PT1019073E

PT1019073E - Agonistas da apolipoproteína a-i e sua utilização para tratar distúrbios dislipidémicos

Info

Publication number: PT1019073E
Application number: PT98951978T
Authority: PT
Inventors: Renate Sekul; Jean Dufourcq; Klaus Buttner; Jean-Louis Dasseux; Isabelle Cornut; Gunther Metz
Original assignee: Renate Sekul; Jean Dufourcq; Klaus Buttner; Jean-Louis Dasseux; Isabelle Cornut; Gunther Metz
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2008-04-21
Also published as: AU2002300785B2; US6753313B1; AU9779098A; AU2005201985B2; EP1019073A4; US7307058B2; PL339629A1; CN1280501A; US20030203842A1; US6376464B1; US6573239B1; IL135318A0; US20040181034A1; KR100650929B1; CN1247254C; US7312190B2; EP1854471A1; HUP0002381A3; ES2331808T3; US6329341B1

Description

ΡΕ1019073 1 DESCRIÇÃO "AGONISTAS DA APOLIPOPROTEÍNA A-I E SUA UTILIZAÇÃO PARA TRATAR DISTÚRBIOS DISLIPIDÉMICOS"

1. INTRODUÇÃO O invento refere-se a composições agonistas da apolipoproteina A-l (ApoA-l) para tratamento de distúrbios associados a dislipoproteinemia, incluindo hipercoleste-rolemia, doença cardiovascular, aterosclerose, restenose e outros distúrbios tais como choque séptico.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

0 colesterol em circulação é transportado por lipoproteinas plasmáticas - partículas de composição lipídica e proteica complexa que transportam lípidos no sangue. As lipoproteinas de baixa densidade (LDL) e as lipoproteinas de alta densidade (HDL) são os principais transportadores de colesterol. Crê-se que as LDL sejam responsáveis pela distribuição de colesterol do fígado (onde é sintetizado ou obtido a partir de fontes dietéticas) pelos tecidos extra-hepáticos no corpo. 0 termo "transporte inverso de colesterol" descreve o transporte do colesterol dos tecidos extra-hepáticos para o fígado onde é catabolizado e eliminado. Crê-se que as partículas de HDL 2 ΡΕ1019073 plasmáticas tenham um papel principal no processo de transporte inverso, actuando como eliminadores do colesterol dos tecidos.

As evidências que ligam colesterol elevado a doença cardíaca coronária são demolidoras. Por exemplo, a aterosclerose é uma doença lentamente progressiva caracterizada pela acumulação de colesterol dentro da parede arterial. Provas convincentes apoiam o conceito de que os lípidos depositados em lesões ateroscleróticas são derivados principalmente da LDL plasmática; assim, as LDLs tornaram-se popularmente conhecidas como o colesterol "mau". Em contraste, os níveis séricos de HDL correlacionam-se inversamente com a doença cardíaca coronária -de facto, elevados níveis séricos de HDL são considerados como um factor de risco negativo. É colocada a hipótese de que níveis elevados de HDL plasmática não sejam apenas protectores contra a doença das artérias coronárias, mas que podem também de facto induzir a regressão das placas ateroscleróticas (e.g., ver Badimon et al., Circulation 86 (Supl. III): 86-94, 1992). Assim, a HDL tornou-se popularmente conhecida como o colesterol "bom".

2.1. TRANSPORTE DO COLESTEROL 0 sistema de transporte das gorduras pode ser dividido em duas vias: uma exógena para o colesterol e os triglicéridos absorvidos a partir do intestino e uma endógena para o colesterol e os triglicéridos que entram na 3 ΡΕ1019073 corrente sanguínea a partir do fígado e de outros tecidos não hepáticos.

Na via exógena, as gorduras da dieta são empacotadas em partículas lipoproteicas designadas quilomicrons que entram na corrente sanguínea e distribuem os seus triglicéridos pelo tecido adiposo (para armazenamento) e pelo músculo (para oxidação para fornecer energia). 0 restante do quilomicron, contendo ésteres de colesteril, é removido da circulação através de um receptor específico que se encontra apenas nas células do fígado. Este colesterol torna-se então disponível novamente para metabolismo celular ou para reciclagem em tecidos extra-hepáticos como lipoproteínas plasmáticas.

Na via endógena, o fígado segrega uma grande partícula lipoproteica de muito baixa densidade (VLDL) para a corrente sanguínea. 0 núcleo das VLDLs consiste principalmente em triglicéridos sintetizados no fígado, com uma menor quantidade de ésteres de colesteril (sintetizados no fígado ou reciclados a partir de quilomicrons). Duas proteínas predominantes são apresentadas à superfície das VLDLs, a apoproteína B-100 e a apoproteína E. Quando a VLDL alcança os capilares do tecido adiposo ou do músculo, os seus triglicéridos são extraídos resultando num novo tipo de partícula, com um tamanho menor e enriquecida em ésteres de colesteril mas mantendo as suas duas apoproteínas, designada lipoproteína de densidade intermédia (IDL). 4 ΡΕ1019073

Em seres humanos, cerca de metade das partículas de IDL são removidas da circulação rapidamente (dentro de duas a seis horas após a sua formação) , porque se ligam fortemente às células do fígado que extraem o seu colesterol para produzir novas VLDL e ácidos biliares. As partículas de IDL que não são tomadas pelo fígado permanecem mais tempo na circulação. A seu tempo, a apoproteína E dissocia-se das partículas em circulação, convertendo-as em LDL possuindo a apoproteína B-100 como sua única proteína.

Primeiramente, o fígado toma e degrada a maior parte do colesterol em ácidos biliares, que são os produtos finais do metabolismo do colesterol. A tomada de partículas contendo colesterol é mediada por receptores de LDL, que estão presentes em elevadas concentrações nos hepatócitos. O receptor da LDL liga-se tanto à apoproteína E como à apoproteína B-100 e é responsável pela ligação e remoção tanto das IDLs como das LDLs da circulação. No entanto, a afinidade da apoproteína E para o receptor de LDL é maior que a da apoproteína B-100. Como resultado, as partículas de LDL têm uma vida em circulação muito maior que as partículas de IDL - as LDLs circulam durante uma média de dois dias e meio antes de se ligarem aos receptores de LDL no fígado e noutros tecidos. Níveis séricos elevados de LDL (o colesterol "mau") estão positivamente associados a doença cardíaca coronária. Por exemplo, em aterosclerose, o colesterol derivado das LDLs em circulação acumula-se nas paredes das artérias conduzindo à formação de placas 5 ΡΕ1019073 espessas que inibem o fluxo sanguíneo até que eventualmente se forma um coágulo, obstruindo a artéria e causando um ataque cardíaco ou um acidente vascular.

Finalmente, a quantidade de colesterol intracelular libertada das LDLs controla o metabolismo do colesterol celular. A acumulação do colesterol celular derivado das VLDLs e das LDLs controla três processos: primeiro, reduz a síntese de colesterol celular desligando a síntese de HMGCoA-redutase, uma enzima chave na via biossintética do colesterol. Segundo, a entrada de colesterol derivado de LDL promove o armazenamento de colesterol através da activação de ACAT - a enzima celular que converte o colesterol em ésteres de colesteril que são depositados em gotículas de armazenamento. Terceiro, a acumulação de colesterol dentro da célula origina um mecanismo de retroacçâo que inibe a síntese celular de novos receptores de LDL. Portanto, as células ajustam o seu complemento de receptores de LDL para que seja internalizado colesterol suficiente para verificar as suas necessidades metabólicas, sem se sobrecarregarem (para uma revisão, ver Brown e Goldstein, Em, "The Pharmacological Basis Of Therapeutics", 8a. Ed., Goodman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Cap. 36, págs. 874-896).

2.2. TRANSPORTE INVERSO DO COLESTEROL

Em resumo, as células periféricas (não hepáticas) obtêm o seu colesterol a partir de uma combinação de 6 ΡΕ1019073 síntese local e a tomada de esterol pré-formado a partir de VLDLs e LDLs. Em contraste, o transporte inverso de colesterol (TIC) é a via pela qual o colesterol das células periféricas pode ser devolvido ao fígado para reciclagem para tecidos extra-hepáticos ou excreção para o intestino na bílis, na forma modificada ou oxidada como ácidos biliares. A via de TIC representa o único meio de eliminação do colesterol da maioria dos tecidos extra-hepáticos e é crucial para a manutenção da estrutura e função da maioria das células no corpo. 0 TIC consiste principalmente em três passos: a) efluxo de colesterol, a remoção inicial do colesterol a partir de vários bancos de células periféricas; b) esterificação do colesterol através da acção da lecitina:colesterol-aciltransferase (LCAT), impedindo a reentrada nas células do colesterol que saiu por efluxo; e c) tomada/distribuição de éster de colesteril de HDL pelas células do fígado. A via de TIC é mediada pelas HDLs. HDL é um termo genérico para partículas lipoproteicas que são caracterizadas pela sua elevada densidade. Os principais constituintes lipídicos dos complexos de HDL são vários fosfolípidos, colesterol (éster) e triglicéridos. Os componentes mais proeminentes apolipoproteicos são A-I e A-II que determinam as 7 ΡΕ1019073 características funcionais da HDL; para além disso foram observadas quantidades menores da apolipoproteina C-I, C-II, C-III, D, E, J, etc. A HDL pode existir numa ampla variedade de diferentes tamanhos e diferentes misturas dos constituintes acima mencionados dependendo do estado de remodelação durante a cascata metabólica do TIC. A enzima chave envolvida na via do TIC é a LCAT. A LCAT é produzida principalmente no figado e circula no plasma associada à fracção de HDL. A LCAT converte o colesterol derivado das células em ésteres de colesteril que são sequestrados em HDL destinado a remoção. A proteína de transferência dos ésteres de colesteril (CETP) e a proteína de transferência de fosfolípidos (PLTP) contribuem para mais remodelação da população de HDL em circulação. A CETP pode mover os ésteres de colesteril produzidos através da LCAT para outras lipoproteínas, particularmente lipopro-teínas contendo ApoB, tais como VLDL e LDL. A PLTP fornece lecitina a HDL. Os triglicéridos de HDL podem ser catabo-lizados através da triglicérido-lipase hepática extra-celular e o colesterol das lipoproteínas é removido pelo fígado através de vários mecanismos.

Cada partícula de HDL contém pelo menos uma cópia (e habitualmente duas a quatro cópias) de ApoA-I. A ApoA-I é sintetizada pelo fígado e pelo intestino delgado como preproapolipoproteína que é segregada como uma proproteína que é rapidamente clivada para gerar um polipéptido maduro possuindo 243 resíduos de aminoácidos. A ApoA-I consiste ΡΕ1019073 principalmente em G a 8 repetições diferentes de 22 amino-ácidos espaçadas por uma porção ligadora que é frequentemente prolina e nalguns casos consiste num trecho feito de vários resíduos. A ApoA-I forma três tipos de complexos estáveis com lípidos: complexos pequenos pobres em lípidos, referidos como HDL pre-beta-1; partículas discoidais achatadas contendo lípidos polares (fosfolípidos e colesterol) referidas como HDL pre-beta-2; e partículas esféricas contendo tanto lípidos polares como não polares, referidas como HDL esférica ou madura (HDL3 e HDL2) . A maior parte da HDL na população em circulação contém tanto ApoA-I como ApoA-II (a segunda principal proteína de HDL) e são aqui referidas como a fracção de HDL AI/AII-HDL. No entanto, a fracção de HDL contendo apenas ApoA-I (aqui referida como a fracção ΑΙ-HDL) parece ser mais eficaz no TIC. Certos estudos epidemiológicos apoiam a hipótese de que a fracção ΑΙ-HDL é anti-aterogénica (Parra et al., Arterioscler. Thromb. 12: 701-707, 1992; Decossin et al., Eur. J. Clin. Invest. 27: 299-307, 1997).

Embora o mecanismo para a transferência do colesterol da superfície celular (í.e., efluxo de colesterol) seja desconhecido, crê-se que o complexo pobre em lípidos, HDL pre-beta-1 seja o aceitador preferido para a transferência de colesterol transferido do tecido periférico envolvido no TIC (ver Davidson et al., J. Biol. Chem. 269: 22975-22982, 1994; Bielicki et al., J. Lipid Res. 33: 1699-1709, 1992; Rothblat et al., J. Lipid Res. 33: 1091-1097, 1992; e Kawano et al., Biochemistry 32: 9 ΡΕ1019073

5025-5028, 1993; Kawano et al., Biochemistry 36: 9816-9825, 1997) . Durante este processo de recrutamento do colesterol a partir da superfície celular, o HDL pre-beta-1 é rapidamente convertido em HDL pre-beta-2. A PLTP pode aumentar a taxa de formação de discos de pre-beta-2, mas faltam dados que indiquem um papel da PLTP no TIC. A LCAT reaqe de preferência com o HDL discoidal e esférico, transferindo o grupo 2-acilo da lecitina ou de outros fosfolípidos para o resíduo hidroxilo livre do colesterol para gerar ésteres de colesteril (mantidos na HDL) e lisolecitina. A reacção da LCAT requer ApoA-I como activador; í.e., ApoA-I é o co-factor natural para LCAT. A conversão do colesterol no seu éster sequestrado na HDL impede a reentrada do colesterol na célula, sendo o resultado que os ésteres de colesteril ficam destinados à remoção. Os ésteres de colesteril nas partículas maduras de HDL na fracção ΑΙ-HDL (i.e., contendo ApoA-I e nenhuma ApoA-II) são removidos pelo fígado e processados na bílis mais eficazmente que os derivados de HDL contendo tanto ApoA-I como ApoA-II (a fracção AI/AII-HDL). Isto pode ser devido, em parte, a uma ligação mais eficaz da ΑΙ-HDL à membrana dos hepatócitos. Foi colocada a hipótese da existência de um receptor de HDL e recentemente foi identificado um receptor de eliminação, SR-BI, como receptor de HDL (Acton et al., Science 271: 518-520, 1996; Xu et al., Lipid Res. 38: 1289-1298, 1997). O SR-BI é expresso com maior abundância em tecidos esteroidogénicos (e.g., nas supra-renais) e no fígado (Landshulz et al., J. Clin. invest. 98: 984-995, 1996; Rigotti et al., J. Biol. Chem. 271: 33545-33549, 1996). 10 ΡΕ1019073 A CETP não parece ter um papel principal no TIC e em vez disso está envolvida no metabolismo dos lipidos derivados de VLDL e LDL. No entanto, mudanças na actividade de CETP ou nos seus aceitadores, VLDL e LDL, têm um papel na "remodelação" da população de HDL. Por exemplo, na ausência de CETP, as HDLs tornam-se partículas maiores que não são eliminadas (para revisões sobre TIC e HDLs, ver Fielding e Fielding, J. Lipid Res. 36: 211-228, 1995;

Barrans et al., Biochem. Biophys. Acta. 1300: 73-85, 1996; Hirano et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17(6): 1053-1059, 1997).

2.3. TRATAMENTOS ACTUAIS PARA DISLIPOPROTEINEMIAS Vários tratamentos estão actualmente disponíveis para baixar o colesterol e os triglicéridos séricos (ver, e.g., Brown e Goldstein, supra) . No entanto, cada um tem as suas próprias desvantagens e limitações em termos de eficácia, efeitos secundários e qualificação da população de pacientes.

As resinas de ligação aos ácidos biliares são uma classe de fármacos que interrompem a reciclagem dos ácidos biliares do intestino até ao fígado; e.g., colestiramina (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb), e cloridrato de colestipol (Colestid®, The Upjohn Company). Quando tomadas oralmente, estas resinas com carga positiva ligam-se aos ácidos biliares do intestino com carga negativa. Como as 11 ΡΕ1019073 resinas não podem ser absorvidas a partir do intestino, elas são excretadas transportando os ácidos biliares com elas. No entanto, a utilização de tais resinas, na melhor das hipóteses apenas baixa os niveis do colesterol sérico em cerca de 20% e está associada a efeitos secundários gastrointestinais, incluindo obstipação e certas deficiências vitaminicas. Para além disso, uma vez que as resinas se ligam a outros fármacos, têm de ser tomadas outras medicações orais pelo menos uma hora antes ou quatro a seis horas após a ingestão da resina; complicando assim, os regímenes de fármacos cardíacos do paciente.

As estatinas são agentes de diminuição do colesterol que bloqueiam a síntese de colesterol através da inibição da HMGCoA-redutase - a enzima chave envolvida na via biossintética do colesterol. As estatinas, e.g., a lovastatina (Mevacor®, Merck & Co., Inc.), e a pravastatina (Pravachol®, Bristol-Myers Squibb Co.) são por vezes utilizadas em combinação com resinas de ligação a ácidos biliares. As estatinas reduzem significativamente o colesterol sérico e os níveis séricos de LDL e atrasam a progressão da aterosclerose coronária. No entanto, os níveis séricos de colesterol HDL são apenas moderadamente aumentados. O mecanismo do efeito de diminuição da LDL pode envolver tanto a redução da concentração de VLDL como a indução de expressão celular de receptor de LDL, conduzindo a uma produção reduzida e/ou a um catabolismo aumentado de LDLs. Efeitos secundários, incluindo insuficiência hepática e renal estão associados à utilização destes fármacos 12 ΡΕ1019073 ("Physicians Desk Reference", Medicai Economics Co., Inc., Montvale, N.J., 1997). Recentemente, a FDA aprovou a atorvastatina (um inibidor da HMGCoA-redutase desenvolvido por Parke-Davis) (Warner Lambert) para o mercado para tratar casos raros mas urgentes de hipercolesterolemia familiar (Scríp 20(19): 10, 1995). A niacina, ou ácido nicotinico, é um complexo de vitamina B solúvel em água, utilizado como suplemento dietético e agente anti-hiperlipidémico. A niacina diminui a produção de VLDL e é eficaz a baixar a LDL. Nalguns casos, é utilizada em combinação com resinas de ligação aos ácidos biliares. A niacina pode aumentar a HDL quando utilizada em doses adequadas, no entanto, a sua utilidade está limitada por efeitos secundários graves quando utilizada a doses tão elevadas.

Os fibratos são uma classe de fármacos de diminuição dos lipidos utilizados para tratar várias formas de hiperlipidemia (i.e., triglicéridos séricos elevados) que pode também estar associada a hipercolesterolemia. Os fibratos parecem reduzir a fracção de VLDL e aumentar modestamente a HDL - no entanto os efeitos destes fármacos no colesterol sérico é variável. Nos Estados Unidos, os fibratos foram aprovados para utilização como fármacos anti-lipidémicos, mas não receberam aprovação como agentes de hipercolesterolemia. Por exemplo, o clofibrato (Atromid-S®, Wyeth-Ayerst Laboratories) é um agente anti-lipidémico que actua (através de um mecanismo desconhecido) baixando 13 ΡΕ1019073 os triglicéridos séricos através da redução da fracção de VLDL. Embora o colesterol sérico possa ser reduzido em certas subpopulações de pacientes, a resposta bioquímica ao fármaco é variável, e nem sempre é possível prever quais os pacientes que obterão resultados favoráveis. Não se mostrou que o Atromid-S® fosse eficaz para prevenção de doença cardíaca coronária. 0 fármaco quimicamente e farmacolo-gicamente aparentado, gemfibrozil (Lopid®, Parke-Davis) é um agente de regulação dos lípidos que diminui moderadamente os triglicéridos séricos e o colesterol VLDL, e aumenta moderadamente o colesterol HDL - as subfracções HDL2 e RDL3 bem como ApoA-I e A-II (i.e., a fracção AI/AII-HDL). No entanto, a resposta dos lípidos é heterogénea, especialmente entre diferentes populações de pacientes. Para além disso, embora tenha sido observada prevenção de doença cardíaca coronária em pacientes masculinos entre os 40-55 sem história nem sintomas de doença cardíaca coronária existente, não é claro até que ponto estas descobertas podem ser extrapoladas para outras populações de pacientes (e.g., mulheres, homens mais velhos e mais novos). De facto, não se observou eficácia em pacientes com doença cardíaca coronária estabelecida. Efeitos secundários graves estão associados à utilização de fibratos incluindo toxicidade tal como malignidade (especialmente cancro gastrointestinal), doença da vesícula biliar e uma maior incidência na mortalidade não coronária. Estes fármacos não estão indicados para o tratamento de pacientes com LDL elevada ou HDL baixa como sua única anomalia lipídica ("Physician's Desk Reference", Medicai Economics Co., Inc. Montvale, N.J., 1997). 14 ΡΕ1019073 A terapia oral de substituição de estrogénio pode ser considerada para a hipercolesterolemia moderada em mulheres pós-menopausa. No entanto, os aumentos de HDL podem ser acompanhados por um aumento nos triglicéridos. 0 tratamento de estrogénio está, como é claro, limitado a uma população especifica de pacientes (mulheres pós-menopausa) e está associado a graves efeitos secundários incluindo a indução de neoplasmas malignos, doença da vesícula biliar, doença tromboembólica, adenoma hepático, pressão sanguínea elevada, intolerância à glicose e hipercalcemia.

Assim, existe a necessidade de desenvolver fármacos mais seguros que sejam eficazes no abaixamento do colesterol sérico, aumentando os níveis séricos de HDL, prevenindo a doença cardíaca coronária e/ou no tratamento de doença existente, especialmente aterosclerose.

2.4. ApoA-I COMO ALVO

Nenhum dos fármacos actualmente disponíveis para baixar o colesterol eleva de forma segura os níveis de HDL e estimula o TIC, a maioria parece operar na via de transporte do colesterol, modulando a tomada dietética, a reciclagem, a síntese de colesterol e a população de VLDL.

Embora seja desejável descobrir fármacos que estimulem o efluxo e a remoção de colesterol, existem vários potenciais alvos no TIC - e.g., LCAT, HDL e os seus 15 ΡΕ1019073 vários componentes (ApoA-I, ApoA-II e fosfolípidos), PLTP e CETP - e não se sabe que alvo será mais eficaz na obtenção de perfis lipoproteicos desejáveis e efeitos protectores. A perturbação de qualquer componente na via do TIC afecta no final a composição das populações de lipoproteinas em circulação e a eficiência do TIC. Várias linhas de evidência baseadas em dados obtidos in vivo implicam a HDL e o seu principal componente proteico, ApoA-I, na prevenção de lesões ateroscleróticas e potencialmente na regressão de placas, tornando estes alvos atractivos para intervenção terapêutica. Primeiro, existe uma correlação inversa entre a concentração sérica de ApoA-I (HDL) e a aterogénese no homem (Gordon e Rifkind, N. Eng. J. Med. 321: 1311-1316, 1989; Gordon et al., Circulation 79: 8-15, 1989). De facto, subpopulações específicas de HDL foram associadas a um risco reduzido de aterosclerose em humanos (Miller, Amer. Heart 113: 589-597, 1987; Cheung et al., Lípid Res. 32: 383-394, 1991; Fruchart e Ailhaud, Clin. Chem. 38: 79, 1992).

Segundo, estudos animais apoiam o papel protector de ApoA-I (HDL). 0 tratamento de coelhos alimentados com colesterol com ApoA-I ou HDL reduziu o desenvolvimento e a progressão de placas (estrias gordas) em coelhos alimentados com colesterol (Koizumi et al., J. Lipid Res. 29: 1405-1415, 1988; Badimon et al., Lab. invest. 60: 455— 461, 1989; Badimon et al., J. Clin. Invest. 85: 1234-1241, 1990). No entanto, a eficácia variou dependendo da fonte de 16 ΡΕ1019073 HDL (Beitz et al., Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47: 149-152, 1992; Mezdour et al.,

Atherosclerosis 113: 237-246, 1995).

Terceiro, foram obtidas provas directas do papel da ApoA-I a partir de experiências envolvendo animais transgénicos. A expressão do gene humano para ApoA-I transferido para ratinhos geneticamente predispostos a aterosclerose induzida pela dieta protegeu contra o desenvolvimento de lesões aórticas (Rubin et al., Nature 353: 265-267, 1991). Mostrou-se também que o transgene de ApoA-I suprimia a aterosclerose em ratinhos deficientes em ApoE e em ratinhos transgénicos para Apo(a) (Paszty et al., J. Clin. Invest. 94: 899-903, 1994; Plump et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 9607- 9611, 1994; Liu et 3.1 , t J. Lípid Res. 35: 2263-2266, 1994) Foram observados resultados semelhantes em coelhos transgénicos expressando ApoA-I humana (Duverger, Circulation 94: 713-717, 1996; Duverger et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16: 1424-1429, 1996) e em ratos transgénicos em que níveis elevados de ApoA-I humana protegeram contra aterosclerose e inibiram a restenose após angioplastia de balão (Burkey et al., Circulation, Suplemento I, 86: 1-472, 1992, Resumo N° 1876; Burkey et al., J. Lípid Res. 36: 1463-1473, 1995). A fracção AI-HDL pareceu ser mais eficiente no TIC que a AI/AII-HDL. Estudos com ratinhos transgénicos para a ApoA-I humana ou Apo-I e Apo-II (AI/AII) mostraram que a composição proteica de HDL afecta significativamente 17 ΡΕ1019073 o seu papel. AI-HDL é mais anti-aterogénica que AI/AII-HDL (Schultz et al., Nature 365: 762-764, 1993). Estudos paralelos envolvendo ratinhos transgénicos expressando o gene de LCAT humano demonstram que aumentos moderados na actividade de LCAT mudam significativamente os niveis de colesterol da lipoproteína e que LCAT tem uma preferência significativa pela HDL contendo ApoA-I (Francone et al., J. Clinic. Invest. 96: 1440-1448, 1995; Berard et al., Nature Medicine 3(7): 744-749, 1997). Embora estes dados apoiem um papel significativo para ApoA-I na activação da LCAT e na estimulação do TIC, estudos adicionais demonstram um cenário mais complicado: um componente principal da HDL que modula o efluxo do colesterol das células é os fosfolípidos (Fournier et al., J. Lipid Res. 37: 1704-1711, 1996).

Tendo em vista o potencial papel da HDL, i.e., tanto a ApoA-I como o seu fosfolipido associado, na protecção contra doença aterosclerótica, foram iniciados ensaios clínicos utilizando ApoA-I produzida de forma recombinante, descontinuados e aparentemente reiniciados por UCB Belgium (Pharmaprojects, 27 de Out. de 1995; IMS R&D Focus, 30 de Junho de 1997; Drug Status Update, Atherosclerosis 2(6): 261-265 , 1997); (ver também M. Eriksson em Congresso, "The Role of HDL in Disease Prevention, " 7-9 de Nov. de 1996, Fort Worth; Lacko e

Miller, J. Lip. Res. 38: 1267-1273, 1997; e WO 94/13819) e foram iniciados e descontinuados por Bio-Tech (Pharmaprojects, 7 de Abril de 1989) . Foram também tentados ensaios utilizando ApoA-I para tratar choque séptico (Opal, 18 ΡΕ1019073 "Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis," IBC's 7th International Conference on Sepsis, 28-30 de Abril de 1997, Washington, D.C.; Gouni et al., J. Lipid Res. 94: 139-146, 1993; Levine, WO 96/04916). No entanto, existem muitas desvantagens associadas à produção e utilização de ApoA-I, não a tornando ideal como fármaco; e.g., a ApoA-I é uma proteína grande cuja produção é difícil e dispendiosa; têm de ser superados problemas significativos de fabrico e reprodutibilidade em relação à estabilidade durante o armazenamento, distribuição de um produto activo e semi-vida in vivo.

Tendo em vista estas desvantagens, foram feitas tentativas para preparar péptidos que imitassem a ApoA-I. Uma vez que as actividades chave de ApoA-I foram atribuídas à presença de múltiplas repetições de uma característica estrutural secundária única na proteína - uma hélice α anfipática de classe A (Segrest, FEBS Lett. 38: 247-253, 1974), a maioria dos esforços para desenhar péptidos que imitem a actividade ApoA-I centraram-se no desenho de péptidos que formem hélices α anfipáticas de tipo classe A.

As hélices α anfipáticas de tipo classe A são únicas por os aminoácidos carregados positivamente serem agrupados na interface hidrófoba-hidrófila e os aminoácidos carregados negativamente serem agrupados no centro da face hidrófila. Para além disso, os péptidos α helicoidais de classe A têm um ângulo hidrófobo de menos de 180° (Segrest et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics 8: 103- 19 ΡΕ1019073 117, 1990) . As estratégias iniciais de novo para desenhar imitadores de ApoA-I não se basearam nas sequências primárias das apolipoproteinas de ocorrência natural, mas em vez disso na incorporação destas caracteristicas únicas da hélice de classe A nas sequências dos análogos peptidicos, bem como nalgumas das propriedades dos domínios de ApoA-I (ver, e.g., Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 13605-13610, 1996; Rogers et al., Biochemistry 36: 288-300, 1997; Lins et al., Biochim. Biophys. Acta biomembranes 1151: 137-142, 1993; Ji e Jonas, J. Biol.

Chem. 270: 11290-11297, 1995; Collet et al., Journal of Lipid Research 38: 634-644, 1997; Sparrow e Gotto, Ann. N.Y. Acad. Sei. 348: 187-211, 1980; Sparrow e Gotto, CRC Crit. Rev. Biochem. 13: 87-107, 1982; Sorci-Thomas et al., J. Biol. Chem. 268: 21403-21409, 1993; Wang et al.,

Biochim. Biophys. Acta 174-184, 1996; Minnich et al., J.

Biol. Chem. 267: 16553-16560, 1992; Holvoet et al.,

Biochemistry 34: 13334-13342, 1995; Sorci-Thomas et al., J. Biol. Chem. 272(11): 7278-7284, 1997; e Frank et al.,

Biochemistry 36: 1798-1806, 1997).

Num estudo, Fukushima et al. sintetizaram um péptido de 22 resíduos composto inteiramente por resíduos Glu, Lys e Leu dispostos periodicamente para formar uma hélice α anfipática com faces hidrófilas e hidrófobas iguais ("péptido ELK") (Fukushima et al., J. Amer. Chem. Soc. 101(13): 3703-3704, 1979; Fukushima et al., J. Biol. Chem. 255: 10651-10657, 1980). O péptido ELK partilha 41% de homologia de sequência com o fragmento 198-219 de ApoA- 20 ΡΕ1019073 I. Tal como estudado através de ultrafiltração quantitativa, cromatografia de permeação em gel e dicroismo circular, mostrou-se que este péptido ELK se associa eficazmente a fosfolipidos e imita algumas das propriedades fisicas e quimicas de ApoA-I (Kaiser et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 1137-1140, 1983; Kaiser et ai., Science 223: 249-255, 1984; Fukushima et ai., supra, 1980; Nakagawa et ai., J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092, 1985). Yokoyama et ai. concluíram a partir de tais estudos que o factor crucial para a activação de LCAT é simplesmente a presença de uma estrutura anfipática suficientemente grande (Yokoyama et ai., J. Biol. Chem. 255(15): 7333-7339, 1980). Verificou-se depois que um dímero deste péptido de 22 resíduos imitava melhor ApoA-I que o monómero; com base nestes resultados, foi sugerido que o 44-mero, que é pontuado no meio por uma interrupção da hélice (Gly ou Pro) , representava o domínio funcional mínimo em ApoA-I (Nakagawa et ai., 1985, supra).

Outro estudo envolveu péptidos anfipáticos modelo designados "péptidos LAP" (Pownall et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77(6): 3154-3158, 1980; Sparrow et ai., Em: "Peptides: Synthesis-Structure-Function", Roch and Gross, Eds., Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 253-256, 1981). Com base em estudos de ligação de lípidos com fragmentos de apolipoproteínas nativas, foram desenhados vários péptidos LAP, designados LAP-16, LAP-20 e LAP-24 (contendo 16, 20 e 24 resíduos de aminoácidos, respectivamente). Estes péptidos anfipáticos modelo não partilham homologia de 21 ΡΕ1019073 sequência com as apolipoproteínas e foram desenhados para terem faces hidrófilas organizadas de um modo contrário ao dos domínios helicoidais anfipáticos de tipo classe A associados às apolipoproteínas (Segrest et al., J. Lipid Res. 33: 141-166, 1992). A partir destes estudos, os autores concluíram que é necessário um comprimento mínimo de 20 resíduos para conferir aos péptidos anfipáticos modelo propriedades de ligação a lípidos.

Estudos com mutantes de LAP20 contendo um resíduo de prolina em diferentes posições na sequência indicaram que existe uma relação directa entre a ligação a lípidos e a activação de LCAT, mas que o potencial helicoidal de um péptido sozinho não conduz à activação de LCAT (Ponsin et al., J. Biol. Chem. 261(20): 9202-9205, 1986). Para além disso, a presença desta interrupção da hélice (Pro) próximo do meio do péptido reduziu a sua afinidade para as superfícies dos fosfolípidos bem como a sua capacidade para activar LCAT. Embora se tenha mostrado que certos péptidos LAP se ligam a fosfolípidos (Sparrow et al., supra), existe controvérsia quanto até que ponto é que os péptidos LAP são helicoidais na presença de lípidos (Buchko et al., J. Biol. Chem. 271(6): 3039-3045, 1996; Zhong et al., Peptlde Research 7(2): 99-106, 1994).

Segrest et al. sintetizaram péptidos compostos por 18 a 24 resíduos de aminoácidos que não partilham homologia de sequência com as hélices de ApoA-I (Kannelis et al., J. Biol. Chem. 255(3): 11464-11472, 1980; Segrest 22 ΡΕ1019073 et al., J. Biol. Chem. 258: 2290-2295, 1983). As sequências foram especificamente desenhadas para imitarem os domínios helicoidais anfipáticos das apolipoproteínas de classe A permutáveis em termos de momento hidrófobo (Eisenberg et al., Nature 299: 371-374, 1982) e distribuição de cargas (Segrest et al., Proteins 8: 103-117, 1990; Patente U.S. N° 4643988) . Um péptido de 18 resíduos, o péptido "18A", foi desenhado para ser uma hélice α de classe A modelo (Segrest et al., 1990, supra). Estudos com estes péptidos e outros péptidos possuindo uma distribuição inversa de cargas, tal como o péptido "18R", mostraram consistentemente que a distribuição de cargas é crítica para a actividade; os péptidos com uma distribuição inversa de cargas exibiram uma menor afinidade para lípidos relativamente aos imitadores de classe A 18A e um teor helicoidal inferior na presença de lípidos (Kanellis et al., J. Biol. Chem. 255: 11464-11472, 1980; Anantharamaiah et al., J. Biol. Chem. 260: 10248-10255, 1985; Chung et al., J. Biol. Chem. 260: 10256-10262, 1985; Epand et al., J. Biol. Chem. 262: 9389— 9396, 1987; Anantharamaiah et al., Adv. Exp. Med. Biol. 285:131-140, 1991).

Outros péptidos sintéticos que não partilham homologia de sequência com as apolipoproteínas que foram propostos com um sucesso limitado incluem dímeros e trímeros do péptido 18A (Anantharamaiah et al., Proteins of Biological Fluids 34: 63-66), péptidos GALA e EALA (Subbarao et al., Proteins: Structure, Function and Genetícs 3: 187-198, 1988) e péptidos ID (Labeur et al., 23 ΡΕ1019073

Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17: 580-588) e o péptido 18AM4 (Brasseur et al., Biochim. Biophys. Acta 1170: 1-7, 1993).

Foi também desenhado um péptido de "consenso" contendo 22 resíduos de aminoácidos, baseado nas sequências das hélices da ApoA-I humana (Anantharamaiah et al., Arteriosclerosis 10(1): 95-105, 1990; Venkatachalapathi et al., Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sei. B: 585-596, 1991). A sequência foi construída através da identificação do resíduo mais prevalente em cada posição das hélices hipotéticas da ApoA-I humana. Tal como os péptidos descritos acima, a hélice formada por este péptido tinha resíduos de aminoácidos com carga positiva agrupados na interface hidrófila-hidrófoba, resíduos de aminoácidos com carga negativa agrupados no centro da face hidrófila e um ângulo hidrófobo de menos de 180°. Embora um dímero deste péptido seja de algum modo eficaz na activação de LCAT, o monómero exibiu fracas propriedades de ligação a lípidos (Venkatachalapathi et al., 1991, supra).

Com base primariamente em estudos in vitro com os péptidos acima descritos, emergiu um conjunto de "regras" para o desenho de péptidos que imitem a função de ApoA-I. Significativamente, pensa-se que seja necessária uma hélice α anfipática possuindo resíduos com carga positiva agrupados no interface hidrófila-hidrófoba e resíduos de aminoácidos com carga negativa agrupados no centro da face hidrófila para afinidade com lípidos e activação da LCAT 24 ΡΕ1019073 (Venkatachalapathi et al., 1991, supra). Anantharamaiah et al. indicaram também que o resíduo Glu carregado negativamente na posição 13 do péptido de consenso 22-mero, que se posiciona dentro da face hidrófoba da hélice a, tem um papel importante na activação de LCAT ((Anantharamaiah et al., 1991, supra). Para além disso, Brasseur indicou que era necessário um ângulo hidrófobo (ângulo fo) de menos de 180° para uma estabilidade óptima do complexo lípido-apolipoproteína, e contribui também para a formação de partículas discoidais possuindo os péptidos em torno do bordo da bicamada lipídica (Brasseur, j. Blol. Chem. 66(24): 16120-16127, 1991). Rosseneu et al. insistiram também que é necessário um ângulo hidrófobo de menos de 180° para a activação de LCAT (W093/25581).

No entanto, apesar destas "regras", até à data ninguém desenhou ou produziu um péptido tão activo como ApoA-I - tendo o melhor menos de 40% da actividade de ApoA-I medida através do ensaio de activação de LCAT aqui descrito. Nenhum dos "imitadores" peptídicos descritos na literatura demonstrou ser útil como fármaco.

Tendo em vista o antecedente, existe a necessidade do desenvolvimento de um agonista estável de ApoA-I que imite a actividade de ApoA-I e cuja produção seja relativamente simples e rentável. No entanto, as "regras" para o desenho de imitadores eficazes de ApoA-I não foram clarificadas e os princípios para o desenho de 25 ΡΕ1019073 moléculas orgânicas com a função de ApoA-I são desconhecidos.

3. SUMÁRIO DO INVENTO 0 invento refere-se a agonistas de ApoA-I capazes de formar hélices α anfipáticas que imitam a actividade de ApoA-I, com actividades especificas, i.e., unidades de actividade (activação de LCAT/unidade de massa), que se aproximam ou excedem a da molécula nativa. Em particular, os agonistas de ApoA-I do invento são péptidos ou análogos peptidicos que: formam hélices anfipáticas (na presença de lipidos), se ligam a lipidos, formam complexos semelhantes a pré-β ou semelhantes a HDL, activam LCAT, aumentam os niveis séricos das fracções de HDL e promovem o efluxo de colesterol. 0 invento baseia-se, em parte, no desenho e na descoberta pelos requerentes de péptidos que imitam a função de ApoA-I. Os péptidos do invento foram desenhados com base na suposta estrutura helicoidal e nas propriedades anfipáticas da sequência de consenso de 22 aminoácidos que foi derivada das repetições helicoidais de ApoA-I.

Surpreendentemente, os péptidos do invento têm uma actividade especifica bem acima da relatada para os péptidos derivados de ApoA-I descritos na literatura. De facto, algumas formas de realização do invento aproximam-se de 100% da actividade da ApoA-I nativa, enquanto os 26 ΡΕ1019073 superagonistas aqui descritos excedem a actividade especifica de ApoA-i. 0 invento é ilustrado por meio de exemplos operativos que descrevem a estrutura, preparação e utilização de determinados péptidos antipáticos que formam hélices (na presença de lípidos), se ligam a lipidos, formam complexos e aumentam a actividade de LCAT. Com base na estrutura e na actividade das formas de realização exemplificadas, os requerentes consideraram um conjunto de "regras" que podem ser utilizadas para desenhar formas alteradas ou mutadas que estão também dentro do âmbito do invento. 0 invento refere-se também a formulações farmacêuticas contendo tais agonistas de ApoA-I (como péptidos ou complexos péptido-lipido) como ingrediente activo, bem como métodos para preparação de tais formulações e sua utilização para tratar doenças associadas a dislipoproteinemia (e.g., doenças cardiovasculares, aterosclerose, síndroma metabólico), restenose ou endotoxemia (e.g., choque séptico).

3.2. ABREVIATURAS

Tal como aqui se utiliza, as abreviaturas para os aminoácidos L-enantioméricos geneticamente codificados são as convencionais e são como se segue: 27 ΡΕ1019073

Aminoácido Símbolo de Uma Letra Abreviatura Usual Alanina A Ala Arginina R Arg Asparagina N Asn Ácido aspártico D Asp Cisteína C Cys Glutamina Q Gin Ácido glutâmico E Glu Glicina G Gly Histidina H His Isoleucina I Ile Leucina L Leu Lisina K Lys Metionina M Met Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptofano W Trp Tirosina Y Tyr Valina V Vai

As abreviaturas utilizadas para os D-enantiómeros dos aminoácidos geneticamente codificados são os equivalentes em minúsculas dos símbolos de uma letra. Por exemplo, "R" designa L-arginina e "r" designa D-arginina. 28 ΡΕ1019073

3.2. DEFINIÇÕES

Tal como aqui se utiliza, os seguintes termos devem ter os seguintes significados: "Alquilo": refere-se a um radical hidrocarboneto saturado ramificado, de cadeia linear ou cíclico. Grupos alquilo típicos incluem, mas não se limitam a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo e semelhantes. Em formas de realização preferidas, os grupos alquilo são alquilo (Ci— C6) · "Alcenilo": refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado ramificado, de cadeia linear ou cíclico possuindo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. O radical pode estar na conformação eis ou trans em torno da ligação dupla ou das ligações duplas. Grupos alcenilo típicos incluem, mas não se limitam a, etenilo, propenilo, isopropenilo, butenilo, isobutenilo, terc-butenilo, pente-nilo, hexenilo e semelhantes. Em formas de realização preferidas, o grupo alcenilo é um alcenilo (Ci-Cô) . "Alcinilo": refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado ramificado, de cadeia linear ou cíclico possuindo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Grupos alcinilo típicos incluem, mas não se limitam a, etinilo, propinilo, butinilo, isobutinilo, pentinilo, hexinilo e semelhantes. Em formas de realização preferidas, o grupo alcinilo é um alcinilo (Ci-C6) . 29 ΡΕ1019073 "Arilo": refere-se a um radical hidrocarboneto cíclico insaturado possuindo um sistema electrónico π conjugado. Grupo arilo típicos incluem, mas não se limitam a, penta-2,4-dieno, fenilo, naftilo, antracilo, azulenilo, crisenilo, coronenilo, fluorantenilo, indacenilo, idenilo, ovalenilo, perilenilo, fenalenilo, fenantrenilo, picenilo, pleiadenilo, pirenilo, pirantrenilo, rubicenilo e semelhantes. Em formas de realização preferidas, o grupo arilo é um arilo (C5-C20) r sendo particularmente preferido (C5-C10) · "Alcarilo": refere-se a um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo de cadeia linear em que um dos átomos de hidrogénio ligado a um carbono terminal é substituído com uma porção arilo. Grupos alcarilo típicos incluem, mas não se limitam a, benzilo, benzilideno, benzilidino, benzenobenzilo, naftenobenzilo e semelhantes. Em formas de realização preferidas, o grupo alcarilo é um alcarilo (C6-C26)r í.e., a porção alquilo, alcenilo ou alcinilo do grupo alcarilo é (C1-C6) e a porção arilo é (C5-C20) . Em formas de realização particularmente preferidas, o grupo alcarilo é um alcarilo (C6-Ci3), í.e., a porção alquilo, alcenilo ou alcinilo do grupo alcarilo é (C1-C3) e a porção arilo é (C5-C10) · "Heteroarilo": refere-se a uma porção arilo em que um ou mais átomos de carbono são substituídos por outro átomo, tal como N, P, 0, S, As, Se, Si, Te, etc. Grupos 30 ΡΕ1019073 heteroarilo típicos incluem, mas não se limitam a, acridarsina, acridina, arsantridina, arsindol, arsindolina, carbazol, β-carbolina, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolizina, isoarsindol, isoarsinolina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isofosfoindol, iso-fosfinolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, nafti-ridina, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, fosfoindol, fosfinolina, ftalazina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, piri-midina, pirrol, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quino-lizina, quinoxalina, selenofeno, telurofeno, tiofeno e xanteno. Em formas de realização preferidas, o grupo heteroarilo é um heteroarilo com 5-20 membros, sendo particularmente preferido um arilo com 5-10 membros. "Alceteroarilo": refere-se a um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo de cadeia linear onde um dos átomos de hidrogénio ligado a um átomo de carbono terminal é substituído com uma porção heteroarilo. Em formas de realização preferidas, o grupo alceteroarilo é um grupo alceteroarilo com 6-26 membros, i.e., a porção alquilo, alcenilo ou alcinilo do alceteroarilo é (Ci-Cç) e o heteroarilo é um heteroarilo com 5-20 membros. Em formas de realização particularmente preferidas o alceteroarilo é um alceteroarilo com 6-13 membros, i.e., a porção alquilo, alcenilo ou alcinilo é um heteroarilo com 5-10 membros. "Alquilo, Alcenilo, Alcinilo, Arilo, Alcarilo, Heteroarilo ou Alceteroarilo Substituído": refere-se a um 31 ΡΕ1019073 grupo alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, alcarilo, heteroarilo ou alceteroarilo no qual um ou mais átomos de hidrogénio são substituídos com outro substituinte.

Substituintes preferidos incluem -0R, -SR, -NRR, -NO2, -CN, halogéneo, -C(0)R, -C(0)0R e -C(0)NR, onde cada R é independentemente hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, alcarilo, heteroarilo ou alceteroarilo.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. IA é um diagrama de roda helicoidal de

Schiffer-Edmundson de uma hélice α anfipática idealizada na qual os círculos vazios representam resíduos de aminoácidos hidrófilos e os círculos sombreados representam resíduos de aminoácidos hidrófobos. A FIG. 1B é um diagrama de rede helicoidal da hélice anfipática idealizada da FIG. IA. A FIG. 1C é um diagrama de cilindro helicoidal da hélice anfipática idealizada da FIG. IA. A FIG. 2A é um diagrama de roda helicoidal de

Schiffer-Edmundson do péptido central de estrutura (I) ilustrando a anfipaticidade da hélice (círculos vazios representam os resíduos de aminoácidos hidrófilos, os círculos sombreados representam resíduos de aminoácidos hidrófobos e os círculos parcialmente sombreados representam resíduos de aminoácidos hidrófilos ou hidrófobos) . 32 ΡΕ1019073 A FIG. 2B é um diagrama de rede helicoidal do péptido central de estrutura (I) ilustrando a face hidró-foba da hélice. A FIG. 2C é um diagrama de rede helicoidal do péptido central de estrutura (I) ilustrando a face hidrófila da hélice. A FIG. 3A é um diagrama de rede helicoidal ilustrando a face hidrófila do péptido 22-mero de consenso de Segrest (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO:75). A FIG. 3B é um diagrama de rede helicoidal ilustrando a face hidrófila do péptido central exemplar 4 (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO:4). A FIG. 4A é um diagrama de rede helicoidal ilustrando a face hidrófoba do péptido 22-mero de consenso de Segrest (SEQ ID NO:75). A FIG. 4B é um diagrama de rede helicoidal ilustrando a face hidrófoba do péptido central exemplar 4 (SEQ ID NO:4) . A FIG. 5A é um diagrama de rede helicoidal de Schiffer-Edmundson do péptido 22-mero de consenso de Segrest (SEQ ID NO:75) . 33 ΡΕ1019073 A FIG. 5B é um diagrama de rede helicoidal de Schiffer-Edmundson do péptido central exemplar 4 (SEQ ID NO: 4) . A FIG. 6A é um modelo de computador de dois péptidos 4 (SEQ ID NO:4) dispostos de um modo antiparalelo no qual os resíduos Glu-8 e Gln-19 estão realçados para ilustrar a capacidade destes dois péptidos para formarem ligações intermoleculares de hidrogénio quando ligados a lípidos. A FIG. 6B é um modelo de computador de dois péptidos 102 (PVLDLFRELLNLXLEALKEKLK; SEQ ID NO:102) dispostos de um modo antiparalelo no qual os resíduos Glu-8 e Glu-19 estão realçados para ilustrar a incapacidade destes dois péptidos para formar ligações intermoleculares de hidrogénio quando ligados a lípidos. A FIG. 7A ilustra uma rede ramificada de ordem terciária do invento. A FIG. 7B ilustra uma rede ramificada de ordem quaternária do invento. A FIG. 7C ilustra uma rede ramificada de ordem mista do invento. A FIG. 7D ilustra redes ramificadas em "árvore de Lys" exemplares do invento. 34 ΡΕ1019073 A FIG. 8A é um gráfico ilustrando as diferenças entre as mudanças químicas da Ha observadas e as mudanças químicas da Ha do enrolamento aleatório tabuladas para o péptido 4 (SEQ ID NO:4) e o péptido 22-mero de consenso de Segrest (SEQ ID NO:75). A FIG. 8B é um gráfico ilustrando as diferenças entre as mudanças químicas de protões da amida observadas e as mudanças químicas de protões da amida do enrolamento aleatório tabuladas para o péptido 4 (SEQ ID NO: 4) e o péptido 22-mero de consenso de Segrest (SEQ ID NO:75). A FIG. 8C é um desenho ilustrando a relação periódica entre as mudanças químicas de protões de Ha do péptido 4 (SEQ ID N0:4) e a sua conformação em hélice a.

As FIGS. 9A-9D proporcionam cromatogramas em gel de HDL humana isolada incubada durante 2 h a 37°C em tampão medido através da absorvência (-) e na presença de péptido 4 marcado com 14C medido através da absorvência (--) ou de contagem radiométrica de 14C (♦). Os cromatogramas foram obtidos a razões de massa de péptido:HDL de 1:15 (FIG. 19A) 1:10 (FIG. 9B), 1:5 (FIG. 9C) e 1:3 (FIG. 9D) . A FIG. 9E é um cromatograma de filtração em gel de controlo de péptido 4 marcado com 14C livre, não ligado medido através da absorvência (—) e de contagem radiométrica de 14C (♦). 35 ΡΕ1019073 A FIG. 9F proporciona cromatogramas de diferença de filtração em gel ilustrando a diferença entre cada um dos cromatograma da absorvência de HDL tratada com péptido apresentados nas FIGS. 9A 9B (-) , 9C (---) e 9D (—) e o cromatograma de controlo da FIG. 9E (valores positivos indicam uma absorvência superior na amostra tratada; valores negativos indicam uma maior absorvência na amostra de controlo). A FIG. 10 é um gráfico ilustrando o perfil lipoproteico de coelhos injectados com 10 mg/kg de péptido 4 (SEQ ID NO:4) (na forma de complexos péptido/DPPC). A FIG. 11A é um desenho representando os vários estados de agregação e complexos péptido-lipido que podem ser obtidos com os agonistas de ApoA-I do invento. Esquerda: Processo de multimerização dos péptidos resultando na interacção de várias hélices peptídicas e conduzindo à formação de oligómeros em condições definidas de concentração peptídica, pH e força iónica. Centro: A interacção dos péptidos (em qualquer um destes estados de agregação) com entidades lipidicas (tais como SUVs) conduz à reorganização dos lipidos. Direita: Através da alteração da razão molar lípido:péptido, podem ser obtidos diferentes tipos de complexos péptido-lipido, de co-micelas lípido-péptido a baixas razões lipido-péptido, até partículas discoidais e finalmente até grandes complexos multi-lamelares a razões lípido:péptido cada vez maiores. 36 ΡΕ1019073 A FIG. 11B ilustra o modelo geralmente aceite para complexos discoidais péptido-lipido formados num intervalo definido de razões lipido:péptido. Cada péptido rodeando o bordo do disco está em intimo contacto com os seus dois vizinhos mais próximos.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Os agonistas de ApoA-I do invento imitam a função e a actividade de ApoA-l. Formam hélices anfipáticas (na presença de lipidos), ligam-se a lipidos, formam complexos semelhantes a pré-β ou semelhantes a HDL, activam LCAT, aumentam a concentração sérica de HDL e promovem o efluxo de colesterol. A função biológica dos péptidos correlaciona-se com a sua estrutura helicoidal ou a conversão em estruturas helicoidais na presença de lipidos.

Os agonistas de ApoA-I do invento podem ser preparados em formas de dosagem estáveis em volume ou em unidade, e.g., produtos liofilizados, que podem ser reconstituídos antes da utilização in vivo ou reformulados. 0 invento inclui as formulações farmacêuticas e a utilização de tais preparações no tratamento de hiper-lipidemia, hipercolesterolemia, doença cardíaca coronária, aterosclerose e outras condições tais como endotoxemia causando choque séptico. 0 invento é ilustrado através dos exemplos 37 ΡΕ1019073 operativos que demonstram que os agonistas de ApoA-I do invento se associam ao componente HDL do plasma e podem aumentar a concentração de HDL e de partículas pré-β. Os agonistas de ApoA-I do invento aumentam o efluxo de colesterol celular. Os agonistas são também extremamente eficientes na activação de LCAT e promovem assim o TIC. A utilização dos agonistas de ApoA-I do invento in vivo em modelos animais resulta num aumento da concentração sérica de HDL. 0 invento é exposto em mais detalhe nas subsecções abaixo, que descrevem: a composição e a estrutura dos agonistas peptídicos de ApoA-I; a caracterização estrutural e funcional; os métodos de preparação das formulações de dosagem em volume e em unidade; e os métodos de utilização.

5.1. ESTRUTURA E FUNÇÃO DE PÉPTIDO

Os agonistas de ApoA-I do invento são geralmente péptidos ou análogos destes, que são capazes de formar hélices α anfipáticas na presença de lípidos e que imitam a actividade de ApoA-I. Os agonistas têm como sua principal característica um péptido "central" composto por 15 a 29 resíduos de aminoácidos, de preferência 22 resíduos de aminoácidos, ou um análogo deste em que pelo menos uma ligação amida no péptido é substituída por uma amida substituída, um isostero de uma amida ou um imitador de uma amida. 38 ΡΕ1019073

Os agonistas de ApoA-I do invento baseiam-se em parte, na surpreendente descoberta dos requerentes de que a alteração de certos residuos de aminoácidos na sequência primária da sequência de consenso 22-mero de Venkata-chalapathi et al., Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indían Acad. Sei., B: 585-596, 1991 (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO:75; daqui em diante "22-mero de consenso de Segrest" ou "22-mero de consenso") que se pensava serem críticos para a actividade, produz péptidos sintéticos que exibem actividades que se aproximam, ou nalgumas formas de realização até excedem, a actividade da ApoA-I nativa. Em particular, os requerentes descobriram que a substituição de três resíduos de aminoácidos carregados no péptido 22-mero de consenso de Segrest (Glu-5, Lys-9 e Glu-13) por um resíduo Leu hidrófobo proporciona péptidos que imitam as propriedades estruturais e funcionais de ApoA-I até um grau sem precedentes na arte.

Embora não se pretenda ficar ligados a qualquer teoria particular, crê-se que a hélice formada pelos agonistas da ApoA-I do invento imita de modo mais próximo as propriedades estruturais e funcionais das regiões helicoidais anfipáticas da ApoA-I nativa que são importantes para efectuar a ligação a lípidos, o efluxo de colesterol e a activação da LCAT que a hélice α formada pelos péptidos imitadores de ApoA-I descritos na literatura, resultando deste modo em péptidos que exibem uma actividade semelhante a ApoA-I significativamente maior 39 ΡΕ1019073 que esses outros péptidos. De facto, enquanto muitos dos agonistas de ApoA-I do invento se aproximam, e nalgumas formas de realização até excedem, a actividade de ApoA-I, até à data, o melhor péptido imitador de ApoA-I descrito na literatura - o péptido 18AM4 (EWLEAFYKKVLEKLKELF; SEQ ID NO:246) (Corinjn et al., Biochim. Biophys. Acta 1170: 8-16, 1993; Labeur et al., Arteriosclerosis; Resumos N03 186 e 187, Out. de 1994) e o péptido 18AM4 N-acetilado, C-amidado (SEQ ID NO:239) (Brasseur, Biochim. Biophys. Acta 1170: 1-7, 1993) - exibem menos de 4% e 11%, respectivamente, da actividade de ApoA-I medida através do ensaio de activação de LCAT aqui descrito.

Geralmente, os péptidos centrais (ou análogos destes) que compõem os agonistas de ApoA-I do invento têm a seguinte Fórmula estrutural (I): XÍ-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19- X20-X21-X22 em que:

Xi é Pro (P) , Ala (A) , Gly (G) , Gin (Q) , Asn (N) , Asp (D) ou D-Pro (p); X2 é um aminoácido alifático; X3 é Leu (L) ou Phe (F) ; X4 é um aminoácido ácido; X5 é Leu (L) ou Phe (F) ; Xô é Leu (L) ou Phe (F); X7 é um aminoácido hidrófilo; 40 ΡΕ1019073

Xs é um aminoácido ácido ou básico; Xg é Leu (L) ou Gly (G) ; X o é Leu (L), Trp (W) ou Gly (G); Xll é um aminoácido hidrófilo; Xl2 é um ácido hidrófilo; Xl3 é Gly (G) ou um aminoácido alifático; Xl4 é Leu (L), Trp (W) , Gly (G) ou Nal; Xl5 é um aminoácido hidrófilo; Xl6 é um aminoácido hidrófobo; Xl7 é um aminoácido hidrófobo; co l—I X é um aminoácido básico, Gin (Q) ou Asn Xl9 é um aminoácido básico, Gin (Q) ou Asn X20 é um aminoácido básico; X21 é um aminoácido alifático; e X22 é um aminoácido básico.

Os péptidos centrais da estrutura (I) são definidos, em parte, em termos de aminoácidos ou classes designadas. As definições das várias classes designadas são proporcionadas abaixo ligadas à descrição das formas de realização mutadas ou alteradas da estrutura (I).

Nos péptidos centrais de estrutura (I), o símbolo entre os resíduos de aminoácidos Xn designa geralmente uma função de ligação constitutiva do esqueleto. Assim, o símbolo representa habitualmente uma ligação peptídica ou uma ligação amida (-C(O)NH-). Deve entender-se, no entanto, que o presente invento contempla análogos peptí-dicos em que uma ou mais ligações amida são opcionalmente 41 ΡΕ1019073 substituídas por uma ligação diferente da amida, de preferência uma amida substituída ou um isostero de amida. Assim, embora vários resíduos Xn dentro da estrutura (I) sejam geralmente descritos em termos de aminoácidos e as formas de realização preferidas do invento sejam exemplificadas por meio de péptidos, um perito na arte reconhecerá que em formas de realização possuindo ligações não amida, o termo "aminoácido" ou "resíduo" tal como aqui se utiliza refere-se a outras porções bifuncionais possuindo grupos semelhantes em estrutura às cadeias laterais dos aminoácidos.

Amidas substituídas incluem geralmente, mas não se limitam a, grupos de fórmula -C(0)NR-, em que R é alquilo (Ci-Ce) , alquilo (Ci—Ce) substituído, alcenilo (Ci-Οβ) , alcenilo (Ci-C6) substituído, alcinilo (Ci—Õ6) r alcinilo (Ci-C6) substituído, arilo (C5-C2o) , arilo (C5-C20) substituído, alcarilo (C6—C26) , alcarilo (C6~C26) substituído, heteroarilo com 5-20 membros, heteroarilo com 5-20 membros substituído, alceterolarilo com 6-26 membros e alceterolarilo com 6-26 membros substituído.

Isosteres de amida incluem geralmente, mas não se limitam a, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- [eis and trans) , -C(0)CH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-. Os compostos possuindo tais ligações não amida e método para preparação de tais compostos são bem conhecidos na arte (ver, e.g., Spatola, Vega Data Vol. 1, Número 3, 3 Março de 1983;

Spatola, "Peptide Backbone Modifications" Em: Chemistry and 42 ΡΕ1019073

Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins,

Weinstein, ed., Mareei Dekker, New York, pág. 267, 1983 (revisão geral); Morley, Trends Pharm. Sei. 1: 463-468, 1980; Hudson et ai., Int. J. Prot. Res. 14: 177-185, 1979 (-CH2NH-, -CH2CH2-); Spatola et al., Life Sei. 38: 1243- 1249, 1986 (-CH2-S); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1: 307-314, 1982 (-CH=CH-, eis e trans); Almquist et al., J. Med. Chem. 23: 1392-1398, 1980 (-COCH2-) ; Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23: 2533, 1980 (-COCH2-) ; Pedido de Patente Europeia EP 45665 (1982) CA 97: 39405 (- CH(OH)CH2-); Holladay et al., Tetrahedron Lett. 24: 4401— 4404, 1983 (-C (OH) CH2-) ; e Hruby, Life Sei. 31: 189-199, 1982 (-CH2-S-).

Adicionalmente, uma ou mais ligações amida podem ser substituídas por porções imitadoras de péptidos ou imitadoras de amidas que não interfiram significativamente com a estrutura ou actividade dos péptidos. Porções imitadoras de amidas adequadas são descritas, por exemplo, em Olson et al., J. Med. Chem. 36: 3039-3049, 1993.

Uma característica crítica dos péptidos centrais da estrutura (I) é a sua capacidade para formar uma hélice α anfipática na presença de lípidos. Por anfipático entenda-se que a hélice α tem uma face hidrófila e uma hidrófoba opostas orientadas ao longo do seu eixo longitudinal, i.e., uma face da hélice projecta principalmente cadeias laterais hidrófilas enquanto que a face oposta projecta principalmente cadeias laterais hidrófobas. As 43 ΡΕ1019073 FIGS. IA e 1B apresentam duas perspectivas ilustrativas das faces hidrófila e hidrófoba opostas de uma hélice α anfipática idealizada. A FIG. IA é um diagrama de roda helicoidal de Schiffer-Edmundson (Schiffer e Edmundson, Bíophys. J. 7: 121-135, 1967). Na roda, o eixo maior da hélice é perpendicular à página. A começar no terminal N, os resíduos de aminoácidos sucessivos (representados por círculos) estão radialmente distribuídos em torno do perímetro de um círculo a intervalos de 100°. Assim, o resíduo do aminoácido n+1 está posicionado a 100° do resíduo η, o resíduo n+2 está posicionado a 100° do resíduo n+1 e por aí adiante. A colocação a 100° contribui para os 3,6 resíduos de aminoácidos por volta que são tipicamente observados numa hélice α idealizada. Na FIG. IA, as faces opostas hidrófila e hidrófoba da hélice estão claramente visíveis; os aminoácidos hidrófilos estão representados como círculos vazios e os resíduos de aminoácidos hidrófobos estão representados como círculos sombreados. A FIG. 1B apresenta um diagrama de rede helicoidal da hélice anfipática idealizada da FIG. IA (Lim, FEBS Lett. 89: 10-14, 1978) . Num diagrama de rede helicoidal típico, a hélice α é apresentada como um cilindro que foi cortado ao longo do centro da sua face hidrófila e aplanado. Assim, o centro da face hidrófoba, determinado pelo momento hidrófobo da hélice (Eisenberg et al., Nature 299: 371-374, 1982), reside no centro da figura e está orientado de forma a sair para fora do plano da página. Uma ilustração do cilindro helicoidal antes de ser 44 ΡΕ1019073 cortado e aplanado está representada na FIG. 1C. Através do corte do cilindro ao longo de diferentes planos, podem-se observar diferentes perspectivas da mesma hélice anfipática e pode-se obter diferente informação sobre as propriedades da hélice obtida. A natureza anfipática da hélice α formada pelos péptidos centrais da estrutura (I) na presença de lípidos está ilustrada na FIG. 2. A FIG. 2A apresenta um diagrama de roda helicoidal de Schiffer-Edmundson, a FIG. 2B apresenta um diagrama de rede helicoidal ilustrando a face hidrófoba e a FIG. 2C apresenta um diagrama de rede helicoidal ilustrando a face hidrófila. Em cada uma das FIGS. 2A, 2B e 2C, os resíduos hidrófilos estão representados como círculos vazios e os resíduos hidrófobos como círculos sombreados. Tal como será discutido mais profundamente abaixo em conjunto com formas alteradas ou mutadas dos péptidos de estrutura (I), certos resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos de modo a que as faces hidrófila e hidrófoba da hélice formada pelos péptidos não possam ser inteiramente compostas de aminoácidos hidrófilos e hidrófobos, respectivamente. Assim, deve entender-se que quando nos referimos à hélice α anfipática formada pelos péptidos centrais do invento, a frase "face hidrófila" refere-se a uma face da hélice possuindo um carácter líquido global hidrófilo. A frase "face hidrófoba" refere-se a uma face do péptido possuindo um carácter líquido global hidrófobo. 45 ΡΕ1019073

Embora não pretendendo ficar ligados a qualquer teoria particular, crê-se certas propriedades estruturais e/ou físicas da hélice anfipática formada pelos péptidos centrais da estrutura (I), são importantes para a actividade. Estas propriedades incluem o grau de anfipaticidade, a hidrofobicidade global, a hidrofobicidade média, os ângulos hidrófobos e hidrófilos, o momento hidrófobo, o momento hidrófobo médio e a carga líquida da hélice a.

Embora os diagramas de roda helicoidal da FIG. 2A proporcionem um meio conveniente de visualização da natureza anfipática dos péptidos centrais de estrutura (I), o grau de anfipaticidade (grau de assimetria da hidrofobicidade) pode ser convenientemente quantificado através do cálculo do momento hidrófobo (μΗ) da hélice. Os métodos para cálculo do μΗ para uma determinada sequência peptídica são bem conhecidos na arte e estão descritos, por exemplo, em Eisenberg, Ann. Rev. Bíochem. 53: 595-623, 1984. 0 μΗ real para um determinado péptido dependerá do número total de resíduos de aminoácidos que compõem o péptido. Assim, geralmente não é informativo comparar directamente ο μΗ para péptidos de diferentes comprimentos.

As anfipaticidades de péptidos de diferentes comprimentos podem ser directamente comparadas por meio do momento hidrófobo (<μΗ>). 0 momento hidrófobo médio pode ser obtido através da divisão do μΗ pelo número de resíduos na hélice (í.e., <μΗ> = μΗ/Ν) . Geralmente, os péptidos 46 ΡΕ1019073 centrais que exibem um <μΗ> no intervalo de 0,45 a 0,65, determinado utilizando a escala de hidrofobicidade de consenso normalizada de Eisenberg (Eisenberg, J. Mol. Biol. 179: 125-142, 1984) são considerados como estando dentro do âmbito do presente invento, sendo preferido um <μΗ> no intervalo de 0,50 a 0,60. A hidrofobicidade global ou total (H0) de um péptido pode ser convenientemente calculada tomando a soma algébrica das hidrofobicidade de cada residuo de aminoácido

N no péptido (í.e., H0 = ^Hi), onde N é o número de resíduos i=1 de aminoácidos no péptido e Hi é a hidrofobicidade do resíduo de aminoácido i). A hidrofobicidade média (<H0>) é a hidrofobicidade dividida pelo número de resíduos de aminoácidos (í.e., <H0> = H0/N). Geralmente, os péptidos centrais que exibem uma hidrofobicidade média no intervalo de -0,050 a -0,070, determinada utilizando a escala de hidrofobicidade de consenso normalizada de Eisenberg (Eisenberg, j. Mol. Biol. 179: 125-142, 1984) são considerados como estando dentro do âmbito do presente invento, sendo preferida uma hidrofobicidade média no intervalo de -0,030 a -0,055. A hidrofobicidade da face hidrófoba (H0ph0) de uma hélice anfipática pode ser obtida tomando a soma das hidrofobicidades dos resíduos de aminoácidos hidrófobos que caiem no ângulo hidrófobo tal como definido a baixo (í.e.,

N

H0pho = ^Hi, onde Hi é tal como anteriormente definido e NH 47 ΡΕ1019073 é o número total de aminoácidos hidrófobos na face hidrófoba). A hidrofobicidade média da face hidrófoba (<H0ph0>) é H0ph0/NH onde NH é tal como definida acima. Geralmente, os péptidos centrais que exibem uma <H0ph0> no intervalo de 0,90 a 1,20, determinada utilizando a escala de hidrofobicidade de consenso de Eisenberg (Eisenberg, 1984, supra; Eisenberg et al., 1982, supra) são considerados como estando dentro do âmbito do presente invento, sendo preferida uma <H0ph0> no intervalo de 0,94 a 1,10. O ângulo hidrófobo (ângulo pho) é geralmente definido como o ângulo ou arco coberto pelo maior trecho continuo de resíduos de aminoácidos hidrófobos quando o péptido está disposto na representação de roda helicoidal de Schiffer-Edmundson (i.e., o número de resíduos hidrófobos contíguos na roda multiplicado por 20°). O ângulo hidrófilo (ângulo phi) é a diferença entre 360° e o ângulo pho (i.e., 360°-ângulo pho). Os peritos na arte reconhecerão que os ângulos pho e phi dependerão, em parte, do número de resíduos de aminoácidos no péptido. Por exemplo, em relação às FIGS. 5A e 5B, pode observar-se que apenas se ajustam 18 aminoácidos em torno de uma rotação da roda helicoidal de Schiffer-Edmundson. Menos aminoácidos deixam um intervalo na roda; mais aminoácidos fazem com que certas posições na roda sejam ocupadas por mais de um resíduo de aminoácido.

No caso de péptidos contendo mais de 18 resíduos de aminoácidos, tais como os péptidos centrais de estrutura 48 ΡΕ1019073 (I) , um trecho "contínuo" de resíduos de aminoácidos hidrófobos significa que pelo menos um aminoácido nas posições ao longo da roda contendo dois ou mais aminoácidos é um aminoácido hidrófobo. Assim, em relação à FIG. 5B, o ângulo pho é o arco coberto pelos resíduos 5, 16, 9, 2, 13, 6, 17, 10, 3 e 14 apesar da ocorrência de um resíduo hidrófilo na posição 20, uma vez que o resíduo na posição 2, que partilha a mesma posição na roda, é um resíduo hidrófobo. Tipicamente, os péptidos centrais possuindo um ângulo pho no intervalo de 160° a 220° são considerados como estando dentro do âmbito do invento, sendo preferido um ângulo pho no intervalo de 180° a 200°.

Certas características estruturais e/ou físicas dos péptidos centrais da estrutura (I) são ilustrados nas FIGS. 3 e 4. A FIG. 3B apresenta um diagrama de rede helicoidal de um péptido central exemplar do invento, o péptido 4 (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO:4), ilustrando a distribuição de cargas ao longo da face hidrófila da hélice. Na FIG. 3B, o cilindro helicoidal foi cortado ao longo do centro da face hidrófoba e aplanado. Os três resíduos hidrófobos de Leu (L) que substituem resíduos hidrófilos na sequência 22-mero de consenso de Segrest (FIG. 3A) estão sombreados. Tal como se pode observar na FIG. 3B, os resíduos de aminoácidos com carga positiva estão agrupados na última volta C-terminal da hélice (o terminal C está no topo da página). Embora não pretendendo ficar ligado a qualquer teoria particular, crê-se que o grupo de resíduos básicos no terminal C estabiliza a hélice 49 ΡΕ1019073 através de interacções electrostáticas do dipolo de cargas de (NH3+)-hélice. Pensa-se também que a estabilização ocorre através de interacções hidrófobas entre as cadeias laterais de lisina e o centro da hélice (ver, Groebke et âl.r Proc. Nâtl. Acâd. Sei. USA 93: 4025-4029, 1996; Esposito et ai., Biopolymers 41: 27-35, 1997).

Com a excepção do grupo C-terminal com carga positiva, as cargas negativas estão distribuídas no resto da face hidrófila, com pelo menos um resíduo de aminoácido com carga negativa (ácido) por volta, resultando num trecho contínuo de cargas negativas ao longo da face hidrófila da hélice. Uma carga positiva está situada no resíduo 7, que contribui potencialmente para a estabilidade da hélice através da formação de uma ponte salina com um resíduo ácido a uma volta de distância na hélice. A FIG. 4B apresenta um diagrama de rede helicoidal ilustrando a face hidrófoba da hélice anfipática formada pelo péptido central exemplar 4 (SEQ ID NO:4). Na FIG. 4B, o cilindro helicoidal é cortado ao longo do centro da face hidrófila e aplanado. A face hidrófoba do péptido central consiste em dois resíduos hidrófobos por volta, excepto quanto à última volta C-terminal, onde dominam os resíduos básicos. Estudos de RMN indicam que os resíduos de aminoácidos 3, 6, 9 e 10 deste péptido central formam um grupo hidrófobo próximo do terminal N da hélice. Phe-6 está centrado neste grupo e crê-se que tenha um papel importante na estabilização do grupo hidrófobo. 50 ΡΕ1019073

Embora não pretendendo ficar ligado a qualquer teoria particular, crê-se que o grupo hidrófobo formado pelos residuos 3, 6, 9 e 10 seja significativo na realização da ligação a lipidos e na activação de LCAT. Por exemplo, embora o péptido exemplar 4 (SEQ ID NO:4) exiba uma activação de LCAT de 93% no ensaio aqui descrito, um derivado do péptido 4 contendo um resíduo Lys (K) na posição 9 (péptido 33; SEQ ID NO:33), que destrói o grupo hidrófobo, exibe apenas 33% de activação de LCAT no mesmo ensaio. Espera-se que os péptidos anfipáticos se liguem aos fosfolípidos apontando as suas faces hidrófobas na direcção das cadeias alquilo das porções lípidicas. Assim, crê-se que este agrupamento altamente hidrófobo contribua para as fortes afinidades a lipidos observadas para os péptidos centrais do invento. Uma vez que a ligação a lipidos é um pré-requisito para a activação de LCAT, crê-se que este agrupamento hidrófobo seja também essencial para a activação de LCAT.

Verifica-se frequentemente que resíduos aromáticos são importantes no ancoramento de péptidos e proteínas a lipidos (De Kruijff, Biosci. Rep. 10: 127-130, 1990; 0'Neil e De Grado, Science 250: 645-651, 1990; Blondelle et al., Biochim. Biophys. Acta 1202: 331-336, 1993). Assim, crê-se ainda que Phe-6, que se posiciona no centro do agrupamento hidrófobo, possa também ter um papel chave no ancoramento dos péptidos centrais da estrutura (I) a lipidos. 51 ΡΕ1019073

As interacções entre os péptidos centrais do invento e os lipidos conduzem à formação de complexos péptido-lípido. Tal como ilustrado na FIG. 11A, o tipo de complexo obtido (co-micelas, discos, vesículas ou multi-camadas) depende da razão molar lípido:péptido, sendo as co-micelas geralmente formadas a baixas razões molares lípido:péptido e sendo os complexos discoidais e vesiculares ou de multicamadas formados com razões molares lípido:péptido crescentes. Esta característica foi descrita para péptidos anfipáticos (Epand, "The Amphipathic Helix", 1993) e para ApoA-I (Jones, "Structure and Function of Apolipoproteins", Capítulo 8, págs. 217-250, 1992). A razão molar lípido:péptido determina também o tamanho e a composição dos complexos (ver, Secção 5.3.1, infra). O eixo mais longo da hélice α formado pelos péptidos centrais da estrutura (I) tem uma forma globalmente curva. Em hélices anfipáticas típicas, verificou-se que os comprimentos das ligações de hidrogénio das faces hidrófila e hidrófoba variam de modo a que o lado hidrófobo da hélice seja côncavo (Barlow e Thornton, J. Mol. Biol. 201: 601-619, 1988; Zhou et al., J. Am. Chem. Soc. 33: 11174-11183, 1992; Gesell et al., J. Biomol. NMR 9: 127-135, 1997). Embora não pretendo ficar ligados à teoria, crê-se que a curvatura global da face hidrófoba da hélice possa ser importante na ligação dos complexos discoidais -uma hélice curva permite que o péptido se "ajuste" melhor em torno dos bordos de partículas discoidais, aumentando deste modo a estabilidade do complexo péptido-disco. 52 ΡΕ1019073

No modelo estrutural geralmente aceite de ApoA-I, as hélices α anfipáticas são empacotadas em torno do bordo da HDL discoidal (ver, FIG. 11B). Neste modelo assume-se que as hélices estão alinhadas com as suas faces hidrófobas a apontar na direcção das cadeias acilo dos lipidos (Brasseur et al., Biochim. Biophys. Acta 1043: 245-252, 1990). As hélices são dispostas de um modo anti-paralelo e pensa-se que um efeito cooperativo entre as hélices contribui para a estabilidade do complexo de HDL discoidal (Brasseur et al., supra). Foi proposto que um factor que contribui para a estabilidade do complexo de HDL discoidal é a existência de interacções iónicas entre os resíduos ácidos e básicos resultando na formação de pontes salinas intermoleculares ou pontes de hidrogénio entre resíduos em hélices anti-paralelas adjacentes. Neste modelo, os péptidos são considerados não como uma entidades única mas como em interacção com pelo menos duas moléculas peptídicas vizinhas (FIG. 11B). É também geralmente aceite que a ligação intra-molecular de hidrogénio ou a formação de pontes salinas entre os resíduos ácidos e básicos, respectivamente, nas posições i e i+3 da hélice estabiliza a estrutura helicoidal (Marqusee et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (24) : 8898-8902, 1985) .

Assim, características chave adicionais dos péptidos centrais da estrutura (I) são a sua capacidade para formar ligações intermoleculares de hidrogénio uns com 53 ΡΕ1019073 os outros quando alinhados de um modo anti-paralelo com as sua faces hidrófobas a apontar na mesma direcção, tal como seria o caso quando os péptidos estão ligados a lípidos (i.e., entre os resíduos ácidos nas posições 4 e 8 e os resíduos básicos nas posições 18, 20 e 22) e também a sua capacidade para formar ligações de hidrogénio intra-moleculares ou pontes salinas próximo dos terminais N e C da hélice (í.e., entre os resíduos ácidos e básicos nas posições 4 e 7 e 15 e 18). A capacidade dos péptidos centrais da estrutura (I) para formar ligações de hidrogénio intermoleculares está ilustrada na FIG. 6A. Na FIG. 6A, duas hélices α ideais do péptido central exemplar 4 (SEQ ID NO:4) estão alinhadas de um modo antiparalelo com as suas respectivas faces hidrófobas a apontar na mesma direcção (para fora do plano da página) . As interacções das ligações de H podem ocorrer entre os resíduos E-8 e Q-19 (Huyghues-Despointes et al., Biochemistry 34(41): 13267-13271, 1995).

Para além disso, quando dispostas deste modo anti-paralelo, as hélices ficam intimamente empacotadas; não há impedimento espacial impedindo o contacto estreito entre as hélices. Alterações na sequência dos péptidos centrais que afectem o empacotamento das hélices influenciam negativamente a actividade dos péptidos centrais. Por exemplo, em relação à FIG. 6B, um dímero dos péptidos possuindo Gln-19 substituído por Gly-19 (péptido 102; PVLDLFRELLNLXLEALKEKLK onde X é Aib; SEQ ID NO:102), e que portanto não pode formar ligações intermoleculares de 54 ΡΕ1019073 hidrogénio, não activou LCAT. Significativamente, enquanto o péptido 4 (SEQ ID NO:4) exibiu uma activação de LCAT de 93% no ensaio aqui descrito, o péptido 102 (SEQ ID NO:102) exibiu uma actividade de apenas 2% no mesmo ensaio.

Assim, embora não estando ligados a qualquer teoria particular, crê-se que a capacidade dos péptidos centrais da estrutura (I) para se empacotarem intimamente e interagirem ionicamente para formarem pontes salinas e/ou ligações de hidrogénio intramoleculares e/ou intermole-culares quando ligados a lipidos de um modo antiparalelo é uma caracteristica importante dos péptidos centrais do invento.

Pensa-se também que a capacidade dos péptidos centrais para formarem interacções intermoleculares péptido-péptido seja importante na ausência de lipidos. Os péptidos centrais do invento auto-associam-se, devido em parte ao seu elevado <μΗ>, <H0> e ângulo hidrófobo (ver, TABELA I, infra) . O fenómeno de auto-associação depende das condições de pH, da concentração peptídica e da força iónica, e pode resultar em vários estados de associação, de formas monoméricas a várias multiméricas (FIG. 11A). O centro hidrófobo dos agregados peptidicos favorece as interacções hidrófobas com os lipidos. A capacidade dos péptidos para se agregarem mesmo a concentrações muito baixas pode favorecer a sua ligação aos lipidos. Pensa-se que no centro dos agregados peptidicos também ocorram interacções péptido-péptido e possam competir com as interacções lipido-péptido. 55 ΡΕ1019073

Para além das propriedades acima descritas, pensa-se que outros parâmetros sejam também importantes para a actividade, incluindo o número total de resíduos hidrófobos, o número total de resíduos com carga e a carga líquida dos péptidos.

Um resumo das propriedades físicas e estruturais preferidas dos péptidos centrais de estrutura (I) é proporcionado na TABELA I, abaixo:

TABELA I

PROPRIEDADES FÍSICAS DOS AGONISTAS DE ApoA-I DE ESTRUTURA

(I) PREFERIDOS PROPRIEDADE INTERVALO INTERVALO PREFERIDO % de aminoácidos hidrófobos 40 - 70 50 - 60 <H0> -0,050 a -0,070 -0,030 a -0,055 <H0pho> 0,90 - 1,2 0,94 - 1,1 <Ph> 0,45 - 0,65 0,50 - 0,60 ângulo pho 1604 - 2204 180° - 200° n° de aminoácidos com carga positiva 3 - 5 4 n° de aminoácidos com carga negativa 3 - 5 4 carga liquida -1 a +1 0 agrupamento hidrófobo as posições 3,6,9,10 são aminoácidos hidrófobos pelo menos 1 aminoácido ácido por volta excepto agrupamento ácido para os últimos aminoácidos C-terminais pelo menos 3 aminoácidos básicos nos últimos 5 agrupamento básico aminoácidos C-terminais 56 ΡΕ1019073

As propriedades das hélices α anfipáticas formadas pelos péptidos centrais do invento diferem significativamente das propriedades das hélices α anfipáticas de classe A, particularmente da hélice α de classe A do 22-mero de consenso de Segrest. Estas diferenças são ilustradas com o péptido central exemplar 4 (SEQ ID NO:4) nas FIGS. 3-5.

Em relação às FIGS. 4A e 4B, pode-se observar que a face hidrófoba do péptido 4 tem um carácter muito mais hidrófobo que a face hidrófoba dos 22-mero de consenso de Segrest. Em particular, o resíduo 5, 9 e 13 (região sombreada da FIG. 4B) são resíduos Leu (L) hidrófobos no péptido 4 (SEQ ID NO: 4) em comparação com os resíduos carregados no 22-mero de consenso (SEQ ID NO:75). A substituição destes três resíduos carregados no 22-mero de consenso de Segrest por resíduos Leu (L) hidrófobos conduz a diferenças significativas na anfipaticidade, hidrofo-bicidade, ângulo de pho e outras propriedades da hélice.

Uma comparação das propriedades físicas e estruturais de dois péptidos centrais exemplares de estrutura (I), o péptido 4 (SEQ ID N0:4) e o péptido 8 (SEQ ID N0:8), e do 22-mero de consenso de Segrest (SEQ ID NO:75) é proporcionada na TABELA II, abaixo: 57 ΡΕ1019073

TABELA II

COMPARAÇÃO DAS PROPRIEDADES DE PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES COM O 22-MERO DE CONSENSO DE SEGREST PROPRIEDADE CONSENSO péptido 4 péptido 8 n° de aminoácidos 22 22 22 n° de aminoácidos hidrófilos 13 10 10 n° de aminoácidos hidrófobos 9 12 12 % de aminoácidos hidrófobos 41 55 55 <H0> -0,293 -0,013 -0,040 A o ho ir o V 0,960 0,990 0,940 <μΗ> 0,425 0,547 0,521 ângulo pho 100° 200° 200° n° de aminoácidos com carga positiva 5 4 4 n° de aminoácidos com carga negativa 6 4 4 carga liquida -1 0 0

Notavelmente, os péptidos centrais de estrutura (I) são compostos por uma grande percentagem de resíduos hidrófobos, têm um <H0> e <μΗ> significativamente maior e têm um ângulo pho duas vezes maior (ver, FIGS. 5A e 5B) . Estas diferenças nas propriedades conduzem a diferenças significativas na actividade. Enquanto o 22-mero de consenso de Segrest (SEQ ID NO:75) exibe uma activação de LCAT de apenas 10% em comparação com a ApoA-I nativa nos ensaios aqui descritos, os péptidos 4 (SEQ ID NO:4) e 8 (SEQ ID NO: 8) exibem uma activação de LCAT de 93% e 83%, respectivamente, em comparação com a ApoA-I nativa nos mesmos ensaios. O péptido 1 (PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK; SEQ ID NO: 1) e O péptido 2 (GVLDLFRELLNEALKQKLKK; SEQ ID NO:2), exibiram uma activação de LCAT de 120% e 105%, respec- 58 ΡΕ1019073 tivamente, em comparação com a ApoA-I nativa nos mesmos ensaios.

Certos resíduos de aminoácidos nos péptidos centrais de estrutura (I) podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos sem afectar de modo significativamente deletério, e em muitos casos até aumentando, a actividade dos péptidos. Assim, estão também contemplados pelo presente invento formas alteradas ou mutadas dos péptidos centrais de estrutura (I) em que pelo menos um resíduo de aminoácido definido na estrutura é substituído por outro resíduo de aminoácido. Como uma das caracte-rísticas críticas que afectam a actividade dos péptidos centrais do invento se crê ser a sua capacidade para formar hélices α na presença de lípidos que exibem as propriedades anfipáticas e outras descritas acima, será reconhecido que em formas de realização preferidas do invento, as substituições de aminoácidos sejam conservativas, i.e., o resíduo de aminoácido substituinte tem propriedades físicas e químicas que são semelhantes às do resíduo de aminoácido a substituir.

Para fins de determinação das substituições de aminoácidos conservativas, os aminoácidos podem ser convenientemente classificados em duas categorias principais, hidrófilos e hidrófobos dependendo primeiramente das características físico-químicas da cadeia lateral do aminoácido. Estas duas categorias principais podem ainda ser classificadas em subcategorias que definem mais dis- 59 ΡΕ1019073 tintamente as características das cadeias laterais dos aminoácidos. Por exemplo, a classe de aminoácidos hidrófilos pode ainda ser subdividida em aminoácidos ácidos, básicos e polares. A classe de aminoácidos hidrófobos pode ainda ser subdividida em aminoácidos apoiares e aromáticos. As definições das várias categorias de aminoácidos que definem a estrutura (I) são como se segue: "Aminoácido Hidrófilo" refere-se a um aminoácido exibindo uma hidrofobicidade menor que zero de acordo com a escala de hidrofobicidade de consenso normalizada de Eisenberg et al., J. Mol. Biol. 179: 125-142, 1984. Os aminoácidos hidrófilos geneticamente codificados incluem Thr (T) , Ser (S), His (H) , Glu (E) , Asn (N) , Gin (Q) , Asp (D) , Lys (K) e Arg (R) . "Aminoácido Ácido" refere-se a um aminoácido hidrófilo possuindo um valor de pK da cadeia lateral de menos de 7. Os aminoácidos ácidos têm tipicamente cadeias laterais com carga negativa a pH fisiológico devido à perda de um ião de hidrogénio. Os aminoácidos ácidos geneticamente codificados incluem Glu (E) e Asp (D). "Aminoácido Básico" refere-se a um aminoácido hidrófilo possuindo um valor de pK da cadeia lateral de mais de 7. Os aminoácidos básicos têm tipicamente cadeias laterais com carga positiva a pH fisiológico devido à associação com um ião hidrónio. Os aminoácidos básicos geneticamente codificados incluem His (H), Arg (R) e Lys 60 ΡΕ1019073 "Aminoácido Polar" refere-se a um aminoácido hidrófilo possuindo uma cadeia lateral que não tem carga a pH fisiológico, mas que tem pelo menos uma ligação em que o par de electrões partilhado em comum pelos dois átomos é mantido mais intimamente por um dos átomos. Os aminoácidos polares geneticamente codificados incluem Asn (N), Gin (Q) Ser (S) e Thr (T). "Aminoácido Hidrófobo" refere-se a um aminoácido exibindo uma hidrofobicidade superior a zero de acordo com a escala de hidrofobicidade de consenso normalizada de Eisenberg, J. Mol. Biol. 179: 125-142, 1984. Os aminoácidos hidrófobos geneticamente codificados incluem Pro (P), Ile (I), Phe (F), Vai (V), Leu (L) , Trp (W) , Met (M) , Ala (A), Gly (G) e Tyr (Y). "Aminoácido Aromático" refere-se a um aminoácido hidrófobo com uma cadeia lateral possuindo pelo menos um anel aromático ou heteroaromático. O anel aromático ou heteroaromático pode conter um ou mais substituintes tais como -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(0)R, -C(0)0H, -C(0)0R, -C(0)NH2, -C(0)NHR, -C(0)NRR e semelhantes onde cada R é, independentemente alquilo (Οι-Οε) , alquilo (Ci-Οβ) substituído, alcenilo (Ci~ C6) , alcenilo (Ci—Ce) substituído, alcinilo (Ci-C6), alcinilo (0ι-0β) substituído, arilo (C5-C20) , arilo (C5-C20) substituído, alcarilo (0β-026), alcarilo (C6-C26) substituído, heteroarilo com 5-20 membros, heteroarilo com 5-20 61 ΡΕ1019073 membros substituído, alceterolarilo com 6-26 membros ou alceterolarilo com 6-26 membros substituído. Os aminoácidos aromáticos geneticamente codificado incluem Phe (F), Tyr (Y) e Trp (W) . "Aminoácido Não Polar" refere-se a um aminoácido hidrófobo possuindo uma cadeia lateral que não tem carga a pH fisiológico e que tem ligações em que o par de electrões partilhado em comum pelos dois átomos é geralmente mantido igualmente por cada um dos átomos (í.e., a cadeia lateral é não polar). Os aminoácidos apoiares geneticamente codificados incluem Leu (L), Vai (V), lie (I), Met (M) , Gly (G) e Ala (A). "Aminoácido Alifático" refere-se a um aminoácido hidrófobo possuindo uma cadeia lateral de hidrocarboneto alifática. Os aminoácidos alifáticos geneticamente codificados incluem Ala (A), Vai (V), Leu (L) e Ile (I). 0 resíduo de aminoácido Cys (C) é invulgar por poder formar pontes dissulfureto com outros resíduos Cys (C) ou outros aminoácidos contendo sulfanilo. A capacidade dos resíduos Cys (C) (e de outros aminoácidos com cadeias laterais contendo -SH) para existirem num péptido na forma -SH reduzida livre ou na de ponte dissulfureto oxidada afecta se os resíduos Cys (C) contribuem para um carácter hidrófobo ou hidrófilo líquido num péptido. Embora Cys (C) exiba uma hidrofobicidade de 0,29 de acordo com a escala de 62 ΡΕ1019073 consenso normalizada de Eisenberg (Eisenberg, 1984, supra), deve entender-se que para fins do presente invento Cys (C) é categorizado como um aminoácido hidrófilo polar, apesar das classificações gerais acima definidas.

Tal como será apreciado pelos peritos na arte, as categorias acima definidas não são mutuamente exclusivas. Assim, aminoácidos possuindo cadeias laterais exibindo duas ou mais propriedades fisico-quimicas podem ser incluídos em múltiplas categorias. Por exemplo, as cadeias laterais de aminoácidos possuindo porções aromáticas que são ainda substituídas com substituintes polares, tais como Tyr (Y), podem exibir tanto propriedades hidrófobas aromáticas como polares ou propriedades hidrófilas, e podem portanto ser incluídas tanto nas categorias aromáticas como polares. A categorização apropriada de qualquer aminoácido será aparente para os peritos na arte, especialmente à luz da divulgação detalhada aqui proporcionada.

Certos resíduos de aminoácidos, designados aminoácidos que "quebram a hélice", têm uma propensão para destruir a estrutura de hélices α quando contidos em posições internas dentro da hélice. Os resíduos de aminoácidos exibindo tais propriedades de quebra da hélice são bem conhecidos na arte (ver, e.g., Chou e Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276) e incluem Pro (P) , Gly (G) e potencialmente todos os D-aminoácidos (quando contidos num L-péptido; reciprocamente, os L-aminoácidos destroem a 63 ΡΕ1019073 estrutura helicoidal quando contidos num D-péptido). Embora estes resíduos de aminoácidos que quebram a hélice recaiam nas categorias acima definidas, com a excepção de Gly (G) (discutido infra) , estes resíduos não devem ser utilizados para substituir resíduos de aminoácidos em posições internas dentro da hélice - devem ser utilizados apenas para substituir 1-3 resíduos de aminoácidos no terminal N e/ou no terminal C do péptido.

Embora as categorias acima definidas tenham sido exemplificadas em termos dos aminoácidos geneticamente codificados, as substituições de aminoácidos não necessitam de estar, e de preferência nalgumas formas de realização não estão, restringidas aos aminoácidos geneticamente codificados. De facto, muitos dos péptidos preferidos da estrutura (I) contêm aminoácidos não codificados geneticamente. Assim, para além dos aminoácidos geneticamente codificados de ocorrência natural, os resíduos de aminoácidos nos péptidos centrais da estrutura (I) podem ser substituídos por aminoácidos não codificados de ocorrência natural e aminoácidos sintéticos.

Certos aminoácidos vulgarmente encontrados que proporcionam substituições úteis para os péptidos centrais de estrutura (I) incluem, mas não se limitam a, β-alanina (β-Ala) e outros aminoácidos ómega tais como o ácido 3-aminopropiónico, ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr), ácido 4-aminobutírico e por aí adiante; ácido a-aminoisobutírico 64 ΡΕ1019073 (Aib); ácido ε-amino-hexanóico (Aha); ácido δ-aminovalérico (Ava); N-metilglicina ou sarcosina (MeGly); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); t-butilglicina (t-BuG); N-metilisoleucina (Melle); fenilglicina (Phg); ciclo-hexilalanina (Cha); norleucina (Nle); naftilalanina (Nal); 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)); 2-fluorofenilalanina (Phe(2-F)); 3-fluorofenilalanina (Phe(3-F)); 4-fluoro-fenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic); β-2-tienilala-nina (Thi); sulfóxido de metionina (MSO); homoarginina (hArg); N-acetil-lisina (AcLys); ácido 2,4-diaminobutirico (Dbu); ácido 2,3-diaminobutirico (Dab); p-aminofenilalanina (Phe(pNH2)); N-metil-valina (MeVal); homocisteina (hCys), homofenilalanina (hPhe) e homo-serina (hSer); hidroxipro-lina (Hyp), homoprolina (hPro), aminoácidos N-metilados e peptóides (glicinas N-substituidas).

As classificações dos aminoácidos geneticamente codificados e dos vulgares não codificados de acordo com as categorias definidas acima estão resumidas na TABELA III, abaixo. Deve entender-se que a TABELA III é apenas para fins ilustrativos e não tem intenção de ser uma lista exaustiva de resíduos de aminoácidos que possam ser utilizados para substituir os péptidos centrais aqui descritos. Outros resíduos de aminoácidos não mencionados especificamente aqui podem ser facilmente categorizados com base nas suas propriedades físicas e químicas observadas à luz das definições aqui proporcionadas. 65 ΡΕ1019073

TABELA III

CLASSIFICAÇÕES DOS AMINOÁCIDOS VULGARMENTE ENCONTRADOS

Classificação Geneticamente Codificados Não Geneticamente Codificados Hidrófobo Aromático F, Y, w Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe (2-F), Phe(3—F), Phe(4-F), hPhe Apoiar L, v, I, M, t-BuA, t-BuG, Melle, Nle, MeVal, G, A, P Cha, McGly, Aib Alifático A, V, L, I b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG, Melle, Cha, Nle, MeVal Hidrófilo Ácido D, E Básico H, K, R Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2), Dbu, Dab Polar c, Q, N, S, T Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer Quebra hélice p, G D-Pro e outros D-aminoácidos (em L- péptidos) Embora na maioria dos casos, os aminoácidos dos péptidos centrais de estrutura (I) sejam substituídos com aminoácidos L-enantioméricos, as substituições não estão limitadas a aminoácidos L-enantioméricos. Assim, também incluídas na definição de formas "mutadas" ou "alteradas" estão as situações onde um L-aminoácido é substituído por um D-aminoácido idêntico (e.g., L-Arg -* D-Arg) ou por um D-aminoácido da mesma categoria ou subcategoria (e.g., L-Arg -> D-Lys) , e vice-versa. De facto, em certas formas de realização preferidas que são adequadas para a administração oral a sujeitos animais, os péptidos podem ser vantajosamente compostos por pelo menos um aminoácido D-enantiomérico. Pensa-se que os péptidos contendo tais D- 66 ΡΕ1019073 aminoácidos sejam mais estáveis à degradação na cavidade oral, no estômago ou soro que os péptidos compostos exclusivamente por L-aminoácidos.

Tal como observado acima, os D-aminoácidos tendem a destruir a estrutura de hélices a quando contidos em posições internas com um L-péptido α-helicoidal. Para além disso, observou-se que certas formas mutadas dos péptidos centrais de estrutura (I) que são compostos inteiramente por D-aminoácidos exibem uma activação de LCAT significativamente mais baixa no ensaio aqui descrito que péptidos idênticos compostos inteiramente de L-aminoácidos. Como consequência, D-aminoácidos não devem ser utilizados para substituir L-aminoácidos internos; as substituições de D-aminoácidos devem estar limitadas a 1-3 resíduos de aminoácidos no terminal N e/ou no terminal C do péptido.

Tal como anteriormente discutido, o aminoácido Gly (G) actua geralmente como um resíduo de quebra da hélice quando contido em posições internas de um péptido. Muito surpreendentemente, os requerentes descobriram que embora a estrutura helicoidal dos péptidos centrais do invento seja destruída na ausência de lípidos quando os resíduos de aminoácidos internos são substituídos com Gly (G) , na presença de lípidos tais péptidos contendo Gly (G) exibem uma estrutura helicoidal significativa bem como actividade. Por exemplo, enquanto o péptido 8 (SEQ ID NO:8) exibe uma estrutura apenas 20% helicoidal em tampão, uma estrutura 61-93% helicoidal foi observada na presença de 67 ΡΕ1019073 lípidos e foi observada uma helicidade de 93% na presença de tri-fluoroetanol (TFE). A estrutura helicoidal deste péptido na presença de TFE foi confirmada através de RMN (ver, Secção 7.3.5, infra). Notavelmente, este péptido exibiu também uma activação de LCAT de 83%. Outros péptidos centrais contendo resíduos internos de glicina exibiram também uma activação de LCAT >38% (ver, e.g., a TABELA X, Secção 8.3, infra). Assim, embora Gly (G) seja geralmente considerado como sendo um resíduo de quebra da hélice, Gly (G) pode ser utilizado para substituir aminoácidos em posições internas dos péptidos centrais de estrutura (I) . De preferência, apenas resíduos internos posicionados dentro de cerca de ± 1 volta da hélice do centro do péptido (particularmente para péptidos compostos por um número par de aminoácidos) são substituídos com Gly (G) . Adicionalmente, é preferido que apenas um resíduo de aminoácido interno no péptido seja substituído com Gly (G). As formas de realização preferidas dos agonistas de ApoA-I do invento contendo glicinas internas estão descritas na Secção 5.1.2, infra.

Utilizando as classificações dos resíduos de aminoácidos descritas acima em conjunto com as apresentações em diagrama de roda helicoidal de Schiffer-Edmundson e de rede helicoidal dos péptidos centrais de estrutura (I) , bem como a descrição detalhada das propriedades desejadas aqui proporcionadas, formas alteradas ou mutadas dos péptidos centrais de estrutura (I) que mantenham substancialmente as propriedades anfipáticas e outras da 68 ΡΕ1019073 hélice, e que sejam portanto consideradas como estando dentro do âmbito do presente invento, podem ser facilmente obtidas.

Numa forma de realização preferida do invento, as formas alteradas ou mutadas dos péptidos centrais de estrutura (I) são obtidas fixando os resíduos hidrófilos ou hidrófobos de acordo com a estrutura (I) e substituindo pelo menos um resíduo não fixado por outro aminoácido, de preferência por outro aminoácido da mesma categoria ou subcategoria. Os resíduos compondo os agrupamentos básicos e/ou hidrófobos podem também ser fixados e pelo menos um resíduo não fixado substituído.

Noutra forma de realização preferida, formas alteradas ou mutadas dos péptidos centrais de estrutura (I) são obtidas fixando os resíduos de aminoácidos hidrófilos posicionados dentro da face hidrófila da hélice de acordo com a estrutura (I) e substituindo pelo menos um resíduo de aminoácido não fixado por outro aminoácido, de preferência por outro resíduo de aminoácido da mesma categoria ou subcategoria. Em relação à FIG. 2A, pode observar-se que os resíduos 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 e 22 estão posicionados dentro da face hidrófila da hélice anfipática formada pelos péptidos centrais de estrutura (I) . Destes resíduos, todos são hidrófilos excepto quanto ao resíduo 1, que pode ser hidrófilo ou hidrófobo. Assim, numa forma de realização preferida, os resíduos 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 e 22 são fixados de acordo com a estrutura (I) e pelo 69 ΡΕ1019073 menos um dos resíduos 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 e 21 é substituído por outro aminoácido da mesma categoria, de preferência por outro aminoácido da mesma subcategoria. Alternativamente, o resíduo 1 é também fixado de acordo com a estrutura (I) e pelo menos um dos resíduos 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 e 21 é substituído tal como descrito.

Numa forma de realização particularmente preferida, o agrupamento básico C-terminal (resíduos 18, 19, 20 e 22) é também fixado de acordo com a estrutura (I), e apenas os resíduos 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17 e/ou 21 são substituídos.

Noutra forma de realização particularmente preferida, o agrupamento hidrófobo é também fixado, e apenas os resíduos 2, 5, 13, 14, 16, 17, 20 e/ou 21 são substituídos.

Ainda noutra forma de realização particularmente preferida, ambos os agrupamentos básico e hidrófobo são fixados e apenas os resíduos 2, 5, 13, 14, 16, 17 e/ou 21 são substituídos.

Noutra forma de realização preferida do invento, formas alteradas ou mutadas dos péptidos centrais do invento são obtidas através de fixação dos resíduos de aminoácidos hidrófobos posicionados dentro da face hidrófoba da hélice e da substituição de pelo menos um 70 ΡΕ1019073 resíduo de aminoácido não fixado por outro resíduo de aminoácido, de preferência por outro resíduo da mesma categoria ou subcategoria.

Em relação à Fig. 2A, pode observar-se que os resíduos 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 e 21 estão posicionados dentro da face hidrófoba. Destes, todos são hidrófobos excepto quanto ao resíduo 20, que é hidrófilo. Assim, numa forma de realização preferida os resíduos 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17 e 21 são fixados de acordo com a estrutura (I) e pelo menos um dos resíduos 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19, 20 e 22 é substituído por outro resíduo de aminoácido, de preferência por outro aminoácido da mesma categoria ou subcategoria.

Numa forma de realização particularmente preferida, o agrupamento básico C-terminal é também fixado e apenas os resíduos 1, 4, 7, 8, 11, 12 e/ou 15 são substituídos.

Noutra forma de realização, são obtidas formas alteradas ou mutadas dos péptidos de estrutura (I) fixando todos os resíduos de aminoácidos residentes dentro da face hidrófoba ou hidrófila da hélice e substituindo, de preferência de modo conservativo, pelo menos um resíduo de aminoácido residente na outra face por outro resíduo de aminoácido. Os resíduos que constituem o agrupamento hidrófobo e/ou o agrupamento básico podem também ser opcionalmente fixados de acordo com a estrutura (I), tal como previamente definido. 71 ΡΕ1019073

Noutra forma de realização do invento, são obtidas formas alteradas ou mutadas da estrutura (I) substituindo pelo menos um aminoácido por um aminoácido não conservativo. Os peritos na arte reconhecerão que tais substituições não devem alterar substancialmente as propriedades antipáticas e/ou estruturais da hélice discutidas supra. Assim, em certos casos pode ser desejável substituir um ou mais pares de aminoácidos de modo a conservar as propriedades liquidas da hélice. Mais orientações para selecção das substituições de aminoácidos apropriadas são proporcionadas pelas sequências peptidicas da TABELA X (ver, Secção 8.3, infra).

Ainda noutra forma de realização do invento, os primeiros um a quatro residuos de aminoácidos no terminal N e/ou no terminal C dos péptidos centrais de estrutura (I) são substituídos por um ou mais resíduos de aminoácidos, ou um ou mais segmentos peptídicos, que se sabe conferirem estabilidade às regiões de estrutura secundária da hélice α (resíduos ou segmentos "de fecho da extremidade"). Tais resíduos e segmentos de fecho da extremidade são bem conhecidos na arte (ver, e.g., Richardson e Richardson, Science 240: 1648-1652, 1988; Harper et al.r Bíochemístry 32(30): 7605-7609, 1993; Dasgupta e Bell, Int. J. Peptide Protein Res. 41: 499-511, 1993; Seale et al., Protein Science 3: 1741-1745, 1994; Doig et al., Biochemistry 33: 3396-3403, 1994; Zhou et al., Proteins 18: 1-7, 1994; Doig e Baldwin, Protein Science 4: 1325-1336, 1995; Odaert et 72 ΡΕ1019073 al., Biochemistry 34: 12820-12829, 1995; Petrukhov et al., Bíochemistry 35: 387-397, 1996; Doig et al., Protein Science 6: 147-155, 1997). Alternativamente, os primeiros um a quatro resíduos de aminoácidos N-terminais e/ou exterminais da estrutura (I) podem ser substituídos por porções peptidomiméticas que imitam a estrutura e/ou as propriedades dos resíduos ou segmentos de fecho da extremidade. Os imitadores de fechos da extremidade são bem conhecidos na arte e estão descritos, por exemplo, em Richardson e Richardson, Science 240: 1648-1652, 1988; Harper et al., Biochemistry 32(30): 7605-7609, 1993; Dasgupta e Bell, Int. J. Peptide Protein Res. 41: 499-511, 1993; Seale et al., Protein Science 3: 1741-1745, 1994; Doig et al., Biochemistry 33: 3396-3403, 1994; Zhou et al., Proteins 18: 1-7, 1994; Doig e Baldwin, Protein Science 4: 1325-1336, 1995; Odaert et al., Biochemistry 34: 12820-12829, 1995; Petrukhov et al., Biochemistry 35: 387-397, 1996; Doig et al., Protein Science 6: 147-155, 1997).

Embora a estrutura (I) contenha 22 posições de resíduos de aminoácidos especificadas, deve entender-se que os péptidos centrais do invento podem conter menos de 22 resíduos de aminoácidos. De facto, formas truncadas ou internamente suprimidas da estrutura (I) contendo apenas 18 ou mesmo 15 resíduos de aminoácidos que mantenham substancialmente as características e as propriedades globais da hélice anfipática formada pelos péptidos centrais de estrutura (I) são consideradas como estando dentro do âmbito do presente invento. 73 ΡΕ1019073

As formas truncadas dos péptidos de estrutura (I) são obtidas através da supressão de um ou mais aminoácidos do terminal N e/ou do terminal C da estrutura (I) . As formas suprimidas internamente da estrutura (I) são obtidas através da deleção de um ou mais aminoácidos de posições internas dentro do péptido de estrutura (I). Os resíduos de aminoácidos internos suprimidos podem ser ou não resíduos consecutivos.

Os peritos na arte reconhecerão que a supressão de um resíduo de aminoácido interno de um péptido central de estrutura (I) fará com que o plano da interface hidrófila-hidrófoba da hélice rode 100° no ponto da deleção. Como tais rotações podem alterar significativamente as propriedades anfipáticas da hélice resultante, numa forma de realização preferida do invento os resíduos de aminoácidos são suprimidos de modo a manter substancialmente o alinhamento do plano da interface hidrófila-hidrófoba ao longo de todo o eixo comprido da hélice.

Isto pode ser convenientemente alcançado através da deleção de um número suficiente de resíduos de aminoácidos consecutivos ou não consecutivos de modo a que seja suprimida uma volta helicoidal completa. Uma hélice α idealizada contém 3,6 resíduos por volta. Assim, numa forma de realização preferida, são suprimidos grupos de 3-4 resíduos de aminoácidos consecutivos ou não consecutivos. Se são suprimidos 3 aminoácidos ou 4 aminoácidos dependerá 74 ΡΕ1019073 da posição dentro da hélice do primeiro resíduo a suprimir. A determinação do número apropriado de resíduos de aminoácidos consecutivos ou não consecutivos que constitui uma volta helicoidal completa a partir de qualquer ponto de partida particular dentro de uma hélice antipática está bem dentro das capacidades dos peritos na arte.

Devido à suposta importância do agrupamento básico no terminal C dos péptidos centrais da estrutura (I) na estabilização da hélice e à importância do agrupamento hidrófobo na realização da ligação a lípidos e activação de LCAT, em formas de realização preferidas do invento, os resíduos compreendendo os agrupamentos básico e hidrófobo não são suprimidos. Assim, em formas de realização preferidas, os resíduos 18, 19, 20 e 22 (agrupamento básico) e os resíduos 3, 6, 9 e 10 (agrupamento hidrófobo) não são suprimidos.

Os péptidos centrais de estrutura (I) podem também ser prolongados num ou em ambos os terminais ou internamente com resíduos de aminoácidos adicionais que não interfiram substancialmente com, e nalgumas formas de realização até estimulem, as propriedades estruturais e/ou funcionais dos péptidos. De facto, os péptidos centrais prolongados contendo tantos quanto 23, 25, 26, 29 ou até mais resíduos de aminoácidos são considerados como estando dentro do âmbito do presente invento. De preferência, tais péptidos prolongados manterão substancialmente a anfipa-ticidade líquida e outras propriedades dos péptidos de 75 ΡΕ1019073 estrutura (I) . Claro que, será reconhecido que a adição de aminoácidos internamente rodará o plano da interface hidrófoba-hidrófila no ponto de inserção de um modo semelhante ao descrito acima para deleções internas. Assim, as considerações discutidas acima em conjunto com as deleções internas aplicam-se também a adições internas.

Numa forma de realização, os péptidos centrais são prolongados no terminal N e/ou no terminal C em pelo menos uma volta helicoidal. De preferência, tais prolongamentos estabilizarão a estrutura secundária da hélice na presença de lipidos, tais como os aminoácidos e segmentos de fecho da extremidade anteriormente descritos.

Numa forma de realização particularmente preferida, o péptido central de estrutura (I) é prolongado no terminal C por um único residuo de aminoácido básico, de preferência Lys (K) . Quando é prolongado deste modo, Xi é de preferência D- -Pro (p) ou Gly (G) ; X2 é de preferência Vai (V); X3 é de preferência Leu (L); X4 é de preferência Asp (D); X5 é de preferência Leu (L); X6 é de preferência Phe (F); X7 é de preferência Arg (R); X9 é de preferência Glu (E); X9 é de preferência Leu (L) ; X10 é de preferência Leu (L) ; X11 é de preferência Asn (N); X12 é de preferência Glu (E); X13 é de preferência Leu (L); X14 é de preferência Leu (L); X15 é de preferência Glu (E); Xie é de preferência Ala (A); X17 é de preferência Leu (L); Xi8 é de preferência Lys (K); X19 é de preferência Gin (Q); X20 é de preferência (L) e/ou X22 é de

Lys (K); X2i é de preferência Leu preferência Lys (K). 76 ΡΕ1019073

Também incluído dentro do âmbito do presente invento estão as formas "bloqueadas" do agonista de ApoA-I, i.e., formas dos agonistas de ApoA-I nas quais o terminal N e/ou o terminal C está bloqueado com uma porção capaz de reagir com ο -NH2 N-terminal ou o -C(0)0H C-terminal. Descobriu-se que a remoção das cargas N-terminais e/ou C-terminais dos agonistas de ApoA-I do invento contendo 18 ou menos resíduos de aminoácidos (através da síntese de amidas/ésteres/hidrazidas/álcoois de péptidos N-acetilados) resulta em agonistas que se aproximam e nalgumas formas de realização até excedem, a actividade da forma não bloqueada do agonista. Nalgumas formas de realização contendo 22 ou mais aminoácidos, o bloqueio do terminal N ou do terminal C resulta em agonistas de ApoA-I que exibem uma actividade inferior às formas não bloqueadas. No entanto, espera-se que o bloqueio de ambos os terminais N e C dos agonistas de ApoA-I compostos por 22 ou mais aminoácidos restaure a actividade. Assim, numa forma de realização preferida do invento, é bloqueado o terminal N e/ou o terminal C (de preferência ambos os terminais) dos péptidos centrais contendo 18 ou menos aminoácidos, enquanto os terminais N e o C de péptidos contendo 22 ou mais aminoácidos são ambos bloqueados ou ambos não bloqueados. Grupos típicos de bloqueio do terminal N incluem RC(O)-, onde R é -H, alquilo (Ci-C5) , alcenilo (Ci-C6) , alcinilo (Ci—C6) r arilo (C5-C20) r alcarilo (C6-C26) t heteroarilo com 5-20 membros ou alceteroarilo com 6-26 membros. Os grupos de bloqueio do terminal N preferidos incluem o acetilo, formilo e dansilo. 77 ΡΕ1019073

Grupos de bloqueio do terminal C típicos incluem, C(0)NRR e -C(0)0R, onde cada R é independentemente definido como acima. Os grupos de bloqueio do terminal C preferidos incluem aqueles onde cada R é independentemente metilo. Embora não se pretenda ficar ligado a qualquer teoria particular, crê-se que tais grupos de bloqueio dos terminais estabilizem a hélice α na presença de lípidos (ver, e.g., Venkatachelapathi et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 15: 349-359, 1993). A estrutura nativa de ApoA-I contém oito unidades helicoidais que se pensa actuarem em conjunto para se ligarem a lípidos (Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092, 1985; Anantharamaiah et al., J. Blol. Chem. 260: 10248-10262, 1985; Vanloo et al., J. Lipid Res. 32: 1253-1264, 1991; Mendez et al., J. Clin. Invest. 94: 1698-1705, 1994; Palgunari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16: 328-338, 1996; Demoor et al., Eur. J. Biochem. 239: 74-84, 1996). Assim, estão também incluídos no presente invento os agonistas de ApoA-I constituídos por dímeros, trímeros, tetrâmeros e até polímeros de ordem superior ("multímeros") dos péptidos centrais aqui descritos. Tais multímeros podem estar na forma de repetições em cadeia, redes ramificadas ou combinações destas. Os péptidos centrais podem ser ligados directamente uns aos outros ou separados por um ou mais ligadores.

Os péptidos centrais que compreendem os multímeros podem ser os péptidos de estrutura (I), análogos da 78 ΡΕ1019073 estrutura (I), formas mutadas da estrutura (I), formas truncadas ou internamente suprimidas da estrutura (I), formas prolongadas da estrutura (I) e/ou combinações destas. Os péptidos centrais podem ser ligados de um modo cabeça com cauda (í.e., terminal N com terminal C), um modo cabeça com cabeça (í.e., terminal N com terminal N) , um modo cauda com cauda (í.e., terminal C com terminal C), ou combinações destes.

Numa forma de realização do invento, os multimeros são repetições em cadeia de dois, três, quatro e até cerca de dez péptidos centrais. De preferência, os multimeros são repetições em cadeia de 2 a 8 péptidos centrais. Assim, numa forma de realização, os agonistas de ApoA-I do invento compreendem multimeros possuindo a seguinte fórmula estrutural:

(II) HH-[LLm-HH]-nLLm-HH em que: cada m é independentemente um número inteiro de 0 a 1, de preferência 1; n é um número inteiro de 0 a 10, de preferência de 0 a 8; cada "HH" representa independentemente um péptido central ou análogo peptídico de estrutura (I) ou uma forma mutada, truncada, internamente suprimida ou prolongada deste tal como aqui descrito; cada "LL" representa independentemente um ligador; e 79 ΡΕ1019073 cada designa independentemente uma ligação covalente.

Na estrutura (II), o ligador LL pode ser qualquer molécula bifuncional capaz de ligar covalentemente dois péptidos um ao outro. Assim, ligadores adequados são moléculas bifuncionais nas quais os grupos funcionais são capazes de ser covalentemente ligados ao terminal N e/ou ao terminal C de um péptido. Grupos funcionais adequados para ligação ao terminal N ou C dos péptidos são bem conhecidos na arte, tal como o são as químicas adequadas para efectuar tal formação de ligação covalente. 0 ligador pode ser flexível, rígido ou semi-rígido, dependendo das propriedades desejadas do multímero. Ligadores adequados incluem, por exemplo, resíduos de aminoácidos tais como Pro ou Gly ou segmentos peptídicos contendo de cerca de 2 a cerca de 5, 10, 15 ou 20 ou até mais aminoácidos, compostos orgânicos bifuncionais tais como H2N (CH2) nCOOH onde n é um número inteiro de 1 a 12, e semelhantes. Exemplos de tais ligadores, bem como os métodos de produzir tais ligadores e péptidos incorporando tais ligadores são bem conhecidos a arte (ver, e.g., Hunig et al., Chem. Ber. 100: 3039-3044, 1974; Basak et al., Bíoconjug. Chem. 5(4): 301-305, 1994).

Numa forma de realização preferida do invento, as repetições em cadeia são pontuadas internamente por um único resíduo de prolina. Para este fim, nas circunstâncias 80 ΡΕ1019073 em que os péptidos centrais são terminados no seu terminal N ou C com prolina, tal como, e.g., onde Xi na estrutura (I) é Pro (P) ou D-Pro (p) , m na estrutura (II) é de preferência 0. Nos casos em que os péptidos centrais não contêm uma prolina N-terminal ou C-terminal, LL é de preferência Pro (P) ou D-Pro (p) e m é de preferência 1.

Em certas formas de realização do invento pode ser desejável empregar ligadores cliváveis que permitam a libertação de um ou mais segmentos helicoidais (HH) sob certas condições. Ligadores cliváveis adequados incluem péptidos possuindo sequências de aminoácidos que são reconhecidas por proteases, oligonucleótidos que são clivados por endonucleases e compostos orgânicos que podem ser clivados através de meios químicos, tais como sob condições ácidas, básicas ou outras. De preferência, as condições de clivagem serão relativamente suaves de modo a não desnaturar ou de outro modo degradar os segmentos helicoidais e/ou os ligadores não clivados que compõem os agonistas multiméricos de ApoA-I.

Os ligadores peptídicos e oligonucleotídicos que podem ser selectivamente clivados, bem como os meios para clivagem dos ligadores são bem conhecidos e serão facilmente aparentes para os peritos na arte. Ligadores de compostos orgânicos adequados que podem ser selectivamente clivados serão aparentes para os peritos na arte e incluem os descritos, por exemplo, em WO 94/08051, bem como as referências aí citadas. 81 ΡΕ1019073

Numa forma de realização preferida, os ligadores empregues são péptidos que são substratos para enzimas endógenas em circulação, permitindo deste modo que os agonistas multiméricos de ApoA-I sejam selectivamente clivados in vivo. Enzimas endógenas adequadas para clivar os ligadores incluem, por exemplo, a proapolipoproteína-A-I-propeptidase. As enzimas apropriadas, bem como os segmentos peptidicos que actuam como substratos de tais enzimas, são bem conhecidas na arte (ver, e.g., Edelstein et al., J. Biol. Chem. 258: 11430-11433, 1983; Zanis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 2574-2578, 1983).

Tal como discutido acima, uma caracteristica chave dos péptidos centrais do invento é a sua capacidade para formar ligações de hidrogénio ou pontes salinas intermoleculares quando dispostos de um modo anti-paralelo. Assim, numa forma de realização preferida do invento, são utilizados ligadores de comprimento e flexibilidade suficientes de modo a permitir que os segmentos helicoidais (HH) da estrutura (II) se alinhem de um modo anti-paralelo e formem ligações de hidrogénio ou pontes salinas intermoleculares na presença de lipidos.

Ligadores de comprimento e flexibilidade suficientes incluem, mas não se limitam a, Pro (P), Gly (G), Cys-Cys, H2N-(CH2)n-COOH onde n é de 1 a 12, de preferência de 4 a 6; H2N-aril-COOH e hidratos de carbono. 82 ΡΕ1019073

Alternativamente, como as apolipoproteínas nativas permitem a ligação cooperativa entre segmentos helicoidais anti-paralelos, ligadores peptidicos que correspondam na sequência primária aos segmentos peptidicos ligando hélices adjacentes das apolipoproteínas nativas, incluindo, por exemplo, ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE e ApoJ podem ser convenientemente utilizados para ligar os péptidos centrais. Estas sequências são bem conhecidas na arte (ver, e.g., Rosseneu et al., "Analysis of the Primary and of the Secondary Structure of the Apolipoproteins", Em: Structure and Function of Lipoproteins, Cap. 6: 159-183, CRC Press, Inc., 1992) .

Outros ligadores que permitem a formação de ligações de hidrogénio ou pontes salinas intermoleculares entre repetições em cadeia de segmentos helicoidais anti-paralelos incluem voltas peptídicas inversas tais como voltas β e voltas γ, bem como moléculas orgânicas que imitem as estruturas de voltas β e/ou voltas γ peptídicas. Geralmente, as voltas inversas são segmentos de péptidos que invertem a direcção da cadeia polipeptídica de modo a permitir que uma única cadeia polipeptídica adopte regiões de estrutura de folha β anti-paralela ou de hélice α anti-paralela. As voltas β são geralmente compostas por quatro resíduos de aminoácidos e as voltas γ são geralmente compostas por três resíduos de aminoácidos.

As conformações e sequências de muitas voltas β 83 ΡΕ1019073 peptídicas foram bem descritas na arte e incluem, como exemplo e não como limitação, tipo-I, tipo-I', tipo-II, tipo-II', tipo-III, tipo-III', tipo-IV, tipo-V, tipo-V, tipo-VIa, tipo-VIb, tipo-VII e tipo-VIII (ver, Richardson,

Adv. Protein Chem. 34: 167-339, 1981; Rose et al., Adv Protein Chem. 37: 1-109, 1985; Wilmot et al., J. Mol. Biol 203: 221-232, 1988; Sibanda et al., J. Mol. Biol. 206: 759— 777, 1989; Tramontano et al., Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382-394, 1989) .

As conformações especificas de voltas peptídicas curtas tais como voltas β dependem primeiramente das posições de certos resíduos de aminoácidos na volta (habitualmente Gly, Asn ou Pro) . Geralmente, a volta β de tipo-I é compatível com qualquer resíduo de aminoácido nas posições 1 a 4 da volta, excepto que Pro não pode ocorrer na posição 3. Gly predomina na posição 4 e Pro predomina na posição 2 de voltas tanto de tipo-I como de tipo-II. Os resíduos Asp, Asn, Ser e Cys ocorrem frequentemente na posição 1, onde as suas cadeias laterais se ligam frequentemente por hidrogénio ao NH do resíduo 3.

Em voltas de tipo-II, Gly e Asn ocorrem muito frequentemente na posição 3, uma vez que adoptam muito facilmente os ângulos do esqueleto necessários. Idealmente, as voltas de tipo-I' têm Gly nas posições 2 e 3, e as voltas de tipo-II' têm Gly na posição 2. As voltas de tipo-III podem geralmente ter a maioria dos resíduos de aminoácidos, mas as voltas de tipo-III' necessitam 84 ΡΕ1019073 habitualmente de Gly nas posições 2 e 3. As voltas de tipo-Vla e VIb têm geralmente uma ligação peptídica eis e Pro como residuo interno. Para uma revisão dos diferentes tipos e sequências de voltas β em proteínas e péptidos o leitor é remetido para Wilmot et al., J. Mol. Biol. 203: 221-232, 1988. A conformação e as sequências de muitas voltas peptidicas γ foram também muito bem descritas na arte (ver, e.g., Rose et al., Adv. Protein Chem. 37: 1-109, 1985;

Wilmer-White et al., Trends Blochem. Sei . 12: 189-192, 1987; Wilmot et al., J. Mol . Biol. 203: 221-232, 1988; Sibanda et al. , J. Mol. Biol. 206: 759-777, 1989; Tramontano et al ., Proteins: , Struct. Funct. Genet. 6: 382- 394, 1989). Todos estes tipos de estruturas de voltas β e voltas γ e suas sequências correspondentes, bem como as estruturas e sequências de voltas β e voltas γ peptidicas descobertas depois, estão especificamente contempladas pelo invento.

Alternativamente, o ligador (LL) pode compreender uma molécula orgânica ou porção que imite a estrutura de uma volta peptídica β ou γ. Tais porções imitadoras de volta β e/ou volta γ, bem como os métodos para a síntese de péptidos contendo tais porções, são bem conhecidos na arte e incluem, entre outros, os descritos em Giannis e Kolter, Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 32: 1244-1267, 1993; Kahn et al., J. Molecular Recognítíon 1: 75-79, 1988; e Kahn et al., Tetrahedron Lett. 28: 1623-1626, 1987. 85 ΡΕ1019073

Ainda noutra forma de realização do invento, os multimeros estão na forma de redes ramificadas (ver, e.g., FIG. 7) . Tais redes são convenientemente obtidas através da utilização de porções de ligação multifuncionais que permitem que mais de duas unidades helicoidais sejam unidas a uma única porção de ligação. Assim, as redes ramificadas empregam moléculas possuindo três, quatro ou até mais grupos funcionais que são capazes de se unir covalentemente ao terminal N e/ou C de um péptido. Porções de ligação adequadas incluem, por exemplo, resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais possuindo funcionalidades de hidroxilo, sulfanilo, amino, carboxilo, amida e/ou éster, tais como, por exemplo, Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N), Gin (Q), Lys (K), Arg (R), Orn, Asp (D) e Glu (E); ou outras moléculas orgânicas contendo tais grupos funcionais.

Os segmentos helicoidais ligados a uma única porção de ligação não necessitam de ser unidos através de terminais semelhantes. De facto, nalgumas formas de realização os segmentos helicoidais são unidos a uma única porção de ligação de modo a ficarem dispostos de um modo anti-paralelo, i.e., algumas das hélices são unidas através dos seus terminais N, outras através dos seus terminais C.

Os segmentos helicoidais podem ser unidos directamente à porção de ligação ou podem ser espaçados a partir da porção de ligação por meio de um ou mais 86 ΡΕ1019073 ligadores bifuncionais (LL), tal como anteriormente descrito.

Em relação às FIGS. 7A e 7B, pode observar-se que uma rede ramificada pode ser descrita em termos do número de "nós" que constituem a rede, em que cada porção de ligação multifuncional constitui um nó. Nas FIGS. 7A e 7B, os segmentos helicoidais (í.e., os péptidos centrais do invento) estão ilustrados como cilindros e as porções de ligação multifuncionais (ou nós) como círculos (·), onde o número de linhas que emanam do círculo indica a "ordem" (ou número de grupos funcionais) da porção de ligação multifuncional. 0 número de nós na rede será dependerá geralmente do número total desejado de segmentos helicoidais e será tipicamente de cerca de 1 a 2. Claro que, será apreciado que para um dado número de segmentos helicoidais desejados, redes possuindo porções de ligação de ordem superior terão menos nós. Por exemplo, em relação às FIGS. 7A e 7B, uma rede de ordem terciária (í.e., uma rede possuindo porções de ligação trifuncionais) de sete unidades helicoidais tem três nós (FIG. 7A), enquanto uma rede de ordem quaternária (í.e., uma rede possuindo porções de ligação tetrafun-cionais) de sete unidades helicoidais tem apenas dois nós (FIG. 7B) .

As redes podem ser de ordem uniforme, í.e., redes nas quais todos os nós são, por exemplo, porções de ligação 87 ΡΕ1019073 trifuncionais ou tetrafuncionais ou podem ser de ordem mista, e.g., redes nas quais os nós são misturas de, por exemplo, porções de ligação trifuncionais e tetrafuncionais. Claro que, deve entender-se que mesmo em redes de ordem uniforme as porções de ligação não necessitam de ser idênticas. Uma rede de ordem terciária pode empregar, por exemplo, duas, três, quatro ou mesmo mais porções de ligação trifuncionais diferentes.

Tal como os multimeros lineares, os segmentos helicoidais compreendendo a rede ramificada podem ser, mas não necessitam de ser, idênticos.

Um exemplo de uma tal rede ramificada de ordem mista está ilustrado na FIG. 7C. Na FIG. 7C, os segmentos helicoidais (í.e., os péptidos centrais do invento) estão ilustrados como cilindros e as porções de ligação multifuncionais como círculos (·), onde o n° de linhas que emana do círculo indica a "ordem" (ou o número de grupos funcionais) da porção de ligação multifuncional. As linhas que ligam os segmentos helicoidais representam ligadores bifuncionais LL, tal como anteriormente descrito. Os segmentos helicoidais que compreendem as redes ramificadas podem ser repetições em cadeia de péptidos centrais, tal como anteriormente descrito.

Numa forma de realização ilustrativa, as redes ramificadas do invento são descritas pela fórmula: ΡΕ1019073 88 (III) X Nya X(ya-l) (Nyb X(yb-l))p em que: cada X é independentemente HH (LLm-HH) nLLm-HH; cada HH é independentemente um péptido central de estrutura (I) ou um análogo ou forma mutada, truncada, internamente suprimida ou prolongada deste tal como aqui descrito; cada LL é independentemente um ligador bifuncional; cada m é independentemente um número inteiro de 0 a 1; cada n é independentemente um número inteiro de 0 a 8;

Nya e Nyb são cada um, independentemente, uma porção de ligação multifuncional onde ya e yb representam o número de grupos funcionais em Nya e Nyb, respectivamente; cada ya ou yb é independentemente um número inteiro de 3 a 8; p é um número inteiro de 0 a 7; e cada designa independentemente uma ligação covalente.

Numa forma de realização preferida, a rede ramificada compreende uma "árvore de Lys", i.e., uma rede em que a porção de ligação multifuncional é um ou mais residuos Lys (K) (ver, e.g., FIG. 7D).

Numa forma de realização ilustrativa, as redes ramificadas de "árvore de Lys" do invento são descritas pelas fórmulas: 89 ΡΕ1019073 χ

ou em que: cada X é independentemente HH(LLm-HH)nLLm-HH; cada HH é independentemente um péptido central ou um análogo peptídico de estrutura (I) ou uma forma mutada, truncada, internamente suprimida ou prolongada deste tal como aqui descrito; cada LL é independentemente um ligador bifuncional; cada n é independentemente um número inteiro de 0 a 8; cada m é independentemente um número inteiro de 0 a 1; Ri é -0R OU -NRR; e cada R é independentemente -H, alquilo (Ci-Ce), alcenilo (Ci-C6), alcinilo (Ci-Cê) ; arilo (C5-C2o), alcarilo (C6-C26) , heteroarilo com 5-20 membros ou alceteroarilo com 6-26 membros.

5.1.1. ANÁLISE DA ESTRUTURA E FUNÇÃO A estrutura e função dos péptidos centrais ou dos 90 ΡΕ1019073 análogos peptídicos do invento, bem como dos agonistas de ApoA-I compostos por tais péptidos centrais, incluindo as formas multiméricas descritas acima, podem ser ensaiadas para seleccionar agonistas activos ou imitadores de ApoA-I. Por exemplo, os péptidos centrais ou análogos peptídicos podem ser ensaiados quanto à sua capacidade para formarem hélices α na presença de lípidos, para se ligarem a lípi-dos, para formarem complexos com lípidos, para activarem LCAT, para promoverem efluxo de colesterol, etc.

Os métodos e ensaios para análise da estrutura e/ou função dos péptidos são bem conhecidos na arte. Os métodos preferidos são proporcionados nos exemplos de trabalho, infra. Por exemplo, os ensaios de dicroísmo circular (DC) e de ressonância magnética nuclear (RMN) descritos na Secção 7, infra, podem ser utilizados para analisar a estrutura dos péptidos ou análogos peptídicos -particularmente o grau de helicidade na presença de lípidos. A capacidade para se ligarem a lípidos pode ser determinada utilizando o ensaio de espectroscopia de fluorescência descrito na Secção 7, infra. A capacidade dos péptidos e/ou dos análogos peptídicos para activarem LCAT pode ser facilmente determinada utilizando a activação de LCAT descrita na Secção 8, infra. Os ensaios in vitro e in vivo descritos na Secção 9, 10 e 11, infra, podem ser utilizados para avaliar a semi-vida, distribuição, efluxo de colesterol e efeitos no TIC.

Geralmente, os péptidos centrais e/ou os análogos 91 ΡΕ1019073 peptídicos de acordo com o invento que exibem as propriedades listadas na TABELA IV, infra, são considerados como sendo activos.

TABELA IV PROPRIEDADES DOS PÉPTIDOS ACTIVOS Gama Gama Preferida % de helicidade na presença de lípidos (Ri=30) >60% >80% (péptidos de 22 resíduos de aminoácidos não bloqueados) % de helicidade na presença de lípidos (Ri=30) >40% >60% (péptidos de 18 resíduos de aminoácidos não bloqueados) % de helicidade na presença de lípidos (Ri=30) >60% >80% (péptidos de 18 resíduos de aminoácidos e péptidos mais curtos bloqueados) Ligação a lípidos (na presença de SUVs) 0,5-10 pM Ri=l-50 Activação de LCAT >38% >80% Ri é a razão molar lípido:péptido

Tal como ilustrado nos exemplos operativos, infra, os péptidos centrais que exibem uma elevado grau de activação de LCAT (>38%) possuem geralmente uma estrutura em hélice α significativa na presença de pequenas vesículas lipídicas unilamelares (SUVs) (>60% da estrutura helicoidal no caso de péptidos não bloqueados contendo 22 ou mais resíduos de aminoácidos e péptidos bloqueados contendo 18 ou menos resíduos de aminoácidos; >40% da estrutura helicoidal no caso de péptidos não bloqueados contendo 18 92 ΡΕ1019073 ou menos resíduos de aminoácidos) e aqueles péptidos que exibem pouca ou nenhuma activação de LCAT possuem pouca estrutura em hélice a. No entanto, em certos casos, os péptidos que exibem uma estrutura helicoidal significativa na presença de lípidos não efectuam uma LCAT significativa.

De modo semelhante, enquanto os péptidos centrais que exibem uma activação de LCAT significativa se ligam tipicamente a lípidos, em certos casos os péptidos que exibem ligação a lípidos não efectuam uma activação de LCAT significativa.

Como consequência, será reconhecido pelos peritos na arte que embora a capacidade dos péptidos centrais aqui descritos para formarem hélices α (na presença de lípidos) e para se ligarem a lípidos seja crítica para a actividade, em muitos casos estas propriedades podem não ser suficientes. Assim, numa forma de realização preferida os péptidos centrais do invento são sujeitos a uma série de pesquisas para seleccionar péptidos centrais exibindo uma actividade farmacológica significativa.

Num primeiro passo, um péptido central é pesquisado quanto à sua capacidade para formar uma hélice α na presença de lípidos utilizando o ensaio de DC descrito na Secção 7, infra. Esses péptidos que são pelo menos 40% helicoidais (péptidos não bloqueados contendo 18 ou menos resíduos de aminoácidos) ou 60% helicoidais (péptidos bloqueados contendo 18 ou menos resíduos de aminoácidos; 93 ΡΕ1019073 péptidos não bloqueados contendo 22 ou mais resíduos de aminoácidos) na presença de lípidos (a uma conc. de cerca de 5 μΜ e uma razão molar lípido :péptido de cerca de 30) são então pesquisados quanto à sua capacidade para se ligarem a lípidos utilizando o ensaio de fluorescência descrito na Secção 7, infra. Claro que apenas os péptidos centrais que contêm um resíduo Trp (W) ou Nal fluorescente são pesquisados quanto à ligação a lípidos através da fluorescência. No entanto, para os péptidos que não contêm resíduos fluorescentes, a ligação a lípidos é óbvia quando a helicidade aumenta na presença de lípidos.

Os péptidos centrais que exibem ligação a péptidos na presença de SUVs (péptido a 0,5-10 μΜ; razão molar lípido: péptido no intervalo de 1 a 50) são então pesquisados quanto à actividade farmacológica. Claro que a actividade farmacológica pesquisada dependerá da utilização desejada dos agonistas de ApoA-I. Numa forma de realização preferida, os péptidos centrais são pesquisados quanto à sua capacidade para activarem LCAT, uma vez que os péptidos que activam LCAT são particularmente úteis nos métodos aqui descritos. Os péptidos centrais que exibem pelo menos cerca de 38% de activação de LCAT em comparação com a ApoA-I humana nativa (determinado utilizando o ensaio de activação de LCAT descrito na Secção 8, infra) são preferidos, sendo particularmente preferidos péptidos centrais que exibam 50%, 60%, 70%, 80% ou mesmo 90% ou mais. 94 ΡΕ1019073

5.1.2. FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Os agonistas de ApoA-I do invento podem ser ainda definidos por meio de formas de realização preferidas.

Numa forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterifiçadas no terminal C destes .

Noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais X7 é um aminoácido básico, Asn (N) ou Glu (E) ; X8 é um aminoácido ácido ou Arg (R) ; Xi2 é um aminoácido ácido ou Asn (N); e/ou X15 é um aminoácido ácido, Gin (Q) ou Lys (K) ; e Xi, X2, X3, X4, X5, X6, Xg, X10, Xn, X13, X14, Xi6, X17 , Xis, X19, X20 e X2i são tal como anteriormente definido para a Estrutura (I).

Noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais: X! é Pro (P) , Gly (G) , Ala (A) , Gin (Q) , Asn (N) , Asp 95 ΡΕ1019073 (D) ou D-Pro (p); X2 é Ala (A) , Vai (V) ou Leu (L) ; X4 é Asp (D) ou Glu (E); X7 é Lys (K), Arg (R), Orn, Asn (N) ou Glu (E);

Xs é Asp (D), Arg (R) ou Glu (E);

Xn é Asn (N), Gin (Q), Glu (E) ou Arg (R); X12 é Asp (D) , Glu (E) ou Asn (N) ; X13 é Leu (L) , Gly (G) ou Aib;

Xis é Asp (D), Glu (E) , Gin (Q) ou Lys (K) ;

Xie é Ala (A) , Trp (W) , Gly (G) , Leu (L) , Phe (F) ou

Nal; X17 é Leu (L) , Gly (G) ou Nal;

Xis é Lys (K) , Orn, Gin (Q) ou Asn (N) ; X19 é Lys (K) , Orn, Gin (Q) ou Asn (N); X20 é Lys (K) ou Orn; X21 é Leu (L) ; e/ou X22 é Lys (K) ou Orn e X3, X5, X6, X9, X10 e X14 são tal como anteriormente definido para a estrutura (I).

Uma forma de realização ainda mais preferida de acordo com este aspecto do invento são os péptidos nos quais: X2 é Vai (V) ; X3 é Leu (L) ; X5 é Leu (L) ; Xe é Phe (F) ; X7 é Arg (R) ou Lys (K); x8 é Glu (E) ; 96 ΡΕ1019073

Xg é Leu (L) ;

Xio é Leu (L) ; xn é Asn (N) ou Glu (Q); X12 é Glu (E); e/ou Xis é Glu (E); e Xi, X4, Xl3, Xl4 , Xl6, Xl7, Xl8, Xl9, X20, X21 θ X22 SãO tal como anteriormente definido para a estrutura (I) ou são tal como definido no parágrafo anterior.

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais apenas um de Xis ou X19 é um aminoácido básico e o outro de Xis ou X19 é Gin (Q) ou Asn (N) .

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterifiçadas no terminal C destes, nos quais um de Xis ou X19 é Lys (K) ou Orn e o outro de Xi8 ou X19 é Gin (Q) ou Asn (N) .

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterifiçadas no terminal C destes, nos quais um de Xg, Xun Χΐ3, Χΐ4, Xi6 ou X17 é Gly (G) e os outros são diferentes de Gly (G). 97 ΡΕ1019073

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais Xis é Gly (G) e cada um de Xg, Χίο, X14, Xi6 e X17 é diferente de Gly (G). Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais:

Xi é Pro (P), Gly (G) ou D-Pro (p); X2 é Vai (V) ; X3 é Leu (L) ; X4 é Asp (D) ou Glu (E) ; X5 é L (Leu) ou Phe (F); Xe é Phe (F) ; X7 é Arg (R) ; X8 é Glu (E) ; Xg e Leu (L) ; Xio é Leu (L) ou Trp (W); Xn é Asn (N) ; X12 é Glu (E); Xl3 é Gly (G) ; X14 é Leu (L) ; Xi5 é Glu (E); ΡΕ1019073 98

Xi6 é Ala X17 θ Leu Xis é Lys X19 e Gin X20 é Lys X21 é Leu X22 é Lys (A) ou Trp (W) ; (L) ou Nal; (K) ou Orn; (Q); (K) ou Orn; (L) ; e (K) ou Orn.

Os agonistas de ApoA-I particularmente preferidos de acordo com este aspecto do invento são seleccionados a partir do grupo que consiste em: péptido 3 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:3); péptido 13 GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:13); péptido 19 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:19); péptido 137 PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK (SEQ ID NO:137); péptido 138 PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK (SEQ ID NO:138); péptido 139 PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:139); péptido 140 PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO (SEQ ID NO:140); péptido 141 PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:141); péptido 142 PVLELFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:142); e as formas amidadas ou esterificadas no terminal C e/ou aciladas no terminal N destes.

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no 99 ΡΕ1019073 terminal C destes, nos quais Xg é Gly (G) e cada um de Xio, X13, X14, Xi6 e X17 é diferente de Gly (G) . Um agonista de ApoA-I particularmente preferido de acordo com este aspecto do invento é o péptido 20: PVLDLFREGLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:20) .

Ainda noutra forma de realização particularmente preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais Χχ0 é Gly (G) e cada um de X9, X13, X14, Xi6 e X17 é diferente de Gly (G) . Um agonista de ApoA-I particularmente preferido de acordo com este aspecto do invento é o péptido 9: PVLDLFRELGNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:9).

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais X14 é Gly (G) e cada um de Xg, Χίο, X13, Χίε e X17 é diferente de Gly (G) . Um agonista de ApoA-I particularmente preferido de acordo com este aspecto do invento é O péptido 126: PVLDLFRELLNELGEALKQKLK (SEQ ID NO:126).

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas 100 ΡΕ1019073 aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterifiçadas no terminal C destes, nos quais Xi6 é Gly (G) e cada um de Xg, Χίο, X13, X14 e Xi7 é diferente de Gly (G) . Um agonista de ApoA-I particularmente preferido de acordo com este aspecto do invento é O péptido 22: PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK (SEQ ID NO: 22) .

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais Χ1Ί é Gly (G) e cada um de Xg, Xio, X13, X14 e Χίε é diferente de Gly (G) . Um agonista de ApoA-I particularmente preferido de acordo com este aspecto do invento é O péptido 12: PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK (SEQ ID NO:12) .

As formas de realização contendo resíduos internos de glicina podem ser facilmente sintetizadas com elevado rendimento por meio da condensação de segmentos, proporcionando deste modo vantagens significativas para a produção em grande escala. A condensação de segmentos, i.e.r a união de pequenas cadeias peptídicas constituintes para formar uma cadeia peptídica maior, foi utilizada para preparar muitos péptidos biologicamente activos, incluindo imitadores de ApoA-I de 44 resíduos de aminoácidos (ver, e.g., Nakagawa et al., J. Am Chem. Soc. 107: 7087-7083, 1985; Nokihara et al., Peptides 1988: 166-168, 1989; Kneib-Cordonnier et al., Int. J. Pept. Proteln Res. 35: 527-538, 101 ΡΕ1019073 1990) e é considerada como sendo o método mais rentável para a síntese em bruto de elevado rendimento dos péptidos centrais do invento.

As vantagens da síntese através da condensação de segmentos incluem a capacidade de condensar segmentos pré-formados na fase de solução e a facilidade de purificação do produto final. As desvantagens do método incluem uma baixa eficiência de ligação e rendimento no passo de condensação e uma baixa solubilidade de certas sequências peptídicas. A eficiência de ligação do passo de condensação pode ser significativamente aumentada através do aumento do tempo de ligação. Tipicamente, o aumento do tempo de ligação resulta em maior racemização do produto (Sieber et ai., Helv. Chim. Acta 53: 2135-2150, 1970). No entanto, uma vez que a glicina não tem um centro quiral, não sofre racemização (os resíduos de prolina, devido ao impedimento espacial, sofrem também pouca ou nenhuma racemização a tempos de ligação longos). Assim, as formas de realização contendo resíduos internos de glicina podem ser sintetizadas em bruto com elevado rendimento através da condensação de segmentos sintetizando segmentos constituintes que tira partido do facto dos resíduos de glicina não sofrerem racemização. Assim, as formas de realização contendo resíduos de glicina internos proporcionam vantagens sintéticas significativas para a preparação em bruto em grande escala. 102 ΡΕ1019073

Ainda noutra forma de realização preferida, OS agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais cada um de Xg, XlOf Xl3f Xl4, Χ16 e X17 é diferente de Gly (G) .

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são péptidos de 22 resíduos de aminoácidos de acordo com a estrutura (I) ou as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais:

Xi é Pro (P), Gly (G), Ala (A) ou D-Pro (p); x2 é Vai (V) ou Leu (L); X3 é Leu (L) ; X4 é Asp (D) ou Glu (E) ; x5 é Leu (L) ou Phe (F) ; Xe é Leu (L) ou Phe (F) ; X7 é Arg (R) ou Lys (K) ; x8 é Glu (E) ; Xg é Leu (L) ; Xio é Leu (L) ou Trp (W) ; Xn é Asn (N) ou Gin (Q); Xl2 é Glu (E) r Xl3 é Leu (L) ou Aib, r Xl4 é Leu (L) , Trp (W) ou Xl5 é Glu (E) r 103 ΡΕ1019073 Χίε é Ala (A) , Leu (L) , Trp (W) ou Nal; X17 é Leu (L) ou Nal; um de X18 ou X19 é Gin (Q) e o outro é Lys (K) ou Orn; X20 é Lys (K) ou Orn; X21 é Leu (L); e X22 é Lys (K) ou Orn.

Numa forma de realização particularmente preferida de acordo com este aspecto do invento, X2 é Vai (V) ; X4 é Asp (D); X5 é Leu (L); Xe é Phe (F) ; X7 é Arg 0 >< • é Leu (L); Xn é Asn (N) ; X13 é Leu (L) ; Xl4 é Leu (L); Xie é Ala (A) ; X17 é Leu (L) ; Xis é Lys (K) ; Xl9 é Gin 0 CM X 3 é Lys (K) e/ou X22 é Lys (K) .

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são formas alteradas ou mutadas dos péptidos de estrutura (I) ou das formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterifiçadas no terminal C destes, nos quais:

Xi é diferente de Aib, Vai (V) ou Leu (L); X2 é diferente de D-Val (v); X5 é diferente de Lys (K), Glu (E), Trp (W) ou Nal;

Xe é diferente de Trp (W); X7 é diferente de Trp (W) ou Leu (L); X8 é diferente de Trp (W); X9 é diferente de Lys (K) ou Trp (w); X11 é diferente de Trp (W) ; X12 é diferente de Trp (W) ou Leu (L); 104 ΡΕ1019073

Xi3 é diferente de Glu (E) ou Trp (W);

Xis é diferente de Trp (W) ; e/ou X21 é diferente de Lys (K) .

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I do invento são seleccionados de entre o grupo de péptidos exposto abaixo: péptido 1 PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK (SEQ id : NO:1) ; péptido 2 GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO:2); péptido 3 PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK (SEQ ID : NO:3) ; péptido 4 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ id : NO:4) ; péptido 5 pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO:5); péptido 6 PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK (SEQ id : NO:6) ; péptido 7 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ id : NO:7) ; péptido 8 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ id : NO:8) ; péptido 9 PVLDLFRELGNELLEALKQKLK (SEQ id : NO:9) ; péptido 10 PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK (SEQ ID NO:10) péptido 11 PVLDLFKELLQELLEALKQKLK (SEQ ID NO:11) péptido 12 PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK (SEQ ID NO:12) péptido 13 GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:13) péptido 14 PVLDLFRELLNELLEALOQOLO (SEQ ID NO:14) péptido 15 PVLDLFRELWNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:15) péptido 16 PVLDLLRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:16) péptido 17 PVLELFKELLQELLEALKQKLK (SEQ ID NO:17) péptido 18 GVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:18) péptido 19 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:19) péptido 20 PVLDLFREGLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:20) péptido 21 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:21) 105 ΡΕ1019073 péptido 22 péptido 23 péptido 24 péptido 25 péptido 26 péptido 27 péptido 28 péptido 29 péptido 123 péptido 124 péptido 125 péptido 126 péptido 127 péptido 128 péptido 129 péptido 130 péptido 131 péptido 132 péptido 133 péptido 134 péptido 135 péptido 136 péptido 137 péptido 138 péptido 139 péptido 140 péptido 141 péptido 142 106 ΡΕ1019073 e das formas aciladas (particularmente acetiladas ou dansiladas) no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais X é Aib; Z é Nal; e O é Orn.

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I do invento são seleccionados de entre o grupo de péptidos exposto abaixo: péptido 1 PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK (SEQ ID NO:1) ; péptido 2 GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO:2); péptido 3 PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK (SEQ ID NO:3); péptido 4 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 4) ; péptido 5 pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO: 5); péptido 6 PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK (SEQ ID NO:6); péptido 7 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:7) ; péptido 8 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:8) ; péptido 9 PVLDLFRELGNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:9); péptido 10 PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK (SEQ ID NO:10); péptido 11 PVLDLFKELLQELLEALKQKLK (SEQ ID NO:11); péptido 12 PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK (SEQ ID NO:12); péptido 13 GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:13); péptido 14 PVLDLFRELLNELLEALOQOLO (SEQ ID NO:14); péptido 15 PVLDLFRELWNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:15); péptido 16 PVLDLLRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:16); péptido 17 PVLELFKELLQELLEALKQKLK (SEQ ID NO:17); péptido 18 GVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:18); péptido 19 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:19); péptido 20 PVLDLFREGLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:2 0); péptido 21 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO:21); 107 ΡΕ1019073 (SEQ ID NO:22); (SEQ ID NO:23); (SEQ ID NO 24) ; (SEQ ID NO:25); (SEQ ID NO 2 6) ; (SEQ ID NO:27); (SEQ ID NO:28); (SEQ ID NO:29);

péptido 22 PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK péptido 23 PLLELFKELLQELLEALKQKLK péptido 24 PVLDLFRELLNELLEALQKKLK péptido 25 PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK péptido 26 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK péptido 27 PVLDLFRELLNELZEALKQKLK péptido 28 PVLDLFRELLNELWEALKQKLK péptido 29 AVLDLFRELLNELLEALKQKLK e das formas aciladas (particularmente acetiladas ou dansiladas) no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes, nos quais X é Aib; Z é Nal; e O é Orn.

Ainda noutra forma de realização preferida, os agonistas de ApoA-I são formas multiméricas de acordo com as estruturas II, III e/ou IV nas quais HH é um péptido de acordo coma estrutura (I), ou uma forma acilada no terminal N e/ou amidada ou esterifiçada no terminal C deste, ou qualquer um dos péptidos preferidos de acordo com a estrutura (I) aqui descrita.

Ainda noutra forma de realização preferida, os péptidos centrais que compõem os agonistas de ApoA-I não são nenhum dos seguintes péptidos: péptido 75: PVLDEFREKLNEELEALKQKLK (SEQ ID NO:75); péptido 94: PVLDEFREKLNEALEALKQKLK (SEQ ID NO:94); péptido 109: PVLDEFREKLNERLEALKQKLK (SEQ ID NO:109); péptido 237: LDDLLQKWAEAFNQLLKK (SEQ ID NO:237); 108 ΡΕ1019073 péptido 238: EWLKAFYEKVLEKLKELF* (SEQ ID NO:238); péptido 241: DWFKAFYDKVFEKFKEFF (SEQ ID NO:241); péptido 242: GIKKFLGSIWKFIKAFVG (SEQ ID NO:242); péptido 243: DWFKAFYDKVAEKFKEAF (SEQ ID NO:243); péptido 244: DWLKAFYDKVAEKLKEAF (SEQ ID NO:244); péptido 245: DWLKAFYDKVFEKFKEFF (SEQ ID NO:245); péptido 246: EWLEAFYKKVLEKLKELF (SEQ ID NO:246); péptido 247: DWFKAFYDKFFEKFKEFF (SEQ ID NO:247); péptido 248: EWLKAFYEKVLEKLKELF (SEQ ID NO:248); péptido 249: EWLKAEYEKVEEKLKELF* (SEQ ID NO:249); péptido 250: EWLKAEYEKVLEKLKELF* (SEQ ID NO:250); e péptido 251: EWLKAFYEKVLEKLKELF* (SEQ ID NO:251).

Numa forma de realização preferida final, os agonistas de ApoA-I não são nenhum dos péptidos listados na TABELA X (Secção 8.3, infra) exibindo uma actividade de activação de LCAT de menos de 38% em comparação com a ApoA-I humana nativa.

5.2. SÍNTESE E PURIFICAÇÃO DOS AGONISTAS PEPTÍDICOS DE ApoA-I

Os péptidos centrais do invento podem ser preparados utilizando virtualmente qualquer técnica conhecida na arte para a preparação de péptidos. Por exemplo, os péptidos podem ser preparados utilizando sinteses peptí-dicas convencionais por passos em solução ou fase sólida, ou técnicas de ADN recombinante. 109 ΡΕ1019073

5.2.1. SÍNTESE QUÍMICA

Os péptidos centrais podem ser preparados utilizando síntese convencional por passos em solução ou fase sólida (ver, e.g., "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997, e referências aí citadas; "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989 e referências aí citadas).

Alternativamente, os péptidos do invento podem ser preparados por meio de condensação de segmentos, tal como descrito, por exemplo, em Liu et al., Tetrahedron Lett. 37(7): 933-936, 1996; Baca, et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 1881-1887, 1995; Tam et al., Int. J. Peptide Protein Res. 45: 209-216, 1995; Schnõlzer e Kent, Science 256: 221-225, 1992; Liu e Tam, J. Am. Chem. Soc. 116(10): 4149-4153, 1994; Liu e Tam, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 6584-6588, 1994; Yamashiro e Li, Int. J. Peptide Protein Res. 31: 322-334, 1988). Este é particularmente o caso com péptidos contendo glicina. Outros métodos úteis para a síntese de péptidos do invento estão descritos em Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092.

Agonistas de ApoA-I contendo grupos de bloqueio N-terminais e/ou C-terminais podem ser preparados utilizando técnicas padrão de química orgânica. Por exemplo, os métodos para a acilação do terminal N de um péptido ou 110 ΡΕ1019073 amidação ou esterificação do terminal C de um péptido são bem conhecidos na arte. Os modos de realização de outras modificações no terminal N e/ou C serão aparentes para os peritos na arte, tal como os modos de protecção de quaisquer funcionalidades das cadeias laterais conforme seja necessário para unir os grupos de bloqueio terminais.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis (contra-iões) podem ser convenientemente preparados através de cromatografia de permuta iónica ou de outros métodos bem conhecidos na arte.

Os compostos do invento que estão na forma de multimeros em cadeia podem ser convenientemente sintetizados através da adição do ligador ou ligadores à cadeia peptidica no passo apropriado na síntese. Alternativamente, podem ser sintetizados os segmentos helicoidais e fazer cada segmento reagir com o ligador. Claro que o método real de síntese dependerá da composição do ligador. Os esquemas de protecção e as químicas adequados são bem conhecidos e serão aparentes para os peritos na arte.

Os compostos do invento que estão na forma de redes ramificadas podem ser convenientemente sintetizados utilizando as resinas triméricas e tetraméricas e as químicas descritas em Tam, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5409-5413, 1988 e Demoor et al., Eur. J. Biochem. 239: 74-84, 1996. A modificação das resinas sintéticas e as estratégias para sintetizar redes ramificadas de ordem 111 ΡΕ1019073 superior ou inferior ou que contenham combinações de diferentes segmentos helicoidais dos péptidos centrais, estão bem dentro das capacidades dos peritos na arte da quimica de péptidos e/ou da quimica orgânica. A formação de ligações dissulfureto, se desejada, é geralmente conduzida na presença de agentes de oxidação suaves. Podem ser utilizados agentes químicos de oxidação ou os compostos podem ser simplesmente expostos a oxigénio atmosférico para efectuar estas ligações. São conhecidos vários métodos na arte, incluindo os aqui descritos, por exemplo por Tam et ai., Synthesis 955-957, 1979; Stewart et ai., "Solid Phase Peptide Synthesis", 2a Ed., Pierce Chemical Company Rockford, IL, 1984; Ahmed et ai., J. Biol. Chem. 250: 8477-8482, 1975; e Pennington et ai. "Peptides", 164-166, Giralt e Andreu, Eds., ESCOM Leiden, The Netherlands, 1990. Uma alternativa adicional é descrita por Kamber et ai., Helv. Chim. Acta 63: 899-915, 1980. Um método conduzido em suportes sólidos é descrito por Albericio, Int. J. Peptide Protein Res. 26: 92-97, 1985. Qualquer um destes métodos pode ser utilizado para formar ligações dissulfureto nos péptidos do invento.

5.2.2. SÍNTESE RECOMBINANTE

Se o péptido for composto inteiramente por aminoácidos codificados por genes ou se uma porção sua for assim composta, o péptido ou a porção relevante pode também ser sintetizado utilizando técnicas convencionais de engenharia genética recombinante. 112 ΡΕ1019073

Para produção recombinante, uma sequência poli-peptídica codificando o péptido é inserida num veiculo de expressão apropriado, i.e., um vector que contenha os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação inserida, ou no caso de um vector virai de ARN, os elementos necessários para a replicação e tradução. 0 veiculo de expressão é então transfectado para uma célula alvo adequada que expressará o péptido. Dependendo do sistema de expressão utilizado, o péptido expresso é então isolado através de procedimentos bem estabelecidos na arte. Os métodos para a produção recombinante de proteínas e péptidos são bem conhecidos na arte (ver, e.g., Sambrook et ai., "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; e Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989 cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade).

Para aumentar a eficiência de produção, o polinucleótido pode ser concebido para codificar múltiplas unidades do péptido separadas por locais de clivagem enzimática - podem ser concebidos deste modo homopolímeros (unidades peptídicas de repetição) ou heteropolímeros (péptidos diferentes alinhados juntos). 0 polipéptido resultante pode ser clivado (e.g., através de tratamento com a enzima apropriada) para recuperar as unidades peptídicas. Isto pode aumentar o rendimento dos péptidos 113 ΡΕ1019073 conduzidos por um único promotor. Numa forma de realização preferida, pode ser concebido um polinucleótido policis-trónico de modo a que seja transcrito um único ARNm que codifique múltiplos péptidos (i.e., homopolímeros ou heteropolimeros), cada região de codificação ligada operativamente a uma sequência de controlo da tradução independente da extremidade; e.g., um local interno de entrada no ribossoma (IRES). Quando utilizado em sistemas de expressão virais apropriados, a tradução de cada péptido codificado pelo ARNm é dirigida internamente no transcrito; e.g., pelo IRES. Assim, a construção policistrónica dirige a transcrição de um único ARNm policistrónico grande que, por sua vez, dirige a tradução de múltiplos péptidos individuais. Esta abordagem elimina a produção e o processamento enzimático de poliproteinas e pode aumentar significativamente o rendimento do péptido conduzido por um único promotor.

Pode ser utilizada uma variedade de sistemas hospedeiro-vector de expressão para expressar os péptidos aqui descritos. Estes incluem, mas não se limitam a microrganismos, tais como bactérias transformadas com ADN bacteriofágico recombinante ou vectores de expressão de ADN plasmidico contendo uma sequência de codificação apropriada; levedura ou fungos filamentosos transformados com vectores de expressão de levedura ou fungos recombinantes contendo uma sequência de codificação apropriada; sistemas de células de insecto infectadas com vectores de expressão de virus recombinantes (e.g., baculovirus) contendo uma 114 ΡΕ1019073 sequência de codificação apropriada; sistemas de células vegetais infectadas com vectores de expressão de virus recombinantes (e.g., virus do mosaico da couve-flor ou virus do mosaico do tabaco) ou transformadas com vectores de expressão de plasmideos recombinantes (e.g., plasmídeo Ti) contendo uma sequência de codificação apropriada; ou sistemas de células animais.

Os elementos de expressão dos sistemas de expressão variam na sua força e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro/vector utilizado, qualquer um de vários elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, pode ser utilizado no vector de expressão. Por exemplo, quando se clona em sistemas bacterianos, podem ser utilizados promotores indutíveis tais como pL do bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) e semelhantes; quando se clona em sistemas de células de insecto, podem ser utilizados promotores tais como o promotor do poliedro de baculovírus; quando se clona em sistema de células vegetais, podem ser utilizados promotores derivados do genoma de células vegetais (e.g., promotores de choque térmico; o promotor para a subunidade pequena da RUBISCO; o promotor para a proteína de ligação à clorofila a/b) ou de vírus de plantas (e.g., o promotor do ARN 35S de CaMV; o promotor da proteína de revestimento de TMV); quando se clona em sistemas de células de mamífero, podem ser utilizados promotores derivados do genoma de células de mamífero (e.g., promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamífero 115 ΡΕ1019073 (e.g., o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7.5 K do vírus vacínia); quando se geram linhas celulares que contêm múltiplas cópias do produto de expressão, podem ser utilizados vectores baseados em SV40, BPV e EBV com um marcador seleccionável apropriado.

Em casos em que são utilizados vectores de expressão de plantas, a expressão das sequências codificando os péptidos do invento pode ser dirigida por qualquer um de vários promotores. Por exemplo, podem ser utilizados promotores virais tais como os promotores do ARN 35S e do ARN 19S de CaMV (Brisson et al., Nature 310: 511-514, 1984), ou o promotor da proteína de revestimento de TMV (Takamatsu et al., EMBO J. 6: 307-311, 1987); alternativamente, promotores de plantas tais como a subunidade pequena da RUBISCO (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671-1680, 1984; Broglie et al., Science 224: 838-843, 1984) ou os promotores de choque térmico, e.g., pode ser utilizado hspl7.5-E ou hspl7.3-B de soja (Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6: 559-565, 1986). Estas construções podem ser introduzidas em células vegetais utilizando plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vectores de vírus de plantas, transformação directa de ADN, microinjecção, electroporação, etc. Para revisões de tais técnicas ver, e.g., Weissbach & Weissbach, "Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, NY, Section VIII, págs. 421-463, 1988; e Grierson & Corey, "Plant Molecular Biology", 2a Ed., Blackie, London, Cap. 7-9, 1988. 116 ΡΕ1019073

Num sistema de expressão de insecto que pode ser utilizado para produzir os péptidos do invento, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é utilizado como vector para expressar os genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. Uma sequência de codificação pode ser clonada em regiões não essenciais (por exemplo, o gene do poliedro) do vírus e colocada sob controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor do poliedro). A inserção com sucesso de uma sequência de codificação resultará em inactivação do gene do poliedro e produção de vírus recombinante não ocluso (í.e., vírus sem o revestimento proteináceo codificado pelo gene do poliedro). Estes vírus recombinantes são então utilizados para infectar células de Spodoptera frugiperda nas quais o gene inserido é expresso (e.g., ver Smith et al., J. Virol. 46: 584, 1983; Smith, Patente U.S. N° 4215051) . Mais exemplos deste sistema de expressão podem ser verificados em "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 2, Ausubel et al., eds., Greene Publish. Assoe. & Wiley Interscience.

Em células hospedeiras de mamífero, podem ser utilizados vários sistemas de expressão baseados em vírus. Em casos onde é utilizado um adenovírus como vector de expressão, uma sequência de codificação pode ser ligada a um complexo de controlo da transcrição/tradução de adenovírus, e.g., o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma adenoviral através de recombinação in vitro ou in 117 ΡΕ1019073 vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (e.g., região EI ou E3) resultará num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar péptidos em hospedeiros infectados (e.g., ver Logan e Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 3655-3659, 1984). Alternativamente, pode ser utilizado o promotor 7.5 K de vacínia (ver, e.g., Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 7415-7419, 1982;

Mackett et al., J. virol. 49: 857-864, 1984; Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 4927-4931, 1982).

Outros sistemas de expressão para produção dos péptidos do invento serão aparentes para os peritos na arte.

5.2.3. PURIFICAÇÃO DE PÉPTIDOS

Os péptidos do invento podem ser purificados através de técnicas conhecidas na arte tais como cromatografia líquida de elevada resolução de fase inversa, cromatografia de permuta iónica, electroforese em gel, cromatografia de afinidade e semelhantes. As condições actuais utilizadas para purificar um determinado péptido dependerão, em parte, da estratégia de síntese e de factores tais como a carga líquida, a hidrofobicidade, a hidrofilicidade, etc., e serão aparentes aos peritos na arte. Os péptidos multiméricos ramificados podem ser purificados, e.g., através de cromatografia de permuta iónica ou de exclusão de tamanho. 118 ΡΕ1019073

Para purificação por cromatografia de afinidade, pode ser utilizado qualquer anticorpo que se ligue especificamente ao péptido. Para a produção de anticorpos, podem ser imunizados vários animais hospedeiros, incluindo mas não se limitando a coelhos, ratinhos, ratos, etc., através de injecção com um péptido. 0 péptido pode ser ligado a um transportador adequado tal como BSA, por meio de um grupo funcional da cadeia lateral ou ligadores ligados a um grupo funcional da cadeia lateral. Podem ser utilizados vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo mas não se limitando a adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões em óleo, hemocianina da lapa, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerrin) e Corynebacterium parvum.

Os anticorpos monoclonais para um péptido podem ser preparados utilizando qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo através de linhas celulares contínuas em cultura. Estas incluem mas não se limitam à técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein, Nature 256: 495-497, 1975, ou Kaprowski, Patente U.S. N° 4376110 que é aqui incorporada por referência; a técnica de hibridoma de células B humanas; Kosbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 2026-2030, 1983); e a 119 ΡΕ1019073 técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., "Monoclonal

Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96 (1985)). Adicionalmente, podem ser utilizadas as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" de Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314: 452-454, 1985, Boss,

Patente U.S. N° 4816397, 1985; Cabilly, Patente U.S. N° 4816567, 1985; que são aqui incorporadas por referência, através do processamento dos genes de uma molécula de anticorpo de ratinho de especificidade antigénica apropriada juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humana de actividade biológica apropriada. Ou podem ser preparados anticorpos "humanizados" (ver, e.g., Queen, Patente U.S. N° 5585089 que é aqui incorporada por referência). Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patente U.S. N° 4946778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples específicos dos péptidos.

Fragmentos de anticorpo que contêm deleções dos locais de ligação específicos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem mas não se limitam a fragmentos F(ab')2, que podem ser produzidos através de digestão com pepsina da molécula de anticorpo e fragmentos Fab, que podem ser gerados através da redução de pontes dissulfureto dos fragmentos F(ab')2· Alternativamente, podem ser construídas bibliotecas de expressão de Fab (Huse et al., Science 246: 1275-1281, 120 ΡΕ1019073 1989) para permitir a rápida e fácil identificação de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada para o péptido de interesse. O anticorpo ou fragmento de anticorpo especifico para o péptido desejado pode ser ligado, por exemplo, a agarose, e o complexo anticorpo-agarose é utilizado em imunocromatografia para purificar péptidos do invento. Ver, Scopes, "Protein Purification: Principies and Practice", Springer-Verlag New York, Inc., NY, 1984, Livingstone, "Methods In Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins" 34: 723-731, 1974.

5.3. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE TRATAMENTO

Os agonistas de ApoA-I do invento podem ser utilizados para tratar qualquer distúrbio em animais, especialmente mamíferos incluindo humanos, para os quais seja benéfico o aumento da concentração de HDL sérica, a activação de LCAT e a promoção do efluxo de colesterol e do TIC. Tais condições incluem, mas não se limitam a hiperlipidemia e especialmente hipercolesterolemia e doença cardiovascular tal como aterosclerose (incluindo tratamento e prevenção de aterosclerose); restenose (e.g., prevenção ou tratamento de placas ateroscleróticas que se desenvolvem em consequência de procedimentos médicos tais como angioplastia de balão); e outros distúrbios, tais como endotoxemia, que resulta frequentemente em choque séptico. 121 ΡΕ1019073

Os agonistas de ApoA-I podem ser utilizados sozinhos ou em terapia de combinação com outros fármacos utilizados para tratar as condições anteriores. Tais terapias incluem, mas não se limitam a administração simultânea ou sequencial dos fármacos envolvidos.

Por exemplo, no tratamento de hipercolesterolemia ou de aterosclerose, as formulações de agonistas de ApoA-l podem ser administradas com uma ou mais das terapias de abaixamento do colesterol actualmente em utilização; e.g., resinas de ácidos biliares, niacina e/ou estatinas. Um tal regímen combinado pode produzir efeitos terapêuticos particularmente benéficos uma vez que cada fármaco actua num alvo diferente na síntese e no transporte de colesterol; í.e., as resinas de ácidos biliares afectam a reciclagem do colesterol, o quilomicron e a população de LDL; a niacina afecta primeiramente a população de VLDL e LDL; as estatinas inibem a síntese de colesterol, diminuindo a população de LDL (e talvez aumentando a expressão do receptor de LDL); enquanto que os agonistas de ApoA-I afectam o TIC, aumentam a HDL, aumentam a actividade de LCAT e promovem o efluxo de colesterol.

Noutra forma de realização, os agonistas de ApoA-I podem ser utilizados em conjunto com fibratos para tratar hiperlipidemia, hipercolesterolemia e/ou doença cardiovascular tal como aterosclerose.

Ainda noutra forma de realização, os agonistas de 122 ΡΕ1019073

ApoA-I do invento podem ser utilizados em combinação com os agentes antimicrobianos e anti-inflamatórios vulgarmente utilizados para tratar choque séptico induzido por endotoxina.

Os agonistas de ApoA-I do invento podem ser formulados como péptidos ou como complexos péptido-lipido que podem ser administrados a sujeitos numa variedade de modos para distribuir o agonista de ApoA-I pela circulação. As formulações e regímenes de tratamento exemplares são descritos abaixo.

5.3.1. AGONISTAS DE ApoA-I E COMPLEXO PÉPTIDO/LÍPIDO COMO INGREDIENTE ACTIVO

Os péptidos agonistas de ApoA-I podem ser sintetizados ou produzidos utilizando qualquer técnica descrita na Secção 5.2 e suas subsecções. As preparações estáveis possuindo uma vida de armazenamento longa podem ser produzidas através da liofilização dos péptidos - para preparar em bruto para reformulação ou para preparar aliquotas individuais ou unidades de dosagem que possam ser reconstituídas através de re-hidratação com água estéril ou uma solução tamponada estéril apropriada antes da administração a um sujeito.

Em certas formas de realização, pode ser preferido formular e administrar o agonista de ApoA-I num complexo péptido-lipido. Esta abordagem tem várias 123 ΡΕ1019073 vantagens uma vez que o complexo deve ter uma maior semi-vida em circulação, particularmente quando o complexo tem um tamanho e densidade semelhantes a HDL, e especialmente às populações de HDL pré-β-Ι ou pré-p-2. Os complexos péptido-lípido podem ser convenientemente preparados através de qualquer um de vários métodos descritos abaixo. Preparações estáveis possuindo uma semi-vida longa podem ser produzidas através de liofilização - sendo a abordagem preferida o procedimento de co-liofilização descrito abaixo. Os complexos péptido-lipido liofilizados podem ser utilizados para preparar um volume para reformulação ou para preparar aliquotas individuais ou unidades de dosagem que possam ser reconstituídas através de re-hidratação com água estéril ou uma solução tamponada apropriada antes da administração a um sujeito.

Uma variedade de métodos bem conhecidos dos peritos na arte pode ser utilizada para preparar as vesículas ou complexos péptido-lípido. Para este fim, podem ser utilizadas várias técnicas disponíveis para preparação de lipossomas ou proteolipossomas. Por exemplo, o péptido pode ser co-sujeito a ultra-sons (utilizando um banho ou uma sonda de ultra-sons) com os lípidos apropriados para formar complexos. Alternativamente, o péptido pode ser combinado com vesículas lipídicas pré-formadas resultando na formação espontânea de complexos péptido-lípido. Ainda noutra alternativa, os complexos péptido-lípido podem ser formados através de um método de diálise com detergente; e.g., uma mistura do péptido, lípido e detergente é 124 ΡΕ1019073 dialisada para remover o detergente e reconstituir ou formar complexos péptido-lipido (e.g., ver Jonas et al.,

Methods in Enzymol. 128: 553-582, 1986).

Embora as abordagens antecedentes sejam praticáveis, cada método apresenta os seus próprios problemas de produção peculiares em termos de custo, rendimento, reprodutibilidade e segurança. Os requerentes desenvolveram um método simples para a preparação de péptidos ou de complexos proteina-fosfolipido que têm caracteristicas semelhante a HDL. Este método pode ser utilizado para preparar os complexos péptido-lipido de ApoA-I e tem as seguintes vantagens: 1) A maioria ou todos os ingredientes incluídos são utilizados para formar os complexos desenhados, evitando assim o desperdício de material de partida que é comum a outros métodos. 2) São formados compostos liofilizados que são muito estáveis durante o armazenamento. Os complexos resultantes podem ser reconstituídos imediatamente antes da utilização. 3) Os complexos resultantes não necessitam habitualmente de ser mais purificados após a formação e antes da utilização. 4) São evitados compostos tóxicos, incluindo detergentes tais como colato. Para além disso, o método de produção pode ser facilmente escalonado e é adequado para a produção de GMP (i.e., num ambiente livre de endotoxinas).

De acordo com o método preferido, o péptido e o lípido são combinados num sistema de solventes que co-solubiliza cada ingrediente e que pode ser completamente 125 ΡΕ1019073 removido através de liofilização. Para este fim, têm de ser cuidadosamente escolhidos pares de solventes para assegurar a co-solubilidade tanto do péptido anfipático como do lipido. Numa forma de realização, a(s) proteína (s) ou o(s) péptido(s) a incorporar nas partículas podem ser dissolvidos num solvente ou mistura de solventes aquosos ou orgânicos (solvente 1). 0 componente (fosfo)lipido é dissolvido num solvente ou mistura de solventes aquosos ou orgânicos (solvente 2) que é miscível com o solvente 1, e as duas soluções são misturadas. Alternativamente, o péptido e o lipido podem ser incorporados num sistema de co-solventes; i.e., uma mistura de solventes miscíveis. Uma proporção adequada de péptido (proteína) para lípidos é primeiro determinada empiricamente de modo a que os complexos resultantes possuam as propriedades físicas e químicas apropriadas; i.e., habitualmente (mas não necessariamente) semelhantes em tamanho a HDL. A mistura resultante é congelada e liofilizada até à secura. Por vezes tem de ser adicionado à mistura um solvente adicional para facilitar a liofilização. Este produto liofilizado pode ser armazenado durante longos períodos e permanecerá estável.

Nos exemplos operativos descritos infra, o péptido 4 (SEQ ID NO:4) e os fosfolípidos foram dissolvidos separadamente em metanol, combinados, depois misturados com xileno antes da liofilização. 0 péptido e o lipido podem ambos ser adicionados a uma mistura dos dois solventes. Alternativamente, uma solução do péptido dissolvido em 126 ΡΕ1019073 metanol pode ser misturada com uma solução de lípido dissolvido em xileno. Deve ser tido cuidado ao eliminar o sal do sistema solvente para evitar a dessalinização do péptido. A solução resultante contendo o péptido e o lipido co-solubilizados em metanol/xileno é liofilizada para formar um pó. 0 produto liofilizado pode ser reconstituído para se obter uma solução ou suspensão do complexo péptido-lípido. Para este fim, o pó liofilizado é re-hidratado com uma solução aquosa até um volume adequado (frequentemente 5 mg de péptido/ml que é conveniente para injecção intravenosa). Numa forma de realização preferida o pó liofilizado é re-hidratado com solução salina tamponada com fosfato ou com uma solução salina fisiológica. A mistura pode ter de ser agitada ou sujeita a vórtice para facilitar a re-hidratação e, em muitos casos, o passo de reconstituição deve ser conduzido a uma temperatura igual ou superior à temperatura de transição de fase do componente lípido dos complexos. Em minutos, resulta numa preparação clara dos complexos lípido-proteína reconstituídos .

Uma alíquota da preparação reconstituída resultante pode ser caracterizada para confirmar que os complexos na preparação têm a distribuição de tamanho desejada; e.g., a distribuição de tamanho de HDL. Pode ser utilizada cromatografia de filtração em gel para este fim. Nos exemplos de trabalho descritos infra, foi utilizado um 127 ΡΕ1019073 sistema de cromatografia de filtração em gel Pharmacia Superose 6 FPLC. 0 tampão utilizado contém NaCl 150 mM em tampão fosfato 50 mM, pH 7,4. Um volume de amostra típico é de 20 a 200 microlitros de complexos contendo 5 mg de péptido/ml. O caudal da coluna é de 0,5 ml/min. Uma série de proteínas de peso molecular e diâmetro de Stokes conhecidos bem como HDL humana são utilizadas como padrões para calibrar a coluna. As proteínas e os complexos lipoproteicos são monitorizados através da absorvência ou da dispersão de luz de comprimento de onda de 254 ou 280 nm.

Os agonistas de ApoA-I do invento podem ser complexados com uma variedade de lípidos, incluindo lípidos saturados, insaturados, naturais e sintéticos e/ou fosfolípidos. Lípidos adequados incluem, mas não se limitam a, fosfolípidos de cadeia alquilo pequena, fosfatidilcolina de ovo, fosfatidilcolina de soja, dipalmitoilfosfatidil-colina, dimiristoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidil-colina, l-miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1-palmi-toil-2-miristoilfosfatidilcolina, l-palmitoil-2-estearoil-fosfatidilcolina, 1-estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina dioleofosfatidiletanolamina, di-lauroilfosfatidilglicerol-fosfatidilcolina, fosfatidilse-rina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, esfingo-mielina, esfingolípidos, fosfatidilglicerol, difosfatidil-glicerol, dimiristoilfosfatidilglicerol, dipalmitoilfosfa-tidilglicerol, diestearoilfosfatidilglicerol, dioleoilfos-fatidilglicerol, ácido dimiristoilfosfatídico, ácido dipal- 128 ΡΕ1019073 mitoilfosfatídico, dimiristoilfosfatidiletanolamina, dipal-mitoilfosfatidiletanolamina, dimiristoilfosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina, fosfatidilserina do cérebro, esfingomielina do cérebro, dipalmitoilesfingomielina, dies-tearoilesfingomielina, ácido fosfatídico, galactocerebró-sido, gangliósidos, cerebrósidos, dilaurilfosfatidilcolina, (1,3)-D-manosil-(1,3)diglicérido, aminofenilglicósido, gli-colípidos de 3-colesteril-6'-(glicosiltio)hexil-éter e colesterol e seus derivados.

Os Requerentes descobriram que quando os ago-nistas de ApoA-I do invento são complexados com esfingo-mielina, é removido todo o HDL das partículas semelhantes pré-β. Concordantemente, numa forma de realização preferida do invento, os agonistas de ApoA-I são administrados como um complexo com esfingomielina.

5.3.2. MÉTODOS DE TRATAMENTO

Os agonistas peptídicos de ApoA-I ou os complexos péptido-lípido do invento podem ser administrados através de qualquer via adequada que assegure a biodisponibilidade na circulação. Isto pode ser alcançado através de vias parentéricas de administração, incluindo injecções intravenosas (IV) , intramusculares (IM), intradérmicas, subcutâneas (SC) e intraperitoneais (IP). No entanto, podem ser utilizadas outras vias de administração. Por exemplo, a absorção através do tracto gastrointestinal pode ser alcançada através de vias de administração oral (incluindo 129 ΡΕ1019073 mas não se limitando às vias de ingestão, bucal e sublingual) desde que sejam utilizadas formulações apropriadas (e.g., revestimentos entéricos) para evitar ou minimizar a degradação do ingrediente activo, e.g., nos ambientes agrestes da mucosa oral, do estômago e/ou do intestino delgado. Alternativamente, a administração através do tecido da mucosa tal como os modos de administração vaginal e rectal podem ser utilizados para evitar ou minimizar a degradação no tracto gastrointestinal. Ainda noutra alternativa, as formulações do invento podem ser administradas transcutaneamente (e.g., transdermicamente) ou através de inalação. Será apreciado que a via preferida pode variar com a condição idade e adesão do receptor. A dose real de agonistas de ApoA-I ou de complexo péptido-lipido utilizada variará com a via de administração e deve ser ajustada para se alcançarem concentrações plasmáticas em circulação de 100 mg/1 a 2 g/1. Os dados obtidos em sistemas de modelos animais aqui descritos mostram que os agonistas de ApoA-I do invento se associam ao componente HDL, e têm uma semi-vida projectada em humanos de cerca de cinco dias. Assim, numa forma de realização, os agonistas de ApoA-I podem ser administrados através de injecção a uma dose entre 0,5 mg/kg a 100 mg/kg uma vez por semana. Noutra forma de realização, os níveis séricos desejáveis podem ser mantidos através de infusão contínua ou através de infusão intermitente proporcionando cerca de 0,5 mg/kg/hr a 100 mg/kg/hr. 130 ΡΕ1019073 A toxicidade e eficácia terapêutica dos vários agonistas de ApoA-l podem ser determinadas utilizando procedimentos farmacêuticos padrão em cultura de células ou animais experimentais para determinação da DL5q (a dose letal para 50% da população) e a DE5o (a dose terapeutica-mente eficaz em 50% da população) . A razão de doses entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão DL50/DE5o. São preferidos agonistas peptídicos de ApoA-l que exibam grandes índices terapêuticos.

5.3.3. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS A formulação farmacêutica do invento contém o agonista peptídico de ApoA-I ou o complexo péptido-lípido como ingrediente activo num transportador farmaceuticamente aceitável adequado para administração e distribuição in vivo. Uma vez que os péptidos podem conter cadeias terminais e/ou laterais ácidas e/ou básicas, os péptidos podem ser incluídos nas formulações na forma de ácidos ou bases livres ou na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis.

As preparações injectáveis incluem suspensões estéreis, soluções ou emulsões do ingrediente activo em veículos aquosos ou oleosos. As composições podem também conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou de dispersão. As formulações para injecção podem ser apresentadas na forma de dosagem 131 ΡΕ1019073 unitária, e.g., em ampolas ou em recipientes multi-dose, e podem conter conservantes adicionados.

Alternativamente, a formulação injectável pode ser proporcionada na forma de pó para reconstituição com um veiculo adequado, incluindo mas não se limitando a água estéril apirogénica, tampão, solução de dextrose, etc., antes da utilização. Para este fim, o agonista de ApoA-l pode ser liofilizado ou pode ser preparado o complexo péptido-lipido co-liofilizado. As preparações armazenadas podem ser fornecidas em formas de dosagem unitária e reconstituídas antes da utilização in vivo.

Para distribuição prolongada, o ingrediente acti-vo pode ser formulado como uma preparação de depósito, para administração através de implantação; e.g., injecção subcutânea, intradérmica ou intramuscular. Assim, por exemplo, o ingrediente activo pode ser formulado com materiais poli-méricos ou hidrófobos adequados (e.g., como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica, ou como derivados ligeiramente solúveis; e.g., como uma forma de sal ligeiramente solúvel do agonista de ApoA-I.

Alternativamente, podem ser utilizados sistemas de distribuição transdérmica como um disco ou penso adesivo que libertam lentamente o ingrediente activo para adsorção percutânea. Para este fim, podem ser utilizados estimuladores da permeação para facilitar a penetração transdérmica 132 ΡΕ1019073 do ingrediente activo. Um beneficio particular pode ser alcançado através da incorporação dos agonistas de ApoA-I do invento ou do complexo péptido-lipido num penso de nitroglicerina para utilização em pacientes com doença cardiaca isquémica e hipercolesterolemia.

Para administração oral, as composições farmacêuticas podem tomar a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação (e.g., amido de milho pré-gelatinizado, poli-vinilpirrolidona ou hidroxipropil-metilcelulose); enchimentos (e.g., lactose, celulose microcristalina ou hidro-genofosfato de cálcio); lubrificantes (e.g., estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (e.g., amido de batata ou glicolato de amido sódico); ou agentes humidi-ficantes (e.g., lauril-sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos através de métodos bem conhecidos na arte. As preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, xaropes ou suspensões ou podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Tais preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (e.g., xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras edíveis hidrogenadas); agentes emulsionantes (e.g., lecitina ou acácia); veículos não aquosos (e.g., óleo de 133 ΡΕ1019073 amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fraccionados); e conservantes (e.g., metil- ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais tampão, agentes aromatizantes, corantes e adoçantes conforme apropriado. As preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para dar uma libertação controlada do composto activo.

Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas de modo convencional. Para as vias de administração rectal e vaginal, o ingrediente activo pode ser formulado como soluções (para clisteres de retenção), supositórios ou unguentos.

Para administração através de inalação, o ingrediente activo pode ser convenientemente distribuído na forma de uma apresentação em spray de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado, e.g., diclorodifluo-rometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para distribuir uma quantidade medida. As cápsulas e cartuchos e.g. de gelatina para utilizar num inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido. 134 ΡΕ1019073

As composições podem, se necessário, ser apresentadas numa embalagem ou dispositivo dispensador que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente activo. A embalagem pode compreender por exemplo uma folha metálica ou plástica, tal como uma embalagem de bolhas. A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado por instruções para administração.

5.4. OUTRAS UTILIZAÇÕES

Os agonistas de ApoA-I do invento podem ser utilizados em ensaios in vitro para medir a HDL sérica, e.g., para fins de diagnóstico. Como os agonistas de ApoA-I se associam ao componente HDL do soro, os agonistas podem ser utilizados como "marcadores" para a população de HDL. Para além disso, os agonistas podem ser utilizados para a subpopulação de HDL que é eficaz no TIC. Para este fim, o agonista pode ser adicionado ou misturado com uma amostra de soro de um paciente; após um tempo de incubação apropriado, o componente HDL pode ser ensaiado através da detecção do agonista de ApoA-I incorporado. Isto pode ser alcançado utilizando um agonista marcado (e.g., radiomar-cadores, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, etc.) ou através de imunoensaios utilizando anticorpos (ou fragmentos de anticorpo) específicos para o agonista.

Alternativamente, o agonista marcado pode ser utilizado em procedimentos de imagiologia (e.g., varri- 135 ΡΕ1019073 mentos TAC, varrimentos IRM) para visualizar o sistema circulatório ou monitorizar o TIC ou para visualizar a acumulação de HDL em estrias gordas, lesões ateroscle-róticas, etc. (onde a HDL deve ser activa no efluxo de colesterol).

6. EXEMPLO: SÍNTESE DE AGONISTAS PEPTÍDICOS DE ApoA-I

Os péptidos descritos na TABELA X (Secção 8.3, infra) foram sintetizados e caracterizados tal como descrito nas subsecções abaixo. Os péptidos foram também analisados estruturalmente e funcionalmente tal como descrito nas Secções 7 e 8, infra.

6.1. SÍNTESE DOS PÉPTIDOS CENTRAIS

Os péptidos foram sintetizados em fase sólida de acordo com a técnica de Merrifield (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1969), utilizando 0,25 mmol de resina de p-alcoxibenzilálcool (resina HMP) (Wang, J. Am. Chem. Soc. 95: 1328-1333, 1973) e química de Fmoc. Todas as sínteses foram realizadas num sintetizador de péptidos automático Applied Biosystems ABI modelo 430A (Perkin-Elmer, Foster City, CA) . Os tempos de solvatação e de activação utilizados para cada ciclo de ligação são mostrados na TABELA V abaixo: ΡΕ1019073 136

TABELA V CICLOS ÚNICOS DO ACTIVADOR DA LIGAÇÃO NOME DO AMINOÁCIDOS SOLVENTE DE TEMPO TEMPO DE TEMPOS DE CICLO DESIGNADOS DISSOLUÇÃO ACTIVAÇÃO TRANS-FERÊNCIA* afmc 31 Asn(trt) His(trt) ~0,4ml DCM ~7 min. «51 min. 1=50 seg. 2=36 Lys(Boc),Trp «l,2ml NMP seg. ~l,0ml HOBt/NMP afmc 32 Arg(Pmc) «0,8ml DCM »32 min. «51 min. 1=60 seg. Gin(trt),Aib «1,2ml NMP 2=40 seg. ~1,Oml HOBt/NMP afmc 33 Ala,Asp(OtBu), «0,4ml DCM «4 min. «36.5 min. 1=38 seg. Glu(OtBu), Gly, «0,8ml NMP 2=27 seg. Ile,Leu, *0,lml Met,Phe,Pro HOBt/NMP afmc 34 Vai *0,4ml DCM ~4 min. «61.5 min. 1=38 seg. 2=27 «0,8ml NMP seg. «0,lml HOBt/NMP *1 = Transferência do Cartucho para o Activador. 2 = Transferência do Activador para o Cartucho. DCC é diciclo-hexilcarbodiimida, BOC é t-butiloxicarbonilo, HOBt é 1- hidroxibenzotriazol, Pmc é pentametilcroman-6-sulfonilo, NMP é N- metilpirrolidona, OtBu é t -butil-éster, trt é tritilo

As resinas foram lavadas com NMP entre cada passo de ligação. 0 protocolo para um ciclo de síntese é mostrado abaixo na TABELA VI: 137 ΡΕ1019073

TABELA VI

PROTOCOLO DE LIGAÇÃO PARA UM CICLO DE SÍNTESE OPERAÇÃO TEMPO (min.) 1. Desprotecção (piperdina a 10% em NMP) 20 2. Lavagem (NMP) 5 3. Ligação (4 equiv. éster de Fmoc-aminoácido-HOBT em NMP, 61 pré-activado 50 min.) 4. Lavaqem 3 5. Amostra da Resina (opcional) 3 TOTAL 92

Todos os aminoácidos excepto Fmoc-β-(1-naftil)-alanina foram ligados deste modo. Fmoc-β-(1-naftil)alanina foi ligado manualmente. Para a ligação manual, foram dissolvidos 1 mmol de Fmoc-β-(1-naftil)alanina e 1 mmol de tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (TBTU) em 5 ml de NMP e misturados com a resina do péptido. A partir dai, foram adicionados 2 mmol de N-etildiisopropilamina, a mistura foi agitada durante 2 horas e a resina do péptido lavada 6 vezes com 10 ml de NMP. A eficiência de ligação foi monitorizada utilizando o teste de Kaiser (Kaiser, Anal. Biochem. 34: 59577, 1970), e a ligação repetida se necessário. Após a ligação da naftil-alanina, o resto da síntese foi efectuado automaticamente tal como descrito acima. 138 ΡΕ1019073

6.2. SÍNTESE DE AMIDAS PEPTÍDICAS

Onde indicado, na TABELA X (Secção 8.3, infra), as amidas peptidicas foram sintetizadas utilizando uma resina de amidas Rink contendo a pega de amida Fmoc-Rink 4-(2',4'-dimetilfenil)-Fmoc-fenoximetilo (Rink, Tetrahedron Lett. 28: 3787-3790, 1987) e os protocolos de síntese descritos na Secção 6.1, supra.

6.3. SÍNTESE DE PÉPTIDOS ACILADOS NO TERMINAL N

Onde indicado na TABELA X (Secção 8.3, infra), as formas aciladas no terminal N dos péptidos foram preparadas através da exposição do péptido ligado à resina tal como descrito na Secção 6.1 ou 6.2, supra, a um agente de acilação apropriado.

Para os péptidos acetilados no terminal N, foram adicionados 15 ml de solução de ácido acético anidrido (10% v/v em NMP) a cada 1 g de péptido ligado à resina, a mistura foi agitada durante 5 min. e a resina recuperada através de filtração. A resina recuperada foi lavada três vezes com NMP (15 ml) e três vezes com etanol (15 ml).

6.4. CLIVAGEM E DESPROTECÇÃO

Após síntese, os péptidos descritos nas Secções 6.1, 6.2 e 6.3, supra, foram clivados da resina e desprotegidos com uma solução de clivagem contendo 92,5% de 139 ΡΕ1019073 ácido trifluroacético (TFA)/3,75% de anisol/3,75% de dodecantiol (v/v/v). Para efectuar a clivagem, 10 ml de solução de clivagem foram adicionados a 0,25 mmol de resina do péptido e agitou-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente. A resina foi removida através de filtração e o péptido clivado/desprotegido precipitado com éter dietilico, lavado com éter e seco em vácuo. A mistura de clivagem para péptidos contendo Trp (W) , bem como para amidas peptidicas, era composta por TFA a 86,5%, H20 a 4,5%, 1,2-etanoditiol a 4,5%, anisol a 4,5% e fenol a 3%.

6.5. PURIFICAÇÃO

Os péptidos brutos, clivados da Secção 6.4 foram purificados através de HPLC de fase inversa. A pureza de cada péptido foi confirmada através de diferentes técnicas analíticas (HPLC analítica, electroforese capilar). As electroforeses capilares foram realizadas em capilares de sílica fundida de 70 cm de comprimento e um diâmetro interno de 75 μΜ (Thermo Separation Products). As separações foram efectuadas a 25°C, 15 kV, tempo de corrida de 35 min., em dois sistemas tampão diferentes: Tampão 1 (Na2B407 20 mM, pH 9,2) e Tampão 2 (Na2HP04 10 mM, pH 2,5). As separações em HPLC foram realizadas em colunas Nucleosil 7C18 ou Nucleosil 7C4 (Macherey e Nagel, Alemanha), 250x21 mm, a um caudal de 8 ml/min. A eluição em gradiente foi efectuada utilizando uma mistura de TFA a 0,1% em água 140 ΡΕ1019073 (Solvente A) e TFA a 0,1% em acetonitrilo (Solvente B). Os gradientes utilizados foram ajustados para se verificarem as necessidades de cada péptido.

6.6. CARACTERIZAÇÃO A massa e a análise dos aminoácidos dos péptidos purificados descritos na Secção 6.5 foram confirmadas através de espectrometria de massa e análise dos aminoácidos, respectivamente, tal como descrito abaixo. Para a sequenciação foi utilizada degradação de Edman.

6.6.1 LC-MS

Para a determinação da massa foi utilizado um espectrómetro de massa quádruplo de triplo estádio comercialmente disponível (modelo TSQ 700; Finnigan MAT, San Jose CA, USA). Uma interface electrovaporizadora pneumaticamente assistida (ESI) foi utilizada para a introdução da amostra na fonte de ionização à pressão atmosférica do espectrómetro de massa. A interface vaporizadora foi operada a um potencial positivo de 4,5 kV. A temperatura do capilar de aço foi mantida a 200°C enquanto que o colector estava a 70°C. Os iões positivos gerados por este processo de evaporação iónica entraram no analisador do espectrómetro de massa. O multiplicador foi ajustado a 1000 V. O compartimento analisador do espectrómetro de massa estava a 4E-6. Todas as aquisições foram efectuadas à resolução de <lu. 141 ΡΕ1019073

Os péptidos foram analisados através de infusão directa dos péptidos purificados utilizando um sistema Microbore ABI (Applied Biosystems) consistindo numa bomba de seringa (modelo 140B), um detector de UV (modelo 785A) e um forno/injector (modelo 112A). 0 sistema solvente consistiu em água (solvente A) e acetonitrilo (solvente B) , cada um contendo TFA a 0,1%. Os péptidos foram infundidos a um gradiente ou a condições isocráticas e eluidos de uma coluna Aquapore C18. O caudal foi tipicamente de 300 μΐ/min. A concentração de cada péptido foi de cerca de 0,03 mg/ml, 20 μΐ dos quais foram injectados (e.g., 30 pmol).

Foram obtidas experiências de MS de varrimento completo através do varrimento quádruplo 1 de m/z 500-1500 em 4 seg. Os dados foram adquiridos utilizando uma estação Alpha DEC e foram processados utilizando o pacote de suporte lógico proporcionado por Finnigan MAT (BIOWORKS).

6.6.2. ANÁLISE DOS AMINOÁCIDOS A análise dos aminoácidos foi efectuada num Analisador de Aminoácidos 420 ABI (Applied Biosystems). Este sistema consiste em três módulos: um instrumento de hidrólise e derivação, uma HPLC de fase inversa e um sistema de dados. A amostra peptídica foi aplicada (3 vezes em triplicado) em lâminas de vidro poroso e subsequentemente hidrolisada sob condições de fase gasosa (155° C, 90 min.). Após a remoção do HC1, os aminoácidos resultantes 142 ΡΕ1019073 foram convertidos em PTC-AA (Feniltiocarbamoil-aminoácidos) utilizando PITC (Fenilisotiocianato). Após transferência para a volta da amostra de HPC as misturas resultantes foram fraccionadas numa coluna Aquapore C18 utilizando um modo de gradiente (Solvente A: 50 mmol de acetato de amónio (NH4Ac), pH 5,4, em água; Solvente B: 32 mmol de acetato de sódio (NaOAc) em acetonitrilo aquoso) sob condições de controlo da temperatura. Os dados de HPLC foram processados através do pacote de suporte lógico proporcionado por Applied Biosystems. A quantificação foi efectuada relativamente a um padrão peptídico distribuído por Applied Biosystems.

6.7. SÍNTESE DE REDES RAMIFICADAS A resina tetramérica-peptidilo central e a resina trimérica-peptidilo central são sintetizadas tal como descrito em Demoor et al., Eur. J. Biochem. 239: 74-84, 1996. A matriz tetramérica e trimérica central ainda ligada à resina de 4-metil-benzidrilamina é então utilizada como resina do peptidilo inicial para a síntese automática dos péptidos centrais tal como anteriormente descrito.

Redes ramificadas contendo segmentos helicoidais com diferentes composições de aminoácidos podem ser sintetizadas utilizando síntese ortogonal e estratégias de protecção bem conhecidas na arte. 143 ΡΕ1019073

7. EXEMPLO: ANÁLISE ESTRUTURAL E DA LIGAÇÃO A LÍPIPOS DOS PÉPTIDOS DE ApoA-I

As características estruturais e de ligação a lipidos dos péptidos purificados sintetizados tal como descrito na Secção 6, supra, foram determinadas através de dicroísmo circular (DC), espectroscopia de fluorescência e ressonância magnética nuclear (RMN).

7.1. DICROÍSMO CIRCULAR

Este Exemplo descreve um método preferido para a determinação do grau de helicidade dos péptidos centrais do invento tanto livres em tampão como na presença de lipidos.

7.1.1. MÉTODO EXPERIMENTAL

Os espectros longínquos de dicroísmo circular de UV foram registados entre 190 e 260 nm (em aumentos de 0,5 nm ou 0,2 nm) com um espectrómetro AVIV62DS (AVIV Associates, Lakewood, NJ, USA) equipado com um suporte de célula termoeléctrica e um permutador de amostras. O instrumento foi calibrado com ácido (+)-10-canfórico. Foram recolhidos entre um e três varrimentos para cada amostra, utilizando células Suprasil de quartzo com um comprimento de via de 10 cm, 5 cm, 1 cm e 0,1 cm, respectivamente, para concentrações peptídicas de 10"7 M a 10“4 Μ. A largura de banda foi fixada a 1,5 nm e a velocidade do varrimento é por passo de comprimento de onda. Os dados relatados são a média de pelo menos 2 ou 3 medições independentes. 144 ΡΕ1019073

Após subtracção do fundo, os espectros foram convertidos em elipticidade molar (Θ) por resíduo em graus. cm"2 drnol"1. A concentração peptídica foi determinada através da análise dos aminoácidos e também através de espectrometria de absorção num espectrómetro Perkin Elmer Lambda 17 UV/Visível quando o péptido continha um cromóforo (triptofano, dansilo, naftilalanina).

Os espectros de DC foram obtidos com péptido livre não ligado (5 μΜ em tampão fosfato 5 mM, pH 7,4); com complexos péptido-SUV (EPC:Col 20:1, Ri = 30 e Ri =50); com complexos péptido-micelas (l-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfatidilcolina, Ri=100); e com péptido livre não ligado na presença de 2,2,2-trifluoroetanol (TFE) (péptido 5 μΜ, TFE a 90% vol).

As SUVs foram obtidas através da dispersão dos lípidos (10 mM, EPC:Col 20:1, Avanti Polar Lipids, AL) em tampão fosfato (5 mM, pH 7,4) fazendo borbulhar N2 durante 5 min., seguido de ultra-sons (1,5 h) num banho de ultra-sons. A homogeneidade da preparação foi verificada através de FPLC.

As micelas foram obtidas através de dispersão do lípido (l-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfatidilcolina 6 mM, Avanti Polar Lipids, AL) em tampão fosfato (5 mM, pH 7,4) fazendo borbulhar N2 durante 5 min., seguido de vórtice. 145 ΡΕ1019073

Para obter os complexos péptido-SW, as SUVs foram adicionadas ao péptido (5 μΜ em tampão fosfato 5 mM, pH 7,4) a uma razão molar fosfolipido-péptido (Ri) de 30 ou 50.

Para obter os complexos péptido-micelas, as micelas foram adicionadas ao péptido (5 μΜ em tampão fosfato 5 mM, pH 7,4) a uma Ri de 100.

Todos os espectros foram registados a 37°C. A estabilidade do péptido 4 (SEQ ID NO: 4) em função da temperatura (tanto livre em tampão como nas micelas) foi determinada através do registo dos espectros numa série de temperaturas diferentes.

Foi também determinado o grau de helicidade do péptido 4 (SEQ ID NO:4) em função da concentração.

7.1.2. DETERMINAÇÃO DA HELICIDADE

O grau de helicidade dos péptidos nas várias condições foi determinado a partir da elipticidade média dos resíduos a 222 nm (Chen et al., Biochemistry 13: 3350— 3359, 1974) ou através da comparação dos espectros de DC obtidos em relação aos espectros disponíveis em bases de dados (16 espectros de referência helicoidais de Provencher e Glockner, Biochemistry 2-0: 33-37, 1981; espectros de referência de proteínas desnaturadas de Venyaminov et al., 146 ΡΕ1019073

Anal. Biochem. 214: 17-24, 1993) utilizando o algoritmo de ajuste à curva CONTIN versão 2DP, pacote CD-I (Ago. de 1982) (Provencher, Comput. Phys. Commun. 27: 213-227, 229— 242, 1982). 0 ajuste aceitável foi determinado utilizando a metodologia de análise estatística proporcionada pelo algoritmo CONTIN. O erro de todos os métodos foi de ±5% de helicidade.

7.1.3 RESULTADOS 0 grau de helicidade (%) dos péptidos livres, não ligados (livres), dos complexos péptido-SUV (SUVs), dos complexos péptido-micelas (mies) e da solução péptido-TFE (TFE) estão relatados na TABELA X, Secção 8.3, infra. O grau de helicidade do péptido 4 (SEQ ID NO:4) em função da concentração (livre e ligado a lípidos) é proporcionado na TABELA VII.

TABELA VII

% DE HELICIDADE DO PÉPTIDO 4 (SEQ ID NO:4) EM FUNÇÃO DA

CONCENTRAÇÃO

Concentração (μΜ) Livre % DE HELICIDADE Ligado (micelas) TFE 0,15 42 65 - 0,40 58 68 - 2,0 63 - - 5,0 80 95 - 50,0 - - 94 O péptido 4 (SEQ ID NO:4) contém uma estrutura 147 ΡΕ1019073 significativamente em hélice α (80% de helicidade) em tampão a uma concentração de 5 μΜ. Embora o grau de helicidade diminua com a diminuição da concentração do péptido, é mantida uma helicidade significativa (42%) mesmo a concentrações tão baixas como 0,15 μΜ. Para além disso, a estrutura em hélice α é completamente estável ao longo de um intervalo de temperatura de 5-45°C (dados não mostrados) . A helicidade do péptido 4 (SEQ ID NO:4) aumenta na presença tanto de SUVs (97% de helicidade) como de micelas (95% de helicidade), e também na presença de TFE (94% de helicidade), que é um solvente que, devido a ter uma constante dieléctrica significativamente inferior (ε=26,7) à da água (ε=78,4), estabiliza as hélices α e as ligações de hidrogénio intrapéptidos a concentrações entre 5-90% (v/v).

Em relação à TABELA X, Secção 8.3, infra, pode observar-se que os péptidos que exibem um elevado grau de activação de LCAT (>38%) possuem geralmente uma estrutura significativa em hélice α na presença de lipidos (-60% de estrutura helicoidal no caso de péptidos não bloqueados contendo 22 ou mais aminoácidos ou péptidos bloqueados contendo 18 ou menos aminoácidos; ^40% de estrutura helicoidal no caso de péptidos não bloqueados contendo 18 ou menos aminoácidos), enquanto que os péptidos que exibem pouca ou nenhuma activação de LCAT possuem pouca estrutura em hélice a. No entanto, nalguns casos, os péptidos que 148 ΡΕ1019073 contêm uma estrutura em hélice α significativa na presença de lípidos não exibem uma activação de LCAT significativa. Como consequência, a capacidade dos péptidos centrais do invento para adoptarem uma estrutura de hélice α na presença de lipidos é considerada uma caracteristica critica dos péptidos centrais do invento, tal como a capacidade para formarem uma hélice α na presença de lipidos parece ser um pré-requisito para a activação de LCAT.

7.2. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

As propriedades de ligação aos lipidos dos péptidos sintetizados na Secção 6, supra, foram testadas através de medições de fluorescência com péptidos marcados, no presente caso Triptofano (Trp ou W) ou Naftilalanina (Nal). Os espectros de fluorescência foram registados num Fluoromax de Spex (Jobin-Yvon) equipado com uma lâmpada de Xenon de 150 W, dois monocromadores (excitação e emissão) , um fotomultiplicador R-928 para detecção sensível no vermelho até 850 nm e um suporte de célula termoeléctrica com agitação magnética. Foram utilizadas cuvetes Suprasil de Quartzo para medições no intervalo de concentrações micromolares. Um dispositivo de fendas variáveis (de 0,4 a 5 nm) permite a modulação das intensidades incidente e emitida de acordo com a concentração do péptido utilizado. Os valores relatados são em geral a média de entre 2 a 4 espectros. A concentração do péptido é determinada através de espectrometria de absorção num Philips PU 8800 149 ΡΕ1019073 utilizando a banda de absorção do Trp (ε28ο nm=5550 M 1cm 1 em tampão Tris) o do Nal (ε224 nm=92770 M"1cm"1 em metanol) .

Os espectros de fluorescência dos péptidos foram registados entre 290 nm e 450 nm em tampão Tris-HCl (20 mM, pH = 7,5), na presença e ausência de vesículas lipídicas. As pequenas vesículas unilamelares foram formadas após re-hidratação em tampão dos fosfolípidos liofilizados, dispersão e ultra-sons em ponta sob uma corrente de N2. Os lípidos utilizados foram PC de ovo/Col. (20:1) ou POPC/Col. (20:1). Os espectros foram registados a uma concentração peptídica de 2 μΜ e a uma temperatura de 37°C. O padrão de referência de fluorescência no caso de Trp foi N-acetiltriptofanilamida (NATA).

Os estudos de ligação a lípidos foram feitos através da adição progressiva de vesículas lipídicas ao péptido em solução a 2 μΜ (fendas: 5 nm na excitação e 1,5 nm na emissão). Os efeitos de diluição foram tidos em conta para a determinação da intensidade de fluorescência. As concentrações de lípidos foram variadas de 10 a 600 μΜ e a razão molar de lípido para péptido (Ri) foi variada de 5 a 300. O comprimento de onda de excitação foi estabelecido a 280 nm tanto para Trp como para Nal.

7.2.1. ANÁLISE DO ESPECTRO DE FLUORESCÊNCIA

Os dados foram registados directamente e tratados num PC IBM ligado ao espectrofluorímetro através do suporte 150 ΡΕ1019073 lógico DM3000F de Spex. Os espectros foram corrigidos através de subtracção da contribuição do solvente e através de aplicação de um coeficiente dado pelo fabricante tendo em conta a variação da resposta do fotomultiplicador versus o comprimento de onda.

Os espectros de fluorescência dos péptidos foram caracterizados pelo comprimento de onda no seu máximo de emissão de fluorescência e pelo seu rendimento quântico em comparação com NATA no caso de péptidos marcados com um triptofano. O processo de ligação a lípidos foi analisado através do cálculo da mudança do comprimento de onda no máximo da emissão de fluorescência (λΜΧ), e a variação da intensidade relativa de fluorescência de emissão versus a concentração lipidica. A intensidade relativa de fluorescência é definida como a seguinte razão: (I-I0)xmax/IoXmax- I e Io são ambas medidas ao (Xmax) correspondente ao estado livre inicial do péptido, i.e., sem lípidos. I é a intensidade a uma razão de lípido para péptido definida e Io é o mesmo parâmetro medido na ausência de lípidos. A ausência destas variações é relevante da ausência de interacções dos péptidos com os lípidos.

7.2.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As propriedades de ligação a lípidos do péptido 15 (SEQ ID NO: 15) (que é o péptido 4 contendo um resíduo Trp na posição 10) são apresentadas na TABELA VIII. 151 ΡΕ1019073

TABELA VIII

PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO DO PÉPTIDO 15 (SEQ ID NO:15) A VESÍCULAS LIPÍDICAS MEDIDAS ATRAVÉS DE FLUORESCÊNCIA

Razão Molar Lípido:Péptido (Ri) I/Io Kax (nm) 0 0 332 5 10,8 323 10 13,2 323,5 30 17,5 323 100 26,4 323 200 43,5 323 O máximo da emissão de triptofano (A™ax) a 332 nm indica que no tampão a uma concentração de 2 μΜ o péptido está ligeiramente auto-associado. 0 péptido liga-se às vesículas lipídicas (EPC/Col 5%) com uma afinidade muito elevada tal como demonstrado pela ocultação do Trp (o máximo das mudanças do comprimento de onda de emissão do Trp de 332 nm para 323 nm) e a elevada exaltação da intensidade de fluorescência (ver TABELA VIII). A ocultação máxima do resíduo de Triptofano é obtida para uma razão molar muito baixa de lípido para péptido, inferior a 5.

Outros péptidos que exibiram um elevado grau de helicidade na presença de lípidos (>60% para péptidos não bloqueados de ê22 aminoácidos, ou péptidos bloqueados de 18 aminoácidos; ^40% para péptidos não bloqueados de <18 aminoácidos) medido através de dicroísmo circular tal como divulgado na Secção 7.1, supra, demonstraram também boa ligação a lípidos. Claro que entre todos os péptidos 152 ΡΕ1019073 seleccionados através da pesquisa por dicroísmo circular, apenas os que podiam ser seguidos por fluorescência foram testados quanto às suas propriedades de ligação a lipidos. 7.3. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

Este Exemplo descreve um método de RMN para análise da estrutura dos péptidos centrais do invento.

7.3.1. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DE RMN

As amostras foram preparadas através da dissolução de 5 mg de péptido em H20 a 90%/D2O a 10% contendo quantidades vestigiais de 2,2-dimetil-2-sila-5-pentano-sulfonato (DSS) como referência interna da transição quimica. Algumas das amostras continham trifluoroetanol (TFE) (expresso como % de vol) . O volume total da amostra foi de 500 μΐ e a concentração do péptido foi de aproxi-madamente 5 mM.

7.3.2. ESPECTROSCOPIA DE RMN

Os espectros de RMN-1!! foram adquiridos a 500 MHz utilizando um espectrómetro Bruker DRX500 equipado com uma unidade de controlo da temperatura B-VT2000. As experiências uni e bidimensionais foram registadas utilizando sequências de pulsos padrão ("Two Dimensional NMR Spectros-copy", Eds. W.R. Croasmun e RMK Carlson, VCH Publishers, New York, USA, 1994). A supressão de água foi alcançada com 153 ΡΕ1019073 uma pré-saturação de baixa potência durante 2 seg. As experiências bidimensionais foram realizadas no modo sensível à fase utilizando aumentos de fase proporcionais ao tempo (TPPI) e uma largura de espectro de 6000 Hz em ambas as dimensões. Tipicamente, 40 varrimentos foram co-adicionados para aumentos de 400 ti com 2048 pontos de dados. Os dados foram processados utilizando suporte lógico FELIX95 (Molecular Simulations) numa estação de trabalho INDIG02 (Silicon Graphics). Os dados foram enchidos com zeros para dar uma matriz de dados de 2K x 2K e apostos por uma função sinusal quadrada deslocada 45°.

7.3.3. ATRIBUIÇÃO DE RMN

As atribuições completas da ressonância de protões foram obtidas através da aplicação da técnica de atribuições sequenciais utilizando espectros DQFCOSY, TOCSY e NOESY tal como descrito na literatura (Wuthrich, "NMR of Proteins and Nucleic Acids", John Wiley & Sons, New York, USA, 1986) . As transições químicas secundárias foram calculadas para protões de HN e Hoí através da subtracção das transições químicas tabuladas de enrolamento aleatório (Wishart e Sykes, Method. Enz. 239: 363-392, 1994) dos valores experimentais correspondentes.

7.3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Consideração Geral. Os péptidos helicoidais anfipáticos tendem a agregar-se em soluções aquosas às 154 ΡΕ1019073 elevadas concentrações necessárias para espectroscopia de RMN, tornando difícil a obtenção de espectros de elevada resolução. Por exemplo, os espectros de RMN do péptido central exemplar 4 (SEQ ID NO:4) em água exibem linhas muito amplas. Assim, as ressonâncias de cada resíduo de aminoácido não podem ser resolvidas. A adição de TFE à amostra melhora a resolução dos espectros. Sabe-se que o TFE solubiliza péptidos e estabiliza adicionalmente conformações helicoidais de péptidos possuindo propensão helicoidal. As descobertas da espectroscopia de RMN são demonstradas para o péptido 4 (SEQ ID NO:4) como exemplo representativo. 0 22-mero de consenso de Segrest (SEQ ID NO:75) foi estudado em comparação.

Transições químicas secundárias. As transições químicas de protões dos aminoácidos dependem tanto do tipo de resíduo como da estrutura secundária local dentro de um péptido ou proteína (Szlagyi, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 27: 325-443, 1995). Portanto, a identificação da estrutura secundária normal é possível através da comparação das transições experimentais com valores tabulados para a conformação do enrolamento aleatório. A formação de uma hélice α resulta tipicamente num transição para um campo superior (negativa) para a ressonância de Ηα. A observação de uma transição de Ha para um campo superior para vários resíduos sequenciais é geralmente tomada como prova de uma estrutura em hélice. As 155 ΡΕ1019073 transições secundárias de Ha para o péptido 4 (SEQ ID N0:4) em TFE a 25% a 295 K mostram uma transição negativa significativa para os residuos 4 até 19 (FIG. 9A) , demonstrando uma conformação altamente helicoidal. Pequenas diferenças são observadas nas transições quimicas de Ha do 22-mero de consenso (SEQ ID NO:75) em comparação com o péptido 4 (SEQ ID NO:4).

As transições quimicas dos hidrogénios das amidas dos residuos de aminoácidos que residem em regiões da hélice α são também deslocadas para um campo superior em relação às transições quimicas observadas para o enrolamento aleatório. Adicionalmente, pode ser observada uma periodicidade das transições de HN, e isto reflecte o período das voltas helicoidais. A amplitude da variação das transições ao longo da sequência está relacionada com a anfipaticidade de um péptido helicoidal. Um momento hidrófobo superior conduz a uma oscilação mais pronunciada (Zhou et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 4320-4326, 1992). As transições secundárias de HN para o péptido 4 (SEQ ID NO:4) em TFE a 25% a 295 k mostram um comportamento oscilatório de acordo com a natureza anfipática da hélice (FIG. 9B). O padrão da transição química da amida do péptido 22-mero de consenso (SEQ ID NO:75) difere significativamente do do péptido 4 (SEQ ID NO:4). Em particular, a substituição dos resíduos 5, 9 e 13 por Leu (L) resulta em transições quimicas com uma periodicidade mais pronunciada no caso do péptido 4 (SEQ ID NO:4). O efeito prolonga-se mesmo ao resíduo 17 e numa menor extensão ao resíduo 21. A partir 156 ΡΕ1019073 dos dados de RMN, pode ser discernida a existência de 5-6 voltas na sequência. Assim, a substituição de três aminoácidos afecta a dobragem do péptido ao longo de toda a sequência. 0 padrão de RMN reflecte claramente a natureza antipática mais forte do péptido 4 (SEQ ID N0:4) em comparação com o péptido 22-mero de consenso de Segrest (SEQ ID NO:75). A transição secundária de um protão de uma amida é influenciada pelo comprimento da ligação de hidrogénio ao oxigénio do carbonilo a uma volta de distância da hélice. Portanto, a periodicidade dos valores da transição química observada reflecte diferentes comprimentos da ligação de hidrogénio. Esta diferença está associada a uma forma helicoidal curva global da estrutura da hélice. Os resíduos hidrófobos ficam situados no lado côncavo. As transições secundárias do péptido 4 (SEQ ID N0:4) indicam uma configuração em hélice α curva. 7.3.5. PÉPTIDOS CONTENDO GLICINAS INTERNAS SÃO HELICOIDAIS NA PRESENÇA DE NOEs A estrutura tridimensional do péptido 8 (SEQ ID NO: 8) foi determinada na presença de TFE utilizando constrangimentos da distância interprotónica derivados dos Efeitos Nucleares de Overhauser (NOEs). Em particular, a presença de NOEs de médio alcance (daN3, dap3, daN4) ao longo de toda sequência é consistente com uma estrutura global em hélice a. Foi gerada uma família de rotâmeros a 157 ΡΕ1019073 partir do conjunto de dados de RMN e as estruturas sobrepuseram-se bem do resíduo 4 ao 19 com uma estrutura RMSD <0,8 Â. Uma representação em fita estéreo da estrutura média juntamente com o vestígio do esqueleto dos 15 rotâmero de menor energia confirmam uma forma helicoidal curva. Numa estimativa aproximada, a curva resulta num ângulo de 20° entre a metade N-terminal e a C-terminal do péptido. Os resíduos hidrófobos são principalmente verificados no lado côncavo com excepção de Leu-5. Um agrupamento hidrófobo bem definido fica centrado em torno de Phe-6 incluindo Leu-3, Leu-9 e Leu-10. Embora as voltas helicoidais se iniciem em torno do resíduo 3 no terminal N, a existência de muitos NOEs até ao resíduo 22 indica que a hélice se prolonga até ao final do terminal C.

8. EXEMPLO: ENSAIO DE ACTIVAÇÃO DE LCAT

Os péptidos sintetizados tal como descrito na Secção 6, supra, foram analisados in vitro quanto à sua capacidade para activarem LCAT. No ensaio de LCAT, as vesículas do substrato (pequenas vesículas unilamelares ou "SUVs") compostas por fosfatidilcolina de ovo (EPC) ou 1-Palmitoil-2-oleil-fosfatidilcolina (POPC) e colesterol radiomarcado são pré-incubadas com massas equivalentes de péptido ou ApoA-I (isolada a partir de plasma humano). A reacção é iniciada através da adição de LCAT (purificada a partir de plasma humano). A ApoA-I nativa, que foi utilizada como controlo positivo, representa uma actividade de activação de 100%. A "actividade específica" (i.e., 158 ΡΕ1019073 unidades de actividade (activação de LCAT)/unidade de massa) dos péptidos pode ser calculada como a concentração de péptido que alcança uma activação máxima de LCAT. Por exemplo, pode ser ensaiada uma série de concentrações do péptido (e.g., uma diluição limitante) para determinar a "actividade especifica" para o péptido - a concentração que alcança uma activação máxima de LCAT (í.e., percentagem de conversão de colesterol em éster de colesterol) num momento especifico no ensaio (e.g., 1 h) . Quando se representa graficamente a percentagem de conversão do colesterol, e.g., a 1 h, contra a concentração de péptido utilizado, a "actividade especifica" pode ser identificada como a concentração de péptido que alcança um patamar na curva do gráfico.

8.1. PREPARAÇÃO DAS VESÍCULAS DE SUBSTRATO

As vesículas utilizadas no ensaio de LCAT são SUVs compostas por fosfatidilcolina de ovo (EPC) ou 1-palmitoil-2-oleil-fosfatidilcolina (POPC) e colesterol com uma razão molar de 20:1. Para preparar uma solução de reserva de vesículas suficiente para 40 ensaios, são dissolvidos e liofilizados 7,7 mg de EPC (ou 7,6 mg de POPC; 10 ymol), 78 pg (0,2 pmol) de 4-14C-colesterol, 116 pg de colesterol (0,3 pmol) em 5 ml de xileno. A partir dai são adicionados 4 ml de tampão de ensaio ao pó seco e sujeita-se a ultra-sons sob atmosfera de azoto a 4°C. Condições de ultra-sons: sonicador Branson 250, sonda de 10 159 ΡΕ1019073 mm, 6 χ 5 minutos; Tampão de ensaio: Tris 10 mM, NaCl 0,14 M, EDTA 1 mM, pH 7,4). A mistura sujeita a ultra-sons é centrifugada 6 vezes durante 5 minutos de cada vez a 14000 rpm (16000 xg) para remover as partículas de titânio. A solução clara resultante é utilizada para o ensaio enzimático.

8.2. PURIFICAÇÃO DE LCAT

Para a purificação de LCAT, é utilizado tratamento com sulfato de dextrano/Mg2+ do plasma humano para obter soro deficiente em lipoproteínas (LPDS), que é sequencialmente sujeito a cromatografia em Fenil-sepharose, Affigelblue, Concanavalina A-sepharose e cromatografia de afinidade com anti-ApoA-I, tal como resumido para uma purificação representativa na TABELA IX, abaixo:

TABELA IX

PURIFICAÇÃO DE LCAT

Fracção Volume Total (ml) Proteína Total (mg) Actividade Total (nmol CE/mg.h) Rendi mento (%) Purifi cação (vezes) Plasma 550 44550 63706 LPDS 500 31000 62620 98 1,4 Fenil-Sepharose 210 363 51909 82 100 Affigelblue 95 153 25092 39 115 ConA Sepharose 43 36 11245 18 220 Afinidade anti-A-I 120 3,5 5500 9 1109 160 ΡΕ1019073 8.2.1. PREPARAÇÃO DE LPDS plasma Para preparar LPDS, são adicionados 500 ml de a 50 ml de solução de sulfato de dextrano (ΡΜ= 500000) . Agitar 20 minutos. Centrifugar durante 30 minutos a 3000 rpm (16000 xg) a 4°C. Utilizar o sobrenadante (LPDS) para mais purificação (ca. 500 ml). 8.2.2. CROMATOGRAFIA DE FENIL-SEPHAROSE Para a cromatografia de fenil-sepharose são utilizados os seguintes materiais e condições. fase sólida: Fenil-sepharose de fluxo rápido, elevado coluna: grau de subst., Pharmacia XK26/40, altura do leito de gel: 33 cm, V=ca. 175 ml caudais: : 200 ml/h (amostra) lavagem: : 200 ml/hr (tampão) eluição: : 80 ml/hr (água destilada) tampão: Tris 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM pH 7-4, azida de sódio a 0,01%. Equilibrar a coluna em tampão Tris, adicionar 29 g de NaCl a 500 ml de LPDS e aplicar na coluna. Lavar com vários volumes de tampão Tris até a absorção a um comprimento de onda de 280 nm estar aproximadamente no limiar, depois iniciar a eluição com água destilada. As fracções contendo proteína são reunidas (tamanho do banco: 180 ml) e utilizadas para cromatografia de Affigelblue. 161 ΡΕ1019073

8.2.3. CROMATOGRAFIA DE AFFIGELBLUE 0 banco de Fenil-sepharose é sujeito a diálise de um dia para o outro a 4°C contra Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, azida de sódio a 0,01%. O volume do banco é reduzido através de ultrafiltração (Amicon YM30) até 50-60 ml e carregado numa coluna de Affigelblue. fase sólida: Affigelblue, Biorad, 153-7301 coluna: XK26/20, altura do leito de gel: ca. 13 cm, volume da coluna: aprox. 70 ml caudais: carga: 15 ml/h lavagem: 50 ml/h

Equilibrar a coluna em tampão Tris. Aplicar o banco de Fenil-sepharose na coluna. Iniciar em paralelo a recolha das fracções. Lavar com tampão Tris. As fracções reunidas (170 ml) foram utilizadas para cromatografia de ConA.

8.2.4. CROMATOGRAFIA de ConA O banco de Affigelblue foi reduzido através de Amicon (YM30) até 30-40 ml e sujeito a diálise contra tampão de início de ConA (Tris-HCl 1 mM pH 7,4; MgCl2 1 mM, MnCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, azida de sódio a 0,01%) de um dia para o outro a 4°C. 162 ΡΕ1019073 fase sólida: ConA sepharose (Pharmacia) coluna: XK26/20, altura do leito de gel: 14 cm (75 ml) Caudais: carga: 40 ml/h lavagem (com tampão de inicio): 90 ml/h eluição: 50 ml/h, Metil-a-D-manósido 0,2 M em Tris 1 mM, pH 7,4. As fracções proteicas das eluições de manósido foram recolhidas (110 ml) e o volume foi reduzido através de ultrafiltração (YM30) até 44 ml. O banco de ConA foi dividido em aliquotas de 2 ml, que foram armazenadas a - 20°C. 8.2.5. CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE ANTI-ApoA-I A cromatografia de afinidade anti-ApoA-I foi efectuada em material Affigel-Hz (Biorad), ao qual foi ligado covalentemente o ac anti-ApoA-I. coluna: XK16/20, V=16 ml. A coluna foi equilibrada com PBS pH 7,4. 2 ml do banco de ConA foram sujeitos a diálise durante 2 horas contra PBS antes de serem carregados na coluna. caudais: carga: 15 ml/h lavagem (PBS): 40 ml/h.

As fracções proteicas reunidas (V=14 ml) são utilizadas para ensaios de LCAT. 163 ΡΕ1019073 A coluna é regenerada com tampão citrato 0,1 M (pH 4,5) para eluir a A-I ligada (100 ml) e imediatamente após este procedimento reequilibrada com PBS.

8.3. RESULTADOS

Os resultados do ensaio de activação de LCAT são apresentados na TABELA X, infra.

TABELA X ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA FOR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES EÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINQÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 1 (SEQ ID NO: 1) PVLDLFRELLNELLEZEKQKLK 120% 77 85 81 69 2 (SEQ ID NO: 2) GVLDLERELtNELLEAIjKQKLKK 105% 3 (SEQ ID NO: 3) FVLDLFRET ,Τ,ΝΕΤ ,T ,EWT ,ΚΟΚΤ K 98% 70 95 80 95 4 (SEQ ID NO: 4) FVLDLFKELIiNELLEAIKQKLK 93% 80 95 97 94 5 (SEQ ID NO: 5) pVLDT ,ERET ,Τ,ΝΕΤ ,Τ ,ΕΆΤ ,ΚΟΚΤ KK 90% 6 (SEQ ID NO: 6) PVLDLERELINEXLEALKQKLK 80% 57 93 70 99 7 (SEQ ID NO: 7) FVT PT iEKF.T ,Τ ,ΝΕΤ ,Τ ,ΕΆΤ ,ΚΟΚΤ K 83% 77 89 85 73 8 (SEQ ID NO: 8) FVT ,ΠΤ iERET ,T iNFiOT ,ΕΆΤ ,ΚΟΚΤ ,Κ 83% 20 90 61 93 9 (SEQ ID NO: 9) FVT ,ητ lERET iONFiT ,Τ ,ΕΆΤ ,ΚΟΚΤ ,Κ 83% ΡΕ1019073 164 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 10 (SEQ ID NO:10) PVLDLERELLNELLEAZKQKLK 79% 60 87 70 71 11 (SEQ ID NO:11) FVLDLEKELLQELLEALKQKLK 72% 12 (SEQ ID NO:12) PVLDLERELUNIELLEAGKQKLK 70% 13 (SEQ ID NO:13) πντ ,ητ FRF.T ,τ ,νεοτ ,f,at ,κοκτ k 67% 14 (SEQ ID NO:14) FVT ,ητ .ERFiT .T.NF.T ,Τ ,FAT OOOT Ο 61% 70 96 80 15 (SEQ ID NO:15) PVLDLERELWNELLEALKQKLK 60% 55 60 64 68 16 (SEQ ID NO:16) FVT ,ητ ,Τ .RF.T .T.NF.T ,Τ .F.AT ,ΚΟΚΤ Κ 59% 17 (SEQ ID NO:17) FVT Κ,Τ KKF.T ,Τ QF.T ,Τ .F.AT ,ΚΟΚΤ Κ 59% 18 (SEQ ID NO:18) CVT ,ητ .ERFiT .T.NF.T ,Τ .F.AT ,ΚΟΚΤ ,Κ 58% 19 (SEQ ID NO:19) ρντ ,ητ .ERFiT ,Τ iNFiOT .F.AT ,ΚΟΚΤ ,Κ 58% 20 (SEQ ID NO:20) FVLDLEREGENELLEALKQKLK 57% 21 (SEQ ID NO:21) pVT ,ΠΤ KRF.T .T.NF.T ,Τ .F.AT ,ΚΟΚΤ ,Κ 57% 22 (SEQ ID NO:22) FVT ,ΠΤ .“FRF.T .T.NF.T ,Τ ,ΕΟΤ ,ΚΟΚΤ ,Κ 54% 23 (SEQ ID NO:23) PT .T.F.T .FKF.T .TQF.T ,Τ .F.AT ,ΚΟΚΤ ,Κ 54% 24 (SEQ ID NO:24) PVLDLFRELLNELLEALQKKLK 53% 25 (SEQ ID NO:25) PVT JWRF.T ,Τ .NF.XT .F.AT ,ΚΟΚΤ ,Κ 51% 46 82 93 ΡΕ1019073 165 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 26 (SEQ ID NO:26) PVLDLERELLNELLELLKQKLK 47% 27 (SEQ ID NO:27) FVLDLERELLNELZEALKQKLK 44% 72 92 82 81 28 (SEQ ID NO:28) FVT ,DT iNRF.T .T.NF.T ,WFAT ,ΚΟΚΤ K 40% 82 98 90 81 29 (SEQ ID NO:29) AVT ,DT iERFiT .T.NF.T ,T ,FAT ,ΚΟΚΤ K 39% 30 (SEQ ID NO:30) FVT ,DT iERFiT .T.NF.T ,T ,FAT ,ΚΟΚΤ K' 38% 85 90 98 90 31 (SEQ ID NO:31) PVLDLFLELLNEXLEALKQKLK 34% 49 98 90 32 (SEQ ID NO:32) XVT ,DT KRF.T .T.NF.T ,T ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 33% 33 (SEQ ID NO:33) FVT ,DT FRFKT iNF.T ,T ,FAT ,ΚΟΚΤ K 33% 34 (SEQ ID NO:34) FVT iDZFRFT .T.NF.T ,T ,FAT ,ΚΟΚΤ K 32% 58 67 68 62 35 (SEQ ID NO:35) FVT iDWFRF.T .T.NF.T ,T ,FAT ,ΚΟΚΤ K 31% 49 (ps) 59 61 36 (SEQ ID NO:36) PLLELLKELLQELLEALKQKLK 31% 95 100 95 37 (SEQ ID NO:37) FVT ,DT FRFWT NF.T ,T ,FAT ,ΚΟΚΤ K 29% 65 75 76 73 38 (SEQ ID NO:38) P\TT ,DT iERFiT ,T iNF.XT .FAWKQKT ,K 29% 25 49 21 49 39 (SEQ ID NO:39) P\TT ,DT iERFiT ,T ,F.F.T ,Τ ιΚΆΤ ,ΚΚΚΤ ,K 25% 66 69 68 72 40 (SEQ ID NO:40) PVLDLENELLRELLEALQKKLK 25% 66 84 79 77 41 (SEQ ID NO:41) P\TT ,DT ,WRF,T ,T ,NF,XT ,F,AT ,ΚΟΚΤ ,K 25% 53 73 85 69 ΡΕ1019073 166 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 42 (SEQ ID NO:42) FVLDEEREKLNEXWEALKQKLK 25% 15 74 27 76 43 (SEQ ID NO:43) PVLDEEREKLWEXLEALKQKLK 25% 44 (SEQ ID NO:44) pvldefreklneXlealkqklk 25% 20 86 45 (SEQ ID NO:45) FVT .DFFRFiKT NF.XT ,FAT ,ΚΟΚΤ K 24% 24 84 25 86 46 (SEQ ID NO:46) FVT ,DT iERFiKT ,NF,XT ,FAT KQKT K 23% 30 86 58 85 47 (SEQ ID NO:47) -VLDLERELLNEGLEALKQKLK 23% 48 (SEQ ID NO:48) pvT ,DT iNRF.T .T.NF.T ,T ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 22% 49 (SEQ ID NO:49) FVLDLFRNLIEKLLEAIEQKLK 22% 57 65 52 57 50 (SEQ ID NO:50) PVLDLFRELLWEXLEALKQKLK 21% 68 84 89 76 51 (SEQ ID NO:51) PVT ,DT iFWF.T ,T iNF.XT ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 20% 63 82 81 73 52 (SEQ ID NO:52) PVWDEEREKLNEXLEALKQKLK 20% ps ps ps 53 (SEQ ID NO:53) WT ,DT iNRF.T .T.NF.T ,T ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 19% 54 (SEQ ID NO:54) PVT ,DT iERFiT ,T iNF,WT ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 19% 76 71 84 78 55 (SEQ ID NO:55) P---T ,ERF,T ,T iNF.T ,T ,F,AT ,ΚΟΚΤ ,K 19% 38 72 78 75 56 (SEQ ID NO:56) PVLDLFRELLNELLEALKQKKK 18% 57 (SEQ ID NO:57) PVLDLERNLLEELLKALEQKLK 18% ΡΕ1019073 167 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 58 (SEQ ID NO:58) FVLDEEREKLNEXLEALKQKL- 18% 59 (SEQ ID NO:59) LVLDLERELLNELLEALKQKLK 17% 60 (SEQ ID NO:60) FVT ,DT iNRF.T .T.NF.T ,T ,F,AT ,KQ--- 16% 39 83 66 84 61 (SEQ ID NO:61) PVT iDFFRWKT ,NF,XT ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 16% 62 (SEQ ID NO:62) PVT iDEWRFKT ,NF,XT ,FAT KQKT K 16% 15 85 43 63 (SEQ ID NO:63) PVLDEEREKLNEXLEALKQKLK 16% 64 (SEQ ID NO:64) PWT .DFFRFKT ,NF,XT ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 15% 65 (SEQ ID NO:65) -VLDEFREKIiNEXLEAIKQKLK 15% 66 (SEQ ID NO:66) PVLDLFRNLIEELLEALQKKLK 15% 64 82 66 70 67 (SEQ ID NO:67) ~VT ,DT .FRF.T .T.NF.T ,T ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 14% 81 90 84 94 68 (SEQ ID NO:68) PVLDEERELLKEXLEALKQKLK 14% 69 (SEQ ID NO:69) PVT ,DF,ERKKT ,NF,XT ,F,AT ,ΚΟΚΤ ,K 13% 70 (SEQ ID NO:70) PVLDEFRELLYEXLEALKQKLK 12% 27 78 33 66 71 (SEQ ID NO:71) PVT .DFiERFiKT NF.T ,XF,AT ,ΚΟΚΤ ,K 11% 72 (SEQ ID NO:72) PVLDLFRELLNEXLWALKQKLK 11% ps ps ps 73 (SEQ ID NO:73) PVT ,DF,FWF,KT ,NF,XT ,F,AT ,ΚΟΚΤ ,K 10% ΡΕ1019073 168 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 74 (SEQ ID NO:74) PVLDKEREKLNEXLEALKQKLK 10% 75v (SEQ ID NO:75) PVLDEEREKLNEELEALKQKLK 10% 18 28 23 55 76 (SEQ ID NO:76) PVLDEERELLEEXLEALKQKLK 9% 41 88 66 77 (SEQ ID NO:77) FVT .DFFRFiKT NKXT ,FAT ,ΚΟΚΤ K 9% 78 (SEQ ID NO:78) FVT iDFKRDKT ,NF,XT ,FAT KQKT K 79 (SEQ ID NO:79) PVLDEERELLNELLEALKQKLK 9% 80 (SEQ ID NO:80) PVLDLEERLUnIELLEALQKKLK 9% 81 (SEQ ID NO:81) PVT ,DFFRFKT ,NWXT ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 82 (SEQ ID NO:82) ~~T iDFFRFKT ,NF,XT ,FAT KQKT k 8% 83 (SEQ ID NO:83) PVLDEFREKIjNEXLEALWQKLK 84 (SEQ ID NO:84) PVLDEEREKLNELLEALKQKLK 7% 85 (SEQ ID NO:85) P-T ,DT iNRF.T ,T NF.T ,T ,F,AT ,ΚΟΚΤ ,K 7% 58 61 64 69 86 (SEQ ID NO:86) PVLELFERLLDELLNALQKKLK 7% 87 (SEQ ID NO:87) pllellkellqellealkqklk 7% 100 100 100 88 (SEQ ID NO:88) PVLDKFRELLNEXLEALKQKLK 7% 89 (SEQ ID NO:89) ΕνΕΟΕΕΊ1ΕΚΙιΝΕΧΕΜΑΠ\0ΚΕΚ 6% ΡΕ1019073 169 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 90 (SEQ ID NO:90) ---DEEREKLNEXLEALKQKLK 6% 91 (SEQ ID NO:91) PVLDEERELLNEXLEALKQKLK 6% 43 100 100 92 (SEQ ID NO:92) PVLDEERELYNEXLEALKQKLK 5% 93 (SEQ ID NO:93) EVLDEFRMINEXLKAII(QKLK 5% 942/ (SEQ ID NO:94) FVT DF.FRFKT NF.AT ,FAT ,ΚΟΚΤ ,K 5% 18 70 27 63 95 (SEQ ID NO:95) PVLDLERELLNLXLEALKQKLK 5% ps ps 96 (SEQ ID NO:96) pvldlfrellneXlealkqklk 5% 52 85 63 81 97 (SEQ ID NO:97) PVT,nT,FRF.T,T,NF.T,T,F.------ 4% 98 (SEQ ID NO:98) FVT ,DT iFRF.T ,T NF.F.T ,FAT iKOKT ,K 2% 99 (SEQ ID NO:99) KLKQKLAELIENLLERFLDLVP 2% 72 88 80 80 100 (SEQ ID NO:100) pvldlfrellnellealkqklk 2% 83 92 98 101 (SEQ ID NO:101) FVT ,DT iFRF.T ,T ,NWXT ,FAT iKOKT ,K 2% ps ps 102 (SEQ ID NO:102) FVT ,DT iFRF.T ,T NT ,XT ,FAT ,ΚΕΚΤ ,K 2% ps 103 (SEQ ID NO:103) FVT .DFiFRFiT ,T .NFF.T ,FAT iKOKT ,K 1% 104 (SEQ ID NO:104) p-------LLNELLEALKQKLK 1% 21 49 29 55 105 (SEQ ID NO:105) PAADAFREMNEAAEMKQKAK 1% 29 28 32 65 ΡΕ1019073 170 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 106 (SEQ ID NO:106) PVLDLEREKLNEELEALKQKLK 0% 107 (SEQ ID NO:107) klkqklaellenllerfldlvp 0% ps ps 77 108 (SEQ ID NO:108) FVT ,DT ,FRWT ,T ,NF,XT FAT ,ΚΟΚΤ K 0% 28 55 54 109v (SEQ ID NO:109) PVmEnMOINERIEALKQKLK 0% 19 45 23 58 110 (SEQ ID NO:110) PVmEEiraaiNEXXEALKQKLK 0% 111 (SEQ ID NO:111) PVLDEEREKLWEXWEALKQKLK 0% 112 (SEQ ID NO:112) FVmEElM<LNEXSEALKQKLK 0% 113 (SEQ ID NO:113) PVmEEREKINEFLEALKQKLK 0% 6 22 114 (SEQ ID NO:114) FVLDEFREK]INEXiyEAIKQKLK 0% 115 (SEQ ID NO:115 ΡΚΤ iDFFRFKT ,NF,XT FAT ,ΚΟΚΤ K 0% 116 (SEQ ID NO:116) PHLDEEREKLNEXLEALKQKLK 0% 117 (SEQ ID NO:117) PF.T iDFFRFKT ,NF,XT FAT ,ΚΟΚΤ K 0% 118 (SEQ ID NO:118) FVT DFFRFKT ,NF,XT FAT FQKT ,K 0% 119 (SEQ ID NO:119) FVT DFFRFKT .NF.F.T FAXKQKT ,K 0% 120 (SEQ ID NO:120) PVLDEFREKLNEELEXLKQKLK 0% 121 (SEQ ID NO:121) PVT .DF.FRFKT .NF.F.T FAT ,WQKT ,K 0% 171 ΡΕ1019073 (continuação)

ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 122 (SEQ ID NO:122) PVLDEEREKLNEELEWLKQKLK 0% 123 (SEQ ID NO:123) QVLDLERELLNELLEALKQKLK 124 (SEQ ID NO:124) PVLDLFOELINELLEALOQOLO 125 (SEQ ID NO:125) NVT ,DT FRF.T .T.MF.T ,T FAT ,ΚΟΚΤ K 126 (SEQ ID NO:126) PVT ,DT .FRF.T ,T,NF,T GFAT ,ΚΟΚΤ K 127 (SEQ ID NO:127) PVLDLERELLNELLELLKQKLK 47% 128 (SEQ ID NO:128) PVLDLERELINELLEFLKQKLK 129 (SEQ ID NO:129) PVT iF.T iFNDT ,T ,RF.T ,T ,FAT OKKT K 130 (SEQ ID NO:130) PVT ET iFNDT ,T ,RF.T ,T ,F,AT ,ΚΟΚΤ K 131 (SEQ ID NO:131) PVT ET iFKF.T ,T ,NF.T ,Τ ,ΠΆΤ ,RQKT K 132 (SEQ ID NO:132) PVLDLERELLENLLEALQKKLK 133 (SEQ ID NO:133) PVT F,T iFF.RT ,T F.DT ,T QAT ,ΝΚΚΤ K 134 (SEQ ID NO:134) PVT ET iFF.RT ,T ,F.DT ,Τ ,ΚΆΤ ,ΝΟΚΤ ,Κ 135 (SEQ ID NO:135) PVT ,ητ iFRF.T ,Τ ,NF.T ,t f,at ,ΚΟΚΤ ,κ 136 (SEQ ID NO:136) PALELFKDLLQELLEALKQKLK 137 (SEQ ID NO:137) PVLDLFRELINEGLEAZKQKLK ΡΕ1019073 172 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 138 (SEQ ID NO:138) PVLDLERELLNEGLEWLKQKLK 139 (SEQ ID NO:139) FVLDLERELWNEGLEALKQKLK 140 (SEQ ID NO:140) PVLDLERELINEGLEALOQOLO 141 (SEQ ID NO:141) FVT .DFFRFiT ,T ,NF,GT ,FAT ,ΚΟΚΤ ,K 142 (SEQ ID NO:142) PVT ,F,T iERFiT ,T ,NF,GT ,FAT ,ΚΟΚΤ K 143 (SEQ ID NO:143) PVLDLERELLNEGLEALKQKLK* 144 (SEQ ID NO:144) pVIELEENLLERLLDALQKKLK 111% 89 88 95 145 (SEQ ID NO:145) GVT iF.T iEF,NT ,T ,F.RT ,Τ ,ΡΆΤ QKKT K 100% 55 51 58 146 (SEQ ID NO:146) PVT ,F,T iFFiNT ,T ,F.RT ,Τ.ΠΆΤ QKKT K 86% 97 100 100 95 147 (SEQ ID NO:147) FVT ,F,T 1FF1NT ,T ,F.RT iFDAT QKKT K 76% 148 (SEQ ID NO:148) PVLELEENLLERLGDALQKKLK 75% 10 76 23 80 149 (SEQ ID NO:149) PVLELEENLWERLLDALQKKLK 63% 28 54 47 150 (SEQ ID NO:150) PT .T.F.T iEFiNT ,T ,F.RT ,Τ.ΠΆΤ QKKT ,K 57% 151 (SEQ ID NO:151) PVT ,F,T 1FF1NT iGF.RT ,Τ ,ΡΆΤ QKKT ,K 55% 152 (SEQ ID NO:152) PVFELFENLLERLLDALQKKLK 50% 153 (SEQ ID NO:153) AVT ,F,T ,PF,NT ,T ,F,RT ,Τ.ΠΆΤ QKKT ,K 49% ΡΕ1019073 173 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 154 (SEQ ID NO:154) PVLELEENLLERGLDALQKKLK 39% 13 76 25 80 155 (SEQ ID NO:155) PVLELFLNLWERLLDALQKKLK 38% 156 (SEQ ID NO:156) FVT ,F.T iFT ,NT iT ,F.RT ,Τ.ΠΆΤ OKKT ,K 35% 157 (SEQ ID NO:157) FVT FiFFFiNT ,T ,F.RT ,Τ ,ΡΆΤ QKKT ,K 30% 158 (SEQ ID NO:158) FVT ,F,T ,FT ,ΝΤ ΙΪ ,F,RT ,T ,FWT OKKT ,K 30% 159 (SEQ ID NO:159) PVLDLEENLLERLLDALQKKLK 28% 160 (SEQ ID NO:160) FVT ,F,T ,FF,NT ,T ,F,RT ,Τ ,ΓΜ QKKT ,K 28% 65 73 75 61 161 (SEQ ID NO:161) FVT iF.T iFF,NT ,T ,F.RT ,T ,F,AT QKKT ,K 27% 162 (SEQ ID NO:162) FVT ,F,T iFFiNWT ,F.RT ,Τ.ΠΆΤ OKKT ,K 27% 68 83 81 163 (SEQ ID NO:163) FVT ,F,T 1FF1NT ,T ,F.RT WDAT OKKT ,K 26% 27 53 55 164 (SEQ ID NO:164) PVLELEENLLERLLDAWQKKLK 24% 37 66 51 61 165 (SEQ ID NO:165) P\TT ,F.T iFF,NT ,T ,F.RT .Τ.ΠΤ.Τ QKKT ,K 23% 166 (SEQ ID NO:166) P\TT ,F,T ,FT ,ΝΤ ,Τ .F.KT ,Τ.ΠΆΤ QKKT ,K 22% 167 (SEQ ID NO:167) P\TT ,F,T ,ΤΤ,ΝΟΤ ,F,RT ,Τ ,ΡΆΤ QKKT ,K 18% 168 (SEQ ID NO:168) PVLELFEQLLEKLLDALQKKLK 17% 169 (SEQ ID NO:169) PVI£LEENLLEKLLDALQKKLK 17% ΡΕ1019073 174 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 170 (SEQ ID NO:170) PVLELEENLLEOLLDALQOOLO 17% 171 (SEQ ID NO:171) PVLELEENLLEKLLDLLQKKLK 16% 172 (SEQ ID NO:172) FVT ,F.T iFT ,NT iT ,F.RT ΟΠΆΤ OKKT ,K 16% 173 (SEQ ID NO:173) PVLDLFDNLLDRLLDLINKKLK 15% 174 (SEQ ID NO:174) pvlelfenllerlldalqkklk 13% 175 (SEQ ID NO:175) PVLELFENLLERLLELLNKKLK 13% 176 (SEQ ID NO:176) PVI£LWENLLERLLDALQKKLK 11% 177 (SEQ ID NO:177) GVLELFLNLIERLLDALQKKLK 10% 178 (SEQ ID NO:178) PVT ,F,T iFDNT ,T ,F.KT ,T ,FAT OKKT ,R 9% 179 (SEQ ID NO:179) PVT ,F,T iFDNT ,T ,F.RT .Τ.ΠΆΤ OKKT ,K 8% 180 (SEQ ID NO:180) FVLELFDNLLDKLLDALQKKLR 8% 181 (SEQ ID NO:181) PVT |F,T iFF,NT ,T ,F,RWT ,ΠΆΤ OKKT ,K 8% 182 (SEQ ID NO:182) PVT ET 1FF1NT ,T F.KT ,T ,F,AT OKKT ,K 7% 183 (SEQ ID NO:183) PT .T.F.T iFFiNT ,T ,F.KT ,Τ ,ΡΆΤ OKKT ,K 6% 184 (SEQ ID NO:184) PVLELFLNLLERLLDAWQKKLK 4% 185 (SEQ ID NO:185) PVT F,T ,FF,NT ,T F.RT ,Τ ,ΠΆΤ QOOT ,0 3% ΡΕ1019073 175 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 186 (SEQ ID NO:186) PVLELEEQLLERLLDALQKKLK 187 (SEQ ID NO:187) PVLELEENLLERLLDALNKKLK 188 (SEQ ID NO:188) PVLELEENLLDRLLDALQKKLK 189 (SEQ ID NO:189) DVT ,F,T iFFiNT ,T ,F,RT ,Τ.ΠΆΤ QKKT ,K 190 (SEQ ID NO:190) PVLEFWDNLLDKLLDALQKKLR 191 (SEQ ID NO:191) PVLDLLRELLEELKQKLK* 100% 192 (SEQ ID NO:192) EVLDLENELLEELKQKLK* 100% 36 56 193 (SEQ ID NO:193) FVT ,DT iERF.T ,T ,F.F.T ,ΚΟΚΤ K* 96% 34 88 87 87 194 (SEQ ID NO:194) FVT ,F,T iERFiT ,T .F.F.T ,ΚΟΚΤ K* 88% 38 93 93 195 (SEQ ID NO:195) FVT ,F,T iEKFiT ,T .F.F.T ,ΚΟΚΤ K* 87% 196 (SEQ ID NO:196) PVLDLERELLEELKNKLK* 81% 197 (SEQ ID NO:197) PLLDLERELLEEIjKQKLK* 81% 43 70 69 198 (SEQ ID NO:198) GVLDLFRELLEEIjKQKLK* 80% 199 (SEQ ID NO:199) EVLDLFRELWEEIjKQKLK* 76% 35 77 80 79 200 (SEQ ID NO:200) NVLDLERELLEELKQKLK* 75% 201 (SEQ ID NO:201) PLLDLENELLEELKQKLK* 74% ΡΕ1019073 176 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 202 (SEQ ID NO:202) PALELEKDLLEELRQKLR* 70% 203 (SEQ ID NO:203) AVLDLERELLEELKQKLK* 66% 204 (SEQ ID NO:204) FVT iDFERF.T ,T ,F.F.T ,ΚΟΚΤ K* 63% 205 (SEQ ID NO:205) FVT ,DT iEREWT .F.F.T ,ΚΟΚΤ K* 60% 206 (SEQ ID NO:206) PT ,T ,F,T ,T .KF.T ,T ,F,F,T ,ΚΟΚΤ K* 57% 207 (SEQ ID NO:207) PVLELLKELLEELKQKLK* 50% 208 (SEQ ID NO:208) PALELEKDLLEELRQRLK* 48% 209 (SEQ ID NO:209) PVIDm^INELLQKLK 47% 54 71 67 62 210 (SEQ ID NO:210) FVT ,DT KRF.T ,T .F.F.T ,ΚΟΚΤ K 46% 20 63 37 53 211 (SEQ ID NO:211) PVLDLFRELLEEIQQOLO* 45% 212 (SEQ ID NO:212) PVLDLFOELLEELOQOLK* 43% 213 (SEQ ID NO:213) ΡΆΤ ,F.T iPKDT ,T KF.FRQRT K* 42% 214 (SEQ ID NO:214) PVLDLFRELLEEIjKQKLK* 39% 215 (SEQ ID NO:215) PVLDLFRELLEEWKQKLK* 38% 28 63 53 68 216 (SEQ ID NO:216) PVLELFKELLEELKQKLK 35% 217 (SEQ ID NO:217) PVLDLERELLELLKQKLK 30% 52 78 76 70 ΡΕ1019073 177 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 218 (SEQ ID NO:218) PVLDLERELLNELLQKLK* 29% 219 (SEQ ID NO:219) PVLDLERELLNELWQKLK 24% 220 (SEQ ID NO:220) FVT ,ΠΤ ,ERF,T ,T ,F,F,T OKKT K 22% 27 64 54 64 221 (SEQ ID NO:221) DVLDLERELLEELKQKLK* 12% 222 (SEQ ID NO:222) EVLDAFRELLEALLQLKK 8% 223 (SEQ ID NO:223) PVLDAERELLEALAQLKK 8% 21 56 23 51 224 (SEQ ID NO:224) EVLDLEREGWEELKQKLK 8% 225 (SEQ ID NO:225) EVLDAERELAEALAQLKK 1% 226 (SEQ ID NO:226) EVLDAFRELGEALLQLKK 1% 227 (SEQ ID NO:227) FVT ,DT iERFiT CFF.T KOKT ,K* 0% 228 (SEQ ID NO:228) PVLDLEREGLEELKQKLK* 0% 229 (SEQ ID NO:229) EVLDLERELLEEGKQKLK* 0% 230 (SEQ ID NO:230) FVT ,F,T ,EF,RT ,T ,F,DT OKKT K 231 (SEQ ID NO:231) FVT ,DT iERFiT ,T ,F.KT ,F,QKT ,K 232 (SEQ ID NO:232) PLLELEKELLEELKQKLK* 2374/ (SEQ ID NO:237) LDDLLQKWAEAFNQLLKK 11% 30 66 45 - ΡΕ1019073 178 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 238v (SEQ ID NO:238) EWLKAFYEKVLEKLKELF* 19% 49 72 60 58 2396/ (SEQ ID NO:239) EWLEAFYKKVLEKLKELF* 11% 44 49 ps 240 (SEQ ID NO:240) EWLKAFYDKVAEKLKEAF* 10% 16 68 59 57 241 (SEQ ID NO:241) EWFKAFYDKVFEKFKEFF 8% 2427/ (SEQ ID NO:242) GIKKFLGSIWKFIKAFVG 7% 243 (SEQ ID NO:243) EMFAFYDKVAEKFKEAF 5% 10 64 50 244s/ (SEQ ID NO:244) EWLKAFYDKVAEKLKEAF 5% 9 40 13 48 245 (SEQ ID NO:245) EWLKAFYDKVFEKFKEFF 4% 38 77 70 ps 2 4 69/ (SEQ ID NO:246) EWLEAFYKKVLEKLKELF 4% 18 44 47 247 (SEQ ID NO:247) CWFKAFYDKFFEKFKEFF 3% 24810/ (SEQ ID NO:248) EWLKAFYEKVLEKLKELF 3% 18 45 13 249u/ (SEQ ID NO:249) EWLKAEYEKVEEKLKELF* 25012/ (SEQ ID NO:250) EWLKAEYEKVLEKLKELF* 25113/ (SEQ ID NO:251) EWLKAFYKKVLEKLKELF* 252 (SEQ ID NO:252) FVLDLFRELLEQKLK* 253 (SEQ ID NO:253) FVLDLFRELLEELKQK* ΡΕ1019073 179 (continuação) ACTIVAÇÃO DE LCAT EXIBIDA POR PÉPTIDOS CENTRAIS EXEMPLARES PÉPTIDO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ACTIVI-DADE (%) LCAT He (%) livre He (%) ratinhos He (%) SUVs He (%) TFE 254 (SEQ ID NO:254) PVLDLFRELLEKLKQK* 255 (SEQ ID NO:255) PVLDLFRELLEKLQK* 256 (SEQ ID NO:256) FVLDLFRELLEALKQK* 257 (SEQ ID NO:257) PVLDLFENLLERLKQK* 258 (SEQ ID NO:258) PVLDLFRELLNELKQK* 17 Péptido 22-mero de consenso de Segrest (Anantharamaiah et al., Arteriosclerosis 10(1): 95-105, 1990). 2/ [A13]-Péptido 22-mero de consenso (Anantharamaiah et al., Arteriosclerosis 10 (1) : 95-105, 1990) . 3/ [R13]-Péptido 22-mero de consenso (Anantharamaiah et al., Arteriosclerosis 10(1): 95-105, 1990). 47 Péptido ID-3 (Labeur et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17(3): 580-588, 1997). 5/ Ac-18AM0D-C(0)NH, péptido (Epand et al., J. Biol. Chem. 262(19): 9389-9396, 1987) . 67 Péptido Ac-18AM4-C(0)NH2 (Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170: 1-7) - 77 Péptido 18L (Segrest et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 8: 103-117, 1990). 87 Péptido 18A (Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(18):10248-10255). 97 Péptido 18AM4 (Rosseneu et al., W093/25581; Corijn et al., Biochim. Biophys. Acta 1170: 8-16, 1993). 107 Péptido [Glu1,8; Leu5'11'17] 18A (Epand et al., J. Biol. Chem. 262(19): 9389-9396, 1987) . 117 Ac-18AM3-C(O)NH2 (Rosseneu et al., W093/25581). 127 Ac-18AM2-C(O)NH2 (Rosseneu et al., W093/25581). 137 Ac-18AM1-C(0)NH2 (Rosseneu et al., W093/25581). 180 ΡΕ1019073

Na TABELA X, * indica péptidos que são acetilados no terminal N e amidados no terminal C; indica péptidos que são dansilados no terminal N; ps indica péptidos que exibiram problemas de solubilidade nas condições experimentais; X é Aib; Z é Nal; O é Orn; He (%) designa a percentagem de helicidade; mies designa micelas; e - indica aminoácidos suprimidos.

9. EXEMPLO: FARMACOCINÉTICA DOS AGONISTAS DE ApoA-I

As seguintes experiências demonstram que os agonistas de ApoA-I são estáveis na circulação e se associam ao componente HDL do plasma.

Em particular, o péptido 4 radioactivamente marcado injectado intraperitonealmente em ratinhos asso-ciou-se ao componente HDL e permaneceu estável durante pelo menos 6 horas. Quando adicionado a plasma humano (ex vivo) o péptido 4 também se associou ao componente HDL.

9.1. SÍNTESE DE PÉPTIDOS RADIOMARCADOS

Os péptidos radiomarcados 4 (SEQ ID NO:4) e 8 (SEQ ID NO:8) foram sintetizados através da ligação a Fmoc-Pro marcado com 14C como aminoácido N-terminal.

Foi utilizada L-[U-14C]Prolina, com actividade especifica de 9,25 GBq/mmol, para a síntese de Fmoc-L-Prolina marcada. A síntese foi realizada de acordo com Lapatsanis, Synthesis 671-173, 1983. Resumidamente, foram dissolvidos 250 181 ΡΕ1019073 μΜ (29,6 mg) de L-Prolina não marcada em 225 μΐ de uma solução de Na2CC>3 a 9% e adicionou-se a uma solução (Na2CC>3 a 9%) de 9,25 MBq (250 μΜ) de L-Prolina marcada com 14C. O líquido foi arrefecido até 0°C, misturado com 600 μΜ (202 mg) de 9-fluorenilmetil-N-succinimidilcarbonato (Fmoc-OSu) em 0,75 ml de DMF e agitado à temperatura ambiente durante 4 h. A partir daí a mistura foi extraída com éter dietílico (2><5 ml) e clorofórmio (1x5 ml), a restante fase aquosa foi acidificada com HC1 a 30% e extraída com clorofórmio (5 χ 8 ml) . A fase orgânica foi seca sobre Na2S04, filtrada e o volume foi reduzido sob fluxo de azoto para 5 ml. A pureza foi estimada através de TLC (CHCÍ3:MeOH:Hac, 9:1:0,1 v/v/v, fase estacionária HPTLC sílica-gel 60, Merck, Alemanha) e mostrou um único pico (detecção de UV, pureza radioquímica: Linear Analyzer, Berthold, Alemanha); rendimento da reacção: 90% (determinado através de LSC). A solução de clorofórmio contendo 14C-Fmoc-Prolina foi utilizada directamente para a síntese peptídica. Uma resina peptídica contendo os aminoácidos 2-22, sintetizada automaticamente tal como descrito na Secção 6, foi utilizada para a síntese. A sequência do péptido foi determinada através de degradação de Edman. A ligação foi efectuada tal como descrito na Secção 6.1 (ligação manual de Fmoc-Nal), excepto que foi utilizado HATU (0-(7-azabenzotriazol-l-il)1-,1,3,3-tetrametilurónio-hexafluoro-fosfato) em vez de TBTU. Uma segunda ligação com Fmoc-L-Pro não marcado foi realizada manualmente tal como descrito na Secção 6.1. A clivagem e desprotecção dos péptidos foram tal como descrito na Secção 6.4. As actividades específicas 182 ΡΕ1019073 dos péptidos marcados foram como se segue: péptido 4 (SEQ ID NO: 4) = 3,9 χ 105 dpm/mg péptido 8 (SEQ ID NO:8) = 1,0 χ 105 dpm/mg

9.2. FARMACOCINÉTICA EM RATINHOS

Em cada experiência, foram injectados 2,5 mg/kg de péptido radiomarcado intraperitonealmente em ratinhos que foram alimentados com ração normal para ratinho ou com a dieta aterogénica modificada de Thomas-Harcroft (resultando em colesterol VLDL e IDL gravemente elevados). Foram tomadas amostras de sangue a múltiplos intervalos de tempo para avaliação da radioactividade no plasma. Os resultados estão resumidos na TABELA XI, abaixo:

TABELA XI

SEMI-VIDA DO PÉPTIDO 4 (SEQ ID NO:4) EM RATINHOS ESPÉCIE PREPARAÇÃO SEMI-VIDA (horas) C57BL/6 (dieta normal) peptide 4/PBS 5,721 C57B1/6 (dieta rica em gordura) péptido 4/PBS 5, 982 complexo3 péptido 4/POPC 6,394 ApoE-6 péptido 4/PBS 14,25 A máxima concentração sérica alcançada foi de 25,7% das cpm injectadas às 1,9 horas após a injecção. r2=0,960. 2 A máxima concentração sérica alcançada foi de 20,3% das cpm injectadas às 2,98 horas após a injecção. r2=0,973. 3 Os complexos consistindo em fosfolipido (POPC) e péptido 4 foram preparados utilizando o método de diálise do colato. 4 A máxima concentração sérica alcançada foi de 39,4% das cpm injectadas às 4,2 horas após a injecção. r2=0,893. 5 A máxima concentração sérica alcançada foi de 17,4% das cpm injectadas às 1,46 horas após a injecção. r2=0,973. 6 "Knockout" para ApoE._ 183 ΡΕ1019073

9.3. ESTABILIDADE NO SORO HUMANO 9.3.1. MÉTODOS EXPERIMENTAIS 100 yg de péptido 4 marcado com 14C (SEQ ID NO:4) preparado tal como descrito na Secção 9.1. supra, foram misturados com 2 ml de plasma humano fresco (a 37°C) e os lípidos removidos imediatamente (amostra de controlo) ou após 8 dias de incubação a 37°C (amostra de teste) . A remoção dos lipidos foi realizada através da extracção dos lipidos com um volume igual de 2:1 (v/v) clorofórmio :metanol.

As amostras foram carregadas numa coluna Cie de HPLC de fase inversa e eluidas com um gradiente linear (25— 58% durante 33 min.) de acetonitrilo (contendo TFA a 0,1%). Os perfis de eluição foram seguidos pela absorvância (220 nm) e radioactividade.

9.3.2. RESULTADOS A amostra de controlo eluiu como um único pico com um tempo de retenção de aproximadamente 30 min. Toda a radioactividade eluiu neste pico. A amostra de teste eluiu como dois picos: um possuindo um tempo de retenção de cerca de 3 min., o outro possuindo um tempo de retenção de cerca de 30 min. O pico 184 ΡΕ1019073 de 3 min. (péptido degradado) contribuiu para aproximada-mente 15% da radioactividade total carregada na coluna. A restante radioactividade eluiu com o pico de 30 min. (péptido intacto), indicando que o péptido 4 (SEQ ID NO:4) é extremamente estável no soro humano - mais de 80% do péptido 4 permaneceu intacto mesmo após uma incubação de 8 dias em soro humano.

9.4. FORMAÇÃO DE PARTÍCULAS SEMELHANTES A PRÉ-β 9.4.1. MÉTODO EXPERIMENTAL HDL humana foi isolada através ultracentrifugação de densidade em KBr, a uma densidade d = 1,21 g/ml para obter uma fracção superior seguido de cromatografia de filtração em gel de Superose 6 para separar a HDL de outras lipoproteinas. A HDL isolada foi ajustada a uma concentração final de 1,0 mg/ml com solução salina fisiológica com base no teor proteico determinado através do ensaio proteico de Bradford. Foi retirada uma aliquota de 300 μΐ da preparação de HDL isolada e incubou-se com 100 μΐ de péptido 4 marcado com 14C (0,2-1,0 pg/μΐ) durante duas horas a 37°C. Foram analisadas cinco incubações separadas incluindo um branco contendo 100 μΐ de solução salina fisiológica e quatro diluições do péptido 4 marcado com 14C: (i) 0,20 pg/μΐ razão péptido:HDL = 1:15; (ii) 0,30 pg/pl razão péptido:HDL = 1:10; (iii) 0,60 pg/μΐ razão péptido:HDL = 1:5; e (iv) 1,00 pg/pl razão péptido:HDL = 185 ΡΕ1019073 1:3. Após a incubação de duas horas, foi carregada uma alíquota de 200 yl da amostra (volume total = 400 yl) numa coluna de filtração em gel Superose 6 para separação e análise das lipoproteinas, e foram utilizados 100 yl para determinar a radioactividade total carregada. As condições para todas as cromatografias FPLC foram tal como descrito na Secção 9.4, infra.

9.4.2. RESULTADOS

Os resultados são apresentados na TABELA XII, infra, e nas FIGS. 9A-9F.

TABELA XII

DESLOCAMENTO DA ApoA-I HUMANA DE HDL HUMANA IS( COM 14C (SEQ ID NO:4 DLADA PELO PÉPTIDO 4 MARCADO Pico #1 Pico #2 Pico #3 14λ C carregado (cpm) 14C coluna (cpm) Recuperação (%) la lb P:LP=1:15 controlo péptido VE 30,5 ASC 9,95 VE 29,4 30,9 ASC 4,09 6,26 14C 7920 1622 10361 9542 921 P:LP=1:10 controlo péptido VE 30,7 ASC 9,15 33,0 VE 30,7 0,67 ASC 8,42 14C N/A N/A N/A N/A N/A 186 ΡΕ1019073 (continuação) DESLOCAMENTO DA ApoA-I HUMANA DE HDL HUMANA ISC COM 14C (SEQ ID NO:4 OLADA PELO PÉPTIDO 4 MARCADO Pico #1 Pico #2 Pico #3 1 C carregado (cpm) 14C coluna (cpm) Recuperação (%) la lb P:LP=1:5 controlo VE 30,9 ASC 9,87 34,3 péptido VE 30,8 1,53 5,281 ASC 8,19 14C 20768 28794 26049 90,5 P:LP=1:3 controlo VE 30,5 ASC 10,22 péptido VE 30,6 34,3 ASC 7,93 1,97 14C 43495 7832 54593 51321 94 P:LP = Razão de péptido para lipoproteina com base na massa (yg) VE = Volume de eluição (ml) ASC = Área sob a curva (programa Peakfit) 14C = Cpms determinadas a partir da contagem radiométrica Pico #1 = Fracções 29 a 33 Pico #2 = Fracções 34 a 35 Pico #3 = Fracções 41 a 47 A partir dos dados apresentados na TABELA XII, é evidente que mais de 90% da radioactividade foi recuperada da coluna após separação das partículas lipoproteicas. A baixa concentração de péptido (i.e., razão de massa péptido:HDL de 1:15), o pico de HDL foi dividido em dois picos separados (FIG. 9A), sugerindo que ocorreu uma interacção entre o péptido e HDL que resultou nalguma remodelação da partícula lipoproteica, mas uma vez que não 187 ΡΕ1019073 se observou qualquer deslocamento do pico a interacção não foi suficiente para deslocar a ApoA-I nativa. À medida que a concentração do péptido foi aumentada, foi observado um deslocamento de ApoA-I que aumentou com o aumento da concentração do péptido (FIGS. 9B-9D). Adicionalmente, todas as corridas cromatográficas mostraram um terceiro pico detectado através de contagem radiométrica (excepto aquele com uma razão de massa de 1:10, para o qual os resultados não são mostrados) que é consistente com o volume de eluição do péptido livre (FIG. 9E).

Para melhor analisar o efeito da concentração do péptido na interacção do péptido 4 marcado com 14C e HDL, foi gerado um gráfico de diferenças a partir das quatro corridas cromatográficas (FIGS. 9A-9D) que é mostrado na FIG. 9F. O gráfico das diferenças demonstra a mudança no pico de HDL bem como o maior deslocamento de ApoA-I com o aumento da concentração do péptido. O deslocamento de ApoA-I resulta na formação de partículas semelhantes a pré-β.

9.5. ASSOCIAÇÃO DO PÉPTIDO 4 COM LIPOPROTEÍNAS HUMANAS

9.5.1. MÉTODOS EXPERIMENTAIS A associação do péptido 4 (SEQ ID NO: 4) com fracções lipoproteicas humanas foi determinada através da incubação do péptido 4 marcado com 14C (SEQ ID NO: 4) com 188 ΡΕ1019073 cada classe de lipoproteínas (HDL, LDL e VLDL) e uma mistura das diferentes classes de lipoproteínas. HDL, LDL e VLDL foram isoladas através de ultracentrifugação em gradiente de densidade de KBr a d = 1,21 g/ml e purificadas através de FPLC numa coluna de exclusão de tamanho de Superose 6B (a cromatografia foi realizada com um caudal de 0,7 ml/min. e um tampão de corrida de Tris 10 mM (pH 8), NaCl 115 mM, EDTA 2 mM e NaN3 a 0,01%) . O péptido 4_ marcado com 14C foi incubado com HDL, LDL e VLDL a uma razão péptido:fosfolípido de 1:5 (razão de massa) durante 2 h a 37°C. A quantidade de lipoproteína necessária (volumes com base na quantidade necessária para produzir 1000 pg) foi misturada com 0,2 ml de solução de reserva do péptido (1 mg/ml) e a solução foi levada até 2,2 ml utilizando 0,9% de NaCl de acordo com a TABELA XIII:

TABELA XIII

PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PÉPTIDO-LIPOPROTEÍNA HDL (ml) LDL (ml) VLDL (ml) NaCl a 0,9% (ml) Péptido 4 marcado com 14C (ml) Total (ml) Controlo 2,0 0,2 2,2 LP/Péptido 0,4 0,3 0,9 0,4 0,2 2,2 HDL/Péptido 0,4 1,6 0,2 2,2 LDL/Péptido 0,3 1,7 0,2 2,2 VLDL/Péptido 0,9 1,1 0,2 2,2

Após incubação durante 2 h a 37°C, foi removida uma alíquota (0,1 ml) para contagem de cintilações líquidas 189 ΡΕ1019073 para determinar a radioactividade total, a densidade da restante mistura de incubação foi ajustada a 1,21 g/ml com KBr e as amostras foram centrifugadas a 100000 rpm (300000 g) durante 24 horas a 4°C num rotor TLA 100.3 utilizando uma ultracentrifuga Beckman tabletop. O sobrenadante resultante foi fraccionado através da remoção de aliquotas de 0,3 ml do topo de cada amostra para um total de 5 fracções, e 0,05 ml de cada fracção foram utilizados para contagem de cintilações liquidas. As duas fracções de cima contêm as lipoproteínas flutuantes, as outras fracções (3-5) correspondem a proteinas/péptidos em solução.

9.5.2. RESULTADOS

Os resultados são apresentados na TABELA XIV, infra. A incubação do péptido 4 marcado com 14C com as fracções de lipoproteínas isoladas revelou uma forte associação com HDL (88% da radioactividade total nas fracções 1 e 2) bem como com VLDL (85%) , e uma afinidade substancialmente mais fraca para LDL (66%). A mistura de incubação consistindo em todas as fracções de lipoproteínas e o péptido 4 marcado com 14C (LP/Péptido) mostrou 88% do péptido marcado associado à fracção de lipoproteínas. A análise FPLC da mistura de incubação LP/péptido demonstrou que quase todo o péptido 4 marcado com 14C estava associado à fracção de HDL, indicando uma elevada selectividade para esta classe de lipoproteínas. 190 ΡΕ1019073

TABELA XIV

ASSOCIAÇÃO DO PÉPTIDO 4 (SEQ ID NO:4) COM VÁRIOS LÍPIDOS

Fracção Controlo LP/Péptido HDL/Péptido LDL/Péptido VLDL/Péptido 1 650 60250 61510 43740 42920 2 1000 12990 17620 15140 19280 3 6590 3810 2260 11880 3930 4 36550 1510 3130 10860 2600 5 34380 5090 5450 7710 4550 Total 79170 83650 89970 89330 73280 Total* 88550 96646 98494 100452 97306 Recuperação /2Λ 89 87 91 89 75 antes da centrifugação

9.6. O PÉPTIDO 4 (SEQ ID NO:4) LIGA-SE SELECTIVAMENTE A LÍPIDOS HDL NO PLASMA HUMANO

9.6.1. MÉTODO EXPERIMENTAL O plasma humano (2 ml) foi incubado com 20, 40, 60, 80 e 100 yg de péptido 4 marcado com 14C durante 2 h a 37°C. As lipoproteinas foram separadas através do ajuste da densidade a 1,21 g/ml e centrifugação num rotor TLA 100.3 a 100000 rpm (300000 g) durante 36 h a 4°C. Os 900 μΐ de cima (em fracções de 300 μΐ) foram tomados para análise. Foi contada a radioactividade de 50 μΐ de cada fracção de 300 μΐ e foram analisados 200 μΐ de cada fracção através de FPLC (coluna de combinação Superose 6/Superose 12).

9.6.2. RESULTADOS A quantidade de radioactividade recuperada para 191 ΡΕ1019073 cada fracção é apresentada na TABELA XV, infra. A maior parte da radioactividade foi recuperada nas três fracções de cima. Todos os perfis de separação de lipoproteinas das amostras de plasma incubadas com o péptido 4 marcado com 14C (SEQ ID N0:4) (não mostrado) indicam que, em todos os casos, quase toda a radioactividade está presente na fracção de HDL. Assim, embora no soro humano estejam presentes outras lipoproteinas, o péptido 4 (SEQ ID NO:4) exibe uma ligação altamente selectiva à HDL.

TABELA XV RADIOACTIVIDADE RECUPERADA A PARTIR DA INCUBAÇÃO DO PÉPTIDO 4 MARCADO COM 14C COM SORO HUMANO Péptido Fracção Radioactividade (cpm*) Recuperação** (pg) N° em 50 μΐ em 300 μΐ (%) 20 1 1407 8442 71,6 2 405 2430 20,6 3 152 912 7,7 40 1 2538 15228 70,4 2 721 4326 20 3 347 2082 9,6 60 1 4492 26952 75,5 2 1107 6642 18,6 3 354 2124 5,9 80 1 4715 28290 60 2 2251 13506 28,6 3 851 5346 11,3 100 1 5424 32544 67,5 2 1708 10248 21,2 3 907 5442 11,3 0 valor para 300 μΐ foi obtido através da multiplicação do valor de 50 μΐ por 6. Com base nas contagens totais iniciais utilizadas para misturar com plasma. 192 ΡΕ1019073

10. EXEMPLO: OS AGONISTAS DE ApoA-I PROMOVEM O EFLUXO DE COLESTEROL Células de hepatoma HepG2 foram plaqueadas em caixas de cultura de 6 poços e criadas até confluência. As células foram marcadas com 3H-colesterol secando o colesterol, depois adicionando albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), sujeitando a solução a ultra-sons e adicionando às células 0,2 ml de solução de marcação e 1,8 ml de meio de crescimento, de modo que cada poço continha 2 yCi de radioactividade. As células foram incubadas durante 24 h com o meio de marcação.

Os complexos de péptido (ou proteína):DMPC foram preparados a uma razão péptido (ou proteína):DMPC de 1:2 (p/p). Para preparar os complexos, o péptido 4 (SEQ ID NO: 4) ou a proteína ApoA-I humana nativa foi adicionado a uma solução de DMPC em PBS e incubado à temperatura ambiente de um dia para o outro, tempo durante o qual a solução clarificou. A concentração do péptido ou da proteína na solução final foi de 1 mg/ml.

Os meios de marcação foram removidos das células e as células foram lavadas com PBS antes da adição dos complexos. Foi adicionado 1,6 ml de meio de cultura a cada poço, seguido do complexo péptido (ou proteína):DMPC e PBS suficiente para levar o volume final até 2 ml por poço. As 193 ΡΕ1019073 concentrações finais de péptido ou ApoA-I foram 1, 2,5, 5, 7,5 e 25 pg/ml de meio. Após 24 horas de incubação a 37°C, o meio foi removido, e as células lavadas com 2 ml de BSA a 1%/PBS, seguido de 2 lavagens com 2 ml cada de PBS. A quantidade de 3H-colesterol sujeito a efluxo para o meio foi determinada através de contagem de cintilações líquidas.

Os resultados demonstram que o péptido 4 (SEQ ID NO:4) foi mais eficiente no efluxo de colesterol que ApoA- I.

II. EXEMPLO: UTILIZAÇÃO DOS AGONISTAS DE ApoA-I EM SISTEMAS MODELO ANIMAIS A eficácia dos agonistas de ApoA-I do invento foi demonstrada em coelhos. Os resultados mostram que a administração dos agonistas de ApoA-I aumenta a concentração sérica de partículas semelhantes a HDL.

11.1. PREPARAÇÃO DOS COMPLEXOS FOSFOLÍPIDO/PÉPTIDO

Pequenas partículas discoidais consistindo em fosfolipidos (DPPC) e péptido foram preparadas seguindo o método de diálise de colato. O fosfolipido foi dissolvido em clorofórmio e seco sob uma corrente de azoto. O péptido foi dissolvido em tampão (solução salina) a uma concentração de 1-2 mg/ml. A película lipídica foi novamente 194 ΡΕ1019073 dissolvida em tampão contendo colato (43°C) e a solução peptidica foi adicionada a uma razão de peso fosfoli-pido/péptido de 3:1. A mistura foi incubada de um dia para o outro a 43°C e depois sujeita a diálise a 43°C (24 h) , à temperatura ambiente (24 h) e a 4°C (24 h), com três mudanças de tampão (volumes grandes) a cada temperatura. Os complexos foram esterilizados por filtração (0,22 ym) para injecção e armazenados a 4°C.

11.2. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DAS PARTÍCULAS PÉPTI-DO/FOSFOLÍPIDO

As partículas foram separadas numa coluna de filtração em gel (Superose 6 HR). A posição do pico contendo as partículas foi identificada através da medição da concentração de fosfolípido em cada fracção. A partir do volume de eluição foi determinado o raio de Stokes. A concentração de péptido no complexo foi determinada através da medição do teor de fenilalanina (através de HPLC) após uma hidrólise ácida de 16 h.

11.3. INJECÇÃO NO COELHO

Coelhos machos New Zealand White (2,5-3 kg) foram injectados intravenosamente com uma dose de complexo fosfolípido/péptido (5 ou 10 mg/kg de peso corporal, expresso como péptido) numa única injecção não excedendo 10-15 ml. Os animais foram ligeiramente sedados antes das 195 ΡΕ1019073 manipulações. Amostras sanguíneas (colhidas em EDTA) foram tiradas antes e 5, 15, 30, 60, 240 e 1440 minutos após a injecção. Foi determinado o hematócrito (Hct) para cada amostra. As amostras foram divididas em alíquotas e armazenadas a -20°C antes da análise.

11.4. ANÁLISE DOS SOROS DE COELHO Lípidos do Plasma. O colesterol total do plasma, os triglicéridos do plasma e os fosfolípidos do plasma foram determinados enzimaticamente utilizando ensaios comercialmente disponíveis de acordo com os protocolos do fabricante (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany and Biomérieux, 69280, Marcy-L'étoile, França).

Perfis Lipoproteicos. Os perfis das lipoproteínas plasmáticas das fracções obtidas após a separação do plasma nas suas fracções lipoproteicas foram determinados através de centrifugação num gradiente de densidade de sacarose. As fracções foram recolhidas e em cada fracção individual foi medido enzimaticamente o teor de fosfolípidos e colesterol.

11.5. RESULTADOS O perfil lipoproteico dos coelhos injectados com 10 mg/kg de péptido 4 (SEQ ID NO:4) (na forma de complexos péptido/DPPC) em função do tempo é mostrado na FIG. 10. Um aumento substancial no colesterol das fracções de 196 ΡΕ1019073 colesterol HDL (fracções >1,06 mg/ml) é aparente 5 min. após a injecção e dura aproximadamente 1 h. O colesterol das fracções de HDL combinadas obtidas através de ultracentrifugação em gradiente de densidade é apresentado na TABELA XVI, abaixo. O maior aumento de colesterol HDL (31,3%) ocorreu 15 min. após a administração.

Estes dados indicam que a administração de complexos péptido 4/DPPC (10 mg/kg) induz uma mobilização rápida e eficiente do colesterol periférico.

TABELA XVI

COLESTEROL HDL EM COELHOS APÓS ADMINISTRAÇÃO DE 10 mg/kg DE PÉPTIDO 4 (SEQ ID NO:4)

Tempo (min.) Colesterol HDL Aumento do Colesterol HDL (%) 0 325 408 25,2 15 428 31,3 60 387 18,9 240 291 -10,7 1440 347 6,6 A dependência da dose dos complexos péptido 4/DPPC é mostrada na TABELA XVII, abaixo. Com base nestes dois momentos, foi observada uma dependência da dose aproximadamente linear. 197 ΡΕ1019073

TABELA XVII

DEPENDÊNCIA DA DOSE DOS NÍVEIS DE COLESTEROL HDL APÓS ADMINISTRAÇÃO DE COMPLEXOS PÉPTIDO 4/DPPC

Dose Colesterol HDL (5 min.) Colesterol HDL min.) (15 Colesterol HDL (60 min.) 5 mg/kg 33,7 28 60 5 mg/kg 49 40 20 Aumento médio (%) 41,4 35,0 40,0 10 mg/kg 60,7 75 121,3 10 mg/kg 35 42,5 35,6 Aumento médio (%) 47,9 58,8 78,5 O aumento percentual no colesterol HDL após injecção de 5 mg/kg de péptido 1 (SEQ ID NO:l) (na forma de complexos péptido/DPPC) ou de 10 mg/kg de péptido 3 (SEQ ID NO: 3) (na forma de complexos péptido/DPPC) é mostrada na TABELA XVIII, abaixo.

TABELA XVIII

Tempo (min) Aumento (%) (Péptido 1, 5 mg/kg) Aumento (%) (Péptido 3, 10 mg/kg) 15 24,5 84 30 95 71 60 40,7 60 240 29 14,5

Estas experiências demonstram a capacidade dos agonistas de ApoA-I do invento para aumentar o colesterol HDL. Foi observado um aumento substancial no colesterol HDL mesmo 4 horas após a administração de péptido 1 (SEQ ID NO:1) e de péptido 3 (SEQ ID NO:3). 198 ΡΕ1019073

12. EXEMPLO: PREPARAÇÃO DO COMPLEXO PÉPTIDO-LÍPIDO ATRAVÉS DA ABORDAGEM DE CO-LIOFILIZAÇÃO

Foi utilizado o seguinte protocolo para preparar complexos péptido-lipido.

Foi dissolvido 1 mg de péptido 4 (SEQ ID NO:4) em 250 μΐ de metanol com qualidade de HPLC (Perkin Elmer) num frasco de vidro transparente de 1 ml com tampa (Waters #WAT025054) . A dissolução do péptido foi ajudada por vórtice ocasional durante um período de 10 minutos à temperatura ambiente. A esta mistura foi adicionada uma alíquota contendo 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10 ou 15 mg de dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC; Avanti Polar Lipids, 99% de Pureza, produto #850355) de uma solução de reserva a 100 mg/ml em metanol. O volume da mistura foi levado até 400 μΐ através da adição de metanol, e a mistura foi ainda sujeita a vórtice intermitentemente durante um período de 10 minutos à temperatura ambiente. A cada tubo foram adicionados 200 μΐ de xileno (Sigma-Aldrich 99% puro, qualidade de HPLC) e os tubos foram sujeitos a vórtice durante 10 segundos cada um. Foram feitos dois pequenos furos nas tampas de cada tubo com uma agulha de seringa de calibre 20, os tubos foram congelados durante 15 segundos cada um em azoto líquido, e os tubos foram liofilizados de um dia para o outro em vácuo. A cada tubo foram adicionados 200 ml de solução de NaCl a 0,9%. Os tubos foram sujeitos a vórtice durante 20 segundos cada um. Neste momento as 199 ΡΕ1019073 soluções nos tubos tinham uma aparência láctea. Os tubos foram então incubados num banho-maria durante 30 minutos a 41°C. As soluções em todos os tubos tornaram-se transparentes (i.e., com uma aparência semelhante à da água) excepto o tubo contendo 15 mg de DPPC, que permaneceu turvo.

Foi utilizado o seguinte protocolo para preparar uma maior quantidade de complexos péptido-lipido para experiências in vivo. O péptido 4 (SEQ ID NO: 4) (22,4 mg) foi dissolvido em metanol a uma concentração de 3,5 mg/ml através de incubação durante vários minutos e de mistura sujeitando a vórtice intermitentemente. A esta solução foi adicionada dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) em metanol (solução de reserva a 100 mg/ml) de modo a que a razão final de DPPC/péptido fosse de 2,5:1 (peso/peso) . Esta solução foi misturada através de vórtice. Foi adicionado xileno a esta solução até uma concentração final de 36%. Foram tiradas alíquotas da solução resultante para posterior análise através de cromatografia de filtração. As soluções foram congeladas em azoto liquido e liofilizadas até à secura através de vácuo. Uma alíquota contendo 20 mg de péptido e 50 mg de DPPC foi re-hidratada em solução salina estéril (NaCl a 0,9%), misturada e aquecida até 41°C durante vários minutos até resultar numa solução transparente de complexos péptido-fosfolipido reconstituídos . 200 ΡΕ1019073 12.1. CARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS ATRAVÉS DE CROMATO-GRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL SUPEROSE 6

Os complexos péptido-fosfolípido contendo péptido 4 marcado com 14C (SEQ ID NO:4) (radioactividade específica 159000 DPM/mg de péptido por peso, assumindo um teor de péptido de 50%) foram preparados através de co-liofilização tal como descrito no texto. A preparação continha 1 mg de péptido e 4 mg de DPPC por peso. Após reconstituição dos complexos em 200 μΐ de NaCl a 0,9%, foram aplicados 20 μΐ (100 pg) dos complexos numa coluna Pharmacia Superose 6 utilizando NaCl a 0,9% como fase líquida a um caudal de 0,5 ml/minuto. Após um atraso de 5 ml (o volume vazio da coluna = 7,7 ml), foram colhidas fracções de 1 ml. Alíquotas contendo 20 μΐ das fracções foram ensaiadas quanto ao teor de fosfolípidos utilizando o estojo bioMerieux

Phospholipides Enzymatique PAP 150 (#61491) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. O restante de cada fracção foi contado durante 3 minutos num contador de cintilações líquidas Wallach 1410 (Pharmacia) utilizando o programa Easy Count. A grande maioria dos fosfolípidos e dos péptidos foi recuperada junta em poucas fracções com picos a aproximadamente 16 ml. O perfil de absorvância de UV para esta amostra (não mostrado) indica que os complexos eluem da coluna a um volume de 14,7 ml. A discrepância entre o volume de eluição medido através do ensaio de radioactividade/fosfolípido e a absorvância de UV é devida 201 ΡΕ1019073 ao volume morto de 1,3 ml da tubagem entre a célula de fluxo da absorvância de UV e a saída do colector das fracções. Este volume de eluição corresponde a um diâmetro de Stokes de 114 Angstroms. Os volumes de eluição de cerca de 15-19 ml correspondem a partículas de diâmetro de Stokes de 50-120 Angstroms, que é o intervalo de tamanho da HDL humana.

12.2. CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL SUPEROSE 6 DE HDL HUMANA A HDL2 humana foi preparada como se segue: 300 ml de plasma humano congelado (Mannheim Blutspendzentrale #1185190) foram descongelados, ajustados a uma densidade de 1,25 com brometo de potássio sólido e centrifugados durante 45 h a 40000 RPM utilizando um rotor Ti45 (Beckman) a 20°C. A camada flutuante foi colhida, dializada contra água destilada, ajustada a uma densidade de 1,07 com brometo de potássio sólido e centrifugada tal como descrito acima durante 70 horas. A camada de baixo (a um nível de um cm acima do fundo do tubo) foi colhida, levada até 0,01% de azida de sódio e armazenada a 4°C durante 4 dias até à cromatografia. Foram carregados 20 μΐ da HDL2 num sistema de cromatografia de filtração em gel Pharmacia Superose 6 FPLC utilizando NaCl a 0,9% como eluato da coluna. O caudal da coluna foi de 0,5 ml/min. O eluato da coluna foi monitorizado através de absorvância ou de dispersão de luz de comprimento de onda de 254 nm. Uma série de proteínas de 202 ΡΕ1019073 peso molecular e de diâmetro de Stokes conhecidos foi utilizada como padrão para calibrar a coluna para o cálculo do diâmetro de Stokes das partículas (Pharmacia Gel Filtration Calibration Kit Instruction Manual, Pharmacia Laboratory Separation, Piscataway, NJ, revisto em Abril de 1985) . A HDL eluiu com um volume de retenção de 14,8 ml, correspondente a um diâmetro de Stokes de 108 nm.

13. EXEMPLO: PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS

Os péptidos 4 ou 8 foram conjugados com hemocianina da lapa (KLH; 1 mg de péptido para 10 mg de KLH) . O conjugado de KLH (LMG) foi suspenso em adjuvante completo de Freund e injectado em coelhos no momento 0 e estes foram reforçados com 0,25 mg de conjugado de KLH às 4 semanas e novamente às 5 semanas. As pré-sangrias e pós-sangrias de seis semanas foram testadas quanto ao título de anticorpo contra o antigénio autêntico através de ELISA.

As sangrias de produção foram reunidas a partir de 2 coelhos cada uma. Os anticorpos dirigidos exclusivamente contra os antigénios peptídicos foram isolados como se segue: 1. O péptido livre foi ligado a Sepharose 4B (Pharmacia) activada com brometo de cianogénio de acordo com o protocolo do fabricante. 203 ΡΕ1019073 2. Os anti-soros foram pré-absorvidos numa coluna de péptidos irrelevantes e em colunas de proteínas séricas humanas e de ratinho irrelevantes. 3. Os anti-soros pré-absorvidos foram passados através da coluna do péptido correspondente (ver ponto 1). 4. As colunas foram lavadas com solução salina tamponada com borato 0,1 M (pH 8,2) e os anticorpos ligados foram eluídos utilizando um passo de gradiente de baixo pH de pH 4,0 a pH 3,0 a pH 2,0 (tampão glicina 0,1 M) e finalmente com HC1 0,1 M. 5. O material eluído foi neutralizado com solução salina de borato em excesso, concentrado através de ultrafiltração (Amicon, YM30) e dializado contra solução salina de borato. 6. A concentração proteica foi determinada através de absorvância a 280 nm.

Os anticorpos resultantes foram testados quanto à especificidade para a espécie utilizando ApoA-I humana purificada ou ApoA-I de ratinho purificada num ensaio de ligação ELISA directo. Os anticorpos humanos e de murídeo foram específicos para a ApoA-I humana e demonstraram uma reactividade cruzada mínima. ΡΕ1019073 204

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Dasseux, Jean-Louis

Sekul, Renate Buttner, Klaus Cornut, Isabelle Metz, Gunther Dufourcq, Jean

(ii) TÍTULO DO INVENTO: AGONISTAS DA APOLIPOPROTEÍNA

A-I E SUA UTILIZAÇÃO PARA TRATAR DISTÚRBIOS DISLIPIDÉMICOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 254 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: Pennie & Edmonds LLP (B) RUA: 1155 Avenue of the Américas (C) CIDADE: New York

(D) ESTADO: NY

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 10036-2811 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) SUPORTE LÓGICO: FastSEQ Versão 2.0 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US98/20327 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-SET-1998 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/940095 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 29-SET-1997 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE: (A) NOME: Coruzzi, Laura A. (B) NÚMERO DE REGISTO: 30742 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/RECIBO: 009196-0004-228 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 650-493-4935 (B) TELECÓPIA: 650-493-5556

(C) TELEX: 66141 PENNIE (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 205 ΡΕ1019073 (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 16 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Naftilalanina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Xaa 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Gly Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 206 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = D-Pro (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Xaa Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: 207 ΡΕ1019073 (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii ) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: : 8: Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples 208 ΡΕ1019073 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO ': 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 17 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Naftilalanina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 1 Leu Lys Gin Lys 5 Leu Lys 10 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:12: 209 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

Ala

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu 15 10 15

Gly Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13:

Ala

Gly Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 18 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 20 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Xaa = Orn 210 ΡΕ1019073 (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 22 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Xaa = Orn (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Pro Vai Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 Leu Lys Gin Lys 5 Leu Lys 10 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples 211 ΡΕ1019073 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:18: (i) CARAÇTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

Gly Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO : 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = D-Pro (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19:

Xaa Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:20: 212 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = D-Pro (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21:

Xaa Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22: 213 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra 214 ΡΕ1019073 (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25:

Pro Vai Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 1 Leu Lys Gin Lys 5 Leu Lys 10 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 14 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Naftilalanina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:28: 215 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28:

Ala

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29:

Ala

Ala Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: péptido dansilado no

terminal N (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:30: 216 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:31:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Leu Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32:

Xaa Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:33: 217 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:33:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Xaa = Naftilalanina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34:

Pro Vai Leu Asp Xaa Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:35: 218 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Trp Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:36:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:37:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: 219 ΡΕ1019073 (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:38:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Trp Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:40:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Asn Glu Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 220 ΡΕ1019073 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:41:

Ala

Pro Vai Leu Asp Leu Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:42:

Ala

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Trp Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 221 ΡΕ1019073 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:43:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Todos os aminoácidos geneticamente codificados estão na

configuração D (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:44:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib 222 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:45:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:46:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:47:

Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos 223 ΡΕ1019073 (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = D-Pro (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = D-Val (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:48:

Xaa Xaa Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:49: (i) CARACTERÍSTIÇAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:49:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra 224 ΡΕ1019073 (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:50:

Ala

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Trp Glu Xaa Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:51:

Ala

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO : 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:52: 225 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Gly Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:53:

Vai Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:54:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Trp Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:55: 226 ΡΕ1019073

Pro Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:56:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Lys Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:57:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra 227 ΡΕ1019073 (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:58:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:59:

Leu Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii ) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:60: Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu 1 5 10 15 Leu Lys Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 228 ΡΕ1019073 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:61:

Ala

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Trp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:62:

Ala

Pro Vai Leu Asp Glu Trp Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) (B) (D) NOME/CHAVE: Outra LOCALIZAÇÃO: 13 OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib 229 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:63:

Pro Vai Leu Asp Phe Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 15 10

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:64:

Pro Trp Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 12 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:65:

Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 230 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:66:

Ala

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Glu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:67:

Leu

Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:68: 231 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Lys Glu Xaa Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:69: CARACTERÍSTIÇAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:69:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Lys Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:70: (i) CARACTERÍSTIÇAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:70:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:71: 232 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 14 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:71:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:72:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 233 ΡΕ1019073 ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:73:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Trp Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:74:

Pro Vai Leu Asp Lys Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:75: 234 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:76:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Phe Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:77:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Lys Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:78: 235 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:78:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Asp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:79:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:80: 236 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:81:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 11 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:82:

Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:83: 237 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:83:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:84:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:85: 238 ΡΕ1019073

Pro Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu 1 5 10 15 Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:86:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1..22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Todos os aminoácidos estão

na configuração D (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:87:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples 239 ΡΕ1019073 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:88:

Pro Vai Leu Asp Lys Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:89: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:89:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:90: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra ΡΕ1019073 240 (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:90: Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15 Lys Leu Lys

Gin (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO : 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO : 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:91: Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu 15 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

Ala (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:92: 241 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Tyr Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:93:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:94:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ala Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 242 ΡΕ1019073 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:95:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...22

(D) OUTRA INFORMAÇÃO: Todos os aminoácidos geneticamente codificados estão na configuração D (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:96:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum 243 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:97:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:98:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Vai Pro 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO >: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: 244 ΡΕ1019073 (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...22

(D) OUTRA INFORMAÇÃO: Todos os aminoácidos estão na configuração D (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:100:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:101: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO : 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:101:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:102: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) (B) (D) NOME/CHAVE: Outra LOCALIZAÇÃO: 13 OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib 245 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:102:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Glu Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:103: (i) CARACTERÍSTIÇAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:103:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:

Pro Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys Leu Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:105: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:105: 246 ΡΕ1019073

Pro Ala Ala Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Glu Ala 1 5 10 15 Ala Lys Gin Lys Ala Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:106:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:107: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Todos os aminoácidos estão

na configuração D (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:107:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Vai Pro 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples 247 ΡΕ1019073 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:108:

Ala

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Trp Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:109: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:109:

Ala

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:110: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:110: 248 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Xaa Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:lll: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:111:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Trp Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:112: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:112:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Ser Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:113: 249 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:113:

Ala

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Pro Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:114: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:114:

Ala

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Met Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:115: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: 250 ΡΕ1019073 (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:115:

Pro Lys Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:116: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:116:

Pro His Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:117: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:117: 251 ΡΕ1019073

Pro Glu Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:118: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:118:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:119: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO : 17 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:119:

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:120: 252 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 16 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Aib (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:120:

Xaa

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:121: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:121:

Ala

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu 15 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:122: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:122: 253 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Trp 1 5 10 15 Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:123: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:123:

Gin Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:124: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 20 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:124:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa 20 254 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:125: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:125:

Asn Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:126: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:126:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Gly Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:127: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:127:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:128: 255 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:128:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Phe 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:129: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:129:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:130: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:130:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:131: 256 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:131:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Arg Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:132: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:132:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:133: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:133:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Gin Ala 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:134: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 257 ΡΕ1019073 (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:134:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Lys Ala 1 Leu Asn Gin Lys 5 Leu Lys 10 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:135: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:135:

Asp Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:136: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:136:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:137: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: ΡΕ1019073 258 (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: : Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 17 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Naftilalanina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:137:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:138: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:138:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:139: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:139:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 259 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:140: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 20 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:140:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:141: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:141:

Pro Vai Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:142: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 260 ΡΕ1019073 (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:143: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = péptido acetilado no

terminal N e amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:143:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:144: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = D-Pro 261 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:144:

Xaa Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:145: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:145:

Gly Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:146: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:146:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:147: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum 262 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:147:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Phe Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:148: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:148:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:149: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:149:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:150: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:150: 263 ΡΕ1019073

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 Leu Gin Lys Lys 5 Leu Lys 10 15 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:151: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:151:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:152: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:152:

Pro Vai Phe Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:153: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:153: 264 ΡΕ1019073

Vai Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:154: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:154:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:155: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:155:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:156: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:156: 265 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:157: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:157:

Pro Vai Leu Glu Phe Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:158: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:158:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:159: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) i TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:159: 266 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:160: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:160:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:161: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:161:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:162: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:162: 267 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Trp Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:163: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:163:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Trp Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:164: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:164:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Trp Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:165: (i) CARACTERÍSTIÇAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:165: 268 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:166: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:166:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:167: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:167:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:168: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:168: 269 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Gin Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:169: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:169:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:170: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 12 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 19 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 20 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:170: 270 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:171: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:171:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:172: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:172:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:173: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:173: 271 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:174: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...22 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Todos os aminoácidos

estão na configuração D (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:174:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:175: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:175:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:176: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples 272 ΡΕ1019073 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:176:

Pro Vai Leu Glu Leu Trp Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:177: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:177:

Gly Vai Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:178: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:178:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Leu Asp Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:179: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 273 ΡΕ1019073 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:179:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:180: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:180:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:181: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:181:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Trp Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:182: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 274 ΡΕ1019073 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:182:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:183: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:183:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:184: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:184:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Trp Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:185: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum 275 ΡΕ1019073 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 19 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 20 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:185:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:186: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:86:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Gin Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Xaa 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:187: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:187: 276 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:188: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:188:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:189: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:189:

Asp Vai Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:190: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum 277 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:190:

Pro Vai Leu Glu Phe Trp Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:191: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:191:

Pro Vai Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:192: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:192: 278 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:193: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:193:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:194: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:194:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys 279 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:195: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:195:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:196: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:196:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:197: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos 280 ΡΕ1019073 (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:197:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:198: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:198:

Gly Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:199: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum 281 ΡΕ1019073 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:199:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:200: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:200:

Asn Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:201: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 282 ΡΕ1019073 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:201:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:202: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:202:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys 15 10 15

Leu Arg (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:203: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:203: 283 ΡΕ1019073

Ala Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:204: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:204:

Pro Vai Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:205: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:205:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys 284 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:206: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:206:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:207: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:207:

Pro Vai Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:208: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos 285 ΡΕ1019073 (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:208:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Arg 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:209: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:209:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:210: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:210:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys 286 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:211: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 14 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 16 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:211:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa 15 10 15

Leu Xaa (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:212: (i) CARACTERÍSTIÇAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C ΡΕ1019073 - 287 - (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 14 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 16 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa = Orn (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:212:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa 15 10 15

Leu Xaa (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:213: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:213:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Phe Arg Gin Arg 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:214: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum 288 ΡΕ1019073 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: configuração D de Pro (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:214:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:215: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:215:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Trp Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:216: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum 289 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:216:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:217: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:217:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Leu Leu Leu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:218: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:218:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:219: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos 290 ΡΕ1019073 (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:219:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:220: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:220:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Gin Lys Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:221: (i) CARACTERÍSTIÇAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:221:

Asp Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys 291 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:222: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (il) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:

Pro Vai Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Leu Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:223: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:223:

Pro Vai Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Ala Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:224: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:224:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Trp Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys 292 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:225: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:225:

Pro Vai Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:226: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:226:

Pro Vai Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Gly Glu Ala Leu Leu Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:227: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:227: 293 ΡΕ1019073

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:228: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:228:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:229: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:229:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Gly Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys 294 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:230: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:230:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Gin Lys Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:231: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:231:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:232: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C 295 ΡΕ1019073 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:232:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:233: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: (B) TIPO: (C) CADEIA: (D) TOPOLOGIA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:233:

Esta sequência foi intencionalmente omitida (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:234: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: (B) TIPO: (C) CADEIA: (D) TOPOLOGIA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:234:

Esta sequência foi intencionalmente omitida (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:235: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: (B) TIPO: (C) CADEIA: (D) TOPOLOGIA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:235:

Esta sequência foi intencionalmente omitida (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:236: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 296 ΡΕ1019073 (A) COMPRIMENTO: (B) TIPO: (C) CADEIA: (D) TOPOLOGIA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:236:

Esta sequência foi intencionalmente omitida (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:237: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:237:

Leu Asp Asp Leu Leu Gin Lys Trp Ala Glu Ala Phe Asn Gin Leu Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:238: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:238:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Vai Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe 297 ΡΕ1019073 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:239: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:239:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Vai Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:240: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:240:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:241: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos 298 ΡΕ1019073 (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:241:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:242: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:242:

Gly Ile Lys Lys Phe Leu Gly Ser Ile Trp Lys Phe Ile Lys Ala Phe 15 10 15

Vai Gly (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:243: (i) CARACTERÍSTIÇAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:243:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:244: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 299 ΡΕ1019073 (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:244:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:245: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:245:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:246: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Vai Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:247: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples 300 ΡΕ1019073 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:247:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:248: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:248:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Vai Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:249: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:249:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Vai Glu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:250: 301 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:250:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Vai Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:251: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:251:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Lys Lys Vai Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:252: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 302 ΡΕ1019073 (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...15 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:252:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Gin Lys Leu Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:253: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...16 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:253:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:254: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...16 303 ΡΕ1019073 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:254:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:255: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...15 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:255:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:256: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...16 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:256:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:257: 304 ΡΕ1019073 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO : 1...16 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:257:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:258: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Nenhum (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Outra (B) LOCALIZAÇÃO: 1...16 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: acetilado no terminal N e

amidado no terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:258:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Lisboa, 9 de Abril de 2008

Claims

ΡΕ1019073 1 REIVINDICAÇÕES 1. Agonista de ApoA-I compreendendo: i) um péptido ou análogo peptídico de 15 a 29 resíduos que forma uma hélice α anfipática na presença de lípidos e que compreende a Fórmula estrutural (I): Zl-Xl-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0-Xll-Xl2-Xl3-Xl4-Xl5- Xi6-Xi7_Xi8-Xi9_X20_X21_X22_X23_Z2 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que: Xi é Pro (P) , Ala (A), Gly (G) , Gin (Q) , Asn (N) , Asp (D) ou D-Pro (p); X2 é um resíduo alifático; X3 é Leu (L) ou Phe (F) ; X4 é um resíduo ácido; X5 é Leu (L) ou Phe (F); Χδ é Leu (L) ou Phe (F) ; X7 é um resíduo hidrófilo; Xs é um resíduo ácido ou básico; X9 é Leu (L) ou Gly (G); X10 é Leu (L), Trp (W) ou Gly (G) ; X11 é um resíduo hidrófilo; X12 é um resíduo hidrófilo; X13 é Gly (G) ou um resíduo alifático; X14 é Leu (L), Trp (W) , Gly (G) ou Nal; 2 ΡΕ1019073 Xis é resíduo hidrófilo; Χίε é um resíduo hidrófobo; X17 é um resíduo hidrófobo; Xis é Gin (Q), Asn (N) ou um resíduo básico; X19 é Gin (Q), Asn (N) ou um resíduo básico; X20 é um resíduo básico; X21 é um resíduo alifático; X22 é um resíduo básico; X23 está ausente ou é um resíduo básico; Zi é H2N- ou RC(0)NH-; Z2 é -C(0)NRR, -C(0)0R ou -C(0)0H ou um sal deste; cada R é independentemente -H, alquilo (C1-C6), alcenilo (Ci-C6), alcinilo (Ci-Cô) ; arilo (C5-C2o), alcarilo (C6—C26) , heteroarilo com 5-20 membros ou alceteroarilo com 6-2 6 membros ou um péptido ou análogo peptídico de 1 a 7 resíduos; cada entre os resíduos Xn designa indepen dentemente uma ligação amida, uma ligação amida substituída, um isostero de uma amida ou imitador de amida; ou ii) uma forma suprimida da Fórmula estrutural (I) em que pelo menos um e até oito dos resíduos Xi, X2, X3, X4, X5, Χβ, X7, Χδ, X9, X10, Xll, X12, X13, X14, X15, Xl6, Xl7, Xis, X19, X20, X21 e X22 são suprimidos; ou iii) uma forma alterada da Fórmula estrutural (I) em que pelo menos um dos resíduos Xi, X2, X3, X4, X5, X6, X7, Χδ, X9 r X10, Xll; X12, Xl3, Xl4, Xl5, Xl6; Xl7; Xl8, Xl9; X20; X2I; X22 ou X23 é conservativamente substituído por outro resíduo. 3 ΡΕ1019073 2. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 1 que exibe pelo menos cerca de 38% de actividade de activação de LCAT em comparação com a ApoA-I humana. 3. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 1 que é a forma alterada da Fórmula estrutural (I). 4. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 3 no qual os resíduos hidrófobos são fixados de acordo com a Fórmula estrutural (I) e pelo menos um resíduo não fixado é conservativamente substituído por outro resíduo. 5. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 4, em que: Xi é Pro (P), D-Pro (P) , Gly (G) ou Ala (A) ; X2 é Ala (A) , Leu (L) ou Vai (V) ; X3 é Leu (L) ou Phe (F) ; X5 é Leu (L) ou Phe (F); Xe é Leu (L) ou Phe (F) ; X9 é Leu (L) ou Gly (G) ; X10 é Leu (L), Trp (W) ou Gly (G); Xl3 é Leu (L), Gly (G) ou Aib; Xl4 é Leu, . Nal, Trp (W) ou Gly (G); X26 é Ala (A), Nal, Trp (W), Gly (G), Leu (F) ; X17 é Leu (L) , Gly (G) ou Nal; X21 é Leu (L) ; e 4 ΡΕ1019073 pelo menos um de X4, X7, Xs, Xn, Xi2^ X15, Xis? Xi9? X20, X22 e X23, é conservativamente substituído por outro resíduo. 6. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 3, no qual os resíduos hidrófilos são fixados de acordo com a Fórmula estrutural (I) e pelo menos um resíduo não fixado é conservativamente substituído por outro resíduo. 7. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 6, em gue: Xe é Asp (D) ou Glu (E); X7 é Lys (K) , Arg (R) ou Orn f X9 é Asp (D) ou Glu (E); X11 é Asn (N) ou Gin (Q) ; X12 é Glu (E) ou Asp (D); Xis é Asp (D) ou Glu (E) ; Xis é Gin (Q) , Asn (N), Lys (K) ou Orn; X19 é Gin (Q) , Asn (N) , Lys (K) ou Orn; X20 é Lys (K) ou Orn; X22 é Lys (K) ou Orn; X23 está ausente ou é Lys (K); e pelo menos um de Xi, X2, X3, X5, Xe, X9, Χίο, X13, Xu, Xie, Xi e X21 é conservativamente substituído por outro resíduo. 8. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 1, em que X3 é Leu (L) ou Phe (F) , X6 é Phe (F) , X9 é Leu (L) ou 5 ΡΕ1019073 Gly (G) , Χίο é Leu (L) ou Trp (W) ou Gly (G) e pelo menos um de Xi, X2, X5, Xi3f X14, Xi6, X17 e X21 é conservativamente substituído por outro resíduo. 9. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 5 ou 7, no qual o resíduo substituinte é classificado dentro da mesma subcategoria que o resíduo substituído. 10. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 1 que é a forma suprimida da Fórmula estrutural (I). 11. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 10, no qual está suprimida uma volta helicoidal do péptido ou análogo peptídico. 12. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 1 que é um péptido ou análogo peptídico de 22-23 resíduos de Fórmula estrutural (I). 13. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 12, no qual: o entre os resíduos designa -C(0)NH-; Zi é H2N-; e Z2 é -C(0)0H ou um sal deste. 14. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 13, no qual: 6 ΡΕ1019073 Xi é Pro (P), Ala (A), Gly (G) , Asn (N) , Gin (Q) , Asp (D) ou D-Pro (p); (G) x2 é Ala (A) , Vai (V) ou Leu (L); X3 é Leu (L) ou Phe (F) ; X4 é Asp (D) ou Glu (E); X5 é Leu (L) ou Phe (F) ; Xe é Leu (L) ou Phe (F) ; X7 é Lys (K) , Arg (R) ou Orn; Xs é Asp (D) ou Glu (E); Xg é Leu (L) ou Gly (G); X10 é Leu (L) , Trp (W) ou Gly (G); Xn é Asn (N) ou Gin (Q) ; X12 é Glu (E) ou Asp (D); X13 é Gly (G) , Leu (L) ou Aib; Xl4 é Leu (L) , Nal, Trp (W) ou Gly (G) ; Xl5 é Asp (D) ou Glu (E) ; Xl6 é Ala (A) , Nal, Trp (W) , Leu (L) , r-~ I—1 X é Gly (G) , Leu (L) ou Nal; X18 é Gin (Q) , Asn (N), Lys (K) ou Orn; 03 c—1 X é Gin (Q) , Asn (N), Lys (K) ou Orn; X20 é Lys (K) ou Orn; X21 é Leu (L) r X22 é Lys (K) ou Orn; e X23 está ausente ou é Lys (K) 15. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 14, no qual X21 está ausente. 7 ΡΕ1019073 16. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 13 ou 14, no qual um de Xis ou Xig é Gin (Q) ou Asn (N) e o outro de Xis ou Xig é Lys (K) ou Orn. 17. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 14, no qual cada um de Xg, Χίο, X13, X14, X15 e X17 é diferente de Gly (G). 18. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 14, no qual um de X9, Χχ0, X13, X14, X15 e X17 é Gly (G) e os outros são diferentes de Gly (G). 19. Agonista de ApoA-I da Reivindicação 1 que é seleccionado a partir do grupo que consiste em: péptido 1 PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK (SEQ ID NO: 1) péptido 2 GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO: 2) péptido 3 PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK (SEQ ID NO: 3) péptido 4 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 4) péptido 5 pVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO: 5) péptido 6 PVLDLFRELLNEXLEALKQKLK (SEQ ID NO: 6) péptido 7 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 7) péptido 8 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 8) péptido 9 PVLDLFRELGNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 9) péptido 10 PVLDLFRELLNELLEAZKQKLK (SEQ ID NO:10) péptido 11 PVLDLFKELLQELLEALKQKLK (SEQ ID NO:11) péptido 12 PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK (SEQ ID NO:12) péptido 13 GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:13) péptido 14 PVLDLFRELLNELLEALOQOLO (SEQ ID NO:14) ΡΕ1019073 péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido péptido 15 PVLDLFRELWNELLEALKQKLK 16 PVLDLLRELLNELLEALKQKLK 17 PVLELFKELLQELLEALKQKLK 18 GVLDLFRELLNELLEALKQKLK 19 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK 20 PVLDLFREGLNELLEALKQKLK 21 pVLDLFRELLNELLEALKQKLK 22 PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK 23 PLLELFKELLQELLEALKQKLK 24 PVLDLFRELLNELLEALQKKLK 25 PVLDFFRELLNEXLEALKQKLK 26 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK 27 PVLDLFRELLNELZEALKQKLK 28 PVLDLFRELLNELWEALKQKLK 29 AVLDLFRELLNELLEALKQKLK 123QVLDLFRELLNELLEALKQKLK 124 PVLDLFOELLNELLEALOQOLO 125NVLDL KQKLK 126 PVLDLFRELLNELGEALKQKLK 127 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK 128PVLDL FLKQKLK 129 PVLELFNDLLRELLEALQKKLK 130 PVLELFNDLLRELLEALKQKLK 131PVLELFKELLNELLDALRQKLK 132PVLDLFRELLENLLEALQKKLK 133 PVLELFERLLEDLLQALNKKLK 134 PVLELFERLLEDLLKALNQKLK 135 DVLDLFRELLNELLEALKQKLK 136 PALELFKDLLQELLEALKQKLK 137 PVLDLFRELLNEGLEAZKQKLK (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16) (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:18) (SEQ ID NO:19) (SEQ ID NO:20) (SEQ ID NO:21) (SEQ ID NO:22) (SEQ ID NO:23) (SEQ ID NO:24) (SEQ ID NO:25) (SEQ ID NO:26) (SEQ ID NO:27) (SEQ ID NO:28) (SEQ ID NO:29) (SEQ ID NO:123) (SEQ ID NO:124) (SEQ ID NO:125) (SEQ ID NO:126) (SEQ ID NO:127) (SEQ ID NO:128) (SEQ ID NO:129) (SEQ ID NO:130) (SEQ ID NO:131) (SEQ ID NO:132) (SEQ ID NO:133) (SEQ ID NO:134) (SEQ ID NO:135) (SEQ ID NO:136) (SEQ ID NO:137) 9 ΡΕ1019073 péptido 138PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK (SEQ ID NO:138) péptido 139PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:139) péptido 140PVLDLFRELLNEGLEALOQOLO (SEQ ID NO:140) péptido 141PVLOFFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:141) péptido 142PVLELFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO:142) e as formas aciladas no terminal N e/ou amidadas ou esterificadas no terminal C destes em que X é Aib; Z é Nal; e 0 é Orn. 20. em que Z é Nal. Péptido PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK (SED ID NO: 1) , 21. Péptido GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO: 2). 22. Péptido PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK (SEQ ID NO: 3). 23. Péptido PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 4). 24. Péptido PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 8). 25. Aqonista multimérico de ApoA-1 que exibe pelo menos cerca de 38% de actividade de activação de LCAT em comparação com a ApoA-I humana e que tem a Fórmula estrutural (II): (II) HH-[LLm-HH]-nLLm-HH ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que: 10 ΡΕ1019073 cada m é independentemente um número inteiro de 0 a 1; n é um número inteiro de 0 a 10; cada "HH" é independentemente um péptido ou um análogo peptidico de acordo com a Reivindicação 1; cada "LL" é independentemente um ligador bifuncional; e cada designa independentemente uma ligação cova- lente . 26. dicação 25, em Agonista multimérico de ApoA-I da Reivin-que o ligador bifuncional é clivável. 27. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivin dicação 25, em que n é 0. 28. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivin dicação 27, em que m é zero. 29. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivin dicação 25, em que cada HH é independentemente um péptido de acordo com a Reivindicação 13. 30. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivindicação 25, em que cada HH é independentemente um péptido de acordo com a Reivindicação 14. 31. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivindicação 25, em que cada HH é independentemente um péptido de acordo com a Reivindicação 19. 11 ΡΕ1019073 32. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivindicação 25, em que cada HH é independentemente um péptido de acordo com a Reivindicação 20. 33. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivindicação 25, em que cada HH é independentemente um péptido de acordo com a Reivindicação 21. 34. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivindicação 25, em que cada HH é independentemente um péptido de acordo com a Reivindicação 22. 35. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivindicação 25, em que cada HH é independentemente um péptido de acordo com a Reivindicação 23. 36. Agonista multimérico de ApoA-I da Reivindicação 25, em que cada HH é independentemente um péptido de acordo com a Reivindicação 24. 37. Complexo agonista de ApoA-I-lipido compreendendo um agonista de ApoA-I e um lipido, em que o agonista de ApoA-I é um péptido ou análogo peptidico de acordo com a Reivindicação 1 ou um agonista multimérico de ApoA-I de acordo com Reivindicação 25. 38. Complexo agonista de ApoA-I-lipido da Reivindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 12. 12 ΡΕ1019073 39. Complexo agonista de ApoA-I-lípido da Reivindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 13. 40. Complexo agonista de ApoA-I-lipido da Reivindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 14. 41. Complexo agonista de ApoA-I-lípido da Reivindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 19. 42. Complexo agonista de ApoA-I-lípido da Reivindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 20. 43. Complexo agonista de ApoA-I-lipido da Reivindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 21. 44. Complexo agonista de ApoA-I-lípido da Reivindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 22. 45. Complexo agonista de ApoA-I-lipido da Reivindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 23. 46. Complexo agonista de ApoA-I-lípido da Rei- 13 ΡΕ1019073 vindicação 37, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 24. 47. Complexo agonista de ApoA-I-lipido da Reivindicação 37, em que o lipido é esfingomielina. 48. Complexo agonista de ApoA-I-lipido da Reivindicação 37, que está na forma de um pó liofilizado. 49. Complexo agonista de ApoA-I-lipido da Reivindicação 38 que está na forma de uma solução. 50. Composição farmacêutica compreendendo um agonista de ApoA-I e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o agonista de ApoA-I é um péptido ou análogo peptídico de acordo com a Reivindicação 1 ou um agonista multimérico de ApoA-I de acordo com a Reivindicação 20. 51. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 12. 52. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 13. 53. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 14. 14 ΡΕ1019073 54. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 19. 55. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 20. 56. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 21. 57. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 22. 58. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 23. 59. Composição farmacêutica da Reivindicação 50, em que o agonista de ApoA-I é um péptido de acordo com a Reivindicação 24. 60. Composição farmacêutica de qualquer uma das Reivindicações 50-59, em que o agonista de ApoA-I está na forma de um complexo agonista de ApoA-I-lipido, compreendendo o referido complexo o agonista de ApoA-I e um lipido. 15 ΡΕ1019073 61. Composição farmacêutica da Reivindicação 60, em que o complexo agonista de ApoA-I-lípido está na forma de um pó liofilizado. 62. Utilização de um agonista de ApoA-I da Reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para tratamento de um sujeito sofrendo de um distúrbio associado a dislipidemia. 63. Utilização da Reivindicação 62, em que o medicamento está na forma de uma composição farmacêutica, compreendendo a referida composição o agonista de ApoA-I e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. 64. Utilização da Reivindicação 62, em que o agonista de ApoA-I está na forma de um complexo agonista de ApoA-I-lípido, compreendendo o referido complexo o agonista de ApoA-I e um lipido. 65. Utilização da Reivindicação 62, em que o distúrbio associado a dislipidemia é hipercolesterolemia. 66. Utilização da Reivindicação 62, em que o distúrbio associado a dislipidemia é doença cardiovascular. 67. Utilização da Reivindicação 62, em que o distúrbio associado a dislipidemia é aterosclerose. 16 ΡΕ1019073 68. Utilização da Reivindicação 62, em que o distúrbio associado a dislipidemia é restenose. 69. Utilização da Reivindicação 62, em que o distúrbio associado a dislipidemia é deficiência de HDL ou de ApoA-I. 70. Utilização da Reivindicação 62, em que o distúrbio associado a dislipidemia é hipertriqliceridemia. 71. Utilização da Reivindicação 62, em que o distúrbio associado a dislipidemia é uma síndroma metabólica . 72. Utilização de um agonista de ApoA-I da Reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para tratamento de um sujeito sofrendo de choque séptico. 73. Utilização da Reivindicação 62 ou 72, em que o sujeito é um humano. 74. Utilização da Reivindicação 62 ou 72, em que são administrados ao referido sujeito de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de agonista de ApoA-I. Lisboa, 9 de Abril de 2008 PE1019073 1/21 HÉLICE a ANFÍPÃTICA HÉLICE a AN FIP ATIÇA HÉLICE a ANFlPÃTfCA * Q o 0 H 1 i d o o ΡΕ1019073 2/21 PE1019073 3/21 FACE HÍDRÓFUA CENTRADA FACE HIDRÓFILA CENTRADA 22-MERO DE CONSENSO 22-MERO DE CONSENSO ΡΕ1019073 4/21 ca o Ll_ S Q S £je Uio Ou.•o KQ £ Uio s <C O Lt_ PE1019073 5/21 RODA HELICOIDAL ΡΕ1019073 6/21 Ν PE1019073 7/21 •m ΡΕ1019073 8/21 ΡΕ1019073 9/21 FIG. 7D PE1019073 10/21 TRANSfÇQES QUÍMICAS DQ ALFA-H1DROGEMO ÍSÍ íN «Sí O ÍNf <3* i£» U“> *3* *?* *?»> O ess m r** ws m *#· **r> #St ΡΕ1019073 11/21 íQD § PO I ο hj α La** (uidd) f>H®7 PE1019073 12/21 HÉLfCE a ANFIPÂTÍCA PE1019073 13/21 ABSORVÂNCIA (280 nm} FIG. 9A VOLUME DE EWiÇÃQ (mí) PE1019073 14/21 ABSORVÃNÇIA (2ΒΏ nm) VOLUME DE RETENÇÃO (M) PE1019073 15/21 P:IP=1;5 ABSORVÃNCíA (280 nmi PE1019073 16/21 P::IP=I:3 ABSORVANCIA (280 nm) PE1019073 17/21 ABSORVÂNCÍA 4.000 2.000 Ο se EX 'Ur- PE1019073 18/21 RVÃNCIA {280 nm) PE1019073 19/21 10 mg m PÊPTÍDO 4/DPPO ΡΕ1019073 20/21 PE1019073 21/21 COMPLEXO DISCOIDAL PEPTIDO-FOSFOUPÍDO

1 ΡΕ1019073 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição US 4375110 A US 4318397 A US 4816587 A US 5535089 A US 4948778 A US 9820327 W WQ 09949095 A WO 9413819 A WO 96045 ÍS A US4S4398SA WQ 9325591A EF 45S651S82 A: CA97394S5 WOMHS51A US 4215051 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição BABtKGN « ai. OKS^Sll, 1992. vol. SÊ, 36-94 BROWN; GOLOSTS». The PitanwíCdoçicsIBas® O? ThsrapsLílícs. Pargamon Press, 1990.. 874-896 PARRA et al. Arfeíãstíer. Ttesrsfc, 1932, vai. 12. 731-797 DECOS9W et at, Bs. J. O&i irm$L 1397, m. 271 299-307 DAViQSON et ai. J. Síúí Ctmv, 1934, voi 269. 22975-22932 BÍEUICKI et at, J. Lipiú Res. 1992. vol 33, 1699-1709 ROTHSLAT et ai. J. Lip® «fiSt, 1392, vai. 33.. 1901-1037 KAWAHG et aE. Stoclm^síry, 1933, vol. 32; £025-5028 KAWANG et ai. BkKÍMtistW, 1997. VOt. 33. 9816-9825 ACTGN et al. Science, 1996, vol. 271, 518-520 XUetaf, Ipítífies., ?9&7,«5l38,5283-1238 LANDSHULZ atai, J. CSn. ím-esi. 1990, vol. 98, 984-995 RfGGTTI et ai, J. Biol. Cfistji, 1998, vcl. 271, 33545-33543 FiELDiNG; FIELD1NG. J. Lipid Res.. 1995, vol. 39. 211-228 BARRAMS eíai, Siotísm. BfWtys. Aeia., 1S9S, vol. •3G0, 73-85 HtRANG «t ai, Attsrtoscter. Tfmré. Vssc. SM, 1997, vol. 17 ίβ), 1953-1059 Physisiasss Desh Refsreince. ttodfcsi Ecoiioraiss Ca, Enc. 1997 GORDOKRÍFKiHD. N. Er,g. J. Msá., 1988, vol. 3211311-1316 GQRDON et al. Cir&iiãtm, 1389, vol. 79, 6-15 WLLER. AfíW. Hmi, 1987, vol. 113, 539-597 CHEIMG et al. LipkiRes.., 1S91, vol. 32, 383-39« FRUCHART; AELHÂUD. Cfírí. Oim.t 19S2.VC138, 79 KOÍZIMi et ai J: Ufikf Res., 1903, 29, 1405-1415 BADiWON et ai Laa. jwvast, 1989, vol. 60,45S-4S1 BADEMON e! al. J. CM. Invest, 1990, vei 85, 1234-1241 BEI7Z et ai. Pmsisglsmins, Leuhoitistiss shS ts-S£í?íí3í FsÊjfAdâs, 1992, vol. 47,149-152 MEZOOIJR et al. Atoemtíerctòs, 1995. vcE. 11¾ 237-246 RU85H et af. Natm 1891, vd. 353,265-267 PASZ7Y et al. J. Oto. tossi, 1994, vd. 94,39S-303 PLUMP et af. Pmc. Nati Acad. Sei. USA, 1394,vct 91,9507-9611 LIU et at. 1 LIW fies, 18S4. vol. 35. 2263-22156 DUVERGER, CmMon, 1998, vol. §4, 713-71? DUVERGER et el. Aftartescfer. Ttmrtd. Vase. SM, 19:*.vd 16.1424-1420 BURKEY et aí. Ofcidaím, 1582, vcl. W, M72 BURKEY et ai J. itpkt fies., 1995, vei 36. 1463-1473 SCHULTZ aí a*. Natais. 1993, vol. 365, 7S2-7S4 FRANC08E et at. J. Citm. inmsL 1995, vcl. §6. 1440-1448 2 ΡΕ1019073 * BERARD et aí. mm Medicine, 18S7, voí. 3 (7), 744-749 * FGURNIER «t af. J SSs.. 19§6, vai. 3?« 1704-1711 * DfisgStatiisUpdsÊa Aiheicstierosis, 1907, «s.

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