PL198687B1

PL198687B1 - Zastosowanie polipeptydu do wytwarzania leku

Info

Publication number: PL198687B1
Application number: PL378071A
Authority: PL
Inventors: Darrell C. Conklin; Betty A. Haldeman; Angelica Grossmann
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 2008-07-31
Also published as: PL340755A1; DE69824755D1; UA73275C2; BR9814904A; EP1424393A3; NZ504751A; NO20002698L; HU227703B1; EP1032671B1; EA200000565A1; HUP0100436A3; WO1999027103A1; IL136076A0; EP1719780A3; KR20010032490A; KR100574387B1; PL195304B1; NO329731B1; CZ20001910A3; CZ300849B6

Abstract

1. Zastosowanie polipeptydu, który jest w 80% identyczny z polipeptydem o sekwencji wybranej z grupy polipeptydów o sekwencji SEQ ID nr 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 i 35 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia choroby autoimmunologicznej. 2. Zastosowanie wed lug zastrz. 1, znamienne tym, ze chorob e lub stan wybiera si e z grupy obejmuj acej immunozale zn a cukrzyc e (IDDM), stwardnienie rozsiane i reumatoidalne zapalenie stawów. 3. Zastosowanie wed lug zastrz. 1, znamienne tym, ze chorob e lub stan wybiera si e z grupy obejmuj acej raka w stanie wzrostu lub proliferacji komórek, astm e, zapalenie oskrzeli i ma lop lytko- wo sc u pacjentów z rakiem wynikaj acej z kuracji chemioterapi a lub na swietlaniem. 4. Zastosowanie wed lug zastrz. 1, znamienne tym, ze chorob e lub stan wybiera si e z grupy obejmuj acej luszczyc e, egzem e i stan suchej skóry. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu do wytwarzania leku. Zastosowanie dotyczy zwłaszcza wykorzystania polipeptydu do wytworzenia leku do leczenia chorób autoimmunologicznych. Rozmnażanie i różnicowanie komórek organizmów wielokomórkowych jest kontrolowane przez hormony i polipeptydowe czynniki wzrostowe. Te rozpuszczalne cząsteczki pozwalają komórkom komunikować się ze sobą i zgodnie oddziaływać w celu wytworzenia komórek i organów oraz w celu naprawy i regeneracji uszkodzonej tkanki. Przykł ady hormonów i czynników wzrostowych obejmują hormony steroidowe (na przykład estrogen, testosteron), hormon przytarczyc, hormon folikulotropowy, interleukiny, płytkowy czynnik wzrostowy (PDGF), epidermalny czynnik wzrostowy (EGF), czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytarnomakrofagalnych (GM-CSF), erytropoetynę (EPO) i kalcytoninę .

Hormony i czynniki wzrostowe wpływają na metabolizm komórkowy przez wiązanie się z białkami. Białka te mogą być integralnymi białkami błony, połączonymi w komórce z drogami przekazywania sygnałów, takimi jak drugorzędowe systemy przekaźnikowe. Inne klasy białek obejmują rozpuszczalne cząsteczki.

Szczególnie interesujące są cytokiny, cząsteczki które stymulują namnażanie i/lub różnicowanie komórek. Przykłady cytokin obejmują erytropoetynę (EPO), która pobudza rozwój czerwonych komórek krwi, trombopoetyna (TPO), która pobudza rozwój komórek linii megakariocytarnej i czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytarnych (G-CSF), który pobudza rozwój granulocytów obojętnochłonnych. Cytokiny użyteczne są w przywracaniu normalnego poziomu komórek krwi u pacjentów cierpiących na anemię albo chorych na nowotwór, leczonych metodą chemioterapii. Aktywność in vivo tych cytokin przedstawia ogromny potencjał kliniczny i istnieje potrzeba, znalezienia innych cytokin, agonów cytokin i ich antagonów.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu, który jest w 80% identyczny z polipeptydem o sekwencji wybranej z grupy polipeptydów o sekwencji SEQ ID nr 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 i 35 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia choroby autoimmunologicznej.

Korzystnie, zastosowanie według wynalazku dotyczy zastosowania wyżej wymienionego polipeptydu do wytworzenia leku leczącego chorobę lub stan z grupy obejmującej immunozależną cukrzycę (IDDM), stwardnienie rozsiane i reumatoidalne zapalenie stawów.

Zastosowanie według wynalazku dotyczy także choroby lub stanu który wybiera się z grupy obejmującej raka w stanie wzrostu lub proliferacji komórek, astmę, zapalenie oskrzeli i małopłytkowość u pacjentów z rakiem wynikającej z kuracji chemioterapią lub naświetlaniem, lub ewentualnie z grupy obejmującej łuszczycę, egzemę i stan suchej skóry.

Kluczową sprawą w realizacji niniejszego wynalazku jest dostarczenie wyizolowanego polinukleotydu kodującego ssaczą cytokinę o strukturze czterech alfa helis, nazwaną Zcyto10. Ludzki polipeptyd Zcyto10 zawiera sekwencję 176 aminokwasów z początkowym aminokwasem Met jak pokazano na SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:2. Przyjmuje się, że reszty aminokwasowe 1-24 są sekwencją sygnałową, a dojrzały polipeptyd Zcyto10 stanowi sekwencja aminokwasowa, zawierająca reszty aminokwasowe od reszty 25, leucyna, do reszty aminokwasowej 176, kwas glutaminowy, tak jak pokazano na SEQ ID NO:12. Inny przykład wykonania sposobu według wynalazku określony jest przez sekwencje SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO: 4. Polipeptyd SEQ ID NO: 4 zawiera 151 reszt aminokwasowych, przy czym aminokwasy 1-24 są sekwencją sygnałową, a dojrzały polipeptyd Zcyto10 stanowi sekwencja aminokwasowa zawierająca reszty aminokwasowe od reszty 25, leucyna, do reszty aminokwasowej 176, kwas glutaminowy, pokazane na SEQ ID NO:13. Inny aktywny wariant stanowi sekwencja aminokwasowa zawierająca reszty aminokwasowe od reszty 33, cysteina do reszty aminokwasowej 176 pokazanych na SEQ ID NO: 2. Ten wariant jest zdefiniowany przez SEQ ID NO:26.

Polipeptyd Zcyto10 myszy jest polipeptydem zawierającym 176 reszt aminokwasowych, jak pokazano na SEQ ID NO: 18 i 19.

Polipeptyd Zcyto10 myszy ma sekwencję sygnałową rozciągającą się od reszty aminokwasowej 1, metionina, do reszty aminokwasowej 24, glicyna, włącznie, tak jak pokazano na SEQ ID NO:19. Dojrzały polipeptyd Zcyto10 myszy zawiera reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 25, leucyna, do reszty aminokwasowej 176, leucyna, włącznie, jak pokazano na SEQ ID NO:19. Jest on zdefiniowany przez SEQ ID NO:20. Przyjmuje się, że inny aktywny wariant rozciąga się od reszty aminokwasowej 33, cysteina, do reszty aminokwasowej 176 pokazanych na SEQ ID NO:19. Ten wariant jest

PL 198 687 B1 zdefiniowany przez SEQ ID NO:25. W dodatkowym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, polipeptyd zawiera także znacznik powinowactwa.

Wariant polipeptydu Zcyto10 myszy jest zdefiniowany przez SEQ ID NO: 33 i 34. Ten wariant ma wielkość 154 reszt aminokwasowych i zawiera sekwencję sygnałową rozciągającą się od reszty aminokwasowej 1, metionina, do reszty aminokwasowej 24, glicyna, włącznie, tak jak pokazano na SEQ ID NO:34. Dojrzały polipeptyd Zcyto10 myszy zawiera reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 25, leucyna, do reszty aminokwasowej 154, leucyna, włącznie, jak pokazano na SEQ ID NO:34. Sekwencja dojrzałego wariantu polipeptydu Zcyto10 myszy jest zdefiniowana przez SEQ ID NO:35.

Konieczne jest zatem także dostarczenie wektora do ekspresji zawierającego (a) region promotorowy; (b) segment DNA kodujący polipeptyd Zcyto10; i (c) terminator transkrypcji, znamiennego tym, że region promotorowy, segment DNA i terminator są połączone funkcjonalnie.

Konieczne jest także dostarczenie nadającej się do hodowli komórki eukariotycznej albo prokariotycznej, do której został wprowadzony opisany powyżej wektor do ekspresji, która wytwarza ona polipeptyd kodowany przez segment DNA.

Dostarcza się także chimerowego polipeptydu składającego się głównie z pierwszej części i drugiej części, połączonych wiązaniem peptydowym. Pierwsza część chimerowego polipeptydu zawiera głównie (a) polipeptyd Zcyto10 pokazany przez SEQ ID NO:2, (b) allelowe warianty SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:34 albo SEQ ID. NO:35; i (c) polipeptydy białkowe, które przynajmniej są 90% identyczne z (a) albo (b). Druga część chimerowego polipeptydu zawiera głównie inny polipeptyd, taki jak znacznik powinowactwa. W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku znacznikiem powinowactwa jest polipeptyd Fc przeciwciała. Sposobem według wynalazku dostarcza się też wektora do ekspresji kodującego chimerowy polipeptydy i transfekowanych komórek gospodarza wytwarzających chimerowe polipeptydy.

Można także dostarczyć przeciwciała, które specyficznie wiąże się z opisanym powyżej polipeptydem Zcyto10, jak również anty-idiotypowego przeciwciała, które neutralizuje przeciwciało przeciw polipeptydowi Zcyto10.

Można także utworzyć kompozycję farmaceutyczną zawierającą oczyszczony polipeptyd Zcyto10 w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką. Takie kompozycje są użyteczne do modulowania namnażania komórek, różnicowania komórek lub wytwarzania cytokin, w celu zapobiegania albo leczenia stanów chorobowych cechujących się niewłaściwym namnażaniem komórek, niewłaściwym różnicowaniem komórek lub niewłaściwym wytwarzaniem cytokin. Bardziej dokładnie, polipeptyd Zcyto10 jest użyteczny w zapobieganiu albo leczeniu chorób autoimmunologicznych dzięki hamowaniu komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Choroby autoimmunologiczne, które są podatne na leczenie polipeptydem Zcyto10 obejmują IDDM, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów. Polipeptydy Zcyto10 wytworzone sposobem według wynalazku są też użyteczne w hamowaniu wzrostu lub namnażania komórek nowotworowych.

Polipeptydy Zcyto10 może pobudzać system immunologiczny do lepszej walki z zakażeniami bakteryjnymi albo wirusowymi. Polipeptydy Zcyto10 podaje się systemowo w celu zwiększenia liczby płytek krwi wytwarzanej przez pacjenta. Ponadto, polipeptydy Zcyto10 wytworzone sposobem według wynalazku mogą być używane w aplikacjach specyficznych dla tchawicy albo tchawiczo-oskrzelowych, takich jak utrzymanie albo leczenie uszkodzeń nabłonka tchawiczo-oskrzelowego lub komórek podścieliska, w regulacji wytwarzania śluzu albo w usuwaniu resztek komórek rzęskowych albo w leczeniu astmy, zapalenia oskrzeli lub innych chorób dróg tchawiczo-oskrzelowych. Mogą one także wspomagać leczenie ran i zwiększać regenerację dotkniętych chorobą tkanek, co może być szczególnie użyteczne w leczeniu chorób okołozębowych. Ponadto, polipeptydy Zcyto10 mogą być używane do leczenia chorób skórnych, takich jak łuszczyca, egzema i ogólnie sucha skóra.

Dodatkowym przykładem jest peptyd albo polipeptyd, który ma sekwencję aminokwasową epitopowej części polipeptydu Zcyto10 o sekwencji aminokwasowej opisanej powyżej. Peptyd albo polipeptydy posiadające sekwencję aminokwasową epitopowej części polipeptydu Zcyto10, wytworzonego sposobem według wynalazku obejmują części takich polipeptydów o wielkości przynajmniej dziewięciu, korzystnie przynajmniej 15 i bardziej korzystnie przynajmniej 30 do 50 aminokwasów, chociaż jakiejkolwiek wielkości części epitopowe polipeptydów, aż do pełnej sekwencji aminokwasowej opisanego powyżej polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku są też włączone w zakres wynalazku. Zastrzeżone są też którekolwiek z tych polipeptydów połączone z innymi polipeptydami albo z cząsteczką nośnika. Takie warianty epitopów obejmują, ale bez ograniczania SEQ ID NO: 25-32.

PL 198 687 B1

Przeciwciała wytworzone przeciw takim epitopowym częściom polipeptydu Zcyto10 mogą być używane do oczyszczania polipeptydu Zcyto10 z podłoża do hodowli komórek.

Przed szczegółowym opisem sposobu według wynalazku, dla jego lepszego zrozumienia może być pomocne zdefiniowanie następujących określeń:

Termin znacznik powinowactwa oznacza segment polipeptydu, który może być przyłączony do drugiego polipeptydu w celu umożliwienia oczyszczenia albo wykrycia drugiego polipeptyd, albo w celu stworzenia miejsca przyczepu drugiego polipeptydu do substratu. W zasadzie, jakikolwiek peptyd albo białko, dla którego dostępne jest przeciwciało albo inny specyficznie wiążący związek, może być używany jako znacznik powinowactwa. Znaczniki powinowactwa obejmują polihistydynę, białko A, (Nilsson i wsp., EMBO J. 4: 1075 (1985), Nilsson i wsp., Methods Enzymol. 198: 3 (1991)), S-transferazę glutationową (Smith i Johnson, Gene 67: 31 (1988)), znacznik powinowactwa Glu-Glu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4 (1985)), substancje P, peptyd Flag™ (Hopp i wsp., Biotechnology 6: 1204-1210 (1988)), peptyd wiążący streptawidynę, lub inny antygenowy epitop albo domenę wiążącą. Patrz, Ford i wsp., Protein Expression and Purification 2: 95-107 (1991). DNA kodujące znaczniki powinowactwa są dostępne w handlu (na przykład, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Termin allelowy wariant oznacza którykolwiek z dwu albo więcej alternatywnych form genu zajmujących ten sam locus chromosomowy. Allelowy wariant powstaje naturalnie przez mutację i może powodować w populacji polimorfizm fenotypowy. Mutacje genu mogą być ciche (nie powodują zmian w kodowanym polipeptydzie) lub mogą kodować polipeptydy posiadające zmienioną sekwencję aminokwasową.

Termin allelowy wariant jest też używany w celu określenia białka kodowanego przez allelowy wariant genu.

Terminy koniec aminowy i koniec karboksylowy oznaczają pozycje w polipeptydach. Jeżeli wskazuje na to kontekst, te terminy używane są w odniesieniu do określonej sekwencji albo części polipeptydu w celu wskazania bliskości albo pozycji względnej. Na przykład, jeżeli w polipeptydzie pewna sekwencja leży w kierunku końca karboksylowego od sekwencji odniesienia oznacza to, że jest zlokalizowana bliżej końca karboksylowego peptydu niż sekwencja odniesienia, ale nie koniecznie znajduje się na końcu karboksylowym kompletnego polipeptydu.

Termin para cząsteczka komplementarna/cząsteczka przeciw-komplementarna oznacza nieidentyczne domeny, które w odpowiednich warunkach tworzą niekowalecyjnie związaną, stałą parę. Na przykład, para biotyna i awidyna (lub streptawidyna) są prototypową parą cząsteczka komplementarna/cząsteczka przeciw-komplementarna. Inne przykładowe pary cząsteczka komplementarna/cząsteczka przeciw-komplementarna obejmują parę receptor/ligand, parę przeciwciało/antygen (albo hapten albo epitop); parę polinukleotyd sensowny/polinukleotyd antysensowny. Jeżeli istnieje potrzeba późniejszej dysocjacji pary cząsteczka komplementarna/cząsteczka przeciwkomplementarna, powinowactwo wiązania takiej pary cząsteczka komplementarna/cząsteczka przeciwkomplementarna korzystnie wynosi <10⁹ M^-1.

Termin cząsteczka komplementarna do cząsteczki polinukleotydu oznacza cząsteczkę polinukleotydu posiadającą komplementarną sekwencję zasad i odwrotną orientację w porównaniu do sekwencji odniesienia. Na przykład, sekwencja 5' ATGCACGGG 3' jest komplementarna do sekwencji 5' CCCGTGCAT 3'.

Termin kontig oznacza polinukleotyd, którego sekwencja jest częściowo identyczna lub komplementarna z sąsiednią sekwencją innego polinukleotydu. Sąsiednia sekwencja oznacza, że przy danej długości polinukleotydu sąsiednia sekwencja zachodzi na daną sekwencję polinukleotydową w całości albo częściowo. Na przykład, przykładowymi kontigami do sekwencji polinukleotydowej 5'-ATGGCTTAGCTT-3' są 5'-TAGCTTgagtct-3' i 3'-gtcgacTACCGA-5'.

Termin zdegenerowana sekwencja nukleotydowa oznacza sekwencję nukleotydową, która zawiera jeden albo więcej zdegenerowanych kodonów (w porównaniu z cząsteczką polinukleotydu odniesienia, która koduje dany polipeptyd). Zdegenerowane kodony zawierają inne triplety nukleotydów, ale kodują tę samą resztę aminokwasową (na przykład triplety GAU i GAC kodują Asp).

Termin wektor do ekspresji oznacza cząsteczkę DNA, liniową albo kołową, która zawiera segment kodujący dany polipeptyd połączony funkcjonalnie z dodatkowymi segmentami, które zapewniają jego transkrypcję. Takie dodatkowe segmenty obejmują region promotorowy i sekwencję terminatora, mogą też obejmować jeden albo więcej początków replikacji, jeden albo więcej markerów

PL 198 687 B1 do selekcji, sekwencję wzmacniającą i sygnał poliadenylacji. Wektory do ekspresji pochodzą głównie od plazmidowego DNA albo wirusowego DNA lub mogą zawierać elementy tych obu rodzajów DNA.

Termin wyizolowany, kiedy jest stosowany do polinukleotydu, oznacza, że polinukleotyd jest usunięty z jego naturalnego genetycznego środowiska i jest pozbawiony obcych albo niepotrzebnych sekwencji kodujących, oraz że znajduje się w formie przydatnej do użytku w systemach wytwarzania genetycznie zmienionych białek. Takimi wyizolowanymi cząsteczkami są cząsteczki oddzielone od ich naturalnego otoczenia, takie jak cDNA i klony genomowe. Wyizolowane cząsteczki DNA wytworzone sposobem według wynalazku są wolne od innych genów, z którymi są one zwykle połączone, ale mogą zawierać naturalnie występujące 5' i 3'regiony nie ulegające translacji, takie jak regiony promotorowe i terminatory. Identyfikowanie połączonych regionów dla danej sekwencji jest oczywiste dla biegłych w sztuce (patrz na przykład, Dynan i Tijan, Nature 316: 774-78 (1985)).

Wyizolowany polipeptyd lub białko oznacza polipeptyd albo białko, które znajduje się w warunkach innych niż jego naturalne otoczenie, na przykład poza krwią lub tkanką zwierzęcą. W korzystnej formie, wyizolowany polipeptyd jest całkowicie wolny od innych polipeptydów, szczególnie innych polipeptydów pochodzenia zwierzęcego. Korzystnie jest dostarczać polipeptydy w postaci wysoko oczyszczonej, na przykład o czystości większej niż 95%, bardziej korzystnie większej niż 99%. Używany w tym kontekście termin wyizolowany nie wyklucza występowania tego samego polipeptydu w alternatywnej formie fizycznej, takiej jak dimer albo formy alternatywnie glikozylowane lub derywatyzowane.

Termin połączony funkcjonalnie, kiedy odnosi się do segmentów DNA, oznacza, że segmenty te są tak rozmieszczane, że zgodnie działają w celu osiągnięcia przewidzianych celów, na przykład transkrypcja zaczyna się w regionie promotorowym i postępuje przez segment kodujący do terminatora.

Termin ortolog oznacza polipeptyd albo białko otrzymywane z jednego gatunku, które jest funkcjonalnym duplikatem polipeptydu albo białka otrzymywanego z innego gatunku. Różnice Sekwencji ortologów są wynikiem specjacji.

Termin paralog oznacza odmienne, ale strukturalnie odpowiednie białka wytwarzane przez organizm. Uważa się, że paralogi powstają przez podwojenie genu. Na przykład, α-globina, β-globina i hemoglobina mięśniowa są wzajemnymi paralogami.

Termin polinukleotyd oznacza jedno- albo dwuniciowy polimer zasad dezoksyrybonukleotydowych albo rybonukleotydowych czytany od końca 5' do końca 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA, i mogą być wyizolowane ze źródeł naturalnych, zsyntetyzowane in vitro, albo wytworzone przez połączenie naturalnych i syntetycznych cząsteczek. Wielkość polinukleotydów wyraża się w parach zasad (skrót pz), nukleotydach (nt), albo kiloparach zasad (kpz). Jeżeli wskazuje na to kontekst, dwa pierwsze określenia oznaczają polinukleotydy, które są pojedynczo albo dwuniciowe. Kiedy termin jest stosowany do dwuniciowych cząsteczek to oznacza całkowitą długość i zakłada się, że jest on równoważny do terminu par zasad. Biegli w sztuce zdają sobie sprawę, że dwie nici dwuniciowego polinukleotydu mogą się nieznacznie różnić długością, i że końce tego polinukleotydu mogą być nierówne, co jest spowodowane cięciem enzymatycznym, tak więc nie wszystkie nukleotydy w dwuniciowej cząsteczce polinukleotydu muszą być sparowane.

Takie niesparowane końce nie powinny mieć więcej niż 20 nukleotydów długości.

Termin polipeptyd oznacza wytworzony naturalnie albo syntetycznie polimer reszt aminokwasowych połączonych wiązaniem peptydowym. Polipeptydy mniejsze niż 10 reszt aminokwasowych zwykle określane są jako peptydy.

Termin region promotorowy oznacza, zgodnie z jego znaczeniem rozpoznawanym w sztuce, część genu zawierającą sekwencję DNA która zapewnia wiązanie polimerazy RNA i zapoczątkowanie transkrypcji. Sekwencje regionów promotorowych zwykle, ale nie zawsze, znajdują się w 5' regionie niekodującym genów.

Termin białko oznacza makrocząsteczkę zawierającą jeden albo więcej łańcuchów polipeptydowych. Białko może też zawierać składniki niepeptydowe, takie jak grupy węglowodanowe. Węglowodany i inne niepeptydowe podstawniki mogą być przyłączane do białka przez komórkę, która to białko wytwarza, i będą zmieniać się w zależności od typu komórki. Białka są definiowane tu na podstawie struktury ich szkieletu aminokwasowego; podstawniki takie jak grupy węglowodanowe nie są wyszczególniane, tym niemniej mogą być obecne.

Termin receptor oznacza związane z komórką białko, które wiąże się z cząsteczkami aktywnymi biologiczne (to znaczy ligandami) i pośredniczy w działaniu ligandu na komórkę. Receptory bło6

PL 198 687 B1 nowe cechują się wielodomenową budową, obejmującą pozakomórkową domenę wiążącą ligand i ś ródkomórkową domenę efektorową , która typowo jest włączona w przekazywanie sygnałów.

Wiązanie ligandu z receptorem powoduje konformacyjną zmianę receptora, która powoduje oddziaływanie między domeną efektorową i inną cząsteczką w komórce. To oddziaływanie z kolei prowadzi do zmiany metabolizmu komórki. Zdarzenia metaboliczne, które są spowodowane przez oddziaływanie receptora z ligandem obejmują transkrypcję genu, fosforylację, defosforylację, wzrost wytwarzania cyklicznego AMP, mobilizację komórkowego wapnia, mobilizację błonowych lipidów, przyleganie komórki, hydrolizę lipidów inozytolowych i hydrolizę fosfolipidów. Receptory mogą być związane z błoną , cytozolowe albo jądrowe; monomeryczne (na przykład receptor tyrotropiny, receptor betaadrenergiczny) lub multimeryczne (na przykład receptor PDGF, receptor hormonu wzrostu, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor erytropoetyny i receptor IL-6).

Termin sekwencja sygnału wydzielniczego wskazuje sekwencję DNA, która koduje polipeptyd (peptyd wydzielniczy), który będąc częścią większego polipeptydu, kieruje cały polipeptyd na wydzielniczą drogę komórki, w której jest syntetyzowany. Podczas przechodzenia przez wydzielniczą drogę w komórce, taki polipeptyd zwykle jest rozcinany w celu usunięcia peptydu wydzielniczego.

Termin wariant składania oznacza alternatywne formy RNA transkrybowanego genu. Wariant składania powstaje naturalnie w wyniku wykorzystania alternatywnych miejsc składania w transkrybowanej cząsteczce RNA, lub rzadziej pomiędzy oddzielnie transkrybowanymi cząsteczkami RNA. Może powodować powstanie kilku mRNA transkrybowanych z tego samego genu. Warianty składania mogą kodować polipeptydy posiadające zmienioną sekwencję aminokwasową. Termin wariant składania jest też używany w celu wskazania białka kodowanego przez wariant składania mRNA transkrybowany z genu.

Masy cząsteczkowe i długości polimerów określa się w nieprecyzyjny analityczny sposób (na przykład metodą elektroforezy na żelu) i są rozumiane jako wartości przybliżone. Kiedy taka wartość jest wyrażona jako około X lub w przybliżeniu X, wartość X jest wyrażana z dokładnością do 10%.

Konserwowane aminokwasy w helisie D polipeptydu Zcyto10 mogą być używane jako narzędzie do identyfikacji nowych członków tej rodziny białek. Helisa D jest najbardziej konserwowana i wykazuje około 32% identyczności z helisą D IL-10. Na przykład, do namnożenia kodującej sekwencji konserwowanej [domena, region albo motyw opisany powyżej] z RNA otrzymanego z tkanek, pochodzących z różnych źródeł lub różnych linii komórkowych, można użyć reakcji łańcuchowej polimerazy DNA z wykorzystaniem odwrotnej transkrypcji (RT-PCR). W tym celu szczególnie użyteczne są wysoko zdegenerowane startery zaprojektowane dla sekwencji polipeptydu Zcyto10.

W korzystnych przykł adach wykonania sposobu wedł ug wynalazku wytworzone sposobem według wynalazku wyizolowane polinukleotydy hybrydyzują w ostrych warunkach hybrydyzacji z regionami SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:33 o podobnej wielkości albo z sekwencjami do nich komplementarnymi. Ogólnie, ostre warunki hybrydyzacji dobiera się tak, żeby były o 5°C poniżej punktu topnienia (Tm) specyficznej sekwencji w zdefiniowanej sile jonowej i pH. Tm jest to temperatura (w zdefiniowanej sile jonowej i pH) przy której 50% sekwencji docelowej hybrydyzuje z doskonale dopasowywaną sondą. Typowe ostre warunki hybrydyzacji to takie warunki, w których stężenie soli wynosi około 0,02 M albo mniej w pH 7, a temperatura wynosi przynajmniej około 60°C. Jak poprzednio wspomniano, wyizolowany polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku obejmuje DNA i RNA. Sposoby izolowania DNA i RNA są dobrze znane w sztuce. Całkowity RNA otrzymuje się używając metody ekstrakcji chlorowodorkiem guanidyny i następnie wirowania w gradiencie CsCl (Chirgwin i wsp., Biochemistry 18: 52-94, (1979)). Poli(A)⁺ RNA otrzymuje się z całkowitego RNA metodą opisaną przez Aviv i Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412 (1972).

Komplementarny DNA (cDNA) wytwarza się z poli(A)⁺ RNA znanymi metodami. Polinukleotydy kodujące polipeptydy Zcyto10 identyfikuje się i izoluje, na przykład, metodą hybrydyzacji albo PCR.

Ponadto, polinukleotydy wytworzone sposobem według wynalazku można syntetyzować za pomocą syntezatora DNA. Obecnie metodą z wyboru jest metoda fosforoamidowa. Jeżeli dla takich zastosowań, jak synteza genu albo fragmentu genu, potrzebny jest chemicznie zsyntetyzowany dwuniciowy DNA, wtedy każdą komplementarną nić syntetyzuje się oddzielnie. Wytwarzanie krótkich genów (60 do 80 par zasad) jest łatwe technicznie i może być wykonane przez zsyntetyzowanie komplementarnych nici i ich połączenie. Wytwarzanie dłuższych genów (>300 par zasad), wymaga jednak specjalnych strategii, ponieważ skuteczność łączenia nukleotydów w każdym cyklu chemicznej syntezy DNA, rzadko wynosi 100%. W celu przezwyciężenia tego problemu, syntetyczne geny (dwuniciowe) wytwarza się w sposób modułowy z jednoniciowych fragmentów DNA, o długości od 20 do 100 nuklePL 198 687 B1 otydów. Patrz Glick, Bernard R. I Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994), Itakura, K. i wsp., Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Annu. Rev. Biochem. 53: 323-356 (1984) i Climie, S. i wsp. Chemical synthesis of the thymidylate synthase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 633-637 (1990).

Fachowcy wiedzą, ze sekwencje opisane przez SEQ ID NOs: 1, 2, 3 i 4 przedstawiają dwa allele ludzkiego genu, a SEQ ID NOs: 18, 19, 33 i 34 przedstawiają dwa allele genu myszy. Dodatkowe allelowe warianty tych sekwencji mogą być zklonowane przez sondowanie cDNA lub bibliotek genomowego DNA różnych osobników stosownie do standardowych metod. Allelowe warianty tej sekwencji klonuje się przez sondowanie cDNA lub bibliotek genomowego DNA różnych osobników stosownie do standardowych metod. Allelowe warianty sekwencji DNA pokazanej na SEQ ID NO:1, włączając te, które zawierają ciche mutacje i te, w których mutacje powodują zmianę sekwencji aminokwasowej, wchodzą w zakres sposobu według wynalazku, podobnie jak białka, które są allelowymi wariantami białka, pokazanego na SEQ ID NO:2. cDNA generowany z alternatywnie złożonego mRNA, które zachowują własności polipeptydu Zcyto10, także wchodzą w zakres sposobu według wynalazku, tak samo, jak polipeptydy kodowane przez takie cDNA i mRNA. Allelowe warianty i warianty składania tych sekwencji klonuje się przez sondowanie cDNA, bibliotek genomowego DNA różnych osobników albo tkanek stosownie do standardowych metod postępowania znanych w sztuce.

Dostarczane są podobne białka i polinukleotydy pochodzące z innych gatunków (ortologów gatunkowych). Szczególnie interesujące są polipeptydy Zcyto10 z innych gatunków ssaków, włączając mysie, świńskie, owcze, wołowe, psie, kocie, końskie i naczelnych. Ortologi gatunkowe ludzkiego białka Zcyto10 mogą być zklonowane dzięki wykorzystaniu informacji i kompozycji dostarczanych sposobem według wynalazku, przy użyciu konwencjonalnych technik klonowania. Na przykład, cDNA może być zklonowany przy użyciu mRNA otrzymanego z tkanki albo komórki, która wytwarza interesujące białko. Przydatne źródła mRNA identyfikuje się metodą Northern blot z sondami zaprojektowanymi na podstawie sekwencji opisanych sposobem według wynalazku. Z mRNA pozytywnej tkanki albo linii komórkowej wytwarza się wtedy bibliotekę. Następnie różnymi metodami, takimi jak sondowanie kompletnym albo częściowym ludzkim lub mysim cDNA, albo sondowanie jednym lub więcej zestawami zdegenerowanych sond opartych na opisanych sekwencjach, izoluje się cDNA kodujące białko. cDNA można też zklonować przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy DNA (PCR) (Mullis i wsp. Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4683202), używając starterów zaprojektowanych na podstawie sekwencji opisanych w wynalazku. Dodatkowo, biblioteki cDNA można użyć do transformowania lub transfekowania komórek gospodarza, a ekspresję interesującego cDNA wykrywa się za pomocą przeciwciała do białka. Podobne techniki stosuje się do izolacji klonów genomowych. Tak jak się tu używa i jest to zastrzeż one, okreś lenie wyizolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd, znamienny tym, że polinukleotyd jest zdefiniowany przez SEQ ID NOs: 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 i 35 obejmuje wszystkie allelowe warianty i ortologi gatunkowe tych polipeptydów.

Dostarczane są też wyizolowane polipeptydy białkowe, które są w zasadzie identyczne do polipeptydu białkowego opisanego przez SEQ ID NO:2 i jego ortologów gatunkowych. Termin wyizolowany oznacza białko albo polipeptyd, który znajduje się w warunkach innych niż jego naturalne otoczenie, na przykład poza krwią lub tkanką zwierzęcą. W korzystnej formie, wyizolowany polipeptyd jest całkowicie wolny od innych polipeptydów, szczególnie innych polipeptydów pochodzenia zwierzęcego. Korzystnie jest dostarczać polipeptydy w postaci wysoko oczyszczonej, na przykład o czystości wiekszej niż 95%, bardziej korzystnie większej niż 99%. Termin w zasadzie identyczne jest tu używany w celu wskazania polipeptydu posiadają cego sekwencję w 50%, korzystnie w 60%, bardziej korzystnie przynajmniej w 80% identyczną z sekwencją przedstawioną na SEQ ID NO: 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 i 35, lub ich ortologami gatunkowymi. Korzystnie, takie polipeptydy mają sekwencję przynajmniej w 90% identyczną, a najbardziej korzystnie w 95% albo więcej, identyczną do sekwencji przedstawionej na SEQ ID NO:2, albo jej ortologów gatunkowych. Procent identyczności sekwencji określa się konwencjonalnymi sposobami. Patrz, na przykład Altschul i wsp., Bull. Math. Bio. 48: 603-616 (1986) i Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992). W skrócie, dwie sekwencje aminokwasowe są wyrównywane w celu optymalizacji wyniku wyrównania, stosuje się karę luki otwarcia 10, karę luki w czasie rozszerzania 1, i matrycę naliczania blossom 62 według Henikoff i Henikoff (cytowane powyżej). Ten sposób porównywania sekwencji pokazane jest w tabeli 1 (aminokwasy określone są przy użyciu standardowego kodu jednoliterowego).

Procent identyczności oblicza się następująco:

PL 198 687 B1

Całkowita liczba identycznych aminokwasów

100

[długość dłuższej sekwencji plus liczba luk wprowadzonych do dłuższej sekwencji przy wyrównywaniu obu porównywanych sekwencji]

T a b e l a 1
A	R	N	D	c	Q	E	G	HILKMFPSTWYV
A 4
R -1	5
N -2	0	6
D -2	-2	1	6
C 0	-3 -	-3	-3	9
Q -1	1	0	0	-3	5
E -1	0	0	2	-4	2	5
G 0	-2	0	-1	-3	-2	-2	6
H -2	0	1	-1	-3	0	0	-2	8

I	-1	-3	-3	-3	-1	-3	-3	-4	-3	4
L	-1	-2	-3	-4	-1	-2	-3	-4	-3	2	4
K	-1	2	0	-1	-3	1	1	-2	-1	-3	-2	5
M	-1	-1	-2	-3	-1	0	-2	-3	-2	1	2	-1	5
F	-2	-3	-3	-3	-2	-3	-3	-3	-1	0	0	-3	0	6
P	-1	-2	-2	-1	-3	-1	-1	-2	-2	-3	-3	-1	-2	-4	7
S	1	-1	1	0	-1	0	0	0	-1	-2	-2	0	-1	-2	-1	4
T	0	-1	0	-1	-1	-1	-1	-2	-2	-1	-1	-1	-1	-2	-1	1	5
w	-3	-3	-4	-4	-2	-2	-3	-2	-2	-3	-2	-3	-1	1	-4	-3	-2	11
Y	-2	-2	-2	-3	-2	-1	-2	-3	2	-1	-1	-2	-1	-3	-3	-2	-2	2	7
V	0	-3	-3	-3	-1	-2	-2	-3	-3	3	1	-2	1	-1	-2	-2	0	-3	-1 4

Identyczność sekwencji cząsteczek polinukleotydowych określa się podobnie używając opisanego powyżej stosunku.

Warianty polipeptydu Zcyto10 lub w zasadzie identyczne białka i polipeptydy określa się jako posiadające jedno albo więcej podstawień aminokwasowych, delecji albo addycji. Korzystnie zmiany takie mają mniejsze znaczenie, na przykład konserwatywne podstawienia aminokwasowe (patrz tabela 2) i inne podstawienia aminokwasowe, które nie wpływają znacząco na składanie albo aktywność białka albo polipeptydu; małe delecje, typowo jednego do około 30 aminokwasów; i małe addycje na aminowym albo karboksylowym końcu, takie jak dodanie reszty metioniny na końcu aminowym, mały peptyd łącznikowy o wielkości do około 20-25 reszt aminokwasowych, lub małe rozszerzenie, które

PL 198 687 B1 ułatwia oczyszczanie (znacznik powinowactwa), takie jak polihistydyna, białko A, (Nilsson i wsp., EMBO J. 4: 1075 (1985), Nilsson i wsp., Methods Enzymol. 198: 3 (1991)), S-transferaza glutationowa (Smith i Johnson, Gene 67: 31 (1988)) lub inny antygenowy epitop albo domenę wiążącą. Patrz, Ford i wsp., Protein Expression and Purification 2: 95-107 (1991). DNA koduj ą ce znaczniki powinowactwa są dostępne w handlu (na przykład, Pharmacia Biotech, Piscata-way, NJ).

T a b e l a 2

Konserwatywne podstawienia aminokwasowe

Zasadowe:	arginina Lizyna histydyna
Kwasowe:	kwas glutaminowy kwas asparaginowy
Polarne:	glutamina asparagina
Hydrofobowe:	leucyna izoleucyna walina
Aromatyczne:	fenyloalanina tryptofan tyrozyna
Małe:	glicyna alanina seryna treonina metionina

Dostarczane są różne polipeptydy połączone (i odpowiednie multimeryczne białka zawierające jeden albo więcej połączonych polipeptydów). Na przykład, polipeptyd Zcyto10 wytwarza się jako polipeptyd połączony z białkiem tworzącym dimery, tak jak opisane w Dokumentach patentowych Stanów Zjednoczonych Nr 5155027 i 5567584. Korzystne pod tym względem białka tworzące dimery obejmują domeny regionu stałego przeciwciała. Polipeptydy połączone immunoglobulina-Zcyto10 wytwarza się w genetycznie zmienionych komórkach (w celu wytworzenia róż nych multimerycznych analogów polipeptydu Zcyto10). Dodatkowe domeny łączy się z polipeptydami Zcyto10 w celu skierowania ich do specyficznych komórek, tkanek, lub makrocząsteczek (na przykład kolagenu). Na przykład, polipeptyd lub białko Zcyto10 można skierować do wybranej komórki przez połączenie tego polipeptydu z ligandem, który specyficznie wiąże się z receptorem na powierzchni komórki docelowej. W ten sposób, można kierować polipeptydy i białka w celach terapeutycznych albo diagnostycznych. Polipeptyd Zcyto10 można połączyć z dwoma albo więcej domenami, takimi jak znacznik powinowactwa w celu łatwego oczyszczania i domena kierująca. Polipeptydy połączone mogą też zawierać jedno albo więcej miejsc cięcia, szczególnie między domenami. Patrz, Tuan i wsp., Connective Tissue Research 34: 1-9 (1996).

Białka wytworzone w ten sposób, że mogą też zawierać nie występujące w naturze reszty aminokwasowe.

Nie występujące w naturze reszty aminokwasowe obejmują, ale bez ograniczania, trans-3-metyloprolinę, 2,4-metanoprolinę, cis-4-hydroksyprolinę, trans-4-hydroksyprolinę, N-metyloglycinę, allotreoninę, metylothreoninę, hydroksyetylocysteinę, hydroksyetylohomocysteinę, nitroglutaminę, homoglutaminę, kwas pipekolinowy, kwas tiazolidynokarboksylowy, dehydroprolinę, 3- i 4-metyloprolinę, 3,3-dimetyloprolinę, tert-leucynę, norwalinę, 2-azafenyloalaninę, 3-azafenyloalaninę, 4-azafenyloalaninę, i 4-fluorophenyloalaninę. W sztuce znanych jest kilka sposobów włączania do białek nie występujących w naturze reszt aminokwasowych.

Na przykład, wykorzystuje się system in vitro w którym mutacje typu nonsens znoszone są dzięki użyciu chemicznie aminoacylowanego supresorowego tRNA. Sposoby syntetyzowania aminokwasów i aminoacylowanego tRNA są znane w sztuce. Istotne aminokwasy w polipeptydzie wytworzonym sposobem według wynalazku identyfikuje się stosownie do sposobów znanych w sztuce, takich jak ukierunkowana miejscowo mutageneza albo mutageneza z wyszukiwaniem alaniny (Cunningham i Wells, Science 244: 1081-1085 (1989); Bass i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502 (1991)).

PL 198 687 B1

W tej drugiej technice, w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych, które są krytyczne dla aktywności cząsteczki, przy każdej reszcie aminokwasowej tej cząsteczki wprowadza się pojedynczą mutację powodującą wstawienie alaniny, a powstające zmutowane cząsteczki białka bada się pod kątem aktywności biologicznej (na przykład wiązanie ligandu i przekazywanie sygnałów). Miejsce oddziaływania białko-ligand określa się przez analizę budowy krystalicznej tego białka, takimi technikami jak jądrowy rezonans magnetyczny, krystalografia albo znakowanie fotopowinowactwa. Patrz, na przykład, de VOS i wsp., Science 255: 306-312 (1992); Smith i wsp., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992); Wlodaver i wsp., FEBS Lett. 309: 59-64 (1992). Położenie istotnych aminokwasów można też wywnioskować na podstawie analizy homologii z odpowiednimi białkami.

Znanymi sposobami mutagenezy można wprowadzić do polipeptydu wielokrotne podstawienia aminokwasowe i zbadać powstający polipeptyd znanymi sposobami badań przesiewowych, takimi jak opisane przez Reidhaar-Olson i Sauer, Science 241: 53-57 (1988) albo Bowie i Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 2152-2156 (1989). Autorzy ci opisują sposoby równoczesnej losowej mutagenezy dwu albo więcej w pozycji w polipeptydzie, wybierania funkcjonalnego polipeptydu, i sekwencjonowania zmutowanego polipeptydu w celu określenia zakresu dopuszczalnych podstawień w każdej pozycji. Inne sposoby których można użyć obejmują obrazowanie za pomocą bakteriofagów (na przykład Lowman i wsp., Biochem. 30: 10832-10837 (1991); Ladner i wsp.,

Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5223409; Huse, WIPO Publikacja WO 92/06204) i ukierunkowaną miejscowo mutagenezę , Derbyshire i wsp., Gene 46: 145 (1986); Ner i wsp., DNA 7: 127 (1988).

W celu wykrycia aktywnoś ci zklonowanych, zmutowanych biał ek w komórkach gospodarza opisane powyżej sposoby mutagenezy łączy się z wysokowydajnymi sposobami badań przesiewowych. Korzystne pod tym względem testy obejmują, test namnażania komórek i test wiązania ligandu oparty na biosensorach, które są opisane poniżej. Zmutowane cząsteczki DNA, które kodują aktywne białka albo ich części (na przykład fragmenty wiążące ligand) odzyskuje się z komórek gospodarza i sekwencjonuje przy użyciu nowoczesnego wyposażenia. Sposoby te pozwalają na szybkie określenie znaczenia pojedynczej reszty aminokwasowej w interesującym polipeptydzie, i mogą być stosowane do polipeptydów nieznanej budowy.

Używając sposobów dyskutowanych powyżej, fachowiec może wytworzyć różne polipeptydy, które w zasadzie są identyczne z SEQ ID NO: 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 i 35 lub są ich allelowymi wariantami i zachowują własności białka typu dzikiego. Tak jak się tu używa i jest to zastrzeżone, określenie polinukleotyd zdefiniowany przez SEQ ID NO: 2 obejmuje wszystkie allelowe warianty i ortologi gatunkowe tego polipeptydu.

Polipeptydy białkowe opisane tutaj włączając białka pełnej długości, fragmenty białka (na przykład fragmenty wiążące ligand) i polipeptydy połączone wytwarza, się w genetycznie zmienionych komórkach gospodarza według tradycyjnych technik. Przydatnymi komórkami gospodarza są komórki, które można transformować lub transfekować obcym DNA i można je hodować w kulturze. Komórki takie obejmują bakterie, komórki grzybów, i nadające się do hodowli komórki wyższych organizmów eukariotycznych. Korzystne są komórki eukariotyczne, szczególnie, nadające się do hodowli komórki organizmów wielokomórkowych. Techniki manipulowania zklonowanymi cząsteczkami DNA i wprowadzania obcego DNA do różnych komórek gospodarza są opisane przez Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wydanie 2, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), i Ausubel i wsp., cytowane powyżej.

Sekwencja DNA, która koduje tak polipeptyd składa się z serii kodonów, każda reszta aminokwasowa polipeptydu kodowana jest przez kodon, a każdy kodon składa się z trzech nukleotydów. Reszty aminokwasowe są kodowane przez odpowiednie dla nich kodony.

Alanina (Ala) jest kodowana przez GCA, GCC, GCG albo GCT;

Cysteina (Cys) jest kodowana przez TGC albo TGT;

Kwas asparaginowy (Asp) jest kodowany przez GAC albo GAT;

Kwas glutaminowy (Glu) jest kodowany przez GAA albo GAG;

Fenyloalanina (Phe) jest kodowana przez TTC albo TTT;

Glicyna (Gly) jest kodowana przez GGA, GGC, GGG albo GGT;

Histydyna (His) jest kodowana przez CAC albo CAT;

Izoleucyna (Ile) jest kodowana przez ATA, ATC albo ATT;

Lizyna (Lys) jest kodowana przez AAA, lub AAG;

Leucyna (Leu) jest kodowana przez TTA, TTG, CTA, CTC, CTG albo CTT;

PL 198 687 B1

Metionina (Met) jest kodowana przez ATG

Asparagina (Asn) jest kodowana przez AAC albo AAT;

Prolina (Pro) jest kodowana przez CCA, CCC, CCG albo CCT;

Glutamina (Gln) jest kodowana przez CAA albo CAG;

Arginina (Arg) jest kodowana przez AGA, AGG, CGA, CGC, CGG albo CGT;

Seryna (Ser) jest kodowana przez AGC, AGT, TCA, TCC, TCG albo TCT;

Treonina (Thr) jest kodowana przez ACA, ACC, ACG albo ACT;

Walina (Val) jest kodowana przez GTA, GTC, GTG albo GTT;

Tryptofan (Trp) jest kodowana przez TGG i

Tyrozyna (Tyr) jest kodowana przez TAC albo TAT.

Przyjmuje się stosownie do obecnego wynalazku, że kiedy zastrzeżone jest cDNA, tak jak opisano powyżej, to zastrzeżone są obie nici, nić sensowna i nić antysensowna, a dwuniciowy DNA zawiera nić sensowną i nić antysensowną, połączone odpowiednimi wiązaniami wodorowymi. Zastrzeżony jest też Informacyjny RNA (mRNA), który koduje polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku, i który jest kodowany przez opisany powyżej cDNA. Informacyjny RNA (mRNA) koduje polipeptyd wykorzystując te same kodony, które zdefiniowano powyżej, z jednym wyjątkiem, każdy nukleotyd tyminowy (T) zastąpiony jest przez nukleotyd uracylowy (U).

W ogóle, sekwencja DNA kodują ca polipeptyd Zcyto10 połączona jest funkcjonalnie z innymi genetycznymi elementami wymaganymi dla jego ekspresji. Ogólnie wektor do ekspresji zawiera region promotorowy i terminator transkrypcji. Wektor taki zwykle zawiera też jeden albo więcej markerów do selekcji i jeden albo więcej początków replikacji, chociaż biegli w sztuce wiedzą, że w pewnych systemach markera do selekcji dostarcza się na oddzielnych wektorach, a replikację obcego DNA uzyskuje się po integracji wektora do genomu komórki gospodarza. Wybór regionów promotorowych, terminatorów, markerów do selekcji, wektorów i inny elementów jest sprawą rutynową dla biegłych w sztuce. Wiele takich elementów opisywanych jest w literaturze i są one dostępne w handlu.

W celu skierowania polipeptydu Zcyto10 na drogę wydzielniczą komórki gospodarza, sekwencja sygnału wydzielniczego (znanego też jako sekwencja kierująca, sekwencja prepro lub sekwencja prę) wstawiana jest w wektor do ekspresji. Sekwencja sygnału wydzielniczego może pochodzić z danego białka, lub może pochodzić od innych wydzielanych białek (na przykład t-PA) albo może być zsyntetyzowana de novo. Sekwencję sygnału wydzielniczego łączy się z sekwencja DNA polipeptydu Zcyto10 zgodnie z ramką odczytu. Sekwencje sygnału wydzielniczego zwykle wstawia się w pozycji 5', w stosunku do sekwencja DNA kodującej interesujący polipeptyd, chociaż pewne sekwencje sygnałowe mogą być lokowane gdzie indziej w interesującej sekwencji DNA (patrz, na przykład Welch i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5037743; Holland i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 5143830).

Sposoby dla wprowadzania obcego DNA do ssaczej komórki gospodarza obejmują transfekcję za pomocą fosforanu wapniowego, Wigier i wsp., Cell 14: 725 (1978); Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, (1981); Graham i van der Eb, Virology 52: 456 (1973), elektroporację, Neumann i wsp., EMBO J. 1: 841-845 (1982), transfekcję za pomocą DEAE-dextranu, Ausubel i wsp., edytorzy, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), i transfekcję za pomocą liposomów, Hawley-Nelson i wsp., Focus 15: 73 (1993); Ciccarone i wsp., Focus 15: 60 (1993). Wytwarzanie zrekombinowanych polipeptydów w nadających się do hodowli komórkach ssaczych jest opisane, na przykład, przez Levinson i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4713339; Hagen i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4784950; Palmiter i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4579821; i Ringold, Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4656134. Odpowiednie, nadające się do hodowli komórki ssacze obejmują linie komórkowe COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham i wsp., J. Gen. Virol. 36: 59-72 (1977)) i komórki jajnika chomika chińskiego (na przykład CHO K1; ATCC No. CCL 61). Dodatkowo przydatne linie komórkowe są znane w sztuce i dostępne w publicznych bankach tkanek, takich jak American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Ogólnie, korzystne są regiony promotorowe dające silną transkrypcję, takie jak region promotorowy SV-40 albo cytomegalowirusa. Patrz, na przykład Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4956288. Inne przydatne regiony promotorowe obejmują region promotorowy genów metalotionein (Dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr 4579821 i 4601978 i główny późny region promotorowy adenowirusa.

PL 198 687 B1

W celu wybrania nadających się do hodowli komórek ssaczych, do których wprowadza się obcy DNA zwykle stosuje się selekcję za pomocą leków. Takie komórki zwykle określa się jako transfektanty. Komórki, które rosną w hodowli w obecności czynnika selekcyjnego i są zdolne do przekazywania interesującego genu swojemu potomstwu określa się jako stałe transfektanty''. Korzystnym markerem selekcyjnym jest gen kodujący oporność na antybiotyk neomycynę. Selekcję prowadzi się w obecności związków typu neomycyny, takich jak G-418. Systemów selekcji można też używać do zwiększenia poziomu ekspresji interesującego genu, proces taki określa się jako amplifikacja. Amplifikację prowadzi się przez hodowanie transfektantów w obecności niskiego stężenia czynnika selekcyjnego, a następnie zwiększenie stężenia czynnika selekcyjnego i wyselekcjonowanie komórek, które wytwarzają więcej produktu wprowadzanych genów. Korzystnym dla procesu amplifikacji markerem selekcyjnym jest reduktaza dihydrofolianowa, która nadaje oporność na metotreksat. Można też użyć innych genów, oporności na leki (na przykład genu oporności na higromycynę, genu oporności wielolekowej, genu acetylotransferazy puromycyny). W celu oddzielenia transfekowanych komórek od nietransfekowanych komórek przy użyciu sortera FACS lub rozdzielenia za pomocą mikrosfer magnetycznych, używa się alternatywnych markerów, takich jak powodujące zmianę fenotypu zielone fluorescencyjne białko, lub komórkowe białka błonowe, takie jak CD4, CD8, MHC klasy I lub łożyskowa fosfataza zasadowa.

Jako komórek gospodarza można używać także innych komórek wyższych eukariontów, włączając komórki owadów, komórki roślinne i komórki ptasie. Transformacja komórek owada i wytwarzanie w nich obcych polipeptydów jest opisana przez Guarino i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5162222; Bang i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4775624; i WIPO Publikacja WO 94/06463. Wykorzystanie Agrobacterium rhizogenes jako wektora do ekspresji genów w komórkach roślinnych było opisane przez Sinkar i wsp., J. Biosci. (Bangalore) 22: 47-58 (1987). Komórki owada zakaża się zrekombinowanym baculovirusem, zwykle wyprowadzonym od wirusa polyhedrozy jądra Autographa californica (AcNPV). Patrz, King, L.A. i Possee, R. D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London); O'Reilly, D.R. i wsp., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (University Press, New York, Oxford, 1994); i, Richardson, C.D., edytor, Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, (Humana Press, Totowa, NJ, 1995). Drugi sposób wytwarzania zrekombinowanych Zcyto10 baculowirusów wykorzystuje system oparty na transpozonie opisany przez Luckow, V., i wsp., J. Virol 67: 4566-79 (1993). Ten system wykorzystujący wektory przenoszące, jest sprzedawany jako zestaw Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). W celu wstawienia DNA kodującego polipeptyd Zcyto10 do genomu baculowirusa utrzymywanego w komórkach E. coli jako wielki plazmid nazwany bacmid, system ten wykorzystuje wektor przenoszący, pFastBac1¹⁸⁴ (Life Technologies) zawierający transposon Tn7. Patrz, HillPerkins, M.S. i Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971-6, (1990); Bonning, B.C. i wsp., J. Gen. Virol. 75: 1551-6 (1994); i, Chazenbalk, G.D. i Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543-9 (1995). Ponadto, wektory przenoszące mogą obejmować wstawiony zgodnie z ramką odczytu DNA kodujący znacznik epitopowy przy C- albo N-końcu wytwarzanego polipeptydu Zcyto10, na przykład, znacznik epitopowy GluGlu, Grussenmeyer, T. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4 (1985). Przy użyciu znanych w stanie techniki, przenoszenie wektora zawierającego Zcyto10 jest transformowane do komórek

E. coli, i komórki te można badać pod kątem występowania bacmidów, które zawierają przerwany gen lacZ, co świadczy o wbudowaniu zrekombinowanego baculowirusa. Następnie przy użyciu znanych technik izoluje się bacmid zawierający DNA genomu zrekombinowanego baculowirusa, i używa się go do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda, na przykład komórek Sf9. Następnie wytwarza się zrekombinowany wirus, który wytwarza polipeptyd Zcyto10. Zapas zrekombinowanego wirusa wytwarza się metodami znanymi w sztuce.

Zrekombinowanego wirusa używa się do zakażenia komórek gospodarza, typowo komórek linii wyprowadzonej od Spodoptera frugiperda. Patrz, Glick i Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C. (1994). Inną przydatną linią komórkową jest linia komórkowa High FiveO™ (Invitrogen) wyprowadzona z Trichoplusia ni (Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5300435). Do hodowli tych komórek używa się dostępnych w handlu podłóż bez surowicy. Dla komórek Sf9 przydatnym podłożem jest podłoże Sf900 II™ (Life Technologies) albo podłoże ESF 921™ (Expression Systems), a dla komórek T. ni podłoże Ex-cell0405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) lub podłoże Express FiveO™ (Life Technologies) dla komórki. Komórki hoduje się od zaszczepienia o gęstości w przybliżeniu 2-5 x 10⁵ komórek do gęstości 1-2 x 10⁶ komórek. Przy tej gęstości dodaje się zrekombinowanego wirusa przy wielokrotności

PL 198 687 B1 zakażania (MOI) od 0,1 do 10, typowo około 3. Używane procedury ogólnie opisane są w dostępnych podręcznikach laboratoryjnych (King, L. i Possee, R.D., cytowane powyżej O'Reilly, D.R. i wsp., cytowane powyżej Richardson, C.D., cytowane powyżej). Późniejsze czyszczanie polipeptydu Zcyto10 z nadsączu dokonywane jest za pomocą sposobów tu opisanych.

Komórki grzybów, włączając komórki drożdży, szczególnie komórki rodzaju Saccharomyces, też mogą być używane sposobem według wynalazku, na przykład do wytwarzania fragmentów białka lub połączonych polipeptydów. Sposoby transformowania komórek drożdży obcym DNA i wytwarzania zrekombinowanych polipeptydów są opisane przez, na przykład, Kawasaki, Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4599311; Kawasaki i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4931373; Brake, Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4870008; WeIch i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5037743; i Murray i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4845075. Transformowane komórki selekcjonuje się na podstawie fenotypu określonego przez marker selekcyjny, zwykle oporności na leki albo zdolności do wzrostu przy braku określonego składnika podłoża (na przykład leucyny). Korzystnym system wektorowym dla użycia w komórkach drożdży jest system wektorowy POT1 opisany przez Kawasaki i wsp. (Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4931373), który pozwala na selekcję transformowanych komórek dzięki zdolności do wzrostu na podłożu zawierającym glukozę. Odpowiednie dla użycia w komórkach drożdży regiony promotorowe i terminatory obejmują region promotorowy i terminator genów enzymów glikolitycznych (patrz, na przykład Kawasaki, Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4599311; Kingsman i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4615374; i Bitter, Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4977092) i genu dehydrogenazy alkoholowej. Patrz Dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr 4990446; 5063154; 5139936 i 4661454. W sztuce znane są także systemy transformacji komórek innych drożdży, włączając Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustllago maydls, Pichia pastoralis, Pichia methanolica, Pichia guillermondii i Candida maltosa. Patrz, na przykład Gleeson i wsp., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465 (1986) i Cregg, Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4882279. Można też wykorzystać komórki Aspergillus stosownie do sposobu opisanego przez McKnight i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4935349. Sposoby transformowania Acremonium chrysogenum są opisane przez Sumino i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5162228. Sposoby transformowania Neurospora są opisane przez Lambowitz, Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4486533.

Wykorzystanie komórek Pichia methanolica jako gospodarza w celu wytwarzania zrekombinowanych białek jest opisane w WIPO Publikacjach WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, i WO 98/02565. Cząsteczki DNA, którymi mają być transformowane komórki P. methanolica zwykle przygotowuje się jako dwuniciowe, kołowe plazmidy, które korzystnie linearyzuje się przed transformacją. Dla wytwarzania polipeptydów w P. methanolica, korzystnie jest, żeby region promotorowy i terminator plazmidu pochodził z genu P. methanolica, takiego jak gen wykorzystania alkoholu

P. methanolica (AUG1 lub AUG2). Inne użyteczne regiony promotorowe obejmują regiony promotorowe genu syntazy dihydroksyacetonu (DHAS), genu dehydrogenazy mrówczanowej (FMD) i genu katalazy (CAT). W celu ułatwienia integracji DNA do chromosomu komórki gospodarza, korzystnie jest jeżeli cały segment ekspresyjny w plazmidzie połączony jest z dwóch stron z sekwencjami DNA gospodarza. Korzystnym markerem selekcyjnym używanym w komórkach Pichia methanolica jest gen ADE2 P. methanolica, który koduje karboksylazę fosforybozylo-5-aminoimidazolu (AIRC; EC 4.1.1.21). Gen ten pozwala komórkom ade2 gospodarza rosnąć przy braku adeniny. W procesach przemysłowych na dużą skalę, w których pożądane jest zmniejszenie zużycia metanolu, korzystnie jest używać komórek gospodarza, w których usunięte są oba geny wykorzystania metanolu (AUG1 i AUG2). Do wytwarzania białek wydzielanych, korzystne są komórki gospodarza pozbawione genów proteaz wodniczkowych (PEP4 i PRB1). Dla ułatwienia wprowadzenia plazmidu zawierającego DNA kodującego interesujący polipeptyd do komórek P. methanolica używa się elektroporacji. Korzystnie jest transformować komórki P. methanolica metodą elektroporacji przy użyciu wykładniczo zanikającego, impulsu pola elektrycznego o napięciu od 2,5 do 4,5 kV/cm, korzystnie o napięciu około 3,75 kV/cm, i stałej czasowej (t) od 1 do 40 milisekund, najbardziej korzystnie około 20 milisekund.

Jako komórki gospodarza przydatne są też prokariotyczne komórki gospodarza, bakterii Escherich coli, 'Bacillus i inne rodzaje. Sposoby transformowania takich komórek gospodarza i uzyskiwania ekspresji sekwencji obcego DNA otrzymanego sposobem według wynalazku, są znane w sztuce (patrz, na przykład Sambrook i wsp., cytowane powyżej). Kiedy wytwarza się polipeptyd Zcyto10

PL 198 687 B1 w bakteriach takich jak E. coli, polipeptyd może znajdować się w cytoplazmie, typowo jako nierozpuszczalne ziarnistości, lub może być kierowany do przestrzeni periplazmatycznej przez bakteryjne sekwencje wydzielania. W pierwszym przypadku, komórki lizuje się i ziarnistości są odzyskiwane i denaturowane przy uż yciu, na przykł ad izotiocyjanianu guanidynowego lub mocznika. Zdenaturowany polipeptyd powtórnie się składa i wytwarza dimery po rozcieńczeniu związku denaturującego, na przykład przez dializę przeciw roztworowi mocznika i kombinacji zredukowanego i utlenionego glutationu, a następnie dializę przeciw zbuforowanemu roztworowi soli. W drugim przypadku, polipeptyd odzyskuje się z przestrzeni periplazmatycznej w rozpuszczalnej i funkcjonalnej formie, przez rozrywanie komórek (na przykład, przez sonikację albo wstrząs osmotyczny), wypuszczenie zawartości przestrzeni periplazmatycznej i odzyskanie białka. W ten sposób zapobiega się niepotrzebnej denaturacji ponownemu składaniu się białka.

Transformowane lub transfekowane komórki gospodarza hoduje się stosownie do konwencjonalnych metod w podłożu do hodowli zawierającym składniki odżywcze i inne składniki konieczne dla wzrostu wybranych komórek gospodarza. W sztuce znanych jest wiele przydatnych podłóż do hodowli, włączając podłoża do hodowli i złożone podłoża do hodowli. Ogólnie zawierają one źródło węgla, źródło azotu, istotne aminokwasy, witaminy i minerały. Jeśli jest to wymagane, podłoża do hodowli mogą też zawierać takie składniki, jak czynniki wzrostowe albo surowicę. Podłoże do hodowli powinno także pozwolić na selekcję komórek zawierających obcy DNA, na przykład, przez selekcję za pomocą leków albo brak istotnych składników odżywczych, który jest uzupełniany przez marker selekcyjny zawarty w wektorze do ekspresji albo innym wektorze transfekowanym do komórek gospodarza razem z wektorem do ekspresji. Komórki P. methanolica hoduje się w podł o żu zawierają cym odpowiednie źródła węgla, azotu i śladowe substancje odżywcze, w temperaturze od około 25°C do 35°C. Stosuje się płynne hodowle zawiesinowe z wystarczającym napowietrzaniem przez konwencjonalne środki, taki jak wytrząsanie w małych kolbkach albo fermentory rozpryskowe. Korzystne podłoże do hodowli

P. methanolica to podłoże YEPD (2% D-glukoza, 2% Bacto™ Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto™ wyciąg z drożdży (Difco Laboratories), 0,004% adenina i 0,006% L-leucina).

W jednym aspekcie sposobu wedł ug wynalazku nowe biał ko wytwarza się przez hodowanie komórek, a komórki te bada się pod kątem występowania receptora albo receptorów dla białka, włączając naturalny receptor, jak również agony i antagony naturalnego ligandu.

IZOLACJA BIAŁKA

Korzystnie jest oczyszczać polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku do czystości >80%, bardziej korzystnie do czystości >90%, najbardziej korzystnie do czystości >95%, a szczególnie korzystna jest forma czysta farmaceutycznie, która ma czystość większą niż 99,9% w odniesieniu do zanieczyszczeń spowodowanych przez makrocząsteczki, szczególnie inne białka i kwasy nukleinowe oraz jest wolna od związków infekcyjnych i gorączkotwórczych. Korzystnie, oczyszczony polipeptyd jest w zasadzie wolny od innych polipeptydów, szczególnie innych polipeptydów pochodzenia zwierzęcego.

Wytworzony sposobem według wynalazku zrekombinowany polipeptyd (albo polipeptyd chimerowy) oczyszcza się przy pomocy frakcjonowania i/lub konwencjonalnych sposobów i podłóż do czyszczenia. Do frakcjonowania próbek używa się strącania siarczanem amonowym i kwaśnej albo chaotropowej ekstrakcji. Przykładowe etapy oczyszczania obejmują chromatografię na hydroksyapatycie, chromatografię z wykluczeniem wielkości, chromatografię FPLC i wysokociśnieniową chromatografię cieczową w odwróconym układzie faz. Przydatne podłoża anionowymienne obejmują derywatyzowany dekstran, agarozę, celulozę, poliakrylamid, krzemionki i tym podobne. Korzystne są derywatyzowane podłoża PEI, DEAE, QAE i Q, a szczególnie korzystne jest podłoże DEAE Fast-Flow Sepfearose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Przykładowe podłoża chromatograficzne obejmują te podłoża derywatyzowane grupami fenyIową, butylową lub oktylową, takie jak Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i tym podobne; albo żywice poliakrylowe, takie jak Amberchrom CG 71 (Toso Haas) i tym podobne. Przydatne fazy stałe obejmują. na krzemionce, żywice celulozowe, perełki agarozowe, usieciowane perełki agarozowe, perełki polistyrenowe, usieciowane żywice poliakrylamidowe i tym podobne, pod warunkiem, że są nierozpuszczalne w warunkach w których mają być używane. Takie fazy stałe modyfikuje się grupami reaktywnymi, które pozwalają, na wiązanie białek przez grupy aminowe, grupy karboksylowe, grupy sulfhydryIowe, grupy hydroksylowe i/albo grupy węglowodanowe. Przykłady reakcji sprzęgania obejmują aktywację bromocyjnem, aktywację N-hydroksybursztynoimidem, aktywację epoksydem, aktywację sulfhydrylem, aktywację hydrazydem, i pochodnymi grupami karboksylowymi oraz aminowymi

PL 198 687 B1 w chemii sprzęgania karbodiimidu. Te i inne stałe podłoża są dobrze znane i szeroko używane w sztuce i są dostępne w handlu. Sposoby wiązania polipeptydów receptorów do fazy stałej są takż e dobrze znane w sztuce. Wybór poszczególnych metod jest sprawą rutynową, a wybrana metoda częściowo jest określona przez własności wybieranego podłoża. Patrz, na przykład, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnpiogy, Uppsala, Szwecja, 1988).

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku można wyizolować wykorzystując ich własności. Na przykład metodę chromatografii z adsorpcją na immobilizowanych jonach metali (IMAC) wykorzystuje się do oczyszczania białek bogatych w histydynę. Najpierw ładuje się żel dwuwartościowymi jonami metali i tworzy się chelat (E. Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7 (1985). Białka bogate w histydynę są adsorbowane na tej matrycy z różnym powinowactwem, w zależności od użytego jonu metalu. Białka takie można wymywać metodą wymywania konkurencyjnego, obniżając pH, lub używając silnych związków chelatujących. Inne sposoby oczyszczania obejmują oczyszczanie glikozylowanych białek metodą chromatografia powinowactwa z utyciem lektyny lub chromatografii jonowymiennej {Methods in Enzymol. Tom 182, Giude to Protein Purification, M. Deutscher, edytorzy), strony 529-539 (Acad. Press, San Diego, 1990. Alternatywnie, oczyszczanie może także ułatwić połączenie Interesującego polipeptydu i znacznika powinowactwa (na przykład, polyhistydyny, białkiem wiążącym maltozę lub domeną immunoglobuliny).

Zastosowania

Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku ma strukturę cytokiny typu wiązka czterech helis. Ma podstawie rozpuszczalności i zdolności działania przez komórkowe receptory powierzchniowe na drogę przekazywania sygnałów i modulowanie namnażania komórek, białko to ogólnie określa się jako cytokinę. Cytokiny dzieli się pod kątem trzeciorzędowej struktury składania na kilka klas: dimery bogate w cysteinę (na przykład insulina, PDGF), złożenie typu beta koniczyna (na przykład FGF, IL-1), i wiązka czterech alfa helis. Ostatnia klasa cechuje się występowaniem czterech helis, oznaczonych A, B, C i D, o unikatowej topologii typu góra-góra-dół-dół, przy czym dwie wystające pętle łączą helisy A i B i helisy C i D. Patrz, na przykład Manavalan i wsp., Journal of Protein Chemistry 11 (3): 321-31, (1992). Cytokiny typu wiązka czterech helis czasami dzieli się dodatkowo na krótkołańcuchowe (na przykład IL-4, IL-2, GM-CSF) i długołańcuchowe (na przykład TPO, hormon wzrostu, leptyna, IL-10). Druga grupa cechuje się ogólnie dłuższymi helisami A i D oraz dłuższymi wystającymi pętlami. Od tego miejsca terminu cytokina używa się jako synonimu terminu cytokina typu wiązka czterech helis. Helisa A Zcyto10 obejmuje reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 35, izoleucyna, do reszty aminokwasowej 49, izoleucyna, pokazane na SEQ ID NO: 14; helisa B obejmuje reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 91, leucyna, do reszty aminokwasowej 105, treonina, pokazane na SEQ ID NO: 15; helisa C obejmuje reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 112, leucyna, do reszty aminokwasowej 126, cysteina, pokazane na SEQ ID NO: 16; helisa D obejmuje reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 158, walina, do reszty aminokwasowej 172, metionina, pokazane na SEQ ID NO: 17.

Ludzki polipeptyd Zcyto10 posiada wewnątrzcząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe między Cys33 i Cys126. Przewiduje się także cztery inne cysteiny, Cys80, Cys132, Cys81 i Cys134, które tworzą dwa wewnątrzcząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe, w układzie Cys80-Cys132 i Cys81-Cys134. Przyjmuje się, że reszty Cys33, Cys126, Cys80, Cys132, Cys81 i Cys134 mają decydujące znaczenie dla strukturalnej stabilności Zcyto10. Mutacja którejkolwiek z tych reszt do jakiejkolwiek innej reszty powoduje zniesienie działania Zcyto10.

Stabilność strukturalna Zcyto10 jest też zależna od utrzymania wewnętrznej płaszczyzny hydrofobowej przez cztery alfa-helisy. Przyjmuje się, że reszty Ile42, Phe46, Ile49, Leu91, Val94, Phe95, Tyr98, Leu112, Phe116, Ile119, Leu123, Val158, Leu162, Leu165, Leu168, Leu169 i Met172 znajdują się wewnątrz rdzenia białka i jeżeli są zmienione, podstawiona reszta aminokwasowa musi być aminokwasem hydrofobowym.

Reszty biorące udział w wiązaniu Zcyto10 do receptora powierzchniowego komórki obejmują prawdopodobnie Asp57, na wystającej pętli między helisami A i B, Lys160 i Glu164, naładowane reszty, które prawdopodobnie są eksponowane na zewnętrznej powierzchni helisy D. Na powierzchni białka, w rejonie pętli AB i helisy D, znajduje się hydrofobowy zewnętrzny obszar zawierający reszty Ile62, Leu71, Ile167, i Trp171. Reszty te mogą oddziaływać z hydrofobowym zewnętrznym obszarem receptora powierzchniowego komórki.

Ludzki polieptyd Zcyto10 wytworzony sposobem wykazuje około 28% identyczności do interleukiny 10 (IL-10). Polipeptyd Zcyto10 myszy wykazuje w przybliżeniu 24% identyczności do ludzkiej IL-10

PL 198 687 B1 i około 27% identyczności do mysiej IL-10. Ludzki polipeptyd Zcyto10 wykazuje około 76% identyczności z mysim polipeptydem Zcyto10.

Helisa A mysiego polipeptydu Zcyto10 obejmuje reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 35, izoleucyna, do reszty aminokwasowej 49, arginina, SEQ ID NO:19, pokazane też na SEQ ID NO:21. Helisa B mysiego polipeptydu Zcyto10 obejmuje reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 91, leucyna, do reszty aminokwasowej 105, treonina, SEQ ID NO:19, pokazane też na SEQ ID NO: 22. Helisa C mysiego polipeptydu Zcyto10 obejmuje reszty aminokwasowe od reszty aminokwasowej 112, leucyna, do reszty aminokwasowej 126, cysteina, SEQ ID NO:19, pokazane też na SEQ ID NO: 23. Helisa D mysiego polipeptydu Zcyto10 obejmuje aminokwasowe od reszty aminokwasowej 158, walina, do reszty aminokwasowej 172, metionina, SEQ ID NO:19, pokazane też na SEQ ID NO: 24.

IL 10 jest cytokiną, która hamuje wytwarzanie innych cytokin, indukuje proliferację i różnicowanie aktywowanych limfocytów B, hamuje replikację wirusa HIV-1 i wykazuje antagonistyczne działanie w stosunku do gamma interferonu. Wydaje się, że IL 10 występuje jako dimer powstający z dwóch alfa-helikalnych regionów polipeptydowyeh zbliżonych przez rotację o 180°. Patrz, na przykład Zdanov i wsp., Structure: 3(6): 591-601 (1996). Wiadomo, że IL 10 jest wytwarzana przez aktywowane Th2 limfocyty T, limfocyty B, keratynopyty i monocyty/makrofagi, w celu modulowania odpowiedź Th1 limfocytów T. Modulacja ta może być realizowana przez zahamowanie syntezy cytokin przez Th1 limfocyty T. Patrz, na przykład Hus i wsp., Int. Immunol. 4: 563 (1992) i D'Andrea i wsp., J. Exp. Med. 178: 1042 (1992).

Wiadomo także, że IL 10 hamuje syntezę cytokin przez komórki naturalni zabójcy (NK) i monocyty/makrofagi. Patrz, na przykład Hus i wsp., cytowany powyżej i Fiorentino i wsp., J. Immunol. 146: 3444 (1991). Ponadto stwierdzono, że IL-10 me ochronne działanie w stanach cukrzycy insulinozale ż nej.

Podczas analizy tkankowo specyficznej ekspresji mRNA odpowiedniej dla tego nowego DNA, obserwuje się pojedynczy transkrypt o wielkości w przybliżeniu 1,2 kb. Przy użyciu Clontech Multiple Tissue Northerns, stwierdza się, że ludzki transkrypt występuje w tchawicy, łożysku, jądrach, skórze, gruczołach ślinowych, prostacie i tarczycy, mniejszą ekspresję obserwuje się w brzuchu i trzustce. Polipeptyd Zcyto10 był wytwarzany także w następujących tkankach myszy: nerka, mięśnie szkieletowe, gruczoły ślinowe, wątrobie i skórze.

Specyficzność tkankowa ekspresji polipeptydu Zcyto10 sugeruje że Zcyto10 może być czynnikiem wzrostowym i/albo czynnikiem podtrzymującym w tchawicy i gruczołach ślinowych, brzuchu, trzustce i mięśniach; może też brać udział w miejscowej odpowiedzi immunologicznej. Położenie genu Zcyto10 na chromosomie Iq32.2 wskazuje, że Zcyto10 jest czynnikiem wzrostu/różnicowania lub bierze udział w regulowaniu odpowiedzi immunologicznej, tak jak IL-10.

Sondy zawierającej Zcyto10 DNA lub RNA albo fragmenty ich sekwencji można używać do określenia, czy gen Zcyto10 jest obecny na chromosomie 1 albo jest zmutowany.

Polipeptyd Zcyto10 (występujący naturalnie lub rekombinowany), jego fragmenty, przeciwciała i anty-idiotypowe przeciwciała przeciw temu peptydowi, razem ze związkami, które wykazują powinowactwo do polipeptydu Zcyto10, powinny być użyteczne w leczeniu stanów chorobowych związanych z nienormalną fizjologią albo rozwojem, włączając nienormalną proliferację, na przykład stany rakowate lub stany zwyrodnieniowe albo zaburzenia odpowiedzi immunologicznej.

Przeciwciała przeciw polipeptydowi Zcyto10 oczyszcza się i wtedy można podać je pacjentowi. Odczynniki te można łączyć w celach terapeutycznych z innymi aktywnymi albo obojętnymi składnikami, na przykład z akceptowanymi farmaceutycznie nośnikami albo rozcieńczalnikami, razem z fizjologicznie nieszkodliwymi stabilizatorami i zaróbkami. Kombinacje takie jałowi się przez filtrowanie i umieszcza w pojemnikach do dawkowania, jako liofilizaty w pojemnikach do dawkowania lub przechowuje się w stabilizowanych preparatach wodnych. Sposobem według wynalazku rozpatruje się także zastosowanie przeciwciał, ich fragmentów wiążących albo jedno łańcuchowych przeciwciał w formach leku, które zawierają przeciwciała i które nie wiążą dopełniacza.

Ilości odczynników koniecznych dla efektywnej terapii zależą od wielu różnych czynników, włączając sposób podania, miejsce docelowe, fizjologiczny stan pacjenta i inne podawane leki. Dawkowanie powinno być dobrane pod kątem optymalizacji bezpieczeństwa i skuteczności. Typowo, dawkowanie używane in vitro stanowi podstawę wnioskowania o ilościach tych odczynników użytecznych do traktowania in vivo. Testy na zwierzętach, dla określenia efektywnych dawek w przypadku traktowania określonych stanów chorobowych dostarczają następnych wskazań dla dawkowania u ludzi. Sposoby podawania obejmują podawanie ustne, dożylne, otrzewnowe, śródmięśniowe, przezskórne

PL 198 687 B1 albo podawanie do płuca albo tchawica w formie do rozpylania, za pomocą rozpylacz albo rozpryskiwacza. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmują między innymi wodę, solankę i bufory. Wielkość dawki zwykle wynosi od 1 μg do 1000 μg na kilogram wagi ciała na dzień. Jednak, dawki mogą być wyższe albo niższe, jeżeli tak zdecyduje lekarz o zwykłej zręczności w sztuce. Pełny opis form leków i dawkowania zawarty jest w Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 wydanie, (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996), i Goodman i Gilman's: Pharmacological Bases of Therapeutics, 9 wydanie, (Pergamon Press 1996).

Leczenie oparte na kwasie nukleinowym

Jeżeli ssak posiada zmutowany gen Zcyto10 lub nie posiada tego genu, gen Zcyto10 można wprowadzić do komórek tego ssaka. W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, gen kodujący polipeptyd Zcyto10 wprowadza się in vivo za pomocą wirusowego wektora. Takie wektory obejmują atenuowane albo defektywne wirusowe DNA, takie jak, ale nie ograniczania, DNA wirusa opryszczki (HSV), wirusa brodawczaka, wirusa Epstein-Barra (EBV), adenowirusa, wirusa asocjowanego z adenowirusami (AAV) i tym podobne. Korzystne są defektywne wirusy, które całkowicie albo niemal całkowicie pozbawione są genów wirusowowych. Defektywny wirus nie jest infekcyjny po wprowadzeniu do komórki. Użycie defektywnych wirusowych wektorów pozwala na wprowadzenie DNA do komórek w specyficzny, zlokalizowany sposób, bez obawy, że zakazi się inne komórki. Przykłady określonych wektorów obejmują, ale nie są ograniczone do, defektywnego wektora opartego na wirusie opryszczki typu 1 (HSV1) (Kaplitt i wsp., Molec. Cell. Neurosci., 2: 320-330 (1991)), atenuowane wektory adenowirusowe, takie jak wektor opisany przez Stratford-Perricaudet i wsp., J. Clin. Inwest., 90: 626-630 (1992), i wektor oparty na defektywnych wirusach asocjowanych z adenowirusami (Samulski i wsp., J. Virol., 61: 3096-3101 (1987); Samulski i wsp. J. Virol., 63: 3022-3828 (1989)).

Gen wprowadza się w wektorze retrowirusowym, na przykład tak jak opisuje Andersen i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5399346; Mann i wsp., Cell, 33: 153 (1983); Temin i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4650764; Temin i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4980289; Markowitz i wsp., J. Virol., 62: 1120 (1988); Temin i wsp., Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5124263; Międzynarodowy dokument patentowy nr WO 95/07358, publikowany 16 marca, 1995 przez Dougherty i wsp., oraz Blood, 82: 845 (1993). Alternatywnie, wektor wprowadza się metodą lipofekcji in vivo przy użyciu liposomów. Do przygotowania liposomu dla transfekcji in vivo genu kodującego marker, używa się syntetycznych kationowych lipidów (Felgner i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987); Mackey i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027-8031 (1988)). Zastosowanie lipofekcji do wprowadzenia obcych genów do specyficznych organów in vivo ma pewne praktyczne zalety. Istotną korzyścią jest możliwość kierowania liposomów do specyficznych komórek. Ukierunkowana transfekcja określonych typów komórek jest bardzo korzystna. Ukierunkowana transfekcja określonych typów komórek jest szczególnie korzystna w tkankach składających się z różnorodnych komórek, takich jak trzustka, wątroba, nerka, i mózg. W celu ukierunkowania lipofekcji, lipidy sprzęga się chemicznie z innymi cząsteczkami. Z lipidami można sprzęgać chemicznie peptydy kierujące, na przykład hormony albo neurotransmitery, białka, takie jak przeciwciała, lub cząsteczki niepeptydowe. Liposomy takie można też podawać w formie do rozpylania do płuc albo tchawicy za pomocą rozpylacza albo rozpryskiwacza.

Można także usunąć komórki z ciała i wprowadzić do nich wektor w postaci nagiego plazmidowego DNA, a następnie ponownie wszczepić transformowane komórki do ciała pacjenta. Wektor w postaci nagiego DNA do celów terapii genowej wprowadza się do pożądanych komórek gospodarza sposobami znanymi w sztuce, na przykład za pomocą transfekcji, elektroporacji, mikroiniekcji, transdukcji, fuzji komórek, DEAE-dekstranu, strącania fosforanem wapniowym, metodami balistycznymi lub używa się wektora transportowego DNA (patrz, na przykład Wu i wsp., J. Biol. Chem., 267: 963-967 (1992); Wu i wsp., J. Biol. Chem., 263: 14621-14624 (1988)).

Zcyto10 polipeptydy używa się także do wytwarzania przeciwciał specyficznie wiążących polipeptyd Zcyto10. Takie przeciwciała mogą być następnie użyte do wytwarzania przeciwciał anty-idiotypowych. Użyty tu termin przeciwciała obejmuje poliklonalne przeciwciała, monoklonalne przeciwciała, ich fragmenty wiążące antygen, takie jak F(ab')2, fragmenty Fab i tym podobne, włączając przeciwciała genetycznie zmienione. Przyjmuje się, że przeciwciała specyficznie wiążą się z polipeptydem Zcyto10 jeżeli wiążą się z Ka większą niż albo równą 10⁷/M. Osoba o zwykłej zręczności w sztuce może łatwo określić powinowactwo przeciwciała monoklonalnego (patrz, na przykład Scatchard, cytowane powyżej).

PL 198 687 B1

Sposoby przygotowywania poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał są dobrze znane w sztuce (patrz na przykład, Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Drugie wydanie (Cold Spring Harbor, NY, 1989); i Hurrell, J.G.R., edytor., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982), który są tu włączone przez cytowanie).

Osoba o zwykłej zręczności w sztuce zdaje sobie sprawę, że poliklonalne przeciwciała można wytwarzać w wielu zwierzętach ciepłokrwistych, takich jak konie, krowy, kozy, owce, psy, kurczęta, króliki, myszy i szczury. Immunogenność polipeptydu Zcyto10 można zwiększyć przez zastosowanie adjuwanta, takiego jak pełny lub niepełny adjuwant Freunda. Biegli w sztuce znają wiele testów, które można wykorzystać do wykrycia przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem Zcyto10. Przykładowe testy opisane są szczegółowo w Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i Lane (edytorzy), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Przykładowe testy obejmują: zbieżną immunoelektroforezę, testy radioimmunologiczne, radioimmunoprecypitację, test immunosorbcyjny (ELISA), test hybrydyzacji metodą dot-blot, testy hamowania albo konkurencji, i test typu sandwicz.

Przeciwciał przeciw Zcyto10 używa się do znakowania komórek, które wytwarzają białko, w celu oczyszczania z wykorzystaniem powinowactwa, w testach diagnostycznych w celu określania poziomu cyrkulujących rozpuszczalnych polipeptydów białkowych, i jako antagony blokujące wiązanie ligandu i przekazywanie sygnał ów in vitro i in vivo.

W oparciu o niniejszy wynalazek można też utworzyć kompozycję farmaceutyczną zawierającą oczyszczony polipeptyd Zcyto10 w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką. Takie kompozycje są użyteczne w modulowaniu rozmnażania komórek, różnicowania komórek lub wytwarzania cytokin, w celu zapobiegania albo leczenia stanów chorobowych cechujących się niewłaściwym rozmnażaniem komórek, niewłaściwym różnicowaniem komórek lub niewłaściwym wytwarzaniem cytokin, jak będzie dalej dyskutowane. Ponadto, polipeptydy Zcyto10 wytworzone sposobem według wynalazku mogą być używane w aplikacjach specyficznych dla tchawicy albo tchawiczo-oskrzelowych, takich jak utrzymanie albo leczenie uszkodzeń nabłonka tchawiczo-oskrzelowego lub komórek podścieliska, w regulacji wytwarzania śluzu albo w usuwaniu resztek komórek rzęskowych albo w leczeniu astmy, zapalenia oskrzeli lub innych chorób dróg tchawiczo-oskrzelowych. Zakłada się, że polipeptyd Zcyto10 trzeba podawać w dawce wahającej się od dawki podobnej do dawek używanych dla konstruktu Zcyto10-Fc do dawek 100 razy większych, w zależności od stabilności polipeptydu Zcyto10. Dawki terapeutyczne ZcytolO znajdują się w zakresie od 5 do 5000 μg/kg/dzień. Polipeptyd Zcyto10, ulega silnej ekspresji w gruczołach ślinowych i tchawicy, został znaleziony w ślinie metodą Western błot. Gruczoły ślinowe syntetyzują i wydzielają pewną liczbę białek posiadających rozmaite funkcje biologiczne. Takie białka ułatwiają nawilżanie jamy ustnej (na przykład mucyna i białka bogate w prolinę), remineralizację (na przykład stateryna i jonowe białka bogate w prolinę) i trawienie (na przykład amylaza, lipaza i proteaza). Są także środkiem przeciw drobnoustrojom (na przykład białka bogate w prolinę, lizozym, histatyny i lactoperoksydaza) i zapewniają utrzymanie integralności śluzówki (na przykład mucyna). Ponadto, ślina jest bogatym źródłem czynników wzrostowych, syntetyzowanych przez gruczoły ślinowe. Na przykład ślina zawiera epidermalny czynnik wzrostowy (EGF), czynnik wzrostu nerwów (NGF), transformujący czynnik wzrostowy alfa (TGF-α), transformujący czynnik wzrostowy beta (TGF-β), insulinę, insulinopodobne czynniki wzrostowe I i II (IGF-I i IGF-II) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF). Patrz, na przykład, Zeiles i wsp., J. Dental. Res. 74 (12): 1826-32, 1995. Synteza czynników wzrostowych przez gruczoły ślinowe jest androgenozależna i jest konieczna dla zdrowia jamy ustnej i przewodu pokarmowego.

Polipeptydy Zcyto10, ich agony albo antagony mogą być użyteczne terapeutycznie w regeneracji przewodu pokarmowego albo jamy ustnej. W celu sprawdzenia tej zdolności polipeptydów Zcyto10, ich agonów albo antagonów wytworzonych sposobem według wynalazku, takie polipeptydy Zcyto10, ich agony albo antagony ocenia się pod kątem zdolności do rozkładania skrobi, stosownie do postępowań znanych w sztuce. Polipeptydy Zcyto10, ich agony albo antagony mogą być użyteczne w leczeniu astmy i inny chorób dróg tchawiczo-oskrzelowych, takich jak zapalenie oskrzeli tym podobne, dzięki oddziaływaniu na wzajemną regulację wzrostu, różnicowania i wytwarzania cytokin limfocytów Th1 i Th2 i innych komórkowych mediatorów stanów zapalnych, takich jak granulocyty eozynochłonne, komórki tuczne, leukocyty zasadochłonne, leukocyty obojętnochłonne i makrofagi. Polipeptydy Zcyto10, ich agony albo antagony mogą modulować toniczność dróg tchawiczo-oskrzelowych.

Polipeptydy Zcyto10 mogą być też używane do leczenia niektórych chorób skóry, na przykład egzema, łuszczyca, chorób suchej skóry lub używane do ochrony skóry, jako leki systemowe albo

PL 198 687 B1 miejscowe, wtedy podawane są w formie maści albo kremu. W celu leczenia atrofii mięśni u ludzi starych, chorych lub chronicznie leżących, polipeptyd Zcyto10 może być bezpośrednio wstrzykiwany do mięśni.

Mapowanie hybrydowe z wykorzystaniem promieniowania jest techniką genetyczna stosowaną w somatycznych komórkach, w celu utworzenia ciągłej mapy chromosomów o wysokiej rozdzielczości (Cox i wsp., Science 250: 245-250 (1990)). Częściowa albo pełna znajomość sekwencji genu pozwala na zaprojektowanie starterów PCR przydatnych dla otrzymania paneli techniką mapowania hybrydowego z wykorzystaniem promieniowania. W handlu są dostępne panele mapowania hybrydowego z wykorzystaniem promieniowania, pokrywające cały ludzki genom, takie jak Stanford G3 RH Panel i GeneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Panele te umożliwiają szybką, opartą na PCR, lokalizację chromosomową i określenie kolejności genów, miejsc sekwencji znacznikowych (STS) i innych niepolimorficznych i polimorficznych markerów, w interesującej badacza okolicy. W ten sposób można określić bezpośrednie, proporcjonalne fizyczne odległości między niedawno odkrytymi interesującymi genami i poprzednio znanymi markerami. Dokładna znajomość pozycji genu jest przydatna na wiele sposobów włączając: 1) określenie, czy sekwencja jest częścią istniejącego kontigu i uzyskanie dodatkowych, otaczających sekwencji genetycznych, w różnej formie, takiej jak klony YAC, BAC albo cDNA, 2) znalezienie potencjalnego genu odpowiedzialnego za dziedziczenie choroby, jeżeli wykazuje wiązanie do tej samej okolicy chromosomu i 3) dla referencyjnych modeli zwierzęcych, takich jak mysz, co może być korzystne w określeniu funkcji określonego genu.

Wyniki wskazują, że aby określić gen Zcyto10, mapuje się grupy wiązania 889.26 cR_3000 od początku ludzkiego chromosomu 1 na mapie hybrydowej z wykorzystaniem promieniowania WICGR. Najbliższym i końcowym markerem zrębu były D1S504 i WI-9641 (D1S2427), odpowiednio. Dzięki wykorzystaniu pozycji otaczających markerów można umiejscowić gen Zcyto10 w okolicy Iq32.2 na zintegrowanej mapie LDB chromosomu l (The Genetic Location Database, University Southhampton, WWW serwer:

http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/). W okolicy Iq32.2 chromosomu mapują się liczne geny. Mutacje w tej okolicy są przyczyną syndromu van der Woude, związanym ze zniekształceniem dolnej wargi, które czasami związane jest z rozszczepieniem podniebienia. Gen Zcyto10, który ulega ekspresji w gruczołach ślinowych, może być używany w terapii genowej tego syndromu. Jeżeli ssak ma zmutowany gen Zcyto10 lub cechuje się brakiem tego genu, gen Zcyto10 można wprowadzić do jego komórek.

Kompozycja może zawierać antysensowny polinukleotyd, który jest komplementarny do segmentów polinukleotydu pokazanych na SEQ ID NO: 1, 3, 18 i 33. Takie syntetyczne antysensowne oligonukleotydy są zaprojektowane w celu wiązania mRNA, kodującego polipeptydy Zcyto10 i hamowania translacji tego mRNA. Takie antysensowne oligonukleotydy są przydatne do hamowania ekspresji genów kodujących polipeptydy Zcyto10, w hodowlach komórkowych albo u pacjenta.

Do celów diagnostycznych można używać na przykład genu Zcyto10 sondy zawierającej Zcyto10 DNA lub RNA albo fragment ich sekwencji, w celu stwierdzenia czy gen Zcyto10 znajduje się na chromosomie 1, albo czy wystąpiła mutacja. Możliwe do wykrycia aberracje chromosomowe locus, genu Zcyto10 obejmują, ale bez ograniczenia, niewłaściwą liczbę chromosomów, zmianę liczby kopii genu, wstawienie, delecję, zmianę miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny i rearanżacje układu genów. Takie aberracje wykrywa się przy użyciu polinukleotydów wytworzonych sposobem według wynalazku, wykorzystując techniki genetyki molekularnej, takie jak analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), analiza krótkich, tandemowych sekwencji powtarzających się (STR), analiza techniką PCR, i inne techniki analizy powiązań genetycznych znane w sztuce [Sambrook i wsp., cytowane powyżej Ausubel i wsp., cytowane powyżej Marian, A. J. Chest, 108: 255-265, (1995)).

Biegli w sztuce wiedzą, że sekwencje opisane przez SEQ ID NO: 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 i 35 przedstawiają pojedyncze allele ludzkich i mysich genów Zcyto10 i polipeptydów, i że mogą występować allelowe warianty i warianty alternatywnego składania. Allelowe warianty klonuje się przez sondowanie cDNA lub biblioteki genomowego DNA, pochodzących od różnych osobników stosownie do standardowych postępowań. Sekwencje DNA allelowych wariantów pokazane na SEQ ID NO: 1, 3, 18 i 33 włączając te, które zawierają ciche mutacje i te, w których mutacje kończą się zmianą sekwencji aminokwasowej, wchodzą w zakres sposobu według wynalazku.

Sekwencja Zcyto10 ma 7 motywów niestabilności informacji w 3', nie ulegającym translacji regionie w pozycjach 706, 813, 855 i 906 SEQ ID NO: 1. Traktowanie komórek wytwarzających Zcyto10

PL 198 687 B1 cycloheksymidem może znieść tę niestabilność informacji. Patrz Shaw, G. i wsp., Cell 46: 659-667 (1986). Ponadto, w celu dalszego polepszenia stabilności informacji, bogaty w pary AT 3', nie ulegający translacji region można zmienić genetycznie albo usunąć.

UŻYCIE ZCYT010 W CELU UŁATWIENIA GOJENIA SIĘ RAN

Wyniki otrzymane w przykładzie 4 wskazują, że Zcyto10 odgrywa rolę w gojeniu się ran. Zcyto10 może być stosowany dla ułatwienia gojenia się ran albo oparzeń. Zctyo10 podaje się systemowo w dawkach od 1 do 100 μ g na kilogram wagi ciał a osobnika. Zcyto10 podaje się też do rany w formie balsamu albo maści, które zawierają od 1 ng do 1 mg Zcyto10 na gram balsamu lub maści. Patrz Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 wydanie, (Mack Publishing Co., Easton, Perm., 1996). W celu ułatwienia gojenia się ran Zcyto10 podaje się codziennie, na oczyszczoną ranę.

UŻYCIE ZCYT010 W CELU ZWIĘKSZENIA LICZBY PŁYTEK KRWI

Jak pokazano w przykładzie 7, że Zcyto10 może być używany do zwiększenia liczby płytek krwi.

To jest szczególnie ważne dla pacjentów chorych na nowotwory, którzy cechują się małopłytkowością spowodowaną przez chemioterapię albo radioterapię. Zcyto10 podaje się tym pacjentom w celach terapeutycznych wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

P r z y k ł a d 1 Klonowanie Zcyto10

Pełnej długości sekwencję zcyto10x1 (dłuższa forma) i zcyto10x2 (krótsza forma) określa się przy użyciu 3' RACE®, następnie sekwencjonuje się dwa otrzymane fragmenty (SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11) i poddaje je sztucznemu składaniu przez komputer. Najlepsza sekwencja pokazana jest na SEQ ID NO: 5 razem z zachodzącymi sekwencjami dwóch fragmentów 3' RACE.

Oligonukleotyd zc15907 (SEQ ID NO: 6) jest tak zaprojektowany, że łączy się z obszarem tuż powyżej (5') domniemanego kodonu metioniny dla zcyto10. Poniżej, inny oligonukleotyd, zc15906 (SEQ ID NO: 7), jest tak zaprojektowany, że łączy się z obszarem tuż powyżej miejsce cięcia sekwencji sygnałowej. Tych oligonukleotydów używa się w reakcji 3' RACE na ludzkim MARATHON cDNA z tchawicy. ZC15907 używa się w pierwotnej reakcji 3' RACE, a zc15906 uż ywa się w zagnieżdżanej reakcji 3' RACE. MARATHON cDNA otrzymuje się przy użyciu Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech, Palo Alto, CA) stosownie do instrukcji wytwórcy, wychodząc z mRNA, z ludzkiej tchawicy kupionej od Clontech.

Reakcje PCR prowadzi się stosownie do instrukcji wytwórcy w Marathon cDNA Amplification Kit, z niewielką zmianą parametrów cykli cieplnych. Parametry cykli używane w pierwotnej reakcji PCR są następujące:

94°C 1 minuta 30 sekund 1x

94°C 15 sekund 68°C 1 minuta 30x

72°C 7 min 1x

Parametry cykli używane w zagnieżdżanej reakcji PCR są następujące:

94°C 1 minuta 30 sekund 1x

94°C 15 sekund 68°C minuta 20 sekund 30x

72°C 7 min 1 x

Wytworzone produkty rozdziela się na 1,2% żelu agarozowym (Gibco agarose) i obserwuje się dwa główne prążki, o różnicy wielkości około 80 bp. Prążki te wycina się i oczyszcza z żelu używając żywicy QIAEX™ (Qiagen), zgodnie z zaleceniami wytwórcy. Następnie fragmenty te dosekwencjonuje się, co pozwala na otrzymanie pełnej długości sekwencji Zcyto10.

P r z y k ł a d 2

Analiza metodą Northern Blot

W celu określenia tkankowej dystrybucji Zcyto10 sonduje się bloty różnych ludzkich tkanek I, II, III i RNA Master Dot Blot (Clontech). Jako sondy używa się, antysensowny oligonukleotyd o wielkości 45-mer, SEQ ID NO: 9, który projektuje się wykorzystując sekwencję ( SEQ ID NO: 5 pary zasad, 100-145).

pm SEQ ID NO: 9 znakuje się na końcach izotopem ³²P za pomocą kinazy polinukleotydowej faga T4 (Gibco-BRL). Reakcja znakowania zawiera 2 μΐ 5X buforu do reakcji kinazy (Gibco-BRL), 1 μΐ kinazy faga T4, 15 pm SEQ ID NO: 9, 1 μl 6000Ci/mmol ³²P gamma-ATP (Amersham) i wodę do 10 gl. Mieszaninę reakcyjną inkubuje się 30 minut w temperaturze 37°C. Nie włączony izotop usuwa się za pomocą NucTrap Probe Purification Column (Stratagene). Bloty różnych ludzkich tkanek I, II, III i RNA

Master Dot Blot (Clontech) wstępnie hybrydyzuje się w temperaturze 50°C przez trzy godziny w 10 ml

ExpressHyb (Clontech), który zawiera 1 mg DNA spermy łososia i 0,3 mg DNA ludzkiego cot1 (Gibco-BRL). DNA gotuje się przez 3 minuty, wkłada do łani lodowej na 2 minuty i dodaje do ExpressHyb. HybrydyPL 198 687 B1 zację prowadzi się przez noc w temperaturze 50°C. Początkowe warunki płukania są następujące: 2X SSC, 0,1% SDS, temperatura pokojowa przez 40 minut z kilkoma zmianami roztworu do płukania. Następnie błony płucze się przez 30 minut w roztworze 1X SSC, 0,1% SDS w temperaturze 64°C (Tm-10). Filtry eksponuje się przez dwa dni.

Ekspresja Zcyto10 przejawiała się na blotach w postaci prążka o wielkości 1,2 kilopar zasad, który wykrywa się w tchawicy, słabego prążka o wielkości 1,5 kilopar zasad w brzuchu i bardzo słabych prążków o obu wielkościach w trzustce. Analiza metodą dot-blot wykazała obecność Zcyto10 w tchawicy, gruczoł ach ś linowych, ł o ż ysku, ją drach, skórze, prostacie, nadnerczach i tarczycy.

W myszach Zcyto10 znajduje się w nerkach, mięśniach szkieletowych, gruczoł ach ś linowych, wątrobie i skórze.

P r z y k ł a d 3

Przypisanie i rozmieszczenie Zcyto10 na chromosomie

Zcyto10 mapuje się na chromosomie 1 przy użyciu dostępnej w handlu wersja Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Stanford G3 RH Panel zawiera podatny na reakcję PCR DNA każdego z 83 klonów hybrydowych całego ludzkiego genomu, oraz dwu kontrolne DNA (RM dawcy i A3 biorcy). Publicznie dostępny WWW serwer ( http://shgc.www.stanford.edu) pozwala na lokalizację markerów chromosomowych.

W celu zmapowania Zcyto10 za pomocą Stanford G3 RH Panel, w 96-studzienkowych pł ytkach do PCR (Stratagene, La Jolla, CA) przygotowuje się reakcje PCR o objętości 20 μΐ i wykonuje reakcję PCR w termocyklerze RoboCycler Gradient 96 (Stratagene). Każda z 85 reakcji PCR zawiera 2 μl buforu do reakcji PCR KlenTaq 10X (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM każdego, PERKIN-ELMER, Foster City CA), 1 μl sensownego startera, SEQ ID NO: 6, 5' ATT CCT AGC TCC TGT GGT CTC GAG 3', 1 μl antysensownego startera, (SEQ ID NO: 8) 5' TCC CAA ATT GAG TGT CTT CAG T 3', 2 μ RediLoad (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,4 μl 50X Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA indywidualnego klonu hybrydowego lub klonu kontrolnego i x 1 μl ddH₂O do objętości całkowitej 20 μ. Reakcje pokrywa się równą ilością oleju mineralnego i zamyka. Warunki cykli reakcji PCR są następujące:

Początkowy 1 cykl 5 minut denaturacja w temperaturze 95°C, 35 cykli 1 minuta denaturacja w temperaturze 95°C, 1 minuta przyłączanie w temperaturze 66°C i 1,5 minuty wydłużanie w temperaturze 72°C, następnie końcowy 1 cykl wydłużanie 7 minut w temperaturze 72°C. Produkty reakcji rozdziela się metodą elektroforezy na 2% żelu agarozowym (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

Wyniki wskazują, że Zcyto10 wiąże się w okolicy markerów zrębu SHGC-36215 z wynikiem LOD >10 i przy odległości 14.67cR_10000 od markera. Dzięki wykorzystaniu pozycji otaczających markerów można umiejscowić gen Zcyto10 w okolicy Iq32.2, na zintegrowanej mapie LDB chromosomu 1 (The Genetic Location Database, University Southhampton, WWW serwer: http://cedar.genetics.ac.uk/public_html/).

P r z y k ł a d 4

Użycie Zcyto10 w celu ułatwienia gojenia się ran

W badaniach używa się normalnych, dorosłych samic myszy Balb/C Zwierzęta umieszcza się w zwierzętarni z 12 godzinnym cyklem dzień-noc. Podczas badania, wodę i karmę dla zwierząt laboratoryjnych podaje się ad libitum. Od dnia wykonania zabiegu zwierzęta trzyma się w klatkach pojedynczo.

W dniu zabiegu zwierzęta znieczula się za pomocą ketaminy (Vetalar, Aveco Inc. Ft. Dodge, IA) 104 mg/kg plus Xylazyna (Rompun, Mobey Corp., Shawnee, KS) 7 mg/kg w jałowym (za pomocą mikrofiltracji przez filtr 0,2 μm) roztworze soli buforowanym fosforanami (PBS) podanymi za pomocą śródotrzewnowego zastrzyku. Następnie spina się im włosy na plecach, depiluje skórę za pomocą NAIR® (Carter-Wallace, Nowy Jork, NY) i płucze się wodą. W celu przeciwdziałania zasadowym oparzeniom spowodowanym przez traktowanie NAIR®, stosuje się 100% żel aloe vera. Następnie zwierzęta umieszcza się na płytce, która jest podgrzewana za pomocą cyrkulującej łaźni wodnej w celu wysuszenia skóry i otaczającego futra.

Zwierzęta znieczula się metofanem (Pittman Moore, Mundelein, NJ) i depilowany grzbiet przemywa się 70% etanol. Następnie przez skórę i warstwę mięśni podskórnych robi się cztery wycięcia, każde o powierzchni 0,5 cm², ponad przykręgowym obszarem, na poziomie kręgów piersiolędźwiowych. Rany i otaczająca zdepilowaną skórę pokrywa się przylegającym, półprzepuszczalnym opatrunkiem zamykającym, BIOCLUSIVE® (Johnson & Johnson, Arlington, TX). W celu późniejszego oszacowania parametrów zamknięcia, nakładając opatrunek BIOCLUSIVE®, krawędź cięcia umieszcza się tak, żeby była widoczna przez octanową błonę opatrunku.

PL 198 687 B1

Skórę kontrolną i skórę zranioną obrabia się za pomocą Qiagen RNeasy Midi Kit, w różnych punktach czasowych (7 godzin, 15 godzin i 24 godziny). Skórę (kontrola i obszar zraniony) waży się i homogenizuje w odpowiedniej obję toś ci buforu do lizy (RLT). Lizaty odwirowuje się w celu usunię cia resztek tkanki. Następnie, do lizatu dodaje się równą objętości 70% etanolu, dobrze miesza i ładuje na kolumnę. Próbki odwirowuje się przez pięć minut i przemywa się 3,8 ml buforu RW1, a potem dwa razy z buforem RPE (2,5 ml każdy). Całkowity RNA wymywa się wodą wolną od RNazy. Poziom ekspresji Zcyto10 w próbkach skóry mierzy się używając PCR w czasie rzeczywistym (Perkin Elmer ABI Prism 7700 Sequence Detector).

Eksperyment wykonuje się z kontrolą pozbawioną matrycowego RNA, zestawem standardów i próbek skóry. Całkowity RNA z nerki myszy wykorzystuje się do zrobienia krzywej standardowej. W tym eksperymencie używa się trzech zestawów całkowitego RNA ze skóry (25 ng) 7 godzin (kontrolna i zraniona skóra), 15 godzin (kontrolna i zraniona skóra) i 24 godziny (kontrolna i zraniona skóra). Każdą próbkę bada się w trzech powtórzeniach zestawem One Step RT-PCR, przy użyciu detektora sekwencji 7700. W eksperymencie używa się wewnętrznego przedniego startera SEQ ID NO: 36, odwrotnego startera SEQ ID NO: 37, i sondy Perkin Elmer's TaqMan (ZG-7-FAM). Warunki One Step RT-PCR są następujące: (etap RT) 48°C przez 30 minut, (etap PCR 40 cykli) 95°C przez 10 minut, 95°C przez 15 sekund, 60°C przez 1 minutę.

Poziom ekspresji Zcyto10 w próbkach skóry kontrolnej w czasie 7 godzin i 15 godzin jest porównywalny, i wynosi odpowiednio 2,46 ng/ml i 2,61 ng/ml. Poziom ekspresji Zcyto10 w próbkach skóry kontrolnej w czasie 24 godziny był zerowy. Poziom ekspresji Zcyto10 w próbkach skóry rannej w czasie 7 godzin wynosi 5,17 ng/ml przyrost wię cej niż dwa razy w porównaniu ze próbkami kontrolnymi). Poziom ekspresji Zcyto10 w próbkach skóry rannej w czasie 15 godzin wynosi 14,45 ng/ml (przyrost 5,5-krotny w porównaniu z próbkami kontrolnymi). Poziom ekspresji Zcyto10 w próbkach skóry rannej w czasie 24 godziny wynosi 5,89 ng/ml. Powtórzony eksperyment, w którym włączono także kontrolę negatywną (tRNA drożdży) dał podobny wynik, a wynik dla tRNA drożdży był bliski zeru. Wynik ten sugeruje, że amplifikacja był prawdziwa i specyficzna dla myszy.

Dane te sugerują, że Zcyto10 odgrywa rolę w naprawie ran, ponieważ poziom jego ekspresji w rannej tkance ulega podwyższeniu w porównaniu do próbek kontrolnych. Ponadto poziom ten wzrastał i zmniejszał się w czasie. Zcyto10 może być stosowany w celu ułatwienia gojenia się ran.

P r z y k ł a d 5

Myszy transgeniczne

Wytwarza się myszy transgeniczne, które wytwarzają Zcyto10 pod kontrolą regionu promotorowego albuminy albo metalotioniny. Po urodzeniu, kilka myszy miało błyszczący wygląd i ograniczoną motorykę. Skóra tych myszy była ciasna i pomarszczone, kilka miało też wibrysy na dolnej wardze. Nozdrza i obszar ust, części dystalne i ogon były obrzmiałe.

Jedna transgeniczna mysz, w której użyto regionu promotorowego albuminy, przeżyła trzy dni i cechowała się silnym opóźnieniem wzrostu. Nie obserwowano rozwoju ucha, a palce u nogi był mniejsze. Zwierzęta zabito w dniach 1, 2 albo 3, kiedy były konające. Pobrano próbki ogona i wątroby i utrwalono in situ w 10% obojętnej formalinie, a następnie zatopiono w parafinie, pocięto na skrawki o gruboś ci 3 mikrometrach i wybarwiono H&E. Wszystkie myszy o tym fenotypie były transgeniczne i miał y niską lub wysoką ekspresję Zcyto10.

Nie obserwuje się żadnych znaczących zmian w większości tkanek poza skórą. Skóra noworodków wytwarzających Zcyto10, szczególnie tych myszy, które miały wysoki poziom ekspresji Zcyto10, wydaje się grubsza niż noworodków nie wytwarzających Zcyto10. Warstwa ziarnista tych noworodków wydawała się być mniejszej grubości w porównaniu noworodków nie wytwarzających Zcyto10, podczas gdy warstwa kolczasta naskórka była grubsza, co było spowodowane większą grubością warstw komórek i/albo większą średnicą komórek.

Oprócz zmian naskórka, skóra właściwa jednej myszy wykazującej średnią ekspresję Zcyto10 była ogniskowo, umiarkowanie rozszerzana przez materiał śluzowy.

P r z y k ł a d 6

Oczyszczanie Zcyto10 z podłoża do hodowli komórek

Zcyto10 wytwarzany przez komórki CHO izoluje się z podłoża do hodowli komórek, używając dwuetapowego sposobu obejmującego kationowymienną chromatografię i chromatografię sączenia molekularnego.

A. Etap chromatografii kationowymiennej

PL 198 687 B1

U ż yte materia ły

Kolumna (AMICON) o średnicy 2,2 cm (D) x i wysokości 6 cm (H) wypełniona żywicą kationowymiennąSP-650M, która jest żywicą jonowymienną TOYOPEARL, posiadającą związane kowalencyjnie grupy sulfopropylowe (SP).

Zbiera się piętnaście (15) litrów podłoża do hodowli z hodowli komórek zebranych z nerki chomika (BHK), które były transfekowane plazmidem zawierającym Zcyto10. pH podłoża do hodowli doprowadza się do pH 5 przy pomocy 2 N HCl. Opisaną powyżej kolumnę równoważy się 50 mM octanem sodowym, NaAc, o pH 5,0. Podłoże do hodowli ładuje się na kolumnę przy stosunku 20 objętości kolumny (cv)/hr przy przepływie w przybliżeniu 8 ml/min. Po naładowaniu kolumny, przemywa się ją 10 objętościami kolumny 50 mM NaAc, pH 5,0. Interesujący materiał wymywa się z kolumny 20 objętościami kolumny gradientu NaCl w 50 mM NaAc, pH 5,0. gradient NaCl wynosi od 0 do 0,5 M NaCl. Postępowanie takie zatęża materiał zawarty w wyjściowym podłożu do hodowli z 15 litrów do 170 ml.

Otrzymane 170 ml zatęża się dalej do około 5 ml, za pomocą koncentratora odśrodkowego z poziomem odcięcia 5 tysięcy (Millipore, Inc. Bedford, MA).

B. Etap sączenia molekularnego (S-100) na żelu

U ż yte materia ły

Kolumna S-100 1,6 cm (D) (średnica) x 6 cm (H) wysokość (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Otrzymany przesącz 5 ml ładuje się na opisywaną powyżej kolumnę zawierającą żel S-100. Wcześniej kolumnę równoważy się 5X roztworem soli, buforowanymi fosforanami doprowadza się pH kolumny do o 7,0. Zcyto10 izoluje się od zanieczyszczeń przy użyciu 1X PBS i szybkości przepływu

1,5 ml/min. Frakcje zbiera się co 2 ml. Polipeptyd Zcyto10 jest wymywany we frakcjach 52-64 po około 90 minutach od początku wymywania. Frakcje w których znajduje się Zcyto10 określa się za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w obecności soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS). Żel barwi się Coomassie Blue ii obserwuje się jeden prążek o przewidywanej masie cząsteczkowej około 14 kDa.

P r z y k ł a d 7

Klonowanie mysiego Zcyto10

Na MARATHON RACE™ cDNA, pochodzącym ze skóry myszy wykonuje się 5' i 3' RACE PCR przy użyciu startera PCR 5' MARATHON RACE™ (Clontech, Palo Alto, CA), opisanego na SEQ ID NO: 38, połączonego z adaptatorem MARATHON™ AP1, i zagnieżdżonego startera PCR opisanego na SEQ ID NO: 39 połączonego z adaptatorem MARATHON™ AP2 i 3' startera opisanego na SEQ ID NO: 40, połączonego z adaptatorem MARATHON™ AP1, i zagnieżdżonego startera PCR opisanego na SEQ ID NO: 41 połączonego z adaptatorem MARATHON™ AP2. Kilka fragmentów otrzymanych w tych reakcjach rozdziela się na żelu i sekwencjonuje. Pozwala to na znalezienie pełnej długości sekwencji kodującej mysiego Zcyto10, oraz fragmentów 5' i 3' UTR. Znaleziono dwa warianty mysiego Zcyto10, opisane na SEQ ID NO: 18 i 19 i SEQ ID NO: 33 i 34. Klony te namnaża się metodą PCR przy użyciu starterów opisanych na SEQ ID NO: 42 i 43.

P r z y k ł a d 8

Podawanie Zcyto10 do komórek normalnych myszy za pomocą adenowirusa

Zcyto10 podaje się za pomocą adenowirusa zawierającego gen Zcyto10. W doświadczeniu używa się trzech grup myszy opisanych poniżej. Adenowirus wstrzykuje się dożylnie samcom i samicom myszy C57B1/6. Wszystkie myszy otrzymują bromodezoksyurydynę (BrdU) w wodzie do picia 3 dni przed zabiciem. Pozwala to na wykrycie histologicznymi sposobami komórek namnażających się. Mierzone parametry obejmują zmianę wagi ciała, pełny obraz krwi, chemię surowicy, histologię, wagę organów i namnażanie się komórek, mierzone za pomocą włączania BrdU.

Projekt doświadczenia

Grupa 1 Zcyto10Xl (SEQ ID NO: 18)/pAC-CMV/AdV 1 x 10¹¹ cząsteczek/dawka (9 samic, 9 samców zabija się w dniu 21) (2 samice, 2 samce zabija się w dniu 11)

Liczba całkowita - 22 myszy.

Grupa 2 kontrola negatywna CMV/AdV x 10¹¹ cząsteczek/dawka (10 samic, 10 samców zabija się w dniu 21) (2 samice, 2 samce zabija się w dniu 11)

Liczba całkowita = 24 myszy.

PL 198 687 B1

Grupa 3 brak traktowania (5 samic, 5 samców)

Liczba całkowita = 10 myszy.

Wyniki

Najbardziej uderzającą obserwacją było stwierdzenie znacznego przyrostu liczby płytek krwi, który obserwowano u samic i samców myszy traktowanych Zcyto10-adenovirusem w porównaniu do kontroli, której podano pusty adenowirus. Jednocześnie u samców obserwuje się zmniejszenie hematokrytu i powiększenie wagi śledziony i wątroby. U samców obserwuje się także zmniejszenie wagi grasicy. W porównaniu do kontroli, samice traktowane Zcyto10-adenovirusem wykazywały znaczące zwiększenie liczby białych krwinek, głównie limfocytów i leukocytów obojętnochłonnych.

Wyniki te sugerują, że podawanie Zcyto10 wpływa na powstawanie krwinek, ale poza zwiększoną liczbą płytek krwi, którą stwierdzono u obu płci, działanie to jest specyficzne dla płci.

Stwierdza się także inne działanie:

Poziom glukozy we krwi samic był niższy w traktowanej grupie, natomiast w przypadku samców nie stwierdzono żadnych znaczących zmian.

Poziom azotu mocznikowego we krwi (BUN) był wyższy zarówno w grupie traktowanych samic jak i samców.

Poziom fosfatazy zasadowej we krwi samic był wyższy w traktowanej grupie, natomiast w przypadku samców nie stwierdzono żadnych znaczących zmian.

Liczba płytek krwi była wyższa zarówno w grupie traktowanych samic jak i samców.

Całkowita liczba białych krwinek we krwi samic była wyższa w traktowanej grupie, natomiast w przypadku samców nie stwierdzono żadnych znaczących zmian.

Claims

1. Zastosowanie polipeptydu, który jest w 80% identyczny z polipeptydem o sekwencji wybranej z grupy polipeptydów o sekwencji SEQ ID nr 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 i 35 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia choroby autoimmunologicznej.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobę lub stan wybiera się z grupy obejmującej immunozależną cukrzycę (IDDM), stwardnienie rozsiane i reumatoidalne zapalenie stawów.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobę lub stan wybiera się z grupy obejmującej raka w stanie wzrostu lub proliferacji komórek, astmę, zapalenie oskrzeli i małopłytkowość u pacjentów z rakiem wynikającej z kuracji chemioterapią lub naświetlaniem.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobę lub stan wybiera się z grupy obejmującej łuszczycę, egzemę i stan suchej skóry.