PL197666B1 - Szczepionka anty-HIV-1, sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT, sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, zestaw do diagnozowania zakażenia HIV i sposób wytwarzania wariantu TAT - Google Patents

Abstract

1. Szczepionka anty-HIV-1, znamienna tym, ze zawiera co najmniej jedno bia lko TAT HIV-1, obejmuj a- ce pomi edzy 99 a 106 aminokwasów, zdolne do wi azania si e z celem nukleotydowym nazywanym TAR (region wra zliwy na transaktywacj e) zlokalizowanym na ko ncu 5' mRNA HIV-1 i niezdolny do transaktywacji LTR HIV-1, w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym no snikiem. 10. Sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwcia l anty-TAT zdolnych do rozpoznawania kilku warian- tów TAT, znamienny tym, ze immunizuje si e zwierz eta za wyj atkiem cz lowieka poprzez wstrzykiwanie bia lka TAT odpowiadaj acego wariantowi Oyi w po laczeniu z adiuwantem odpowiedzi immunologicznej i oczyszcza si e specy- ficzne przeciwcia la zawarte w surowicy immunizowanych zwierz at. 12. Sposób wykrywania obecno sci bia lka TAT w próbce biologicznej, znamienny tym, ze kontaktuje si e próbk e biologiczn a z przeciwcia lami anty-TAT zdolnymi do tworzenia kompleksów antygen-przeciwcia lo z kilkoma wariantami TAT, uzyskanymi sposobem okre slonym w zastrz. 10 i stwierdza si e obecno sc kompleksów antygen- -przeciwcia lo. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka anty-HIV-1, sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT, sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, zestaw do diagnozowania zakażenia HIV i sposób wytwarzania wariantu TAT.

Zgodnie z wynalazkiem wykorzystano białko regulacyjne ludzkiego wirusa nabytego braku odporności (HIV), białko Tat, jako szczepionkę przeciwko temu wirusowi, jak również do wykrywania tego białka u osób zakażonych HIV.

Tat jest białkiem wirusowym o zasadniczym znaczeniu dla ekspresji genów wirusowych i replikacji wirusa HIV-1. Gen Tat składa się z dwóch egzonów, kodujących białko o długości od 99 do 106 reszt w zależności od izolatów. Aktywność Tat w postaciach o 86 resztach, po delecji części od strony C-końcowej, została już jednak opisana. Te pochodne Tat o 86 resztach uważa się za artefakty laboratoryjne lub dawne formy, nie istniejące już w stanie naturalnym. Białko to umożliwia aktywację genów HIV-1 dzięki przyłączaniu się do celu nukleotydowego, zwanego TAR, umiejscowionego na końcu 5' mRNA HIV-1. Wydzielane jest przez komórki zakażone HIV i jest niezbędne do skutecznej odwrotnej transkrypcji HIV-1. Po wyjściu na zewnątrz komórki białko to jest zdolne do aktywowania odległych komórek zakażonych i do spowodowania zaburzeń odporności w niezakażonych limfocytach T. Ponadto bierze ono bezpośredni udział w procesach patologicznych związanych z AIDS, takich jak mięsak Kaposiego.

Pomimo że, opracowanie szczepionki przeciwko AIDS jest bardzo oczekiwane na całym świecie, napotyka ono jednak na dwie zasadnicze trudności. Pierwsza z nich związana jest ze skrajną zmiennością białka otoczki GP120. Druga spowodowana jest tym, że przeciwciała anty-GP120 wydają się zaostrzać przebieg choroby u pewnych chorych z AIDS. Jednakże wyniki wstępne wskazują, że możliwe byłoby uzyskanie działania ochronnego poprzez zastosowanie przeciwciał anty-GP120 u osób uprzednio nie zakaż onych. Firma Roche rozpoczęła badania kliniczne fazy II w Stanach Zjednoczonych szczepionki anty-GP120. Grupy chorych dobrane do tych badań fazy II są ściśle kontrolowane pod względem lekarskim. Trudno będzie jednak uzyskać taki sam nadzór lekarski po wprowadzeniu szczepionki na rynek.

Przy zastosowaniu GP120 we krwi chorych zakażonych HIV-1 wykrywa się Tat. Tat coraz silniej blokuje czynność makrofagów i limfocytów T cytotoksycznych (CTL) mających za zadanie usuwanie komórek zakażonych przez wirus, działa zatem immunosupresyjnie. Przeciwciała przeciwko Tat (lub związki czynne ukierunkowane na Tat) powinny umożliwić przywrócenie aktywności CTL i makrofagów.

Tat jest zatem uprzywilejowanym miejscem docelowym zarówno do wytwarzania środków przeciwwirusowych, jak i do wytwarzania szczepionek.

Białko Tat było już zatem przedmiotem doświadczeń. W szczególności, badania przedkliniczne, uzyskane przy zastosowaniu rekombinacyjnego, nieczynnego biologicznie białka Tat (toksoidu Tat) wykazały, że toksoid Tat powoduje u chorych seronegatywnych długotrwałe wytwarzanie dużych ilości przeciwciał przeciwko Tat (Le Buanec i wsp., 1998). U chorych seropozytywnych i z zaburzeniami odporności stwierdza się znamienne podwyższenie poziomu przeciwciał anty-Tat w stosunku do prawidłowego poziomu przeciwciał anty-Tat (Westendorp i wsp., 1995).

Ten toksoid Tat jest białkiem rekombinacyjnym, któremu nieaktywność biologiczną nadaje karboksymetylacja reszt cysteinowych Tat. Autorom udało się wytworzyć również Tat karboksymetylowane (Tat Bru cmC), zaobserwowali także utratę, aktywności transaktywacji, podczas gdy ten sam wariant Tat z wolnymi resztami cysteinowymi (Tat Bru fC) jest zdolny do transaktywacji. Tat Bru cmC jest zdolny do umocowywania się na TAR z powinowactwem porównywalnym z Tat Bru fC.

Główną przeszkodą w powszechnym wykorzystaniu karboksymetylowego Tat jako szczepionki jest to, że chemiczna modyfikacja reszt cysteinowych powoduje zmiany konformacji, które twórcy wynalazku zaobserwowali poprzez dichroizm kołowy i NMR. Jakkolwiek istnieją zmiany konformacji między różnymi wariantami Tat, karboksymetylacja reszt cysteinowych powoduje istotne zmiany w pofałdowaniu łańcucha peptydowego Tat, który, z tego powodu nie nadaje się do wytwarzania szczepionki przeciwko Tat.

W związku z tym zalecane jest stosowanie do wytwarzania szczepionki przeciwko HIV-1 defektywnego białka Tat HIV-1, jednak o strukturze podobnej do Tat funkcjonalnych. To Tat mogłoby w istocie mieć strukturę trójwymiarową najbardziej zbliżoną do naturalnych Tat, tak aby było zdolne do powodowania reakcji immunologicznej podobnej do reakcji wywoływanej przez Tat naturalne, nie byłoby jednak zdolne do transaktywacji, to znaczy, jak to wskazano uprzednio, byłoby niezdolne do aktywowaPL 197 666 B1 nia odległych komórek zakażonych i wywoływania niedoboru odporności niezakażonych limfocytów T. Istotnie, zahamowanie tego niedoboru odporności ma znaczenie kluczowe.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka anty-HIV-1, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej jedno białko TAT HIV-1, obejmujące pomiędzy 99 a 106 aminokwasów, zdolne do wiązania się z celem nukleotydowym nazywanym TAR (region wrażliwy na transaktywację) zlokalizowanym na końcu 5' mRNA HIV-1 i niezdolny do transaktywacji LTR HIV-1, w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa białka TAT zawiera co najmniej jedną mutację w porównaniu z sekwencją nukleotydową funkcjonalnego białka TAT, które zdolne jest do wiązania się z TAR i transaktywacji LTR HIV-1.

Korzystniej mutacja dotyczy co najmniej jednej z cystein białka TAT.

Korzystnie białko TAT stanowi białko TAT wariantu Oyi HIV-1.

Korzystnie białko TAT stanowi syntetyczne białko TAT.

Korzystniej białko TAT stanowi białko TAT wytworzone drogą syntezy na fazie stałej.

Korzystnie białko TAT stanowi rekombinowane białko TAT.

Korzystnie zawiera wektor ekspresyjny obejmujący sekwencję nukleotydową dla TAT oraz elementy niezbędne do jej ekspresji.

Korzystnie region Arg-Gly-Asp zlokalizowany na końcu C białka TAT jest zmodyfikowany.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT zdolnych do rozpoznawania kilku wariantów TAT, polegający na tym, że immunizuje się zwierzęta za wyjątkiem człowieka poprzez wstrzykiwanie białka TAT odpowiadającego wariantowi Oyi w połączeniu z adiuwantem odpowiedzi immunologicznej i oczyszcza się specyficzne przeciwciała zawarte w surowicy immunizowanych zwierząt.

Korzystnie jako białko TAT do immunizacji stosuje się syntetyczne białko TAT.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, polegający na tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną z przeciwciałami anty-TAT zdolnymi do tworzenia kompleksów antygen-przeciwciało z kilkoma wariantami TAT, uzyskanymi sposobem określonym powyżej i stwierdza się obecność kompleksów antygen-przeciwciało.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do diagnozowania zakażenia HIV przez oznaczanie obecności białka TAT w próbce biologicznej, charakteryzujący się tym, że obejmuje odczynniki do wytwarzania odpowiedniego środowiska do reakcji immunologicznej obejmującej przeciwciała poliklonalne wytworzone sposobem powyżej; odczynniki pozwalające na detekcję kompleksów antygen-przeciwciało wytworzonych podczas reakcji immunologicznej; ewentualnie referencyjną próbkę biologiczną bez antygenu (kontrola negatywna); ewentualnie referencyjną próbkę biologiczną z określoną ilością antygenu (kontrola pozytywna).

Korzystnie odczynniki do wytwarzania odpowiedniego środowiska do reakcji immunologicznej obejmują przeciwciała określone powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania wariantu TAT określonego powyżej, polegający na tym, że stosuje się grupy zabezpieczające typu FMOC, korzystnie typu fastFMOC.

Szczepionka anty-HIV-1 według wynalazku zawiera co najmniej jedno białko Tat HIV-1, zdolne do wiązania się z TAR i niezdolne do transaktywacji, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, lub ewentualnie z jednym lub kilkoma adiuwantami immunologicznymi. To białko Tat powinno być zdolne do wywołania u zwierzęcia, któremu je podano, wytwarzania przeciwciał zdolnych do rozpoznawania innych wariantów tego białka w ilości wystarczającej do zahamowania transaktywacji tych wariantów.

Do wytwarzania szczepionki według wynalazku można wykorzystywać białko Tat, albo jego jedną lub kilka części białka, zdolne do spełniania wskazanych funkcji białka Tat. Powyższa szczepionka może również zawierać połączenie różnych białek Tat lub też części różnych białek Tat.

W zalecanym wykonaniu biał ko Tat stosuje się w całoś ci, i zawiera ono dogodnie od 99 do 106 aminokwasów, dogodniej, 101 aminokwasów.

Pojęcie „część białka Tat” w rozumieniu niniejszego opisu oznacza każdy fragment lub połączenie fragmentów jednego lub kilku białek Tat, należących, lub nie, do tego samego wariantu, dostatecznie immunogennych do spowodowania wytwarzania przeciwciał. Dogodnie, fragment ten zawiera 15 - 30 aminokwasów, zwłaszcza, od 18 do 25 aminokwasów.

Białko Tat do zastosowania w szczepionce według wynalazku powinno zatem różnić się od funkcjonalnych białek Tat, zwanych „naturalnymi”, to znaczy wyciągów z różnych szczepów HIV-1, obecnych w stanie naturalnym, w taki sposób, że jest niezdolne do transaktywacji, przy czym jednocześnie

PL 197 666 B1 wiąże się z TAR. Dlatego też Tat stosowane w szczepionce według wynalazku mają sekwencję nukleotydową z co najmniej jedną mutacją w stosunku do sekwencji nukleotydowej Tat funkcjonalnego. Mutacja ta, zwykle punktowa, może na przykład powodować delecje, insercje lub substytucje jednego lub kilku aminokwasów.

Twórcy wynalazku w ramach swych prac zbadali najpierw wariant Tat, odpowiadający izolatowi Bru (86 reszt), po czym zsyntetyzowali pięć innych wariantów, reprezentujących zmienność strukturalną, obserwowaną w przypadku tego białka (Gregoire i Loret, 1996): Tat Z2 (86 reszt), Tat Mal (87 reszt), Tat Eli (99 reszt), Tat Oyi (101 reszt) i Tat Jr (101 reszt). W ten sposób ustalono 6 grup strukturalnych, w zależności od wielkości białka i rodzaju mutacji, spośród wszystkich izolatów HIV-1. Prawdopodobnie wszystkie te warianty mają aktywność farmakologiczną podobną do Tat Bru, które zsyntetyzowano dwukrotnie, z karboksymetylowymi resztami cysteinowymi (Tat Bru cmC) i następnie z wolnymi resztami cysteinowymi (Tat Bru fC). Zastosowano procesy chemiczne typu fastFmoc z aktywatorem HBTU. Oczyszczenia białek dokonano przez wysokosprawną chromatografię cieczową. Okazało się, że wszystkie te białka syntetyczne są zdolne do wiązania się z TAR, stwierdzono jednak znaczne różnice w wynikach badania transaktywacji na komórce HeLa. Najbardziej nieoczekiwanym wynikiem było to, że nie stwierdzano transaktywacji przy wariancie Tat Oyi. Nie obserwowano też transaktywacji w przypadku pochodnej Tat Bru, zawierającej karboksymetylowane reszty cysteinowe. Badanie techniką dichroizmu kołowego (CD) w fazie wodnej tych białek syntetycznych wykazało, że modyfikacja chemiczna Tat Bru cmC istotnie zmieniła strukturę Tat Bru. Tat Oyi, przeciwnie, ma strukturę podobną do innych, o czym świadczy jego widmo CD.

W 1988 u chorej z Gabonu (dokładniej, u kobiety ciężarnej) zidentyfikowano szczep HIV-1 Oyi (Huet i wsp., 1989). Chora ta, mimo że seropozytywna od kilku lat, cieszyła się doskonałym zdrowiem. Najwyraźniej fakt posiadania defektywnego białka Tat w tym szczepie HIV-1 zapobiegł rozwojowi zakażenia w kierunku AIDS u tej chorej i nadał jej odporność przeciwko wirusowi powodującemu AIDS. Istotnie, badania epidemiologiczne, przeprowadzone w terenie, wykazały, że u chorych zakażonych HIV-1 Oyi przez długi czas nie dochodzi do rozwoju choroby.

Szczep HIV Oyi należy do podtypu B i odpowiada szczepom HIV-1 najbardziej rozpowszechnionym w Europie i Ameryce Północnej. Kobieta z Gabonu, u której wykryto szczep HIV Oyi, należała do grupy 31 osób w rolniczej prowincji Haut Ogooue na południowym wschodzie Gabonu, u których go wykryto. Grupę te zidentyfikowano w 1986 r. W trakcie analizy seroepidemiologicznej, przeprowadzonej u około 2000 zakażonych osób w całym Gabonie. Ta grupa z Haut Ogooue przyciągnęła uwagę, ponieważ stan zdrowia osób zakażonych był dobry, a ich profil Western blot był zupełnie nietypowy. Nie można było mianowicie wykryć u tych osób obecności przeciwciał przeciwko gp 120, gp 160 i gp 41, stwierdzono natomiast obecność przeciwciał anty gag i pol (Huet i wsp., 1989).

Następnie przeprowadzono badania na grupie 750 kobiet ciężarnych, pochodzących z tej samej prowincji Haut Ogooue, stwierdzając, że 25 z nich (czyli 3,3%) było HIV-dodatnich w teście ELISA. Spośród tych 25 kobiet u 23 profil Western blot był atypowy, charakterystyczny dla tego regionu (zob. niżej). Około dziesięciu kobiet obserwowano przez 2 lata, w tym kobiety, u których wykrywano szczep HIV-1 Oyi. W tym czasie atypowy profil serologiczny pozostawał stały z wyłączeniem możliwości niedawnego zakażenia, nie pozostawiającego czasu na wytworzenie przeciwciał anty-gp 120. Obecność zakażenia HIV-2 była wykluczona, ponieważ nie stwierdzano reakcji na gag HIV-2, i w Gabonie odnotowano jedynie dwa przypadki zakażenia HIV-2, w regionie nadmorskim. Wszyscy obserwowani chorzy pozostawali w dobrym zdrowiu, bez ubytku masy ciała, i nie występowały u nich zakażenia oportunistyczne przez 2 lata trwania badania (Huet i wsp., 1989).

Kobieta, u której stwierdzono Oyi, pochodziła z regionu wiejskiego, była w dobrym stanie zdrowia i była seronegatywna w odniesieniu do HTLV-1 i HIV-2. Jednoczesna hodowla limfocytów z PPMC pozwoliła wykryć aktywność RT zaledwie po 15 dniach, co jest bardzo nietypowe. Wirus wykazywał również niemal niewykrywalną aktywność cytopatyczną. Jakkolwiek nadsącz hodowli umożliwiał zakażenie PBMC, replikacja nie była praktycznie możliwa na prawidłowych liniach limfocytarnych, takich jak H-9 i CEM, ani na monocytach U-937. Przy potwierdzaniu tej analizy podobne wyniki obserwowano u 17 chorych z tego samego regionu, co potwierdza nieobecność przeciwciał anty-gp 120 we wszystkich przypadkach. Ciekawe było stwierdzenie, że prawidłowa surowica dawcy HIV-1 jest zdolna do rozpoznawania gp 120 HIV-1 Oyi (Huet i wsp., 1989). Wirus HIV-1 Oyi poddano zatem klonowaniu i sekwencjonowanie nie ujawniło żadnych nieprawidłowości z wyjątkiem genu Tat (Huet i wsp., 1989).

Przyczyną utraty zdolności do transaktywacji wydaje się mutacja Cys 22 do Ser; odwrócenie tej mutacji wydaje się odtwarzać aktywność Tat.

PL 197 666 B1

Stwierdzono ponadto, że w nieobecności Tat reprodukcja wirusa jest możliwa, lecz na niskim poziomie. Istnieje zatem ścisły związek między zjadliwością HIV a skutecznością transaktywacji Tat. To badanie epidemiologiczne wykazuje raz jeszcze istnienie ścisłego związku między umieralnością na tę chorobę a poziomem replikacji HIV. Tat umożliwia zatem HIV, jak się wydaje, osiągniecie poziomu replikacji przekształcającego to zakażenie wirusowe w śmiertelną chorobę.

Ponadto to badanie nietypowych chorych z regionu Haut Ogooue ujawniło działanie ochronne, jakie wydają się zapewniać defektywne szczepy HIV w stosunku do zwykłych szczepów HIV. Istotnie, analizy PGR limfocytów świeżo pobranych od kilku nietypowych chorych ujawniły obecność zwykłych szczepów HIV. Mechanizm działania ochronnego nie obejmuje udziału przeciwciał anty gp 120, nieobecnych u tych chorych. Działanie limfocytów T cytotoksycznych mogłoby stanowić mechanizm umożliwiający wykorzenienie wirusa.

Badanie epidemiologiczne, względnie niedawno przeprowadzone w Gabonie (Delaporte i wsp., 1996) wykazało niewielki odsetek osób zakażonych HIV (2 - 3%) w porównaniu z innymi krajami afrykańskimi. Wydaje się, że podtyp Oyi całkowicie zanikł w populacji, a kobieta gabońska, u której wykryto szczep HIV-1 Oyi pozostawała w 1995 r. w doskonałym zdrowiu i od czasu pierwszego badania urodziła troje seronegatywnych dzieci. Nie wykrywano już u niej wirusa HIV-1 Oyi.

Białko Tat wariantu HIV-1 Oyi wydaje się zatem najlepiej nadawać na składnik szczepionki przeciwko HIV-1. Jednakże nieaktywne Tat nie zawsze jest immunogenne. Cała trudność w wytworzeniu szczepionki polega na spowodowaniu wytwarzania przeciwciał, w danym przypadku, przeciwciał czynnych także w stosunku do innych wariantów Tat. Twórcom wynalazku udało się nieoczekiwanie tego dokonać. Szczepionka według wynalazku może zawierać zatem, w zalecanym wykonaniu, Tat, w całości lub w części, wariantu HIV-1 Oyi.

Szczepionka przeciwko Tat jest dogodna pod kilkoma względami. U chorych bezobjawowych można opóźnić postęp w kierunku AIDS, zmniejszając niedobory odporności. Taka szczepionka powinna umożliwić choremu zachowanie skutecznej odporności przeciw wirusowi, tak jak (prawdopodobnie) na początku zakażenia. W szczególności odtworzenie aktywności limfocytów T cytotoksycznych (CTL) i makrofagów, które nie są zakażone HIV, lecz których aktywność jest zahamowana przez Tat, mogłoby w konsekwencji spowodować brak postępu choroby.

U chorych z rozwiniętym AIDS szczepionka przeciwko Tat mogłaby zmniejszyć częstość występowania pewnych chorób i zaburzeń, takich jak mięsak Kaposiego lub zespoły neurologiczne, które wydają się mieć związek z bezpośrednim działaniem białka Tat po ich wydzieleniu przez komórki zakażone HIV.

Możliwość dogodnego zastosowania wariantu HIV-1 Oyi zgodnie z wynalazkiem została ponadto potwierdzona doświadczeniami Western blot (zdjęcia żelu nie zostały dołączone do niniejszego opisu) i testem ELISA, przeprowadzonymi przez twórców wynalazku w celu stwierdzenia, czy istnieje reaktywność krzyżowa między różnymi wariantami Tat.

Istotnie, w tych dwóch typach doświadczeń badano reakcje trzech różnych surowic przeciwko Tat na siedem wariantów Tat.

Twórcy wynalazku uodpornili króliki Tat Oyi, Tat Bru cmC i Tat Eli według klasycznego sposobu immunizacji z zastosowaniem adiuwanta Freunda. Surowice poliklonalne, uzyskane po 53 dniach, analizowano techniką Western blot i testem ELISA. Otrzymano miana, odpowiednio, 700, 11 i 660 pM dla przeciwciał anty-Oyi, Bru cmC i Eli.

W warunkach denaturujących doświadczenia Western blot wykazały, że surowica anty-Tat Oyi i surowica anty-Tat Eli są niezdolne do wykazania immunogenności krzyżowej z wszystkimi wariantami, jak surowica anty-Tat Bru cmC.

Tat Bru cmC jest wariantem, w którym reszty cysteinowe są karboksymetylowane. Ta chemiczna modyfikacja reszt cysteinowych powoduje nie tylko utratę aktywności transaktywacji (Peloponese i wsp., 1999), lecz również utratę struktury trójwymiarowej tego wariantu, przekształ cają cego się w kłębek statystyczny (wynik niepublikowany). Nie jest zatem dziwne, że stwierdzono, iż surowica anty-Tat Bru cmC jest zdolna do rozpoznawania wszystkich wariantów w stanie denaturacji.

W warunkach niedenaturują cych test ELISA (fig. 7) wykazuje, ż e surowica anty-Tat Oyi jest zdolna do rozpoznawania wszystkich wariantów podobnie, jak surowica anty-Tat Bru cmC. Przeciwnie, surowica anty-Tat Eli jest zawsze niezdolna do rozpoznawania wszystkich wariantów. Wydaje się zatem, że istnieją epitopy trójwymiarowe, zachowane w licznych wariantach Tat. Jednakże jedynie szczególny charakter immunogenny Tat Oyi pozwala wytwarzać te przeciwciała w dużej ilości. Istnieje zatem duże prawdopodobieństwo, że aż do tej pory obecność Tat u chorych była niedoszacowana.

PL 197 666 B1

Rozcieńczenie trzech surowic wynosiło 1/1000. W tym samym doświadczeniu, bez rozcieńczenia, surowica anty-Tat Eli może również rozpoznawać wszystkie inne warianty Tat. Co ciekawe, stwierdzono, że acetylacja reszty lizynowej 50 Tat Bru (Tat Bru K50) umożliwia rozpoznawanie przez surowicę anty-Tat Eli w niskim stężeniu.

Te doświadczenia, przeprowadzone z trzema surowicami poliklonalnymi na królikach, potwierdzają zatem korzystne cechy Tat Oyi w roli szczepionki. Ponadto surowica anty-Tat Oyi jest zdolna do hamowania transaktywacji na komórkach HeLa z Tat Bru lub Tat Eli. Surowica anty-Tat Eli, stosowana jako kontrola, wykazała, że wytwarzanie przeciwciał z jednego wariantu, nawet aktywnego, nie gwarantuje rozpoznawania krzyżowego wszystkich wariantów Tat, jak w przypadku Tat Oyi. Tat Oyi, który jest wariantem o dużej długości (101 reszt), umożliwia lepsze rozpoznawanie wariantów Tat w porównaniu z Tat Bru cmC, który jest wariantem o małej długości (86 reszt). Szczepy HIV-1 z wariantami Tat o małej długości praktycznie zanikły i wydaje się, że stanowiły artefakt laboratoryjny (Jeang i wsp., 1999). Ponadto surowica anty-Tat Oyi wykazuje dużą swoistość, ponieważ nie rozpoznaje postaci zdenaturowanych (czyli epitopów liniowych) wariantów Tat. Przeciwnie, nie do pominięcia jest ryzyko, że surowica anty-Tat Bru cmC spowoduje wytwarzanie przeciwciał autoimmunologicznych u człowieka, z uwagi na dużą różnorodność strukturalną Tat Bru cmC. Twórcy wynalazku istotnie zaobserwowali, że w surowicy anty-Tat Bru cmC znajdują się przeciwciała zdolne do rozpoznawania albuminy ludzkiej (dane nie ukazane).

Zachowanie trójwymiarowej struktury co najmniej jednego epitopu Tat ma zatem zasadnicze znaczenie dla rozpoznawania innych wariantów Tat przez trójwymiarowe przeciwciała anty-Tat.

Twórcy wynalazku wykazali zresztą również, że przeciwciała anty-Tat są zdolne do hamowania transaktywacji białek Tat Eli.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano również sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-Tat, zdolnych do rozpoznawania kilku wariantów Tat. Należy podkreślić, że przeciwciała te można zatem stosować do wykrywania u osób narażonych na zakażenie HIV obecności białka Tat we krwi, niezależnie od wariantu HIV.

Sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-Tat według wynalazku, zdolnych do rozpoznawania kilku wariantów Tat, może obejmować:

- immunizację zwierzęcia, za wyjątkiem człowieka, za pomocą białka Tat lub części tego białka Tat, w połączeniu z adiuwantem reakcji immunologicznej

- oczyszczenie swoistych przeciwciał, zawartych w surowicy immunizowanych zwierząt.

Immunizacji zwierzęcia można dokonać stosując dowolny sposób wprowadzenia białka Tat lub części tego białka Tat do organizmu zwierzęcia, na przykład: wstrzyknięcie, inhalacje, podanie doustne, podanie podskórne, śródskórne, dootrzewnowe, dożylne lub domięśniowe.

Immunizację zwierzęcia można również przeprowadzić za pomocą ekspresji in vivo i in situ wektora zawierającego nie tylko sekwencję białka Tat w całości lub w części, lecz również cały system niezbędny do ekspresji białka Tat, sposobami znanymi specjalistom.

Oczyszczenie swoistych przeciwciał, znajdujących się w surowicy immunizowanych zwierząt, można na przykład przeprowadzić na kolumnie powinowactwa, na której uprzednio osadza się białko lub część białka, stanowiącego antygen.

W zalecanym wykonaniu białko Tat lub cześć białka Tat, stosowane w etapie immunizacji według powyższego sposobu, może odpowiadać wariantowi Oyi lub wariantowi Bru cmC.

W innym wykonaniu powyższe białko stanowi białko syntetyzowane chemicznie.

Pozycja siedmiu reszt cysteinowych (region 22-37) wykazuje dużą zachowawczość wśród wszystkich wariantów Tat, a znaczenie 6 z tych reszt cysteinowych dla transaktywacji szeroko opisano w piśmiennictwie (Jeang, 1996).

W związku z tym można przewidywać mutacje wariantu Tat na co najmniej jednej z tych reszt cysteinowych, tak aby wariant stał się niezdolny do transaktywacji, zachowując dogodne właściwości według wynalazku. Mutacja ta może na przykład obejmować substytucje reszty cysteinowej inną resztę aminokwasową, taką jak seryna lub alanina.

Twórcy wynalazku, poprzez oznaczenie struktury trzeciorzędowej Tat Bru w heteronuklearnym NMR, zidentyfikowali ponadto region docelowy, który musi być zachowany w wariantach Tat. Cel ten tworzy się częściowo z regionu N-końcowego i regionu zasadowego sekwencji Tat.

Struktura trójwymiarowa wariantu Tat Bru wykazuje, że region bogaty w reszty cysteinowe jest bliski przestrzeni trójwymiarowej regionu N-końcowego i regionu zasadowego. Wskazuje to, że karboksymetylacja reszt cysteinowych zmienia prawdopodobnie strukturę tego celu i potwierdza to,

PL 197 666 B1 że tak zmodyfikowanego Tat nie można uważać za białko potencjalnie nadające się do wytwarzania szczepionki anty-HIV.

Twórcy wynalazku przeprowadzili ponadto syntezę chemiczną w fazie stałej różnych białek Tat. Według obecnego stanu wiedzy to wykonanie jest zalecane z uwagi na zmniejszenie kosztów produkcji, lepszą wydajność w stosunku do Tat wytwarzanego metodami biologii molekularnej i brak zanieczyszczeń.

I tak, według zalecanego wykonania, Tat do zastosowania do wytwarzania szczepionek, wytwarza się sposobem według wynalazku poprzez syntezę chemiczną, dokładniej, poprzez syntezę chemiczną w fazie stałej, na przykład syntezę typu FMOC, korzystnie, FastFMOC.

Jednakże Tat stosowany do wytwarzania szczepionki według niniejszego wynalazku można również wytwarzać zupełnie innym sposobem, na przykład z zastosowaniem technik rekombinacyjnych, znanych specjalistom. Te systemy klonowania i ekspresji mogą obejmować zastosowanie drobnoustrojów, takich jak Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces i Saccharomyces, lecz również komórek drożdży, owadów i ssaków. Przewiduje się również systemy ekspresji pochodzące z bakulowirusa. Oczywiście, wektory zawierające sekwencję białkową Tat w całości lub części mogą zawierać cały niezbędny do tego system ekspresji, zgodnie z wiedzą specjalistów.

Ponadto w celu uniknięcia potencjalnego ryzyka toksycznego wpływu pasażu białka Tat, zwłaszcza Tat Oyi, na błony, korzystna jest modyfikacja sekwencji Arg-Gly-Asp, obecnej na końcu C sekwencji wszystkich wariantów Tat. Sekwencja ta ma w istocie zasadnicze znaczenie dla przechodzenia przez błony komórkowe, ponieważ rozpoznaje ona receptor błonowy na powierzchni komórek (Jeang, 1996). Bardziej szczegółowo, modyfikacja ta mogłaby obejmować substytucje tej sekwencji przez sekwencje Lys-Ala-Glu, co nie miałoby wpływu na strukturę, lub ewentualnie przez sekwencję Ala-Ala-Ala.

Jak to wspomniano powyżej, bardzo możliwe jest, że dotąd niedoszacowywano liczbę osób zakażonych HIV, ponieważ nie było możliwości wykrycia u nich, na przykład we krwi, obecności białka Tat. Zgodnie z wynalazkiem zapewniono sposoby wykrywania jak największej liczby wariantów Tat za pomocą ograniczonej liczby przeciwciał.

Sposób wykrywania obecności białka Tat lub części białka Tat w próbce biologicznej według wynalazku może obejmować:

- kontaktowanie tej próbki z przeciwciałami anty-Tat zdolnymi do utworzenia kompleksów antygen-przeciwciało z kilkoma wariantami Tat

- oznaczanie obecności kompleksów antygen-przeciwciało.

Pojęcie „przeciwciała anty-Tat” obejmuje nie tylko całe przeciwciała, lecz również fragmenty przeciwciał lub przeciwciała chimeryczne, zdolne do spełniania zalecanej tu funkcji, to znaczy do rozpoznawania całości lub części białka Tat.

Oznaczania obecności kompleksów antygen-przeciwciało dokonuje się sposobami znanymi specjalistom. W szczególności, odczynniki umożliwiające wykrywanie tych kompleksów mogą zawierać marker lub też mogą być rozpoznawanie przez znakowany marker, szczególnie w przypadku, gdy stosowane przeciwciało nie jest znakowane.

Kontaktowania próbki biologicznej w sposobie według wynalazku z przeciwciałami anty-Tat można również dokonać z użyciem surowicy anty-Tat.

Pojęcie „próbka biologiczna” oznacza każdą próbkę płynu ustrojowego, komórek lub tkanek, pobraną od pacjenta, która może zawierać antygen zdolny do tworzenia kompleksu antygen-przeciwciało w obecności jednego lub więcej odpowiednich przeciwciał. Zalecaną próbką biologiczną jest krew.

Zestaw do rozpoznawania zakażenia HIV poprzez oznaczenie obecności białka Tat według wynalazku lub części białka Tat w próbce biologicznej, może obejmować:

- odczynniki do wytwarzania środowiska sprzyjającego reakcji immunologicznej,

- odczynniki umożliwiające wykrywanie kompleksów antygen-przeciwciało, wytworzonych w wyniku reakcji immunologicznej,

- ewentualnie, referencyjną próbkę biologiczną bez antygenu (kontrola ujemna),

- ewentualnie, referencyjną próbkę biologiczną, zawierającą z góry określoną ilość antygenu (kontrola dodatnia).

W jednym wykonaniu odczynniki do wytwarzania środowiska sprzyjającego reakcji immunologicznej mogą obejmować przeciwciała anty-Tat zdolne do wytworzenia kompleksów antygen-przeciwciało z kilkoma wariantami Tat, takie jak przykładowo anty-Tat Oyi, anty-Tat Bru cmM lub połączenie obu tych przeciwcia ł..

PL 197 666 B1

R y s u n e k

Figura 1: porównanie różnych białek Tat.

Białka Tat podzielono na 6 grup strukturalnych, wytłuszczonych na fig. 1A i podkreślonych na fig. 1B.

Figura 1A: sekwencje aminokwasowe białek Tat.

TatZ2 pochodzi z izolatu HIV-1, pokrewnego szczepom rodzicielskim wirusa (Zhu i wsp., 1998). Tat Mal i Tat Eli pochodzą ze szczepu HIV-1, izolowanego w latach 80. W Afryce Środkowej w trakcie badań nad zakażeniami heteroseksualnymi HIV (Alizon i wsp., 1986). Tat Br zawiera sekwencję najczęściej stosowaną w laboratorium i pochodzi ze szczepu izolowanego we Francji (Barre-Sinoussi i wsp., 1983), natomiast Tat Jr pochodzi z amerykań skiego izolatu HIV-1 (O'Brien i wsp., 1990). Tat Oyi jest blisko spokrewniony z Tat Jr i Tat Bru, pochodzi jednak ze szczepu HIV zidentyfikowanego od pacjenta z Gabonu (Huet i wsp., 1989).

Figura 1B: klasyfikacja białek Tat w zależności od ich wymiarów i mutacji, które zawierają, do programu MULTALIN (Corpet, 1989).

Figura 2: sekwencja białka Tat wariantu HIV-Oyi (opisanego przez Huet i wsp., 1989).

Figura 3: oczyszczanie 6 wariantów Tat w wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami z kolumną szczepioną C8 przy długości fali 280 nm (procedurę doświadczalną opisano w podrozdziale „Materiał i metody”).

W przypadku każ dej kratki ś lad dolny obrazuje wynik syntezy peptydowej przed oczyszczeniem, natomiast ślad górny obrazuje wynik syntezy po ostatnim etapie oczyszczania. Tat Bru (A), Tat Jr (B), Tat Z2 (C), Tat Oyi (D), Tat Mal (E) i Tat Eli (F) rozszczepiono z zastosowaniem żywicy z TFA. Po strąceniu eterem butylowo-metylowym białka rozpuszczono w buforze TFA w stężeniu 0,1% (ślad dolny na każdej z ramek). Dla każdego białka oczyszczenia dokonano z 2 migracjami HPLC kolejno na kolumnach Hybar Merk C8 (4,5 x 125 mm, przepływ 0,8 ml/min) półpreparacyjnych, po czym przeprowadzono analizę czystych frakcji (ślad górny na każdej ramce) i zidentyfikowano je poprzez spektrometrię masową i analizę aminokwasów (dane nieprzedstawione). W każdym przypadku okazało się, że główny szczyt HPLC odpowiada pełnej sekwencji. Szczyty między 10 a 15 min odpowiadają 50 resztom, natomiast szczyty bliskie frakcji głównej są pochodnymi z 1 - 15 delecjami od końca N. Frakcje wysoce hydrofobowe są pochodnymi o masie cząsteczkowej podwyższonej, prawdopodobnie ze względu na niecałkowite odłączenie grup zabezpieczających z łańcuchów bocznych.

Figura 4. Pomiar stałości powinowactwa syntetycznych Tat dla celu nukleotydowego TAR metodą elektroforezy (zob. testy zmiany ruchliwości elektroforetycznej w podrozdziale „Materiały i metody”).

Na szczycie każdego prążka żelu oznaczono stężenie białka (ng/μΐ). RNA wolne lub sprzężone oznaczono, odpowiednio, literami f („free” - wolne) i c („complexed” - sprzężone). Do oznaczania miana 6 białek stosuje się wytwarzanie tego samego RNA. Zbadano również pochodną Tat Bru z karboksymetylowanymi resztami cysteinowymi (Bru cmC). Stałe dysocjacji w stanie równowagi (Kd) zmierzono bezpośrednio z zastosowaniem testów zmiany ruchliwości elektroforetycznej. Wartości Kd zmieniają się z około 50 nM dla Tat Eli i Tat Mal do około 140 nM dla Tat Oyi i Tat Jr. Ponadto twórcy zauważyli, że poza zmiennością wartości Kd, profile wiązane z różnymi białkami są nieco różne. Na przykład słabe stężenie Tat Bru daje prosty kompleks o dobrej rezolucji, i dopiero przy wyższych stężeniach (>4,5 ng/μΐ) tworzą się agregaty, które nie są w stanie przenikać do żeli akrylamidowych. Przeciwnie, kompleksy multimerowe można łatwo identyfikować samym Tat Eli nawet w małym stężeniu. Można obserwować do 3 opóźnionych prążków przy zastosowaniu Tat Eli, w mniejszym stopniu przy zastosowaniu Tat Jr. Takich efektów nie obserwuje się przy zastosowaniu białek krótszych, takich jak Tat Bru i Tat Mal, na przykład, jak również Tat Oyi - białka o większej długości.

Figura 5: test transaktywacji syntetycznych białek Tat na komórce HeLa. Komórki te transfekuje się przez LTR HIV-1, z którym związany jest gen reporterowy LacZ. Ilość wytworzonego białka (β-gal jest proporcjonalna do zdolności transaktywacji i różnych syntetycznych Tat. LTR zawiera sekwencje DNA w kierunku końców 3' i 5', konieczne do transkrypcji HIV, a na początku mRNA obecny jest TAR (Clavel i Charneau, 1994). Kofaktory komórkowe, niezbędne do transaktywacji HIV, znajdują się w komórkach HeLa. Bez Tat dochodzi do podstawowej ekspresji (3-gal, zaznaczonej jako kontrola (C), Następny wykres ukazuje transaktywację, obserwowaną przy zastosowaniu różnych wariantów Tat, z zastosowaniem 2 stężeń: 1 μΜ (słupek jasnoszary) i 5 μΜ (słupek ciemnoszary). W każdym przypadku do buforu komórkowego dodano Tat, tak więc ekspresja β-gal wyższa od kontroli oznacza, że Tat syntetyczne jest zdolne do przechodzenia przez błony jądrowe i cytoplazmatyczne, do wiązanie się z Tar i do interakcji z kofaktorami komórkowymi. Jedynie Tat Bru cmC (dane nieprzedstawione) i Tat Oyi nie przebadano w tym doświadczeniu, podczas gdy łączą się one z TAR (fig. 1). Tat Mal i Tat Eli

PL 197 666 B1 przedstawiają poziom transaktywacji 3-4-krotnie wyższy, niż Tat Bru. Tat Z2, najbliższe z macierzystych białek Tat, wykazuje niski poziom transaktywacji i ewolucja mogłaby sprzyjać izolatom HIV-1 z bardziej skutecznym Tat. Podobne wyniki uzyskano w innych testach transfekcji z zastosowaniem lucyferazy, ponieważ gen reporterowy oraz Tat Mal i Tat Eli w stężeniu 1 μΜ transaktywowały LTR na poziomie porównywalnym z poziomem uzyskanym z zastosowaniem transfekowanego Tat-pCMV (dane nieprzedstawione).

W rozmaitych doświadczeniach stosowano stężenie od 0,1 μM do 10 μM (dane nieprzedstawione). W stężeniu 0,1 μM jedynie Tat Eli wykazuje poziom transaktywacji znamiennie wyższy od poziomu wyjściowego. W stężeniu 10 μM, 6 Tat wykazują poziom transaktywacji na tyle podwyższony, że nie można zaobserwować różnic między nimi w odniesieniu do nasycenia.

Figura 6: widma dichroizmu wariantów Tat Z2 (białe trójkąty), Tat Oyi (czarne trójkąty), Tat Bru (białe kółka), Tat Bru cmC (bez oznaczenia), Tat Jr (czarne kółka), Tat Mal (białe kwadraty) i Tat Eli (czarne kwadraty).

Widma mierzono w buforze fosforanowym w stężeniu 20 μM i pH 4,5, rejestrowano je przy długości fali od 260 do 178 nm przy drodze optycznej 50 μm. Różnice obserwowane w odniesieniu do widm CD ujawniają heterogenność struktury między wariantami Tat, niezależnie od ich wielkości. Nie można połączyć widm CD w 2 kategoriach, utworzonych przez Tat o małej długości (białe oznaczenia) i Tat o dużej długości (czarne oznaczenia). Widma CD cechują się obecnością prążka ujemnego bliskiego 200 nm, typowego dla struktur niezorganizowanych. Intensywna wielkość prążka 200 nm, obserwowana przy badaniu Tat Bru cmC, dowodzi, że modyfikacja reszt cysteinowych spowodowała znaczne zmiany konformacji w stosunku do innych Tat.

Figura 7: testy ELISA przeprowadzone z trzema rozcieńczeniami króliczych surowic poliklonalnych (anty-Tat Bru cmC, anty-Tat Oyi i anty-Tat Eli) i z 7 wariantami białka Tat w warunkach denaturujących.

Figura 8: hamowanie transaktywacji przez Tat Eli z surowicami anty-Tat Eli, anty-Tat Oyi i Tat Bru cmC.

Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do powyższego opisu. Jest on poniżej dokładniej objaśniony w przykładach, które mają na celu jedynie ilustrację wynalazku.

P r z y k ł a d y

1) Materiały i metody odpowiadające fig. 3A - 6

Synteza białka, oczyszczanie i charakterystyka

Peptydy połączono sposobem Barany i Merrifield (1980) na żywicy uprzednio naładowanej

4-hydroksymetylofenoksymetyloko-polistyrenem w stężeniu 1% (HMP) (0,5 - 0,65 mmol) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA, Stany Zjednoczone). W celu uniknięcia uzyskania pochodnych z delecjami, końce N bez Fmoc zabezpieczono grupą acetylową po potraktowaniu mieszaniną, zawierająca 4,75% bezwodnego kwasu octowego (Merck), 6,25%: DIEA w stężeniu 2,0 M, 1,5% 1M 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Warrington, Wielka Brytania) i 87, 5% N-metylopirolidonu (Perkin Elmer, Forster City, CA, Stany Zjednoczone). Każdy etap odłączania grup zabezpieczających kontrolowano aparatem do mierzenia przewodności. Od peptydów odłączono grupy zabezpieczające i usunięto je z żywicy z zastosowaniem kwasu trójfluorooctowego (TFA), uzupełnionego 10% siarczkiem metylofenylowym (Merck) i 5% etanem ditiolowym (Merck). Oczyszczenie przeprowadzono z zastosowaniem aparatu do wysokosprawnej chromatografii cieczowej dużej wydajności Beckmana (HPLC) i kolumny z odwróconymi fazami C8 Mercka (10 x 250 mm). Bufor A składał się z wody z 0,1%, TFA, natomiast bufor B składał się z acetonitrylu z 0,1% TFA. Gradient tworzył bufor B w stężeniu od 20 do 40% przez czas 40 min z przepływem 2 ml/min. Spektrometrię masową przez elektrowaporyzację przeprowadzono z zastosowaniem PE-SCIEX API 150ex prostego poczwórnego Perkin Elmer. Analizy aminokwasów przeprowadzono na analizatorze Beckmana, model 6300.

Testy zmiany ruchliwości elektroforetycznej

Wytworzono 59 nukleotydów RNA TAR, zawierających zasadnicze zgrupowanie pirymidynowe UUU, in vitro, poprzez transkrypcję z polimerazą RNA T3. Mieszaniny reakcyjne wiązania (20 μΓ) zawierały 0,2 nmol znakowanego radioaktywnie RNA TAR, 0 - 100 ng Tat w buforze TK (50 mM Tris pH 7,4, 20 mM KCl, 0,1% Triton X-100). Kompleksy oddzielono od RNA niezwiązanego w czasie elektroforezy na poliakrylamidowych żelach denaturujących w stężeniu 8%, zawierających 0,1% Triton Χ-100. Żel poddano migracji wstępnej w czasie 30 min przed nałożeniem próbki (25 μ^. Elektroforezę

PL 197 666 B1 prowadzono przez 90 min przy napięciu około 200 V. Względna ilość RNA wolnego i/lub związanego oznaczono przez obrazowanie fosforem.

Dichroizm kołowy (CD)

Widmo dichroizmu kołowego mierzono z zastosowaniem drogi optycznej 50 μm przy długości fali od 260 do 178 nm na spektrofotometrze CD UV Jobin-Yvon (Long-Jurneau, Francja) (Mark VI). Aparat kalibrowano kwasem (+) -10-kamforosulfonowym. Stwierdzono stosunek równy 2,1 między prążkiem CD dodatnim przy długości fali 290,5 nm a prążkiem ujemnym przy długości fali 192,5 nm. Dane zebrano w odstępie 0,5 nm przy analizie co 1 nm na minutę. Widma CD przedstawiono w postaci Δε na amid. Próbki wytwarzano w buforze fosforanowym w 20 mM (pH 4,5). Stężenie białka wynosiło od 0,5 do 1 mg/ml.

Transaktywacja komórek transfekowanych LTR HIV

Transaktywację czynnościową syntetycznym Tat oznaczono z zastosowaniem komórek P4. Te komórki CD4-HeLa zawierają bakteryjny gen lacZ pod kontrolą LTR HIV i gromadzenie w cytoplazmie (β-galaktozydazy ścisłe zależy od obecności Tat. 80% komórek o wzroście zlewnym, rozmieszczonych na płytce 12-zagłebieniowej, inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C w obecności CO2 w stężeniu 5%, przy czym białko Tat znajdowało się w pożywce DMEM uzupełnionej 0,1% BSA. Po tym okresie inkubacji komórki przepłukano roztworem soli fizjologicznej zbuforowanym fosforanem i białka ekstrahowano i analizowano pod kątem zawartości β-galaktozydazy dostępnym w handlu testem immunoabsorpcyjnym, z zastosowaniem enzymu związanego z antygenem (ELISA dla βgalaktozydazy, Boehringer Mannheim, Francja) zgodnie z zaleceniami producenta. Wartości znormalizowano, stosując całkowite stężenie białka z różnych lizatów komórkowych, jak to określono w metodzie Bradforda.

Hamowanie transaktywacji

Powtórzono powyższe doświadczenia transaktywacji z zastosowaniem komórek transfekowanych LTR HIV, tym razem z dodatkiem pożywki hodowlanej albo do surowicy anty-Tat Eli, albo do anty-Tat Oyi lub do anty-Tat Bru. Białko Tat pochodziło z wariantów Eli.

Twórcy wynalazku stwierdzili inaktywację transaktywacji przez przeciwciała anty-Tat Oyi białka Tat Eli w porównaniu zwłaszcza z pożywką kontrolną, nie zawierająca przeciwciał.

2) Materiały i metody odpowiadające fig. 7

Warunki immunizacji są następujące; wstrzyknięcie śródskórne 100 μg oczyszczonego białka Tat w 0,5 ml 100 mM buforu fosforanowego o pH 4,5 plus 0,5 ml pełnego adiuwanta Freunda (dzień 0). Pierwsze wstrzyknięcie przypominające przeprowadzono w dniu 21 w tych samych warunkach, jednak z dodatkiem niepełnego adiuwanta Freunda (0,5 ml). Drugie wstrzyknięcie przypominające przeprowadzono w dniu 42 w sposób identyczny, co w dniu 21. W dniu 53 pobrano krew do probówek FST i poprzez odwirowanie z prędkością 2000 obr./min uzyskano surowice. Rozcieńczenie surowic wynosiło 1:1000.

ELISA: test prowadzono na płytce Maxisorp U96 (Polylabo). Białka w buforze fosforanowym o pH 4,5 inkubowano na płytce przez noc w temperaturze 4°C. Po nasyceniu buforem MPBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na2HPO4 1,44 g/l, KH2PO4 0,24 g/l, mleko odtłuszczone 5%, doprowadzone do pH 7,4 z zastosowaniem HCl), białka inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym przez jedną godzinę. Następnie prowadzono inkubację z przeciwciałami kozimi, sprzężonymi z peroksydazą swoistą dla fragmentu Fc królika (Cappel) przez jedną godzinę. Wynik wywoływano w obecności H2O2, 100 mM kwasu cytrynowego, 50 mM NaOH i 0,2 mg/ml ABTS (Boehringer). Absorbancję odczytywano przy długości fali 405 nm.

Bez rozcieńczenia surowica anty-Tat Eli jest w stanie rozpoznawać wszystkie warianty i pochodne Tat.

3) Materiały i metody do prowadzenia reakcji Western blot

Western blot: białka najpierw poddawano denaturacji w obecności 3 M Tris-HCl, pH 8,8, 5% β-merkaptoetanolu, 2% SDS, 10% glicerolu i błękitu bromofenolowego. Rozdzielono je poprzez elektroforezę na 15 żelu poliakrylamidowym. Białka przeniesiono następnie na arkusze nitrocelulozowe w celu wywołania metodą immunodetekcji. Miejsca nieswoiste zablokowano roztworem PBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na2HPO4 1,44 g/l, KH2PO4 0,24 g/l, doprowadzonym do pH 7,4 z zastosowaniem HCl), zawierającym 5% mleka odtłuszczonego. Arkusz nitrocelulozowy pozostawiono do inkubacji z pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym na jedną godzinę. Następnie prowadzono inkubację z przeciwciałami kozimi, sprzężonymi z peroksydazą swoistą dla fragmentu Fc królika (Sigma). Wynik wywoływano w obecności H2O2, PBS i diaminobezamidyny (w opisie nie zamieszczono zdjęcia żelu).

PL 197 666 B1

4) Materiały i metody odpowiadające fig. 8

Mierzono transaktywacje z zastosowaniem ludzkich komórek HeLa, transfekowanyoh LTR HIV-1 i genem reporterowym białka β-galaktoydazy (lacZ) sposobem opisanym dla fig. 5.

Surowice uzyskano od królika sposobem opisanym dla fig. 7.

Do pożywki do hodowli komórek dodano 100 μl trzech surowic anty-Tat, a mianowicie anty-Tat Eli, anty-Tat Oyi i anty-Tat Bru cmC, w rosnącym rozcieńczeniu, i następnie 100 μl wariantu Tat Eli w stężeniu 1 - 5 μΜ. Gromadzenie się w cytoplazmie β-galaktozydazy zależy zatem od obecności Tat.

Na początku stwierdzono, że w stężeniu równoważnym najskuteczniejsza jest surowica anty-Tat Eli. Jest to logiczne, ponieważ surowica ta zawiera przeciwciała wytwarzane w reakcji na ten sam wariant, którego aktywność transaktywacji chcemy zneutralizować. Należy jednak podkreślić, że Tat Oyi jest zdolne do wytwarzania przeciwciał w znamiennym stopniu neutralizujących aktywność transaktywacji Tat Eli. Hamowanie to jest zresztą większe od hamowania obserwowanego zwłaszcza dla stężenia 1:10 przy zastosowaniu surowicy anty-Tat Bru cmC. Potwierdza to zalety przeciwciał anty-Tat Oyi względem innych wariantów Tat.

Piśmiennictwo

Alizon, M., Wain-Hobson, S., Montagnier, L., & Sonigo, P. (1986) Celi 46, 63-74

Barany, G. & Merrifield, R.B. (1980) w: Gross, E., & Meinhofer, J. (red.) The peptide: Analysis, Synthesis, Biology. Academic Press, New York, Vol. 2, str. 1-284

Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeyre, M.T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C., Axler-Blin, C, Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C, Rozenbaum, W. & Montagnier, L. (1983) Science 220, 868-871

Clavel, F. & Charneau, P. (1994) J. Virol 68, 1179-1185

Corpet,. F. (1989) Nucl. Acid. Res. 22, 10881-10890.

Delaporte E., Janssens W., Peeters M., Buve A., Dibanga G., Perret J.L., Ditsambou V., Mba J.R., Courbot M.C., Georges A., Bourgeois A., Samb B., Henzel D., Heyndrickx L., Fransen K., van der Groen G., Larouze B. (1996) AIDS 8, 903-910

Gregoire, C. & Loret, E.P. 1996. J. Biol. Chem. 271,22641-22646

Huet, T., Dazza, M.C., Brun-Vezinet, F., Roelants, G.E. & Wain-Hobson, S. 1989. AIDS 3, 707-715

Jeang K.T. (1996) w: Los Alamos National Laboratory (red.) HIV-1Tat : Structure & Function. Human Retroviruses & AIDS compendium. III, str. 3-18

Jeang, K.T., Xiao, H., & Rich, E. A. (1999) J. Biol. Chem. 274, 28837-28840.

Le Buanec, H., Lachgar, A., Bizzini, B., Zagury, J.F., Rappaport, J., Santagostino, E., Muca-Perja, M. & Gringeri, A. 1998. Biomed. Pharmacother 10, 431-435

O'Brien, W.A., Koyanagi, Y., Namazie, A., Zhao, J.Q., Diagne, A., Idler, K., Zack, J. A. & Chen,

I. S. (1990) Nature 348, 69-73

Westendorp, M.O., Frank, R., Ochsenbauer, C, Stricker, K., Dnem, J., Walczak, H., Debatin,

K.M. & Krammer, P.H., 1995. Nature 375, 497-500

Zhu, T., Korber, B.T., Nahmias, A.J., Hooper, E., Sharp, P.M. & Ho, D.D. (1998) Nature 391, 594-597.

Claims (15)

1. Szczepionka anty-HIV-1, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedno białko TAT HIV-1, obejmujące pomiędzy 99 a 106 aminokwasów, zdolne do wiązania się z celem nukleotydowym nazywanym TAR (region wrażliwy na transaktywację) zlokalizowanym na końcu 5' mRNA HIV-1 i niezdolny do transaktywacji LTR HIV-1, w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa białka TAT zawiera co najmniej jedną mutację w porównaniu z sekwencją nukleotydową funkcjonalnego białka TAT, które zdolne jest do wiązania się z TAR i transaktywacji LTR HIV-1.

3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że mutacja dotyczy co najmniej jednej z cystein białka TAT.

4. Szczepionka według zastrz. 1 - 3, znamienna tym, że białko TAT stanowi białko TAT wariantu Oyi HIV-1.

5. Szczepionka według zastrz. 1 - 4, znamienna tym, że białko TAT stanowi syntetyczne białko TAT wytworzone drogą syntezy chemicznej.

PL 197 666 B1

6. Szczepionka według zastrz. 5, znamienna tym, że białko TAT stanowi białko TAT wytworzone drogą syntezy na fazie stałej.

7. Szczepionka według dowolnego z zastrz. 1 - 4, znamienna tym, że białko TAT stanowi rekombinowane białko TAT.

8. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny obejmujący sekwencję nukleotydową dla TAT oraz elementy niezbędne do jej ekspresji.

9. Szczepionka według dowolnego z zastrz. 1 - 6, znamienna tym, że region Arg-Gly-Asp zlokalizowany na końcu C białka TAT jest zmodyfikowany.

10. Sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT zdolnych do rozpoznawania kilku wariantów TAT, znamienny tym, że immunizuje się zwierzęta za wyjątkiem człowieka poprzez wstrzykiwanie białka TAT odpowiadającego wariantowi Oyi w połączeniu z adiuwantem odpowiedzi immunologicznej i oczyszcza się specyficzne przeciwciała zawarte w surowicy immunizowanych zwierząt.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako białko TAT do immunizacji stosuje się białko określone w zastrz. 6.

12. Sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną z przeciwciałami anty-TAT zdolnymi do tworzenia kompleksów antygen-przeciwciało z kilkoma wariantami TAT, uzyskanymi sposobem określonym w zastrz. 10 i stwierdza się obecność kompleksów antygen-przeciwciało.

13. Zestaw do diagnozowania zakażenia HIV przez oznaczanie obecności białka TAT w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje odczynniki do wytwarzania odpowiedniego środowiska do reakcji immunologicznej obejmującej przeciwciała poliklonalne wytworzone sposobem określonym w zastrz. 10; odczynniki pozwalające na detekcję kompleksów antygen-przeciwciało wytworzonych podczas reakcji immunologicznej; ewentualnie referencyjną próbkę biologiczną bez antygenu (kontrola negatywna); ewentualnie referencyjną próbkę biologiczną z określoną ilością antygenu (kontrola pozytywna).

14. Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że odczynniki do wytwarzania odpowiedniego środowiska do reakcji immunologicznej obejmują przeciwciała określone w zastrz. 13.

15. Sposób wytwarzania wariantu TAT określonego w dowolnym z zastrz. 1 - 4, 9 - 10, znamienny tym, że stosuje się grupy zabezpieczające typu FMOC, korzystnie typu fastFMOC.