz Brown & Goldstein, in: The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8^th Ed., Goodman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, rozdział 36, strony 874-896).

2.2. Odwrotny transport cholesterolu

Podsumowując, komórki obwodowe (niewątrobowe) otrzymują swój cholesterol z połączenia syntezy lokalnej i wchłaniania uprzednio utworzonego sterolu z VLDL i LDL. W przeciwieństwie do tego odwrotny transport cholesterolu jest szlakiem, za pomocą którego cholesterol komórek obwodowych może powrócić do wątroby w celu recyrkulacji do komórek pozawątrobowych albo wydzielania do jelit w żółci w zmodyfikowanej albo utlenionej postaci jako kwasy żółciowe. Ścieżka RCT stanowi jedyny środek do usuwania cholesterolu z większości tkanek pozawątrobowych i jest decydująca dla zachowania struktury i działania większości komórek w organizmie.

RCT składa się głównie z trzech etapów: (a) wypływ cholesterolu, wstępne usunięcie cholesterolu z różnych puli komórek obwodowych, (b) estryfikacja cholesterolu przez działanie acylotransferazy lecytynowo-cholesterolowej (LCAT), zapobiegając powrotowi wypłyniętego cholesterolu do komórek oraz (c) pobieranie/dostarczanie estru cholesterylu HDL do komórek wątroby. W szlaku RCT biorą udział HDL. HDL jest określeniem rodzajowym dla cząstek lipoproteinowych, które charakteryzują się swoją wysoką gęstością. Głównymi składnikami lipidowymi kompleksów HDL są różne fosfolipidy, cholesterol (ester) i trójglicerydy. Najważniejszymi składnikami apolipoproteinowymi są A-I i A-II, które określają funkcyjną charakterystykę HDL, przy czym zaobserwowano także mniejsze ilości apolipoproteiny C-I, CIII, C-III, D, E, J, itd. HDL może istnieć w wielu różnych wielkościach i różnych mieszaninach wyżej wspomnianych składników, w zależności od stanu przemodelowania w czasie kaskady metabolicznej RCT.

Kluczowym enzymem uczestniczącym w szlaku RCT jest LCAT. LCAT jest wytwarzany głównie w wątrobie i krąży w osoczu związany z frakcją HDL. LCAT przekształca cholesterol pochodzący z komórek w estry cholesterylu, które ulegają sekwestracji w HDL przeznaczonym do usunięcia. Biał ko przenoszące estry cholesterylu (CETP) i białko przenoszące fosfolipidy (PLTP) przyczyniają się do dalszego remodelowania krążącej populacji HDL. CETP może przenosić estry cholesterylu utworzone przez LACT do innych lipoprotein, a zwłaszcza lipoprotein zawierających ApoB, takich jak VLDL i LDL. PLTP dostarcza lecytynę do HDL.

Trójglicerydy HDL mogą być katabolizowane przez pozakomórkową wątrobową lipazę trójglicerydów, a cholesterol lipoproteinowy jest usuwany przez wątrobę poprzez różne mechanizmy.

Każda cząstka HDL zawiera co najmniej jedną kopię (a zwykle dwie do czterech kopii) ApoA-I. ApoA-I jest syntezowana przez wątrobę i jelito cienkie w postaci preproapolipoproteiny, która wydziela się w postaci probiałka, które szybko ulega rcięciu wytwarzając dojrzały polipeptyd zawierający 243 reszty aminokwasowe. ApoA-I składa się głównie z 6 do 8 różnych 22 powtórzeń aminokwasowych przerywanych przez ugrupowanie łącznikowe, które jest często proliną, a w niektórych przypadkach składa się z odcinka złożonego z kilku reszt. ApoA-I tworzy trzy rodzaje trwałych kompleksów z lipidami: małe, ubogie w lipidy kompleksy nazywane HDL pre-beta-1; spłaszczone dyskoidalne cząstki zawierające lipidy polarne (fosfolipid i cholesterol) nazywane HDL pre-beta-2 oraz sferyczne cząstki zawierające zarówno lipidy polarne, jak i lipidy niepolarne, nazywane sferycznymi albo dojrzałymi HDL (HDL3 i HDL2). Większość HDL w krążącej populacji zawiera zarówno ApoA-I, jak i ApoA-II (drugie

PL 196 675 B1 główne białko HDL) i są tu nazywane frakcją AI/AII HDL. Jednak frakcja HDL zawierająca tylko ApoA-I (nazywana tu frakcją AI-HDL) wydaje się być bardziej skuteczna w RCT. Niektóre badania epidemiologiczne popierają hipotezę, że frakcja AI-HDL jest przeciwmiażdżycowa (Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-707; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307).

Chociaż mechanizm przenoszenia cholesterolu z powierzchni komórek (na przykład wypływ cholesterolu) nie jest znany, to uważa się, że ubogi w cholesterol kompleks HDL pre-beta-1 jest preferowanym akceptorem cholesterolu przeniesionego z tkanki obwodowej uczestniczącej w RCT (patrz Davidson et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22975-22992; Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res. 33:16991709; Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1091-1097; oraz Kawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-5028; Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-9825). W czasie tego procesu rekrutacji cholesterolu z powierzchni komórek HDL pre-beta-1 przekształca się szybko w HDL pre-beta-2. PLTP może zwiększać szybkość tworzenia się dysków pre-beta-2, lecz brak jest danych wskazujących na rolę PLTP w RCT. LCAT reaguje preferencyjnie z dyskoidalnym i sferycznym HDL przenosząc 2-acylową grupę lecytyny albo innych fosfolipidów do wolnej hydroksylowej reszty cholesterolu wytwarzając estry cholesterylu (zatrzymywane w HDL) i lizolecytynę. Reakcja LCAT wymaga obecności ApoA-I jako aktywatora, co oznacza, że ApoA-I jest naturalnym kofaktorem dla LCAT. Przekształcenie cholesterolu w jego ester sekwestrowany w HDL zapobiega ponownemu wejściu cholesterolu do komórki, czego wynikiem jest przeznaczenie estrów cholesterylu do usunięcia. Estry cholesterylowe w dojrzał ych czą stkach HDL we frakcji AI-HDL (to jest zawierającej ApoA-I i ApoA-II) są usuwane przez wątrobę i przetwarzane w żółć bardziej skutecznie niż estry pochodzące z HDL zawierającego zarówno ApoA-I, jak i ApoA-II (frakcja AI/AII-HDL). Może być to spowodowane częściowo bardziej skutecznym wiązaniem AI-HDL z błoną hepatocytową. Postulowano istnienie receptora HDL, a ostatnio zidentyfikowano receptor wymiataczy SR-BI jako receptor HDL (Acton et al., 1996, Science 271:518-520; Xu et al., 1997, Lipid Res. 38:1289-1298). SR-BI ulega najbardziej ekspresji w tkankach steroidogennych (na przykład w nadnerczach) oraz w wątrobie (Landshulz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-995; Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:335645-33549).

Wydaje się, że CETP nie odgrywa znaczącej roli w RCT, a raczej bierze udział w metabolizmie lipidów pochodzących z VLDL i LDL. Jednak zmiany aktywności CEPT albo jego akceptorów, VLDL i LDL, odgrywają pewną rolę w „remodelowaniu” populacji HDL. Na przykł ad przy braku CEPT HDL stają się powiększonymi cząsteczkami, które nie są usuwane (w celu przeglądu odnośnie RCT i HDL patrz Fielding & Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-228; Barrans et al., 1996, Biochem. Biophys. Acta. 1300:73-85; Hirano et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17(6):1053-1059).

2.3. Obecnie stosowane terapie dyslipoproteinemii

Dostępna jest obecnie pewna ilość terapii do obniżenia cholesterolu i trójglicerydów w surowicy (zob. np. Brown i Goldstein, powyżej). Jednak każda z nich ma swoje własne niedogodności i ograniczenia pod względem skuteczności, efektów ubocznych i kwalifikowanej populacji pacjentów.

Żywice wiążące kwasy żółciowe są klasą leków, które przerywają recyrkulację kwasów żółciowych z jelita do wątroby, np. cholestyramina (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb) i chlorowodorek kolestypolu (Colestid®, The Upjohn Company). Gdy są pobierane doustnie, te dodatnio naładowane żywice wiążą ujemnie naładowane kwasy żółciowe w jelicie. Ponieważ żywice nie mogą być absorbowane z jelita, są one wydalane wraz z kwasami żółciowymi. Jednak w najlepszym przypadku stosowanie takich żywic obniża poziom cholesterolu w surowicy o około 20% i jest związany z efektami ubocznymi ze strony przewodu pokarmowego, w tym zatwardzeniem i niedoborem pewnych witamin. Co więcej, ponieważ żywice wiążą inne leki, inne doustne leki muszą być podawane przynajmniej jedną godzinę przed lub cztery do sześciu godzin po konsumpcji żywicy; w ten sposób komplikując schemat pobierania leków pacjenta z chorobą serca.

Statyny są czynnikami obniżającymi cholesterol, które blokują syntezę cholesterolu przez hamowanie reduktazy HMGCoA - kluczowego enzymu biorącego udział w szlaku biosyntezy cholesterolu. Statyny, np. lowastatyna (Mevacor®, Merck & Co., Inc.) i prawastatyna (Pravachol®, Bristol-Myers Squibb Co.) są czasami stosowane w kombinacji z żywicami wiążącymi kwasy żółciowe. Statyny znacząco obniżają poziomy cholesterolu i LDL w surowicy i zwalniają postęp miażdżycy tętnic wieńcowych. Jednak poziomy cholesterolu HDL w surowicy zwiększają się tylko umiarkowanie. Mechanizm efektu obniżenia LDL może obejmować zarówno obniżenie stężenia VLDL i indukcję komórkowej ekspresji receptora LDL, prowadząc do obniżonej produkcji i/lub zwiększonego katabolizmu LDL. Efekty uboczne, obejmujące zaburzenia wątroby i nerek są związane ze stosowaniem tych leków (Physicians Desk Reference, Medical Economics Co., Inc. Montvals, N.J., 1997). Niedawno, FDA dopuściła

PL 196 675 B1 atorwastatynę (inhibitor reduktazy HMGCoA opracowany przez Parke-Davis) (Warner Lambert) na rynek do leczenia rzadkich ale nagłych przypadków rodzinnej hipercholesterolemii (1995, Scrip 20(19):10).

Niacyna lub kwas nikotynowy jest rozpuszczalnym w wodzie kompleksem witaminy B stosowanym jako suplement diety i czynnik przeciwhiperlipidemiczny. Niacyna zmniejsza produkcję VLDL i jest skuteczna w obniżaniu LDL. W niektórych przypadkach jest stosowana w połączeniu z żywicą wiążącą kwasy żółciowe. Niacyna może zwiększać HDL gdy jest stosowana w odpowiednich dawkach, jednak jej pożyteczność jest ograniczona przez poważne efekty uboczne gdy jest stosowana w tak wysokich dawkach.

Fibraty są klasą obniżających lipidy leków stosowanych do leczenia różnych postaci hiperlipidemii (tzn. podwyższonych trójglicerydów w surowicy), które mogą być też związane z hipercholesterolemią. Fibraty wydają się obniżać frakcję VLDL i nieznacznie zwiększać HDL - jednak efekty tych leków na cholesterol surowicy są zmienne. W Stanach Zjednoczonych fibraty dopuszczono do stosowania jako leki przeciwlipidemiczne, ale nie zostały zaaprobowane jako czynniki na hipercholesterolemię. Na przykład klofibrat (Atromid-S^®, Wyeth-Ayerst Laboratories) jest czynnikiem przeciwlipidemicznym, który działa (poprzez nieznany mechanizm) na obniżenie trójglicerydów w surowicy poprzez obniżenie frakcji VLDL. Choć cholesterol surowicy może być obniżony w niektórych subpopulacjach pacjentów, odpowiedź biochemiczna na lek jest zmienna i nie zawsze jest możliwe przewidzieć, u których pacjentów uzyska się korzystne wyniki. Nie wykazano by Atromid-S^® był skuteczny w zapobieganiu chorobie wieńcowej serca. Chemicznie i farmakologicznie spokrewniony lek gemfibrozyl (Lopid®, Parks-Davis) jest czynnikiem regulującym lipidy, który umiarkowanie obniża trójglicerydy i cholesterol VLDL surowicy i umiarkowanie zwiększa cholesterol HDL subfrakcje HDL2 i HDL3 jak i zarówno ApoA-I i A-II (tzn. frakcję AI/AII-HDL). Jednak odpowiedź lipidowa jest heterogenna, w szczególności między róż nymi populacjami pacjentów. Co więcej, podczas gdy zapobieganie chorobie wieńcowej serca zaobserwowano wśród pacjentów płci męskiej między 40-55 bez historii lub objawów istniejącej choroby wieńcowej serca, nie jest jasne w jakim stopniu te wyniki można ekstrapolować do innych populacji pacjentów (np. kobiet, starszych i młodszych mężczyzn). W istocie nie zaobserwowano żadnej skuteczności u pacjentów z ustaloną chorobą wieńcową. Ze stosowaniem fibratów są związane poważne efekty uboczne w tym toksyczność, taka jak złośliwe nowotwory (przede wszystkim nowotwory przewodu pokarmowego), choroby pęcherzyka żółciowego i zwiększona śmiertelność z przyczyn innych niż wieńcowe. Te leki nie są wskazane do leczenia pacjentów z wysokim LDL lub niskim HDL jako ich jedynym zaburzeniem lipidów (Physician's Desk Reference, 1997, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J.).

Doustna estrogenowa terapia zastępcza może być rozważana dla umiarkowanej hipercholesterolemii u kobiet po menopauzie. Jednak zwiększeniu HDL może towarzyszyć zwiększenie trójglicerydów. Terapia estrogenowa jest oczywiście ograniczona do specyficznej populacji pacjentów (kobiet po menopauzie) i jest związana z poważnymi efektami ubocznymi w tym indukcją złośliwych nowotworów, choroby pęcherzyka żółciowego, choroby zakrzepowej, gruczolaka wątroby, podwyższonego ciśnienia krwi, nietolerancji glukozy i hiperkalcemii.

Tak więc istnieje potrzeba opracowania bardziej bezpiecznych leków, które są skuteczne w obniżaniu cholesterolu surowicy, zwiększaniu poziomów HDL, zapobieganiu chorobie wieńcowej i/lub leczeniu istniejącej choroby, szczególnie miażdżycy naczyń.

2.4. ApoA-I jako czynnik docelowy

Żaden z aktualnie dostępnych leków do obniżania poziomu cholesterolu nie podwyższa bezpiecznie poziomu HDL i nie stymuluje RCT, a raczej wydaje się, że większość z nich działa na ścieżce transportu cholesterolu, modulując pobieranie z pokarmem, recyrkulację, syntezę cholesterolu i populację VLDL.

O ile jest pożądane znalezienie leków, które stymulują wypływ i usuwanie cholesterolu, to istnieje kilka potencjalnych celów w RTC, na przykład LCAT, HDL i ich różne składniki (ApoA-I, Apo-II i fosfolipidy), PLTP i CETP, i nie wiadomo, który ś rodek docelowy był by najskuteczniejszy dla uzyskania pożądanych profili lipoproteinowych i skutków ochronnych. Zaburzenia każdego pojedynczego składnika na ścieżce RCT ostatecznie mają wpływ na skład krążących populacji lipoprotein i na skuteczność RCT.

Kilka linii dowodowych opartych na danych uzyskanych in vivo sugeruje udział HDL i jego głównego składnika białkowego, ApoA-I, przy zapobieganiu zmianom miażdżycowym i potencjalnie regresji płytek, co czyni je atrakcyjnymi czynnikami docelowymi w interwencjach terapeutycznych. Po pierwsze, istnieje odwrotna korelacja pomiędzy stężeniem Apo-I (HDL) w surowicy i powstawaniem

PL 196 675 B1 miażdżycy u ludzi (Gordon & Rifkind, 1989, N. Engl. J. Med. 321:1311-1316; Gordon et al., 1989, Circulation 79:8-15). W rzeczywistości specyficzne subpopulacje HDL zostały powiązane ze zmniejszonym ryzykiem powstawania miażdżycy u ludzi (Miller, 1987, Amer. Heart 113:589-597); Cheung et al., 1991, Lipid Res. 32:383-394); Fruchart & Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38:79).

Po drugie, badania nad zwierzętami podtrzymują tezę o ochronnej roli Apo A-I (HDL). Leczenie królików karmionych cholesterolem za pomocą ApoA-I albo HDL zmniejszało rozwój i postęp płytek (pasma tłuszczowe) u królików karmionych cholesterolem (Koizumi et al., 1988, J. Lipid Res. 29:1405-1414); Badimon et al., 1989, Lab. Inbvest. 60:455-461; Badomin et al., 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-1241). Jednak skuteczność zmieniała się w zależności od źródła HDL (Beitz et al., Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47:149-152; Mezdour et al., 1995, Atherosclerosis 113:237-246).

Po trzecie, bezpośredni dowód na rolę ApoA-I uzyskano z doświadczeń ze zwierzętami transgenicznymi. Ekspresja ludzkiego genu dla ApoA-I przeniesionego do myszy genetycznie przygotowanej do miażdżycy indukowanej dietą chroniła przed rozwojem aortalnych zmian chorobowych (Rubin et al., 1991, Nature 353:265-267). Wykazano również, że transgen ApoA-I tłumi miażdżycę u myszy bez ApoE i u trangenicznych myszy z Apo(a) (Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest. 94:899-903; Plump et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611; Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35:2263-2266). Podobne wyniki obserwowano u transgenicznych królików z ekspresją ludzkiej Apo-I (Duverger, 1996, Circulation 94:713-717; Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:1424-1429) oraz u trangenicznych szczurów, u których podwyż szone poziomy ludzkiego ApoA-I chronił y przed miażdżycą i hamowały restenozę po angioplatyce balonowej (Burkey et al., 1992, Circulation, Supplement I, 86:1-472, Abstract No. 1876; Burkey et al., 1995, J. Lipid Res. 36:1463-1473).

AI-HDL wydaje się być bardziej skuteczny przy RCT niż frakcja AI/AII-HDL. Badania ludzkiej ApoA-I albo Apo-I i ApoA-II (AI/AII) u myszy transgenicznych wykazały, że białkowy skład HDL ma znaczny wpływ na ich rolę, a mianowicie AI-HDL jest bardziej przeciwmiażdżycowy niż AI/AII-HDL (Schultz et al., 1993, Nature 365:762-764). Równoległe badania obejmujące transgeniczne myszy dające ekspresję ludzkiego genu LACT wykazały, że umiarkowane wzrosty aktywności LCAT zmieniały znacznie poziomy cholesterolu lipoproteid, oraz że LCAT ma znaczną preferencję w stosunku do HDL zawierającego ApoA-I (Francone et al., 1995, J. Clinic Invest. 96:1440-1448; Berard et al., 1997, Nature Medicine 3 (7):744-749). O ile te dane popierają tezę o znaczącej roli ApoA-I przy aktywowaniu LCAT i stymulowaniu RCT, to dodatkowe badania wykazały scenariusz bardziej złożony: głównym składnikiem HDL, który moduluje wypływanie cholesterolu z komórek są fosfolipidy (Fournier et al., 1996, J. Lipid Res. 37:1704-1711).

Ze względu na potencjalną rolę HDL, to jest zarówno ApoA-I, jak i związanego z nią fosfolipidu, w ochronie przed chorobą miażd ż ycową rozpoczę to próby kliniczne na ludziach, z zastosowaniem rekombinacyjnie wytwarzanej ApoA-I, zaniechano, kontynuowane i ponownie rozpoczęto przez UCB Belgium (Pharmaprojects, 27 październik 1995; IMS R&D Focus, 30 czerwiec 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2(6): 261-265; patrz także M. Eriksson at Congress, „The Role of HDL in Disease Prevention”, 7-9 listopad 1996, Fort Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lip. Res. 38:1267-1273; oraz WO 94/13819) oraz były rozpoczęte i kontynuowane przez Bio-Tech (Pharmaprojects, 7 kwiecień 1989). Usiłowano prowadzić próby stosując ApoA-I do leczenia wstrząsu septycznego (Opal, „Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis", IBC's 7th International Conference on Sepsis, 28-30 kwiecień 1997, Waszyngton, D.C.; Gouni et al., 1993, J. Lipid Res. 94:139-146; Levine, WO 96/04916). Istnieje jednak wiele pułapek związanych z wytwarzaniem i zastosowaniem ApoA-I, co czyni go mniej niż idealnym jako lek. Na przykład ApoA-I jest dużym białkiem, które jest trudne i kosztowne w produkcji, w związku z tym trzeba rozwiązać znaczne problemy związane z wytwarzaniem i odtwarzalnoś cią pod względem trwałości w czasie przechowywania, dostarczania czynnego produktu i okresu pół trwania in vivo.

Z punktu widzenia tych niedogodności poczyniono wysiłki w kierunku otrzymania peptydów, które przypominają ApoA-I. Ponieważ kluczowe aktywności ApoA-I przypisano obecności wielokrotnych powtórzeń unikalnej drugorzędowej cechy strukturalnej w białku, amfipatycznej helisy α klasy A (Segrest, 1974, FEBS Lett. 38:247-253), to większość wysiłków w kierunku otrzymania peptydów, które przypominały swoją aktywnością aktywność ApoA-I, skupiały się na zaprojektowaniu peptydów, które tworzą amfipatyczne helisy α typu klasy A.

Amfipatyczne helisy α typu klasy A są unikalne, ponieważ dodatnio naładowane reszty aminokwasowe skupiają się na interfejsie hydrofobowo-hydrofilowym, natomiast ujemnie naładowane reszty aminokwasowe skupiają się w środku powierzchni hydrofitowej. Co więcej, α-helikalne peptydy klasy A

PL 196 675 B1 mają kąt hydrofobowy mniejszy niż 180° (Segrest et al., 1990, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 8:103-117). Początkowe nowe strategie w kierunku zaprojektowania naśladowców ApoA-I nie były oparte na pierwotnych sekwencjach naturalnie występujących apolipoprotein, lecz raczej na wprowadzaniu tych unikalnych cech helis klasy A do sekwencji analogów peptydowych, jak również niektórych właściwościach domen ApoA-I (patrz na przykład Davidson et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13605-13610; Rogers et al., 1997, Biochemistry 36:288-300; Lins et al., 1993, Biochem. Biophys. Acta Biomembranes 1151:137-142; Ji and Jonas, 1995, J. Biol. Chem. 270:11290-11297; Collet et al., 1997, Journal of Lipid Research, 38:634-644; Sparrow and Gotto, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 348:187-211; Sparrow and Gotto, 1982, CRT Crit. Rev. Biochem. 13:87-107; Sorci-Thomas et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:21403-21409; Wang et al., 1996, Biochim. Biophys. Acta 174184; Minnich et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:16553-16560; Holvoet et al., 1995, Biochemistry 34:13334-13342; Sorci-Thomas et al., 1997, J. Biol. Chern. 272 (11) : 7278-7284; oraz Frank et al., 1997, Biochemistry 36:17988-1806).

W jednym z badań Fukushima et al., syntezowali peptyd z 22 resztami, zł o ż ony cał kowicie z reszt Glu, Lys i Leu rozmieszczonych okresowo w taki sposób, ż e tworzył y helisę α z równymi czołowymi powierzchniami hydrofilowymi i hydrofobowymi („ELK peptide”)(Fukushima et al., 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101 (13) :3703-3704; Fukushima et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:10651-10657). Peptyd ELK podziela 41% homologii sekwencji z fragmentem 198-219 ApoA-I. Jak zbadano drogą ultrafiltracji ilościowej, chromatografii żelowo-permeacyjnej i dichroizmu kołowego, wykazano, że ten peptyd ELK wiąże się skutecznie z fosfolipidami i ma niektóre fizyczne i chemiczne właściwości ApoA-I (Kaiser et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1137-1140; kaiser et al., 1984, Science 223:249-255; Fukushima et al., 1980, jak wyżej; Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092). Yokoyama et al., wywnioskowali z tych badań, że decydującym czynnikiem aktywacji LCAT jest po prostu obecność dość dużej struktury amfipatycznej (Yokoyama et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(15):7333-7339). Ustalono później, że dimer tego peptydu o 22 resztach o wiele dokładniej naśladuje ApoA-I niż jego monomer. W oparciu o te wyniki sugeruje się, że 44-mer, który jest przerwany w ś rodku przez przerywnik w postaci helisy (albo Gly albo Pro), stanowił minimalną funkcyjną domenę w ApoA-I (Nakagawa et al., 1985, jak wyż ej).

Inne badania były związane z modelowymi amfipatycznymi peptydami, nazywanymi „peptydami LAP” (Pownall et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(6):3154-3158; Sparrow et al., 1981, w: Peptides: Synthesis-Structure-Function, Roch and Gross, Eds., Pierce Chem. Co., Rockford, IL 253-256). W oparciu o badania nad wiązaniem lipidów z fragmentami naturalnych apolipo-protein zbudowano kilka peptydów LAP, a mianowicie LAP-16, LAP-20 i LAP-24 (zawierające odpowiednio 16, 20 i 24 reszty aminokwasowe). Te modelowe peptydy amfipatyczne nie podzielały żadnej homologii sekwencji z apolipoproteinami i miały na celu uzyskanie hydrofilowych powierzchni czołowych zorganizowanych w sposób niepodobny do amfipatycznych helikalnych domen typu klasy A, związanych z apolipoproteinami (Segrest et al., 1992, J. Lipid Res. 33:141-166). Na podstawie tych badań autorzy wywnioskowali, że dla nadania modelowym amfipatycznym peptydom właściwości wiązania lipidów konieczna jest minimalna długość 20 reszt.

Badania nad mutantami LAP20 zawierającymi w różnych położeniach w sekwencji resztę prolinową wskazywały, że istnieje bezpośredni związek pomiędzy wiązaniem lipidu i aktywacją LCAT, lecz sam helikalny potencjał lipidu nie prowadzi do aktywacji LCAT (Ponsin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(20):9202-9205). Co więcej, obecność tego przerywnika helisy (Pro) blisko środka peptydu zmniejszała jego powinowactwo do powierzchni fosfolipidowych, jak również jego zdolność do aktywowania LCAT. O ile wykazano, że niektóre peptydy LAP wiążą fosfolipidy (Sparrow et al., jak wyżej), to istnieje kontrowersja co do stopnia, w jakim peptydy LAP są helikalne w obecności lipidów (Buchko et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(6): 3039-3045; Zhong et al., 1994, Peptide Research 7 (2) :99-106).

Segrest et al. zsyntezowali peptydy złożone z 18 do 24 reszt aminokwasowych, które nie podzielały żadnej homologii sekwencji z helisami ApoA-I (Kannelis et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(3) =11464-11472; Segrest et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2290-2295). Sekwencje zaprojektowano specyficznie w celu naśladowania amfipatycznych helikalnych domen wymiennych apolipoprotein klasy A w kategoriach momentu hydrofobowego (Eisenberg et al., 1982, Nature 299:371-374) i rozkładu ładunku (Segrest et al., 1990, Proteins 8:103-117; amerykański opis patentowy nr US 4643988). Jeden z peptydów zawierających 18 reszt, peptyd „18A”, zaprojektowano jako modelową helisę α klasy A (Segrest et al., 1990, jak wyżej). Badania nad tymi peptydami i innymi peptydami, które mają odwrócony rozkład ładunków, takimi jak peptyd „18R”, wykazały zgodnie, że rozkład ładunku jest dla aktywności

PL 196 675 B1 decydujący. Peptydy z odwróconym rozkładem ładunków wykazują zmniejszone powinowactwo do lipidów względem mimetyków peptydów 18A klasy A i niższej zawartości helis w obecności lipidów (Kanellis et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:11464-11472; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10255; Chung et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10256-10162; Epand et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:9389-9396; Anantharamaiah et al., 1991, Adv. Exp. Med. Biol. 285:131-140).

Inne syntetyczne peptydy nie podzielające żadnej homologii sekwencji z apolipoproteinami, które zaproponowano z ograniczonym powodzeniem, obejmowały dimery i trimery peptydu 18A (Anantharamaiah et al., 1986, Proteins of Biological Fluids 34:63-66), peptydy GALA i EALA (Subbarao et al., 1988, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 3:187-198) oraz peptydy ID (Labeur et al., 1987, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17:580-588) i peptyd 18AM4 (Brasseur et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7).

Zaprojektowano także peptyd „najwyższej zgodności” (konsensusowy), zawierający 22 reszty aminokwasowe, oparty na sekwencjach helis ludzkiej ApoA-I (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10 (1) :95-105; Venkatachalapathi et al., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B:585-596). Sekwencję skonstruowano drogą identyfikowania przeważającej reszty w każdym położeniu hipotetycznych helis ludzkiego ApoA-I. Podobnie jak peptydy opisane wyżej, helisa utworzona przez ten peptyd ma dodatnio naładowane reszty aminokwasowe skupione na interfejsie hydrofilowo-hydrofobowym, ujemnie naładowane reszty aminokwasowe skupione w środku hydrofilowej powierzchni oraz kąt hydrofobowy mniejszy niż 180°. O ile dimer tego peptydu jest do pewnego stopnia skuteczny przy aktywowaniu LCAT, to monomer przejawiał słabe właściwości wiązania lipidów (Venkatachalapathi et al., 1991, jak wyżej).

W oparciu przede wszystkim o badania in vitro nad opisanymi wyż ej peptydami ujawnił się zbiór „reguł” co do projektowania peptydów, które naśladują działanie ApoA-I. Sądzi się poważnie, że amfipatyczna helisa α, która ma dodatnio naładowane reszty skupione na interfejsie hydrofilowohydrofobowym i ujemnie naładowane reszty aminokwasowe skupione w środku powierzchni hydrofilowej, jest konieczna dla powinowactwa do lipidów i aktywacji LCAT (Venkatachalapathi et al., 1991, jak wyżej). Anantharamaiah et al. wskazali także, że ujemnie naładowana reszta Glu w położeniu 13 22-merowego peptydu najwyższej zgodności, który jest usytuowany wewnątrz powierzchni hydrofobowej helisy α, odgrywa ważną rolę przy aktywacji LCAT (Anantharamaiah et al., 1991, jak wyżej). Co więcej, Brasseur wykazał, że kąt hydrofobowy (kąt pho) mniejszy niż 180° jest konieczny dla optymalnej trwałości kompleksu lipid-apolipoproteina i jest on także odpowiedzialny za tworzenie się cząstek dyskoidalnych, które mają peptydy dookoła brzegu podwójnej warstwy lipidowej (Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66(24):16120-16127). Rosseneu et al., utrzymują także, że do aktywacji LCAT jest konieczny kąt hydrofobowy mniejszy niż 180° (WO 93/25581).

Jednak pomimo tych reguł nikt do tej pory nie zaprojektował, ani nie wytworzył polipeptydu tak aktywnego jak ApoA-I, a najlepszy z nich miał mniej niż 40% aktywności ApoA-I, zmierzonej w opisanym tu oznaczeniu aktywacji LCAT. Żaden z opisanych w literaturze peptydów „mimetyków" nie okazał się użyteczny jako lek.

Z uwagi na powyż sze istnieje potrzeba opracowania trwał ego agonisty ApoA-I, który naś laduje aktywność ApoA-I i który jest stosunkowo prosty i niekosztowny przy wytwarzaniu. Jednak „reguły” projektowania skutecznych naśladowczych peptydów ApoA-I nie zostały wyjaśnione, a zasady projektowania cząsteczek organicznych z działaniem ApoA-I są nieznane.

3. Podsumowanie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest agonista ApoA-I charakteryzujący się tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i obejmuje:

(i) 22 do 23 reszt peptydu lub jego analogu, który tworzy amfipatyczną α-helisę w obecności lipidów i który obejmuje wzór strukturalny (I):

Z1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-Z2 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól, w którym:

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) lub D-Pro (p); X2 oznacza resztę alifatyczną;

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza resztę kwaśną;

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

PL 196 675 B1

X7 oznacza resztę hydrofilową;

X8 oznacza resztę kwaśną lub zasadową;

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza resztę hydrofilową;

X12 oznacza resztę hydrofilową;

X13 oznacza Gly (G) lub resztę alifatyczną;

X14 oznacza Leu (L), Trp (W), Gly (G) lub Nal;

X15 oznacza resztę hydrofilową;

X16 oznacza resztę hydrofobową;

X17 oznacza resztę hydrofobową;

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub resztę zasadową;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub resztę zasadową;

X20 oznacza resztę zasadową;

X21 oznacza resztę alifatyczną;

X22 oznacza resztę zasadową;

X23 jest nieobecna lub oznacza resztę zasadową;

Z1 oznacza H2N- lub RC(O)NH-;

Z2 oznacza -C(O)NRR, -C(O)OR lub -C(O)OH lub ich sól;

każdy R oznacza niezależnie -H, (C1-C6) alkil, C1-C alkenyl, (C1-C6) alkinyl, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl, 6-26 członowy alkiloheteroaryl lub 1 do 7-resztowy peptyd lub jego analog;

każdy ‘'-‘' między resztami X1-X23 niezależnie oznacza połączenie amidowe, połączenie amidowe podstawione -C(O)NR, gdzie R oznacza (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, ewentualnie aryl, izoster amidu, gdzie izoster oznacza -CH2NH-, CH2S-, -CH2CH2, -CH=CH- (cis i trans),

-C(O)CH2-, -CH(OH)CH2 lub -CH2SO-; albo (ii) zmienioną postać ze wzoru strukturalnego (I), w której przynajmniej jedna spośród reszt X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18, X19, X20, X21, X22, X23 została konserwatywnie podstawiona inną resztą.

Korzystnie stanowi zmienioną postać ze wzoru strukturalnego (I).

Korzystniej reszty hydrofobowe są ustalone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) i przynajmniej jedna nieustalona reszta jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

Jeszcze korzystniej we wzorze (I):

X1 oznacza Pro (P), D-Pro (p), Gly (G) lub Ala (A);

X2 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Val (V);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X13 oznacza Leu (L), Gly (G) lub Aib;

X14 oznacza Leu (L), Nal, Trp (W) lub Gly (G);

X16 oznacza Ala (A), Nal, Trp (W), Gly (G), Leu (L) lub

Phe (F);

X17 oznacza Leu (L), Gly (G) lub Nal;

X21 oznacza Leu (L); i przynajmniej jeden spośród X4, X7, X8, X11, X12, X15, X18, X19, X20, X22 oraz X23 jest konserwatywnie podstawiony inną resztą.

Korzystniej reszty hydrofilowe są ustalone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) i przynajmniej jedna nieustalona reszta jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

Jeszcze korzystniej we wzorze (I):

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X7 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X11 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

PL 196 675 B1

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X20 oznacza Lys (K) lub Orn;

X22 oznacza Lys (K) lub Orn;

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K); oraz przynajmniej jedna spośród reszt X1, X2, X3, X5, X6, X9, X10, X13, X14, X16, X17, oraz X21 została konserwatywnie podstawiona inną resztą.

Najkorzystniej we wzorze (I) X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F), X6 oznacza Phe (F), X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G), X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W) lub Gly (G) i przynajmniej jedna spośród reszt X1, X2, X5, X13, X14, X16, X17 oraz X21 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

Korzystniej reszta podstawiająca jest sklasyfikowana w tej samej podkategorii co reszta podstawiana.

Korzystnie stanowi peptyd lub analog peptydu o 22-23 resztach aminokwasowych, o wzorze strukturalnym (I).

Korzystniej we wzorze (I):

„-” pomiędzy resztami oznacza -C(O)NH-;

Z1 oznacza H2N- ; oraz

Z2 oznacza -C(O)OH lub jego sól.

Jeszcze korzystniej we wzorze (I):

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q), Asp (D) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X13 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Aib;

X14 oznacza Leu (L), Nal, Trp (W), lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X16 oznacza Ala (A), Nal, Trp (W), Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X17 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Nal;

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X20 oznacza Lys (K) lub Orn;

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K) lub Orn, i

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K).

Najkorzystniej X23 jest nieobecny.

Korzystniej jedna z reszt X18 lub X19 oznacza Gln (Q) lub Asn (N), a druga z reszt X18 lub X19 oznacza Lys (K) lub Orn.

Jeszcze korzystniej każda spośród reszt X9, X10, X13, X14, X15 i X17 jest inna niż Gly (G).

Jeszcze korzystniej jedna spośród reszt X9, X10, X13, X14, X15 i X17 oznacza Gly (G) a pozostałe są inne niż Gly (G).

Korzystniej agonista ApoA-I jest wybrany z grupy składającej się z:

peptyd 1 peptyd 2 peptyd 3 peptyd 4 peptyd 5

PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO: 1); (SEQ ID NO: 2); (SEQ ID NO: 3); (SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 5);

PL 196 675 B1 peptyd 6 peptyd 7 peptyd 8 peptyd 9 peptyd 10 peptyd 11 peptyd 12 peptyd 13 peptyd 14 peptyd 15 peptyd 16 peptyd 17 peptyd 18 peptyd 19 peptyd 20 peptyd 21 peptyd 22 peptyd 23 peptyd 24 peptyd 25 peptyd 26 peptyd 27 peptyd 28 peptyd 29 peptyd 123 peptyd 124 peptyd 125 peptyd 126 peptyd 127 peptyd 128 peptyd 129 peptyd 130 peptyd 131 peptyd 132 peptyd 133 peptyd 134 peptyd 135 peptyd 136 peptyd 137 peptyd 138 peptyd 139 peptyd 140 peptyd 141 peptyd 142

PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK

PVLDLFKELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELGNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK

PVLDLFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK

GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALOQOLO

PVLDLFRELWNELLEALKQKLK

PVLDLLRELLNELLEALKQKLK

PVLELFKELLQELLEALKQKLK

GYLDLFRELLNELLEALKOKLK pVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFREGLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK

PLLELFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALQKKLK

PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELZEALKQKLK

PVLDLFRELLNELWEALKQKLK

AVLDLFRELLNELLEALKQKLK

QVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFOELLNELLEALOQOLO

NVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELGEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK

PVLELFNDLLRELLEALQKKLK

PVLELFNDLLRELLEALKQKLK

PVLELFKELLNELLDALRQKLK

PVLDLFRELLENLLEALQKKLK

PVLELFERLLEDLLQALNKKLK

PVLELFERLLEDLLKALNQKLK

DVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PALELFKDLLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK

PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO

PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

PVLELFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ

D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO: D NO:

6);

7) ;

8) ;

9) ;

10) ; 11); 12);

13) ;

14) ;

15) ; :16);

17) ;

18) ;

19) ;

20) ; 21); 22);

23) ;

24) ;

25) ;

26) ;

27) ;

28) ; 29);

123)

124)

125)

126)

127)

128)

129)

130)

131)

132)

133)

134)

135)

136)

137)

138)

139)

140)

141)

142) i ich postaci acylowanych na N-końcu i/lub amidowanych lub estryfikowanych na C-końcu, przy czym X oznacza Aib, Z oznacza Nal; i O oznacza Orn.

Przedmiotem wynalazku jest multimeryczny agonista ApoA-I charakteryzujący się tym, że wykazuje przynajmniej 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i posiada wzór strukturalny (II):

(II) HH-(-LLm-HH-)n-LLm-HH;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, przy czym: każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1; n oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 10;

każdy „HH” oznacza niezależnie peptyd jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (I); każdy „LL” oznacza niezależnie dwufunkcyjny łącznik; i

PL 196 675 B1 każdy „-” niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

Przedmiotem wynalazku multimeryczny agonista ApoA-I charakteryzujący się tym, że wykazuje przynajmniej 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i posiada wzór strukturalny (III):

(III) X-Nya-X(ya-1) - (Nyb-X(yb-1) )p lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, przy czym:

każdy X oznacza niezależnie HH-(-LLm-HH-)n-LLm-HH;

każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (I);

każdy LL oznacza niezależnie dwufunkcyjny łącznik;

każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1; każdy n oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 8;

Nya i Nyb oznacza każdy niezależnie wielofunkcyjną cząsteczkę łączącą gdzie ya i yb to liczba grup funkcyjnych w Nya i Nyb, odpowiednio; każdy ya i yb oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 3 do 8; p oznacza liczbę cał kowitą od 0 do 7; a każdy „-” niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

Przedmiotem wynalazku jest multimeryczny agonista ApoA-I charakteryzujący się tym, że wykazuje przynajmniej 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i posiada wzór strukturalny (IV) lub (V):

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, przy czym: .

każdy X oznacza niezależnie HH-(-LLm-HH-)n-LLm-HH;

każdy LL oznacza niezależnie dwufunkcyjny łącznik;

każdy n oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1; każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 8; każdy R1 oznacza -OR lub NRR; oraz każdy R oznacza niezależnie -H, (C1-C6) alkil, C1-C6 alkenyl, (C1-C6) alkinyl, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy alkiloheteroaryl.

Korzystnie dwufunkcyjny łącznik może ulegać cięciu.

Korzystnie n oznacza 0.

Korzystniej m oznacza 0.

Korzystnie każdy HH oznacza niezależnie peptyd określony powyżej o wzorze strukturalnym (I), w którym „-” pomiędzy resztami oznacza -C(O)NH-; Z1 oznacza H2N-; oraz Z2 oznacza -C(O)OH lub jego sól.

PL 196 675 B1

Korzystnie każdy HH oznacza niezależnie peptyd określony powyżej o wzorze strukturalnym (I), w którym X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q), Asp (D) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L) Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X13 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Aib;

X14 oznacza Leu (L), Nal, Trp (W), lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X16 oznacza Ala (A), Nal, Trp (W), Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X17 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Nal;

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X20 oznacza Lys (K) lub Orn;

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K) lub Orn, i

X23 oznacza nieobecny lub oznacza Lys (K).

Korzystnie każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono powyżej wybrany z grupy składającej się z:

peptyd 1 peptyd 2 peptyd 3 peptyd 4 peptyd 5 peptyd 6 peptyd 7 peptyd 8 peptyd 9 peptyd 10 peptyd 11 peptyd 12 peptyd 13 peptyd 14 peptyd 15 peptyd 16 peptyd 17 peptyd 18 peptyd 19 peptyd 20 peptyd 21 peptyd 22 peptyd 23 peptyd 24 peptyd 25 peptyd 26 peptyd 27 peptyd 28 peptyd 29 peptyd 123

PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK

PVLDLFKELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELGNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK

PVLDLFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK

GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALOQOLO

PVLDLFRELWNELLEALKQKLK

PVLDLLRELLNELLEALKQKLK

PVLELFKELLQELLEALKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFREGLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK

PLLELFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALQKKLK

PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELZEALKQKLK

PVLDLFRELLNELWEALKQKLK

AVLDLFRELLNELLEALKQKLK

QVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ

ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO

1);

2);

3);

4);

5);

6);

7);

8);

9);

10)

11)

12)

13)

14)

15)

16)

17)

18)

19);

20);

21);

22);

23);

24);

25);

26);

27);

28);

29);

123)

PL 196 675 B1 peptyd 124 peptyd 125 peptyd 126 peptyd 127 peptyd 128 peptyd 129 peptyd 130 peptyd 131 peptyd 132 peptyd 133 peptyd 134 peptyd 135 peptyd 136 peptyd 137 peptyd 138 peptyd 139 peptyd 140 peptyd 141 peptyd 142

PVLDLFOELLNELLEALOQOLO

NVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELGEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK

PVLELFNDLLRELLEALQKKLK

PVLELFNDLLRELLEALKQKLK

PVLELFKELLNELLDALRQKLK

PVLDLFRELLENLLEALQKKLK

PVLELFERLLEDLLQALNKKLK

PVLELFERLLEDLLKALNQKLK

DVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PALELFKDLLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK

PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO

PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

PVLELFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ

ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO

124)

125)

126)

127)

128)

129)

130)

131)

132)

133)

134)

135)

136)

137)

138)

139)

140)

141)

Przedmiotem wynalazku jest również kompleks agonista ApoA-I-lipid obejmujący agonistę ApoA-I i lipid, charakteryzujący się tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (I), multimeryczny agonista ApoA-I jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (II), multimeryczny agonista ApoA-I jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (III), lub multimeryczny agonista ApoA-I jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (IV) lub (V).

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi peptyd lub analog peptydu jak określono powyżej o wzorze (I) o 22-23 resztach aminokwasowych.

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono powyżej o wzorze (I), w którym "-" pomiędzy resztami oznacza -C(O)NH-; Z1 oznacza H2N- ; oraz Z2 oznacza -C(O)OH lub jego sól.

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono powyżej o wzorze (I), w którym X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q), Asp (D) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L) Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X13 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Aib;

X14 oznacza Leu (L), Nal, Trp (W), lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X16 oznacza Ala (A), Nal, Trp (W), Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X17 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Nal;

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X20 oznacza Lys (K) lub Orn;

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K) lub Orn, i

X23 oznacza nieobecny lub oznacza Lys (K) .

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono powyżej wybrany z grupy składającej się z:

PL 196 675 B1

Peptyd 1	PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK	(SEQ ID NO	1);
Peptyd 2	GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK	(SEQ ID NO	2);
peptyd 3	PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK	(SEQ ID NO	3);
peptyd 4	PVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	4);
peptyd 5	PVLDLFRELLNELLEALKQKLKK	(SEQ ID NO	5);
peptyd 6	PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK	(SEQ ID NO	6);
peptyd 7	PVLDLFKELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	7);
peptyd 8	PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	8);
peptyd 9	PVLDLFRELGNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	9);
peptyd 10	PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK	(SEQ ID NO	10);
peptyd 11	PVLDLFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	11);
peptyd 12	PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK	(SEQ ID NO	12);
peptyd 13	GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	3);
peptyd 14	PVLDLFRELLNELLEALOQOLO	(SEQ ID NO:	14);
peptyd 15	PVLDLFRELWNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	15);
peptyd 16	PVLDLLRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	16);
peptyd 17	PVLELFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	17);
peptyd 18	GVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	18);
peptyd 19	PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	19);
peptyd 20	PVLDLFREGLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	20);
peptyd 21	PVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	21);
peptyd 22	PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK	(SEQ ID NO:	22);
peptyd 23	PLLELFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	23);
peptyd 24	PVLDLFRELLNELLEALQKKLK	(SEQ ID NO	24);
peptyd 25	PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK	(SEQ ID NO	25);
peptyd 26	PVLDLFRELLNELLELLKQKLK	(SEQ ID NO:	26);
peptyd 27	PVLDLFRELLNELZEALKQKLK	(SEQ ID NO	27);
peptyd 28	PVLDLFRELLNELWEALKQKLK	(SEQ ID NO	28);
peptyd 29	AVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	29);
peptyd 123	QVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	123)
peptyd 124	PVLDLFOELLNELLEALOQOLO	(SEQ ID NO:	124)
peptyd 125	NVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	125)
peptyd 126	PVLDLFRELLNELGEALKQKLK	(SEQ ID NO	126)
peptyd 127	PVLDLFRELLNELLELLKQKLK	(SEQ ID NO:	127)
peptyd 128	PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK	(SEQ ID NO:	128)
peptyd 129	PVLELFNDLLRELLEALQKKLK	(SEQ ID NO	129)
peptyd 130	PVLELFNDLLRELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	130)
peptyd 131	PVLELFKELLNELLDALRQKLK	(SEQ ID NO	131)
peptyd 132	PVLDLFRELLENLLEALQKKLK	(SEQ ID NO:	132)
peptyd 133	PVLELFERLLEDLLQALNKKLK	(SEQ ID NO	133)
peptyd 134	PVLELFERLLEDLLKALNQKLK	(SEQ ID NO	134)
peptyd 135	DVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	135)
peptyd 136	PALELFKDLLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	136)
peptyd 137	PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK	(SEQ ID NO	137)
peptyd 138	PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK	(SEQ ID NO:	138)
peptyd 139	PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	139)
peptyd 140	PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO	(SEQ ID NO:	140)
peptyd 141	PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	141)
peptyd 142	PVLELFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	142)

i ich postaci acylowanych na N-końcu i/lub amidowanych lub estryfikowanych na C-końcu, przy czym X oznacza Aib, Z oznacza Nal; i O oznacza Orn.

Korzystnie lipid stanowi sfingomielina.

Korzystnie ma postać liofilizowanego proszku.

Korzystnie ma postać roztworu.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera agonistę ApoA-I i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, zaróbkę lub

PL 196 675 B1 rozcieńczalnik, przy czym agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (I), multimeryczny agonista ApoA-I jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (II), multimeryczny agonista ApoA-I jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (III), lub multimeryczny agonista ApoA-I jak określono powyżej o wzorze strukturalnym (IV) lub (V).

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono powyżej lub analog peptydu o 22-23 resztach aminokwasowych, o wzorze strukturalnym (I).

Korztystnie agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono powyżej o wzorze (I), w którym X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q), Asp (D) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L) Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Asn (N) lub Gin (Q);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X13 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Aib;

X14 oznacza Leu (L), Nal, Trp (W) , lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X16 oznacza Ala (A), Nal, Trp (W), Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X17 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Nal;

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X20 oznacza Lys (K) lub Orn;

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K) lub Orn, i

X23 oznacza nieobecny lub oznacza Lys (K).

peptyd 1	PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK	(SEQ ID NO:	1);
peptyd 2	GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK	(SEQ ID NO:	2);
peptyd 3	PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK	(SEQ ID NO:	3);
peptyd 4	PVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	4);
peptyd 5	pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK	(SEQ ID NO:	5);
peptyd 6	PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK	(SEQ ID NO	6);
peptyd 7	PVLDLFKELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	7);
peptyd 8	PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	8);
peptyd 9	PVLDLFRELGNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	9);
peptyd 10	PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK	(SEQ ID NO	10);
peptyd 11	PVLDLFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	11);
peptyd 12	PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK	(SEQ ID NO	12);
peptyd 13	GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	13);
peptyd 14	PVLDLFRELLNELLEALOQOLO	(SEQ ID NO:	14);
peptyd 15	PVLDLFRELWNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	15);
peptyd 16	PVLDLLRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	16);
peptyd 17	PVLELFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	17);
peptyd 18	GVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	18);
peptyd 19	pVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	19);
peptyd 20	PVLDLFREGLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	20);
peptyd 21	pVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	21);
peptyd 22	PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK	(SEQ ID NO:	22);
peptyd 23	PLLELFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	23);

PL 196 675 B1

peptyd 24	PVLDLFRELLNELLEALQKKLK	(SEQ ID NO	24);
peptyd 25	PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK	(SEQ ID NO	25);
peptyd 26	PVLDLFRELLNELLELLKQKLK	(SEQ ID NO:	26);
peptyd 27	PVLDLFRELLNELZEALKQKLK	(SEQ ID NO	27);
peptyd 28	PVLDLFRELLNELWEALKQKLK	(SEQ ID NO	28);
peptyd 29	AVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	29);
peptyd 123	QVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	123);
peptyd 124	PVLDLFOELLNELLEALOQOLO	(SEQ ID NO:	124);
peptyd 125	NVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	125);
peptyd 126	PVLDLFRELLNELGEALKQKLK	(SEQ ID NO	126);
peptyd 127	PVLDLFRELLNELLELLKQKLK	(SEQ ID NO:	127);
peptyd 128	PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK	(SEQ ID NO:	128);
peptyd 129	PVLELFNDLLRELLEALQKKLK	(SEQ ID NO	129);
peptyd 130	PVLELFNDLLRELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	130);
peptyd 131	PVLELFKELLNELLDALRQKLK	(SEQ ID NO	131);
peptyd 132	PVLDLFRELLENLLEALQKKLK	(SEQ ID NO	132);
peptyd 133	PVLELFERLLEDLLOALNKKLK	(SEQ ID NO:	133);
peptyd 134	PVLELFERLLEDLLKALNQKLK	(SEQ ID NO	134);
peptyd 135	DVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	135);
peptyd 136	PALELFKDLLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	136);
peptyd 137	PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK	(SEQ ID NO	137);
peptyd 138	PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK	(SEQ ID NO:	138);
peptyd 139	PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	139);
peptyd 140	PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO	(SEQ ID NO:	140);
peptyd 141	PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	141);
peptyd 142	PVLELFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	142);

Korzystnie agonista ApoA-I jest w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, przy czym ten kompleks zawiera agonistę ApoA-I i lipid.

Korzysniej kompleks ApoA-I agonista-lipid jest w postaci liofilizowanego proszku.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, zawierająca agonistę ApoA-I jak określono powyżej o wzorze (I) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik, do zastosowania do wytwarzania leku do leczenia choroby związanej z dyslipidemią.

Korzystnie agonista jest w postaci kompozycji farmaceutycznej, przy czym ta kompozycja zawiera agonistę ApoA-I oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.

Korzystnie agonista jest w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, przy czym ten kompleks zawiera agonistę ApoA-I i lipid.

Korzystnie chorobę związaną z dyslipidemią stanowi hipercholesterolemia.

Korzystnie chorobę związaną z dyslipidemią stanowi choroba sercowonaczyniowa.

Korzystnie chorobę związaną z dyslipidemią stanowi miażdżyca naczyń.

Korzystnie chorobą związaną z dyslipidemią jest restenoza.

Korzystnie chorobę związaną z dyslipidemią stanowi niedobór HDL lub ApoA-I.

Korzystnie chorobę związaną z dyslipidemią stanowi hipertriglicerydemia.

Korzystnie chorobę związaną z dyslipidemią stanowi zespół metaboliczny.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca agonistę ApoA-I jak określono powyżej o wzorze (I) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik do zastosowania do wytwarzania leku do leczenia wstrząsu septycznego.

W przypadku kompozycji określonych powyżej korzystnie lek przeznaczony jest do leczenia człowieka.

W przypadku kompozycji określonych powyżej, korzystnie lek przeznaczony jest do podawania w dawce około 0,5 mg/kg do około 100 mg/kg agonisty ApoA-I.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I jak określono powzyżej o wzorze (II) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

PL 196 675 B1

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I jak określono powyżej o wzorze (III) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I jak określono powzyżej o wzorze (IV) lub (V) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

Agoniści ApoA-I według wynalazku są zdolni do tworzenia amfipatycznych α-helis, które imitują aktywność ApoA-I ze specyficznymi aktywnościami, tzn. jednostkami aktywności (aktywacja LCAT/-jednostkę masy) zbliżonymi lub większymi od natywnej cząsteczki. W szczególności agoniści ApoA-I według wynalazku są peptydami albo analogami peptydów, które tworzą helisy amfipatyczne (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy typu pre-β albo typu HDL, aktywują LCAT, zwiększają poziomy frakcji HDL w surowicy oraz promują wypływ cholesterolu.

Wynalazek opiera się częściowo na projektowaniu i stwierdzeniu przez twórców wynalazku peptydów, które naśladują działanie ApoA-I. Peptydy według wynalazku zaprojektowano w oparciu o przypuszczalną strukturę helikalną i amfipatyczne właściwości 22-aminokwasowej sekwencji najwyższej zgodności, która pochodziła z helikalnych powtórzeń ApoA-I. Niespodziewanie okazało się, że peptydy według wynalazku mają aktywność specyficzną znacząco powyżej aktywności opisanej w literaturze i podanej dla peptydów pochodzących z ApoA-I. W rzeczywistości w niektórych rozwiązaniach dochodzą one do 100% aktywności naturalnej ApoA-I, natomiast opisani tu superagoniści mają aktywność przekraczającą właściwą aktywność ApoA-I.

Wynalazek jest zilustrowany za pomocą przykładów realizacji, które opisują budowę, otrzymywanie i zastosowanie poszczególnych peptydów amfipatycznych, które tworzą helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy i zwiększają aktywność LCAT. W oparciu o strukturę i aktywność przykładowych rozwiązań, twórcy wynalazku określili zbiór „reguł”, które można wykorzystać do projektowania zmienionych albo zmutowanych postaci, które są także objęte zakresem wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano kompozycje farmaceutyczne zawierające jako składnik czynny agonistów ApoA-I (albo w postaci peptydów albo w postaci kompleksów peptyd-lipid), jak również sposoby wytwarzania takich kompozycji i ich zastosowanie do leczenia chorób związanych z dyslipoproteinemią (na przykład choroba naczyniowo-sercowa, miażdżyca naczyń, zespół metaboliczny), restenozy albo endotoksemii (na przykład wstrząsu septycznego).

3.1. Skróty

Stosowane tu skróty dla genetycznie zakodowanych aminokwasów L-enancjomerycznych są skrótami konwencjonalnymi i są jak następuje:

Aminokwas	Symbol jednoliterowy	Skrót stosowany powszechnie
Alanina	A	Ala
Arginina	R	Arg
Asparagina	N	Asn
Kwas asparaginowy	D	Asp
Cysteina	C	Cys
Glutamina	Q	Gin
Kwas glutaminowy	E	Glu
Glicyna	G	Gly
Histydyna	H	His
Izoleucyna	I	Ile
Leucyna	L	Leu
Lizyna	K	Lys
Metionina	M	Met
Fenyloalanina	F	Phe
Prolina	P	Pro
Seryna	S	Ser
Treonina	T	Thr

PL 196 675 B1

Tryptofan	W	Trp
Tyrozyna	Y	Tyr
Walina	V	Val

Skróty stosowane dla D-enancjomerów genetycznie zakodowanych aminokwasów są pisanymi małą literą równoważnikami symboli jednoliterowych. Na przykład „R" oznacza L-argininę, natomiast „r" oznacza D-argininę.

3.2. Określenia

Stosowane tu, następujące określenia mają następujące znaczenia:

„Alkil” oznacza nasycony rozgałęziony, prostołańcuchowy albo cykliczny rodnik węglowodorowy. Do typowych grup alkilowych, lecz nie tylko, należy metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, t-butyl, pentyl, izopentyl, heksyl, itp. W zalecanych rozwiązaniach grupy alkilowe są grupami (C1-C6)-alkilowymi.

„Alkenyl” oznacza nienasycony rozgałęziony, prostołańcuchowy albo cykliczny rodnik węglowodorowy zawierający co najmniej jedno podwójne wiązanie węgiel-węgiel. Rodnik może być w konfiguracji cis albo trans względem wiązania podwójnego (wiązań podwójnych). Do typowych grup alkenylowych należy, lecz nie tylko, etenyl, propenyl, izopropenyl, butenyl, izobutenyl, tert-butenyl, pentenyl, heksenyl, itp. W zalecanych rozwiązaniach grupa alkenylowa jest grupą (C1-C6)-alkenylową.

„Alkinyl” oznacza nienasycony rozgałęziony, prostołańcuchowy albo cykliczny rodnik węglowodorowy, który ma co najmniej jedno potrójne wiązanie węgiel-węgiel. Do typowych grup alkinylowych należy, lecz nie tylko, etynyl, propynyl, butynyl, izobutynyl, pentynyl, heksynyl, itp. W zalecanych rozwiązaniach grupa alkinylowa jest grupą alkinylową.

„Aryl” oznacza nienasycony, cykliczny rodnik węglowodorowy, który ma sprzężony układ elektronów π. Do typowych grup arylowych należy, lecz nie tylko, penta-2,4-dien, fenyl, naftyl, antracyl, azulenyl, chryzenyl, koronelil, fluorantenyl, indacenyl, idenyl, owalenyl, perylenyl, fenalenyl, fenantrenyl, picenyl, plejadenyl, pirenyl, pirantrenyl, rubicenyl, itp. W zalecanych rozwiązaniach grupa arylowa jest grupą (C5-C20)-arylową, przy czym szczególnie zalecana jest grupa (C5-C10)-arylowa.

„Alkiloaryl" oznacza prostołańcuchową grupę alkilową, alkenylową albo alkinylową, w której jeden z atomów wodoru związany z węglem końcowym jest zastąpiony ugrupowaniem arylowym. Do typowych grup alkiloarylowych należy, lecz nie tylko, benzyl, benzyliden, benzobenzyl, naftenobenzyl, itp. W zalecanych rozwiązaniach grupa alkiloarylowa jest grupą (C6-C26)-alkiloarylową, na przykład ugrupowaniem alkilowym, alkenylowym albo alkinylowym grupy alkilo-arylowej jest (C1-C6), a urupowaniem arylowym jest (C5-C20). W szczególnie zalecanych rozwiązaniach grupa alkilo-arylowa jest (C6-C13)-alkiloarylem, na przykład ugrupowaniem alkilowym, alkenylowym albo alkinylowym grupy alkilo-arylowej jest (C1-C3), a ugrupowanie arylowe jest (C5-C10).

„Heteroaryl” oznacza ugrupowanie arylowe, w którym jeden albo więcej atomów węgla jest zastąpione innym atomem, takim jak N, P, O, S, As, Se, Si, Te, itp. Do typowych grup heteroarylowych należy, lecz nie tylko, akrydarsyna, akrydyna, arsantrydyna, arsindol, arsindo-lina, karbazol, β-karbolina, chromen, cynolina, furan, imidazol, indazol, indol, indolizyna, izoarsindol, izoarsindolina, izobenzofuran, izochromen, izoindol, izofosfoindol, izofosfinolina, izochinolina, izotiazol, izoksazol, naftyrydyna, permidyna, fenatrydyna, fenantrolina, fenazyna, fosfoindol, fosfinolina, ftalazyna, pterydyna, puryna, piran, pirazyna, pirazol, pirydazyna, pirymidyna, pirol, pirolizyna, chinazolina, chinolina, chinolizyna, chinoksalina, selenofen, tellurofen, tiofen i ksanten. W zalecanych rozwiązaniach grupa heteroarylowa jest heteroarylem 5-20-członowym, przy czym szczególnie korzystny jest aryl 5-10-członowy.

„Alkiloheteroaryl” oznacza prostołańcuchową grupę alkilową, alkenylową albo alkinylową, w której jeden z atomów wodoru połączony z końcowym atomem węgla jest zastąpiony ugrupowaniem heteroarylowym. W zalecanych rozwiązaniach grupa alkiloheteroarylowa jest 6-26-członowym alkiloheteroarylem, to jest alkilowym, alkenylowym albo alkinylowym ugrupowaniem alkiloheteroarylu jest (C1-C6), a heteroaryl jest heteroarylem 5-20-członowym. W szczególnie zalecanych rozwiązaniach alkiloheteroaryl jest alkiloheteroarylem 6-13-członowym, to jest ugrupowaniem alkilowym, alkenylowym albo alkinylowym heteroarylu 5-10-członowego.

„Podstawiony alkil, alkenyl, alkinyl, aryl, alkiloaryl, heteroaryl albo alkiloheteroaryl” oznacza grupę alkilową, alkenylową, alkinylową, arylową, alkiloarylową, heteroarylową albo alkiloheteroarylową, w której jeden albo więcej atomów wodoru jest zastąpiony innym podstawnikiem. Do zalecanych podstawników należy -OR, -SR, -NRR, -NO2, -CN, chlorowiec, -C(O)R, -C(O)OR i -C(O)NR, w których każdy R oznacza niezależnie wodór, alkil, alkenyl, alkinyl, aryl, alkiloaryl, heteroaryl albo alkiloheteroaryl.

PL 196 675 B1

4. Krótki opis figur

Figura 1A przedstawia helikalny diagram kołowy Schiffera-Edmundsona wyidealizowanej amfipatycznej helisy α, w którym otwarte kółka oznaczają hydrofilowe reszty aminokwasowe, natomiast kółka zacienione oznaczają hydrofobowe reszty aminokwasowe.

Figura 1B przedstawia helikalny diagram sieciowy wyidealizowanej amfipatycznej helisy z fig. 1A.

Figura 1C przedstawia helikalny cylindryczny diagram wyidealizowanej amfipatycznej helisy z fig. 1A.

Figura 2A przedstawia helikalny kołowy diagram Schiffera-Edmundsona rdzeniowego peptydu o strukturze (I), ilustrujący amfipatyczność helisy (otwarte kółka oznaczają hydrofobowe reszty aminokwasowe, natomiast częściowo zacienione kółka oznaczają albo hydrofobowe albo hydrofilowe reszty aminokwasowe).

Figura 2B przedstawia helikalny diagram sieciowy rdzeniowego peptydu o strukturze (I), ilustrujący hydrofobową powierzchnię czołową helisy.

Figura 2C przedstawia helikalny diagram sieciowy rdzeniowego peptydu o strukturze (I), ilustrujący hydrofilową powierzchnię czołową helisy.

Figura 3A przedstawia helikalny diagram sieciowy, ilustrujący hydrofilową powierzchnię czołową

22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO: 75).

Figura 3B przedstawia helikalny diagram sieciowy, ilustrujący powierzchnię hydrofiłową czołową przykładowego rdzeniowego peptydu 4 (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO: 4).

Figura 4A przedstawia helikalny diagram sieciowy, ilustrujący hydrofobową powierzchnię czołową „22-merowego” peptydu najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO: 75).

Figura 4B przedstawia helikalny diagram sieciowy, ilustrujący hydrofobową powierzchnię czołową przykładowego rdzeniowego peptydu 4 (SEQ ID NO: 4).

Figura 5A przedstawia helikalny diagram kołowy Schiffera-Edmundsona „zgodnego” 22-merycznego peptydu Segresta (SEQ ID NO: 75).

Figura 5B przedstawia helikalny diagram kołowy Schiffera-Edmundsona przykładowego rdzeniowego peptydu 4 (SEQ ID NO: 4).

Figura 6A przedstawia komputerowy model dwóch peptydów 4 (SEQ ID NO: 4) rozmieszczonych w sposób przeciw-równoległy, w których reszty Glu-8 i Gln-19 są rozjaśnione w celu zilustrowania zdolności tych dwóch peptydów do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych, gdy są one związane z lipidami.

Figura 6B przedstawia komputerowy model dwóch peptydów 102 (PVLDLFRELLNLXLEALKEKLK; SEQ ID NO: 102) rozmieszczonych w sposób przeciwrównoległy, w których reszty Glu-8 i Gln-19 są rozjaśnione w celu zilustrowania niezdolności tych dwóch peptydów do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych, gdy są one związane z lipidami.

Figura 7A ilustruje opisaną tu rozgałęzioną sieć trzeciorzędową.

Figura 7B ilustruje opisaną tu rozgałęzioną sieć czwartorzędową.

Figura 7C ilustruje opisaną tu rozgałęzioną sieć o mieszanej rzędowości.

Figura 7D ilustruje przykładowe rozgałęzione sieci „drzewa Lys" według wynalazku.

Figura 8A przedstawia wykres ilustrujący różnice pomiędzy obserwowanymi przesunięciami chemicznymi Ha i tablicowymi przesunięciami chemicznymi przypadkowego zwojowego Ha dla peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) i dla „22-merowego peptydu najwyższej zgodności (SEQ ID NO: 75).

Figura 8B przedstawia wykres ilustrujący różnice pomiędzy obserwowanymi przesunięciami chemicznymi protonów amidowych i stabularyzowanymi przesunięciami chemicznymi kłębka statystycznego protonów amidowych dla peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) i dla 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO: 75).

Figura 8C przedstawia rysunek ilustrujący okresową zależność pomiędzy przesunięciami chemicznymi Ha dla peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) i dla jego konformacji a-helikalnej.

Figury 9A-9D przedstawiają żelowe chromatogramy wydzielonego ludzkiego HDL poddawanego inkubacji w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C w buforze, jak zmierzono drogą absorbancji (-) i w obecności ¹⁴C-znaczonego peptydu 4 zmierzonego drogą absorbancji (----) albo zliczania ¹⁴C-radiometrycznego (♦). Chromatogramy otrzymano przy stosunkach masowych peptyd:HDL 1:15 (fig. 9A), 1:10 (fig. 9B), 1:5 (fig. 9C) i 1:3 (fig. 9D).

Figura 9E przedstawia kontrolny chromatogram fltracji w żelu wolnego, niezwiązanego, ¹⁴C-znakowanego peptydu 4, zmierzony drogą absorbancji (----) i drogą zliczania ¹⁴C-radiometrycznego (♦).

PL 196 675 B1

Figura 9F przedstawia różnicowe chromatogramy fltracji w żelu, ilustrujące różnicę pomiędzy każdym z chromatogramów absorpcyjnych HDL potraktowanego peptydem, przedstawionego na fig. 9A (----), 9B (-), 9C (----) i 9D (-), i chromatogramem kontrolnym z fig. 9E (wartości dodatnie wskazują na wyższą absorbancję w potraktowanej próbce, wartości ujemne wskazują na wyższą absorbancję w próbce kontrolnej).

Figura 10 przedstawia wykres ilustrujący profil lipoproteinowy królików, którym podano zastrzyk 10 mg/kg peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) (w postaci kompleksów peptyd/DPPC).

Figura 11A przedstawia film ilustrujący różne stany agregacji i kompleksy peptyd-lipid, które można uzyskać za pomocą agonistów ApoA-I według wynalazku. Strona lewa: Proces multimeryzacji peptydów otrzymanych w wyniku oddziaływania kilku helis peptydowych i prowadzący do tworzenia się oligomerów w warunkach określonego stężenia peptydu, pH i siły jonowej. Środek: Oddziaływanie peptydów (w każdym z tych stanów agregacji) z jednostkami lipidowymi (takimi jak SUV) prowadzi do reorganizacji lipidów. Strona prawa: Przez zmianę stosunku molowego lipid:petyd można otrzymać różne rodzaje kompleksów peptyd:lipid, od różnych komicelli przy niskich stosunkach lipid-peptyd, do dyskoidalnych cząstek, a na koniec do dużych multilamelarnych kompleksów przy coraz wyższych stosunkach lipid:peptyd.

Figura 11B przedstawia ogólnie akceptowany model dyskoidalnych kompleksów peptyd-lipid utworzonych w określonym zakresie stosunków lipidrpeptyd. Każdy peptyd otaczający brzeg dysku znajduje się w ścisłym kontakcie ze swoimi dwoma najbliższymi sąsiadami.

5. Szczegółowy opis wynalazku

Agoniści ApoA-I według wynalazku naśladują działanie i aktywność ApoA-I. Tworzą one amfipatyczne helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy typu pre-β albo typu HDL, aktywują LCAT, zwiększają stężenie HDL w surowicy i promują wypływ cholesterolu. Funkcja biologiczna peptydów koreluje z ich strukturą helikalną albo konwersją do struktur helikalnych w obecności lipidów.

Agonistów ApoA-I według wynalazku można otrzymać w trwałej postaci masowej albo w postaci dawek jednostkowych, na przykład w postaci produktów liofilizowanych, które można odtworzyć przed zastosowaniem in vivo albo przekomponować. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być zastosowane w leczeniu hiperlipidemii, hipercholesterolemii, choroby wieńcowej serca, miażdżycy naczyń i innych stanów chorobowych, takich jak endotoksemia powodująca wstrząs septyczny.

Wynalazek jest zilustrowany za pomocą przykładów realizacji, które wykazują, że agoniści ApoA-I według wynalazku wiążą się ze składnikiem HDL osocza i mogą podwyższać stężenie HDL i cząstek pre-β. Agoniści ApoA-I według wynalazku zwiększają wypływ cholesterolu z komórek. Agoniści są także nadzwyczaj skuteczni przy aktywowaniu LCAT, a zatem promują RCT. Zastosowanie agonistów ApoA-I według wynalazku in vivo w modelach zwierzęcych daje w wyniku wzrost stężenia HDL w surowicy.

Wynalazek jest przedstawiony bardziej szczegółowo niżej w podsekcjach, w których opisuje się skład i strukturę peptydowych agonistów ApoA-I, charakterystykę strukturalną i funkcyjną, sposoby wytwarzania kompozycji masowych i w postaci dawek jednostkowych oraz sposoby zastosowania.

5.1. Struktura i funkcja peptydów

Agoniści ApoA-I według wynalazku są na ogół peptydami albo ich analogami, które są zdolne do tworzenia amfipatycznych helis α w obecności lipidów i które naśladują aktywność ApoA-I. Główną cechą agonistów jest „peptyd rdzeniowy” złożony z 15 do 29 reszt aminokwasowych, a zwłaszcza 22 reszt aminokwasowych, albo jego analog, w którym co najmniej jedno wiązanie amidowe w peptydzie jest zastąpione podstawionym amidem, izosterem amidu albo mimetyki amidu.

Agoniści ApoA-I według wynalazku są oparci częściowo na niespodziewanym stwierdzeniu twórców wynalazku, że zmiana niektórych reszt aminokwasowych w pierwotnej sekwencji 22-merowej sekwencji najwyższej zgodności Venkatachalapathi et al., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B:585-596 (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO: 75, nazywana 22-merowym peptydem najwyższej zgodności Segresta albo 22-merowym peptydem najwyższej zgodności), o których sądzono, że są decydujące dla aktywności, daje syntetyczne peptydy, które przejawiają aktywność, która zbliża się do aktywności, a w niektórych rozwiązaniach nawet przekracza aktywność naturalnej ApoA-I. Twórcy wynalazku stwierdzili w szczególności, że zastępowanie trzech naładowanych reszt aminokwasowych w 22-merowym peptydzie najwyższej zgodności Segresta (Glu-5, Lys-9 i Glu-13) hydrofobową resztą Leu daje peptydy, które naśladują strukturalne i funkcjonalne właściwości ApoA-I w stopniu, który jest bezprecedensowy w tej dziedzinie.

PL 196 675 B1

Nie zamierzając wiązać się z jakąś szczególną teorią sądzi się, że helisa utworzona przez agonistów według wynalazku ściślej naśladuje strukturalne i funkcjonalne właściwości amfipatycznych helikalnych obszarów naturalnego ApoA-I, które są istotne dla przeprowadzenia wiązania lipidów, wypływu cholesterolu i aktywacji LCAT niż czyni to helisa a utworzona przez mimetyki ApoA-I opisane w literaturze, dając przez to w wyniku peptydy, które wykazują znacznie wyższą aktywność typu ApoA-I niż te inne peptydy. W rzeczywistości o ile wiele agonistów ApoA-I według wynalazku zbliża się do aktywności, a w niektórych przypadkach nawet przekracza aktywność ApoA-I, to aktualnie najlepsi peptydowi naśladowcy ApoA-I, opisany w literaturze peptyd 18AM4 (EWLEAFYKKYLEKLKELF; SEQ ID NO: 246)(Corinjn et al., 1993, Biochem. Biophys. Acta 1170:8-16; Labeur et al., październik 1994, Arteriosclerosis: Abstract Nr Nr 186 i 187), i N-acetylowany, C-amidowany peptyd 18AM4 (SEQ ID NO: 239)(Braseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7), wykazują mniej niż odpowiednio 4% i 11% aktywności ApoA-I zmierzonej drogą opisanego tu oznaczenia aktywacji LCAT.

Peptydy rdzeniowe (albo ich analogi), które są agonistami ApoA-I według wynalazku, mają na ogół następujący wzór strukturalny (I):

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22 w którym:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) albo D-Pro (p),

X2 oznacza alifatyczny aminokwas,

X3 oznacza Leu (L) albo Phe (F),

X4 oznacza kwaśny aminokwas,

X5 oznacza Leu (L) albo Phe (F),

X6 oznacza Leu (L) albo Phe (F),

X7 oznacza aminokwas hydrofilowy,

X8 oznacza aminokwas kwaśny albo zasadowy,

X9 oznacza Leu (L) albo Gly (G),

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) albo Gly (G),

XII oznacza aminokwas hydrofilowy,

X12 oznacza kwas hydrofilowy,

X13 oznacza Gly (G) albo aminokwas alifatyczny,

X14 oznacza Leu (L), Trp (W), Gly (G) albo Nal,

X15 oznacza aminokwas hydrofilowy,

X16 oznacza aminokwas hydrofobowy,

X17 oznacza aminokwas hydrofobowy,

X18 oznacza aminokwas zasdadowy, Gln (Q) albo Asn (N),

X19 oznacza aminokwas zasadowy, Gln (Q) albo Asn (N),

X20 oznacza aminokwas zasadowy,

X21 oznacza aminokwas alifatyczny, a

X22 oznacza aminokwas zasadowy.

Peptydy rdzeniowe o strukturze (I) są określone częściowo poprzez aminokwasy o oznaczonych klasach. Określenia różnych oznaczonych klas są podane w tekście w związku z opisem zmutowanych albo zmienionych postaci struktury (I).

W peptydach rdzeniowych o strukturze (I) symbol „-„ pomiędzy resztami aminokwasowymi Xn oznacza na ogół konstytutywną funkcję wiążącą szkieletu. Zatem symbol „-„ oznacza zwykle wiązanie peptydowe albo wiązanie amidowe (-C(O)NH-). Rozumie się jednak, że w niniejszym wynalazku bierze się pod uwagę analogi peptydowe, w których jedno albo więcej wiązań peptydowych jest ewentualnie zastąpione wiązaniem innym niż wiązanie amidowe, dogodnie podstawionym amidem albo izosterem amidu. Zatem, gdy różne reszty Xn wewnątrz struktury (I) opisuje się na ogół w kategoriach aminokwasów i zalecane rozwiązania przedstawia się przykładowo za pomocą peptydów, to dla specjalisty w tej dziedzinie jest oczywiste, że w rozwiązaniach, które mają wiązania nieamidowe, stosowane tu określenie „aminokwas" albo „reszta" dotyczy innych ugrupowań dwufunkcyjnych zawierających grupy podobne pod względem struktury do łańcuchów bocznych aminokwasów.

Do podstawionych amidów należą na ogół, lecz nie tylko, grupy o wzorze -C(O)NR-, w którym R oznacza (C1-C6)-alkil, podstawiony (C1-C6)-alkil, (C1-C6)-alkenyl, (C1-C6)-alkinyl, podstawiony (C1-C6)-alkinyl, (C5-C20)-aryl, podstawiony (C5-C26)-aryl, (C5-C26)-alkiloaryl, podstawiony (C5-C26)-alkiloaryl, 5-20-człoPL 196 675 B1 nowy heteroaryl, podstawiony 5-20-członowy heteroaryl, 6-26-członowy alkiloheteroaryl i podstawiony 6-26-członowy alkiloheteroaryl.

Do izosterów amidów należy na ogół, lecz nie tylko, CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH(cis i trans), -C(O)CH2, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Związki, które mają takie nieamidowe wiązania, oraz sposoby wytwarzania takich związków są dobrze znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Spatola, marzec 1983, Vega Data Vol. 1, wydanie 3; Spatola, 1983, „Peptide Backbone Modifications” in: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptide and Proteins, Weinstein, ed. Marcel Dekker, Nowy Jork, strona 267 (przegląd ogólny); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1:463-468; Hudson et al., 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, -CH2CH2); Spatola et al., 1986, Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1:307-314 (-CH=CH-, cis i trans); Almquist et al., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23:2533 (-COCH2-), europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 45665 (1982), CA 97;39405 (-CH (OH) CH2-); Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); i Hruby, 1982, Life Sci. 31:189-199 (-CH2S-).

Poza tym jedno albo więcej wiązań amidowych można zastąpić ugrupowaniami peptydomimetycznymi albo amidomimetycznymi, które nie zakłócają znacznie struktury albo aktywności peptydów. Odpowiednie ugrupowania amidomimetyczne są opisane na przykład przez Olsona et al., 1993, J. Med. Chem. 36:3039-3049.

Decydującą cechą peptydów rdzeniowych o strukturze (I) jest ich zdolność do tworzenia amfipatycznej helisy α w obecności lipidów. Przez określenie „amfipatyczny” rozumie się, że helisa α ma przeciwne hydrofilowe i hydrofobowe powierzchnie czołowe zorientowane wzdłuż jej osi, to jest z jednej powierzchni helisy wystają głównie hydrofilowe łańcuchy boczne, natomiast z przeciwnej powierzchni wystają głównie hydrofobowe łańcuchy boczne. Na fig. 1A i 1B przedstawiono w dwóch widokach ilustracyjnych przeciwne hydrofilowe i hydrofobowe powierzchnie czołowe przykładowej wyidealizowanej amfipatycznej helisy α. Na fig. 1A jest przedstawiony helikalny kołowy diagram Schiffera-Edmundsona (Schiffer-Edmundson, 1967, Biophys. J. 7:121-135). W kółku długa oś helisy jest prostopadła do strony. Wychodząc z końca N kolejne reszty aminokwasowe (przedstawione kółkami) są rozmieszczone promieniowo na obwodzie koła w przedziałach 100°. Zatem reszta aminokwasowa n+1 jest usytuowana o 100° od reszty n, reszta n+2 jest usytuowana o 100° od reszty n+1, itd. Przemieszczenie o 100° odpowiada 3,6 resztom aminokwasowym na jeden skręt, które obserwuje się typowo w wyidealizowanej helisie α. Na fig. 1A są wyraźnie widoczne przeciwne hydrofilowe i hydrofobowe powierzchnie czołowe helisy. Aminokwasy hydrofilowe są przedstawione w postaci otwartych kółek, natomiast reszty aminokwasów hydro-fobowych są przedstawione kółkami zacienionymi.

Na fig. 1B przedstawiono helikalny sieciowy diagram wyidealizowanej amfipatycznej helisy z fig. 1A (Lim, 1978, FEBS Lett. 89:10-14). W typowym helikalnym diagramie sieciowym helisa α jest przedstawiona w postaci cylindra, który został rozcięty wzdłuż środka swojej hydrofilowej powierzchni czołowej i spłaszczony. Zatem środek hydrofobowej powierzchni czołowej, wyznaczony za pomocą hydrofobowego momentu helisy (Eisenberg et al., 1982, Nature 299:371-374), leży w środku figury i jest zorientowany w taki sposób, ż e wychodzi z pł aszczyzny papieru. Ilustracja cylindra helisowego przed rozcięciem i spłaszczeniem jest przedstawiona na fig. 1C. Przez rozcinanie cylindra wzdłuż różnych płaszczyzn można obserwować w różnych widokach tę samą helisę amfipatyczną oraz uzyskiwać różne informacje o właściwościach helisy.

Amfipatyczna natura helisy α utworzonej przez rdzeniowe peptydy o strukturze (I) w obecności lipidów jest przedstawiona na fig. 2. Na fig. 2A przedstawiono helikalny diagram kołowy SchifferaEdmundsona, fig. 2B przedstawia helikalny diagram sieciowy ilustrujący hydrofobową powierzchnię czołową, a fig. 2C przedstawia helikalny diagram sieciowy ilustrujący hydrofilową powierzchnię czołową. Na każdej z fig. 2A, 2B i 2C reszty hydrofilowe są przedstawione otwartymi kółkami, a reszty hydrofobowe w postaci kółek zacienionych. Jak będzie omówione dokładniej niżej w związku ze zmodyfikowanymi albo zmutowanymi postaciami peptydów o strukturze (I), niektóre reszty aminokwasowe można zastępować innymi resztami aminokwasowymi, tak że hydrofilowe i hydrofobowe powierzchnie czołowe helisy utworzonej przez peptydy mogą nie być złożone całkowicie odpowiednio z aminokwasów hydrofilowych i hydrofobowych. Zatem rozumie się, że odnosząc się do amfipatycznej helisy α utworzonej przez rdzeniowe peptydy tu opisane, określenie „hydrofilowa powierzchnia czołowa" dotyczy powierzchni helisy, która ma ogólny charakter hydrofilowy netto. Określenie „hydrofobowa powierzchnia czołowa" dotyczy powierzchni peptydowej, która ma ogólny charakter hydrofobowy netto.

PL 196 675 B1

Nie mając zamiaru wiązać się z jakąkolwiek szczególną teorią sądzi się, że dla aktywności są istotne niektóre strukturalne i ewentualnie fizyczne właściwości amfipatycznej helisy utworzonej przez rdzeniowe peptydy o strukturze (I). Do tych właściwości należy stopień amfipatyczności, ogólna hydrofobowość, średnia hydrofobowość, kąt hydrofilowy i hydrofobowy, moment hydrofobowy, średni moment hydrofobowy i ładunek netto helisy α.

Jeżeli helisowe diagramy kołowe na fig. 1A dostarczają dogodnego środka dla uwidocznienia amfipatycznej natury rdzeniowych peptydów o strukturze (I), to stopień amfipatyczności (stopień asymetrii hydrofobowości) można dogodnie ocenić ilościowo przez obliczenie hydrofobowego momentu helisy (μ_Η). Sposoby obliczania μ_Η dla szczególnej sekwencji peptydowej są dobrze znane w tej dziedzinie i są opisane na przykład przez Eisenberga, 1984, Ann. Rev. Biochem. 53:595-623. Rzeczywisty μι_ι uzyskany dla szczególnego peptydu zależy od całkowitej liczby reszt aminokwasowych tworzących peptyd. Zatem na ogół nie jest żadną informacją bepośrednie porównywanie μΗ peptydów o różnych długościach.

Amfipatyczności peptydów o różnych długościach można porównywać bezpośrednio za pomocą średniego momentu hydrofobowego (<μΗ>). Średni moment hydrofobowy można otrzymać przez podzielenie μ.. przez liczbę reszt w helisie (to jest <ą_H> = <ą_H>/N). Na ogół peptydy rdzeniowe, które mają <μΗ> w granicach od 0,45 do 0,65, określone z zastosowaniem znormalizowanej zgodnej skali hydrofobowości Eisenberga (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142), uważa się za objęte zakresem niniejszego wynalazku, przy czym korzystny jest <μΗ> w zakresie od 0,50 do 0,60.

Ogólną albo całkowitą hydrofobowość (H_o) peptydu można dogodnie obliczyć przyjmując algebraiczną sumę hydrofobowości każdej aminokwasowej reszty w peptydzie (tzn.

H =Σ Hi i = 1 gdzie N jest liczbą reszt aminokwasowych w peptydzie, a HI jest hydrofobowością i-tej reszty aminokwasowej). Średnia hydrofobowość (<Ho>) jest hydrofobowością podzieloną przez liczbę reszt aminokwasowych (to jest <Ho> = Ho/N). Na ogół peptydy rdzeniowe, które mają średnią hydrofobowość w granicach od -0,50 do -0,070, oznaczoną z zastosowaniem znormalizowanej zgodnej skali hydrofobowości Eisenberga (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142), uważa się za objęte zakresem niniejszego wynalazku, przy czym zalecana jest średnia hydrofobowość w granicach od -0,030 do -0,055.

Całkowitą hydrofobowość hydrofobowej powierzchni czołowej (Ho^pho) helisy amfipatycznej można otrzymać biorąc sumę hydrofobowości hydrofobowych reszt aminokwasowych, które są objęte kątem hydrofobowym, jak określono niżej, _N to jest H0^ho =ΣΗ, gdzie H_i jest określone jak poprzednio ⁱ⁼¹ a NH jest całkowitą liczbą aminokwasów hydrofobowych w hydrofobowej powierzchni czołowej. Średnia hydrofobowość hydrofobowej powierzchni czołowej (<Ho^pho>) jest Ho^pho/NH, gdzie NH jest określone wyżej. Na ogół peptydy rdzeniowe, które mają <Ho^pho> w granicach od 0,90 do 1,20, określone z zastosowanie zgodnej skali hydrofobowości Eisenberga (Eisenberg, 1984, jak wyżej; Eisenberg et al., 1982, jak wyżej), uważa się za objęte zakresem niniejszego wynalazku, przy czym zalecane jest (<Ho^pho>) w granicach od 0,94 do 1,10.

Kąt hydrofobowy (kąt pho) jest na ogół określony jako kąt albo łuk pokryty przez najdłuższy ciągły odcinek hydrofobowych reszt aminokwasowych, gdy peptyd jest przedstawiony w helikalnym kole Schiffera-Edmundsona (to jest liczba przyległych reszt hydrofobowych na kole pomnożona przez 20°). Kąt hydrofilowy (kąt phi) jest różnicą pomiędzy 360° i kątem pho (to jest 360° i kąt pho). Dla specjalistów w tej dziedzinie jest widoczne, że kąty pho i phi zależą częściowo od liczby reszt aminokwasowych w peptydzie. Na przykład odnosząc się do fig. 5A i 5B widać, że do jednego obrotu helisowego kółka Schiffera-Edmundsona pasuje tylko 18 aminokwasów. Mniejsza liczba aminokwasów pozostawia przerwę w kole, natomiast więcej aminokwasów powoduje, że niektóre położenia na kółku są zajęte przez więcej niż jedną resztę aminokwasową.

W przypadku peptydów zawierających więcej niż 18 reszt aminokwasowych, takich jak rdzeniowe peptydy o strukturze (I), przez „ciągłe” rozciągnięcie hydrofobowych reszt aminokwasowych rozumie się, że co najmniej jeden aminokwas w położeniach wzdłuż koła zawierających dwa lub więcej aminokwasów jest aminokwasem hydrofobowym. Zatem odnosząc się do fig. 5B kąt pho jest łukiem pokrytym resztami 5, 16, 9, 2, 13, 6, 17, 10, 3 i 14 pomimo występowania reszty hydrofilowej w położeniu 20, ponieważ reszta w położeniu 2, która podziela to samo położenie na kółku, jest resztą hydroPL 196 675 B1 fobową. Peptydy rdzeniowe, które mają kąt pho w granicach od 160° do 220°, uważa się typowo jako objęte zakresem niniejszego wynalazku, przy czym zalecany jest kąt pho w granicach od 180° do 200°.

Niektóre strukturalne i ewentualnie fizyczne cechy rdzeniowych peptydów o strukturze (I) są przedstawione na fig. 3 i 4. Na fig. 3B przedstawiono helikalny diagram sieciowy przykładowego rdzeniowego peptydu według wynalazku, peptydu 4 (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO: 4), ilustrujący rozkład ładunku wzdłuż hydrofilowej czołowej powierzchni helisy. Na fig. 3B cylinder helikalny został rozcięty wzdłuż środka hydrofobowej powierzchni czołowej i spłaszczony. Trzy hydrofobowe reszty Leu (L), które zastępują hydrofilowe reszty w zgodnym 22-merycznym peptydzie Segresta (fig. 3A), są zacienione. Jak widać na fig. 3B, dodatnio naładowane reszty aminokwasowe są skupione na ostatnim C-terminalnym skręcie helisy (koniec C znajduje się na wierzchu strony). Nie wiążąc się ze szczególną teorią uważa się, że skupisko reszt zasadowych na końcu C stabilizuje helisę poprzez elektrostatyczne oddziaływanie ładunek (NH3⁺)-dipol helikalny. Uważa się także, że stabilizacja ma miejsce poprzez oddziaływania hydrofobowe pomiędzy lizynowymi łańcuchami bocznymi i rdzeniem helisy (patrz Groebke et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4025-4029; Esposito et al., 1997, Biopolymers 41:27-35).

Z wyjątkiem dodatnio naładowanego C-terminalnego skupiska ładunki ujemne są rozłożone na reszcie hydrofilowej powierzchni czołowej, z co najmniej jedną ujemnie naładowaną (kwaśną) resztą aminokwasową na skręt, co daje w wyniku ciągły odcinek ujemnych ładunków wzdłuż hydrofilowej czołowej powierzchni helisy. Jeden ładunek dodatni znajduje się na reszcie 7, która przyczynia się potencjalnie do stabilności helisy tworząc mostek solny z kwaśną resztą oddaloną o jeden skręt helisy.

Na fig. 4B przedstawiono helikalny diagram sieciowy ilustrujący hydrofobową czołową powierzchnię helisy amfipatycznej utworzonej przez przykładowy peptyd rdzeniowy 4 (SEQ ID NO: 4). Na fig. 4B helikalny cylinder jest rozcięty wzdłuż środka hydrofilowej powierzchni czołowej i spłaszczony. Hydrofobowa powierzchnia czołowa peptydu rdzeniowego składa się z dwóch hydrofobowych reszt na skręt, z wyjątkiem ostatniego skrętu C-terminalnego, w którym przeważają reszty zasadowe. Badania NMR wskazują, że reszty aminokwasowe 3, 6, 9 i 10 tego rdzeniowego peptydu tworzą hydrofobowe skupisko blisko N-terminalnego końca helisy. W środku tego skupiska znajduje się Phe-6 i sądzi się, że odgrywa ono ważną rolę w stabilizowaniu skupiska hydrofobowego.

Nie wiążąc się z żadną szczególną teorią sądzi się, że hydrofobowe skupisko utworzone przez reszty 3, 6, 9 i 10 jest istotne przy dokonywaniu wiązania lipidów i aktywacji LCAT. Na przykład, gdy przykładowy peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) wykazuje 93% aktywację LCAT w opisanym tu oznaczeniu, to pochodna peptydu 4 zawierająca resztę Lys (K) w położeniu 9 (peptyd 33, SEQ ID NO: 33), która niszczy skupisko hydrofobowe, wykazuje w tej samej próbie tylko 33% aktywację LCAT. Przewiduje się, że peptydy amfipatyczne wiążą fosfolipidy przez ustawienie ich hydrofobowych powierzchni czołowych w kierunku alkilowych łańcuchów ugrupowań lipidowych. Zatem uważa się, że to silnie hydrofobowe skupisko przyczynia się do silnego powinowactwa do lipidów obserwowanego w przypadku peptydów rdzeniowych tu opisanych. Ponieważ wiązanie lipidów jest wstępnym warunkiem aktywacji LCAT, to uważa się, że to hydrofobowe skupisko jest także istotne dla aktywacji LCAT.

Bardzo często stwierdza się, że reszty aromatyczne są ważne przy zakotwiczaniu się peptydów i białek do lipidów (De Kruijff, 1990, Biosci. Rep. 10:127-130; O'Neil i De Grado, 1990, Science 250:645-651; Blondelle et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1202:331-336). Zatem uważa się ponadto, że Phe-6, który znajduje się w środku hydrofobowego skupiska, może odgrywać także pewną rolę przy zakotwiczaniu peptydów rdzeniowych o strukturze (I) do lipidów.

Oddziaływania pomiędzy peptydami rdzeniowymi tu opisanymi i lipidami prowadzą do utworzenia kompleksów peptyd-lipid. Jak przedstawiono na fig. 11A, rodzaj otrzymanego kompleksu (komicelle, dyski, pęcherzyki albo warstwy wielokrotne) zależy od molowego stosunku lipid:peptyd, przy czym komicelle tworzą się na ogół przy niskich stosunkach molowych lipid:peptyd, natomiast kompleksy pęcherzykowe i wielowarstwowe tworzą się przy zwiększających się stosunkach molowych lipidipeptyd. Ta cecha została opisana w przypadku peptydów amfipatycznych (Epand, The Amphipathic Helix, 1993) i w przypadku ApoA-I (Jones, 1992, Structure and Function of Apolipoproteins, rozdział 8, strony 217-250). Stosunek molowy lipid:peptyd wyznacza także wielkość i skład kompleksów (patrz Sekcja 5.3.1, niżej).

Długa oś helisy α utworzonej przez peptydy rdzeniowe o strukturze (I) ma na ogół kształt zakrzywiony. W przypadku typowych helis amfipatycznych ustalono, że długości wiązań wodorowych i hydrofobowe powierzchnie czołowe zmieniają się w taki sposób, że strona hydrofobowa helisy jest wklęsła (Barlow i Thornton, 1988, J. Mol. Biol. 201:601-619; Zhou et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 33:11174-11183; Gesell et al., 1997, J. Biomol. NMR 9:127-135). Nie zamierzając wiązać się z teorią

PL 196 675 B1 uważa się, że ogólna krzywizna hydrofobowej czołowej powierzchni helisy może mieć znaczenie przy wiązaniu kompleksów dyskoidalnych. Zakrzywiona helisa umożliwia peptydowi lepiej „dopasować się” do brzegów cząstek dyskoidalnych, zwiększając przez to trwałość kompleksu peptyd-dysk.

W ogólnie przyjętym strukturalnym modelu ApoA-I amfipatyczne helisy a są upakowane dookoła brzegów dyskoidalnego HDL (patrz fig. 11B). Przypuszcza się, że w tym modelu helisy są ustawione swoimi hydrofobowymi czołowymi powierzchniami w kierunku lipidowych łańcuchów acylowych (Brasseur et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1043:245-252). Helisy są rozmieszczone przeciwrównolegle i przypuszcza się, że efekt współdziałania pomiędzy helisami przyczynia się do trwałości dyskoidalnego kompleksu HDL (Brasseur et al., jak wyżej). Zaproponowano, że aby jednym z czynników, które przyczyniają się do trwałości dyskoidalnego kompleksu HDL, było istnienie oddziaływań jonowych pomiędzy kwaśnymi i zasadowymi resztami powstałymi w wyniku utworzenia się międzycząsteczkowych mostków solnych albo wiązań wodorowych pomiędzy resztami na przyległych przeciwrównoległych helisach. W tym modelu peptydów nie uważa się za pojedyncze jednostki, lecz jako oddziaływujące z co najmniej dwiema sąsiadującymi cząsteczkami peptydowymi (fig. 11B).

Na ogół przyjmuje się także, że tworzenie się między-cząsteczkowego wiązania wodorowego albo mostka solnego pomiędzy resztami kwaśnymi i zasadowymi, odpowiednio w położeniach i oraz i+3 helisy, stabilizuje strukturę helisową (Marqusee et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(24):8898-8902).

Zatem dodatkowymi kluczowymi cechami peptydów rdzeniowych o strukturze (I) jest ich zdolność do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych z innym peptydem, gdy są one ustawione przeciwrównolegle ich hydrofobowymi powierzchniami czołowymi w tym samym kierunku, tak aby zaistniał przypadek, w którym peptydy są związane z lipidami (na przykład pomiędzy kwaśnymi resztami w położeniu 4 i 8 i zasadowymi resztami w położeniu 18, 20 i 22), oraz także ich zdolność do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych albo mostków solnych w pobliżu końca N i C helisy (na przykład pomiędzy kwaśnymi i zasadowymi resztami w położeniach 4 i 7 oraz 15 i 18).

Zdolność peptydów rdzeniowych o strukturze (I) do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych jest przedstawiona na fig. 6A. Na fig. 6A dwie wyidealizowane helisy a przykładowego rdzeniowego peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) są ustawione przeciwrównolegle swoimi odpowiednimi hydrofobowymi powierzchniami czołowymi w tym samym kierunku (poza płaszczyznę strony). Oddziaływania wiązań wodorowych mogłyby mieć miejsce pomiędzy resztami E-8 i Q-19 (Huyghues-Despointes et al., 1995, Biochemistry 34 (41) :13267-13271).

Co więcej, gdy helisy są ustawione w taki przeciw-równoległy sposób, to są ściśle upakowane i nie ma przeszkody sterycznej przeszkadzającej ścisłemu kontaktowi pomiędzy helisami. Zmiany sekwencji peptydów rdzeniowych, które wpływają na upakowanie helis, wpływają ujemnie na aktywność peptydów rdzeniowych. Na przykład odnosząc się do fig. 6B, dimer peptydów, w których Gln-19 zastąpiono przez Glu-19 (peptyd 102; PVLDLFRELLNLXLEALKEKLK, gdzie X oznacza Aib; SEQ ID NO: 102), i które nie mogą zatem tworzyć międzycząsteczkowych wiązań wodorowych, nie aktywował LCAT. Znaczące jest, że gdy peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) wykazywał 93% aktywację LCAT w opisanym tu oznaczeniu, to peptyd 102 (SEQ ID NO: 102) wykazywał w tej samej próbie aktywność tylko 2%.

Zatem, nie wchodząc w żadną szczególną teorię, uważa się, że zdolność peptydów rdzeniowych o strukturze (I) do ścisłego upakowania i jonowego oddziaływania z utworzeniem wewnątrz - i ewentualnie międzycząsteczkowych mostków solnych i ewentualnie wiązań wodorowych, gdy są one związane z lipidami w sposób przeciwrównoległy, jest ważną cechą peptydów rdzeniowych według wynalazku.

Uważa się, że zdolność peptydów rdzeniowych do tworzenia zalecanych międzycząsteczkowych oddziaływań peptyd-peptyd ma znaczenie przy braku lipidów. Peptydy rdzeniowe tu opisane ulegają samoasocjacji, częściowo na skutek ich wysokiego <μ_Μ>, <H_o> i kąta hydrofobowego (patrz Tabela I, niżej). Zjawisko samoasocjacji zależy od warunków pH, stężenia peptydów i siły jonowej i może dać w wyniku szereg stanów asocjacyjnych, od postaci monomerycznej do kilku postaci multimerycznych (fig. 11A). Rdzeń hydrofobowy agregatów peptydowych sprzyja hydrofobowym oddziaływaniom z lipidami. Zdolność peptydów do agregacji nawet przy bardzo niskich stężeniach może sprzyjać ich wiązaniu się z lipidami. Uważa się, że w rdzeniu agregatów peptydowych mają także miejsce oddziaływania peptyd-peptyd i mogą one konkurować z oddziaływaniami lipid-peptyd.

Poza wyżej opisanymi właściwościami uważa się, że dla aktywności są również istotne inne parametry, włącznie z całkowitą liczbą reszt hydrofobowych, całkowitą liczbą reszt naładowanych i ładunkiem netto peptydów.

Podsumowanie zalecanych fizycznych i strukturalnych właściwości peptydów rdzeniowych o strukturze (I) jest przedstawione niżej w Tabeli I.

PL 196 675 B1

T a b e l a I

Fizyczne właściwości zalecanych agonistów ApoA-I o strukturze (I)

Właściwość	Zakres	Zalecany zakres
% Aminokwasów hydrofobowych	40 - 70	50 - 60
<Ho>	-0,050 do - 0,070	-0,030 do - 0,055
<Ho^pho>	0,90 - 1,2	0,94 - 1,1
< μH >	0,45 - 0,65	0,50 - 0,60
Kąt pho	160° - 220°	180° - 200°
# Aminokwasy naładowane dodatnio	3 - 5	4
# Aminokwasy naładowane ujemnie	3 - 5	4
Ładunek netto	-1 do +1	0
Skupisko hydrofobowe	Położenia 3, 6, 9, 10 są aminokwasami hydrofobowymi
Skupisko kwaśne	Co najmniej 1 kwaśny aminokwas na skręt, z wyjątkiem ostatnich 5 aminokwasów C-terminalnych
Skupisko zasadowe	Co najmniej 3 zasadowe aminokwasy w ostatnich 5 aminokwasach C-terminalnych

Właściwości amfipatycznych helis α utworzonych przez peptydy rdzeniowe tu opisane różnią się znacznie od właściwości amfipatycznych helis α klasy A, a zwłaszcza od helis α klasy A zgodnego 22-merycznego peptydu Segresta. Te różnice są przedstawione za pomocą przykładowego peptydu rdzeniowego 4 (SEQ ID NO: 4) na fig. 3-5.

Co się tyczy fig. 4A i 4B, to widać, że hydrofobowa powierzchnia czołowa peptydu 4 ma charakter o wiele bardziej hydrofobowy niż hydrofobowa powierzchnia czołowa 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta. W szczególności reszty 5, 9 i 13 (zacieniony obszar na fig. 4B) są hydrofobowymi resztami Leu (L) w peptydzie 4 (SEQ ID NO: 4) w porównaniu z naładowanymi resztami w zgodnym 22merycznym peptydzie (SEQ ID NO: 75). Zastąpienie tych trzech naładowanych reszt w 22-merowym peptydzie najwyższej zgodności Segresta hydrofobowymi resztami Leu (L) prowadzi do znacznych różnic w amfipatyczriości, hydrofobowości, kącie pho i innych właściwości helisy.

Porównanie fizycznych i strukturalnych właściwości dwóch przykładowych peptydów rdzeniowych o strukturze (I), peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) i peptydu 8 (SEQ ID NO: 8) oraz 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO: 75) jest przedstawione niżej w Tabeli II:

T a b e l a II

Porównanie właściwości przykładowych peptydów rdzeniowych ze zgodnym 22-merycznym peptydem Segresta

Właściwość	Peptyd najwyższej zgodności	Peptyd 4	Peptyd 8
1	2	3	4
# Aminokwasów	22	22	22
# Aminokwasów hydrofilowych	13	10	10
# Aminokwasów hydrofobowych	9	12	12
% Aminokwasów hydrofobowych	41	55	55
<Ho>	-0,293	-0,013	-0,040
<Ho^pho>	0,960	0,990	0,940
^H>	0,425	0,547	0,521

PL 196 675 B1 cd. tabeli II

1	2	3	4
Kąt pho	100°	200°	200°
# Aminokwasów naładowanych dodatnio	5	4	4
# Aminokwasów naładowanych ujemnie	6	4	4
Ładunek netto	-1	0	0

Najbardziej godne uwagi jest to, że peptydy rdzeniowe o strukturze (I) mają większy udział procentowy reszt hydrofobowych, mają znacznie większe <H_o> i <μκι> oraz mają dwukrotnie większy kąt pho (patrz fig. 5A i 5B). Te różnice właściwości prowadzą do znacznych różnic aktywności. O ile 22-merowy peptyd najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO: 75) wykazuje tylko 10% aktywację LCAT w porównaniu z naturalną ApoA-I w opisanych tu oznaczeniach, to peptydy 4 (SEQ ID NO: 4) i 8 (SEQ ID NO: 8) wykazują odpowiednio 93% i 83% aktywację LCAT w porównaniu z naturalnym ApoA-I w takich samych próbach. Peptyd 1 (PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK, SEQ ID NO: 1) i peptyd 2 (GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK, SEQ ID NO: 2) wykazywały odpowiednio 120% i 105% aktywacji LCAT w porównaniu z naturalnym ApoA-I w takich samych oznaczeniach.

Niektóre reszty aminokwasowe w peptydach rdzeniowych o strukturze (I) można zastąpić innymi resztami aminokwasowymi bez znacznego pogorszenia wpływu, a w wielu przypadkach nawet polepszenia, na aktywność peptydów. Zatem można wziąć pod uwagę także zmodyfikowane albo zmutowane postacie peptydów rdzeniowych o strukturze (I), w których co najmniej jedna określona reszta aminokwasowa w strukturze jest podstawiona inną resztą aminokwasowa. Ponieważ uważa się, że jedną z decydujących cech wpływających na aktywność peptydów rdzeniowych tu opisanych jest ich zdolność do tworzenia w obecności lipidów helis α, które mają opisane wyżej amfipatyczne i inne właściwości, to widać, że w zalecanych rozwiązaniach podstawienia aminokwasowe mają charakter konserwatywny, to znaczy zastępowana reszta aminokwasowa daje fizyczne i chemiczne właściwości, które są podobne do właściwości zastępowanej reszty aminokwasowej.

Dla określenia konserwatywnych podstawień aminokwasowych aminokwasy można dogodnie zaklasyfikować do dwóch głównych kategorii, aminokwasów hydrofilowych i hydrofobowych, przede wszystkim w zależności od fizykochemicznych cech bocznego łańcucha aminokwasu. Te dwie główne kategorie można dalej zaklasyfikować do dwóch podkategorii, które w sposób bardziej zróżnicowany określają cechy charakterystyczne łańcuchów bocznych aminokwasów. Na przykład klasę aminokwasów hydrofilowych można dalej podzielić na aminokwasy kwaśne, zasadowe i polarne. Klasę aminokwasów hydrofobowych można podzielić dalej na aminokwasy niepolarne i aromatyczne. Określenia różnych kategorii aminokwasów, które wyznaczają strukturę (I), są następujące:

„Aminokwas hydrofilowy” oznacza aminokwas, który ma hydrofobowość mniejszą niż zero według znormalizowanej zgodnej skali hydrofobowości Eisenberga et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Genetycznie zakodowane aminokwasy hydrofilowe zawierają Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys (K) i Arg (R).

„Aminokwas kwaśny” oznacza aminokwas hydrofilowy, którego wartość pK łańcucha bocznego jest mniejsza niż 7. Aminokwasy kwaśne mają typowo ujemnie naładowane łańcuchy boczne przy fizjologicznym pH na skutek utraty jonu wodorowego. Genetycznie zakodowane kwaśne aminokwasy zawierają Glu (E) i Asp (D).

„Aminokwas zasadowy” oznacza aminokwas hydrofilowy, którego wartość pK łańcucha bocznego jest większa niż 7. Aminokwasy zasadowe mają typowo dodatnio naładowane łańcuchy boczne w fizjologicznym środowisku pH na skutek asocjacji z jonem hydroniowym. Genetycznie zakodowane aminokwasy zasadowe zawierają His (H), Arg (R) i Lys (K).

„Aminokwas polarny” oznacza aminokwas hydrofilowy, który ma łańcuch boczny, który jest nienaładowany przy fizjologicznym pH, lecz który ma co najmniej jedno wiązanie, w którym para elektronów przypisanych wspólnie dwóm atomom jest trzymana bardziej przez jeden z atomów. Genetycznie zakodowane aminokwasy polarne zawierają Asn (N), Gln (Q), Ser (S) i Thr (T).

„Aminokwas hydrofobowy” oznacza aminokwas wykazujący hydrofobowość większą niż zero według znormalizowanej zgodnej skali hydrofobowości Eisenberga, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142.

PL 196 675 B1

Genetycznie zakodowane aminokwasy hydrofobowe zawierają Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (W), Met (M), Ala (A), Gly (G), i Tyr (Y).

„Aminokwas aromatyczny” oznacza aminokwas hydrofobowy z łańcuchem bocznym, który ma co najmniej jeden aromatyczny albo heteroaromatyczny pierścień. Aromatyczny albo heteroaromatyczny pierścień może zawierać jeden albo więcej podstawników, takich jak -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(O) R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR, itp., w których każdy R oznacza niezależnie (C1-6)-alkil, podstawiony (C1-C6)-alkil, (C1-C6)-alkenyl, podstawiony (C1-C6)-alkenyl, (C1-C6)-alkinyl, podstawiony (C1-C6)-alkinyl, (C5-C20)-aryl, podstawiony (C5-C20)-aryl, (C6-C26)-alkiloaryl, podstawiony (C6-C26)-alkiloaryl, 5-20-członowy heteroaryl, podstawiony 5-20-członowy heteroaryl, 6-26-członowy alkiloheteroaryl albo podstawiony 6-26-członowy alkiloheteroaryl. Genetycznie zakodowane aminokwasy aromatyczne zawierają Phe (F), Tyr (Y) i Trp (W).

„Aminokwas niepolarny” oznacza aminokwas hydrofobowy, który ma łańcuch boczny, który jest nienaładowany przy fizjologicznym pH i który ma wiązania, w których para elektronów przypisana wspólnie dwóm atomom jest na ogół utrzymywana równo przez każdy z dwóch atomów (to jest łańcuch boczny jest niepolarny). Genetycznie zakodowane aminokwasy niepolarne zawierają Leu (L), Val (V), Ile (I), Met (M), Gly (G) i Ala (A).

„Aminokwas alifatyczny” oznacza aminokwas hydrofobowy, który ma alifatyczny węglowodorowy łańcuch boczny.

Genetycznie zakodowane aminokwasy alifatyczne zawierają Ala (A), Val (V), Leu (L) i Ile (I).

Reszta aminokwasowa Cys (C) jest niezwykła w tym sensie, że może tworzyć mostki dwusiarczkowe w innymi resztami Cys (C) albo innymi aminokwasami zawierającymi sulfanyl. Zdolność reszt Cys (C) (i innych aminokwasów z zawierającymi -SR łańcuchami bocznymi) do istnienia w peptydzie albo w postaci zredukowanego wolnego -SH albo w postaci utlenionego dwusiarczkowego mostka ma wpływ na to, czy reszty Cys (C) przyczyniają się do hydrofobowego albo hydrofilowego charakteru netto peptydu. Gdy Cys (C) wykazuje hydrofobowość 0,29 według znormalizowanej zgodnej skali Eisenberga (Eisenberg, 1984, jak wyżej), to należy rozumieć, że dla celów niniejszego wynalazku Cys (C) można zaszeregować jako polarny aminokwas hydrofilowy, niezależnie od określonej wyżej klasyfikacji ogólnej.

Jak mogą ocenić specjaliści w tej dziedzinie, wyżej określone kategorie nie wykluczają się wzajemnie. Zatem aminokwasy, które mają łańcuchy boczne, które wykazują dwie albo więcej właściwości fizykochemicznych, mogą należeć do kilku kategorii. Na przykład łańcuchy boczne aminokwasów, które mają ugrupowania aromatyczne, które są dalej podstawione podstawnikami polarnymi, takimi jak Tyr (Y) mogą przejawiać zarówno aromatyczne właściwości hydrofobowe, jak i właściwości polarne albo hydrofilowe, a zatem mogą należeć zarówno do kategorii aromatycznej, jak i polarnej.

Niektóre reszty aminokwasowe, nazywane aminokwasami „przerywającymi helisę”, mają skłonność do przerywania struktury helisy a, gdy zajmują wewnętrzne położenia wewnątrz helisy. Reszty aminokwasowe wykazujące takie właściwości przerywania helisy są dobrze znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Cou and Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276) i zawierają Pro (P), Gly (G) i potencjalnie wszystkie D-aminokwasy (gdy są zawarte w L-peptydzie, i odwrotnie, L-aminokwasy przerywają strukturę helisową, gdy są zawarte w D-peptydzie). Gdy te reszty aminokwasowe przerywające helisę należą do określonych wyżej kategorii, z wyjątkiem Gly (G) (omówionej niżej), to nie powinny być one stosowane do zastępowania reszt aminokwasowych w wewnętrznych położeniach wewnątrz helisy i powinny być wykorzystywane tylko do podstawiania 1-3 reszt aminokwasowych na końcu N i ewentualnie końcu C peptydu.

Gdy wyżej określone kategorie zostały przedstawione na przykładach w kategoriach aminokwasów zakodowanych genetycznie, to podstawienia aminokwasowe nie muszą, a w niektórych rozwiązaniach nie są ograniczone do aminokwasów zakodowanych genetycznie. W rzeczywistości wiele zalecanych peptydów o strukturze (I) zawiera aminokwasy niekodowane genetycznie. Zatem poza naturalnie występującymi aminokwasami zakodowanymi genetycznie reszty aminokwasowe w peptydach rdzeniowych o strukturze (I) mogą być podstawione naturalnie występującymi, niezakodowanymi aminokwasami i aminokwasami syntetycznymi.

Niektóre powszechnie napotykane aminokwasy, które zapewniają użyteczne podstawienia dla peptydów rdzeniowych o strukturze (I), zawierają, lecz nie tylko, β-alaninę (β-Ala) albo inne omegaaminokwasy, takie jak kwas 3-aminopropionowy, kwas 2,3-dwuaminopropionowy (Dpr), kwas 4-aminomasłowy, itd.; kwas α-aminoizomasłowy (Aib); kwas ε-aminopentanokarboksylowy (Aha); kwas δ-walerianowy (Ava); N-metyloglicyna albo sarkozyna (MeGly), ornityna (Orn), cytrulina (Cit); t-butyloalanina

PL 196 675 B1 (t-BuA); t-butyloglicyna (t-BuG); N-metyloizoleucyna (Melle), fenyloglicyna (Phg); cykloheksyloalanina (Cha); norleucyna (Nie); naftylo-alanina (Nal); 4-chlorofenyloalanina (Phe(4-Cl)); 2-fluorofenyloalanina (Phe(2-F)); 3-fluorofenyloalanina (Phe(3-F)); 4-fluoroalanina (Phe(4-F)); penicylamina (Pen); kwas

1,2,3,4-czterowodoroizochinolino-3-karboksylowy (Tic); β-2-tienyloalanina (Thi); sulfotlenek metioniny (MSO); homoarginina (hArg); N-acetylolizyna (AcLys); kwas 2,4-dwuaminomasłowy (Dbu); kwas

2,3-dwuaminomasłowy (Dab); p-aminofenyloalanina (Phe(pNH2)); N-metylowalina (MeVal); homocysteina (hCys), homofenyloalanina (hPhe) i homoseryna (hSer); hydroksyprolina (Hyp), homoprolina (hPro), N-metylowane aminokwasy i pentoidy (N-podstawione glicyny).

Klasyfikacje genetycznie zakodowanych i zwykłych niezakodowanych aminokwasów według określonych wyżej kategorii zebrano niżej w Tabeli III. Rozumie się, że Tabela III jest przeznaczona tylko do celów ilustracyjnych i nie oznacza wyczerpującej listy reszt aminokwasowych, które mogą być wykorzystane do podstawiania opisanych tu peptydów rdzeniowych. Inne nie wymienione tu specyficznie reszty aminokwasowe można łatwo zaliczyć do odpowiedniej kategorii w oparciu o ich zaobserwowane właściwości fizyczne i chemiczne w świetle podanych tu określeń.

T a b e l a III

Klasyfikacje powszechnie napotykanych aminokwasów

Klasyfikacja	Aminokwasy kodowane Aminokwasy genetycznie niezakodowane genetycznie
Hydrofobowe
Aromatyczne	F, Y, W	Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe (4-F), hPhe
Niepolarne	L, V, I, M, G, A, P	t-BuA, t-BuG, Melle, Nle, MeVal, Cha, McGly, Aib
Alifatyczne	A, V, L, I	b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG, Melle, Cha, Nie, MeVal
Hydrofilowe
Kwaśne	D, E
Zasadowe	H, K, R	Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH₂), Dbu, Dab
Polarne	C, Q, N, S, T	Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer
Przerywające helisę	P, G	D-Pro i inne D-aminokwasy (w L-peptydach)

Jakkolwiek w większości przypadków aminokwasy peptydów rdzeniowych o strukturze (I) są podstawiane L-enancjomerycznymi aminokwasami, to podstawienia nie są ograniczone do aminokwasów L-enancjomerycznych. Zatem określeniem postacie „zmutowane” albo „zmodyfikowane” są objęte także te sytuacje, w których L-aminokwas jest zastąpiony identycznym D-aminokwasem (na przykład L-Arg----> D-Arg) albo D-aminokwasem tej samej kategorii albo subkategorii (na przykład

L-Arg----> D-Lys) i odwrotnie. W rzeczywistości w niektórych zalecanych rozwiązaniach, które nadają się do podawania doustnego zwierzętom, peptydy mogą być dogodnie złożone z co najmniej jednego D-enancjomerycznego aminokwasu. Uważa się, że peptydy zawierające takie D-aminokwasy są bardziej odporne na rozkład w jamie ustnej, jelicie albo surowicy niż peptydy złożone wyłącznie z L-aminokwasów.

Jak wspomniano wyżej, D-aminokwasy mają skłonność do przerywania struktury helis α, gdy znajdują się w wewnętrznych położeniach α-helisowego L-peptydu. Co więcej, zaobserwowano, że niektóre zmutowane postacie petydów rdzeniowych o strukturze (I), które są złożone całkowicie z D-aminokwasów, wykazują znacznie niższą aktywację w opisanych tu oznaczeniach niż identyczne peptydy złożone całkowicie z L-aminokwasów. Skutkiem tego D-aminokwasy nie powinny być wykorzystywane do podstawiania wewnętrznych L-aminokwasów. Podstawienia D-aminokwasowe powinny być ograniczone do 1-3 reszt aminokwasowych na końcu N i ewentualnie końcu C peptydu.

Jak omówiono poprzednio, aminokwas Gly (G) działa na ogół jako reszta przerywającą helisę, gdy jest zawarty w wewnętrznych położeniach peptydu. Całkiem niespodziewanie twórcy wynalazku stwierdzili, że gdy helikalna struktura peptydów rdzeniowych tu opisanych jest przerwana przy braku

PL 196 675 B1 lipidów, gdy wewnętrzne reszty aminokwasowe są podstawione przez Gly (G), to w obecności lipidów takie peptydy zawierające Gly (G) wykazują znaczącą strukturę helikalną oraz aktywność. Na przykład, gdy peptyd 8 (SEQ ID NO: 8) ma tylko 20% struktury helikalnej w buforze, to zaobserwowano 61-93% struktury helikalnej w obecności lipidów i 93% struktury helikalnej w obecności trójfluoroetanolu (TFE). Strukturę helisową tego peptydu w obecności TFE potwierdzono drogą NMR (patrz Sekcja 7.3.5., niżej). W szczególności ten peptyd wykazywał także 83% aktywacji LCAT. Inne peptydy rdzeniowe zawierające wewnętrzne reszty glicynowe także wykazywały > 38% aktywacvji LCAT (patrz na przykład Tabela X, Sekcja 8.3, niżej). Zatem chociaż na ogół Gly (G) uważa się za resztę przerywającą helisę, to Gly (G) można wykorzystać do podstawiania aminokwasów w wewnętrznych położeniach peptydów rdzeniowych o strukturze (I). Dogodnie za pomocą Gly (G) podstawia się dogodnie tylko wewnętrzne reszty znajdujące się wewnątrz około ± 1 skrętu helisy od środka peptydu (zwłaszcza w przypadku peptydów złożonych z parzystej liczby aminokwasów). Ponadto jest zalecane, aby w peptydzie przez Gly (G) była podstawiona tylko jedna wewnętrzna reszta aminokwasowa. Zalecane rozwiązania agonistów ApoA-I według wynalazku, zawierających wewnętrzne glicyny, są opisane w Sekcji 5.1.2., niżej.

Stosując opisane wyżej klasyfikacje reszt amino-kwasowych w połączeniu z helikalnym, kołowym przedstawieniem Schiffera-Edmundsona i helikalnym diagramem sieciowym, jak również ze szczegółowym opisem przedstawionych tu pożądanych właściwości, łatwo można otrzymać zmodyfikowane albo poddane mutacji postacie peptydów rdzeniowych o strukturze (I), które zachowują w zasadzie amfipatyczne i inne właściwości helisy i które uważa się zatem za objęte zakresem niniejszego wynalazku.

W zalecanym rozwiązaniu zmodyfikowane albo poddane mutacji postacie peptydów rdzeniowych o strukturze (I) otrzymuje się przez określenie stałych hydrofilowych albo hydrofobowych reszt według struktury (I) i podstawienie co najmniej jednej niezstałej reszty innym aminokwasem, dogodnie aminokwasem tej samej kategorii albo subkategorii. Można także ustalić stałe reszty zawierające zasadowe i ewentualnie hydrofobowe skupiska i podstawić co najmniej jedną resztę niestałą.

W innym zalecanym rozwiązaniu zmodyfikowane albo poddane mutacji postacie peptydów rdzeniowych o strukturze (I) otrzymuje się poprzez określenie hydrofilowych reszt aminokwasowych usytuowanych wewnątrz hydrofilowej powierzchni czołowej helisy według struktury (I) i podstawienia co najmniej jednej niestałej reszty amino-kwasowej innym aminokwasem, dogodnie inną resztą aminokwasową tej samej kategorii albo subkategorii. Co się tyczy fig. 2A, to widać, że reszty 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 i 22 są usytuowane wewnątrz hydrofilowej powierzchni czołowej amfipatycznej helisy utworzonej przez peptydy rdzeniowe o strukturze (I). Ze wszystkich tych reszt wszystkie są hydrofilowe z wyjątkiem reszty 1, która może być hydrofilowa albo hydrofobowa. Zatem w jednym z zalecanych rozwiązań reszty 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 i 22 są związane według struktury (I), natomiast co najmniej jedna z reszt 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 i 21 jest podstawiona innym aminokwasem tej samej kategorii, dogodnie innym aminokwasem tej samej subkategorii. Alternatywnie reszta 1 jest także związana według struktury (I), a co najmniej jedna z reszt 2, 3, 5, 6, 10, 13, 14, 16, 17, 20 i 21 jest podstawiona jak opisano wyżej.

W szczególnie zalecanym rozwiązaniu C-terminalne skupisko zasadowe (reszty 18, 19, 20 i 22) jest także stałe zgodnie ze strukturą (I), a podstawione są tylko reszty 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17 i ewentualnie 21.

W innym szczególnie zalecanym rozwiązaniu stałe jest także skupisko hydrofobowe, a podstawione tylko reszty 2, 5, 13, 14, 16, 17, 20 i ewentualnie 21.

W jeszcze innym zalecanym rozwiązaniu stałe są skupiska zarówno zasadowe, jak i hydrofobowe, natomiast podstawione tylko reszty 2, 5, 13, 14, 16, 17 i ewentualnie 21.

W innym, zalecanym rozwiązaniu zmodyfikowane albo poddane mutacji postacie peptydów rdzeniowych tu opisanych otrzymuje się przez określenie stałych hydrofobowych reszt aminokwasowych usytuowanych na hydrofobowej powierzchni czołowej helisy i podstawienie co najmniej jednej niestałej reszty aminokwasowej inną resztą aminokwasową, dogodnie inną resztą tej samej kategorii albo subkategorii.

Co się tyczy fig. 2A, to widać, że reszty 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 i 21 są usytuowane na hydrofobowej powierzchni czołowej. Z tych reszt wszystkie są resztami hydrofobowymi z wyjątkiem reszty 20, która jest resztą hydrofilową. Zatem w jednym z zalecanych rozwiązań reszty 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17 i 21 są stałe zgodnie ze strukturą (I), a co najmniej jedna z reszt 1, 4, 7, 8, 11, 12,

PL 196 675 B1

15, 18, 19, 20 i 22 jest podstawiona inną resztą aminokwasową, dogodnie innym aminokwasem tej samej kategorii albo subkategorii.

W szczególnie zalecanym rozwiązaniu stałe jest także C-terminalne skupisko zasadowe, a podstawione są tylko reszty 1, 4, 7, 8, 11, 12 i ewentualnie 15.

W innym rozwiązaniu zmodyfikowane albo poddane mutacji postacie peptydów o strukturze (I) otrzymuje się drogą związania wszystkich reszt aminokwasowych znajdujących się na hydrofilowej albo hydrofobowej powierzchni czołowej helisy i podstawienie, dogodnienie konserwatywnie, co najmniej jednej reszty aminokwasowej znajdującej się na innej powierzchni czołowej inną resztą aminokwasową. Reszty stanowiące skupisko hydrofobowe i ewentualnie skupisko zasadowe mogą ewentualnie także być stałe zgodnie ze strukturą (I), jak określono poprzednio.

W innym zalecanym rozwiązaniu zmodyfikowane albo poddane mutacji postacie peptydów o strukturze (I) otrzymuje się drogą podstawiania co najmniej jednego aminokwasu aminokwasem niekonserwatywnym. Dla specjalisty w tej dziedzinie jest oczywiste, że takie podstawienia nie powinny zasadniczo zmieniać amfipatycznych i ewentualnie strukturalnych właściwości omówionej wyżej helisy. Zatem w pewnych okolicznościach może być pożądane podstawienie jednej albo więcej par aminokwasów zachowując wypadkowe właściwości helisy. Dalsze wskazówki przewodnie co do wybierania właściwych podstawień aminokwasowych są podane w sekwencjach peptydów zebranych w Tabeli X (patrz Sekcja 8.3, niżej).

W jeszcze innym rozwiązaniu reszty aminokwasowe od 1 do 4 na końcu N i ewentualnie na końcu C peptydów rdzeniowych o strukturze (I) są podstawione jedną albo więcej niż jedną resztą aminokwasową albo jednym albo więcej niż jednym segmentem peptydowym, o których wiadomo, że nadają stabilność obszarom α-helikalnej struktury drugorzędnej (reszty „koniec-czapeczka” albo segmenty końcowe). Takie reszty i segmenty końcowe są dobrze znane w technice (patrz na przykład Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(20):7605-7609; Dasgupta i Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Seale et al., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18:1-7; Doig i Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35:387-397; Doig et al., Protein Science 6:147-155). Alternatywnie pierwsze jedne do czterech N-terminalnych i ewentualnie C-terminalnych reszt aminokwasowych o strukturze (I) można zastąpić ugrupowaniami peptydomimetycznymi, które naśladują strukturę i ewentualnie właściwości takich reszt „koniec-czapeczka" albo segmentów. Odpowiednie końcowe peptydy naśladowcze są dobrze znane w tej dziedzinie i są opisane na przykład przez Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32 (30) :7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Seale et al., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18:1-86 7; Doig and Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35: 387-397; Doig et al., 1997, Protein Science 6:147-155).

Jakkolwiek struktura (I) zawiera 22 specyficzne położenia reszt aminokwasowych, to rozumie się, że peptydy rdzeniowe tu opisane mogą zawierać mniej niż 22 reszty aminokwasowe. W rzeczywistości postacie obcięte albo z wewnętrznymi delecjami o strukturze (I) mogą zawierać tylko 18 albo 15 reszt aminokwasowych, które w zasadzie zachowują wszystkie cechy charakterystyczne i właściwości amfipatycznej helisy utworzonej przez peptydy rdzeniowe o strukturze (I).

Obcięte postacie peptydów o strukturze (I) otrzymuje się przez poddawanie delecji jednego albo więcej aminokwasów z końca N i ewentualnie końca C struktury (I). Postacie z delecjami wewnętrznymi struktury (I) otrzymuje się przez poddanie delecji jednego albo więcej aminokwasów usytuowanych w położeniach wewnętrznych peptydu o strukturze (I). Poddane delecji wewnętrzne reszty aminokwasowe mogą, ale nie muszą, być resztami kolejnymi.

Dla specjalistów w tej dziedzinie jest oczywiste, że poddawanie delecji wewnętrznej reszty aminokwasowej z peptydu rdzeniowego o strukturze (I) spowoduje obrócenie się płaszczyzny interfejsu hydrofilowo-hydrofobowego o 100° w punkcie delecji. Ponieważ takie obroty mogą znacznie zmienić amfipatyczne właściwości uzyskanej helisy, to w zalecanym rozwiązaniu reszty aminokwasowe poddaje się delecji w taki sposób, aby w zasadzie zachować ustawienie płaszczyzny interfejsu hydrofilowo-hydrofobowego wzdłuż całej długiej osi helisy.

Można to dogodnie osiągnąć przez poddawanie delecji dostatecznej liczby kolejnych albo niekolejnych reszt aminokwasowych w taki sposób, że delecji poddaje się jeden pełny skręt helisy. Idealna

PL 196 675 B1 helisa α zawiera 3,6 reszt na jeden skręt. Zatem w zalecanym rozwiązaniu delecji poddaje się grupy 3-4 kolejnych albo niekolejnych reszt aminokwasowych. To, czy delecji poddaje się 3, czy 4 aminokwasy, zależy od położenia wewnątrz helisy pierwszej reszty poddawanej delecji. Określanie właściwej liczby kolejnych albo niekolejnych reszt aminokwasowych, które tworzą pełny skręt helisy od jakiegokolwiek punktu wyjściowego w amfipatycznej helisie, mieści się. w umiejętnościach specjalistów w'tej dziedzinie.

Z powodu przypuszczalnego znaczenia zasadowego skupiska na końcu C peptydów rdzeniowych o strukturze (I) dla stabilizacji helisy oraz znaczenia hydrofobowego, skupiska dla wiązania lipidów i aktywacji LCAT, w zalecanych rozwiązaniach nie poddaje się delecji reszt stanowiących zasadowe i hydrofobowe skupiska. Zatem w zalecanych rozwiązaniach nie poddaje się delecji reszt 18, 19, 20 i 22 (skupisko zasadowe) i reszt 3, 6, 9 i 10 (skupisko hydrofobowe).

Peptydy rdzeniowe o strukturze (I) można także wydłużyć na jednym albo obydwóch końcach albo wewnątrz za pomocą dodatkowych reszt aminokwasowych, które nie zakłócają znacznie, w niektórych rozwiązaniach nawet polepszają, strukturalne i ewentualnie funkcjonalne właściwości peptydów. W rzeczywistości wydłużone peptydy rdzeniowe mogą zawierać 23, 25, 26, 29, a nawet więcej reszt aminokwasowych. Takie wydłużone peptydy będą zachowywać zasadniczo dogodnie amfipatyczność wypadkową i inne właściwości peptydów o strukturze (I). Oczywiście należy zdać sobie sprawę z tego, że dodawanie aminokwasów do wewnątrz obraca płaszczyznę interfejsu hydrofobowohydrofilowego w punkcie insercji w sposób podobny do sposobu opisanego wyżej dla wewnętrznych delecji. Zatem omówione wyżej rozważania związane z delecjami wewnętrznymi stosują się również do addycji wewnętrznych.

W jednym z rozwiązań peptydy rdzeniowe wydłuża się na końcu N i ewentualnie końcu C o co najmniej jeden skręt helisy. Takie wydłużenia stabilizują dogodnie helisową strukturę drugorzędową w obecności lipidów, takich jak opisane poprzednio aminokwasy i segmenty końcowe. W szczególnie zalecanym rozwiązaniu peptyd rdzeniowy o strukturze (I) wydłuża się na końcu C o pojedynczą, zasadową resztę aminokwasową, dogodnie Lys (K). Po takim wydłużeniu Xx oznacza dogodnie D-Pro (p) albo Gly (G), X2 oznacza dogodnie Val (V), X3 oznacza dogodnie Leu (L), X4 oznacza dogodnie Asp (D), X5 oznacza dogodnie Leu (L), X6 oznacza dogodnie Phe (F), X7 oznacza dogodnie Arg (R), X8 oznacza dogodnie Glu (E), X9 oznacza dogodnie Leu (L), X10 oznacza dogodnie Leu (L), X11 oznacza dogodnie Asn (N), X12 oznacza dogodnie Glu (E), X13 oznacza dogodnie Leu (L), X14 oznacza dogodnie Leu (L), X15 oznacza dogodnie Glu (E), X16 oznacza dogodnie Ala (A), X17 oznacza dogodnie Leu (L), X18 oznacza dogodnie Lys (K), X19 oznacza dogodnie Gln (Q), X20 oznacza dogodnie Lys (K), X21 oznacza dogodnie Leu (L) i ewentualnie X22 oznacza dogodnie Lys (K).

„Zablokowane” postacie agonisty ApoA-I to postacie agonistów ApoA-I, w których koniec N i ewentualnie koniec C są zablokowane ugrupowaniem zdolnym do reagowania z N-terminalną grupą -NH2 albo C-terminalną grupą -C(O)OH. Stwierdzono, że usuwanie N-terminalnych i ewentualnie C-terminalnych ładunków agonistów ApoA-I według wynalazku, zawierających 18 albo mniej reszt aminokwasowych (drogą syntezowania N-acylowanych peptydowych amidów/estrów/hydrazydów/alkoholi i ich produktów podstawienia) daje w wyniku agonistów, którzy zbliżają się do aktywności, a w niektórych rozwiązaniach nawet przekraczają aktywność zablokowanej postaci agonisty. W niektórych rozwiązaniach zawierających 22 albo więcej aminokwasów blokowanie końca N albo końca C daje w wyniku agonistów ApoA-I, którzy wykazują mniejszą aktywność niż postacie niezablokowane. Jednak przewiduje się, że blokowanie zarówno końca N, jak i końca C, agonistów ApoA-I złożonych z 22 albo więcej aminokwasów przywraca aktywność. Zatem w zalecanym rozwiązaniu blokuje się albo koniec N i ewentualnie koniec C (a dogodnie obydwa końce) peptydów rdzeniowych zawierających 18 albo mniej aminokwasów, natomiast albo blokuje się zarówno koniec N, jak i koniec C peptydów zawierających 22 albo więcej aminokwasów, albo obydwóch nie blokuje. Do typowych N-terminalnych grup blokujących należy RC(O)-, w której R oznacza -H, (C1-C6)-alkil, (C1-C6)-alkenyl, (C1-C6)-alkinyl, (C5-C20)-aryl, (C6-C26)-alkiloaryl, 5-20-członowy heteroaryl albo 6-16-członowy alkiloheteroaryl. Do zalecanych N-terminalnych grup blokujących należy acetyl, formyl i dansyl. Do typowych C-terminalnych grup blokujących należy -C(O)NRR i -C(O)OR, w których każdy R jest określony niezależnie, jak wyżej. Do zalecanych C-terminalnych grup blokujących należą te grupy, w których każdy R oznacza niezależnie metyl. Nie wiążąc się z żadną szczególna teorią uważa się, że takie terminalne grupy blokujące stabilizują helisę α w obecności lipidów (patrz na przykład Venkatachelapathi et al., 1993, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 15:349-359).

PL 196 675 B1

Naturalna struktura ApoA-I zawiera osiem jednostek helikalnych, o których sądzi się, że działają zgodnie w kierunku wiązania lipidów (Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10348-10262; Vanloo et al. , 1991, J. Lipid Res. 32:1253-1264; Mendez et al., 1994, J. Clin. Invest. 94:1698-1705; Palgunari et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338; Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84). Zatem niniejszym wynalazkiem są objęci agoniści ApoA-I złożeni z dimerów, trimerów, tetra-merów, a nawet polimerów wyższego rzędu („multimerów”) opisanych tu peptydów rdzeniowych. Takie multimery mogą mieć postać powtarzających się tandemów, rozgałęzionych siatek albo ich połączeń. Peptydy rdzeniowe mogą być połączone bezpośrednio ze sobą albo oddzielone od siebie jednym albo więcej niż jednym łącznikiem.

Peptydy rdzeniowe, które są multimerami, mogą być peptydami o strukturze (I), analogami o strukturze (I), poddanymi mutacji postaciami o strukturze (I), obciętymi albo poddanymi wewnętrznej delecji postaciami o strukturze (I), wydłużonymi postaciami o strukturze (I) i ewentualnie ich połączeniami. Peptydy rdzeniowe można łączyć „głową do ogona" (to jest koniec N do końca C), „głową do głowy” (to jest koniec N do końca N), „ogonem do ogona” (to jest koniec C do końca C) albo ich połączeniem.

W jednym z rozwiązań wynalazku multimery są tandemowymi powtórzeniami dwóch, trzech, czterech i do około dziesięciu peptydów rdzeniowych. Multimery są dogodnie tandemowymi powtórzeniami od 2 do 8 peptydów rdzeniowych. Zatem w jednym z rozwiązań agoniści ApoA-I według wynalazku mogą być multimerami, które mają następujący wzór strukturalny:

(II) HH-[LLm-HH]-LLm-HH w którym:

każde m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1, a zwłaszcza 1, n jest liczbą całkowitą od 0 do 10, a zwłaszcza od 0 do 8, każde HH oznacza niezależnie opisany tu peptyd rdzeniowy albo analog peptydu o strukturze (I) albo jego poddaną mutacji, obciętą, poddaną wewnętrznej delecji albo wydłużoną postać, każde LL oznacza niezależnie łącznik, a każde „-„ oznacza niezależnie wiązanie kowalencyjne.

W strukturze (II) łącznik LL może być jakąkolwiek cząsteczką dwufunkcyjną zdolną do kowalencyjnego wiązania ze sobą dwóch peptydów. Zatem odpowiednie łączniki są cząsteczkami dwufunkcyjnymi, w których grupy funkcyjne są zdolne do kowalencyjnego przyłączania się do końca N i ewentualnie końca C peptydu. Grupy funkcyjne nadające się do przyłączania się do końca N albo końca C peptydu są dobrze znane w tej dziedzinie, jak i odpowiednia chemia tworzenia się takiego wiązania kowalencyjnego.

Łącznik może być łącznikiem elastycznym, sztywnym albo półsztywnym w zależności od pożądanych właściwości multimeru. Do odpowiednich łączników należą na przykład reszty aminokwasowe, takie jak Pro albo Gly albo segmenty peptydowe zawierające od około 2 do około 5, 10, 15 albo 20, a nawet więcej aminokwasów, dwufunkcyjne związki organiczne, takie jak H2N (CH2)nCOOH, w których n jest liczbą całkowitą od 1 do 12, itp. Przykłady takich łączników oraz sposoby wytwarzania takich łączników i peptydów zawierających takie łączniki są dobrze znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Hijnig et al., 1974, Chem. Ber. 100:3039-3044; Basak et al., 1994, Bioconjug. Chem. 5(4):301-305).

W zalecanym rozwiązaniu wynalazku powtórzenia tandemowe są wewnętrznie przerywaną przez pojedynczą resztę prolinową. W tym celu tam, gdzie peptydy rdzeniowe są zakończone na ich końcu N albo C proliną, to jest na przykład takie, w których X1 w strukturze (I) jest Pro (P) albo D-Pro (p), m w strukturze (II) oznacza dogodnie 0. Tam, gdzie peptydy rdzeniowe nie zawierają N-terminalnej albo C-terminalnej proliny, LL oznacza dogodnie Pro (P) albo D-Pro (p), a m oznacza dogodnie 1.

W niektórych rozwiązaniach wynalazku może być pożądane zastosowanie łączników, które można przeciąć, co umożliwia uwolnienie w pewnych warunkach jednego albo więcej segmentów helikalnych (HH). Do odpowiednich łączników tego typu należą peptydy, które mają sekwencje aminokwasowe, które są rozpoznawane przez proteazy, to jest oligonukleotydy, które są rozszczepiane przez endonukleazy, oraz związki organiczne, które można ciąć środkami chemicznymi, takimi jak warunki kwaśne, zasadowe albo inne. Warunki cięcia są stosunkowo łagodne, aby nie doprowadzić do denaturacji albo innego sposobu rozpadu segmentów helikalnych i ewentualnie nierozszczepionych łączników, które są multimerycznymi agonistami ApoA-I.

PL 196 675 B1

Łączniki peptydów i oligonukleotydów, które można selektywnie ciąć, oraz środki do rozszczepiania łączników są dobrze znane i są oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. Odpowiednie łączniki na bazie związków organicznych, które można selektywnie rozszczepiać, są oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie i należą do nich łączniki opisane na przykład w WO 94/08051 oraz w cytowanych tam referencjach.

W zalecanym rozwiązaniu stosowane łączniki są peptydami, które są z kolei substratami dla endogennych enzymów z układu krążenia, umożliwiając przez to selektywne cięcie multimerycznych agonistów ApoA-I in vivo. Do endogennych enzymów nadających się do cięcia łączników należy na przykład propeptydaza proapolipoproteiny A-I. Odpowiednie enzymy oraz segmenty peptydowe, które działają jako substraty dla takich enzymów, są dobrze znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Edelstein et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:11430-11433; Zanis, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2574-2578).

Jak omówiono wyżej, kluczową cechą peptydów rdzeniowych tu opisanych jest ich zdolność do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych albo mostków solnych, gdy są one ustawione przeciwrównolegle względem siebie. Zatem w zalecanym rozwiązaniu stosuje się łączniki o odpowiedniej długości i elastyczności w celu umożliwienia ustawienia się segmentów helikalnych (HH) o strukturze (II) w sposób przeciwrównoległy i tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych albo mostków solnych w obecności lipidów.

Do łączników o odpowiedniej długości i elastyczności należą, lecz nie tylko, Pro (P), Gly (G), Cys-Cys, H2N-(CH2)n-COOH, gdzie n oznacza od 1 do 12, a zwłaszcza od 4 do 6, H2N-aryl-COOH i węglowodany.

Alternatywnie, ponieważ naturalne apolipoproteiny umożliwiają kooperacyjne wiązanie pomiędzy przeciw-równoległymi segmentami helikalnymi, to do wiązania peptydów rdzeniowych można dogodnie stosować łączniki peptydowe, które odpowiadają pierwszorzędowej sekwencji segmentów peptydowych łączących przyległe helisy naturalnych apolipoprotein, na przykład włącznie z ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE i ApoJ. Te sekwencje są dobrze znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Rosseneu et al., „Analysis of the Primary and of the Secondary Structure of the Apolipoproteins", in: Structure and Function of Lipoproteins, rozdział 6, 159-183, CRC Press, Inc., 1992).

Do innych łączników, które umożliwiają tworzenie się międzycząsteczkowych wiązań wodorowych albo mostków solnych pomiędzy tandemowymi powtórzeniami przeciwrównoległych segmentów helikalnych należą odwrotne skręty peptydowe, takie jak skręty β i skręty γ, jak również cząsteczki organiczne, które naśladują struktury peptydowych zwojów β i zwojów γ. Na ogół skręty odwrotne są segmentami peptydowymi, które odwracają kierunek łańcucha polipeptydowego, umożliwiając przystosowanie się pojedynczego łańcucha polipetydowego do obszarów przeciwrównoległej warstwy β i przeciwrównoległej struktury α-helikalnej. Skręty β są złożone na ogół z czterech reszt aminokwasowych, natomiast skręty γ są złożone na ogół z trzech reszt aminokwasowych.

Konformacje i sekwencje wielu peptydowych zwojów β zostały dobrze opisane w tej dziedzinie i należą do nich, tytułem przykładu, a nie ograniczenia, skręty typu I, typu I', typu II, typu II', typu III, typu III', typu IV, typu V, typu V, typu VIa, typu VIb, typu VII i typu VIII (patrz Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34:167-339; Rose et al., 1985, Adv..Protein Chem. 37:1-109; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206:750-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394).

Specyficzne konformacje krótkich zwojów peptydowych, takich jak skręty β, zależą przede wszystkim od położeń niektórych reszt aminokwasowych w skręcie (zwykle Gly, Asn albo Pro). Na ogół skręt β typu I jest zgodny z każdą resztą aminokwasową w położeniach 1 do 4 skrętu, z tym wyjątkiem, że Pro nie może pojawić się w położeniu 3. Gly przeważa w położeniu 4, natomiast Pro przeważa w położeniu 2 zarówno skrętu typu I, jak i skrętu typu II. Reszty Asp, Asn, Ser i Cys często występują w położeniu 1, w którym ich łańcuchy boczne łączą się często mostkiem wodorowym z NH reszty 3.

W zwojach typu II Gly i Asn występują najczęściej w położeniu 3, ponieważ przyjmują łatwiej wymagane kąty szkieletu. Skręty typu I' mają Gly idealnie w położeniach 2 i 3, natomiast skręty typu II' mają Gly w położeniu 2. Skręty typu III mogą zawierać na ogół większość reszt aminokwasowych, natomiast skręty typu III' wymagają Gly zwykle w położeniu 2 i 3. Skręty typu Via i Vib mają na ogół wiązanie peptydowe cis i Pro jako resztę wewnętrzną. Odnośnie przeglądu różnych typów i sekwencji zwojów β w proteinach odsyła się czytelnika do Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232.

PL 196 675 B1

Konformacja i sekwencje wielu peptydowych zwojów γ już dobrze opisano w tej dziedzinie (patrz na przykład Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394). Wszystkie te typy struktur zwojów β i zwojów γ i ich odpowiednie sekwencje, jak również później odkryte struktury i sekwencje peptydowych zwojów β i zwojów γ, są specyficznie rozważane w niniejszym wynalazku.

Alternatywnie, łącznik (LL) może stanowić cząsteczkę albo ugrupowanie organiczne, które naśladuje strukturę peptydowego skrętu β i skrętu γ. Takie naśladowcze ugrupowania skrętu β i ewentualnie skrętu γ, jak również sposoby syntezowania peptydów zawierających takie ugrupowania są dobrze znane w tej dziedzinie i należą do nich, między innymi, peptydy opisane przez Giannis and Kolter, 1993, Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 32:1244-1267; Kahn et al., 1988, J. Molecular Recognition 1:75-79; oraz Kahn et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28:1623-1626.

W jeszcze innym rozwiązaniu multimery mają postać rozgałęzionych sieci (patrz na przykład fig. 7). Takie sieci otrzymuje się dogodnie przez zastosowanie wielofunkcyjnych ugrupowań wiążących, które umożliwiają przyłączenie się więcej niż dwóch jednostek helikalnych do pojedynczego ugrupowania wiążącego. Zatem w rozgałęzionych sieciach wykorzystuje się cząsteczki, które mają trzy, cztery, a nawet więcej grup funkcyjnych, które są zdolne do kowalencyjnego łączenia się z końcem N i ewentualnie końcem C peptydu. Do odpowiednich ugrupowań wiążących należą na przykład reszty aminokwasowe, które mają łańcuchy boczne zawierające funkcyjną grupę hydroksylową, sulfanylową, aminową, karboksylową, amidową i ewentualnie estrową, takie jak na przykład Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q), Lys (K), Arg ( R), Orn, Asp (D) i Glu (E), albo inne cząsteczki organiczne zawierające takie grupy funkcyjne.

Segmenty helikalne przyłączone do pojedynczego ugrupowania wiążącego nie muszą być przyłączone poprzez podobne końce. W rzeczywistości w niektórych rozwiązaniach segmenty helikalne są przyłączone do pojedynczego ugrupowania wiążącego w taki sposób, że są rozmieszczone przeciwrównolegle, to jest niektóre helisy są przyłączone poprzez ich końce N, natomiast inne poprzez ich końce C.

Segmenty helikalne można przyłączać bezpośrednio do ugrupowania wiążącego albo mogą być one oddzielone od ugrupowania wiążącego za pomocą jednego albo więcej łączników dwufunkcyjnych (LL), jak opisano poprzednio.

Co się tyczy fig. 7A i 7B, to widać, że rozgałęzioną sieć można opisać w kategoriach liczby „węzłów” tworzących sieć, w której węzeł stanowi każde wielofunkcyjne ugrupowanie wiążące. Na fig. 7A i 7B segmenty helisowe (na przykład peptydy rdzeniowe tu opisane) są przedstawione w postaci cylindrów, a wielofunkcyjne ugrupowania wiążące (albo węzły) w postaci kółek (o), w których liczba linii wychodzących z kółka wskazuje „rząd” (albo liczbę grup funkcyjnych) wielofunkcyjnego ugrupowania wiążącego. Liczba węzłów w sieci zależy na ogół od całkowitej pożądanej liczby segmentów helikalnych i wynosi typowo od 1 do 2. Oczywiście widoczne jest, że dla danej liczby pożądanych helikalnych segmentów sieci, które zawierają ugrupowania wiążące wyższego rzędu, mają mniej węzłów. Na przykład w odniesieniu do fig. 7A i 7B sieć trzeciorzędową (na przykład sieć zawierająca trójfunkcyjne ugrupowania wiążące) siedmiu jednostek helikalnych ma trzy węzły (fig. 7A), podczas gdy sieć uporządkowana czwartorzędowo, (tj. sieć posiadająca czterofunkcyjne cząsteczki łączące) złożona z siedmiu jednostek helikalnych posiada jedynie dwa węzły (fig. 7B).

Sieci mogą mieć jednolitą rzędowość tzn. sieci, w których wszystkie węzły przykładowo są trifunkcyjnymi lub tetrafunkcyjnymi cząstkami łączącymi lub mogą być mieszane, przykładowo składające się z trifunkcyjnych i tetrafunkcyjnych cząstek łączących. Oczywiście jest zrozumiałe, że nawet w sieciach o jednolitej rzędowości cząstki łączące nie muszą być identyczne. Trzeciorzędowa sieć może wykorzystywać przykładowo dwie, trzy cztery a nawet więcej różnych trifunkcyjnych cząstek łączących.

Podobnie jak w liniowych oligomerach, segmenty helikalne zawarte w rozgałęzionej sieci mogą, lecz nie muszą, być identyczne.

Przykład takiej rozgałęzionej sieci o mieszanej rzędowości jest przedstawiony na fig. 7C. Na fig. 7C helikalne segmenty (tzn. peptydy rdzeniowe tu opisane) są przedstawione jako cylindry a wielofunkcyjne cząstki łączące jako kółka (•), gdzie liczba linii wychodzących z kółka wskazuje na „rzędowość” (lub liczbę grup funkcyjnych) wielofunkcyjnej cząstki łączącej. Linie łączące helikalne segmenty reprezentują bifunkcyjne łączniki LL, jak opisano wcześniej. Helikalne segmenty obejmujące rozgałęzione sieci mogą być tandemowymi powtórzeniami peptydów rdzeniowych, jak opisano wcześniej.

PL 196 675 B1

W jednej z ilustrujących wynalazek realizacji, rozgałęzione sieci tu opisane są opisane wzorem:

(III) X-Nya - X(ya-1) - (Nyb-X(yb-1,))p.

gdzie:

każde X jest niezależnie HH- (-LLm-HH-)n-LLm - HH;

każde HH jest niezależnie peptydem rdzeniowym o strukturze (I) lub jego analogiem lub formą zmutowaną, skróconą, posiadającą wewnętrzną delecję lub przedłużoną zgodną z niniejszym opisem;

każdy LL jest niezależnie bifunkcyjnym łącznikiem; każdy m jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 1; każdy n jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 8;

Nya i NyŁ są każdy niezależnie wielofunkcyjną cząsteczką łączącą gdzie ya i yb to liczba grup funkcyjnych w Nya i Nyb, odpowiednio;

każdy ya i yb to niezależnie liczba całkowita od 3 do 8;

p to liczba całkowita od 0 do 7; a każda "-" niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

W zalecanej realizacji sieć rozgałęziona posiada „drzewo Lys” tj. sieć w której wielofunkcyjna cząsteczka łącząca jest jedną lub kilkoma resztami Lys (K) (patrz, np. fig. 7D).

W jednej z ilustrujących wynalazek realizacji, są one opisane przez wzory:

każde X jest niezależnie HH- (-LLm-HH-)n-LLm-HH;

każde HH jest niezależnie peptydem rdzeniowym lub analogiem peptydu o strukturze (I) lub jego formą zmutowaną, skróconą, posiadającą wewnętrzną delecję lub przedłużoną zgodną z niniejszym opisem;

każdy LL jest niezależnie dwufunkcyjnym łącznikiem; każdy n jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 8; każdy m jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 1;

R1 jest -OR lub -NRR; a każdy R jest niezależnie -H, (C1-C6)-alkilem, (C1-C6)-alkenylem, (C1-C6)-alkinylem, (C5-C20)-arylem, (C6-C26)-alkarylem, 5-20 członowym heteroarylem lub 6-26 członowym alkheteroarylem.

5.1.1 analiza strukturalna i funkcjonalna.

Strukturę i funkcję peptydów rdzeniowych lub analogów peptydów tu opisanych, jak również agonistów ApoA-I zbudowanych z tych peptydów rdzeniowych, włącznie z multimerycznymi formami opisanymi powyżej, można badać w celu wybrania aktywnych agonistów lub mimetyków ApoA-I. Przykładowo, peptydy rdzeniowe lub analogi peptydów mogą być testowane pod względem ich zdolności do: tworzenia α-helisy w obecności lipidów, wiązania lipidów, tworzenia kompleksów z lipidami, aktywowania LCAT, przenoszenia cholesterolu, itp.

PL 196 675 B1

Sposoby i testy służące do analizowania struktury i/lub funkcji peptydów są dobrze znane ze stanu techniki. Zalecane metody zostały przedstawione w przykładach, poniżej. Przykładowo, testy badające dichroizm kołowy (CD) i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), które zostały opisane w sekcji 7, poniżej, mogą być zastosowane do analizowania struktury peptydów lub analogów peptydów - szczególnie zawartości helis w obecności lipidów. Zdolność peptydów i/lub analogów peptydów do aktywowania LCAT może być dobrze określona za pomocą testu aktywacji LCAT opisanego w sekcji 8, poniżej. Testy in-vivo i in-vitro opisane w sekcjach 9, 10 i 11, poniżej, mogą być użyte do oceny czasu półtrwania, dystrybucji, wypływu cholesterolu i wpływu na RCT.

Ogólnie, peptydy rdzeniowe i/lub analogi peptydów ti opisane uważane są za aktywne, jeżeli posiadają właściwości przedstawione w Tabeli IV, poniżej.

T a b e l a IV

Właściwości peptydów aktywnych

	zakres	zalecany zakres
% heliakalności w obecności lipidów (Ri=30) (peptydy z niezablokowanymi 22 resztami aminokwasowymi)	> 60%	> 80%
% helikalności w obecności lipidów (Ri=30) (peptydy z niezablokowanymi 18 resztami aminokwasowymi)	> 40%	> 60%
% heliakalnościw obecności lipidów (R_i=30) (peptydy z zablokowanymi 18 resztami aminokwasowymi i peptydy krótsze) Wiązanie lipidów (w obecności SUV)	> 60% 0,5-10 pM peptydu Ri+1-50	> 80%
Aktywacja LCAT	> 38%	> 80%

Ri - stosunek molarny lipid:peptyd

Jak przedstawiono w przykładach poniżej, peptydy rdzeniowe wykazujące wyższy poziom aktywacji LCAT (> 38%) ogólnie posiadają znaczący udział α-helis w strukturze w obecności małych lipidowych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV) (> 60% udziału struktury helikalnej w przypadku peptydów niezablokowanych zawierających 22 lub więcej aminokwasów i zablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów; > 40% udziału struktury helikalnej w przypadku nieblokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów), a peptydy wykazujące słabą aktywację LCAT lub jej brak posiadają mały udział α-helis. Jednakże, w pewnych przypadkach, peptydy wykazujące znaczący udział struktury helikalnej w obecności lipidów nie powodują znaczącej aktywacji LCAT.

Podobnie, pomimo, że peptydy rdzeniowe wykazujące znaczącą aktywację LCAT zwykle wiążą lipidy, w pewnych przypadkach peptydy wykazujące wiązanie lipidów nie wpływają znacząco na aktywację LCAT.

W związku z powyższym, specjaliści z tej dziedziny uważają, że w pewnych przypadkach pomimo, że zdolność peptydów rdzeniowych tu opisanych do tworzenia α-helis (w obecności lipidów) i wiązania lipidów jest krytyczna dla ich aktywności, to w wielu przypadkach właściwości takie mogą być niewystarczające. Zatem, w zalecanej realizacji peptydy rdzeniowe tu opisane są poddawane serii badań przesiewowych w celu wyselekcjonowania peptydów rdzeniowych wykazujących znaczącą aktywność farmakologiczną.

W pierwszym etapie, peptyd rdzeniowy jest badany pod względem jego zdolności do tworzenia α-helis w obecności lipidów za pomocą testu CD, opisanego w sekcji 7, poniżej. Te peptydy, które są przynajmniej w 40% helikalne (niezablokowane peptydy zawierające 18 lub mniej aminokwasów) lub w 60% helikalne (blokowane peptydy zawierające 18 lub mniej aminokwasów; niezablokowane peptydy zawierające 22 lub więcej aminokwasów) w obecności lipidów (w stężeniu ok. 5 μM i stosunku molowym lipid:petyd ok. 30) są następnie poddawane dalszym badaniom testującym ich zdolność do wiązania lipidów za pomocą testów fluorescencyjnych opisanych w sekcji 7, poniżej. Oczywiście, tylko te peptydy rdzeniowe, które zawierają fluorescencyjny Trp (W) lub resztę Nal są testowane pod względem wiązania się z lipidami za pomocą techniki fluorescencyjnej. Jednakże, w przypadku peptydów nie

PL 196 675 B1 posiadających reszt fluorescencyjnych, wiązanie się z lipidami jest oczywiste w przypadku wystąpienia wzrostu udziału helis w obecności lipidów.

Peptydy rdzeniowe wykazujące wiązanie się z lipidami w obecności SUV (0,5-10 μM peptydu; stosunek molowy lipid:peptyd w zakresie od 1 do 50) są następnie badane pod kątem ich aktywności farmakologicznej. Oczywiście, wybór testowanej aktywności farmakologicznej zależy od przeznaczenia agonisty ApoA-I. W zalecanej realizacji, peptydy rdzeniowe są badane pod kątem ich zdolności do aktywowania LCAT, jako że peptydy aktywujące LCAT są szczególnie użyteczne w opisanych tutaj metodach. Peptydy rdzeniowe wykazujące przynajmniej 38% aktywacji LCAT w porównaniu z natywną ludzką ApoA-I (określone w teście aktywacji LCAT opisanym w sekcji 8, poniżej). Natomiast peptydy wykazujące 50%, 60%, 70% lub nawet 90% są szczególnie zalecane.

5.1.2. Zalecane realizacje

Agoniści ApoA-I według wynalazku mogą zostać dodatkowo zdefiniowani za pomocą zalecanych realizacji wynalazku.

W jednej z zalecanych realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu.

W innej z zalecanych realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których X7 jest zasadowym aminokwasem, Asn (N) lub Glu (E); X8 jest kwaśnym aminokwasem lub Arg (R); X12 jest kwaśnym aminokwasem lub Asn (N); i/lub X15 jest kwaśnym aminokwasem, Gln (Q) lub Lys (K); a X1, X2, X3, X4, X5, X6, X9, X10, X11, X13, X14, X16, X17, X18, K19, X20 i X21 są takie jak w poprzednio zdefiniowano dla struktury (I).

W jednej z zalecanych realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których:

XI jest Pro (P), Gly (G), Ala (A), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) lub D-Pro (p);

X2 jest Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X4 jest Asp (D) lub Glu (E);

X7 jest Lys (K), Arg (R), Orn, Asn (N) lub Glu (E);

X8 jest Asp (D), Arg (R) lub Glu (E);

XII jest Asn (N), Gln (Q), Glu (E) lub Arg (R);

X12 jest Asp (D), Glu (E) lub Asn (N);

X13 jest Leu (L), Gly (G) lub Aib;

X15 jest Asp (D), Glu (E), Gln (Q) lub Lys (K);

X16 jest Ala (A), Trp (W), Gly (G), Leu (L), Phe (F) lub Nal;

X17 jest Leu (L), Gly (G) lub Nal;

X18 jest Lys (K), Orn, Gln (Q) lub Asn (N);

X19 jest Lys (K), Orn, Gln (Q) lub Asn (N);

X20 jest Lys (K) lub Orn;

X21 jest Leu (L); i/lub

X22 jest Lys (K) lub Orn, a X3, X5, X6, X9, X10 i X14 są takie jak w poprzednio zdefiniowano dla struktury (I).

W jeszcze bardziej zalecanej realizacji przedmiotem są peptydy, w których:

X2 jest Val (V);

X3 jest Leu (L);

X5 jest Leu (L);

X6 jest Phe (F);

X7 jest Arg (R) lub Lys (K);

X8 jest Glu (E);

X9 jest Leu (L);

X10 jest Leu (L);

X11 jest Asn (N) lub Glu (Q);

X12 jest Glu (E); i/lub

X15 jest Glu (E);

a X1, X4, X13, X14, X16, X17, X18, X19, X20, X21 i X22 są takie jak w poprzednio zdefiniowano dla struktury (I) lub są takie jak zdefiniowano w poprzednim paragrafie.

PL 196 675 B1

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą (I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których tylko jeden z X18 lub X19 jest zasadowym aminokwasem a inny z X18 lub X19 jest Gln (Q) lub Asn (N).

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których jeden z X18 lub X19 jest Lys (K) lub Orn a inny z X18 lub X19 jest Gln (Q) lub Asn (N).

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których X9, X10, X13, X14, X16 lub X17 jest Gly (G) a pozostałe są inne niż Gly (G).

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których X13, jest Gly (G) a każdy z X9, X10, X14, X16 i X17 jest inny niż Gly (G).

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których:

XI jest Pro (P), Gly (G) lub D-Pro (p);

X2 jest Val (V);

X3 jest Leu (L);

X4 jest Asp (D) lub Glu (E);

X5 jest L (Leu) lub Phe (F);

X6 jest Phe (F);

X7 jest Arg (R);

X8 jest Glu (E);

X9 jest Leu (L);

X10 jest Leu (L) lub Trp (W);

XII jest Asn (N);

X12 jest Glu (E);

X13 jest Gly (G);

X14 jest Leu (L);

X15 jest Glu (E) 7

X16 jest Ala (A) lub Trp (W);

X17 jest Leu (L) lub Nal;

X18 jest Lys (K) lub Orn;

X19 jest Gin (Q);

X20 jest Lys (K) lub Orn;

X21 jest Leu (L); i

X22 jest Lys (K) lub Orn.

Szczególnie zalecani agoniści ApoA-I według tego aspektu wynalazku są wybrani z grupy obejmującej:

PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 3);

GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 13);

pVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 19);

PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK (SEQ ID NO: 137);

PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK (SEQ ID NO: 138);

PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 139);

PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO (SEQ ID NO: 140);

PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 141);

PVLELFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 142);

i ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu.

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których X9 jest Gly (G) a każdy z X10, X13, X14, X16 i X17 jest inny niż Gly (G). Szczególnie zalecanym agonistą ApoA-I według tego aspektu wynalazku jest peptyd 20:

PVLDLFREGLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 20).

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których X10 jest Gly peptyd 3 peptyd 13 peptyd 19 peptyd 137 peptyd 138 peptyd 139 peptyd 140 peptyd 141 peptyd 142

PL 196 675 B1 (G) a każdy z X9, X13, X14, X16 i X17 jest inny niż Gly (G). Szczególnie zalecanym agonistą ApoA-I według tego aspektu wynalazku jest peptyd 9:

PVLDLFRELGNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 9).

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których X14 jest Gly (G) a każdy z X9, X10, X13, X16 i X17 jest inny niż Gly (G). Szczególnie zalecanym agonistą ApoA-I według tego aspektu.wynalazku jest peptyd 126:

PVLDLFRELLNELGEALKQKLK (SEQ ID NO: 126).

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których X16 jest Gly (G) a każdy z X9, X10, X13, X14 i X17 jest inny niż Gly (G). Szczególnie zalecanym agonistą ApoA-I według tego aspektu wynalazku jest peptyd 22:

PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK (SEQ ID NO: 22).

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których X17 jest Gly (G) a każdy z X9, X10, X13, X14 i X16 jest inny niż Gly (G). Szczególnie zalecanym agonistą ApoA-I według tego aspektu wynalazku jest peptyd 12:

PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK (SEQ ID NO: 12).

Realizacje wynalazku zawierające wewnętrzne reszty glicyny mogą być łatwo syntetyzowane z dużą wydajnością poprzez kondensacje segmentów, co jest dużą zaletą w produkcji na dużą skalę. Kondensacja segmentów, tj. łączenie wzajemne małych składowych łańcuchów peptydowych w celu uzyskania dużego łańcucha peptydowych, było stosowane w przypadku przygotowywania wielu biologicznie aktywnych peptydów, włącznie z 44-aminokwasowym mimetykiem ApoA-I (patrz, np.: Nakagawa et al., 1985, J. Am Chem. Soc. 107:7087-7083; Nokihara et al., 1989, Peptides 1988:166-168; Kneib-Cordonnier et al., 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:527-538), i jest uznawana za najbardziej efektywną kosztowo metodę wysokowydajnej syntezy peptydów tu opisanych na dużą skalę.

Zalety syntezy poprzez kondensację segmentów obejmują zdolność do kondensowania wstępnie przygotowanych segmentów w roztworze i proste oczyszczanie ostatecznego produktu. Wady metody to niska wydajność sprzęgania i wydajność etapu kondensacji i słaba rozpuszczalność pewnych sekwencji peptydowych.

Wydajność sprzęgania w etapie kondensacji może zostać znacząco zwiększona poprzez wydłużenia czasu sprzęgania. Zwykle, wydłużenie czasu sprzęgania daje wzrost racemizacji produktu (Sieber et al., 1970, Helv. Chim. Acta 53:2135-2150). Jednakże, ze względu na to, że glicyna nie posiada centrów chiralności nie dochodzi do racemizacji (reszta proliny, ze względu na zawady steryczne, także nie ulega wcale lub jedynie w niewielkim stopniu procesowi racemizacji, nawet przy długich czasach sprzęgania). Zatem, realizacje wynalazku zawierające wewnętrzne reszty glicyny mogą być syntetyzowane z dużą wydajnością metodą kondensacji segmentów składowych dzięki uwzględnieniu faktu, że reszta glicyny nie ulega racemizacji. Zatem realizacje wynalazku zawierające wewnętrzne reszty glicyny posiadają znaczącą zaletę dla ich syntezy w produkcji na dużą skalę.

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I to 22-aminokwasowe peptydy zgodne ze strukturą(I), lub ich postacie amidowane lub estryfikowane na N- i/lub C-końcu, w których każdy z X9, X10, X13, X14, X16 i X17 jest inny niż Gly (G).

XI jest Pro (P), Gly (G), Ala (A) lub D-Pro (p);

X2 jest Val (V) lub Leu (L);

X3 jest Leu (L);

X4 jest Asp (D) lub Glu (E);

X5 jest Leu (L) lub Phe (F);

X6 jest Leu (L) lub Phe (F);

X7 jest Arg (R) lub Lys (K);

X8 jest Glu (E);

X9 jest Leu (L);

X10 jest Leu (L) lub Trp (W);

XII jest Asn (N) lub Gln (Q);

X12 jest Glu (E);

PL 196 675 B1

X13 jest Leu (L) lub Aib;

X14 jest Leu (L), Trp (W) lub Nal;

X15 jest Glu (E);

X16 jest Ala (A), Leu (L), Trp (W) lub Nal;

X17 jest Leu (L) lub Nal;

jeden z X18 lub X19 jest Gln (Q) a drugi jest Lys (K) lub Orn;

X20 jest Lys (K) lub Orn;

X21 jest Leu (L); i

X22 jest Lys (K) lub Orn.

W szczególnie zalecanej realizacji tego aspektu wynalazku, X2 jest Val (V); X4 jest Asp (D); X5 jest Leu (L); X6 jest Phe (F); X7 jest Arg (R); X10 jest Leu (L); X11 jest Asn (N); X13 jest Leu (L); X14 jest Leu (L); X16 jest Ala (A); X17 jest Leu (L); X18 jest Lys (K); X19 jest Gln (Q); X20 jest Lys (K) i/lub X22 jest Lys (K).

XI jest inny niż Aib, Val (V) lub Leu (L);

X2 jest inny niż D-Val (v);

X5 jest inny niż Lys (K), Glu (E), Trp (W) lub Nal;

X6 jest inny niż Trp (W);

X7 jest inny niż Trp (W) lub Leu (L);

X8 jest inny niż Trp (W);

X9 jest inny niż Lys (K) lub Trp (W);

XII jest inny niż Trp (W);

X12 jest inny niż Trp (W) lub Leu (L);

X13 jest inny niż Glu (E) lub Trp (W);

X15 jest inny niż Trp (W); i/lub

X21 jest inny niż Lys (K).

W jeszcze innej zalecanej realizacji wynalazku, agoniści ApoA-I według wynalazku są wybrani spośród:

peptyd 1	PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK	(SEQ ID NO	1);
peptyd 2	GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK	(SEQ ID NO	2);
peptyd 3	PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK	(SEQ ID NO	3);
peptyd 4	PVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	4);
peptyd 5	pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK	(SEQ ID NO	5);
peptyd 6	PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK	(SEQ ID NO	6);
peptyd 7	PVLDLFKELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	7);
peptyd 8	PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	8);
peptyd 9	PVLDLFRELGNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	9);
peptyd 10	PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK	(SEQ ID NO	10);
peptyd 11	PVLDLFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	11);
peptyd 12	PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK	(SEQ ID NO	12);
peptyd 13	GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	13);
peptyd 14	PVLDLFRELLNELLEALOQOLO	(SEQ ID NO	14);
peptyd 15	PVLDLFRELWNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	15);
peptyd 16	PVLDLLRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	16);
peptyd 17	PVLELFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	17);
peptyd 18	GVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	18);
peptyd 19	pVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ ID NO	19);
peptyd 20	PVLDLFREGLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	20);
peptyd 21	PVLDLFRELLNELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	21);
peptyd 22	PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK	(SEQ ID NO	22);
peptyd 23	PLELFKELLQELLEALKQKLK	(SEQ ID NO	23);
peptyd 24	PVLDLFRELLNELLEALQKKLK	(SEQ ID NO	24);
peptyd 25	PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK	(SEQ ID NO	25);
peptyd 26	PVLDLFRELLNELLELLKQKLK	(SEQ ID NO	26);
peptyd 27	PVLDLFRELLNELZEALKQKLK	(SEQ ID NO	27);

PL 196 675 B1 peptyd 28 peptyd 29 peptyd 123 peptyd 124 peptyd 125 peptyd 126 peptyd 127 peptyd 128 peptyd 129 peptyd 130 peptyd 131 peptyd 132 peptyd 133 peptyd 134 peptyd 135 peptyd 136 peptyd 137 peptyd 138 peptyd 139 peptyd 140 peptyd 141 peptyd 142

DVLDLFRELLNELWEALKQKLK

AVLDLFRELLNELLEALKQKLK

QVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFOELLNELLEALOQOLO

NVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELGEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK

PVLELFNDLLRELLEALQKKLK

PVLELFNDLLRELLEALKQKLK

PVLELFKELLNELLDALRQKLK

PVLDLFRELLENLLEALQKKLK

PVLELFERLLEDLLQALNKKLK

PVLELFERLLEDLLKALNQKLK

DVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PALELFKDLLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK

PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO

PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

PVLELFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ

ID	NO	28);
ID	NO	29);
ID	NO	123);
ID	NO	124);
ID	NO	125);
ID	NO	126);
ID	NO	127);
ID	NO	128);
ID	NO	129);
ID	NO	130);
ID	NO	131);
ID	NO	132);
ID	NO	133);
ID	NO	134);
ID	NO	135);
ID	NO	136);
ID	NO	137);
ID	NO	138);
ID	NO	139);
ID	NO	140);
ID	NO	141);
ID	NO	142);

i ich postaci acylowanych (zwłaszcza acetylowanych lub dansylowanych) na N-końcu i/lub amidowanych lub estryfikowanych na C-końcu, przy czym X jest Aib, Z jest Nal; i O jest Orn.

W jeszcze innej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I według wynalazku są wybrani z grupy peptydów do której należą:

peptyd 1 peptyd 2 peptyd 3 peptyd 4 peptyd 5 peptyd 6 peptyd 7 peptyd 8 peptyd 9 peptyd 10 peptyd 11 peptyd 12 peptyd 13 peptyd 14 peptyd 15 peptyd 16 peptyd 17 peptyd 18 peptyd 19 peptyd 20 peptyd 21 peptyd 22 peptyd 23 peptyd 24 peptyd 25 peptyd 26 peptyd 27 peptyd 28 peptyd 29

PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK

PVLDLFKELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELGNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK

PVLDLFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK

GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALOQOLO

PVLDLFRELWNELLEALKQKLK

PVLDLLRELLNELLEALKQKLK

PVLELFKELLQELLEALKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFREGLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK

PLLELFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALQKKLK

PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELZEALKQKLK

PVLDLFRELLNELWEALKQKLK

AVLDLFRELLNELLEALKQKLK

(SEQ ID NO	1);
(SEQ ID NO	2);
(SEQ ID NO	3);
(SEQ ID NO	4);
(SEQ ID NO	5);
(SEQ ID NO	6);
(SEQ ID NO	7);
(SEQ ID NO	8);
(SEQ ID NO	9);
(SEQ ID NO	10);
(SEQ ID NO	11);
(SEQ ID NO	12);
(SEQ ID NO	13);
(SEQ ID NO	14);
(SEQ ID NO	15);
(SEQ ID NO	16);
(SEQ ID NO	17);
(SEQ ID NO	18);
(SEQ ID NO	19);
(SEQ ID NO	20);
(SEQ ID NO	21);
(SEQ ID NO	22);
(SEQ ID NO	23);
(SEQ ID NO	24);
(SEQ ID NO	25);
(SEQ ID NO	26);
(SEQ ID NO	27);
(SEQ ID NO	28);
(SEQ ID NO	29);

PL 196 675 B1 i ich postacie acylowane (zwłaszcza acetylowane lub dansylowane) na N-końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C-końcu, przy czym X jest Aib, Z jest Nal; i O jest Orn.

W jeszcze innej zalecanej realizacji wynalazku, agoniści ApoA-I są multimerycznymi formami według wzorów II, II i/lub IV, w których HH jest peptydem zgodnym ze strukturą(I), lub jego postacią acylowaną na N-końcu i/lub amidowaną lub estryfikowaną na C-końcu, lub dowolnym z zalecanych peptydów zgodnych ze strukturą(I) opisanych tutaj.

W jeszcze innej zalecanej realizacji, rdzeniowe peptydy, które tworzą agonistów ApoA-I nie są żadnym z następujących peptydów:

peptyd 75:	PVLDEFREKLNEELEALKQKLK	(SEQ ID NO:	75);
peptyd 94:	PVLDEFREKLNEALEALKQKLK	(SEQ ID NO:	94);
peptyd 109:	PVLDEFREKLNERLEALKQKLK	(SEQ ID NO:	109)
peptyd 237:	LDDLLQKWAEAFNQLLKK	(SEQ ID NO:	237)
peptyd 238:	EWLKAFYEKYLEKLKELF*	(SEQ ID NO:	238)
peptyd 241:	DWFKAFYDKYFEKFKEFP	(SEQ ID NO:	241)
peptyd 242:	GIKKFLGSIWKFIKAFYG	(SEQ ID NO:	242)
peptyd 243:	DWFKAFYDKYAEKFKEAF	(SEQ ID NO:	243)
peptyd 244:	DWLKAFYDKYAEKLKEAF	(SEQ ID NO:	244)
peptyd 245:	DWLKAFYDKYFEKFKEFF	(SEQ ID NO:	245)
peptyd 246:	EWLEAFYKKYLEKLKELF	(SEQ ID NO:	246)
peptyd 247:	DWFKAFYDKFFEKFKEFF	(SEQ ID NO:	247)
peptyd 248:	EWLKAFYEKYLEKLKELF	(SEQ ID NO:	248)
peptyd 249:	EWLKAEYEKYEEKLKELF*	(SEQ ID NO:	249)
peptyd 250:	EWLKAEYEKYLEKLKELF*	(SEQ ID NO:	250)
peptyd 251:	EWLKAFYKKYLEKLKELF*	(SEQ ID NO:	251)
W ostatniej zalecanej realizacji, agoniści ApoA-I nie	są peptydami wymienionymi w Tabeli X

(Sekcja 8,3, poniżej) wykazującymi aktywność aktywacji LCAT mniejszą niż 38% w porównaniu z natywnym ludzkim ApoA-I.

5.2. Synteza i oczyszczanie agonistów peptydu ApoA-I.

Peptydy rdzeniowe tu opisane mogą być wytwarzane metodami znanymi ze stanu techniki służącymi do produkcji peptydów. Przykładowo, peptydy mogą być wytwarzane za pomocą standardowej etapowej syntezy peptydów w fazie ciekłej lub stałej, lub technikami rekombinowanego DNA.

5.2.1 Synteza chemiczna

Peptydy rdzeniowe mogą być wytwarzane przy użyciu konwencjonalnych syntez w roztworach lub w fazie stałej (zobacz np. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams i inni., wydanie 1997. CRC Press, Boca Raton Florida, i cytowane tam bibliografie; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, wydanie 1989, IRL Press, Oxford, Anglia, i cytowane tam bibliografie).

Ewentualnie, peptydy tu opisane mogą być wytwarzane przy użyciu kondensacji segmentów, jak to opisano np. w Liu i inni., 1996, Tetrahedron Lett. 37(7):933-936; Baca, i inni., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887; Tarn et a2., 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216; Schnolzer i Kent, 1992, Science 256:221-225; Liu i Tarn, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(10):4149-4153; Liu i Tarn. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6584-6588; Yamashiro i Li, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334). W szczególności, są to przypadki peptydów zawierających glicynę. Inne przydatne metody syntezy peptydów według wynalazku są opisane w Nakagawa i inni. 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092.

ApoA-I agoniści, zawierający N i /lub C końcowe grupy blokujące, mogą być wytwarzani przy użyciu standardowych technik chemii organicznej. Na przykład metody acylowania N-końca peptydu lub aminowania lub estryfikacji C-końca peptydu są dobrze znane specjalistom. Sposoby przeprowadzenia innych modyfikacji na N i/lub C końcu, jak również sposoby dostarczenia bocznych grup funkcjonalnych, które mogą być niezbędne do dołączenia końcowych grup blokujących będą oczywiste specjalistów w dziedzinie.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole (przeciwjony) mogą być przygotowane konwencjonalnie przez chromatografię jonowo wymienną lub przez inne metody dobrze znane w tej dziedzinie.

Związki opisane w wynalazku, które mają formę tandemu multimerów, mogą być konwencjonalnie syntetyzowane przez dodanie łącznika(ów) do łańcucha peptydowego, w odpowiednim momencie

PL 196 675 B1 syntezy. Alternatywnie mogą być także syntetyzowane helikalne cząsteczki, w taki sposób, że każda cząstka przereagowuje z łącznikiem. Oczywiście odpowiednie metody syntezy będą zależeć od układu łączników. Odpowiednie układy i związki chemiczne zabezpieczające są dobrze znane i będą oczywiste specjalistów w dziedzinie.

Związki tu opisane, które mają formę tandemowych sieci mogą być dogodnie syntetyzowane przy użyciu trimerów i tetramerów żywic i związków chemicznych opisanych w Tarn, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413 i Demoor i inni., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84. Modyfikowanie syntetycznych żywic i sposobów syntetyzowania rozgałęzionych żywic o większym lub mniejszym uporządkowaniu lub które zawierają kombinacje różnych segmentów helikalnych peptydów jądrowych są dobrze znane osobom biegłym w chemii peptydów i/lub chemii organicznej.

Tworzenie wiązań dwusiarczkowych, jeśli jest taka potrzeba, jest prowadzone w obecności łagodnie utleniającego czynnika. Mogą być użyte do tego celu czynniki utleniające chemicznie, lub po prostu w celu wytworzenia tych wiązań związki te mogą być poddane działaniu tlenu atmosferycznego. Specjalistom w tej dziedzinie znane są różne metody, jak choćby te opisane przez Tarn'a i innych., 1979, Synthesis 955-957; Stewart i inni., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d Ed., Pierce Chemical Company Rockford, IL; Ahmed i inni., 1975, J. Biol. Chem. 250:8477-8482; i Pennington i inni., 1991 Peptides 1990 164-166, Giralt i Andreu, Eds., ESCOM Leiden, The Netherlands. Dodatkowa możliwość jest opisana przez Kamber i inni., 1980, Helv. Chim. Acta 63:899-915. Metoda prowadzona na stałych nośnikach jest opisana przez Albericio, 1985, Int. J. Peptide Protein Res. 26:92-97. Do utworzenia wiązań dwusiarczkowych w peptydach według wynalazku może być zastosowana którakolwiek z metod opisanych.

5.2.2. Synteza rekombinacyjna

Jeśli peptyd lub jego część składa się z aminokwasów kodowanych wyłącznie przez gen, peptyd ten lub jego stosowną część można syntetyzować przy użyciu tradycyjnych technik rekombinacji stosowanych w inżynierii genetycznej.

Celem wytwarzania rekombinacyjnego sekwencję polinukleotydową kodującą peptyd wprowadza się do odpowiedniego nośnika, tzn. wektora zawierającego elementy konieczne dla transkrypcji i translacji wprowadzonej sekwencji kodującej lub w przypadku wirusowego wektora RNA -elementy konieczne do replikacji i translacji. Nośnik ekspresyjny jest następnie przenoszony do odpowiedniej komórki docelowej, która będzie wytwarzać peptyd. W zależności od użytego systemu ekspresyjnego wytworzony peptyd jest następnie izolowany za pomocą dobrze ustalonych procedur. Metody wytwarzania zrekombinowanego białka i peptydu są dobrze znane specjalistom (patrz np. Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; oraz Ausubel i wsp., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., z których każda jest tu w całości włączona poprzez odniesienia).

Dla zwiększenia wydajności wytwarzania, polinukleotyd można tak zaprojektować aby kodował zgrupowanie jednostek peptydu oddzielonych miejscami do cięcia przez enzymy - zarówno homopolimerów (powtórzone jednostki peptydowe) lub heteropolimerów (różne peptydy razem zlepione). Otrzymany peptyd można ciąć (np. przez działanie odpowiednim enzymem) w celu odzyskania jednostek peptydowych. Będzie to podnosiło ilość peptydów wytwarzanych przy użyciu pojedynczego promotora. W zalecanym wykonaniu policistronowy polinukleotyd można tak zaprojektować, że transkrybowany jest pojedynczy mRNA kodujący zgrupowanie peptydów (tzn. homopolimery lub heteropolimery), każdy kodujący obszar jest funkcjonalnie połączony z, niezależną od czapeczki, sekwencją kontrolującą translację; np. wewnętrznym miejscem wiązania rybosomu (IRES). Użycie odpowiedniego wirusowego systemu ekspresyjnego, pozwala na to, że translacja każdego peptydu kodowanego przez mRNA zależy od sekwencji położonej wewnątrz transkryptu; np. IRES. Zatem z policystronowego konstruktu zachodzi transkrypcja pojedynczego, dużego policistronowego mRNA, który kieruje translacją zgrupowania indywidualnych peptydów. Podejście to eliminuje wytwarzanie i enzymatyczne przetwarzanie polipeptydów i może znacząco podnieść wydajność otrzymywania peptydu z pojedynczego promotora.

Różnorodne systemy gospodarz-wektor ekspresyjny można wykorzystywać do wytwarzania opisanych tu peptydów. Obejmują one między innymi mikroorganizmy, takie jak bakteria stransformowana zrekombinowanym DNA bakteriofaga lub plazmidowym DNA wektorów ekspresyjnych zawierających odpowiednią sekwencję kodującą; drożdże lub grzyby nitkowate stransformowane zrekombinowanymi drożdżowymi lub grzybowymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi odpowiednią sekwencję

PL 196 675 B1 kodującą; systemy komórek owadów infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. bakulowirus) zawierającymi odpowiednią sekwencję kodującą; systemy komórek roślinnych infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirus -mozaiki kalafiora lub wirus mozaiki tytoniu) lub transformowanych zrekombinowanymi plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi (np. Plazmid Ti) zawierającymi odpowiednią sekwencję kodującą; lub systemy komórek zwierzęcych.

Elementy umożliwiające ekspresję różnych systemów ekspresyjnych różnią się siłą i specyficznością. W wektorze ekspresyjnym można użyć każdego z szeregu odpowiednich elementów transkrypcyjnych i translacyjnych, w zależności od wykorzystywanego systemu gospodarz/wektor, włączając promotory konstytutywne i indukowalne. Przykładowo, kiedy klonuje się w systemach bakteryjnych można użyć indukowalne promotory takie jak pL bakteriofaga λ, plac, ptrp, ptac (hybrydowy promotor ptrp-lac) i im podobne; kiedy klonuje się w systemach komórek owadów można użyć promotory, takie jak promotor polihedronu bakulowirusa; kiedy klonuje się w systemach komórek roślinnych można użyć promotory pochodzące z genomu komórek roślinnych (np. promotory szoku cieplnego); promotor małej podjednostki RUBISCO; promotor białka wiążącego chlorofil a/b) lub z wirusów roślinnych (np. promotor 35S RNA z CaMV; promotor białka płaszcza z TMV); kiedy klonuje się w systemach komórek ssaków można użyć promotory pochodzące z genomu komórek ssaków (np. promotor metalotioniny) lub wirusów ssaków (np. późny promotor adenowirusa; promotor 7.5 K wirusa krowianki); kiedy wytwarzane są linie komórkowe zawierające wiele kopii produktu ekspresji, można zastosować wektory oparte na SV40, BPV i EBV posiadające odpowiedni marker selekcyjny.

W przypadku użycia roślinnych wektorów ekspresyjnych ekspresja sekwencji kodującej peptydy według wynalazku może być kierowana przez dowolny z wielu promotorów. Przykładowo, można użyć wirusowych promotorów takich jak promotory 35S RNA i 19S RNA z CaMV (Brisson i wsp., 1984, Nature 310:511-514), lub promotor białka płaszcza TMV (Takamatsu i wsp., 1987 EMBO J. 6:307-311); alternatywnie stosuje się roślinne promotory takie jak promotory małej podjednostki RUBISCO (Coruzzi i wsp., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie i wsp., 1984, Science 224:838-843) lub szoku cieplnego np. soji hsp17.5-E lub hsp17.3-B (Gurley i wsp., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Konstrukty te można wprowadzać do komórek roślinnych przy użyciu plazmidów Ti, plazmidów Ri, wirusowych wektorów roślinnych, poprzez bezpośrednią transformację, mikroinikcję, elektroporacje itp. Dla przeglądu technik patrz np. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sekcja VIII, str. 421-463; oraz Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2-gie Wyd., Blackie, London Rozdz. 7-9.

W owadzim systemie ekspresyjnym, który można zastosować do wytwarzania peptydów według wynalazku, jako wektor do ekspresji obcych genów zastosowano wirus jądrowej polihydrozy Autographa californica (AcNPV). Wirus namnaża się w komórkach Spodoptera frugiperda. Sekwencję kodującą można klonować w regionach nieistotnych (przykładowo gen polihedronu) dla wirusa i wprowadzać pod kontrolę promotora AcNPV (przykładowo promotora polihedronu). Udane wprowadzenie sekwencji kodującej pozwoli na inaktywację genu polihedronu i wytwarzanie zrekombinowanych nie opłaszczonych wirusów (tzn. wirusów, które nie posiadają białkowego płaszcza kodowanego przez gen polihedronu). Takie zrekombinowane wirusy są następnie używane do infekcji komórek Spodoptera frugiperda, w których wprowadzony gen ulega ekspresji (np. patrz Smith i wsp., 1983, J. Virol. 46:584; Smith patent USA nr 4215051). Dalsze przykłady takich systemów ekspresyjnych można znaleźć w Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Ausubel i wsp., wyd., Green Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

Szereg opartych na wirusach systemów ekspresyjnych można wykorzystywać w komórkach ssaczych. W przypadku użycia adenowirusa jako wektora ekspresyjnego sekwencja kodująca jest ligowana z kompleksem kontrolującym transkrypcję/translację adenowirusa, np. późnym promotorem i trzyczęściową sekwencją liderową. Taki chimerowy gen można wprowadzić do genomu adenowirusa poprzez rekombinację in vitro i in vivo. W wyniku insercji w regionie nie istotnym dla genomu wirusa (np. region E1 lub E3) powstanie zrekombinowany wirus zdolny do życia i ekspresji peptydu w zainfekowanych komórkach gospodarza. (np. patrz Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659. Alternatywnie, można użyć promotor 7.5 K krowianki (patrz, np. Mackett i wsp., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett i wsp., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali i wsp., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).

Inne systemy ekspresyjne do wytwarzania peptydów według wynalazku są oczywiste dla specjalistów.

PL 196 675 B1

5.2.3 Oczyszczanie peptydów.

Peptydy według wynalazku można oczyszczać dobrze znanymi technikami takimi jak chromatografia z odwróconą fazą, wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia jonowymienna, elektroforeza w żelu, chromatografia powinowactwa i im podobne. Określone warunki zastosowane do oczyszczania danego peptydu będą częściowo zależały od strategii syntezy i czynników takich jak ładunek wypadkowy, hydrofobowość, hydrofilowość itp. i są oczywiste dla specjalistów. Multimeryczne rozgałęzione peptydy można oczyszczać np. przez chromatografię jonowymienną lub odcinającą daną wielkość.

W oczyszczaniu poprzez chromatografię powinowactwa można zastosować dowolne przeciwciało swoiście wiążące peptyd. Dla wytwarzania przeciwciał immunizuje się, poprzez wstrzyknięcie peptydu, różnych gospodarzy zwierzęcych między innymi króliki, myszy, szczury itp. Peptyd można przyłączyć do odpowiedniego nośnika takiego jak BSA poprzez grupę funkcyjną łańcucha bocznego lub przyłączenie łącznika do grupy funkcyjnej łańcucha bocznego. Dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej, w zależności od rodzaju gospodarza, można stosować różne adiuwanty między innymi adiuwant Freund'a (kompletny lub nie), żele mineralne takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne jak lizolektyna, niejonowe poliole, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocjaninę skałoczepa, dinitrofenol i potencjalnie przydatne adiuwanty ludzkie, takie jak BCG (bacilli Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum.

Przeciwciała monoklonalne dla peptydu można wytwarzać przy użyciu technik umożliwiających wytwarzanie cząsteczek przeciwciał w hodowlach ciągłych linii komórkowych. Obejmują one między innymi technikę hodowli hybrydomy opisaną pierwotnie przez Kohler i Milstein, 1975, Nature 256:495-497 lub Kaprowski patent USA nr 4376110, który jest tu włączany poprzez referencje; technikę hybrydomy ludzkich limfocytów B) Kosbor i wsp., 1983, Immunology Today 4:72, Cote i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030); i technikę hybrydomy EBV (Cole i wsp., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., str. 77-96 (1985)). Dodatkowo można użyć technik rozwiniętych celem wytwarzania „chimerowych przeciwciał” Morrison i wsp., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger i wsp., 1984, Nature 312:604-608; Takeda i wsp., 1985, Naturę 314:452-454, Boss, patent USA nr 4816397; Cabilly, patent USA nr 4816567; które są tu włączone poprzez referencje) poprzez złożenie genów dla cząsteczki mysiego przeciwciała o odpowiedniej swoistości z genami dla cząsteczek ludzkich przeciwciał o odpowiedniej aktywności biologicznej. Można wytwarzać „humanizowane” przeciwciała (patrz np. Queen, patent USA nr 5585089, który jest tu włączony poprzez referencje). Alternatywnie do wytwarzania przeciwciał złożonych z pojedynczego łańcucha, swoistych dla peptydu, można zaadaptować techniki opisane przy wytwarzaniu przeciwciał złożonych z pojedynczego łańcucha (patent USA nr 4946778).

Stosując techniki znane specjalistom można wytwarzać fragmenty przeciwciał zawierające delecje swoistych miejsc wiążących. Przykładowo fragmenty takie obejmują między innymi fragmenty F(ab')₂, które można wytwarzać poprzez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała, a także fragmenty Fab, które można wytwarzać poprzez redukcję mostków dwusiarczkowych we fragmentach F(ab')₂. Alternatywnie można konstruować biblioteki eksprymujące Fab (Huse i wsp., 1989, Science 246:1275-1281) pozwalające na szybkie i łatwe identyfikowanie monoklonalnych fragmentów Fab o żądanej swoistości do białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał można przyłączać, przykładowo, do agarozy a kompleks przeciwciało-agaroza jest stosowany w immunochromatografii do oczyszczania peptydów według wynalazku. Patrz Scopes, 1984, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlang Nowy Jork, Inc., NY Livingstone, 1974, Methods in Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731.

5.3 Kompozycje farmaceutyczne i sposoby stosowania

Agonistów ApoA-I według wynalazku można stosować do leczenia zaburzeń u zwierząt, szczególnie ssaków włączając ludzi, u których korzystne jest podniesienie stężenia HDL w surowicy, aktywacja LCAT i umożliwienie wypływu cholesterolu i RCT. Stany takie obejmują, między innymi, hiperlipidemię, w szczególności hipercholesterolemię, oraz chorobę sercowo-naczyniową jak miażdżyca naczyń (włączając leczenie i zapobieganie miażdżycy naczyń); restenoza (np. zapobieganie i leczenie płytek miażdżycowych rozwijających się w następstwie angioplastyki balonowej) oraz inne zaburzenia, takie jak endotoksemia, która często jest następstwem szoku septycznego.

PL 196 675 B1

Agonistów ApoA-I można stosować pojedynczo lub w kombinacji z innymi lekami stosowanymi przy leczeniu wymienionych stanów. Terapie takie obejmują między innymi jednoczesne lub następujące po sobie podawanie wymaganych leków.

Przykładowo przy leczeniu hipercholesterolemii lub miażdżycy naczyń preparaty agonisty ApoA-I można stosować z jedną lub większą liczbą preparatów obniżających poziom cholesterolu stosowanych obecnie np. ze złożami z kwasami żółciowymi, niacyna i/lub statyny. Taki skojarzony tryb leczenia może dawać dogodne wyniki terapeutyczne jako, że każdy lek działa na różne etapy syntezy i transportu cholesterolu; np. złoża z kwasami żółciowymi zaburzają recykling cholesterolu, populacje chilomikronów i LDL; niacyna przede wszystkim zaburza populację VLDL i LDL; statyny hamują syntezę cholesterolu, obniżając populację LDL (i prawdopodobnie podwyższając ekspresję receptora LDL); podczas gdy agoniści ApoA-I zaburzają RCT, podwyższają HDL, podwyższają aktywność LCAT i umożliwiają wypływ cholesterolu.

W innym wykonaniu wynalazku, agonistów ApoA-I można użyć w skojarzeniu z fibratami przy leczeniu hiperlipidemii, hipercholesterolemii i choroby sercowo-naczyniowej, takiej jak miażdżyca naczyń.

W jeszcze innym wykonaniu agonistów ApoA-I według wynalazku można użyć w kombinacji z czynnikami przeciwbakteryjnymi i przeciwzapalnymi aktualnie stosowanymi przy leczeniu wstrząsu septycznego wywołanego endotoksyną.

Angonistów ApoA-I według wynalazku można preparować jako peptydy lub jako kompleksy peptydowo-lipidowe, które można podawać pacjentowi różnymi drogami, celem dostarczania agonisty ApoA-I do układu krążenia. Przykłady kompozycji i sposobów podawania opisano poniżej.

5.3.1. ApoA-I agoniści i peptydowo/lipidowe kompleksy jako aktywne składniki.

Peptydy będące agonistami ApoA-I można syntetyzować lub produkować przy użyciu technik opisanych w Sekcji 5.2 i podsekcjach. Stabilne preparaty o długim okresie trwałości można wytwarzać -poprzez liofilizację peptydów - zarówno przy wytwarzaniu dużej ilości do ponownego przetworzenia lub przy wytwarzaniu indywidualnych porcji lub jednostek dawkowania, które można odtwarzać poprzez ponowne uwodnienie sterylną wodą lub odpowiednio zbuforowanym roztworem przed podaniem pacjentowi.

W pewnych wykonaniach może być zalecane wytworzenie i podanie agonisty ApoA-I w kompleksie peptydowo-lipidowym. Podejście takie ma szereg zalet, ponieważ kompleks powinien mieć przedłużony okres półtrwania w układzie krążenia, szczególnie kiedy kompleks ten ma podobną wielkość i gęstość do HDL a szczególnie do populacji HDL pre-e-1 i pre-e-2. Kompleksy peptyd-lipid można łatwo wytwarzać stosując każdą z wielu metod opisanych poniżej. Stabilne preparaty posiadające długi okres trwałości można wytwarzać poprzez liofilizację - podejściem zalecanym jest procedura koliofilizacji opisana poniżej. Zliofilizowane kompleksy można użyć do wytwarzana dużej ilości preparatu do ponownego przetworzenia lub do wytwarzania indywidualnych porcji lub jednostek dawkowania, które przed podaniem pacjentowi można odtwarzać poprzez ponowne uwodnienie sterylną wodą lub odpowiednio zbuforowanym roztworem.

Celem wytworzenia pęcherzyków lub kompleksów peptydowo-lipidowych można zastosować szereg metod znanych specjalistom. Można też zastosować wiele dostępnych technik wytwarzania liposomów lub proteoliposomów. Przykładowo dla wytworzenia kompleksów peptydy można współsonifikować (stosując łaźnię lub sondę wytwarzające ultradźwięki) z odpowiednimi lipidami. Alternatywnie peptydy można mieszać z przygotowanymi pęcherzykami lipidowymi w wyniku czego spontanicznie tworzą się kompleksy peptydowo-lipidowe. W jeszcze innym przypadku kompleksy peptydowo-lipidowe można wytwarzać metodą dializowania detergentowej np. mieszaninę peptydu, lipidu i detergentu poddaje się dializie aby usunąć detergent i odtworzyć lub wytworzyć kompleksy peptydowo-lipidowe (np. Jonas i wsp., 1986, Methods in Enzymol. 128:553-582).

Chociaż wszystkie wymienione podejścia są możliwe do przeprowadzenia, to z każdą z metod wiążą się jej własne szczególne problemy produkcyjne wynikające z kosztów, wydajności, odtwarzalności i bezpieczeństwa. Twórcy wynalazku opracowali nową prostą metodę wytwarzania peptydu lub kompleksów białkowo-lipidowych o cechach podobnych do HDL. Metoda ta może być stosowana do wytwarzania kompleksów peptyd ApoA-I-lipid i posiada następujące zalety: (1) Większość lub wszystkie „użyte składniki tworzą pożądane kompleksy dzięki czemu unika się strat materiału wyjściowego, co jest powszechne w innych metodach. (2) Można tworzyć zliofilizowane związki, które są bardzo stabilne w czasie przechowywania. Powstające kompleksy można odtwarzać bezpośrednio przed użyciem. (3) Powstające kompleksy zazwyczaj nie wymagają dalszego oczyszczania po wytworzeniu i przed użyciem. (4) Unika się związków toksycznych, takich jak detergenty, np. cholany. Co więcej

PL 196 675 B1 metoda produkcji może być z łatwością zastosowana na większą skalę i jest zgodna z produkcją GMP (tzn. w środowisku wolnym od endotoksyn).

Zgodnie z preferowaną metodą, peptyd i lipid są mieszane w układzie rozpuszczalnika, który umożliwia jednoczesne rozpuszczanie każdego składnika i który może być całkowicie usunięty poprzez liofilizację. W tym celu pary rozpuszczalników, muszą być uważnie dobrane tak aby zapewnić jednoczesne rozpuszczanie amfipatycznego peptydu i lipidu. W jednym z wykonań białko lub białka albo peptyd lub peptydy, które mają być wprowadzane do cząsteczek mogą być rozpuszczone w rozpuszczalniku wodnym lub organicznym lub w mieszaninie rozpuszczalników (rozpuszczalnik 1). Składnik (fosfo)lipidowy jest rozpuszczony w rozpuszczalniku wodnym lub organicznym lub w mieszaninie rozpuszczalników (rozpuszczalnik 2), który jest mieszalny z rozpuszczalnikiem 1 i te dwa rozpuszczalniki są mieszane. Alternatywnie peptyd i lipid można wprowadzać do systemu współrozpuszczalnika, tzn. mieszaniny mieszalnych rozpuszczalników. Odpowiednia proporcja peptydu (białka) do lipidu jest na początku określana empirycznie tak, że wytworzone kompleksy posiadają odpowiednie właściwości fizyczne i chemiczne tzn. zazwyczaj (lecz nie koniecznie) są podobnej wielkości jak HDL.

Wytworzona mieszanina jest zamrażana i liofilizowana do sucha. Czasami do mieszaniny musi być dodany dodatkowy rozpuszczalnik dla ułatwienia liofilizacji. Zliofilizowany produkt można przechowywać przez długi okres czasu i pozostaje on stabilny.

W przykładach realizacji opisanych poniżej peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) i fosfolipidy rozpuszczano oddzielnie w metanolu, łączono a następnie mieszano z ksylenem przed liofilizacją. Peptyd i lipid można razem dodać do mieszaniny dwóch rozpuszczalników. Alternatywnie roztwór peptydu rozpuszczonego w metanolu można mieszać z roztworem lipidu rozpuszczonego w ksylenie. Należy uważać, aby usunąć sól z układu rozpuszczalników tak, aby zapobiec wysalaniu peptydu. Wytworzony roztwór zawierający jednocześnie rozpuszczony peptyd i lipid w metanolu/ksylenie jest liofilizowany tak, aby powstał proszek.

Zliofilizowany produkt można odtwarzać w celu otrzymania roztworu lub zawiesiny kompleksu peptydowo lipidowego. W tym celu zliofilizowany proszek jest uwadniany w roztworze wodnym w odpowiedniej objętości (często 5 mg peptydu /ml, co jest wygodne do podawania w dożylnych zastrzykach).

W zalecanym wykonaniu zliofilizowany proszek jest uwadniany w buforowanym fosforanem roztworze soli lub roztworze soli fizjologicznej. Mieszaninę można mieszać bądź wytrząsać dla ułatwienia uwadniania i w większości przypadków etap odtwarzania powinien być prowadzony w temperaturze równej lub wyższej niż temperatura fazy przejścia składnika lipidowego kompleksów. W ciągu minut tworzy się klarowny preparat kompleksów lipidowo białkowych.

Próbka odtworzonego preparatu może być scharakteryzowana dla potwierdzenia, że kompleksy w preparacie posiadają żądany rozdział wielkości np. rozdział wielkości HDL. W tym celu można użyć chromatografii filtracyjnej w żelu. W przykładach realizacji opisanych poniżej, stosowany jest układ chromatografii w żelu Superose 6 FPLC Pharmacia. Stosowany bufor zawiera 150 mM NaCl w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7,4. Typowa objętość próbki wynosi 20 do 200 mikrolitrów kompleksów zawierających 5 mg peptydu/ml. Przepływ przez kolumnę wynosi 0,5 ml/min. Jako standardy do kalibracji kolumny stosuje się serię białek o znanej masie cząsteczkowej i średnicy stokesowskiej jak również ludzki HDL. Białka i kompleksy lipoproteinowe monitorowane są absorbancją lub rozproszeniem promieniowania świetlnego o długości 254 lub 280 nm.

Agoniści ApoA-I według wynalazku mogą występować w kompleksach z różnymi lipidami, włączając nasycone i nienasycone, naturalne i syntetyczne lipidy i/lub fosfolipidy. Odpowiednie lipidy obejmują między innymi fosfolipidy o krótkich łańcuchach alkilowych, fosfatydylocholinę z jaja, fosfatydylocholinę z soi, dipalmitoilofosfatydylocholinę, dimirystoilofosfatydylocholinę, distearoilofosfatydylocholinę, 1-mirystoilo-2palmitoilofosfatycholinę, 1-palmitoilo-2mirystoilofosfatydylocholinę, 1-palmitoilo-2stearoilofosfatydylocholinę, 1-stearoilo-2palmitoilofosfatydylocholinę, dioleoilofosfatydylocholinę, dioleofosfatydyloetanolaminę, dilauroilofosfatydyloglicerol, fosfatydylocholinę, fosfatydyloserynę, fosfatydyloetanolaminę, fosfatydyloinozytol, sfingomielinę, sfingolipidy, fosfatydyloglicerol, difosfatydyloglicerol, dimirystoilofosfatydyloglicerol, dipalmitoilofosfatydyloglicerol, distearoilofosfatydyloglicerol,

PL 196 675 B1 dioleoilofosfatydyloglicerol, kwas dimirystoilofosfatydowy, kwas palmitoilofosfatydowy, dimirystoilofosfatydyloetanolaminę, dipalmitoilofosfatydyloetanolaminę, dimirystoilofosfatydyloserynę, dipalmitoilofosfatydyloserynę, fosfatydyloserynę z mózgu, sfingomielinę z mózgu, dipalmitoilosfingomielinę, distearoilosfingomielinę, kwas fosfatydowy, galaktocerebrozyd, gangliozydy, cerebrozydy, dilaurylofosfatydylocholinę, (1,3)-D-mannozylo(1,3)digliceryd, aminofenyloglikozyd, 3-cholesterylo-6'-glikozylotio)heksyloeter glikolipidów. oraz cholesterol i jego pochodne.

Twórcy wynalazku stwierdzili, że kiedy agoniści ApoA-I według wynalazku tworzą kompleks ze sfingomieliną, cały HDL jest usuwany z cząstek typu pre-p. Zgodnie z powyższym, w zalecanym wykonaniu, agonistów ApoA-I podaje się jako kompleks ze sfingomieliną.

5.3.2. Zastosowanie w leczeniu

Peptydy agonistyczne ApoA-I lub kompleksy peptydowo-lipidowe według wynalazku można podawać dowolną drogą, która zapewnia ich dostępność biologiczną w układzie krążenia. Najlepiej można to osiągnąć podając je drogą pozajelitową, obejmującą zastrzyki dożylne (IV), domięśniowe (IM), śródskórne, podskórne (SC) i dootrzewnowe (IP). Jednakże można zastosować inne drogi podawania. Przykładowo, wchłanianie z przewodu pokarmowego można uzyskać przy podawaniu drogami doustnymi (obejmującymi między innymi połykanie, drogi policzkowe i podjęzykowe) przy założeniu, że stosuje się odpowiednie kompozycje (np. powłoki zabezpieczające przed strawieniem) aby uniknąć lub zminimalizować degradację składników aktywnych np. w niesprzyjającym środowisku błony śluzowej jamy ustnej, żołądka i/lub jelita cienkiego. Alternatywnie, można zastosować podawanie poprzez tkanki błony śluzowej, np. sposoby podawania dopochwowe lub doodbytnicze w celu uniknięcia lub zminimalizowania degradacji w przewodzie pokarmowym. Jeszcze inną alternatywę stanowi podawanie kompozycji według wynalazku przezskórnie (np. przez skórę właściwą) lub poprzez inhalację. Będzie oczywiste, że zalecana droga podawania może się zmieniać w zależności od stanu, wieku i zdyscyplinowania biorcy.

Konkretna dawka agonistów ApoA-I lub kompleksów peptydowo-lipidowych będzie się zmieniała w zależności od drogi podawania i powinna być doprowadzana do uzyskania stężenia w osoczu krwi od 100 mg/l do 2 g/l. Dane otrzymane w opisanych tu zwierzęcych systemach modelowych pokazują, że agoniści ApoAI według wynalazku łączą się ze składnikiem HDL, a obserwowany okres półtrwania u ludzi wynosi około pięciu dni. A zatem, według jednego z wykonań, agonistów ApoA-I można podawać w zastrzykach w dawce od 0,5 mg/kg do 100 mg/kg raz na tydzień. W innym wykonaniu, pożądany poziom w surowicy można utrzymywać poprzez wlew stały lub wlew przerywany dostarczający od około 0,5 mg/kg/godz. do 100 mg/kg/godz.

Toksyczność i skuteczność leczniczą różnych agonistów ApoA-I można określić stosując standardowe procedury farmaceutyczne w hodowli komórkowej lub zwierzęta doświadczalne do ustalenia LD50 (dawka letalna dla 50% populacji) i ED50 (dawka skuteczna leczniczo dla 50% populacji). Stosunek pomiędzy efektami toksycznymi i terapeutycznymi stanowi wskaźnik terapeutyczny i może on być wyrażany jako stosunek LD50/ED50. Zalecane peptydy agonistyczne ApoA-I mają wysoki wskaźnik terapeutyczny.

5.3.3. Kompozycje farmaceutyczne.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają peptyd agonistyczny ApoA-I lub kompleks peptydo-lipidowy jako składnik aktywny w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku odpowiednim do podawania i dostarczania in vivo. Ponieważ peptydy mogą zawierać kwaśne i/lub zasadowe końce i/lub łańcuchy boczne, peptydy mogą być zawarte w kompozycjach bądź w postaci wolnych zasad lub kwasów, bądź w postaci farmaceutycznie akceptowalnych soli.

Preparaty do wstrzykiwania obejmują sterylne zawiesiny, roztwory lub emulsje składników aktywnych w nośnikach wodnych lub oleistych. Kompozycje mogą również zawierać środki do wytwarzania mieszanin, takie jak czynniki do zawieszania, stabilizujące i/lub rozpraszające. Kompozycje do zastrzyków mogą być dostarczane w postaci pojedynczej dawki np. w ampułkach lub w wieloporcjowych pojemnikach, a także mogą zawierać dodatek środków konserwujących.

Alternatywnie, kompozycje do zastrzyków mogą być dostarczane w postaci proszku, rekonstytuowanego przed użyciem w odpowiednim nośniku, obejmującym między innymi sterylną, wolną od pirogenu wodę, bufor, roztwór dekstrozy, itd. Przechowywane preparaty można stosować w postaci pojedynczej dawki, rekonstytuowanej przed zastosowaniem in vivo.

Do przedłużonego dostarczania, składnik aktywny może być przygotowany jako depot, do podawania poprzez wszczepienie; np. wstrzyknięcia podskórne, śródskórne lub domięśniowe. A zatem,

PL 196 675 B1 przykładowo, składnik aktywny może być zmieszany z odpowiednim materiałem polimerycznym lub hydrofobowym (np. jako emulsja w akceptowalnym oleju) lub żywicy jonowymiennej, albo jako wolno rozpuszczalne pochodne; np. jako wolno rozpuszczalne sole agonisty ApoA-I.

Alternatywnie, można zastosować przezskórne systemy dostarczania wyprodukowane jako samoprzylepne krążki lub plastry, które powoli uwalniają składnik aktywny do przezskórnej absorpcji. W tym przypadku można zastosować wzmacniacze przepuszczalności dla ułatwienia penetracji przezskórnej aktywnego składnika. Szczególne korzyści można uzyskać przy włączeniu agonistów ApoA-I według wynalazku lub kompleksu peptydowo-lipidowego do plastrów nitroglicerynowych przy stosowaniu u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca i hipercholesterolemią.

Przy podawaniu doustnym, kompozycja farmaceutyczna może mieć postać na przykład tabletek lub kapsułek przygotowywanych w konwencjonalny sposób z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem, takim jak czynniki wiążące (np. wstępnie przekształcona w żel skrobia kukurydziana, poliwinylopirolidon lub metyloceluloza hydroksypropylowa); wypełniacze (np. laktoza, celuloza mikrokrystaliczna lub wodorofosfowran wapnia); smary (np. stearynian magnezowy, talk lub krzemionka) środki rozpraszające (np. skrobia ziemniaczana lub sodowy glikolan skrobiowy); lub czynniki zwilżające (np. sodowy siarczan laurylowy). Tabletki mogą być powlekane metodami znanymi w tej dziedzinie. Preparaty płynne do podawania doustnie mogą mieć na przykład postać roztworów, syropów lub zawiesin albo mogą występować w postaci produktów stałych do rekonstytuowania wodą lub innym odpowiednim nośnikiem przed użyciem. Takie preparaty płynne mogą być przygotowywane konwencjonalnymi sposobami z zastosowaniem farmaceutycznie akceptowalnych dodatków, takich jak środki do zawieszania (syrop sorbitolowy, pochodne celulozy lub utwardzone tłuszcze jadalne), środki emulgujące (np. lecytyna lub akacja); nośniki nie-wodne (np. olej migdałowy, estry oleiste, alkohol etylowy lub frakcjonowane oleje roślinne) oraz środki konserwujące (np. metylo- i propylo-p-hydroksybenzoesany lub kwas sorbowy). Preparaty mogą zawierać również jeśli trzeba, sole buforujące, środki smakowe, barwiące i słodzące. Preparaty do podawania doustnego mogą być odpowiednio sporządzone do uzyskiwania kontrolowanego uwalniania się związku aktywnego.

Przy podawaniu policzkowym, kompozycje mogą mieć postać tabletek lub pastylek do ssania sporządzonych w konwencjonalny sposób. Przy podawaniu drogą doodbytniczą lub dopochwową, składnik aktywny może być przygotowany jako roztwór (do lewatyw), czopki lub maści.

Do podawania poprzez inhalację, aktywny składnik może być konwencjonalnie dostarczany w postaci aerozolu z pojemników pod ciśnieniem lub rozpylacza z zastosowaniem odpowiednich propelentów np. dichlorodifluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetrafluorometanu, dwutlenku węgla i innych odpowiednich gazów. W przypadku aerozolu pod ciśnieniem pojedyncza dawka może być określana poprzez użycie zaworu w celu dostarczenie odmierzonej ilości. Można sporządzić kapsułki lub pojemniki np. żelatynowe do zastosowania w inhalatorze lub insuflatorze zawierające sproszkowaną mieszaninę związków w odpowiednim sproszkowanym podłożu, takim jak laktoza lub skrobia.

Kompozycje mogą, jeżeli to pożądane, opakowaniu lub dozowniku, które mogą zawierać jedną lub więcej pojedynczych dawek, składnika aktywnego. Opakowanie może przykładowo zawierać folię metalową lub plastykową, tak jak w standardowych opakowaniach powlekanych folią. Opakowanie lub dozownik mogą zawierać instrukcję stosowania.

5.4 Inne zastosowania

Agonistów ApoA-I według wynalazku można stosować w testach in vitro do mierzenia HDL w surowicy, np. dla celów diagnostycznych. Ponieważ agoniści ApoA-I wiążą się ze składnikiem HDL surowicy, agonistów można zastosować jako „markery” dla populacji HDL. Ponadto, agonistów można zastosować jako markery dla podpopulacji HDL, która jest skuteczna w RTC. W tym przypadku, agonistów można dodawać lub mieszać z próbką surowicy pacjenta; po odpowiednim czasie inkubacji, składnik HDL można testować poprzez wykrywanie włączonego agonisty ApoA-I. Można tego dokonać przy zastosowaniu wyznakowanych agonistów (np. znacznikami radioaktywnymi, znacznikami fluorescencyjnymi, znacznikami enzymatycznymi, barwnikami, itd.) lub poprzez testy immunologiczne przy zastosowaniu przeciwciał (lub fragmentów przeciwciał) swoistych wobec agonisty.

Alternatywnie, wyznakowanych agonistów można zastosować w procedurach obrazujących (np. skanach CAT, skanach MRI) do uwidaczniania układu krążenia lub śledzenia RCT albo do uwidaczniania akumulacji HDL w pręgach tłuszczowych, uszkodzeniach miażdżycowych, itd. (tam gdzie HDL powinien być aktywny w wypływie cholesterolu).

PL 196 675 B1

6. Przykłady syntezy peptydowych agonistów ApoA-I.

Peptydy opisane w tabeli X (paragraf 8.3) były syntetyzowane i określane jak to opisano w paragrafach poniżej. Peptydy były także analizowane, strukturalnie i funkcjonalnie jak to opisano w paragrafach 7 i 8.

6.1 Synteza peptydów rdzeniowych.

Peptydy syntetyzowano na fazie stałej zgodnie z techniką Merrifield (Merrifield, 1969, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154) przy zastosowaniu 0,25 mmol złoża ρ-alkoksybenzyloalkoholowego (złoże HMP) (Wang, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95:1328-1333) i reakcji chemicznej Fmoc. Wszystkie syntezy przeprowadzono w automatycznym syntetyzatorze peptydów Applied Biosystems ABI model 430A (Perkin Elmer, Foster City, CA). Czasy solwatacji i aktywacji stosowane w każdym cyklu łączenia są pokazane w Tabeli V poniżej:

T a b e l a V

Pojedyncze cykle aktywatora sprzęgającego

Nazwa cyklu	Zamierzone aminokwasy	Rozcieńczalnik	Czas	Czas aktywacji	Czas przenoszenia
6	Asn (trt), His (trt), Lys (Boc),Trp	~0,4 ml DCM ~12 ml NMP ~1,0 ml HOBt/NMP	~7 min	~51 min	1=50 sek. 2=36 sek.
afmc 32	Arg (Pmc), Gln (trt), Aib	~0,8 ml DCM ~1,2 ml NMP ~0,1 ml HOBt/NMP	~32 min	~51 min	1=60 sek. 2=40 sek.
afmc 33	Ala, Asp (OtBu), Glu (OtBu), Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro	~0,4 ml DCM ~0,8 ml NMP ~1,0 ml HOBt/NMP	~4 min	~36,5 min	1=38 sek. 2=27 sek.
afmc 34	Val	~0,4 ml DCM ~0, 8 ml NMP ~1,0 ml HOBt/NMP	~4 min	-61,5 min	1=38 sek. 2=27 sek.
* 1=przeniesienie z wkładki do aktywatora. 2= przeniesienie z aktywatora do wkładki.
DCC to dicykloheksylokarbodiimid, BOC to t-butylooksykarbonyl HOBT to 1-hydroksybenzortiazol, Pmc to pentametylochromano-6-sulfonyl, NMP to N-metylopirolidon, OtBu to t-butylo ester, trt to trityl

Żywice były przemywane NMP pomiędzy każdym etapem sprzęgania. Protokół dla jednego cyklu syntezy pokazano w poniższej tabeli VI:

T a b e l a VI

Protokół sprzęgania dla jednego cyklu syntezy

OPERACJA	CZAS (min.)
1. Odblokowywanie (10% piperydyna w NMP)	20
2. Przemywanie (NMP)	5
3. Sprzęganie (4. równoważ, estru Fmoc-aminokwas-HOBT w NMP,	61
wstępnie aktywowanego 50 min.)	3
4. Przemywanie	3
5. Próbka żywicy (ewentualnie)
Całkowity	92

Wszystkie aminokwasy oprócz Fmoc-e-(1-naftylo)alaniny są sprzęgane w ten sposób. Fmoc-β-(1-naftylo)alanina jest sprzęgana manualnie. Podczas takiego manualnego takiego sprzęgania rozPL 196 675 B1 puszcza się 1 mmol Fmoc-e-(1-naftylo)alaniny i 1 mmol 2-(1H-benzotriazolo-1-ylo)-(1,1,3,3-tetrametylouroniowego tetrafluoroboranu (TBTU) w 5 ml NMP i miesza się z żywicą-peptydową.

Następnie, dodaje się 2 mmol N-etylodiizopropyloaminy, mieszaninę wytrząsa się przez 2 godziny i żywice z peptydem przemywa się 6-ciokrotnie 10 ml NMP. Wydajność sprzęgania była kontrolowana za pomocą testu Keisera (Keiser, 1970, Anal. Biochem. 34:59577), i sprzęganie powtarzano w razie potrzeby. Po sprzęgnięciu naftyloalaniny, pozostałe etapy syntezy prowadzono automatycznie jak opisano powyżej.

6.2. Synteza amidów peptydowych

Wskazane w tabeli X (Sekcja 8,3, poniżej), amidy peptydów były syntetyzowane za pomocą żywicy amidowej Rink zawierającej przyłączający amidy 4-(2', 4'-dimetylofenylo)-Fmoc-fenoksymetyl (Rink, 1987, Tetrahedron Lett. 28:3787-3790) zgodnie z protokołem postępowania opisanym w Sekcji

6.1 powyżej.

6.3. Synteza peptydów acylowanych na N-końcu

Wskazane w tabeli X (Sekcja 8,3, poniżej), formy peptydów acylowane na N-końcu przygotowywano poprzez eksponowanie peptydów związanych z żywicą otrzymaną zgodnie z opisem w Sekcji

6.1 lub 6.2, powyżej, na działanie odpowiedniego czynnika acylującego.

W przypadku acylowanych na N-końcu peptydów, dodawano 15 ml roztworu bezwodnika octowego (10% obj./obj. w NMP) do każdego 1 g peptydu związanego z żywicą, mieszaninę wytrząsano przez 5 min i oddzielano żywicę poprzez filtrowanie. Odzyskana żywica była przemywana trzykrotnie NMP (15 ml) i trzykrotnie etanolem (15 ml).

6.4. Odtrawianie i odblokowywanie

Po syntezie, peptydy opisane w Sekcji 6.1, 6.2 i 6.3 powyżej, były odcinane od żywicy i odblokowywane roztworem odcinającym zawierającym 92,5% kwas trifluorooctowy (TFA)73,75% anizolu/3,75% dodekanotiolu (obj./obj./obj.). Aby osiągnąć cięcie, 10 ml roztworu odcinającego dodawano do 0,25 mmol peptydu na żywicy i mieszano przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Żywica była usuwana poprzez filtrację a odcięte/odblokowane peptydy strącane eterem dietylowym, przemywano eterem i suszono pod próżnią.

Mieszanina do odcinania peptydów zawierających Trp (W), oraz amidy peptydów, była przygotowywana z 86,5% TFA, 4,5% H2O, 4,5% 1,2-etanoditiolu, 4,5% anizolu i 3% fenolu.

6.5. Oczyszczanie

Surowe, odtrawione peptydy z Sekcji 6.4 oczyszczano poprzez HPLC z odwróconą fazą. Czystość każdego z peptydów była potwierdzana różnymi technikami analitycznymi (analityczna HPLC, elektroforeza kapilarna). Elektroforeza kapilarna była prowadzona na łączonych kapilarach silikonowych o długości 70 cm i średnicy wewnętrznej 75 urn (Thermo Separation Products). Rozdzielanie prowadzono przy 25°C, 15 kV, czasie biegu 35 min., w dwóch różnych układach buforowych: bufor 1 (20 mM Na2B4O7, pH 9.2) i buforze 2 (10 mM Na2HPO4, pH 2.5). Rozdzielanie HPLC prowadzono na kolumnach Nucleosil 7C18 lub Nucleosil 7C4 (Macherey i Nagel, Niemcy), 250 x 21 mm, przy przepływie 8 ml/min. Gradient elucji otrzymywano korzystając z mieszaniny 0,1% TFA w wodzie (Rozpuszczalnik A) i 0,1% TFA w acetonitrylu (Rozpuszczalnik B). Stosowane gradienty były dobierane stosownie do każdego peptydu.

6.6. Charakteryzowanie

Analiza masowa i aminokwasowa oczyszczonych peptydów opisanych w Sekcji 6.5 była potwierdzana spektrometrią masową i analizą aminokwasową, odpowiednio, zgodnie z poniższym opisem. Degradacja Edmana została zastosowana do sekwencjonowania.

6.6.1. LC-MS

Dostępny komercyjnie trzystopniowy kwadrupolowy spektrofotometr masowy (model TSQ 700, Finnigan MAT, San Jose CA, USA) został zastosowany do określenia masy. Przystawka pneumatycznie podająca elektorsprej (ESI) została zastosowana do wprowadzania próby do źródła jonizacyjnego pod ciśnieniem atmosferycznym spektrofotometru masowego. Rozpryskiwacz przystawki był ustawiony na dodatni potencjał 4,5 kV. Temperatura kapilary stalowej była utrzymywana na 200°C natomiast temperatura wydechu wynosiła 70°C. Jony dodatnie generowane przez ten proces parowania jonowego poddawano analizie w spektrometrze masowym. Wzmacniacz był ustawiony na 1000 V. Przedział analizatora masy spektrometru masowego był 4E-6. Wszystkie wyniki były mierzone przy rozdzielczości < 1 u.

Peptydy analizowano poprzez bezpośrednią infuzję oczyszczonych peptydów stosując ABI (Applied Biosystem) system wstrzykujący posiadający pompkę strzykawkową (model 140B), detektor UV (model 785A) oraz piec/wtryskiwacz (model 112A). Układ rozpuszczalników składał się z wody (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B), każdy zawierał 0,1% TFA. Peptydy wprowadzano

PL 196 675 B1 za pomocą zarówno gradientu jak i warunków izokratycznych i poddawano elucji z kolumny Aquapore C18. Szybkość przepływu wynosiła zwykle 300 pl/min. Stężenie każdego z peptydów wynosiło około 0,03 mg/ml, wstrzykiwano po 20 pl każdego (np. 30 pmol).

Pełnozakresowe eksperymenty MS przeprowadzono poprzez skanowanie kwadrupola 1 z m/z 500-1500 w 4 sek. Dane zliczano za pomocą stacji Alpha DEC i poddawano obróbce cyfrowej za pomocą oprogramowania dostarczanego przez Finnigan MAT (Bioworks).

6.6.2. Analiza aminokwasowa

Analiza aminokwasowa była prowadzona na analizatorze ABI (Applied Biosystems) 420 Amino Acid Analyzer. System ten składa się z trzech modułów: instrumentu hydrolizującego i różnicującego, HPLC z odwróconą fazą i systemu do obróbki danych. Próby peptydów były podawane (trzykrotnie w grupach trójkowych) na płytki ze szkła porowatego i kolejno hydrolizowane w fazie gazowej (155°C, 90 min). Po usunięciu HCL, uzyskane aminokwasy przekształcano w PTC-AA (fenylo-tiokarbamoiloaminokwasy) stosując PITC (fenyloizotiocjanian). Po przekształceniu próby HPC z uzyskanej mieszaniny były frakcjonowane na kolumnie Aquapore C18 stosując gradient (Rozpuszczalnik A: 50 mmol octanu amonu (NH4Ac), pH 5,4 w wodzie; Rozpuszczalnik B: 32 mmol octan sodu (NaOAc) w uwodnionym acetonitrylu) w kontrolowanych warunkach temperaturowych. Dane z HPLC były poddawane obróbce za pomocą pakietu oprogramowania dostarczanego przez Applied Biosystems. Ocena ilościowa była dokonywana względem standardów dostarczanych przez Applied Biosystems.

6.7. Synteza rozgałęzionych sieci

Tetrameryczna rdzeniowa żywica peptydylowa i trimeryczna rdzeniowa żywica peptydylowa były syntetyzowane zgodnie z opisem Demoor i wsp., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84. Tetrameryczna i trimeryczna żywica rdzeniowa, ciągle jeszcze związana z żywicą 4-metylobenzohydryloamidową była następnie stosowana jako wyjściowa żywica peptydylowa w automatycznej syntezie peptydów rdzeniowych opisanych powyżej.

Rozgałęzione sieci zawierające segmenty helikalne z różnym składem aminokwasowym mogą być syntetyzowane za pomocą syntezy ortogonalnej i metod blokowania dobrze znanych ze stanu techniki.

7. Przykład: analiza strukturalna peptydów ApoA-I i analiza wiązania się ich z lipidami.

Charakterystykę strukturalną i wiązanie się z lipidami oczyszczonych peptydów syntetyzowanych zgodnie z opisem w sekcji 6, powyżej, określano metodą dichroizmu kołowego (CD)/spektroskopii fluorescencyjnej i jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR).

7.1. Dichroizm kołowy

Przykład ten opisuje zalecaną metodę określania stopnia helikalności peptydów rdzeniowych tu opisanych, zarówno wolnych w buforze, jak i w obecności lipidów.

7.1.1. Metoda eksperymentalna

Widma dichroizmu kołowego w dalekim UV otrzymywano pomiędzy 190 a 260 nm (przy rozdzielczości 0,5 nm lub 0,2 nm) za pomocą spektrometru AVIV62DS. (AVIV Associates, Lakewood, NJ, USA) wyposażony w termoelektryczny statyw do kuwet i zmiennik próbek. Przyrząd był kalibrowany za pomocą kwasu (+)-10-kamforowego. Dla każdej próby otrzymywano od jednego do trzech odczytów, stosując kuwety kwarcowe Suprasil o długości toru 10 cm, 5 cm, 1 cm i 0,1 cm, odpowiednio, dla peptydów w stężeniach od 10^-7 do 10^-4 M. Szerokość pasma ustalano na 1,5 nm a prędkość skanowania na 1 sek. na każdy skok długości fali. Przedstawione dane były uśredniane z co najmniej 2 lub 3 niezależnych pomiarów.

Po odjęciu tła, widma były przeliczane na eliptyczność molową (θ) na resztę w stopniach cm^-2dmol^-1. Stężenie peptydu było określane metodą analizy aminokwasowej a także spektrometrią absorpcyjną na spektrometrze Perkin Elmer Lambda 17 UV/Visible, gdy peptyd zawierał chromofor (tryptofan, dansyl, naftyloalanina).

Widma CD uzyskiwano dla wolnych, niezwiązanych peptydów (5 pM w 5 mM buforze fosforanowym, pH 7,4); dla kompleksów peptyd-SUV (20:1 EPC:Chol., Ri=30 i Ri=50); dla kompleksowych micelli peptydowych (1-mirystoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfatydylocholina, Ri=100); i dla wolnego, niezwiązanego peptydu w obecności 2,2,2-trifluoroetanolu (TFE) (5 pM peptydu, 90% obj. TFE).

SUV uzyskiwano poprzez dyspersję lipidów (10 mM, 20:1 EPC:Chol., Avanti Polar Lipids, AL) w buforze fosforanowym (5 mM, pH 7,4) przedmuchiwanym N2 przez 5 min, następnie poddawanym sonifikacji (1 godz.) w sonifikatorze kąpielowym. Homogenność preparatu sprawdzano przez FPLC.

Micelle były otrzymywane poprzez rozpraszanie lipidów (6 mM 1-mirystoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfatydylocholina, Avanti Polar. Lipids, AL) w buforze fosforanowym (5 mM, pH 7,4) przedmuchiwanym N2 przez 5 min, następnie poddawanym gwałtownemu wytrząsaniu.

PL 196 675 B1

W celu uzyskania kompleksów peptyd-SUV, SUV były dodawane do peptydu (5 ąM w 5 mM buforu fosforanowego, pH 7,4) przy stosunku molowym fosfolipid-peptyd (Ri) od 30 do 50.

W celu uzyskania kompleksów micella-peptyd, micelle były dodawane do peptydu (5 ąM w 5 mM buforu fosforanowego, pH 7,4) przy Ri wynoszącym 100.

Wszystkie widma uzyskiwano przy 37°C. Stabilność peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) w funkcji temperatury (zarówno wolnego w buforze, jak i w micellach) została określona poprzez zapisy widma w serii różnych temperatur.

Określono także stopień helikalności peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) w funkcji stężenia.

7.1.2. Określanie helikalności

Stopień helikalności peptydów w różnych warunkach był określany na podstawie średniej eliptyczności reszt przy 222 nra (Chen i wsp., 1974, Biochemistry 13:3350-3359) lub poprzez porównanie otrzymanych widm CD w porównaniu do helikalnych widm referencyjnych dostępnych w bazach danych z Provencher & Glockner, 1981, Biochemistry 20:33-37; spektra odnośnikowe zdenaturowanych białek na podstawie Venyaminov i wsp., 1993, Anal. Biochem. 214:17-24) za pomocą algorytmu dopasowania krzywej CONTIN wersja 2DP, CD.1 pakiet (Sierp. 1982) (Provencher, 1982, Comput. Phys. Commun. 27:213-227, 229-242). Odpowiednie dopasowanie określano stosując metodę analizy statystycznej dostarczaną przez .algorytm CONTIN. Błąd wszystkich metod wynosił ± 5% heliakalności.

7.1.3. Wyniki

Stopień helikalności (%) wolnych, niezwiązanych peptydów (wolnych), kompleksów peptyd-SUV (SUV), kompleksów peptyd-micella (mic) i peptyd-roztwór TFE został przedstawiony w tabeli X, Sekcja

8.3, poniżej. Stopień helikalności peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) jako funkcja stężenia (wolny i związany z lipidami) został przedstawiony w Tabeli VII.

T a b e l a VII % helikalności peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) jako funkcja stężenia

Stężenie (ąM)	Wolny	% Helikalności związany (micelle)	TFE
0,15	42	65	_-
0,40	58	68	-
2,0	63	-	-
5,0	80	95	-
50,0	-	-	94

Peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) zawiera znaczący udział struktur helikalnych (80% helikalności) w buforze przy stężeniu 5 ąM. Pomimo tego, że stopień helikalności spada wraz za spadkiem stężenia peptydu, znaczna helikalność (42%) została stwierdzona nawet przy stężeniu tak niskim jak 0,15 ąM. Ponadto, struktura α-helisy jest całkowicie stabilna w zakresie temperatur 5-45°C (dane niepokazane).

Helikalność peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) wzrasta w obecności zarówno SUV (97% helikalności) jak i micelli (95% helikalności), a także w obecności TFE (94% helikalności), który jest rozpuszczalnikiem posiadającym stałą dielektryczną (ε = 26,7) dużo niższą niż woda (ε = 78,4), stabilizującym α-helisy i międzypeptydowe wiązania wodorowe dla stężeń, pomiędzy 5-90% (obj./obj.).

Analizując dane przedstawione w Tabeli X, Sekcja 8,3, poniżej, można stwierdzić, że peptydy, które wykazują wysoki stopień aktywacji LCAT (> 38%) ogólnie posiadają znaczący udział struktury α-helisy w obecności lipidów (> 60%) struktury helikalnej w przypadku nieblokowanych peptydów zawierających 22 lub więcej aminokwasów lub zablokowane peptydy zawierające 22 lub mniej aminokwasów; > 40% struktury helikalnej w przypadku nieblokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów), przy czym peptydy wykazujące niską lub żadną aktywację LCAT posiadają niski udział struktury α-helisy. Jednakże, w pewnych przypadkach, peptydy zawierające znaczny udział struktury α-helisy w obecności lipidów nie wykazują znaczącej aktywacji LCAT. Zatem, zdolność peptydów rdzeniowych tu opisanych do przyjmowania struktury α-helikalnej w obecności lipidów została uznana za krytyczną cechę peptydów rdzeniowych tu opisanych, jako że zdolność do tworzenia α-helisy w obecności lipidów wydaje się być warunkiem wstępnym dla aktywacji LCAT.

7.2. Spektroskopia fluorescencyjna

Zdolność do wiązania lipidów przez peptydy syntetyzowane w sekcji 6, powyżej, była testowana za pomocą pomiarów fluorescencyjnych wykorzystujących znakowane peptydy, w tym przypadku za pomocą tryptofanu (Trp lub W) lub naftyloalaniny (Nal). Widma fluorescencyjne były otrzymywane za pomocą aparatu Fluoromax produkowanego przez Spex (Jobin-Yvon) wyposażonego w lampę ksehonową o mocy 150 W, dwa monochromatory (wzbudzeniowy i emisyjny), fotopowielacz R-928 służący do

PL 196 675 B1 detekcji w podczerwieni do 850 nm i termoelektryczny statyw do kuwet pomiarowych umożliwiający mieszanie mieszadłem magnetycznym. Kuwety Quartz Suprasil były stosowane do pomiarów w przedziale stężeń mikromolarnych. Przystawka ze zmiennymi szczelinami (od 0,4 do 5 nm) umożliwia modulowanie wchodzących i emitowanych intensywności w zależności od stężenia zastosowanego peptydu. Przedstawione wartości są na ogół średnią z 2 do 4 widm. Stężenie peptydu określa się poprzez spektrometrię absorpcyjną przy użyciu Philips PU 8800 stosując pasmo absorpcji Trp (ε280 nm=5,550 M^-1 cm^-1w buforze Tris) lub Nal (ε280 nm=5,550 M^-1cm^-1 w metanolu).

Widma fluorescencyjne peptydów były otrzymywane pomiędzy 290 nm a 450 nm w buforze Tris-HCl (20 mM, pH = 7,5), w obecności i braku pęcherzyków lipidowych. Małe jednowarstwowe pęcherzyki były otrzymywane po rehydratacji liofilizowanych fosfolipidów w buforze, rozproszeniu i typowej sonifikacji w strumieniu N2. Stosowane lipidy to PC z jaja/Chol. (20:1) lub POPC/Chol. (20:1). Widma otrzymywano przy stężeniu peptydów 2 μΜ i temperaturze 37°C. Standardowym odnośnikiem fluorescencyjnym w przypadku Trp był N-acetylotryptofanyloamid (NATA).

Badanie wiązania lipidów następowało poprzez stopniowe dodawanie pęcherzyków lipidowych do roztworu peptydu o stężeniu 2 μΜ (szczelina 5 nm dla wzbudzania i 1,5 nm dla emisji). Wpływ rozcieńczenia został również uwzględniony podczas określania intensywności fluorescencji. Stężenia lipidu zmieniały się od 10 do 600 μΜ, a stosunek molowy lipidu do peptydu (Ri) zmieniał się od 5 do 300. Długość fali wzbudzającej była ustawiona na 280 nm zarówno w przypadku Trp jak i Nal.

7.2.1. Spektralna analiza fluorescencyjna

Dane były bezpośrednio zapisywane i poddawane obróbce przez IBM-PC przyłączony do spektrofluorymetru za pomocą oprogramowania DM3000F oferowanego przez Spex. Spektra były korygowane o udział rozpuszczalnika i uwzględniano również podany przez konstruktora aparatu współczynnik uwzględniający zmianę odpowiedzi fotopowielacza w zależności od długości fali.

Widma fluorescencyjne peptydów były charakteryzowane przez długość fali odpowiadającą maksymalnej emisji fluorescencji i wydajność kwantową porównywaną z NATA w przypadku peptydów znakowanych Trp. Proces wiązania lipidów był analizowany poprzez obliczanie przesunięcia długości fali odpowiadającej maksymalnej emisji fluorescencji (λ_Π3Χ) i zmian względnej intensywności emisji fluorescencji w zależności od stężenia lipidu. Względna intensywność fluorescencji została zdefiniowana jako następujący stosunek: (I-I₀kma_X/Ic^ma_X. I oraz I₀ były mierzone przy (λ_Π3Χ) odpowiadającej początkowemu stanowi wolnemu peptydu, tj. bez lipidów. I jest intensywnością dla danego peptydu w obecności określonego lipidu, natomiast I0 jest intensywnością mierzoną przy braku obecności lipidu. Brak różnic między tymi dwoma parametrami świadczy o braku oddziaływań pomiędzy peptydem i lipidem.

7.2.2. Wyniki i dyskusja

Zdolność do wiązania się z lipidem peptydu 15 (SEQ ID NO: 15) (który jest peptydem 4 zawierającym Trp w pozycji 10) zostały przedstawione w Tabeli VIII.

T a b e l a VIII

Zdolność wiązania się peptydu 15 (SEQ ID NO: 15) z pęcherzykami lipidowymi mierzona fluorescencyjne

Lipid: peptyd stosunek molowy (Ri)	I/I0	λ max (nm)
0	0	332
5	10,8	323
10	13,2	323,5
30	17,5	323
100	26,4	323
200	43,5	323

Maksymalna emisja tryptofanu (λ_Π3Χ) przy 332 nm wskazywała na to, że w obecny w buforze peptyd w stężeniu 2 μΜ ulega niewielkiemu wiązaniu wzajemnemu. Wiązanie się peptydu do pęcherzyków lipidowych (EPC/Chol 5%) z bardzo wysokim powinowactwem objawia się przesłanianiem Trp (dochodzi do przesunięcia długości fali odpowiadającej maksimum emisji Trp z 332 nm do 323 nm) oraz wyraźnym zwiększeniem natężenia fluorescencji (patrz Tabela VIII). Maksymalne przesłonięcie reszty Trp jest otrzymywane dla bardzo małych wartości stosunku molowego lipidu do peptydu poniżej 5.

Inne peptydy wykazujące wysoki udział struktury helikalnej w obecności lipidów (> 60% dla niezablokowanych peptydów posiadających > 22 aminokwasy, lub zablokowanych peptydów posiadających < 18 aminokwasów; > 40% dla niezablokowanych peptydów posiadających < 18 aminokwasów)

PL 196 675 B1 co stwierdzono na podstawie pomiarów dichroizmu kołowego zgodnie z opisem w sekcji 7.1, powyżej, także wykazują dobre wiązanie się z lipidem. Oczywiście, wśród wszystkich peptydów wybranych na podstawie selekcji techniką dichroizmu kołowego, tylko te, które mogły dawać fluorescencję były poddawane testom wiązania się z lipidami.

7.3. Jądrowy rezonans magnetyczny (NMR)

Przykład ten opisuje technikę NMR zastosowaną do analizy struktury peptydów rdzeniowych tu opisanych.

7.3.1. Przygotowywanie prób do NMR

Próbki były przygotowywane poprzez rozcieńczanie 5 mg peptydu w 90% H2O/10% D2O zawierającej śladowe ilości sulfonianu 2,2-dimetylo-2-sila-5-pentanowego (DSS), który służył jako wewnętrzny odnośnik pozwalający ustalić przesunięcie chemiczne. Pewne próbki zawierały trifluoroetanol (TTE) (wyrażony w % obj.). Całkowita objętość próby wynosiła ok. 500 μl a stężenie peptydu około 5 mM.

7.3.2. Spektroskopia NMR

Widma ¹H NMR zebrano przy 500 MHz stosując spektrometr Bruker DRX500 wyposażony w jednostkę kontrolującą temperaturę B-VT2000. Jedno i dwuwymiarowe eksperymenty były zapisywane przy zastosowaniu standardowej sekwencji pulsów. (Two Dimensional NMR Spectroscopy, Eds. W. R. Croasmun i RMK Carlson, 1994, VCH Publishers, New York, USA). Hamowanie wodą było uzyskiwane przy niskim nasyceniu wstępnym przez 2 sek. Dwuwymiarowe eksperymenty przeprowadzano w trybie wrażliwych faz stosując proporcjonalne do czasu zwiększanie fazy (TPPI) i szerokość spektrum 6000 Hz w obydwu wymiarach. Zwykle 40 odczytów było dodawanych zwiększenia 400 t1 z 2048 punktami danych. Dane były poddawane obróbce za pomocą oprogramowania FELIX95 (Molecular Simulations) na stacji roboczej INDIGO2 (Silicon Graphics). Dane były wypełniane zerami, aby otrzymać 2K x 2K tablice danych i odwracane o 45° dzwonową funkcją sinusoidalną.

7.3.3. Ustalanie widma NMR

Pełne widma protonowego rezonansu były otrzymane poprzez zastosowanie kolejnych technik stosujących widma DQFCOSY, TOCSY i NpESY opisane w literaturze (Wultrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, 1986, John Wiley & Sons, New York, USA). Drugorzędowe przesunięcie chemiczne było wyliczane dla protonów HN i Ha poprzez wykorzystanie stabelaryzowanych przesunięć chemicznych dla przypadkowych skrętów (Wishart i Sykes, 1994, Method. Enz. 239:363-392) odpowiadających wartościom eksperymentalnym.

7.3.4. Wyniki i dyskusja

Ogólne wnioski. Amfipatyczne peptydy helikalne wykazują tendencję do tworzenia kompleksów w roztworach wodnych przy wysokich stężeniach potrzebnych do spektroskopii NMR, co utrudnia uzyskanie widm o wysokiej rozdzielczości. Przykładowo, widma NMR przykładowego peptydu rdzeniowego 4 (SEQ ID NO: 4) w wodzie pokazują bardzo szerokie linie. Stąd też nie można rodzielić rezonansu dla każdego z aminokwasów. Dodanie TFE do próbki, zwiększa rozdzielczość widma. TFE jest znanym rozpuszczalnikiem peptydów, i dodatkowo stabilizuje konformację helikalną peptydów posiadających skłonność do tworzenia helis. Wyniki uzyskane w spektroskopii NMR zostały zaprezentowane dla peptydu 4 (SEQ ID NO: 4), który jest przykładem reprezentacyjnym. Dla porównania badano 22-mer konsensusowy Segresta (SEQ ID NO: 75).

Drugorzędowe przesunięcie chemiczne. Protonowe przesunięcie chemiczne aminokwasów zależy zarówno od typu reszty bocznej, jak i lokalnej drugorzędowej struktury w peptydzie lub białku (Szlagyi, 1994, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 27:325-443). Dlatego, zidentyfikowanie regularnej drugorzędowej struktury jest możliwe poprzez porównanie eksperymentalnych przesunięć z wartościami stabularyzowanymi dla konformacji kłębka statystycznego.

Tworzenie α-helis zwykle powoduje ujemne przesunięcie rezonansu Ha. Obserwowanie ujemnego przesunięcia Ha dla kilku kolejnych reszt jest generalnie uznawane za dowód istnienia struktury helikalnej. Drugorzędowe przesunięcie dla peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) w 25% TFE przy 295K wykazywało znaczące ujemne przesunięcie dla reszt 4 do 19 (fig. 9A), pokazując wysoki udział konformacji helikalnej. Małe różnice zostały zaobserwowane w przesunięciach chemicznych Ha dla 22-mera konsensusowego (SEQ ID NO: 75) porównanego z peptydem 4 (SEQ ID NO: 4).

Przesunięcia chemiczne wodorów amidowych w resztach aminokwasowych obecnych w regionie a-helis były także przesunięte ujemnie w odniesieniu do przesunięć chemicznych obserwowanych dla kłębka statystycznego. Ponadto, można zaobserwować okresowość przesunięć HN, co odpowiada okresowi skrętów helisy. Amplituda zmian przesunięć wzdłuż sekwencji jest związana z hydrofobowością peptydu helikalnego. Wyższy moment hydrofobowy prowadzi do zwiększonej oscylacji (Zhou

PL 196 675 B1 i wsp., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:4320-4326). Drugorzędowe przesunięcia HN dla peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) w 25% TFE przy 295 K wykazują charakter oscylacyjny co pozostaje w zgodzie z amfipatyczną naturą helisy (fig. 9B). Wzór ułożenia amidowych przesunięć chemicznych dla konsensusowego peptydu 22-aminokwasowego (SEQ ID NO: 73) różni się znacznie od uzyskanego dla peptydu 4 (SEQ ID NO: 4). W szczególności, zastąpienie reszt 5, 9, i 13 Leu (L) daje przesunięcie chemiczne o bardziej widocznej okresowości w przypadku peptydu 4 (SEQ ID NO: 4). Efekt ten rozciąga się nawet do reszty 17, a słabiej nawet do reszty 21. Z danych NMR, można wywnioskować istnienie 5-6 skrętów dla sekwencji. Zatem, zastąpienie trzech aminokwasów wpływa na zwinięcie peptydu na całej jego długości. Widma NMR wyraźnie odzwierciedlają wysoce hydrofobową naturę peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) w porównaniu z konsensusowym 22-merem peptydu Segrest-a (SEQ ID NO: 75).

Na drugorzędowe przesunięcie protonów amidu ma wpływ długość wiązania między wodorem a tlenem karbonylowym w odległości jednego skrętu helisy. Dlatego, obserwowana okresowość przesunięcia chemicznego odpowiada różnym długościom wiązań wodorowych. Ta różnica jest związana z ogólnym zakrzywionym kształtem szkieletu helisy. Reszty hydrofobowe są umieszczone po stronie wewnętrznej. Drugorzędowe przesunięcia dla peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) wskazują na skręconą konformację α-helisy.

7.3.5. Peptydy zawierające wewnętrzną glicynę są helikalne w obecności TFE

Trójwymiarowa struktura peptydu 8 (SEQ ID NO: 8) została określona w obecności TFE za pomocą Jądrowego Efektu Overhasera (NOE) dotyczącego odległości między protonami. W szczególności, obecność średnio zakresowego NOE (daN₃, dae₃, daN₄) wzdłuż całej sekwencji odpowiada całkowitej strukturze α-helisy. Rodzina konformerów została przygotowana na podstawie zbioru danych uzyskanych w NMR i rzutom strukturalnym dla reszt 4 do 19 z osiowym RMSD < 0,8 A. Dwuwymiarowe przedstawienie wstęgi na podstawie uśrednionej struktury wraz z przebiegiem osi dla 15 konformerów o najniższej energii potwierdziło helikalny kształt skręcony. W uśrednionych wynikach przybliżone zgięcie wynosiło. 20° pomiędzy N-końcową a C-końcową połówką peptydu. Reszty hydrofobowe były zwykle umieszczone wewnątrz, za wyjątkiem Leu-5. Dobrze zdefiniowany kompleks hydrofobowy znajduje się wokół Phe-6 włączając Leu-3, Leu-9 i Leu-10. Ponieważ skręty helisy rozpoczynają się wokół reszty 3 na N-końcu, istnienie kilku NOE do reszty 22 sugeruje, że helisa rozciąga się do C-końca.

8. Przykład: Oznaczenie aktywacji LCAT

Peptydy syntetyzowane zgodnie z opisem w sekcji 6, powyżej były analizowane in vitro pod kątem ich zdolności do aktywowania LCAT. W oznaczeniu LCAT, pęcherzyki substratowe (małe jednowarstwowe pęcherzyki określane jako „SUV”) przygotowywano z pochodzącej z jaj fosfatydylocholiny (EPS) lub 1-palmitoilo-2-oleilo-fosfatydylocholiny (POPC) oraz znakowanego radioaktywnie cholesterolu były inkubowane wstępnie z równoważnikami masowymi odpowiedniego peptydu lub ApoA-I (izolowanej z ludzkiego osocza). Reakcja była inicjowana poprzez dodawanie LCAT (izolowanej z ludzkiego osocza). Natywna ApoA-I, stosowana jako kontrola pozytywna, odpowiada 100% aktywności aktywacyjnej. „Specyficzna aktywność” (tj. jednostki aktywności (aktywacja LCAT) jednostkę masy) peptydów może być wyliczona jako stężenie peptydu, przy którym osiąga się maksymalną aktywację LCAT. Przykładowo, można testować serie stężeń peptydu (np. ograniczone rozcieńczenia) w celu określenia „specyficznej aktywności” dla peptydu - stężenie, które daje maksymalną aktywacje LCAT (tj. procent konwersji cholesterolu w ester cholesterolu) w określonym czasie testu (np. 1 godz.). Gdy sporządzimy wykres procentowej konwersji cholesterolu w ciągu, np. 1 godz., w zależności od stosowanego stężenia peptydu, „specyficzna aktywność” może być zidentyfikowana jako stężenie peptydu, dla którego osiągana jest najwyższa wartość na krzywej z wykresu.

8.1. Przygotowanie pęcherzyków substratowych

Pęcherzyki stosowane oznaczeniu LCAT składały się z pochodzącej z jaj fosfatydylocholiny (EPS) lub 1-palmitoilo-2-oleilo-fosfatydylocholiny (POPC) i cholesterolu w stosunku molowym 20:1. W celu uzyskania roztworu wyjściowego wystarczającego do przeprowadzenia 40 eksperymentów rozpuszczano w 5 ml ksylenu 7,7 mg EPC (lub 7,6 mg POPC; 10 umol), 78 μg (0,2 umol) 4-¹⁴C-cholesterolu, 116 μg cholesterolu (0,3 umol) i liofilizowano. Następnie 4 ml buforu testowego dodawano do suszonego proszku i sonifikowano w atmosferze azotu przy 4°C. Warunki sonifikacji: Branson 250 sonifikator, 10 mm końcówka, 6 x 5 minut; Bufor testowy: 10 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4). Mieszanina po sonifikacji była odwirowywana 6-ciokrotnie przez 5 minut przy 14,000 rpm (16,000 x g) w celu usunięcia cząsteczek tytanu. Uzyskany klarowny roztwór stosowano w teście enzymatycznym.

8.2. Oczyszczanie LCAT

W celu oczyszczenia LCAT, siarczan dekstranu / Mg²⁺ był dodawany do ludzkiego osocza w celu uzyskania surowicy pozbawionej lipoprotein (LPDS), którą następnie poddawano, chromatografii na

PL 196 675 B1 żywicach Phenylsepharose, Affigelblue, ConcavalinA Sepharose oraz chromatografii powinowactwa anty-ApoA-I, co podsumowano dla reprezentatywnych oczyszczeń w Tabeli IX, poniżej:

T a b e l a IX Oczyszczanie LCAT

Frakcja	Objętość całkowita (ml)	Białko całkowite	Aktywność całkowita (nmol CE/mg*h)	Wydajność (%)	Oczyszczenie (stopień)
Osocze	550	44550	63706
LPDS	500	31000	62620	98	1,4
Phenyl	210	363	51909	82	100
Sepharose
Affigel Blue	95	153	25092	39	115
ConA	43	36	11245	18	220
Sepharose
powinowactwo	120	3,5	5500	9	1109
do Anty-A-I

8.2.1 Wytwarzanie LPDS

W celu uzyskania LPDS, 500 ml osocza dodawano do 50 ml roztworu siarczanu dekstranu (MW=500000). Mieszano przez 20 minut. Odwirowywano przez 30 minut przy 3000 rpm (16,000 x g)m przy 4°C. Stosowano supernatant (LPDS) w dalszych etapach oczyszczania (ok. 500 ml).

8.2.2. Chromatografia na Phenylosepharose

Następujące materiały i warunki zastały zastosowane w chromatografii na Phenylosepharose. faza stała: Phenylosepharose z szybkim przepływem, o wysokiej czystości, Pharmacia kolumna: XK26/40, wysokość złoża: 33 cm, V= ok. 175 ml szybkość przepływu: 200 ml/godz. (próba) przemywanie: 200 ml/godz. (bufor) elucja: 80 ml (woda destylowana) bufor: 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7.4, 0,01% azydek sodu

Równoważono kolumnę buforem Tris, dodawano 29 g NaCl do 500 ml LPDS i nakładano na kolumnę. Przemywano kilkoma objętościami buforu Tris, aż do uzyskania absorpcji przy 280 nm odpowiadającej wartości wyjściowej, następnie rozpoczynano elucję wodą destylowaną. Frakcje zawierające białka zbierano (całkowita objętość: 180 ml) i stosowano do chromatografii Afiggelblue.

8.2.3 Chromatografia na Affigelblue

Roztwór otrzymany z poprzedniej chromatografii dializowano przez noc w 4°C w 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,01% azydku sodu. Objętość roztworu zmniejszano poprzez ultrafiltrację (Amicon YM30) do 50 - 60 ml i nakładano na kolumnę Affigelblue.

faza stała: Affigelblue, Biorad, kolumna 153-7301, KK26/20, wysokość złoża: ok. 13 cm; objętość kolumny: ok. 70 ml. szybkość przepływu: nakładanie 15 ml/godz. przemywanie: 50ml/godz.

Kolumnę równoważono buforem Tris. Podawano produkt z chromatografii Phenylsepharose na kolumnę. Rozpoczynano jednocześnie zbieranie frakcji. Przemywano buforem Tris. Zebrane frakcje stosowano w chromatografii ConA.

8.2.4. Chromatografia ConA

Objętość frakcji zebranych z Affigelblue była zmniejszana za pomocą Amicon (YM30) do 30-40 ml i dializowana w buforze startowym ConA (1 mM Tris HCl pH7,4, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM CaCl2, 0,01% azydek sodu) przez noc w 4°C.

faza stała: ConA Sepharose (Pharmacia) kolumna: XK26/20, wysokość złoża: 14 cm (75 ml) szybkość przepływu: nakładanie 40 ml/godz.

przemywanie (z buforem startowym): 90 ml/godz.

elucja: 50 ml/godz., 0,2M metylo-a-D-mannozyd w 1 mM Tris, pH 7,4.

Frakcje białkowe z elucji mannozydem zbierano (110 ml), i redukowano ich objętość poprzez ultrafiltrację (YM30) do 44 ml. Roztwór uzyskany w ten sposób był dzielony na 2 ml porcje, które przechowywano w -20°C.

8.2.5. Chromatografia powinowactwa anty-ApoA-I

PL 196 675 B1

Chromatografia powinowactwa anty-ApoA-I była prowadzona na produktach Affigel-Hz (Biorad), do którego sprzęgnięto kowalencyjnie przeciwciało anty-ApoA-I.

kolumna: XK16/20, V=16 ml. Kolumnę równoważono PBS pH 7,4. Dwa ml z próbek uzyskanych w chromatografii ConA dializowano przez 2 godziny w buforze PBS i nakładano na kolumnę.

szybkość przepływu: nakładanie: 15 ml/godz. przemywanie (PBS) 40 ml/godz..

Otrzymane frakcje białkowe (V=14 ml) stosowano w oznaczeniach LCAT.

Kolumnę regenerowano 0,1 M buforem cytrynianowym (pH 4,5) w celu wymycia związanej A-I (100 ml), i bezpośrednio po tym równoważono PBS.

8.3. Wyniki

Wyniki oznaczenia aktywacji LCAT zaprezentowano w Tabeli X, poniżej.

PL 196 675 B1

Λ

U >ι

Ο

Η β

<υ

Ν

Ό

Μ

Ό

Ό >1 +J α, ίΧ

Ό r« ι—| .β α; Ρ >1 ϊ

ο

Ό (0

Pd λ;

>1

Ν

Μ

Λ

Ό

Η <

U .Α ><

4->

χι <

ω ω ω ^Η

σ\ ko

tn σ\

σι

99

73

ΓΟ σ

71

CD ko

ο\ο ο ω ^ω -U

rd CO

o co

e· σ\

O Γ*

Lf) CO

rd <0

O

O co

ko

ύΡ — υ •Η ω ε X

m co

in σ\

in CTk

n στ

σι co

O σ\

co

KO σι

o ko

He (%) wolny

P* Γ*

o r*

o co

Γ* m

r* r*

o CM

o KO

o P*

tn in

AKTYWNOŚĆ LCAT (%)

«¥> o ej rd

«Μ» ID O rd

co σι

«V» n σι

o en

_ov> o co

•V» n co

Λ» m co

•V» m co

<A® σ\ p*

oV> OJ r*

O P-

•V» p* ko

•V* r-ł ko

V» o KO

•V» σ\ tn

·>«· σι in

SEKW AMINOKWASOWA

14 G 2 A N Cd A Al Cd 2 Al Al Cd (X bu Al Q Al > CU

2 2 A 14 θ' 2 Al < Cd Al Al Cd -r 3 Al Cd cd Cu Al Q Ul > O

14 Al 14 O 14 Al 2 Cd Al Al Cd 2 A Al Cd X Cu Al O A) > CU

14 Al 14 O 2 Al a. Cd Al Al Cd 2 Al Al Cd X Cu A Q Al > CU

14 14 Al 2 O 2 A < Cd A A Cd •V A A Cd Di Cu A O A > a

14 A 14 O 14 A < Cd A X Cd 2 A A Cd X Cu A □ A > IX

14 A 14 O 2 A < Cd A A Cd 2 A A Cd 14 Cu A Q A > X

14 A 14 O 14 A < Cd A O Cd A A Cd Cd Cu A Q A > Qi

14 A 14 θ' 14 A < Cd A A Cd 2 O A Cd X Cu A Q A > X

14 A 14 O 14 N < Cd A A Cd 2 A A Cd Cd Cu A O A > Cu

14 A 14 O 14 A Cd A A Cd O A A Cd 14 Cu A Q A > CU

14 A 14 θ' 14 U < Cd A A Cd 2 A A Cd Cd Cu A Cl A > X

14 A 14 O 14 2 Cd A O Cd 2 A A Cd Cd bu A Q A > O

o A O O o A Cd A A Cd Z A A Cd Cd Cu A Q A > CU

a A 14 O 14 A < Cd A A Cd 2 3 A Cd « Cu A Q A > X

14 A 14 O Id A < Cd A A Cd Z A A Cd X A A Cl A > X

14 A 14 O 14 A < Cd A A Cd O A A Cd 14 X A Cd A > X

PEPTYD

rd o 2 Q H O Cd CO

OJ o 2 Q H O Cd CO

n o 2 Q H O Cd CO

c 2 O M θ' Cd CO

in o 2 Q H θ' Cd CO

KO o 2 Q w CX Cd CO

eo 2 Cl I-C σ Cd co

CO o 2 O I-I O Cd CO

cn o 2 Q I-I O Cd CO

O rd o 2 Q n O Cd CO

rd rd o 2 Q IH O Cd CO

CM rd o *> Q w O Cd CO

n rd o 2 Q H O Cd CO

rd o 2 Q I-I σ Cd «

m rd o 2 Q I-I O Cd W

KO rd o 2 Q I-C O Cd CO

e rH o 2 Q H σ Cd co

H

CM

m

xr

tn

ko

CO

o>

O rd

rd rd

CM rd

r> rd

rd

in rd

KO H

rd

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

oP Φ X

TFE

m en

81

90

⁰⁶

CM to

95

oV>

>

o

φ

ω

CM

O

CD

co

X

CO

os

CA

to

oP

o

φ

•H £

CM

co

O

co

r-

os

o

X

-

oo

cr\

σ\

CA

to

tn

O r-t

<ΛΡ

> C

•w*

»~ł

CU

o

to

CM

tn

CA

co

tn

Φ •r

3

”3*

co

M*

tn

0Ά

os

V

-u

ΊΛ O

o\o

2

S

•V»

&

•i®

·*»

«Μ

«V»

«*

<*>

A

ó°

«*»

J«“

A·

oM>

«&»

' «Μ»

•V»

X

co

CO

Γ*

r*

’Τ

n

rH

r*

M*

o

cn

CO

ΧΓ

m

CM

AKT

«c u At

tn

ΙΛ

tn

τ*

M⁴

τ*

m

n

m

<

X

2

id

2

X

iż

2

iż

X

►3

>3

A

»3

A

►3

>3

o

łrf

2

iż

2

X

iż

X

iż

X

Z

to

o

O

α

o

O

iż

O

O<

O

O<

Ol

O

θ'

o

CK

o<

Ol

X

X.

Z

iż

σ

iż

X

iż

X

iż

X

z

A

Al

A

*3

A

♦3

A

<

O

<

A

<

Cd

ω

W

ω

Cd

ω

ta

w

ω

O

►3

At

A

►3

A

N

S

A

►3

O

►3

A

X

A

►3

A

X

A

ł-H

ω

Cd

ω

Cd

ω

s

2

o

2

Z

z

o

<

►3

A

>3

A

»3

►3

A

O

A

X

A

ω

W

ω

W

ca

Cd

Id

Cd

W

ω

s

CŻ

oż

CŻ

X

Ci

2

Ci

Di

CŻ

ca

&

Ci

CS

A

Ci

&;

CS

ci

X

tu

Cu

tu

u.

Cu

u.

Cu

A

W

►3

AJ

A

Cu

A

N

2

A

Q

ω

Q

Ω

Q

C

Q

O

ca

Q

ca

W

>3

AJ

>3

A

►3

A

>

A

>

A

o

CU

Cu

α

CU

Cu

Λ

CU

X

0U

CU

co

σ\

o

H

CM

m

tn

to

Π*

co

σ»

o

iH

CM

rt

TT¹

tn

to

r4

rH

CM

m

r>

en

m

o

ó

o

' o

o

ó

2

py

2

py

2

Z

2

Q

O

Q

Cl

Q

O

Q

CJ

Q

ca

M

H

M

H

M

H

M

H

Ht

M

W

o

σ

o

σ

α

o<

o

O

o

Ol

o

Ol

a

Ol

w

W

ω

CU

ω

w

Id

Cd

Id

Cd

to

w

W

CO

W

U)

to

CO

s—-

O

X

H CL·

00

σ>

O

r-4

CM

m

Tf

tn

to

CO

Os

O

H

CM

m

un

tx?

ω

r4

«3

CM

Ci

CM

m

en

m

£L· .. .

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

o-P 0) X

ω Cu

η ο-

σ\ «Γ

Ot r-

r* r*

a\ M3

mo Γ*

86

tn co

I> tn

u>

m r-

78

75

dP

>

o

CD

w

ν>

w

CO

en

tn

θ'

tn

co

n

CA

Γ“ί

Oj

V

a>

i

ο

04

MO

r*

co

03

CM

tn

in

CD

a

W

m

r*

dP

υ

OJ

Ή £

ιη

<A

<n

«ϊ·

m

ta

'S*

MD

Ift

<r

C5

Oj

M

X

θ'

*r

ta

co

θ'

Γ*

03

co

CD

to

co

CO

ω

Γ*

P*

>Ί c

ί-Η

He

0

tn

in

w

vo

Ol

in

O

fl*

O

c-

aj

f*7

Oj

ca

03

Μ)

Of

MO

n

K

CM

Ol

m

n

W

MO

W

o>

m

•u

'Ul O

<Λ®

3

Η < U

&

«Λ°

&

•V»

4»

Λ»

•V»

·*»

(λ“

·¥>

•L·

eL»

&

<π

cn

tn

LA

ιΛ

tn

LA

n

v

m

A4

CM

rH

O

o

CJ\

εη

eh

EZ

ca

Ol

CM

Ol

CM

03

CM

OJ

ΓΜ

CM

<M

04

K

ri

H

<

Si

X

Si

s;

x

Si

Λ

X

3

• 4

43

41

_1

43

rH

u

Ul

UJ

Ui

u

43

41

4

O

X

4i

X

co

o

X

o

O

tr

o

a

o

a

o

c/

o

O

3 Z

X

54

O

X

4i

X

03

X

4

43

41

43

J

41

r-i

J

UJ

41

u

43

4

43

41

4

n

<

5

<

fO

<

2

<

(4

w

X

ω

03

w

03

ω

03

05

03

ω

03

01

O

4

47

43

Ul

J

s

u

r—1

Ul

43

Ul

41

•3

4

u

2

4

X

41

43

si

X

o

Ul

u

X

45

2

43

ω

1x3

ω

03

tu

03

01

ω

X

ω

Ul

01

ω

01

2l

2

03

Ci

z

2

s

£1

2

z

r>

w

s

2

4

47

43

U!

Ul

4

rH

J

Ul

UJ

U)

Ul

ut

►J

41

43

4

s

47

43

4

J

Si

X

Λ

X

U)

Ul

UJ

Ul

X

u

4

,

ω

03

01

03

Φ

03

UJ

ω

«

2

ω

03

05

Γ4

. «

2

c;

ci

Ed

ki

X

ci

«

K

3

ci

χ

O,

X

(u

Oj

3

O.

0.

MU

Eu

tu

fc.

X

tu

fu

O

o

ώ

w cc

4

41

43

ω

OJ

03

UJ

U!

Ul

J

Ul

UJ

03

41

4

Q

C7

Q

a

o

Ό

Q

o

Q

Cl

Q

Cl

(0

O

1

4

43

Ul

uj

4

<—i

►4

J

Ul

45

41

3:

u

4

1

>

CL

£h

Cli

CL

a

CL,

Oj

Cb

(¾

ł

ft

X

P4

cu

CL

£

tL

cu

z—

r~

ca

σ\

O

H

ca

n

*r

tn

MO

r-

co

Ca

O

rH

ΓΜ

m

TT

Lfł

ΟΊ

C"5

tj·

•3¹

*T*

'o*

'T

^J*

ττ

ή

tn

n

tn

δ

o

δ

o

O

o

δ

o

δ

o

ό

o

δ

2

^z

Z

•2

z

Λ

z

a

Q

o

a

Q

a

Q

a

Q

o

D

a

Q

o

Cl

D

o

W

w

M

H

M

W

ł—(

H

n

M

H

M

a

o

a

O

o

Cf

o

Cx

σ

0

o

O

o

O

03

w

07

03

ω

•07

Ul

w

UJ

. X

03

UJ

07

ω

03

07

01

W

CO

w

CZ)

to

w

CO

W

w

03

co

ω

O)

W

w

W

«Μ—

—

O

CL

>

co

CA

O

r4

CM

m

tn

03

r-

CO

<h

o

CM

m

tn

ω

ΓΠ

m

xj*

•Φ

*0

'cr

'f

**

*p

tn

Cu .....

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

o)° Φ

ca Cu H

84

70

"7* c\

66

o\o

>

©

(!) Z

ω

to

m

SO

xr*

n

CL

so

•<r

so

co

n

Id

O\o

’—

ć

Φ -r

•H ε

rn

LH

CM

0

co

X

co

CO

cn

r*

CO

<#>

wolny j -1

m

in

TT

r-ł

r~

a

He

rj

H

so

CO

CM

W

o

•CD o

<AP

>«—· 3:

•Μ»

λ»

. &

J»»

•V»

«Α-

<A°

·*»

«*»

<Λ°

Λ»

a·

Λ·

H

co

ao

ω

r·

so

SO

m

in

. SD

TP

m

CM

rM

r-i

a

O

H X <

< U X

H

r4

. r-i

r4

r—i

H

r4

r-t

r-i

rH

-r-i

r*i

rH

H

r-ł

r-i

H

rM

<

X

id

1

X

1

id

X

• X

X

•x

X

Ll

X

1

Ll

n

Ll

X

x

Ll

X

0 ω <

X

Si

id

1

id

X

0

a.

σ

o

O

0

o

θ'

O

X

0

o

σ

0

O

0

x

Cd

ϋ

X

id

X

0

X

n

Ll

LI

X

LI

X

2

<

*c

<

Cd

2

Cd

Id

Cd

X

2

Cd

X

0

X

x

a

Ll

X

Ll

X

z

X.

x

X

Ll

X

Ll

X

Ll

X

H-ł

Cd

W

ω

X

ω

X

2

Z

Cd

Z

Cd

Z

X

Z

z

<

X

Ll

X

Ll

X

Ll

X

►3

Ll

LI

X

Ll

X

id

Ll

X

Ll

X

Ll

X

Cd

Z

Cd

2

Cd

Z

Cd

X

. X

Cd

X

cd

Ci

X

d

ct

u

cti

o:

a

K

X

2

c:

X ca

Ul

u

U.

Cu

Cl

2

u

fcu

lL

X

Ul

X

u

X

U

u

X

Ll

W

X

H

Cd

b.

Cd

n

Ll

w

ω

X

ω

X

Q

O

Q

O

Q

ca

a

ca

O

ca

Q

ca

0

ca

V)

X

Ll

X

Ll

u

n

x

Ll

X

D

x

Ll

LI

Ll

X

>

2

>

U

CL

Ll

CL

1

CL

1

X

SO

CO

cn

0

r4

CM

m

tn

so

r-

CO

en

0

H

CM

ro

xr

ŁTł

in

tn

in

so

SO

so

0

Γ*

r-

t-

0

z

Q

ca

Q

ca

Q

ca

M

K

M

H

Ft

M

Ft

W

Fł

K

H

K

Fi

Fł

M

Fi

Fł

H

a

0

o

0

o

0

o

0

Ct

a

0

σ

Ct

0

σ

0

σ

0

Cd

Id

w

Cd

Id

Cd

ω

X

C/l

W

ca

W

ω

σι

CZ)

W

w

ω

Μ

w

M

w

Q

><

fc-H

SO

t-

CD

C\

O

H

CM

m

tn

so

CD

o\

0

H

m

TT

Oj ca Oj

m

tn

W

so

SO

so

r-

r·

Τ'

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

£ ω Cu 0) X

55

66

69

o o H

001

i. >

o

<D ^ω

ΓΊ

*ł<

X

N

to

He (%; mic

CO Ci

CO co

61

100

£ c

01 ° X

CO

t-4

CD

o

r~i

'cr

in

H

’ψ

'U

o

•

2

? E-|

·*

<A»

<A®

<A°

•V»

<Λ°

»*»

·*>

o*

£ < ę u

H

σ\

ΟΊ

σ\

CD

r·

o

O

r·

r*

to

<

X

iż

X

s

J

dl

X

rH

dl

dl.

o

X

iż

X

CZ)

o

O

o

X

o

σ

o

X

σ

o

σ

o

fZ

ii

iż

X

o

X

2

X

o

λ:

X

u

3

J

-3

dl

-1

dl

x

dl

rH

dl

<

«5

<

<a

<

o

U

Cd

w

Cd

W

X

2

φ

X

2

X

J

dl

-3

dl

rH

dl

Cd

X

dl

X

dl

rH

X

x

Cd

X

Cd

s

Cd

X

Φ

X

U

2

X

Z

z

2

D

tr

2

dl

X

dl

X

K-)

dl

J—{

dl

X

dl

X

dl

X

dl

rH

dl

X

dl

*

Cd

,ω

Q

Cd

X

Cd

w

X

Φ

X

ω

X

s

a

U

X

Di

Cd

U

Di

ct

X

Ji

Di

X

Di

X

Ul

u

x

X

U

X

u

X

rH

X

U

Cd

ω

Cd

dl

Cd

w

X

dl

rH

X

CO

Q

Ct

a

Q

O

Q

a

X

Φ

Q

Q ł

o

dl

X

dl

X

dl

X

dl

rH

dl

>

ł

>

1

>

rH

>

ł

>

CL

Λ

CU

X

CL

i

X

ł

CL

ld

to

r-

CD

σ\

o

H

CN

rh

<3*

in

to

Γ*

00

Ch

o

rH

o

c·

r~

r*

Γ'

CD

O

CD

co

CD

co

CD

co

Ch

o

O

o

O

o

•z

»3

2

rr

2

O

Q

O

Q

a

Q

a

Q

O

Q

a

O

Cl

K

M

K

M

W

M

H

M

H

K

o

a

o

Cu

o

a

o

a

o

a

o

Cd

w

Cd

w

Cd

X

W

M

co

W

Ul

U)

w

Ul

w

Ul

•u-'

o

•s.

to

< Oj

in

O

CD

Ch

O

X

CM

m

in

to

co

en

o

H

= Cd

r*

r-

t>

r*

co

CD

co

CD

00

co

Ch

□ CU s □ D ... .

/ 22-merowy peptyd konsensusowy Segrest a (Anantharamaiah et al . , 1990, ArteriosclerosiB 10(1):95-105).

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

ω tu <D ^H X

63

01

80

98

55

65

Γ* Γ*

54

e >

Z

ω ^ω

r*

CU

n

O

a

cn

CM

X

CM

to

tO

co

CM

ro

o\° — U

Ή 0) £

o

Cu

tn

co

ΓΜ

a

σ\

CO

a

tn

Γ*

to

co

ΟΊ

ta

CM

tn

i. c

t—|

ni O

co

CM

m

a

H

O\

a

co

CD »£ X *

H

in

t-

co

tn

CM

OJ

to

CM

<j.......

O Ϊ

z

®v>

•Μ»

•V»

ot®

«*»

•V»

<A°

«Α®

A®

«Λ®

«A°

•V*

^1»

«*»

£ < C u <

in

ω

in

ω

CM

cm

t-i

r4

H

O

o

<

Sb

X

Si

i

X

CU

X

a

X

s

d

□

r4

1

d

>

r4

d

<

d

o

Si

X

a

i

X

d

X

2

X

rH

X

ω

O

o

. α

o

tr

I

o

tr

o

Cd

o

ot

o

•o

o

Si'

X

x

X

1

X

d

Si

X

r-i

X

d

j

d

r4

1

d

Cu

r-4

d

tu

d

X o

<

<c

<C

l

<

0£

«s

<

2

$4

<

ω

x

ω

Cd

(U

Cd

Φ

Cd

(U

Cd

d

r4

d

r-t

d

<

d

r-i

d

2

X

<

X

d

ω

d

r-4

X

Cd

d

2

Cd

r-4

X

n

ω

d

OJ

Cd

Z

tu

s

d

Cd

c

Cd

S

z

c

Z

z

Cd

c

z

Z

(U

Z

<

>

d

. d

r4

d

r-4

d

2

d

r4

d

X

d

r4

d

r4

d

2

X

r4

d

*

ω

Cd

ω

Cd

tu

Cd

i

Cd

0)

3

s

ci

a

tó

a

Μ

a

Ci

<

Ul

α

Oi

X

»

a

££

10

X

Sb

li.

Cu

U~)

X

Cu

d

tw

Cu

tu

Uu

ł

Cu

r4

U.

CJ

ω

Cd

d

i-4

d

X

r-i

d

td

i

<

d

Si

d

w

Q

O

Ό

Q

O

Ό

Q

D

Q

l

Q

D

σ

D

d

r-4

d

X

. r-4

d

t

d

Si

d

>

d

>

i

2

>

r4

>

c.

CU

cu

X

a

CU

Si

CU

*->.

CM σ\

m σ\

^T* σ\

tn cn

tO σ\

r* <n

CD cn

Cf\ ort

o o

r4 O

CM O

m o

O

LH O

to o

Γ* o

CQ O

r4

r-t

r4

tH

r-t

r4

o z

6 z

o z

6 z

O z

6 z

o z

ó z

o z

i ^Q M

α M

Q K

α M

Q w

Q K

o H

o w

Cl

o

Q

Cl

Q

D

Q

M

H

M

H

o Cd co

σ ω V)

a Cd ω

o Cd ω

o Cd W

o Cd CO

σ Cd CO

α Cd CO

o Cd CO

σ Cd CO

o Cd C0

• o Cd CO

σ td CO

σ Cd CO

*-*

Q

ca. Tacen a PEPT

CM cn

m OS

cn

tn Ch

to C\

C" cn

CO Cry

ch

o o r4

H O H

CM O H

n o K

o H

in o rH

to o H

o H

CD O H

/ 22-merowy [A¹³] peptyd konsensusowy(Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosie 10 (1):95-105).

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

e ω ω <u ^H X

58

i

°'° >

D

0) ^W

m 04

X

o\°

— u

•H Φ £

45

22

(%) ny

He t wo 1--

19

!

U3

•u

o

2

AKTYW j LCAT

«Μ

Λ»

·*

•M*

*

•V

(A°

·*>

«Λ»

<A®

0*

o

O

o

O

o

O

o

O

o

< ’

id

X

X.

O

X

J

. d

dl

J

dl

.dl

o co <

id

X

o

X

O

C*

o

σ

o

σ

o

σ

o

σ

o

σ

o

id

X

Cd

X

z

X

o

X

dl

d

s

<

Λ

«£

<

X

<

z

<

2

u

Cd

Id

Cd

ω

Cd

ω

o

-X

X

- z

. 01

dl

Σ

dl

d

dl

z

cd

X

Cd

X

Cd

Id

dl

Hi

Cd

ω

Cd

s

Z

X

Z

ΓΖ

Z

2

Z

z

2

dl

d

dl

d

dl

d

id

X

dl

d

'Cd

ω

Cd

ω

W

ci

χ·

ci

X

Ci

X

cd

X

o;

X

o

X

u.

X

Cl,

Cd

Cl

Cl,

Cl.

u

U-

X

Cd

Cl,

X

Cl,

Cd

X

Cd

W

dl

d

Cd

O

o

ci

Q

O

Cd

Q

Cl

Q

Cl

cd

o

Q

o

GO

d

dl

d

dl

u

dl

d

>

X

mM

Cd

>

£>

&

Cu

Cd

CU

o

X

tn

σ\

o

«Η

OJ

rn

TT*

0*

CD

cn

o

rH

04

ΓΊ

tn

o

rH

tH

rH

r-i

rH

t—ł

04

Ol

04

OJ

rH

H

Ή

r-i

rH

• rH

»—t

rH

»—4

rH

iH

rH

o

O

o

O

o

Z

z

Z

z

2

z

Q

o

Q

Q Hi

D

Q

Cd

O

Cd

Q

Cd

Hi

H

M

Hi

W

Hi

H4

H

Hi

o

o Cd 01

o

r>

o

O

σ

Cd

K

Cd

cc

Cd

td

Cd

w

ω

oi

cc

01

w

W

01

03

01

ω

>—·

Q

>-i

H

Ch

O

OJ

m

·*

ir

IO

0*

CD

cn

o

t~

CS

m

Tf

ιη

X

r-

t-

r·

r~

rH

r-

H

r-

cs

CS

04

fs

C'

OJ

Cd

H

r-i

H

r-

H

r

Γ"

rH

H

d

H

* j 1 ....

/ 22~merowy [R¹³] peptyd konsensusowy (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105)

PL 196 675 B1

^οΐ3 ω u. OJ I

_s

IA Ch

ołO

0

(U «

ó-P ·— u -H

Φ £

ca C3

££

r-ł

o g X ^A

Ut ca

"O 1

'3-

2

3“ Fm i

•M

i-H

H < rt "

r-

rl

*

<

X

Z

X

iii

X

z

. z

X

0

X

.z

z

X

3

X

>□

X

o

X

O

X

z

a

σ

ο

x

o

X

0

X

< 1

x

- X

X

o

X

ci

o

z

X

z

Z

X

O

z

Z

z

0

X

N

X

o

<

X

u

<

rt

<

et

<

z

ii

<

et

i ω

ω

Ul

ω

o

ω

0

X

ω

Ul

0

UJ

w

0

Ul

0

o

X

co

u

a

o

0

h3

n

^ω

ω

z

0

Q

ω

Ul

ω

Ul

ω

Ul

X

2

Z

ζ

pi

Ci

z

Ul

0

»>

0

z

Z

z

0

<

X

ui

X

Ul

2

X

z

X

Ul

X

ω

0

ω

CL

ci

ω

0

ω

Ul

0

z

3:

ci

X

2^

z

Si

0ί

0

Ul

κ

z

a

ci

ίϋ

Pi

CL

K

CL

Ul

2 id to

a.

X

U

Cl

U

Lu

u.

Cl

u-

Łu

0

Lu

bu

Lu

0

U<

Łu

*_1

X

u

X

Ul

X

Ul

X

bu

X

Q

α

0

Ul

ω

0

ω

0

Ul

a

0

o

0

Ul

X

Ul

X

>

<

>

CU

U

04

CL

04

a

CL

0

CL

P.

iL

CL

0

a

£L

CL

tx

S-

__ _

r—*.

_

i—

to

Γ-

(ΰ

σι

O

rH

CM

m

Hf

LTl

to

r>

CO

en

O

rH

ΓΜ

d

CM

m

n

ΠΊ

m

d

n

m

d

Hf

V¹

rH

Η

rH

r-ł

H

rH

ri

iH

rH

T"t

rH

H

o

ο

Ο

o

O

o

0

O

o

0

O

o

2

rr

2

z

Z

z

Z

ty

z

Z

2

z

^z

C

0

Q

o

0

Q

0

Q

0

H

Μ

Η

W

H

M

n

ł~H

W

M

H

W

H

c

ο

o

0

O

0

o

0

o

0

o

0

u

ii

ω

u

li

u

Ul

0

K

u:

U

t

a

0

tr

«

σ

(Z

σ

cn

σ

Ul

a

ω

W

0

w

u

Ul

U)

w

0)

Q

χ

*· t->

u

Γ’

ca

ΟΊ

c

F*i

cs

1*

Hf

in

to

t>

co

«7

c

r-

CS

f*l

c

ο,

CS

CM

P"

r

C

d

n

d

r*

*3

Hf

V

*φ

£ł W

r

I Γ-

r-

H

r-

i T^-1

«-

1 r-

f"

t-

r-i

r-

: rn

r

H

(0 X 4—< d o

cd. tabeli X

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

o\o (U -r*

Cd Cu H

5« Cu <D K

58

ID os

60

Γ"

08

r3 to

55

c'.O

3*

X

o

<& 00

07

— >

rs

Lfi

tn

r4

(U X

b Φ co X

t3

CM

r-

CO

oW

ic.

Λ» CO

(P

c:

— U

t3

to

n

m

t_

-r4

tn

Γ*

in

r*

CD

tn

—M

ω S

X

c*>

X

u

y·»

^3

<x> di

41

o

— dl

in

Γ*

o

co

tn

GO

r-

3

lu

ω

os

r3

CM

»3

to

CM

Φ M-J X

Ό

o o

O\O

X Eu

—'

H <

s

w CJ > A

otP

oS®

• <A°

o¥>

<A°

o\°

«*>

(A®

oV>

«Λ®

<A®

o\®

et®

dl®

oM>

o*P

ot®

eV»

• X

IX < O' A

to

Lfi

m

r*

tn

O

OS

CD

tn

o

CD

CO

S

Γ*

to

H

£u —

r3

CD

r-

r*

to

in

tn

m

rs

m

(M

CM

• V'

O dfi

<

< —

<

X

2

A

o

U

X

co

2

X

W

O

CK

O

o

CK

O

o

O

o

CK

cx

ck

a

•ck

CK

CK A

CK

s

2

A

►3

A

χ,ζ'

α

<

<=C

<

rt!

2

<

2

a

o

u

Q

G

O

Q

ω

G

Q

1 w

A

X

O

A

2

—

A

O

A

Q

α

C£

2

oa

Oś

2

&

CŻ

ca

2

ca

2

M

Cd

W

Cd

ω

W

ω

W

ω

Cd

ω

W

2

<

o

A

2

A

U

A

2

A

4

A

2

A

2

py

2

py

2

Sc

o

W

Cd

W

Cd

Id

Cd

ω

A

ω

A

ω

W

2

U

• lu

Lu

Ui

U*

Cu

(ju

U·

2

U

2

U

2

U

Ui

M

A

•A

A

Ui

A

ω

X

Cd

W

Cd

ω

Cd

ω

Cd

W

ω

w

ω

W

w

ω

Q

W

2

A

Ui

A

>

A

>

U

Cd

2

CU

2

A—>

„_„

-__

Lfi

to

c-

co

os

o

i3

CM

m

to

r*

co

os

O

t3

Ci

m

M*

vr*

in

LH

ω

tn

in

tn

to

t3

H

i3

ł3

t3

«3

»3

r3

»3

t3

r3

i3

t3

«3

i3

»3

i3

H

»3

o

2

Q

O

Q

G

O

Q

O

Q

G

Q

M

13

M

W

n

M

W

n

M

H

M

»3

M

13

W

M

o

α

o

CK

Ct

CK

ck

<y

CK

Cd

Id

ω

w

Cd

w

ω

w

ω

w

2

Ui

co

ω

w

Cfl

co

to

co

CO

W

X—-

***

'**'

*“*

***

UW-»·

»*—

Q

w

o

t”^ł

H

tn

to

O

GO

os

o

»3

CM

m

Μφ

tn

to

r*

CO

os

o

H

CM

iX

H

xr

Φ

tn

m

tn

in

tn

to

ω

CU

i3

A

τ3

r3

t3

r3

»3

•3

t3

H

»3

«3

t3

w

2

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

0*= 0) Z

Z Z

61

>

Z

He

z

51

0\°

u

SO SO

ω

£

oW

c

F

He

0

r*

3

m

Ό

-σι O

o\0

z

2

«A°

Λ»

·*»

•®v>

F

&

F en

F CO

F CD

F r*

>l H Z <

H < U Z

TT CM

m CM

CM CM

00 r-ł

Γ" F

O F

r* F

so F

tn F

n F

F F

o F

CD

<

z

O

z

3

X

*—i

X

F

X

O ω

z

o

z

Li

z

24

z

• z

z

o

z

O

o

a

o

z

σ*

z

σ

o

σ

o

σ

o

σ

2 Z

2

X

•x

X

r-ł

X

<

X

<

X

<

X

Oj

X

<

O

o

D

o

Q

ca

Q

D

ci

Q

Ό

X

a

D

X

Q

o

Q

X

O

X

to

X

F

X

F

X

2

X

F

X

z

X

Z

z

o

z

u

a

u

z

a

ci

z

Z

z

2

ω

w

ω

X

ω

X

ω

X

Q

a)

X

Q

X

<

X

F

X

ϋ

X

F

*23

X

' X

z

σ

z

c

z

ω

X

ω

X

ω

X

Q

0)

X

Cl

Q

X

ż (J ω

X

u

X

U-ł

X

2

X

u

X

F

X

ω

w

Cd

X

ω

X

ω

X

a

0)

X

F

X

>

1 X

X

u

X

u

X

o

X

. _

.

_......__

τΡ

1Λ

so

Γ*

CO

CA

o

F

CM

n

TP

tn

so

ł>

CD

<n

o

F

CM

so

SO

so

r*

C*

r*

r-

Γ*

r*

c*

Τ'

c*

r*

co

CO

CD

F

' F

F

o

ó

z

Q

O

Q

D

o

Q

D

ci

a

Q

o

Q

a

F

Fł

W

F

K

F

o

σ

o

CX

o

σ

o

σ

O

o

ω

X

ω

X

ω

X

w

co

CO

co

X

w

co

w

co

w

co

w

co

CO

w

CT

CO

--

****

Q

i *

- H

M*

in

so

co

os

o

F

CM

<n

Tp

tn

so

r*

co

σ\

O

F

CM

5 x

SO

so

c-

Τ'

r*·

r*

C"

Τ'

r*

r·

t-

CD

co

2 W

F

r-ł

F

H

F

H

F

H

F

r-ł

rd

rł

r-

tX

3 Oj 3 3

PL 196 675 B1

PEPTYD I SEKW. AMINOKWASOWA AKTYWNOŚĆ

i>

56

87

m 0T

OT KO

OT

P* ao

o CO

1

CD CO

n OT

o

PP~

KO m

M*

co m

co

in m

<A« KO

«Α»

m

o¥> O O rd

oV> o o rd

KO στ

oV> CD CO

PCO

«¥» rd ao

<A° rd co

<A“ O co

oV> KO P*

<A° ID P*

<A° P*

2 A 14 •2 O A O A A 14 W A A U X AW A A X

14 A 14 14 CM 2 Q A A X X A A 2 A X A x A > X

o A O O O A < Q A A X W A A 2 W X A ' W A > X

14 A 2 2 CM A < Q A A X ω A A Cu W X A ω A > X

2 A 2 2 2 A Q A A X ω A A 2 ω X A ω A > X

2 A 2 2 O A Q A A X Q A A 2 ω X A ω A > X

2 A 2 2 O A Q A A tó ω A A 2 ω X A ω A > o

X A 2 2 CM A Cl A A 2 O A A 2 Q 2 X Cd A > X

k 2 A 2 O 2 A W ω A A Cd X A A Q A > X

* 2 A 2 O 2 A ω X A A W 2 X A Q A > X

* 2 A 2 O 2 A Cd X A A ω X X A Q A > X

k 2 A 2 CM 2 A Cd W A A ω X X A ω A > X

k 2 A 2 O 2 A ω ω A A W 2 X A ω A > X

k 2 A 2 A X X A A X X X A Q A > X

k 2 A 2 O 2 A X X A A X X X A Q A A X

k • 2 A 2 CM 2 A X X A A X X X A a A > O

k 2 A 2 O 2 A X X 2 A X X X A Q A > X

k 2 A 2 O 2 A X W A A X X X A Q A

k 2 A 2 CM 2 A X X A A X 2 X A O A A X

(SEQ ID NO:183)

•M* CO r~’1 Ó 2 Q A O x w

tn CD i—1 6 2 a a O X to

to CO A Ó 2 Q A α ω co

Γa> A ó 2 Q A cm ω C0

CD CD A 6 2 Q H O ω co

σι CD A Ó 2 Q H cm w co

o σι A O 2 Q A Cm Cd co

A σι A O 2 Q I-I O Cd CO

CM σι A Ó 2 O A O W CO

m σι A O 2 Q I-I cm W co

σι A 6 2 Q I-I CM X W

tn σι A O 2 Q A CM W CO

ID σι A O 2 Q A CM X ω

f σι A O 2 Q A CM X w

co σι A Ó 2 Q A CM X CO

σι X A Ó 2 a A CM X W

o o cm Ó 2 Q A CM X W

A O CM ó 2 Q A CM X CO

183

00 rd

m i co rd

KO 00 rd

p* co rd

CO co rd

σι co rd

o OT rd

rd OT rd

C4 Ol rd

m OT rd

OT rd

ΙΛ OT rd

KO OT rd

P* OT rd

CD OT rd

Ot ot rd

O o fS

rd O 04

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

O

ω X F

04 UJ

53

•

co UJ

70

64

>

X

0)

ω

H

m

UJ

Ψ

X

UJ

Ul

r*

in

ΟΨ

u

d)

£

rH

n

m

T?

X

J

UJ

Γ"

Uł

CńP

ny

rH

0

-Ψ

0

<0

04

Φ nr

3

IfJ

04

to

Oł

-u

•Ol o

<A*

z

H=·

d

•d

«Η

Jd

«**>

Jt»

·**

<*>

•V»

**»

*

&

W»

0

UJ

m

σ

H

O

CD

O*

UJ

LTt

n

Ol

o\

CO

to

0

q\

H-

Ot

F X <

< u d

r*

to

’D

UJ

m

tn

-tf

Tl*

n

H) ,

n

0

01

Oł

CM

<

Z

o

co

<*

+

*

+

♦

+

*

: CD

X

0

X

d

dl

d

»-3

UJ

d

X

ci

X

0

X

d-

c*

0

σ

0

σ

0

o

0

o

0

Cx

0

O

0

X

O

tf

X

tf

d

X

o

0

K

X

d

3:

0

z

dl

d

dl

X

d

tf

d

tf

d

z

d

UJ

d

Hł

ω

a

tf

a

ω

tf

ω

tf

d

ω

X

tf

2:

w

tf

' w

w

fil

tf

z

tf

w

ω

tf

Ul

w

*jr

X

<

d

, d

d

dl

d

Ul

d

►n

d

z

UJ

tf

d

tf

d

«

i a

X

tf

ω

Q

tf

ω

Q

ω

w

tf

3

X

K

oi

X

tf

o

X

tf

X

ar

X

tf

i£i

u.

tf

U3

tf

X

tf

X

tf

X

tf

f,l

d

tf

d

Uł

tf

d

UJ

d

ω

ω UJ

0 d

Q d

tf tf

ω tf

tf tf

o d

Cl d

0 d

ω d

0 d

Q d

w d

Q d

o U3

Q

<

>

tf

>

<

>

<

>

tf

<

tf

cu

tf

X

tf

X

tf

X

tf

X

--S

rf-S,

^-¼

___

OJ

n

H*

m

to

o-

oo

Ot

0

1—i

OJ

ΓΊ

TT

tn

U)

H

CD

σ\

0

O

0

O

0

O

0

rH

r-ł

rH

r-1

tH

t-H

rH

OJ

04

Οί

04

OJ

Ol

04

Ol

04

O?

04

OJ

0

z

2

z

JS

z

Q

Cl

Q

ci

a

Q

Cl

Q

a

Cl

CS

Cl

a

0

M

H

W

HI

Hi

H

Hi

H

Hł

HI

Hł

H

Hł

HI

Hi

w

0

σ

O

0

σ

0

Ol

o

σ

0

o

Π

Ci

0

Ci

ω

tf

X

tf

ω

w

ω

w

ω

w

X

ω

X

w

tn

tf

0}

»

to

0)

w

01

co

CO

«

co

to

CO

to

Cl

w

""

—

"

*’··'*

*“·*

«Χ--

·—r

Q

>·

04

r\

Tfl

dO

u>

H

co

Ch

0

H

CM

m

V

tn

UJ

θ'

co

O\

O

5

0

O

0

O

H

rH

H

rH

04

1 ω

04

OŁ

OJ

Oł

04

Oi

04

Oi

OJ

04

OJ

CM

OJ

04

Cti

PL 196 675 B1 cd. tabeli X

Ξ ω ω Q) ^H i X

r-M tn

1

CD tn

Cu w

>

He S

Cl

tn

o

CM

to

oP ' —·· (j

He j mi

tO

to

CM

crt

tn

to

c-

S C

o

r-i

o

cr\

tu H x *

CM

n

Ό

'8 5

z

AKTYW LCAT

·> CM r-i

CO

A® CO

CO

r-i

·* r-i

O

& O

«Μ O

•V» r-i r-i

«*· cn r-i

•Μ» r-i r-i

< 3 O ω < 3 X

*

♦

*

X

d

X

d

X

d

X

d

X

d

X

d

X

α

o

σ

o

ot

o

o<

X

σ

o

d

X

O

X

d

X

<

d

X

θ'

ω

X

cy

d

z

d

•d

d

o

d

z

X

M

ω

Cd

<

ω

w

Cd

Q

X

Σ

ω

Cd

td

ω

X

<

d

3

O

o

d

X

>

d

to

d

O

d

<

X

ω

td

Cd

td

Cd

X

ω

U

td

X

ω

X

3

X

SEKW

K

• tó

CU

X

DŚ

X

><

U.

X

tu

X

U*

X

u.

X

Ul

X

O

X

d

<

d

<

d

o

G

Q

α

o

Q

ω

o

w

d

X

d

O

d

>

d

Q

3

D

CU

X

d

X

....._

rH

CM

m

Xf*

tn

to

r>

co

σ\

o

r-i

CM

c*

CD

Ch

CM

CS

CM

n

cn

m

CM

Cl

CM

o

z

Q

G

Q

o

K

W

Hi

H

Hi

K

Hi

K

H

m

Hi

H

o

σ

o

ot

o

Ot

o

σ

o

o<

ot

w

td

Cd

w

ω

w

ω

X

w

X

w

W

ω

cn

C0

w

tn

«

tn

V.

cn

en

Cf5

tn

«U-*

***

..

***

Q

< ?

'S.

s.'

X.

- H

d

CM

m

rr

tn

to

CD

ch

o

H

CM

V

n

«#

D (X

CM

CS

CM

cs

<s

m

Γ*

CD

σ\

□ td

Ci

ci

CM

Cl

CM

Cs

CM

CS

CM

m

σ cu 3 J

CM

Ci

CM

-18AM0D-C(O)NH, peptyd (Epand et al. , 1987, J. Biol. Chem. 262 (19):9389-9396)

-18AM4-C (O) NH, peptyd (Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7).

PL 196 675 B1 cd.tabeli X

ΐ ω tui ω ^H X	r* tn		““T f	-	co V	a «

dp T>
o
CU X	o			o	n	o			m
tn			ΙΛ	4	Γ"	<?		r4

g\o
υ
Ή ω e X	co			TT	O	Γ*	•cr		1/1
MP			MO	F*	r*	s*
oP
H
0	to			O	CA	<X3	CO		CO
<y ς: X ³	«Η			H	m	K		fS
Ό
'Si
Z
	iA*		·*	- &	v	A*		J*»	*
C ^U	iH	CO	o	tn	in	T		rt	r>


o
	*									+	*
		tŁ,	o	u	(u	z	z	U	U	u	z
	<	Ul	»>	<	«X	u	z	U	4	4	z
X o	ω	ω		ω	td	ω	ω	Ul	ω	«	Ul
X	X	<	X	X	X	X	X	z	z	X
43	u	5?	z	41	Z	J	u.	4	>0	J
2	X	z	KA	z	X	X	X	z	X	X	X
n	Ul	ω	z	Ul	ta	Ul	w	z	ω	u	Ul
5J	<	U	z	<	<	Ul	z	Ul	j	Ul
<	>	>	2	>	>	>	>	z	>	>	>
	z	z	M	z	X	z	z	X	X	z	z
		Ω	W	a	Q	Q	z	Q	K	Ul	ω
3	>	>	o			>>	>.	>	><	>	>
X	U-	u	41	Ul	u	U	U	u	Ul	Ul	K
ω Cf>	G	*5	U		<		<	<		<	<
z	X	«	X	X	X	ω	z	z	2	2
□	Ul	z	. u	J		ul	u		J	j
	X	X	ku!	s	X	X	X	X	X	X	3
	Q	Q	C5	, o	a	a	w	Q	w	Ul	Ul
			___						__r
	O	rA	CS	m		LH	MO		CD	OA	O
	s*		ΧΓ	.·?	xr	V*	AT	<r	-s*	F*	tn
	n	CS	CM	cs	CS	CS	03	CS	CS	rs	CS
	o	o	o	o	0	o	o	o	o	o	δ
	z	z	2	z	z	z	z	z	z	z	zj
	Q	a	Q	a	Q	o	Ω	o	□	o	c!
	W	W	W	W	W	M	H	M	n	H	Ki
	o	θ'	o	o	o	o	o	r>	r>	o	O
	Cd	Ul	w	Ul	Ul	ω	ω	ω	ω	U]	ω
	W	ca	ω	ω	ω	ω	ω	CO	ca	ca	w
								s«*
Q
z			s.		"w						*·.
S H	O	H	tcs	n	*	η	to			Ti	ri
= CL		xr			Tfi	s*	00	ch	O
£ ω D 04 3 3	CS	CS	ST CM	CS	s* CS	CS	CS	CS	s* CS	s* CS	ΙΛ CS

^n/ Ac-18AM2-C (O)NHj (Rosseneu et al., WO93/25581) .

PL 196 675 B1

5 ω X Φ X
> X φ « X
He (%) mic .
ΐ c Ή X
ο Ο Ϊ2 ζ 2 >< Λ Ε- Λ ζ Η <
< 2 Ο ΙΛ < 2 ζ Ο J2 F σ: < & X X ŁO	* X X w ζ X ζ ω X > ζ ζ >1 X J 3 ω	4 Ζ X ζ ο ω X X ω ζ X X X X > X	* ζ ο ζ X X X X X X Ζ X X 3 > CU	* z σ z X z ω X X ω z X X α X > X	* ζ ο X ζ X X X Μ Ζ X ►4 ο X >	* ζ ο ζ X < ω X X X ζ X X D X > X	♦ ζ ο ζ X ζ X L1 X 2 X X X Ω X > X	* ζ ο ζ X ω 2 X X X ζ X X Ω X > X
	rH ιη CM ο 2 Q H Ο ω w	ΓΜ tn CM ο 2 X Η σ ω w	η η CM ο 2 Ο κ σ X ω	Τ’ ΙΛ ΓΝ ο 2 Ω Η σ ω w	η ιη CM ο ζ α Η σ ω w	Ιΰ ιη Π ο 2 Ω Μ Ο X X	r* tn OJ ο 2 Ω w σ X «	03 m ΓΜ σ 2 Ω Η σ X «
α >< Η 0-, ω X	F ιη CS	<Μ ιη <Μ	Π tn CM	Τ» V} CM	tn tn ίΝ	SD tn <Μ	> ιη CM	G0 ιη η

PL 196 675 B1

W Tabeli X: * oznacza peptydy acylowane na N-końcu i amidowane na C-końcu; ' oznacza peptydy dansylowane na N-końcu; sp oznacza peptydy wykazujące trudności przy rozpuszczaniu w warunkach eksperymentu; X jest Aib; Z jest Nal; O jest Orn; He (%) oznacza procentowy udział helis; mics oznacza micelle, a - oznacza aminokwasy, które uległy delecji.

9. Przykład: Farmakokinatyka agonistów ApoA-I

Poniższe eksperymenty prezentują, że agoniści ApoA-I są stabilni w układzie krążenia i wiążą się ze składnikami HDL z osocza.

W szczególności, radioaktywnie znakowany peptyd 4 był wstrzykiwany dootrzewnowo myszom wraz ze składnikami HDL i pozostawał stabilny przez przynajmniej 6 godzin. Po dodaniu peptydu 4 do ludzkiego osocza, (ex vivo) pozostawał on również związany ze składnikiem HDL.

9.1. Synteza peptydów znakowanych radioizotopami

Peptydy 4 (SEQ ID NO: 4) i 8 (SEQ ID NO: 8) znakowane radioizotopami zostały otrzymane poprzez sprzęganie ¹⁴C-znakowanych Fmoc-Pro z N-końcem peptydów.

L-[U-¹⁴C]-prolina, o specyficznej aktywności 9,25 GBq/mol, była zastosowana do syntezy znakowanej Fmoc-L-proliny. Syntezy przeprowadzono zgodnie z Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671-173. W skrócie, 250 μΜ (29,6mg) nieznakowanej L-proliny rozpuszczano w 225 μl 9% roztworze Na₂CO₃i dodawano do roztworu (9% Na₂CO₃) 9,25 MBq (250 μΜ) ¹⁴C-znaczonej L-Pro. Roztwór schładzano do 0°C, mieszano z 600 μΜ (202 mg) 9-fluoroenylometylo-N-sukcynimydylowęglanu (Fmoc-OSu) w 0,75 ml DMF i wytrząsano w temperaturze pokojowej przez 4 godz. Następnie mieszanina była ekstrahowana dietyloeterem (2 Χ 5ml) i chloroformem (1 Χ 5 ml), pozostała faza wodna była zakwaszana 30% HCl i ekstrahowana chloroformem (5 Χ 8 ml). Faza organiczna była suszona w Na2SO4, filtrowana i jej objętość redukowano w strumieniu azotu do 5 ml. Określano czystość stosując TLC (CHCL^eOKHac, 9:1:0.1 obj./obj./obj, w stało-fazowej HPTLC silicagel 60, Merck, Niemcy) i poprzez stwierdzanie obecności jednego piku (detekcja w UV, czystość radiochemiczna: Linear Analyzer, Berthold, Niemcy); wydajność reakcji: 90% (określana przez LSC).

Roztwór chloroformu zawierający ¹⁴C-Fmoc-Prolinę był stosowany bezpośrednio w syntezie peptydów. Żywica z peptydami zawierającymi 2-22 aminokwasów, syntetyzowanymi automatycznie jak opisano w sekcji 6, została użyta do syntezy. Sekwencja peptydów była badana metodą degradacji Edmana. Sprzęganie prowadzono zgodnie z opisem w sekcji 6.1 (manualne sprzęganie Fmoc-Nal), za wyjątkiem tego, że HATU (O-(7-azabenzotriazolo-1-ylo)1-,1,3-tetrametylouroniano-heksafluorofosforan) był stosowany zamiast TBTU. Drugie sprzęganie ze znakowanym Fmoc-L-Pro przeprowadzono manualnie zgodnie z opisem w sekcji 6.1. Peptyd odcinano i odblokowywano zgodnie z opisem w sekcji 6.4. Specyficzne aktywności wyznakowanych peptydów były następujące:

peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) = 3,9 Χ 10⁵ dpm/mg peptyd 8 (SEQ ID NO: 8) = 1,0 Χ 10⁵ dpm/mg

9.2. Famakokinetyka u myszy

W każdym eksperymencie, 2,5 mg/kg radioaktywnego peptydu wstrzykiwano dootrzewnowo myszom, które karmiono zwykłą karmą dla myszy lub miażdżycogenną dietą Thomas-Harcroft (dającą kilkukrotne zwiększenie cholesterolu VLDL i IDL). Próbki krwi pobierano w różnych odstępach czasowych w celu oszacowania radioaktywności w osoczu. Wyniki podsumowano w Tabeli XI, poniżej.

T a b e l a XI

Okres półtrwania peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) w myszach

Gatunek	Preparat	Okres półtrwania (godziny)
C57BL/6	peptyd 4/PBS	5,72¹
dieta zwykła C57BL/6	peptyd 4/PBS	5,98²
dieta wysokotłuszczowa)	kompleks³	6,39⁴
ApoE^-6	peptyd 4/POPC peptyd 4/PBS	14,2⁵

Maksymalne stężenie w surowicy wynosiło 25,7% wstrzykniętej cpm w 1,9 godzin po iniekcji r²=0,960

Maksymalne stężenie w surowicy wynosiło 20,3% wstrzykniętej cpm w 2,98 godzin po iniekcji r²=0,973

PL 196 675 B1

Kompleks składający się z fosfolipidu (POPC) i peptydu 4 przygotowano z użyciem metody dializy cholanowej.

Maksymalne stężenie w surowicy wynosiło 39,4% wstrzykniętej cpm w 4,2 godzin po iniekcji r²=0,893

Maksymalne stężenie w surowicy wynosiło 17,4% wstrzykniętej cpm w 1,46 godzin po iniekcji r²=0,973 knockout ApoE

9.3. Stabilność w ludzkiej surowicy

9.3.1. Metody eksperymentalne

100 pg znakowanego ¹²C peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) przygotowanego jak opisano powyżej w sekcji 9.1, mieszano z 2 ml świeżego ludzkiego osocza (w 37°C) i pozbawiano lipidów bezpośrednio (próbka kontrolna) lub po 8 dniach inkubacji w 37°C (próbka testowa). Lipidy były usuwane poprzez ekstrahowanie lipidów równą objętością 2:1 (obj./obj.) chloroform:metanol.

Próbki były nakładane na kolumnę HPLC w odwróconej fazie C18 i eluowano w liniowym gradiencie (25-58% przez 33 min) acetonitrylu (zawierającego 0,1% TFA). Profile elucji otrzymywano mierząc absorbancje przy 220 nm i radioaktywność.

9.3.2. Wyniki

Próbka kontrolna przechodziła przez kolumnę jako jeden pik z czasem elucji ok. 30 min. Cała radioaktywność eluowała wraz z tym pikiem.

Próbki testowe eluowały w postaci dwóch pików: jednego mającego czas elucji ok. 3 min, i innego mającego czas elucji ok. 30 min. Pik 3 min. (zdegradowany peptyd) zawierał około 15% radioaktywności nakładanej na kolumnę. Pozostała radioaktywność eluowała wraz z pikiem 30 min. (peptyd nienaruszony), wskazując, że peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) jest bardzo stabilny - ponad 80 % peptydu 4 pozostało w postaci nienaruszonej nawet po 8 dniach inkubacji w ludzkiej surowicy.

9.4. Tworzenie cząsteczek podobnych do pre-β

9.4.1. Metody eksperymentalne

Ludzkie HDL były izolowane drogą ultrawirowania w gradiencie gęstości KBr przy gęstości d=1,21 g/ml dając szczytową frakcje w filtracji żelowej na żelu Superose 6, która umożliwiała oddzielenie HDL od innych lipoprotein. Izolowane HDL były doprowadzane do stężenia 1,0 mg/ml poprzez dodawanie odpowiedniej ilości roztworu fizjologicznego w oparciu o zawartość białka określoną testem Bradforda. Porcja 300 μl pochodząca z wyizolowanych HDL była inkubowana z 100 μl ¹⁴C-znakowanego peptydu 4 (0,2-1,0 pg/pl) przez 2 godziny w 37°C Analizowano pięć oddzielnych inkubacji obejmujących próbkę ślepą zawierającą 100 μl roztworu soli fizjologicznej i cztery rozcień14 czenia C-znakowanego peptydu 4: (i) 0,20 pg/pl stosunek peptyd:HDL = 1:15; (ii) 0,30 pg/pl stosunek peptyd:HDL = 1:10; (iii) 0,60 pg/pl stosunek peptyd:HDL = 1:5; (iv) 1,00 pg/pl stosunek peptyd:HDL =1:3. Po dwugodzinnej inkubacji, 200 pl porcje prób (całkowita objętość 400 pl) nakładano na kolumnę do filtracji żelowej Superose 6 w oddzielenia lipoprotein i ich analizy, a 100 pl zastosowano do określenia całkowitej nałożonej radioaktywność. Warunki dla wszystkich chromatografii FPLC opisano w sekcji 9.4, poniżej.

9.4.2. Wyniki

Wyniki zostały przedstawione w Tabeli XII, poniżej oraz na fig. 9A-9F.

T a b e l a XII

Wypieranie ludzkiej ApoA-I z izolowanych ludzkich HDL przez znakowany ¹⁴C peptyd 4 (SEQ ID NO: 4)

	Pik #1	Pik #2	Pik #3	¹⁴C nakładane (cpm)	¹⁴C z kolumny (cpm)	odzyzk (%)
1a	1b
1	2	3	4	5	6	7	8	9
P:LP=1:15 kontrola peptyd	EV	30,5
AUC	9,95
EV	29,4	30,9
AUC	4,09	6,26
14c	7,920			1,622	10,361	9,542	92,1

PL 196 675 B1 cd. tabeli XII

1	2	3	4	5	6	7	8	9
P:LP=1:10 kontrola	EV	30,7
	AUC	9,15
peptyd	EV	30,7		33,0
	AUC	8,42		0,67
	¹⁴C	N/A			N/A	N/A	N/A	N/A
P:LP=1:5 kontrola	EV	30,9
	AUC	9,87
peptyd	EV	30,8		34,3
	AUC	8,19		1,53	5,281
	¹⁴C	20,768				28,794	26,049	90,5
P:LP=1:3 kontrola	EV	30,5
	AUC	10,22
peptyd	EV	30,6		34,3
	AUC	7,93		1,97
	¹⁴C	43,495			7,832	54,593	51,321	94

P:LP = stosunek masowy peptydu do lipoproteiny;

EV = objętość elucji (ml);

AUC = pole pod krzywą (program Peakfit);

¹⁴C - ilość Cpm określona pomiarem radioaktywności;

Pik #1 = frakcje 29 do 33;

Pik #2 = frakcje 34 do 35;

Pik #3 = frakcje 41 do 47

Z danych przedstawionych w Tabeli XII wynika, że więcej niż 90% radioaktywności zostało odzyskane z kolumny po oddzieleniu cząsteczek lipoprotein. W małych stężeniach peptydu (tj. stosunek masowy peptyd:HDL wynoszący 1:15), pik HDL ulegał rozdzieleniu na dwa różne piki (fig. 9A), co sugeruje, że oddziaływania pomiędzy peptydem i HDL powodują pewną zmianę w cząsteczce lipoproteiny, ale ponieważ nie zauważono zaniknięcia piku, oddziaływanie to nie było wystarczające do całkowitego wyparcia natywnej ApoA-I. Wraz ze wzrostem stężenia peptydu wypieranie ApoA-I wzrastało odpowiednio do stężenia peptydu (fig. 9B-9D). Ponadto, wszystkie chromatografie pokazywały także trzeci pik wykrywany pomiarami radioaktywności (za wyjątkiem stosunku masowego 1:10, dla którego nie pokazano uzyskanych danych), co odpowiada objętości elucji wolnego peptydu (fig. 9E).

Aby uzyskać dalszą analizę wpływu stężenia peptydu na oddziaływania ¹⁴C-znakowanego peptydu 4 i HDL, przygotowano wykres różnicowy z czterech chromatografii (fig. 9A-9D) przedstawiony na fig. 9F. Wykresy różnicowe pokazują przesunięcie piku HDL oraz zwiększone wypieranie ApoA-I wraz ze wzrostem stężenia peptydu. Wypieranie ApoA-I skutkuje tworzeniem cząsteczek podobnych do pre-β.

9.5. Wiązanie się peptydu 4 z ludzką frakcją lipoprotein

9.5.1. Metody eksperymentalne

Wiązanie się peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) z frakcjami ludzkich lipoprotein określano inkubując ¹⁴Czna-kowany peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) z każdą klasą lipoprotein (HDL, LDL i VLDL) i mieszaniną różnych klas lipoprotein.

HDL, LDL i VLDL były izolowane w gradiencie gęstości KBr przy gęstości d=1,21 g/ml i oczyszczane techniką FPLC na kolumnie do sączenia molekularnego Superose 6B (chromatografia była prowadzona z przepływem 0,7 ml/min, w buforze zawierającym 10 mM Tris (pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA i 0,01% NaN3). ¹⁴C-znakowany peptyd 4 inkubowano z HDL, LDL i VLDL przy stosunku masowym peptyd:fosfolipid wynoszącym 1:5 przez 2 godz. w 37°C. Wymagana ilość

PL 196 675 B1 lipoprotein (objętości bazujące na ilości potrzebnej do uzyskania 1000 pg) były mieszane z 0,2 ml roztworu wyjściowego peptydu(1 mg/ml) i roztwór był dopełniany do 2,2 ml za pomocą 0,9% NaCl zgodnie z tabelą XIII

T a b e l a XIII

Przygotowywanie próbek peptyd-lipoproteina

	HDL (ml)	LDL (ml)	VLDL (ml)	0,9% NaCl (ml)	¹⁴C znak. peptyd 4 (ml)	Całkowita (ml)
Kontrola				2,0	0,2	2,2
LP/peptyd	0,4	0,3	0,9	0,4	0,2	2,2
HDL/peptyd	0,4			1,6	0,2	2,2
LDL/peptyd		0,3		1,7	0,2	2,2
VLDL/peptyd			0,9	1,1	0,2	2,2

Po 2 godzinnej inkubacji w 37°C, porcje 0,1 ml były usuwane z roztworu i umieszczane w liczniku scyntylacyjnym w celu obliczenia całkowitej radioaktywności, gęstość pozostałej inkubowanej mieszaniny była doprowadzana do 1,21 g/ml za pomocą KBr, i próby odwirowywano przy 100,000 rpm (300,000 g) przez 24 godziny w 4°C w rotorze TLA 100.3 stosując ultrawirówkę Beckman. Uzyskany supernatant był frakcjonowany poprzez pobieranie kolejnych 0,3 ml porcji kolejnych warstw roztworu, dając z każdej próby po 5 frakcji, a 0,05 ml z każdej frakcji poddawano zliczeniom radioaktywności. Dwie szczytowe frakcje zawierają płynne lipoproteiny, pozostałe frakcje (3-5) odpowiadają białkom/peptydom z roztworu.

9.5.2. Wyniki

Wyniki przedstawiono w Tabeli XIV, poniżej. Inkubacja ¹⁴C-znakowanego peptydu 4 z frakcjami izolowanych lipoprotein wykazały silne powinowactwo do HDL (88% całkowitej radioaktywności było zawarte we frakcjach 1 i 2) oraz do VLDL (85%), i stosunkowo słabe powinowactwo do. LDL (66%).

Mieszanina inkubacyjna zawierająca wszystkie frakcje lipoprotein i ¹⁴C-znakowany peptyd 4 (LP/peptyd) wykazała, że 88% znakowanego peptydu wiązało się z frakcją lipoprotein.

Analiza FPLC mieszaniny inkubacyjnej LP/peptyd pokazała, że prawie całkowita ilość ¹⁴C-znakowanego peptydu 4 była związana z frakcją HDL, wskazując na wysoką selektywność w stosunku do tej klasy lipoprotein.

T a b e l a XIV

Wiązanie się peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) z różnymi lipidami

frakcja	kontrola	LP/peptyd	HDL/peptyd	LDL/peptyd	VLDL/peptyd
1	650	60250	61510	43740	42920
2	1000	12990	17620	15140	19280
3	6590	3810	2260	11880	3930
4	36550	1510	3130	10860	2600
5	34380	5090	5450	7710	4550
całk.	79170	83650	89970	89330	73280
całk.*	88550	96646	98494	100452	97306
Odzysk(%)	89	87	91	89	75

*przed odwirowywaniem

9.6. Peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) wiąże się selektywnie z lipidami HDL w ludzkim osoczu

9.6.1. Metody eksperymentalne

Ludzkie osocze (2 ml) inkubowano z 20, 40, 60, 80 i 100 pg ¹⁴C-znakowanego peptydu 4 przez 2 godziny w 37°C. Lipoproteiny były rozdzielane poprzez doprowadzanie gęstości do 1,21 g/ml, i odwirowywanie w rotorze TLA 100.3 przy 100,000 rpm (300,000 g) przez 36 godzin przy 4°C. Szczytowe 900 pl (w 300 pl frakcjach) pobierano do analizy. 50 pl z każdych 300 pl frakcji poddawano zliczaniu radioaktywności, a 200 pl analizowano techniką FPLC (kolumna łączona Superose 6/Superose 12).

9.6.2. Wyniki

Ilość radioaktywności uzyskana dla każdej frakcji została przedstawiona w Tabeli XV, poniżej.

Większość radioaktywności była zawarta w trzech szczytowych frakcjach. Wszystkie profile rozdziału lipoprotein z próbek surowicy inkubowanych z ¹⁴C-znakowanym peptydem 4 (SEQ ID NO: 4) (niepokazane) wskazują na to, że w tym przypadku, większość radioaktywności była obecna we frakcji HDL.

PL 196 675 B1

Zatem, pomimo obecności innych lipoprotein w ludzkiej surowicy, peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) wykazuje wysoką selektywność wiązania się do HDL.

T a b e l a XV

Radioaktywność odzyskana z inkubacji ¹⁴C-znakowanego peptydu 4 z ludzką surowicą

Peptyd	Frakcja	Radioaktywność (cpm*)	Odzysk**
(ąg)	Nr	w 50 ąl	w 300 ąl	(%)
20	1	1407	8442	71,6
	2	405	2430	20,6
	3	152	912	7,7
40	1	2538	15228	70,4
	2	721	4326	20
	3	347	2082	9,6
60	1	4492	26952	75,5
	2	1107	6642	18,6
	3	354	2124	5,9
peptyd	frakcja	radioaktywność (cpm*)	odzysk**

80	1	4715	28290	60
	2	2251	13506	28,6
	3	851	5346	11,3
100	1	5424	32544	67,5
	2	1708	10248	21,2
	3	907	5442	11,3

* Wartość dla 300 μ została otrzymana poprzez pomnożenie wartości dla 50 μ przez 6.

** W oparciu o całkowitą wartość początkową użytą do zmieszania z osoczem

10. Przykład: Agoniści ApoA-I stymulują wypływ cholesterolu

Komórki nowotworu wątroby HepG2 posiewano w 6 studzienkowych płytkach hodowlanych i hodowano do osiągnięcia stanu konfluencji. Komórki znakowano ³H-cholesterolem suchym cholesterolem, następnie dodawano 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (PBS), sonifikowano roztwór, dodawano 0,2 ml znakowanego roztworu i 1,8 medium hodowlanego do komórek, w taki sposób, że każda studzienka zawierała 2 μ Ci radioaktywności. Komórki inkubowano przez 24 godziny ze znakowanym medium.

Kompleksy peptyd (lub białko):DMPC przygotowywano w stosunku peptyd (lub białko):DMPC (wag.:wag.) wynoszącym 1:2. Dla otrzymania kompleksów, peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) lub natywne ludzkie białko ApoA-I było dodawane do roztworu DMPC w PBS i inkubowane w temperaturze pokojowej przez noc, następnie roztwór klarowano. Stężenie białka lub peptydu w końcowym roztworze wynosiło 1 mg/ml.

Medium znakujące było oddzielane od komórek, a komórki przemywane PBS zanim dodano kompleksy. Do każdej studzienki dodawano 1,6 medium wzrostowego, następnie kompleks peptyd (lub białko): DMPC i dopełniano PBS do objętości końcowej 2 ml na studzienkę. Ostateczne stężenia peptydu lub ApoA-I wynosiły 1; 2,5; 5; 7,5 i 25 ąg/ml medium. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C medium usuwano, a komórki przemywano 2 ml 1% BSA/PBS, a następnie 2-krotnie 2 ml PBS. Ilość ³H-cholesterolu wypływającego do medium określano poprzez mierzenie radioaktywności płynu.

Wyniki pokazały, że peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) był dużo bardziej skuteczny w stymulowaniu wypływu cholesterolu niż ApoA-I.

11. Przykład: Zastosowanie agonistów ApoA-I w modelowych układach zwierzęcych

Skuteczność agonistów ApoA-I według wynalazku została wykazana na królikach. Wyniki wykazują, że podawanie agonistów ApoA-I zwiększa stężenie w surowicy podobnych do HDL cząsteczek.

11.1. Przygotowywanie kompleksów fosfolipid/peptyd

Małe dyskoidalne cząsteczki składające się z fosfolipidu (DPPC) i peptydu przygotowywano techniką dializy cholanowej. Fosfolipid był rozpuszczany w chloroformie i suszony w strumieniu azotu. Peptyd był rozpuszczany w buforze (roztwór soli fizjologicznej) w stężeniu 1-2 mg/ml. Błona lipidowa była rozpuszczana w buforze zawierającym cholan (43°C) a roztwór peptydu był dodawany w stosunku

PL 196 675 B1 wagowym fosfolipid/peptyd 3:1. Mieszanina była inkubowana przez noc w 43°C i następnie dializowana w 43°C (24 godz.), w temperaturze pokojowej (24 godz.), i w 4°C (24 godz.), z trzykrotną wymianą buforu (duże objętości) odpowiadającą zmianie temperatur. Kompleksy sterylizowano przez filtrowanie (0,22 μm) przed iniekcjami i przechowywano w 4°C.

11.2. Izolacja i charakterystyka cząsteczek peptyd/fosfolipid

Cząsteczki były rozdzielane na . kolumnie do filtracji żelowej (Superose 6 HR). Pozycja piku zawierającego cząsteczki była identyfikowana za pomocą mierzenia stężenia fosfolipidów w każdej frakcji. Na podstawie objętości elucji, określano promień Stokesa. Stężenie peptydu w kompleksie określano mierząc zawartość fenyloalaniny (stosując HPLC) po 16 godz. hydrolizy kwaśnej.

11.3. Iniekcje królikom

Samce królików rasy New Zealand White (2,5-3 kg) zaszczepiano dożylnie jedną dużą dawką kompleksu fosfolipid/peptyd (ilość peptydu 5 lub 10 mg/kg masy ciała), nie przekraczającą 10-15 ml. Zwierzęta były lekko znieczulane przed zabiegiem. Próbki krwi (zbierane na EDTA) pobierano przed i po 5, 15, 30, 60, 240 i 1440 minutach po iniekcji. Określano hematokryt (Hct) dla każdej próbki. Próbki były porcjowane i przechowywane w -20°C przed analizą.

11.4. Analizy surowicy królików.

Lipidy osocza. Określano całkowity cholesterol osocza, trójglicerydy osocza i fosfolipidy osocza za pomocą dostępnych komercyjnie testów enzymatycznych postępując zgodnie z dołączonymi do nich protokołami (Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy oraz Biomerieux, 69280, Marcy-L'etoile, Francja).

Profile lipoproteinowe. Profile osoczowych lipoprotein z frakcji otrzymanych po rozdzieleniu osocza na jego frakcje lipoproteinowe były określane poprzez odwirowywanie w gradiencie gęstości sacharozy. Frakcje były zbierane i mierzono zawartość fosfolipidów i cholesterolu w każdej frakcji metodami enzymatycznymi.

11.5. Wyniki

Profil lipoproteinowy królików zaszczepianych 10 mg/kg peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) (w postaci kompleksów peptyd/DPPC) w funkcji czasu pokazano na fig. 10. Znaczący wzrost poziomu cholesterolu we frakcjach cholesterolu HDL (frakcje >1,06 mg/ml) był widoczny w 5 min po zaszczepieniu i utrzymywał się przez około 1 godzinę.

Cholesterol z mieszanych frakcji HDL otrzymywanych poprzez wirowanie w gradiencie gęstości został przedstawiony w Tabeli XVI, poniżej. Największy wzrost cholesterolu HDL (31,3%) występował 15 min. po podaniu.

Dane sugerują, że podawanie kompleksu peptyd 4/DPPC (10 mg/kg) indukuje szybką i efektywną mobilizację cholesterolu znajdującego się w układzie krążenia.

T a b e l a XVI

Poziom cholesterolu HDL u królików po podaniu 10 mg/kg peptydu 4 (SEQ ID NO: 4)

czas (min. )	HDL cholesterol	wzrost HDL cholesterolu (%)
0	325 408	25,2
15	428	31,3
60	387	18,9
240	291	-10,7
1440	347	6,6

Zależność wywoływanego efektu od dawki kompleksów peptyd 4/DPPC pokazano w Tabeli XVII, poniżej. W oparciu na tych dwóch punktach czasowych, zaobserwowano w przybliżeniu liniową zależność efektu od wielkości dawki.

T a b e l a XVII

Zależność poziomów cholesterolu HDL od wielkości dawki po podaniu kompleksów peptyd 4/DPPC

Dawka	HDL Cholesterol (5 min)	HDL Cholesterol (15 min)	HDL Cholesterol (60 min)
1	2	3	4
5 mg/ kg	33,7	28	60
5 mg/ kg	49	40	20
średni wzrost %	41,4	35,0	40,0

PL 196 675 B1 cd.tabeli XVII

1	2	3	4
10 mg/kg	60,7	75	121,3
10 mg/kg	35	42,5	35,6
średni wzrost %	47,9	58,8	78,5

Procentowy wzrost poziomu cholesterolu HDL następujący po wstrzyknięciu 5 mg/kg peptydu 1 (SEQ ID NO: 1) (w postaci kompleksów peptyd/DPPC) lub 10 mg/kg peptydu 3 (SEQ ID NO: 3) (w postaci kompleksów peptyd/DPPC) pokazano w tabeli XVIII, poniżej.

T a b e l a XVIII

Czas (min)	Wzrost (%) (peptyd 1, 5 mg/ml)	Wzrost (%) (peptyd 3, 10 mg/ml)
15	24,3	84
30	95	71
60	40,7	60
240	29	14,5

Eksperymenty te wykazują zdolność agonistów ApoA-I według wynalazku do zwiększania poziomu HDL-cholesterolu. Znaczący wzrost poziomu cholesterolu HDL zaobserwowano nawet w 4 godziny po podaniu peptydu 1 (SEQ ID NO: 1) i peptydu 3 (SEQ ID NO: 3).

12. Przykład: Otrzymywanie kompleksu peptyd-lipid metodą koliofilizacji.

Poniższy protokół był stosowany do przygotowywania kompleksów peptyd-lipid.

Jeden mg peptydu 4 (SEQ ID NO: 4) rozpuszczano w 250 pl metanolu o czystości HPLC (Perkin Elmer) w szklanych probówkach o pojemności jednego ml z zatyczkami (Waters #WAT025054). Rozpuszczanie peptydu było wspomagane poprzez okresowe wytrząsanie co 10 minut w temperaturze pokojowej. Do tej, mieszaniny dodawano, po 1, 2, 3, 4, 5, 7.5, 10 lub 15 mg dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC; Avanti Polar Lipids, 99% czystości, produkt #850355) korzystając z wyjściowego roztworu w metanolu o stężeniu 100 mg/ml. Objętość mieszaniny była dopełniana do 400 pl metanolem, a następnie mieszaninę wytrząsano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Do każdej probówki dodawano 200 pl ksylenu (Sigma-Aldrich 99% czystości, czystość HPLC) i wytrząsano probówki przez 10 sekund każdą. Nakłuwano dwie małe dziurki w wieczkach każdej probówki igłą 20 do strzykawek, probówki zamrażano przez 15 sekund w ciekłym azocie i liofilizowano przez noc w próżni. Do każdej probówki dodawano 200 ml roztworu 0,9% NaCl. Probówki wytrząsano przez 20 sekund. Po tym czasie roztwór w probówce stawał się mleczny. Probówki inkubowano w kąpieli wodnej przez 30 minut w 41°C. Roztwory we wszystkich probówkach stawały się klarowne (tj. przypominały wyglądem wodę) oprócz probówki zawierającej 16 mg DPPC, która pozostawała mętna.

Następujący protokół był stosowany do otrzymywania większej ilości kompleksów peptyd-lipid do eksperymentów in vivo.

Peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) (22,4 mg) rozpuszczano w metanolu w stężeniu 3,5 mg/ml poprzez inkubację przez kilka minut i wytrząsanie z przerwami. Do tego roztworu dodawano dipalmitoilu fosfatydylocholiny (DPPC) w metanolu (roztwór wyjściowy 100 mg/ml), dzięki czemu ostateczny stosunek wagowy DPPC/peptyd wynosił 2,5:1. Roztwór ten wytrząsano. Dodawano ksylenu do końcowego stężenia 36%. Porcje otrzymanego roztworu pobierano do dalszej analizy techniką chromatograficznej filtracji żelowej. Roztwór mrożono w ciekłym azocie i liofilizowano susząc pod próżnią. Porcje zawierające 20 mg peptydu i 50 mg DPPC ponownie uwadniano w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,9% NACI), mieszano i ogrzewano do 41°C przez kilka minut, aż do otrzymania klarownego roztworu odtwarzających się kompleksów peptydowo-fosfolipidowych.

12.1. Charakteryzacja kompleksów z użyciem chromatografii filtracji w żelu Sepharose 6

Kompleksy peptyd-fosfolipid zawierające ¹⁴C-znakowany peptyd 4 (SEQ ID NO: 4) (radioaktywność specyficzna 159,00 DPM/mg peptydu, zakładając 50% zawartość peptydu) były przygotowywane poprzez kolifilizację zgodnie z opisem w tekście. Preparaty zawierały 1 mg peptydu i 4 mg DPPC. Po odtworzeniu kompleksów w 200 pl 0,9% NaCl, 20 pl (100 pg) kompleksów nakładano na kolumnę Pharmacia Superose 6 stosując 0,9% NaCl jako fazę ciekłą przy przepływie 0,5 ml/minutę. Po zejściu 5 ml (objętość kolumny 7,7 ml), zbierano 1 ml frakcje. Porcje 20 pl z frakcji testowano na zawartość fosfolipidy, stosując zestaw BioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150 (#61491) postępując

PL 196 675 B1 zgodnie z instrukcją producenta. Pozostałość każdej frakcji była zliczana przez 3 min w cieczowym liczniku scyntylacyjnym Waliach 1410 (Pharmacia) stosując program Easy Count. Ogromna większość fosfolipidów i peptydów była otrzymywana w kilku frakcjach z maksimum przy ok. 16 ml. Profil absorbancji UV dla tej próby (nie pokazano) wskazuje, że kompleksy eluują z kolumny przy objętości 14,7 ml. Rozbieżność pomiędzy objętością elucji mierzoną radioaktywnie/testem fosfolipidowym i pomiarami absorbancji UV wynikała z 1,3 ml martwej objętości zawartej w przewodach pomiędzy komorą pomiaru absorbancji UV i frakcją schodzącą z kolumny. Ta objętość elucji odpowiada średnicy Stokesa 114 Angstremów. Objętości elucji około 15-19 ml odpowiadają cząsteczkom o średnicy Stokesa 50-120 Angsremów, co stanwi zakres wielkości ludzkich HDL.

12.2. Filtracja ludzkich HDL w żelu Superose 6

Ludzkie HDL₂ przygotowywano następująco: 300 ml mrożonej ludzkiego osocza Mannheim, Stacja Krwiodawstwa #1185190) topiono, zagęszczano do gęstości 1,25 stałym bromkiem potasu i odwirowywano przez 45 godzin przy 40,000 ΡΡΜ stosując rotor Ti45 (Beckman) w temperaturze 20°C. Warstwa pływająca była zbierana, dializowana w wodzie destylowanej, doprowadzana do gęstości 1,07 stałym bromkiem potasu, odwirowywana jak opisano powyżej przez 70 godzin. Warstwa spodnia (na głębokości jednego cm powyżej dna probówki) była zbierana, przenoszona do 0,01% azydku sodu, i przechowywana w 4°C do 4 dni przed chromatografią. 20 μl HDL₂ nakładano na układ do chromatograficznej filtracji żelowej Pharmacia Superose 6 FPLC, stosując 0,9% NaCl jako eluent. Przepływ wynosił 0,5 ml/min. Przepływ przez kolumnę był monitorowany pomiarami absorbancji lub rozpraszania światła o długości 254 nm. Serie białek o znanych masach cząsteczkowych i średnicach Stokesa były stosowane jako standardy służące do kalibrowania kolumny oraz wyliczania średnic Stokesa cząsteczek (Pharmacia Gel Filtracion Calibracion Kit Instruction Manual, Pharmacia Laboratory Separacion, Piscataway, NJ, poprawione kwiecień 1985). HDL eLuował z 14,8 ml, co odpowiadało średnicy Stokesa 108 nm.

13. Przykład: Przygotowywanie przeciwciał

Peptydy 4 lub 8 były sprzęgane z hemocyjaniną ze skałoczepa (KHL; 1 mg peptydu na 10 mg KHL). Koniugat KHL (^G) był rozpuszczany w kompletnym adiuwancie Freunda i wstrzykiwany królikom w czasie to, z dawką przypominającą zawierającą 0,25 mg koniugatu KHL w 4 tygodniu i ponownie w 5 tygodniu. W próbkach krwi pobieranych przed szczepieniem i sześć tygodni po szczepieniu określano miano przeciwciał specyficznych wobec antygenu, stosując test ELISA.

Krew, z której otrzymywano przeciwciała pochodziła od dwóch królików. Przeciwciała specyficzne wyłącznie wobec antygenów peptydowych izolowano następująco:

1. Wolny peptyd przyłączano do aktywowanej bromkiem cyjanu Sepharose 4B. (Pharmacia), postępując zgodnie z zaleceniami producenta.

2. Surowice odpornościowe były wstępnie absorbowane na kolumnie z nieistotnymi peptydami i kolumnach zawierających nieistotne ludzkie i mysie białka surowicze.

3. Wstępnie zaabsorbowane surowice odpornościowe były przepuszczane przez kolumnę z odpowiednim peptydem (patrz punkt 1).

4. Kolumny przemywano 0,1 Μ buforowanym boranem roztworem soli fizjologicznej (pH 8,2) a związane przeciwciała były wypłukiwane z użyciem niskiego gradientu pH od pH 4,0 do pH 3,0 do pH 2,0 (0,1 Μ bufor glicynowy) i ostatecznie 0,1 Μ HCl.

5. Wymyty materiał był neutralizowany nadmiarem buforowowanego boranem roztworu soli fizjologicznej, zatężany przez ultrafiltrację (Amicon, ΥΜ30) i dializowany w buforowanym boranem roztworze fizjologicznym.

6. Stężenie białek określano pomiarami absorbancji przy 280 nm.

Uzyskane przeciwciała testowano na specyficzność gatunkową, stosując ludzką ApoA-I lub oczyszczaną mysią ApoA-I w teście Elisa bezpośredniego wiązania. Ludzkie i mysie przeciwciała były specyficzne wobec ludzkiej ApoA-I, i wykazywały minimalną aktywność krzyżową.

Wynalazek ten nie jest ograniczony w swym zakresie do specyficznych realizacji opisanych powyżej, które zostały zaprezentowane jedynie w celu pojedynczego zilustrowania poszczególnych aspektów wynalazku, a odpowiednie techniki i składniki ekwiwalentne funkcjonalnie mieszczą się w zakresie niniejszego wynalazku. W związku z tym wynalazek obejmuje także wszelkie modyfikacje wynalazku, które są uzupełnieniem do opisanych i przedstawionych na załączonych figurach, a mogą być osiągnięte przez specjalistę w oparciu o zaprezentowane ujawnienie. Modyfikacje takie są także objęte zakresem załączonych zastrzeżeń.

Wszystkie cytowane pozycje literaturowe zostały włączone do niniejszego opisu poprzez odesłanie.

PL 196 675 B1

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: Dasseux, Jean-Louis

Sekul, Renate Buttner, Klaus Cornut, Isabelle Metz, Gunther Dufourcą, Jean (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: AGONIŚCI APOLIPOPROTEINY A-I I ICH ZASTOSOWANIE W LECZENIU CHORÓB DYSLIPIDEMICZNYCH (iii) LICZBA SEKWENCJI: 254 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRESAT : Pennie & Edmonds LLP (B) ULICA : 1155 Avenue of the Americas (C) MIASTO: New York (D) STAN: NY (E) PAŃSTWO: USA (F) ZIP: 10036-2811 (v) POSTAĆ DO ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny do IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ Version 2.0 (vi) DANE DOTYCZĄCE TEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: PCT/US98/20327 (B) DATA ZŁOŻENIA: 28-SEP-1998 (C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE ZGŁOSZENIA UPRZEDNIEGO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/940,095 (B) DATA : 29-SEP-1997 (viii) PEŁNOMOCNIK:

(A) NAZWISKO: Coruzzi, Laura A (B) NUMER W REJESTRZE: 30,742 (C) NUMER REFERENCYJNY: 009196-0004-228 (ix) DANE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: 650-493-4935 (B) TELEFAX: 650-493-5556 (C) TELEX: 66141 PENNIE

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:1:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Xaa 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:2:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Trp

PL 196 675 B1

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro

(xi)OPIS	SEKWENCJI:	SEQ	ID NO:5:
Xaa Val	Leu Asp	Leu	Phe	Arg Glu	Leu Leu Asn Glu Leu	Leu Glu Ala
1		5			10	15
Leu Lys	Gin Lys	Leu	Lys	Lys
	20

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza

PL 196 675 B1 (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:6:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:7:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:8: ' (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:6:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:9:

PL 196 675 B1 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:9:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:10:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:10:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:11:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

PL 196 675 B1

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2V INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:12:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:12:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Gly Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:13:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:13:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 18

PL 196 675 B1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:14:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:15:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:15:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:16:

Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:17:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:17:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:18:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;18:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:19:

Xaa Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala

PL 196 675 B1

10

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:20:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony(ix) CECHY:

(A) (B) (D) (xi)OPIS

NAZWA/KLUCZ: Inne LOKALIZACJA: 1

INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro SEKWENCJI: SEQ ID NO:21:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:22: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 196 675 B1 (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:22:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Gly 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:23:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aroino acids (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:23:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:24:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:24:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa

PL 196 675 B1 (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:25:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:26:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:26:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:27:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:28:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:28:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:29:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:29:

Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...22 (D) INNE INFORMACJE: peptyd danzylowany na N-końcu

PL 196 675 B1 (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:30:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:31:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:31:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Leu Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:32:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:33:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:33:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:34:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 5 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (XX)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:34:

Pro Val Leu Asp Xaa Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:35:

PL 196 675 B1

Pro Val Leu Asp Trp Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala ¹ 5 10 ₁₅

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:36:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:36:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:37:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:37:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

PL 196 675 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:38;

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala ¹⁵ 10 15

Trp Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:39:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:39:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:40:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:40:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Asn Glu Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa

100

PL 196 675 B1 (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:41;

Pro Val Leu Asp Leu Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:42:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:42:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Trp Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne

PL 196 675 B1

101 (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:43:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:44:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE:Wszystkie genetycznie kodowane aminokwasy są w konfiguracji D (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:44:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13

102

PL 196 675 B1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:45:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:46:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:46:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:47:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:47:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 675 B1

103 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 2 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Val (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:48:

Xaa Xaa Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:49:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nieokreślony (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:49:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

104

PL 196 675 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:50:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:51:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:51:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:52:

Pro Val Trp Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala

PL 196 675 B1

105

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:53:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:53:

Val Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:54:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:54:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Trp Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:55:

Pro Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin

106

PL 196 675 B1 ¹ 5 10 15

Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:56:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:56:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Lys Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:57:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (XX)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:57:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala 1 5 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony(ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

PL 196 675 B1

107 (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:58:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:59:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:59:

Leu Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:60:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:60:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ; aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

108

PL 196 675 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:61:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Trp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:62:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:62:

Pro Val Leu Asp Glu Trp Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:63:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala

PL 196 675 B1

109

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:64:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:64:

Pro Trp Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:65:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 12 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:65:

Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:66:

110

PL 196 675 B1 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:66;

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:67:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:67:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu 1 5 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:68:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:68;

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Lys Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

PL 196 675 B1

111

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:69:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:69:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Lys Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:70:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:70:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

112

PL 196 675 B1

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:69:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Lys Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:70:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 675 B1

113 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C)RODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:71:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys · (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:72:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:72:

Pro Val· Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony

114

PL 196 675 B1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:73:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Trp Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala ^{1 5} 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:74:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:74:

Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala ¹ 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:75:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala ¹ 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

115 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:76:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:76:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Phe Glu Xaa Leu Glu Ala ¹ 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:77:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:77:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Lys Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:78:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa

116

(A) NAME/KEY; Other (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:78:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Asp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:79:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:79:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:80:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:80:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

117 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:81:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony(ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:81:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:82:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) cechy;

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 11 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:82:

Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:83:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

118

PL 196 675 B1 (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:83:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 1 5 . 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:84:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C)RODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:84:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:85:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:85:

Pro Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:86:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 675 B1

119 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:86:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:87:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne

(B)	LOKALIZACJA:	I. .	.22
(D)	INNE INFORMACJE:	Wszystkie aminokwasy w konfiguracji D
(xi)OPIS	SEKWENCJI: SEQ	ID	NO:87:
Pro Leu	Leu Glu Leu Leu	Lys	Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala
1	5		10 15
Leu Lys	Gin Lys Leu Lys
	20

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:88:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

120

PL 196 675 B1 (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:88:

Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:89:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:89:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:90:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 10 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:90:

Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

121 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:91:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) STRAKDEDNESS: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:91:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala ¹ 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:92:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:92:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Tyr Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:93:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

122

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:93:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:94:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:94:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ala Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:95:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:95:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

PL 196 675 B1

123

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:96:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE:Wszystkie genetycznie kodowane aminokwasy są w konfiguracji D (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:96:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:97:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:97:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu 15 10 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:98:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa

124

PL 196 675 B1 (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:98:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:99:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:99:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Val Pro (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:100:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie aminokwasy w konfiguracji D (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:100:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

125 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:101:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:101:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:102:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:102:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Glu Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:103:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza

126

PL 196 675 B1 (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:103:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys ²⁰ (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:104:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:104:

Pro Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys Leu Lys 1 5 10 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:105:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:105:

Pro Ala Ala Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Glu Ala 1 5 10 15

Ala Lys Gin Lys Ala Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:106:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę

PL 196 675 B1

127 (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:106:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:107:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie aminokwasy w konfiguracji D (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:107:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Val Pro (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:108:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:108:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Trp Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

128

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:109:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:109:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:110:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:110:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:111:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:pojedyńcza

PL 196 675 B1

129 (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:111:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Trp Glu Ala ¹⁵ 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:112:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:112: '

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Ser Glu Ala ¹⁵ 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:113:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:113:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Pro Leu Glu Ala ¹ 5 io 15

130

PL 196 675 B1

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:114:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:114:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Met Glu Ala ¹ 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:115:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ: Inne
(B)	LOKALIZACJA: 13
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa =	Aib
(xi)	SEQUENCE DESCRIPTION:	SEQ.	ID NO	: 115:
Pro	Lys Leu Asp Glu Phe Arg	Glu	Lys	Leu Asn Glu Xaa	Leu Glu Ala
1	5			10	15
Leu	Lys Gin Lys Leu Lys
	20

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:116:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 675 B1

131 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:116:

Pro His Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:117:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:117:

Pro Glu Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:118:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

132

PL 196 675 B1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:118:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:119:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C)RODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:119:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:120:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:120:

PL 196 675 B1

133

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Xaa 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:121:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:121:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:122:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:122:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:123:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:123:

134

PL 196 675 B1

Gin Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala ¹ 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:124:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:124:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:125:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:125:

Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

135 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:126:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:126:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Gly Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys .

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:127:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę' (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:127:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:128:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:128:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Phe 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

136

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:129:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:129:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NQ:130:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:130:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:131:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:131:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Arg Gin Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

137 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:132:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony(xi)

OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:132:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Ala ¹ 5 io 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:133:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:133:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Gin Ala 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:134:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:134:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Lys Ala ¹ 5 10 15

Leu Asn Gin Lys Leu Lys

138

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:135:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:135:

Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala ! 5 10 ¹⁵

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:136:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:136:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 ¹⁵

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:137:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina

PL 196 675 B1

139 (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:137:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 2. 5 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:138:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) .RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:138:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Trp 1 5 10 ¹⁵

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:139:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:139:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Gly Leu Glu Ala ! 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:140:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne

140

PL 196 675 B1

(B) LOKALIZACJA: 18
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa = Orn
(A)	NAZWA/KLUCZ: Inne
(B)	LOKALIZACJA: 20
(θ)	INNE INFORMACJE: Xaa = Om
(A)	NAZWA/KLUCZ: Inne
(B)	LOKALIZACJA: 22
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa = Om

(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:140

Pro	Val	Leu	Asp	Leu	Php Arg	Glu Leu Leu Asn	Glu Gly Leu Glu Ala
1				5		10	15
Leu	Xaa	Gin	Xaa	Leu	Xaa
			20

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:141:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:141:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:142:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:142:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

141 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:143:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE:peptyd acylowany na N-końcu i amidowany na C końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:143:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:144:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:144:

Xaa Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:145:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

142

PL 196 675 B1 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:145:

Gly Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:146:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:146:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:147:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:147:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Phe Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:148:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 675 B1

143 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:148:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:149:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:149:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys .20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:150:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:150:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:151:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

144

PL 196 675 B1 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:151:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:152:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: .

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:152:

Pro Val Phe Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:153:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:153:

Ala Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:154:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 675 B1

145 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:154:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:155:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:155:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:156:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:156:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:157:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

146

PL 196 675 B1 (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:157:

Pro Val Leu Glu Phe Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:158:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:158:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:159:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa .

(C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:159:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:160:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 675 B1

147 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:160:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:161:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:161:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:162:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:162:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Trp Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:163:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

148

PL 196 675 B1 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:163:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Trp Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:164:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:164:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Trp Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:165:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:165:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:166:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 675 B1

149 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:166:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala ¹⁵ 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:167:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:167:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala ^{1 5} 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:168:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:168:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gin Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala ^{1 5} 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:169:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

150

PL 196 675 B1 (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:169:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:170: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 12 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 19 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:170:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:171: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 675 B1

151 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:171:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:172:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGY; linear (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:172:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:173:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:173:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:174:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

152

PL 196 675 B1 (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie aminokwasy w konfiguracji D (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:174:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:175:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:175:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:176:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:176:

Pro Val Leu Glu Leu Trp Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

153 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:177:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:177:

Gly Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:178:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:178:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:179:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:179:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

154

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:180:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:180:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:181:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:181:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Trp Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:182:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:182:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

PL 196 675 B1

155 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:183:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa · (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:183:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala ^{1 2 * * 5} 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:184:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ; aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:184:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 io 15

Trp Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:185:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 19 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne

156

PL 196 675 B1 (B) LOKALIZACJA: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:185:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa .

(C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:186:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gin Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:187:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:187:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:188:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 675 B1

157 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza ' (D) TOPOLOGIA: liniowa .

(ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:188:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:189:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:189:

Asp Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:190:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:190:

Pro Val Leu Glu Phe Trp Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:191:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy

158

PL 196 675 B1 (B) RODZAJ:, aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:191:

Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:192:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:192:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:193:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18

PL 196 675 B1

159 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:193:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:194:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:194:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:195:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:195:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:196:

160

PL 196 675 B1 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:196:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Lys ¹ 5 io i5

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:197;

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C)RODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:197:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys ¹ 5 io i5

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:198:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

PL 196 675 B1

161 (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:198:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys ¹ 5 io i5

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:199:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:199:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Glu Glu Leu Lys Gin Lys ¹ 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:200:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix> CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:200:

Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys ¹ 5 10 15

Leu Lys

162

PL 196 675 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:201:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:201:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:202;

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:202:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys 15 10 15

Leu Arg (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:203:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (J3) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 196 675 B1

163 (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:203:

Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys ¹ 5 10 15

Leu Lys ' (2V INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:204;

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (XX) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:204:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys .

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:205:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:205:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys

164

PL 196 675 B1 ¹ 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:206:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:206:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:207:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (XX)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:207:

Pro Val Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:208:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa

PL 196 675 B1

165 (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:208:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Arg 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:209:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:209:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:210:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:210:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 1 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:211:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy

166

PL 196 675 B1 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) Rodzaj nici: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne ' (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:211:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa ¹ 5 io 15

Leu Xaa (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:212: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) (A) (B) (U) (A) (B) (D) (A) (B) (D)

CECHY:

NAZWA/KLUCZ: Inne LOKALIZACJA: I...18

INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu NAZWA/KLUCZ: Inne LOKALIZACJA: 7 INNE INFORMACJE: Xaa = Orn NAZWA/KLUCZ: Inne LOKALIZACJA: 14 INNE INFORMACJE: Xaa = Orn

amidowany na C-końcu

PL 196 675 B1

167 (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 16 (θ) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:212:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa ¹⁵ 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:213 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI:, pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY: .

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:213:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Phe Arg Gin Arg ¹ 5 io i5

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:214:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNE INFORMACJE: D-konfiguracja Pro.

(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:214:

168

PL 196 675 B1

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:215:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:215:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Trp Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:216:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:216:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:217:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony

PL 196 675 B1

169 (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:217:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Leu Leu Lys Gin Lys ¹ 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:218:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:218:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys ¹ 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:219:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:219:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Gin Lys ¹ 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:220:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa

170

PL 196 675 B1 (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:220:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Gin Lys Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:221:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:221:

Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:222:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:222:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Leu Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:223:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza

PL 196 675 B1

171 (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:223:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Ala Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:224:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:224:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Trp Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 io 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:225:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:225:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:226:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:226:

172

PL 196 675 B1

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Gly Glu Ala Leu Leu Gin Leu ¹ 5 io 15

Lys Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:227:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (XX)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:227:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:228:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:228:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:229:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy

PL 196 675 B1

173 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) Rodzaj nici: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:229:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Gly Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:230:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:Nonę (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:230:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Gin Lys Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:231:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:231:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:232:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

174

PL 196 675 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (Xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:232:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:233:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) RODZAJ:

(C) RODZAJ NICI:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:

(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:233:

Ta sekwencja została celowo pominięta (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:234:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) RODZAJ:

(C) RODZAJ NICI:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:

(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:234:

Ta sekwencja została celowo pominięta (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:235:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) RODZAJ:

(C) RODZAJ NICI:

PL 196 675 B1

175 (D) TOPOLOGIA:

(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:

(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:235:

Ta sekwencja została celowo pominięta (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:236:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) RODZAJ:

(C) RODZAJ NICI:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:

(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:236;

Ta sekwencja została celowo pominięta (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:237:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:237:

Leu Asp Asp Leu Leu Gin Lys Trp Ala Glu Ala Phe Asn Gin Leu Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:238:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:238:

176

PL 196 675 B1

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:239:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:239:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:240:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:240:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:241:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy

PL 196 675 B1

177 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa' (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:241:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:242:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:242:

Gly lie Lys Lys Phe Leu Gly Ser lie Trp Lys Phe lie Lys Ala Phe 15 10 15

Val Gly (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:243:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:243:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:244:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

178

PL 196 675 B1 (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:244:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:245:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:245:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:246:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C)RODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:246:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:247:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: .

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:247:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu

PL 196 675 B1

179

10 15

Phe Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:248:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:248:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:249:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:249:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Glu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:250:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

180

PL 196 675 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:250:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu ¹ 5 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:251:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...18 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:251:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:252:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...15 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:252:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Gin Lys Leu Lys 15 10 15

PL 196 675 B1

181 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:253:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (XX)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:253:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:254:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:254:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:255:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (XX) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne

182

PL 196 675 B1 (B) LOKALIZACJA: 1...15 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:255:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:256:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (ORODZAJ NICI: pojedyńcza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...16 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:256:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:257:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:257:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:258:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasy

PL 196 675 B1

183 (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)Rodzaj cząsteczki: nieokreślony (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: I...16 (D) INNE INFORMACJE: Acylowany na N-końcu i amidowany na C-końcu (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:258:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji

LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i obejmuje:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) lub D-Pro (p); X2 oznacza resztę alifatyczną;

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza resztę kwaśną;

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza resztę hydrofilową;

X8 oznacza resztę kwaśną lub zasadową;

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

XII oznacza resztę hydrofilową;

X12 oznacza resztę hydrofilową;

X13 oznacza Gly (G) lub resztę alifatyczną;

X14 oznacza Leu (L), Trp (W), Gly (G) lub Nal;

X15 oznacza resztę hydrofilową;

X16 oznacza resztę hydrofobową;

X17 oznacza resztę hydrofobową;

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub resztę zasadową;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub resztę zasadową;

X20 oznacza resztę zasadową;

X21 oznacza resztę alifatyczną;

X22 oznacza resztę zasadową;

X23 jest nieobecna lub oznacza resztę zasadową;

Z1 oznacza H2N- lub RC(O)NH-;

Z2 oznacza -C(O)NRR, -C(O)OR lub

C(O)OH lub ich sól;

184

PL 196 675 B1 każdy R oznacza niezależnie -H, (C1-C6)-alkil, (C1-C6)-alkenyl, (C1-C6)-alkinyl, (C5-C20)-aryl, (C6-C26)-alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl, 6-26 członowy alkiloheteroaryl lub 1 do 7-resztowy peptyd lub jego analog;

każdy ‘'-‘' między resztami X1-X23 niezależnie oznacza połączenie amidowe, połączenie amidowe podstawione -C(O)NR, gdzie R oznacza (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, ewentualnie aryl, izoster amidu, gdzie izoster oznacza -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2, -CH=CH- (cis i trans), -C(O)CH2-, -CH(OH)CH2 lub -CH2SO-; albo (ii) zmienioną postać ze wzoru strukturalnego (I), w której przynajmniej jedna spośród reszt X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18, X19, X20, X21, X22, lub X23 została konserwatywnie podstawiona inną resztą.

2. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi zmienioną postać ze wzoru strukturalnego (I).

3. Agonista ApoA-I według zastrz. 2, znamienny tym, że reszty hydrofobowe są ustalone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) i przynajmniej jedna nieustalona reszta jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

4. Agonista ApoA-I według zastrz. 3, znamienny tym, że:

X1 oznacza Pro (P), D-Pro (p), Gly (G) lub Ala (A);

X2 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Val (V);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X13 oznacza Leu (L), Gly (G) lub Aib;

X14 oznacza Leu (L), Nal, Trp (W) lub Gly (G);

X16 oznacza Ala (A), Nal, Trp (W), Gly (G), Leu (L) lub Phe (F);

X17 oznacza Leu (L), Gly (G) lub Nal;

X21 oznacza Leu (L); i przynajmniej jeden spośród X4, X7, X8, X11, X12, X15, X18, X19,

X20, X22 oraz X23 jest konserwa tywnie podstawiony inną resztą.

5. Agonista ApoA-I według zastrz. 2, znamienny tym, że reszty hydrofilowe są ustalone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) i przynajmniej jedna nieustalona reszta jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

6. Agonista ApoA-I według zastrz. 5, znamienny tym, że:

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X7 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X11 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X20 oznacza Lys (K) lub Orn;

X22 oznacza Lys (K) lub Orn;

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K); oraz przynajmniej jedna spośród reszt X1, X2, X3, X5, X6, X9, X10, X13, X14, X16, X17 oraz X21 została konserwatywnie podstawiona inną resztą.

7. Agonista ApoA-I według zastrz. 6, znamienny tym, że: X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F), X6 oznacza Phe (F), X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G), X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W) lub Gly (G) i przynajmniej jedna spośród reszt X1, X2, X5, X13, X14, X16, X17 oraz X21 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

8. Agonista ApoA-I według zastrz. 4 albo 6, znamienny tym, że reszta podstawiająca jest sklasyfikowana w tej samej podkategorii co reszta podstawiana.

9. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi peptyd lub analog peptydu o 22-23 resztach aminokwasowych, o wzorze strukturalnym (I).

10. Agonista ApoA-I według zastrz. 9, znamienny tym, że:

"-" pomiędzy resztami oznacza -C(O)NH-;

PL 196 675 B1

185

Z1 oznacza H2N- ; oraz Z2 oznacza -C(O)OH lub jego sól.

11. Agonista ApoA-I według zastrz. 10, znamienny tym, że:

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q), Asp (D) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L) Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X13 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Aib;

X14 oznacza Leu (L), Nal, Trp (W), lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X16 oznacza Ala (A), Nal, Trp (W), Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X17 oznacza Gly (G), Leu (L) lub Nal;

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N), Lys (K) lub Orn;

X20 oznacza Lys (K) lub Orn;

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K) lub Orn, i

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K).

12. Agonista ApoA-I według zastrz. 11, znamienny tym, że X23 jest nieobecny.

13. Agonista ApoA-I według zastrz. 10 albo zastrz. 11, znamienny tym, że jedna z reszt X18 lub

X19 oznacza Gln (Q) lub Asn (N), a druga z reszt X18 lub X19 oznacza Lys (K) lub Orn.

14. Agonista ApoA-I według zastrz. 11, znamienny tym, że każda spośród reszt X9, X10, X13,

X14, X15 i X17 jest inna niż Gly (G).

15. Agonista ApoA-I według zastrz. 11, znamienny tym, że jedna spośród reszt X9, X10, X13, X14, X15, i X17 oznacza Gly (G) a pozostałe są inne niż Gly (G).

16. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy składającej się z:

peptyd 1 peptyd 2 peptyd 3 peptyd 4 peptyd 5 peptyd 6 peptyd 7 peptyd 8 peptyd 9 peptyd 10 peptyd 11 peptyd 12 peptyd 13 peptyd 14 peptyd 15 peptyd 16 peptyd 17 peptyd 18 peptyd 19 peptyd 20 peptyd 21 peptyd 22

PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK

PVLDLFKELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELGNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK

PVLDLFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK

GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALOQOLO

PVLDLFRELWNELLEALKQKLK

PVLDLLRELLNELLEALKQKLK

PVLELFKELLQELLEALKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFREGLNELLEALKQKLK pVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ

D NO 1); D NO 2); D NO 3); D NO 4); D NO 5); D NO 6), D NO 7); D NO 8); D NO 9); D NO 10) D NO 11) D NO 12) D NO 13) D NO 14) D NO 15) D NO 16) D NO 17) D NO 18) D NO 19) D NO 20) D NO 21) D NO 22)

186

PL 196 675 B1 peptyd 23 peptyd 24 peptyd 25 peptyd 26 peptyd 27 peptyd 28 peptyd 29 peptyd 123 peptyd 124 peptyd 125 peptyd 126 peptyd 127 peptyd 128 peptyd 129 peptyd 130 peptyd 131 peptyd 132 peptyd 133 peptyd 134 peptyd 135 peptyd 136 peptyd 137 peptyd 138 peptyd 139 peptyd 140 peptyd 141 peptyd 142

PLLELFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALQKKLK

PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELZEALKQKLK

PVLDLFRELLNELWEALKQKLK

AVLDLFRELLNELLEALKQKLK

QVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFOELLNELLEALOQOLO

NVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELGEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK

PVLELFNDLLRELLEALQKKLK

PVLELFNDLLRELLEALKQKLK

PVLELFKELLNELLDALRQKLK

PVLDLFRELLENLLEALQKKLK

PVLELFERLLEDLLQALNKKLK

PVLELFERLLEDLLKALNQKLK

DVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PALELFKDLLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK

PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO

PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

PVLELFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ

ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO

23);

24);

25);

26);

27);

28);

29);

123)

124)

125)

126)

127)

128)

129)

130)

131)

132)

133)

134)

135)

136)

137)

138)

139)

140)

141)

142) i ich postaci acylowanych na N-końcu i/lub amidowanych lub estryfikowanych na C-ko ńcu, przy czym X oznacza Aib, Z oznacza Nal; i O oznacza Orn.

17. Multimeryczny agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i posiada wzór strukturalny (II):

(II) HH-(-LLm-HH-)n-LLm-HH;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, przy czym: każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1; n oznacza niezależ nie liczbę cał kowitą od 0 do 10;

każdy "HH" oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 1; każdy "LL" oznacza niezależnie dwufunkcyjny łącznik; i każdy "-" niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

18. Multimeryczny agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i posiada wzór strukturalny (III):

(III) X-Nya-X(ya-1)-(Nyb-X(yb-1))p lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, przy czym:

każdy X oznacza niezależnie HH-(-LLm-HH-)n-LLm-HH;

każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 1;

każdy LL oznacza niezależnie dwufunkcyjny łącznik;

Nya i Nyb oznacza każdy niezależnie wielofunkcyjną cząsteczkę łączącą gdzie ya i yb to liczba grup funkcyjnych w Nya i Nyb, odpowiednio; każdy ya i yb oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 3 do 8; p oznacza liczbę cał kowitą od 0 do 7; a każdy "-" niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

PL 196 675 B1

187

19. Multimeryczny agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i posiada wzór strukturalny (IV) lub (V):

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, przy czym:

każdy X oznacza niezależnie HH- (-LLm-HH-)n-LLm-HH;

każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 1 każdy LL oznacza niezależnie dwufunkcyjny łącznik;

każdy n oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1; każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 8; każdy R1 oznacza -OR lub NRR; oraz każdy R oznacza niezależnie -H, (C1-6) alkil, (C1-6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy alkiloheteroaryl.

20. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 17 albo 18, albo 19, znamienny tym, że dwufunkcyjny łącznik może ulegać cięciu.

21. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 17 albo 18, albo 19, znamienny tym, że n oznacza 0.

22. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 21, znamienny tym, że m oznacza 0.

23. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 17 albo 18, albo 19, znamienny tym, że każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 10.

24. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 17 albo 18, albo 19, znamienny tym, że każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 11.

25. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 17 albo 18, albo 19, znamienny tym, że każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 16.

26. Kompleks agonista ApoA-I-lipid obejmujący agonistę ApoA-I i lipid, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 1, multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 17, multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 18, lub multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 19.

27. Kompleks ApoA-I agonista-lipid według zastrz. 26, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 9.

28. Kompleks ApoA-I agonista-lipid według zastrz. 26, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 10.

29. Kompleks ApoA-I agonista-lipid według zastrz. 26, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 11.

30. Kompleks ApoA-I agonista-lipid według zastrz. 26, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 16.

31. Kompleks ApoA-I agonista-lipid według zastrz. 26, znamienny tym, że lipid stanowi sfingomielina.

188

PL 196 675 B1

32. Kompleks ApoA-I agonista-lipid według zastrz. 26, znamienny tym, że ma postać liofilizowanego proszku.

33. Kompleks ApoA-I agonista-lipid według zastrz. 26, znamienny tym, że ma postać roztworu.

34. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera agonistę ApoA-I i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik, przy czym agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 1, multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 17, multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 18, lub multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 19.

35. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 9.

36. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 10.

37. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 11.

38. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 16.

39. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34 albo 35, albo 36, albo 37, albo 38, znamienna tym, że agonista ApoA-I jest w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, przy czym ten kompleks zawiera agonistę ApoA-I i lipid.

40. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 39, znamienna tym, że kompleks ApoA-I agonista-lipid jest w postaci liofilizowanego proszku.

41. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia choroby związanej z dyslipidemią, znamienna tym, że zawiera agonistę ApoA-I jak określono w zastrz. 1 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.

42. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że agonista jest w postaci kompozycji farmaceutycznej, przy czym ta kompozycja zawiera agonistę ApoA-I oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.

43. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że agonista jest w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, przy czym ten kompleks zawiera agonistę ApoA-I i lipid.

44. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że chorobę związaną z dyslipidemią stanowi hipercholesterolemia.

45. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że chorobę związaną z dyslipidemią stanowi choroba sercowonaczyniowa.

46. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że chorobę związaną z dyslipidemią stanowi miażdżyca naczyń.

47. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że chorobą związaną z dyslipidemią jest restenoza.

48. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że chorobę związaną z dyslipidemią stanowi niedobór HDL lub ApoA-I.

49. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że chorobę związaną z dyslipidemią stanowi hipertriglicerydemia.

50. Kompozycja według zastrz. 41, znamienna tym, że chorobę związaną z dyslipidemią stanowi zespół metaboliczny.

51. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia wstrząsu septycznego, znamienna tym, że zawiera agonistę ApoA-I jak określono w zastrz. 1 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.

52. Kompozycja według zastrz. 41 albo 51, znamienna tym, że lek przeznaczony jest do leczenia człowieka.

53. Kompozycja według zastrz. 41 albo 51, znamienna tym, że lek przeznaczony jest do podawania w dawce około 0,5 mg/kg do około 100 mg/kg agonisty ApoA-I.

54. Zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I jak określono w zastrz. 17 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

55. Zastosowanie multimerycznego ApoA-I jak określono w zastrz. 18 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

56. Zastosowanie multimerycznego ApoA-I jak określono w zastrz. 19 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

PL 196 675 B1

189

Rysunki

190

PL 196 675 B1

STRUKTURA

FIG.2A FIG.2B

PL 196 675 B1

191

POWIERZCHNIA HYDROFILOWA POWIERZCHNIA HYDROFILOWA

FIG.3A FIG.3B

192

PL 196 675 B1

POWIERZCHNIA HYDROFOBOWA POWIERZCHNIA HYDROFOBOWA

KONSENSUSOWY 22-MER PEPTYD 4

FIG.4A FIG.4B

PL 196 675 B1

193

194

PL 196 675 B1

N C

FIG.6A

PL 196 675 B1

195

Ν Ν

FIG.6B

196

PL 196 675 B1

197

198

PL 196 675 B1

ALFA

E-i

N ω

c oo o

(uidd) »H9V

PL 196 675 B1

199

200

PL 196 675 B1

AMFIBATYCZNA ^'HELISA

FIG.8C

PL 196 675 B1

201

ABSORBANCJA • Γ 1 i I I I I I i I I I I I I I I I—lilii

3 5 7 1012151719212427293134363941434648 51535558 OBjęTo^ć elucji (ml)

FIG.9A

202

PL 196 675 B1

ABSORBANCJA (280 ΠΠΐ)

OBJĘTOŚĆ ELUCJI (ml)

FIG.9B

PL 196 675 B1

203

ABSORBANCJA (280 nm)

FIG.9C

204

PL 196 675 B1

ABSORBANCJA

FIG.9D

PL 196 675 B1

205

FIG.9E

14C-CPM

206

PL 196 675 B1

207

208

PL 196 675 B1

DYSKOIDALNY KOMPLEKS PEPTYDOWO-FOSFOLIPIDOWY

Departament Wydawnictw UP RP

Cena 6,00 zł.