PL199419B1

PL199419B1 - Peptydy będące inhibitorami zapalenia wątroby C, kompozycja farmaceutyczna je zawierająca, ich zastosowanie, sposób wytwarzania i związki pośrednie

Info

Publication number: PL199419B1
Application number: PL346051A
Authority: PL
Inventors: Montse Llinas-Brunet; Murray D. Bailey; Dale Cameron; Elise Ghiro; Nathalie Goudreau; Marc-André Poupart; Jean Rancourt; Youla S. Tsantrizos
Original assignee: Boehringer Ingelheim Ltd
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-09
Publication date: 2008-09-30
Also published as: ID27784A; WO2000009558A1; HK1039947B; CZ2001515A3; UA73480C2; BR9912943A; KR100629791B1; EA200100229A1; CO5180537A1; HUP0104548A3; CA2336597C; AR022061A1; SK286846B6; BG64956B1; ZA200100972B; DK1105422T3; RS49819B; BG105230A; TR200100438T2; EE200100080A

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zwi azek o wzo- rze (I), w którym a oznacza 0 lub 1; b oznacza 0 lub 1: Y oznacza H lub C 1-6 alkil; B oznacza H, pochodn a acylow a lub pochodn a sulfonylow a; W oznacza hydroksyl lub N-podstawiony amino; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól lub ester, do zastosowania w leczeniu infekcji wiru- sem zapalenia w atroby C (HCV). PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są związki peptydowe, kompozycja je zawierająca, ich zastosowanie w leczeniu infekcji wirusem zapalenia wą troby C (HCV), a takż e sposób wytwarzania takich peptydów i zwią zki poś rednie.

Wirus zapalenia wątroby C (HCV) jest głównym czynnikiem etiologicznym potransfuzyjnego i nabytego w kontaktach społecznych zapalenia wątroby nie-A nie-B na ca łym świecie. Ocenia się, ż e ponad 150 milionów ludzi na całym świecie jest zakażonych wirusem. U wysokiego odsetka nosicieli zakażenie przechodzi w postać chroniczną i u wielu rozwija się przewlekła choroba wątroby, tzw. przewlekłe zapalenie wątroby C. U tej grupy występuje z kolei wysokie ryzyko poważnej choroby wątroby takiej jak marskość wątroby, rak wątrobowo-komórkowy i terminalna choroba wątroby prowadząca do śmierci.

Mechanizm, według którego HCV uzyskuje stabilność i powoduje częste występowanie przewlekłej choroby wątroby nie został dokładnie ustalony. Nie wiadomo, jak HCV oddziałuje z systemem immunologicznym gospodarza i unika jego działania. Ponadto, role komórkowej i humoralnej odpowiedzi immunologicznej w zabezpieczeniu przeciw infekcji HCV i chorobie pozostały jeszcze do ustalenia. Stwierdzono, że immunoglobuliny znajdują zastosowanie w profilaktyce związanego z transfuzją wirusowego zapalenia wątroby, jednakże Centrum Kontroli Choroby obecnie nie zaleca stosowania immunoglobulin do tego celu. Brak skutecznej ochronnej odpowiedzi immunologicznej hamuje rozwój szczepionki lub adekwatnych środków profilaktycznych po narażeniu, więc w najbliższym okresie nadzieje są związane z interwencją przeciwwirusową.

Przeprowadzono różne badania kliniczne w celu identyfikacji środków farmaceutycznych zdolnych do skutecznego leczenia infekcji HCV u pacjentów dotkniętych przewlekłym zapaleniem wątroby C. Te badania obejmowały zastosowanie interferonu alfa, pojedynczo i w połączeniu z innymi środkami przeciwwirusowymi. Takie badania wykazały, że znaczna liczba uczestników nie odpowiada na te terapie, a z tych, którzy odpowiadają korzystnie, u dużego odsetka wystąpił nawrót choroby po zakończeniu leczenia.

Aż do niedawna, interferon (IFN) był jedynym dostępnym lekiem o udowodnionych korzyściach, zatwierdzonym klinicznie dla pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby C. Jednakże stopień przedłużonej odpowiedzi jest niski, a leczenie interferonem wywołuje także poważne efekty uboczne (tj. retinopatię, zapalenie tarczycy, ostre zapalenie trzustki, depresję), które obniżają jakość życia leczonych pacjentów. Ostatnio zatwierdzono interferon w połączeniu z rybawiryną dla pacjentów nie odpowiadających na sam IFN. Jednakże, to leczenie skojarzone nie łagodzi efektów ubocznych powodowanych przez IFN.

Istnieje więc potrzeba zapewnienia skutecznych środków przeciwwirusowych do leczenia infekcji HCV, które przezwyciężą ograniczenia istniejących terapii farmaceutycznych.

HCV jest wirusem otoczkowym o zgodnej nici RNA z rodziny Flaviviridae. Pojedyncza nić RNA genomu HCV ma w przybliżeniu 9500 nukleotydów długości i pojedynczą otwartą ramkę odczytu (ORF) kodującą pojedynczy duży polipeptyd składający się z około 3000 aminokwasów. W zakażonych komórkach, ten polipeptyd jest przecinany w wielu miejscach przez komórkowe i wirusowe proteazy, z wytworzeniem białek strukturalnych i niestrukturalnych (NS). W przypadku HCV, dojrzałe białka niestrukturalne (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B) tworzą dwie wirusowe proteazy. Pierwsza, jeszcze słabo scharakteryzowana, rozszczepia połączenie NS2-NS3; druga jest proteazą serynową zawartą w N-końcowym obszarze NS3 (w dalszej części opisu zwana proteazą NS3) i pośredniczy we wszystkich późniejszych rozszczepieniach wewnątrz łańcucha NS3, zarówno w cis, w miejscu rozerwania NS3-NS4A, jak i w trans, dla pozostał ych miejsc NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. Wydaje się, że białko NS4A ma liczne funkcje, działa jako kofaktor dla proteazy NS3 i prawdopodobnie wspiera lokalizację na bł onie NS3 i innych skł adników replikacji wirusa. Powstawanie kompleksu białka NS3 z NS4A wydaje się być konieczne do procesów obróbki, wzmacniając wydajność proteolityczną we wszystkich miejscach. Białko NS3 także wykazuje aktywności trifosfatazy nukleozydowej i helikazy RNA. NS5B jest zależną od RNA polimerazą RNA, która jest zaangażowana w replikację HCV.

Ogólna strategia opracowywania środków przeciwwirusowych polega na inaktywowaniu zakodowanych w wirusie enzymów, które mają zasadnicze znaczenie dla replikacji wirusa. W oparciu o powyż sze, opis patentowy nr W097/06804 ujawnia enancjomer (-) analogu nukleozydu cytozyno-1,3-oksatiolanu (także znanego jako 3TC) jako aktywnego środka przeciw HCV. W przypadku tego

PL 199 419 B1 związku, chociaż był on bezpieczny zgodnie z poprzednimi próbami klinicznymi wobec HIV i HBV, powinno się jeszcze klinicznie udowodnić jego aktywność przeciw HCV i zgłosić jego mechanizm działania przeciw wirusowi.

Intensywne wysiłki zmierzające do znalezienia związków, które hamują proteazę NS3 lub helikazę RNA HCV doprowadziły do następujących ujawnień:

Opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5633388 ujawnia heterocykliczne podstawione karboksyamidy i analogi jako aktywne wobec HCV. Te związki są ukierunkowane przeciw aktywności helikazy białka NS3 wirusa, ale kliniczne testy nie zostały jeszcze zgłoszone.

Chu i in. badali fenantrenochinon (Tet. Lett., (1996), 7229-7232), który ma wykazywać aktywność wobec proteazy NS3 HCV in vitro. Brak dalszych opracowań dla tego związku.

Praca przedstawiona na Dziewiątej Międzynarodowej Konferencji na temat Badań Przeciwwirusowych, w Urabandai, Fukyshima, Japonia (1996) (Antiviral Research, (1996), 30, 1, A23 (skrót 19)) przedstawia pochodne tiazolidyny jako inhibitory proteazy HCV.

Kilka badań dotyczyło związków hamujących inne proteazy serynowe, takie jak elastaza ludzkich leukocytów. Jedną rodzinę tych związków ujawniono w opisie patentowym nr WO95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995). Peptydy ujawnione w tym zgłoszeniu są analogami morfolinylokarbonylobenzoilo-peptydu, które różnią się budową od peptydów według niniejszego wynalazku.

Opis patentowy nr WO98/17679 od Vertex Pharmaceuticals Inc. ujawnia inhibitory proteazy serynowej, szczególnie, proteazy wirusa NS3 zapalenia wątroby C. Te inhibitory są analogami peptydów na bazie naturalnego substratu NS5A/5B. Zasadniczą cechą wszystkich tych peptydów jest to, że zawierają C-końcową, aktywowaną karbonylową grupę funkcyjną. Stwierdzono także, że te peptydy są aktywne wobec innej proteazy serynowej i zatem nie są specyficzne dla proteazy NS3 HCV.

Hoffman LaRoche opublikował także heksapeptydy, które są inhibitorami proteinazy przydatnymi jako środki przeciwwirusowe do leczenia infekcji HCV. Te peptydy zawierają aldehyd lub kwas boronowy na C-końcu.

Steinkuhler i in. oraz Ingallinella i in. opublikowali produkt inhibicji odszczepiania na N-końcu (Biochemistry (1998), 37, 8899-8905 i 8906-8914). Jednakże, przedstawione peptydy i analogi peptydów nie obejmują, ani nie prowadzą do peptydów według niniejszego wynalazku.

Opis patentowy nr WO98/46597 od Emory University ujawnia inhibitory proteazy serynowej, szczególnie proteazy wirusa zapalenia wątroby C. Wszystkie ujawnione związki różnią się budową od peptydów według niniejszego wynalazku.

Opis patentowy nr WO98/46630 od Peptide Therapeutics Ltd. ujawnia inhibitory proteazy NS3 zapalenia wątroby C. Jednakże, żaden spośród ujawnionych peptydów nie wykazuje pokrewieństwa do peptydów według wynalazku.

Japoński opis patentowy nr 10298151 od Japan Energy Corp. ujawnia N-(2,3-dihydroksybenzoilo)-podstawione pochodne seryny będące inhibitorami proteazy serynowej, specyficznie inhibitorami proteazy wirusa zapalenia wątroby C. Te związki nie wykazują żadnego podobieństwa w budowie do analogów peptydów według niniejszego wynalazku.

Jedną z korzyści niniejszego wynalazku jest to, że ujawnia on peptydy, które są inhibitorami proteazy NS3 wirusa zapalenia wątroby C.

Kolejna korzyść zgodnie z jednym aspektem niniejszego wynalazku opiera się na fakcie, że te peptydy specyficznie hamują proteazę NS3 i nie wykazują znaczącej aktywności hamowania w stężeniach do 300 μΜ wobec innych proteaz serynowych takich jak elastaza ludzkich leukocytów (HLE), świńska elastaza trzustkowa (PPE) lub bydlęca trzustkowa chymotrypsyna lub proteazy cysteinowe takie jak katepsyna B (Cat B) ludzkiej wątroby.

Wynalazek obejmuje związek, w tym jego racematy, diastereoizomery i izomery optyczne, o wzorze (I)

PL 199 419 B1 w którym a oznacza 0 lub 1; b oznacza 0 lub 1; Y oznacza H lub C1-6alkil;

B oznacza H, pochodną acylową o wzorze R7-C(O)- lub sulfonyl o wzorze R7-SO2, w których

R7 oznacza (i) C1-10alkil ewentualnie podstawiony przez karboksyl, C1-6alkanoiloksyl lub C1-6alkoksyl;

(ii) C3-7cykloalkil ewentualnie podstawiony przez karboksyl, (C1-6alkoksy)karbonyl lub fenylometoksykarbonyl;

(iii) C6 lub C10aryl, lub C7-16aryloalkil ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil, hydroksyl lub amino ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil; lub (iv) Het ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil, hydroksyl, amino ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil lub amido ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil; gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-członowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 lub 2 atomy N;

R6 oznacza C1-6alkil podstawiony przez karboksyl;

R5 oznacza C1-6alkil ewentualnie podstawiony przez karboksyl;

R4 oznacza C1-6alkil, C3-7cykloalkil lub C4-10(alkilocykloalkil);

R3 oznacza C1-10alkil, C3-7cykloalkil lub C4-10(alkilocykloalkil);

R2 oznacza CH2-R20, NH-R20, O-R20 lub S-R20, w których

R20 oznacza nasycony lub nienasycony C3-7cykloalkil lub C4-10(alkilocykloalkil), ewentualnie mono-, di- lub tri-podstawiony przez R21, lub R20 oznacza C6 lub C10aryl, lub C7-16garyloalkil ewentualnie mono-, di- lub tri-podstawiony przez R21, lub R20 oznacza Het lub (C1-6alkil)-Het ewentualnie mono-, di- lub tri-podstawiony przez R21, gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny zawierający 1 atom azotu lub 10-członowy bicykliczny heterocykl zawierający 1 do 4 atomów azotu;

przy czym każdy R21 oznacza niezależnie C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino, ewentualnie mono-lub di-podstawiony przez C1-6alkil; sulfonyl; NO2; OH; SH; atom chlorowca; chlorowcoalkil; amido ewentualnie mono-podstawiony przez C1-6alkil, C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil, Het lub (C1-6alkil)-Het; karboksyl; karboksy(C1-6alkil); C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil lub Het, gdzie Het jest w każdym wypadku niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksylu; wymieniony aryl, aryloalkil lub Het są ewentualnie podstawione przez R22;

przy czym R22 oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino ewentualnie mono- lub di-podstawiony przez C1-6aikil; sulfonyl; NO2; OH; SH; atom chlorowca; chlorowcoalkil; karboksyl; amid lub (C1-6alkilo)amid;

R1 oznacza C1-6alkil lub C2-6alkenyl, ewentualnie podstawiony przez atom chlorowca; i W oznacza hydroksyl lub N-podstawiony amino;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól lub ester, z ograniczeniem, że wzór I nie obejmuje związku, w którym B oznacza acetyl, a i b oznaczają 0,

P4 oznacza aminokwas cykloheksyloglicynę (Chg);

P3 oznacza aminokwas walinę (Val);

P2 oznacza benzyloksy (O-Bn);

P1 oznacza racemiczną grupę o wzorze ο

i W oznacza OH.

Korzystnie, wynalazek obejmuje związek o wzorze I zdefiniowany powyżej, w którym B oznacza H lub pochodną acylową o wzorze R7C(O)-, w którym R7 oznacza C1-6alkil;

C1-6alkoksyl; C3-7cykloalkil ewentualnie podstawiony przez hydroksyl; amido ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil lub Het; C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil lub Het, wszystkie ewentualnie podstawione przez C1-6alkil lub hydroksyl, gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-członowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 lub 2 atomy N.

Wymieniony Het jest korzystnie wybrany z grupy obejmującej:

PL 199 419 B1

bardziej korzystnie B oznacza acetyl.

W kolejnej korzystnej odmianie przedmiotem wynalazku jest zwią zek o wzorze I zdefiniowany powyżej, w którym B oznacza R7-SO2 i R7 oznacza C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil lub Het, wszystkie ewentualnie podstawione przez C1-6alkil, przy czym Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-członowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 lub 2 atomy N.

W jednej z odmian wynalazku R6, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny Asp lub Glu, korzystnie Asp.

W innej odmianie wynalazku a oznacza 0 i wówczas R6 nie występuje.

W korzystnej odmianie wynalazku R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny aminokwasu wybranego z grupy obejmującej: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-tert-butyloglicynę (Tbg) i L-Tbg, korzystnie D-Asp, D-Val lub D-Glu, najbardziej korzystnie D-Glu.

W innej korzystnej odmianie wynalazku R4 oznacza łańcuch boczny aminokwasu wybranego z grupy obejmują cej: Val, cykloheksyloglicynę (Chg), Tbg, Ile lub Leu, korzysstnie Chg lub Ile, najbardziej korzystnie Chg.

Zgodnie z wynalazkiem korzystnym wariantem jest związek o wzorze I zdefiniowany powyżej, w którym Y oznacza H lub Me, korzystnie H.

Korzystny jest ponadto związek, w którym którym R3 oznacza łańcuch boczny aminokwasu wybranego z grupy obejmującej: Ile, Chg, Val lub Tbg, korzystnie Val, Chg lub Tbg, najbardziej korzystnie Val lub Tbg.

W korzystnej odmianie wynalazku R2 oznacza S-R20, O-R20, w których R20 oznacza C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil, Het lub -CH2-Het, wszystkie ewentualnie mono-, di- lub tri-podstawione przez R21, gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny zawierający 1 atom azotu lub 10-członowy bicykliczny heterocykl zawierający 1 do 4 atomów azotu;

przy czym R21 oznacza C1-6alkil, C1-6alkoksyl; amino, mono- lub di-(C1-6alkilo)amino; amido ewentualnie monopodstawiony przez C1-6alkil, C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil, Het lub (C1-6alkil)-Het; NO2; OH; atom chlorowca; trifluorometyl; karboksyl; C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil lub Het, gdzie Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; oraz wymieniony aryl, aryloalkil lub Het są ewentualnie podstawione przez R22, przy czym R22 oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino; mono- lub di-(C1-6alkilo)amino; (C1-6alkilo) amid; NO2; OH; atom chlorowca; trifluorometyl; lub karboksyl. Korzystnie R21 oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino; di(C1-6alkilo)amino; (C1-6alkilo)amid; C6 lub C1-6aryl lub Het, gdzie Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; oraz wymieniony aryl lub Het są ewentualnie podstawione przez R22, przy czym R22 oznacza C1-6alkoksyl; amino; di(C1-6alkilo)amino; (C1-6alkilo)amid; atom chlorowca lub trifluorometyl. Korzystnie R2 oznacza 1-naftylometoksyl; 2-naftylometoksyl; benzyloksyl, 1-naftyloksyl; 2-naftyloksyl; lub chinolinoksyl niepodstawiony, mono- lub di-podstawiony przez R21, gdzie R21 ma znaczenie zdefiniowane powyżej. R2 oznaczać też może 1-naftylometoksyl; lub chinolinoksyl niepodstawiony, mono-lub di-podstawiony przez R21, gdzie R21 ma znaczenie zdefiniowane powyżej. Korzystnie R2 oznacza:

PL 199 419 B1

w którym R21A oznacza amido ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil, C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil lub Het; C6 lub C10aryl lub Het są ewentualnie podstawione przez R22, przy czym Het w każ dym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; i R22 oznacza amino, di(C1-6alkilo)amino; lub (C1-6alkilo)amid: i R21B oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino; di(C1-6alkilo)amino; (C1-6alkilo)amid; NO2; OH; atom chlorowca; trifluorometyl; lub karboksyl. R21A oznacza wówczas korzystnie C6 lub C10aryl lub Het, wszystkie ewentualnie podstawione przez R22 gdzie Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; i R22 oznacza amino, dimetyloamino lub acetamido.

R21B oznacza korzystnie C1-6alkoksyl lub di(C1-6alkilo)amino, korzystnie metoksyl.

Wynalazek obejmuje związek o wzorze I, w którym asymetryczny atom węgla w pozycji 1 ma konfigurację R, reprezentowany przez następujące konfiguracje bezwzględne:

w których R1 ma znaczenie zdefiniowane wyż ej .

W jednej z odmian podstawnik R1 przy P1 jest w orientacji syn wzglę dem grupy karbonylowej, co reprezentuje następująca bezwzględna konfiguracja:

w której R1 oznacza metyl, etyl, propyl, winyl, przy czym wszystkie są ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, korzystnie etyl, winyl lub bromowinyl, najbardziej korzystnie winyl.

W związku o wzorze I w korzystnym wariancie W oznacza hydroksyl lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub ester; lub (C1-6alkilo)amino, di(C1-6alkilo)amino lub aminoaryloalkil, korzystnie hydroksyl lub N(R13a)R13b, w którym R13a i R13b oznaczają niezależnie H, aryl, lub C1-6alkil ewentualnie podstawiony przez hydroksyl lub fenyl; lub ich farmaceutycznie dopuszczalną sól. Korzystnie W oznacza -OH, -NH-benzyl lub -NH-CH(Me)Ph, najkorzystniej W oznacza -OH lub -NH-(S)CH(Me)-fenyl.

Gdy W oznacza ester, ester wybrany jest z grupy obejmującej: C1-6alkoksyl, fenoksyl lub arylo(C1-6alkoksyl), korzystnie metoksyl, etoksyl, fenoksyl, benzyloksyl lub PhCH(Me)-O-.

W korzystnym wariancie wynalazek obejmuje zwią zek o wzorze I, w którym B oznacza H, C1-6alkil-C(O) - lub Het-C(O)-; gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-czionowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 albo 2 atomy azotu;

R6, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny Asp lub Glu;

R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny D- lub L-: Asp, Glu, Val lub Tbg;

Y oznacza H lub metyl;

R4 oznacza łańcuch boczny Val, Chg, Tbg, Ile lub Leu;

R3 oznacza atom wodoru lub łańcuch boczny Ile, Chg, Val lub Tbg;

R2 oznacza 1-naftylometoksyl, 2-naftylometoksyl, O-Bn,

PL 199 419 B1

gdzie Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; i R22 oznacza amino, di(C1-6alkilo)amino, (C1-6alkilo)amid, NO2, OH, atom chlorowca, CF3 lub COOH;

P1 oznacza układ cyklopropylowy o wzorach

w których R1 oznacza etyl, winyl lub bromowinyl; i

W oznacza hydroksyl lub N(R13a)R13b, w którym R13b oznaczają niezależnie H, aryl lub C1-6alkil ewentualnie podstawiony przez hydroksyl lub fenyl; lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub ester.

Wynalazek obejmuje także związek o wzorze I, w którym B oznacza H, acetyl lub Het-C(O)-; gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-czlonowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 albo 2 atomy azotu;

R6, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny Asp; R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny D-Asp, D-Glu lub D-Val; Y oznacza H; R4 oznacza łańcuch boczny Chg lub Ile; R3 oznacza łańcuch boczny Val, Chg lub Tbg; R2 oznacza 1-naftylometoksyl, benzyloksyl, 4-chinolinoksyl lub

PL 199 419 B1

P1 oznacza układ cyklopropylowy o wzorze

w którym R1 oznacza Et lub CH=CH2 lub CH=CHBr; i W oznacza hydroksyl lub NH- (S) -CHMePh, lub jeqo farmaceutycznie dopuszczalną sól.

W korzystnym wariancie wynalazku B oznacza acetyl; R6, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny Asp; R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny D-Glu; Y oznacza H; R4 oznacza łańcuch boczny Chg; R3 oznacza łańcuch boczny Val lub Tbg; R2 oznacza:

P1 oznacza:

W oznacza hydroksyl, lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub ester. Korzystny wariant stanowi związek reprezentowany wzorem:

w którym B, P6, P5, P4, P3, R2 i R1 mają zdefiniowane poniż ej znaczenia:

PL 199 419 B1

Tabela 1 nr związku	B	P6	P5	P4	P3	r₂	^R1	PI ^cl“^c2
101	Ac	-	-	Chg	Val	OBn	Et	IR, 2R
102	Ac	-	-	Chg	Val	OBn	Et	IR, 2?
103	Ac	-	-	Chg	Chg	l-NpCH₂O	Et	IR, 2?
104	Ac	-	-	Chg	Chg	l-NpCH₂O	Et	IR, 2R
105	Ac	-	-	Chg	Chg	l-NpCH₂O	Et	1S, 2S
106	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Me	IR, 2?
107	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	CHMe₂	IR, 2?
108	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Chg	l-NpCH₂O	Et	IR, 2R
109	Ac			Chg	Val	l-NpCH₂O	CH₂O CH₂Ph	IR, 2?
110	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	CH₂OCH₂Ph	IR, 2?
111	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂)	(CH₂)2Ph	IR, 2?
112	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Et	IR, 2R
113	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Et	1S, 2S
114	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Bn	IR, 2?
115	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Bn	IR, 2?
116	Ac	Asp	D-Glu	He	Val	Obn	Et	IR, 2R
117	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Val	l~NpCH₂O	Et	IR, 2R
118	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Pr	IR, 2?
119	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Pr	IR, 1?
120	Ac	Asp	D-Val	Chg	Val	l-NpCH₂O	Et	IR, 2R
121	Ac		-	Chg	Val		winyl	1S, 2R
122	Ac	-	-	Chg	Val		etyl	IR, 2S
123	Ac	-	-	Chg	Val	ęo %	propyl	IR, 2R

Inny korzystny wariant stanowi związek reprezentowany wzorem:

PL 199 419 B1 w którym P6, P5, P4, P3, R2 i R1 mają zdefiniowane poniżej znaczenia:

PL 199 419 B1

Tabela 2 Nr związku	P6	P5	P4	P3	‘ P-2	' ^R1
215			Val	Chg	1 0 \	CH=CH₂
216	-	-	Chg	Val		ch=ch₂
217	-	-	Chg	Val		ch=ch₂
218	-	-	Chg	Val	o « N XX 0 \	ch=ch₂
219	-	-	Chg	Val	Χ'ϊ Ϊ ' N N ''b'^ ^h MbP 0 \	ch=ch₂
220			Chg	Val	00 ^A0ęo o \	ch=ch₂
221	-	-	Chg	Val	0 ΧΧ^^Ν'Χρ^;·^Νχ^<Α ^H kJU 0 \	ch=ch₂
222	Asp	D-Glu	Chg	Tbg	\	ch=ch₂
223			Chg	Val	/~s ^H uu 0 \	ch=ch₂

PL 199 419 B1

Tabela 2 Nr związku	P6	P5	P4	P3	^R2	^R1
224	-		Chg	Tbg	/ o ej)	ch=ch₂
225	-	-	Chg	Val	/ o	ch=ch₂
226	-	-	Chg	Val	i 0	ch=ch₂
227			Chg	Val	0 N .N c γ h 0 \	ch=ch₂
228	-	-	Chg	Tbg	/ o <ΓΛ //	ch=ch₂
229	-	-	Chg	Val	\	ch=ch₂
230	-	-	( Chg	Val	„ⁿ-n ^N'ⁿ^VⁿV^j	ch=ch₂
231	-	-	Chg	Tbg	o \	ch=ch₂
232	-	-	Chg	Tbg	0 \	ch=ch₂

PL 199 419 B1

Tabela 2 Nr związku	P6	P5	P4	P3	R2	Rl
233			Chg	Tbg	/ o za /Ac/\| d	ch=ch₂
234			Chg	Tbg	Ογ-ρ, 0 \	ch=ch₂
235			Chg	Val	ęh YaL/ 0 \	winyl
236	Asp	D-Glu	He	Val	O-Bn	winyl
237	-	-	Chg	Val	aotot 0	winyl
238	Asp	D-Glu	Chg	Tbg	/ o ZA Υ/Ζ^ za	winyl

Wynalazek obejmuje w korzystnym wariancie związek reprezentowany wzorem:

w którym B, P6, P5, P4, P3, R2, R1 i W mają zdefiniowane poniżej znaczenia:

Tabela 3 nr związku	B	P6	P5	P4	P3	^r2	^R1	W
301	Ac	Asp	D-Glu	Ile	Val	Obn	El	NH- (S)- CHMePh
302	Dni	Asp	D-Glu	Chg	Tbg	\	winyl	OH

Wynalazek obejmuje w kolejnym korzystnym wariancie związek reprezentowany wzorem:

PL 199 419 B1

w którym B, Y, P4, P3, R2 i R1 maj ą zdefiniowane poniż ej znaczenia:

Tabela 4 Nr związku	B	Y	P4	P3	^R2	^R1
401	Ac	Me	Chg	Tbg	/ o	winyl

Wynalazek obejmuje w innym korzystnym wariancie związek reprezentowany wzorem:

w którym B i R20 niają zdefiniowane poniżej znaczenia:

PL 199 419 B1

506	Η	0 \
507	OCV il 0	^fXX) 1 0 \
508	o	Q ~Tęo o
509	I-I	γ<5/⁰ ęu
510	CCv 11 o	Ογ*γγ°^ \
511	Dni	Ογ-γγ»·. \

Szczególnie korzystne są związki heksapeptydowe o wzorze I, wybrane z grupy obejmującej związki o numerach: 108, 116, 117, i 120, związki o numerach: 212, 222, 236 i 238, związki o numerach: 301 i 302.

Korzystne związki tetrapeptydowe wybrane są z grupy obejmującej związki o numerach: 122 i 123, oraz o numerach: 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 214, 215, 216, 218, 219, 220, 221, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, a także o numerze: 401, oraz o numerach: 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510 i 511.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca skuteczną przeciw wirusowi zapalenia wątroby C ilość związku o wzorze I, lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru, w mieszance z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub środkiem pomocniczym.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie związku o wzorze I lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C u ssaków.

Zakresem wynalazku jest objęte ponadto zastosowanie związku o wzorze I lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru w ilości inhibitującej proteazę NS3 wirusa zapalenia wątroby C do wytwarzania leku do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby C.

Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie związku o wzorze I lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusem zapalenia wątroby C u ssaków, leku zawieraj ą cego skuteczną przeciw wirusowi zapalenia wą troby C ilość kombinacji związku o wzorze I, lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru, oraz interferon.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca oprócz związku według wynalazku także drugi środek przeciwwirusowy wybrany z grupy zawierającej rybawirynę lub amantadynę.

Wynalazek obejmuje ponadto sposób wytwarzania analogu peptydu o wzorze (I), w którym P1 oznacza podstawioną resztę kwasu aminocyklopropylokarboksylowego, który zawiera etap, w którym:

peptyd wybrany z grupy obejmującej: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3-P2; APG-P4-P3P2; APG-P3-P2; i APG-P2;

sprzęga się ze związkiem pośrednim P1 o wzorze;

PL 199 419 B1

w którym R1 oznacza C1-6alkil lub C2-6alkenyl ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, CPG oznacza grupę zabezpieczającą karboksyl i PG do P2 mają znaczenia zdefiniowane powyżej. Korzystnie grupę zabezpieczającą karboksyl (CPG) wybiera się z grupy obejmującej: estry alkilowe, estry aryloalkilowe i estry ulegające rozpadowi pod wpływem łagodnej zasady lub łagodnych środków redukcyjnych.

Sposób według wynalazku wytwarzania analogu peptydu o wzorze (I), w którym P1 oznacza podstawioną resztę kwasu aminocyklopropylokarboksylowego, obejmuje etap, w którym:

sprzęga się ze związkiem pośrednim P1 o wzorze:

w którym R1 oznacza etyl, winyl lub bromowinyl, CPG oznacza grupę zabezpieczającą karboksyl i P6 do P2 mają znaczenia zdefiniowane powyżej. Korzystnie grupę zabezpieczającą karboksyl (CPG) wybiera się z grupy obejmującej:

estry alkilowe, estry aryloalkilowe i estry ulegające rozpadowi pod wpływem łagodnej zasady lub łagodnych środków redukcyjnych.

W innym wariancie sposób według wynalazku wytwarzania analogu peptydu o wzorze (I), w którym P1 oznacza podstawioną resztę kwasu aminocyklopropylokarboksylowego, zawiera etap, w którym:

sprzęga się ze związkiem pośrednim P1 o wzorze:

w którym R1 oznacza CPG grupę zabezpieczają c ą karboksyl i P6 do P2 mają znaczenia zdefiniowane powyżej. Korzystnie grupę zabezpieczającą karboksyl (CPG) wybiera się z grupy obejmującej:

estry alkilowe, estry aryloalkilowe i estry rozpadające się pod wpływem łagodnej zasady lub łagodnych środków redukcyjnych.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie analogu aminokwasu o wzorze:

w którym R1 oznacza C1-6alkil lub C2-6alkenyl ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, do otrzymywania związku o wzorze I.

PL 199 419 B1

Wynalazek obejmuje także zastosowanie analogu aminokwasu o wzorze:

w którym R1 oznacza etyl, winyl lub bromowinyl, do otrzymywania związku o wzorze I. Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie analogu aminokwasu o wzorze:

do otrzymywania związku o wzorze I.

Stosowane tu definicje, jeśli nie wskazano tego inaczej, mają następujące znaczenia:

W odniesieniu do przypadków, gdy do oznaczenia konfiguracji podstawnika stosuje się (R) lub (S), np. podstawnika R4 związku o wzorze I, oznaczenie dotyczy związku, a nie samego podstawnika.

Naturalne aminokwasy, z wyjątkiem glicyny, zawierają chiralny atom węgla. Jeśli nie wyspecyfikowano tego inaczej, korzystne są związki zawierające naturalne aminokwasy o konfiguracji L. Jednakże, należy zauważyć, że gdy to wskazano, niektóre aminokwasy o wzorze I mogą występować albo w konfiguracji D lub L lub mogą stanowić mieszaninę izomerów D i L, w tym mieszaninę racemiczną.

Stosowane tu oznaczenia „P1, P2 i P3 dotyczą pozycji reszt aminokwasów począwszy od C-końca analogów peptydów w kierunku N-końca (tj. P1 odnosi się do pozycji pierwszej od C-końca, P2: pozycji drugiej od C-końca itd.) (patrz Berger A. i Schechter I., Transactions of the Royal Society London series, B257, 249-264, (1970)).

Skróty α-aminokwasów stosowane w tym zgłoszeniu przedstawiono w Tabeli A.

T a b e l a A

Aminokwas	Symbol
Kwas 1-aminocyklopropylokarboksylowy	Acca
Alanina	Ala
Kwas asparaginowy	Asp
Cysteina	Cys
Cykloheksyloglicyna (znana także jako kwas amino-2-cykloheksylooctowy)	Chg
Kwas glutaminowy	Glu
Izoleucyna	Ile
Leucyna	Leu
Fenyloalanina	Phe
Prolina	Pro
Walina	Val
Tert-butyloglicyna	Tbg

PL 199 419 B1

Stosowany tu termin „kwas 1-aminocyklopropylokarboksylowy (Acca) dotyczy związku o wzorze:

Stosowany tu termin „tert-butyloglicyna dotyczy związku o wzorze:

Termin „reszta w odniesieniu do aminokwasu lub pochodnej aminokwasu oznacza rodnik pochodzący od odpowiedniego α-aminokwasu przez usunięcie hydroksylu grupy karboksylowej i jednego atomu wodoru grupy α-aminowej. Na przykład, terminy Gin, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar i Tyr oznaczają odpowiednio „reszty L-glutaminy, L-alaniny, glicyny, L-izoleucyny, L-argininy, kwasu L-asparaginowego, L-fenyloalaniny, L-seryny, L-leucyny, L-cysteiny, L-asparaginy, sarkozyny i L-tyrozyny.

Termin „łańcuch boczny w odniesieniu do aminokwasu lub reszty aminokwasu oznacza grupę przyłączoną do atomu węgla α-aminokwasu. Np. grupa R łańcucha bocznego glicyny oznacza atom wodoru, alaniny oznacza metyl, waliny oznacza izopropyl. Specyficzne grupy R lub łańcuchy boczne α-aminokwasów można znaleźć w A.L. Lehninger's text on Biochemistry (patrz rozdział 4).

Stosowany tu termin „atom chlorowca oznacza atom wybrany spośród takich jak atom bromu, chloru, fluoru lub jodu.

Stosowany tu termin „C1-6alkil lub „ (niższy) alkil, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony alkil zawierający do sześciu atomów węgla i obejmuje, np. metyl, etyl, propyl, butyl, heksyl, 1-metyloetyl, 1-metylopropyl, 2-metylopropyl, 1,1-dimetyloetyl (np. tert-butyl).

Stosowany tu termin „C3-7cykloalkil, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza cykloalkil zawierający od trzy do siedmiu atomów węgla i obejmuje cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl i cykloheptyl.

Termin „nienasycony cykloalkil obejmuje np. cykloheksenyl:

Stosowany tu termin „C4-10 (alkilocykloalkil) oznacza cykloalkil zawierający od trzech do siedmiu atomów węgla przyłączonych do alkilu, przyłączone rodniki zawierają aż do dziesięciu atomów węgla, np. cyklopropylometyl, cyklopenlyloetyl, cykioheksylometyl, cykloheksyloetyl lub cykloheptyloetyl.

Stosowany tu termin „C2-10alkenyl, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza zdefiniowany powyżej alkil zawierający od 2 do 10 atomów węgla, i zawierający ponadto co najmniej jedno wiązanie podwójne. Np. termin alkenyl obejmuje allil i winyl.

Stosowany tu termin „C1-6alkanoil, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony 1-oksoalkil zawierający jeden do sześciu atomów węgla i obejmujący formyl, acetyl, 1-oksopropyl (propionyl), 2-metylo-1-oksopropyl, 1-oksoheksyl itp.

Stosowany tu termin „C1-6alkoksyl, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza -O(C1-6alkil), w którym alkil ma znaczenie zdefiniowane powyżej, zawierający do sześciu atomów węgla. Alkoksyl obejmuje metoksyl, etoksyl, propoksyl, 1-metyloetoksyl, butoksyl i 1,1-dimetyloetoksyl. Ostatni rodnik z wymienionych jest znany powszechnie jako tert-butoksyl.

Stosowany tu termin „C3-7cykloalkoksyl, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza C3-7cykloalkil związany z atomem tlenu, taki jak np.:

PL 199 419 B1

Stosowany tu termin „C6 lub C10aryl, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza albo aromatyczną grupę monocykliczną zawierającą 6 atomów węgla lub aromatyczną grupę bicykliczną zawierającą 10 atomów węgla. Np. aryl obejmuje fenyl, 1-naftyl lub 2-naftyl.

Stosowany tu termin „C7-16aryloalkil, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza zdefiniowany powyżej C6 lub C10aryl przyłączony do alkilu, o znaczeniu zdefiniowanym powyżej, zawierającego od 1 do 6 atomów węgla. C7-16aryloalkil obejmuje np. benzyl, butylofenyl i 1-naftylometyl.

Stosowany tu termin „aminoaryloalkil, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza grupę aminową podstawioną przez C7-16aryloalkil, taką jak np. aminoaryloalkil:

Stosowany tu termin „karboksy(niższy)alkil, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza karboksyl (COOH) związany poprzez zdefiniowany powyżej(niższy)alkil i obejmuje np. kwas masłowy.

Stosowany tu termin „heterocykl lub „Het, samodzielnie lub w połączeniu z innym rodnikiem, oznacza jednowartościowy rodnik powstały przez usunięcie atomu wodoru z pięcio-, sześcio- lub siedmioczłonowego, nasyconego lub nienasyconego (w tym aromatycznego) heterocyklu zawierającego od jednego do sześciu heteroatomów wybranych spośród takich jak atom azotu, atom tlenu i atom siarki. Ponadto, termin „Het oznacza zdefiniowany powyżej heterocykl skondensowany z jednym lub więcej innymi pierścieniami heterocyklicznymi lub dowolnymi innymi pierścieniami. Przykłady odpowiednich heterocykli obejmują takie jak: pirolidyna, tetrahydrofuran, tiazolidyna, pirol, tiofen, diazepina, 1H-imidazol, izoksazol, tiazol, tetrazol, piperydyna, 1,4-dioksan, 4-morfolina, pirydyna, pirymidyna, tiazolo[4,5-b]-pirydyna, chinolina lub indol, lub następujące heterocykle:

Stosowany tu termin „(niższy alkil)-Het, oznacza zdefiniowany powyżej heterocykliczny rodnik związany poprzez prostołańcuchowy lub rozgałęziony alkil, o znaczeniu zdefiniowanym powyżej, zawierający od 1 do 6 atomów węgla. Przykłady (niższy alkil)-Het obejmują:

Stosowany tu termin „farmaceutycznie dopuszczalny ester, samodzielnie lub w połączeniu z innym podstawnikiem, oznacza estry związku o wzorze I, w którym dowolna karboksylowa grupa funkcyjna, lecz korzystnie końcowa grupa karboksylowa, jest zastąpiona przez alkoksykarbonylową grupę funkcyjną:

w której grupa R estru jest wybrana spośród takich jak alkil (np. metyl, etyl, n-propyl, t-butyl, n-butyl); alkoksyalkil (np. metoksymetyl); alkoksyacyl (np. acetoksymetyl); aryloalkil (np. benzyl); arylooksyalkil (np. fenoksymetyl); aryl (np. fenyl) ewentualnie podstawiony przez atom chlorowca, C1-4alkil lub C1-4alkoksyl. Inne odpowiednie estry prolekowe można znaleźć w „Design of prodrugs, Bundgaard, H. Wydwanictwo Elsevier (1985), wprowadzonym tu na zasadzie odsyłacza. Takie farmaceutycz20

PL 199 419 B1 nie dopuszczalne estry hydrolizują zazwyczaj in vivo po wstrzyknięciu ssakom i ulegają przekształceniu w kwasową formę związku o wzorze I.

W odniesieniu do opisanych powyż ej estrów, jeś li nie wyspecyfikowano tego inaczej, dowolny występujący alkil korzystnie zawiera 1 do 16 atomów węgla, szczególnie 1 do 6 atomów węgla. Dowolny występujący aryl w takich estrach korzystnie obejmuje fenyl.

W szczególności estry mogą obejmować ester C1-16alkilowy, niepodstawiony ester benzylowy lub ester benzylowy podstawiony przez co najmniej jeden atom chlorowca, C1-6alkil, C1-6alkoksyl, nitro lub trifluorometyl.

Stosowany tu termin „farmaceutycznie dopuszczalna sól obejmuje te, które pochodzą od farmaceutycznie dopuszczalnych zasad. Przykłady odpowiednich zasad obejmują takie jak cholina, etanoloamina i etylenodiamina. Sole Na⁺, K⁺ i Ca⁺⁺ są także objęte zakresem wynalazku (patrz także Pharmaceutical salts, Birge, S.M. i in., J. Pharm. Sci., (1977), 66, 1-19, wprowadzony tu na zasadzie odsyłacza).

Jak opisano powyżej część P1 związków o wzorze I oznacza układ cyklopropylowy o wzorze:

w którym każdy C1 i C2 oznacza asymetryczny atom węgla w pozycjach 1 i 2 cyklopropylu. Nie wykluczając innych możliwych centrów asymetrii w innych częściach związków o wzorze I, obecność tych dwóch centrów asymetrii oznacza, że związek o wzorze I może występować w formie racemicznych mieszanin diastereoizomerów. Jak zilustrowano w przykładach przedstawionych poniżej, mieszaniny racemiczne można wytworzyć i następnie rozdzielić na pojedyncze izomery optyczne lub te izomery optyczne można wytworzyć metodą syntezy chiralnej.

Zatem, związek o wzorze l może występować jako racemiczna mieszanina diastereoizomerów, w których R1 w pozycji 2 ma orientację syn wzglę dem karbonylu w pozycji 1, co reprezentuje rodnik:

lub związek o wzorze I może występować jako racemiczna mieszanina diastereoizomerów, w których R1 w pozycji 2 ma orientację anti względem karbonylu w pozycji 1, co reprezentuje rodnik:

Następnie, mieszaniny racemiczne można rozdzielić na pojedyncze izomery optyczne. Najciekwsze rozwiązanie wynalazku dotyczy przestrzennej orientacji części P1. Rozwiązanie dotyczy konfiguracji asymetrycznego atomu węgla w pozycji 1. W korzystnym rozwiązaniu asymetryczny atom węgla w pozycji 1 ma konfigurację R.

PL 199 419 B1

Dokładniej, gdy atom węgla 1 ma konfigurację R, to hamowanie proteazy NS3 HCV jeszcze zwiększa się dzięki ustawieniu podstawnika R1 (np. alkilu lub alkilenu) przy atomie węgla 2 układu cyklopropylowego. Najkorzystniejszym związkiem jest optyczny izomer posiadający podstawnik R1 i karbonyl w orientacji syn w następującej konfiguracji bezwzględnej:

W przypadku gdy R1 oznacza np. etyl asymetryczne atomy węgla w pozycjach 1 i 2 mają konfigurację R,R.

W celu zilustrowania wpł ywu bezwzględnej konfiguracji podstawnika na poziom aktywnoś ci związku, związek 112 (Tabela 1) posiadający bezwzględną konfigurację 1R,2R ma IC₅₀ 1,6 μM, podczas gdy jego izomer 1S,2S (związek 113) ma IC₅₀ 27,5 μM. Zatem, izomer 1R,2R jest 25 razy bardziej aktywny od izomeru 1S,2S.

Zgodnie z rozwiązaniem według wynalazku kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać oprócz związku według wynalazku także inny środek przeciwwirusowy. Przykłady środków anty-HCV obejmują, α- lub β-interferon, rybawirynę i amantadynę.

Wynalazek pozwala na wytworzenie kompozycji farmaceutycznych zawierających oprócz związku według wynalazku także inhibitor innego elementu cyklu życiowego HCV obejmującego, lecz nie ograniczającego się do nich, helikazę, polimerazę, metaloproteazę lub miejsce dostępu wewnętrznego rybosomu (IRES).

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowo lub poprzez wszczepiony zbiornik. Korzystne jest podawanie doustnie lub w zastrzyku. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać dowolne typowe nietoksyczne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, środki wspomagające lub rozczynniki. W pewnych przypadkach, pH preparatu można uregulować z zastosowaniem farmaceutycznie dopuszczalnych kwasów, zasad lub bufor w celu zwiększenia trwałości związku w preparacie lub jego transportowanej postaci. Stosowany tu termin „pozajelitowo obejmuje podawanie podskórnie, śródskórnie, dożylnie, domięśniowo, dostawowo, wewnątrzmaziówkowo, domostkowo, dooponowo i w formie zastrzyku w miejscu wystąpienia zmiany patologicznej lub z zastosowaniem technik infuzyjnych.

Kompozycje farmaceutyczne mogą występować w postaci sterylnego preparatu do wstrzykiwania np. w postaci sterylnych wodnych lub olejowych zawiesin do wstrzykiwania. Tę zawiesinę można komponować z zastosowaniem technik znanych w tej dziedzinie, stosując odpowiednie środki emulgujące lub zwilżające (takie jak np. Tween 80) i środki zawieszające.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać doustnie w dowolnej dopuszczalnej doustnie postaci dawkowania obejmującej, Iecz nie ograniczającej się do nich, kapsułki, tabletki i wodne zawiesiny oraz roztwory. W przypadku tabletek do stosowania doustnie, powszechnie stosowane nośniki obejmują laktozę i skrobię kukurydzianą. Typowo dodaje się także środki smarujące takie jak stearynian magnezu. Do podawania doustnie w postaci kapsułki, przydatne rozcieńczalniki obejmują laktozę i sproszkowaną skrobię kukurydzianą. Gdy wodne zawiesiny podaje się doustnie, aktywny składnik łączy się ze środkami emulgującymi i zawieszającymi. Jeśli to pożądane, można dodawać pewne środki słodzące i/lub smakowe i/lub barwiące.

Inne odpowiednie rozczynniki lub nośniki dla powyżej wymienionych preparatów i kompozycji można znaleźć w standardowych publikacjach farmaceutycznych, np. w „Remington's Pharmaceutical Sciences, The Science and Practice of Pharmacy, wydanie 19, Mack Publishing Company, Easton, Penn., (1995).

Przydatne poziomy dawkowania obejmują pomiędzy około 0,01 i około 100 mg/kg masy ciała dziennie, korzystnie pomiędzy około 0,5 i około 75 mg/kg masy ciała dziennie opisanych tu związków będących inhibitorami proteazy w monoterapii do zapobiegania i leczenia chorób którym pośredniczy HCV. Typowo, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku podaje się od około 1 do około 5 razy dziennie lub alternatywnie, w formie ciągłej infuzji. Takie podawanie można stosować w leczeniu przewlekłym lub ostrym. Ilość aktywnego składnika, którą można połączyć z substancjami nośnika

PL 199 419 B1 w celu otrzymania pojedynczej postaci dawkowania będzie się zmieniać zależnie od leczonego osobnika i konkretnego sposobu podawania. Typowy preparat będzie zawierać od około 5% do około 95% (wagowych) aktywnego związku. Korzystnie, takie preparaty zawierają od około 20% do około 80% aktywnego związku.

Zgodnie z oceną specjalisty w tej dziedzinie, konieczne może być podawanie mniejszych lub większych dawek niż wyszczególnione powyżej. Specyficzne reżimy dawkowania i leczenia dla dowolnego, konkretnego pacjenta będą zależeć od rozmaitych czynników, obejmujących aktywność specyficznego stosowanego związku, wiek, masa ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, dieta, okres podawania, szybkość wydalania, kombinację leków, stan zaawansowania i przebieg infekcji, podatność pacjenta na infekcję i zalecenia lekarza prowadzącego. Na ogół, na początku leczenia stosuje się małe dawki, znacznie mniejsze od optymalnych. Następnie dawkowanie zwiększa się stopniowo aż do uzyskania optymalnego efektu zależnie od okoliczności. Na ogół, najbardziej pożądane jest podawanie związku w stężeniu, które będzie na ogół wywoływać efekt przeciwwirusowy bez jakichkolwiek szkodliwych lub niepomyślnych efektów ubocznych.

Gdy kompozycje według wynalazku obejmują kombinację związku o wzorze l i jednego lub więcej dodatkowych środków terapeutycznych lub profilaktycznych, zarówno związek jak i dodatkowy środek powinny występować w dawkach pomiędzy około 10 do 100%, i korzystniej pomiędzy około 10 i 80% normalnie podawanej dawki w reżimie monoterapii.

Gdy te związki lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole komponuje się razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, uzyskaną kompozycję można podawać in vivo ssakom, takim jak człowiek, w celu hamowania proteazy NS3 HCV lub do leczenia lub zapobiegania infekcjom wirusem HCV. Takie leczenie można także przeprowadzić stosując związki według wynalazku w połączeniu ze środkami, które obejmują, lecz nie ograniczają się do nich: immunomodulatory takie jak α-, β- lub γ-interferony; inne środki przeciwwirusowe takie jak rybawiryna, amantadyna; inne inhibitory proteazy NS3 HCV; inhibitory innych elementów cyklu życiowego HCV, które obejmują, lecz nie ograniczają się do nich, helikazę, polimerazę, metaloproteazę lub miejsce dostępu wewnętrznego rybosomu (IRES); lub ich kombinacje. Dodatkowe środki można połączyć ze związkami według wynalazku w celu otrzymania jednostkowej postaci dawkowania. Alternatywnie te dodatkowe środki można podawać ssakowi jako część dawki wielokrotnej.

Zgodnie z tym, inne rozwiązanie niniejszego wynalazku zapewnia metody hamowania aktywności proteazy NS3 HCV u ssaków poprzez podawanie związku o wzorze I, w którym podstawniki mają powyżej zdefiniowane znaczenia.

W korzystnym rozwiązaniu, te metody są przydatne do zmniejszenia aktywności proteazy NS3 HCV u ssaków. Jeśli kompozycja farmaceutyczna zawiera tylko związek według wynalazku jako aktywny składnik, takie metody mogą ponadto obejmować etap podawania temu ssakowi środka wybranego spośród takich jak immunomodulator, środek przeciwwirusowy, inhibitor proteazy HCV lub inhibitor innego elementu w cyklu życiowym HCV takiego jak helikaza, polimeraza lub metaloproteaza lub IRES. Taki dodatkowy środek można podawać ssakowi przed, jednocześnie lub po podaniu kompozycji według wynalazku.

W alternatywnym korzystnym rozwiązaniu, te metody są przydatne do hamowania wirusowej replikacji u ssaków. Takie metody są przydatne w leczeniu lub zapobieganiu chorobie HCV. Jeśli kompozycja farmaceutyczna zawiera tylko związek według wynalazku jako aktywny składnik, takie metody mogą ponadto obejmować etap podawania temu ssakowi środka wybranego spośród takich jak immunomodulator, środek przeciwwirusowy, inhibitor proteazy HCV lub inhibitor innego elementu w cyklu życiowym HCV. Taki dodatkowy środek można podawać ssakowi przed, jednocześnie lub po podaniu kompozycji według wynalazku.

Związki przedstawione w opisie można także stosować jako odczynnki laboratoryjne. Związki według wynalazku można także stosować do usuwania lub zapobiegania wirusowym zanieczyszczeniom substancji, a więc do zmniejszania ryzyka infekcji wirusowej pracowników laboratorium lub personelu medycznego lub pacjentów, którzy kontaktują się z takimi substancjami (np. krew, tkanka, instrumenty chirurgiczne i ubiory, instrumenty laboratoryjne i ubiory oraz urządzenia i materiały do pobierania krwi).

Związki przedstawione w opisie można stosować jako odczynniki badawcze. Związki według wynalazku można także stosować jako kontrolę dodatnią do walidacji badań surogatów komórkowych lub badań in vitro lub in vivo replikacji wirusowej.

PL 199 419 B1

Proces

Związki według niniejszego wynalazku zsyntetyzowano sposobem zilustrowanym w Schemacie I (w którym CPG oznacza grupę zabezpieczającą karboksyl i APG oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową):

W skrócie, P1, P2, P3, P4 i ewentualnie P5 i P6 można połączyć z zastosowaniem dobrze znanych technik sprzęgania peptydów. Grupy P1, P2, P3, P4 i P5 i P6 można połączyć ze sobą w dowolnej kolejności, jeśli tylko końcowy związek odpowiada peptydom o wzorze I. Np. P6 można przyłączyć do P5, z wytworzeniem P5-P6, który można przyłączyć do P4-P3-P2-P1; lub P6 przyłączyć do P5-P4P3-P2, a następnie przyłączyć do P1 odpowiednio zabezpieczonego na C-końcu.

Na ogół, peptydy przedłuża się metodą odbezpieczania grupy α-aminowej reszty N-końcowej i sprzęgania niezabezpieczonego karboksylu z kolejnym odpowiednio N-zabezpieczonym aminokwasem poprzez wiązanie peptydowe z zastosowaniem opisanych metod. To odbezpieczanie i sprzęganie powtarza się aż do otrzymania pożądanej sekwencji. Sprzęganie można przeprowadzić ze składowymi aminokwasami etapowo, jak to przedstawiono w Schemacie I, lub metodą kondensacji fragmentów (dwóch lub kilku aminokwasów), lub łącząc te dwa procesy, lub metodą syntezy peptydu w fazie stałej zgodnie ze sposobem opisanym pierwotnie przez Merrifield, J. Am. Chem. Soc., (1963), 85, 2149-2154, który załącza się na zasadzie odsyłacza.

Sprzęganie pomiędzy dwoma aminokwasami, aminokwasem i peptydem lub dwoma fragmentami peptydu można prowadzić stosując standardowe procedury sprzęgania takie jak metoda azydku, metoda mieszanego bezwodnika kwasów węglowego i karboksylowego (chloromrówczan izobutylu), metoda karbodiimidu (dicykloheksylokarbodiimid, diizopropylokarbodiimid lub rozpuszczalny w wodzie karbodiimid), metoda aktywnego estru (ester p-nitrofenylowy, ester imido-N-hydroksyburszty-nowy), metoda odczynnika K Woodwarda, metoda karbonylodiimidazolu, z zastosowaniem reagentów fosforowych lub metoda utleniania-redukcji. Niektóre z tych metod (szczególnie metodę karbodiimidu) można ulepszyć przez dodanie 1-hydroksybenzotriazolu. Te reakcje sprzęgania można prowadzić albo w roztworze (fazie ciekłej) lub fazie stałej.

Dokładniej, etap sprzęgania wymaga sprzęgania z usunięciem cząsteczki wody wolnego karboksylu jednego reagenta z wolną grupą aminową drugiego reagenta w obecności środka sprzęgającego, z wytworzeniem łączącego wiązania amidowego. Opisy takich środków sprzęgających można na ogół znaleźć w podręcznikach do chemii peptydów, np. M. Bodanszky, „Peptide Chemistry, wydanie 2 przekład, Springer-Verlag, Berlin, Niemcy, (1993). Przykłady odpowiednich środków sprzęgających obejmują N,N'-dicykloheksylokarbodiimid, 1-hydroksybenzotriazol w obecności N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu lub N-etylo-N'-[(3-dimetyloamino)propylo]karbodiimidu. Praktycznym i przydatnym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu heksafluorofosforan (benzotriazol-1-ilooksy)tris-(dimetylo-amino)fosfoniowy, albo sam lub w obecności 1-hydroksybenzotriazolu. Innym praktycznym i przydatnym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu tetrafluoroboran 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy. Jeszcze innym praktycznym i przydatnym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ylo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy.

PL 199 419 B1

Reakcję sprzęgania prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku, np. dichlorometanie, acetonitrylu lub dimetyloformamidzie. Nadmiar trzeciorzędowej aminy, np. diizopropyloetyloaminy, N-metylomorfoliny lub N-metylopirolidyny, dodaje się w celu utrzymania wartości pH mieszaniny reakcyjnej około 8. Temperatura reakcji zazwyczaj mieści się pomiędzy 0°C i 50°C i czas trwania reakcji zazwyczaj mieści się pomiędzy 15 minutami i 24 godzinami.

Gdy stosuje się syntezę w fazie stałej, C-końcowy kwas karboksylowy przyłącza się do nierozpuszczalnego nośnika (zazwyczaj polistyrenu). Te nierozpuszczalne nośniki zawierają grupę, która będzie reagować z grupą karboksylową, z wytworzeniem wiązania, które jest stabilne w warunkach wydłużania, ale łatwe do usunięcia w dalszym etapie. Przykłady obejmują: chloro- lub bromometylożywicę, hydroksymetylo-żywicę i aminometylo-żywicę. Wiele z tych żywic jest dostępnych w handlu z już wprowadzonym pożądanym C-końcowym aminokwasem. Alternatywnie, aminokwas można umieścić na stałym nośniku stosując znane metody (Wang, S.S., J. Am. Chem. Soc., (1973), 95, 1328; Atherton, E.; Shepard, R.C. „Solid-phase Peptide Synthesis; a practical approach IRL Press, Oxford, (1989); 131-148). Oprócz powyższych, inne metody syntezy peptydu opisali Stewart i Young, „Solid-phase Peptide Synthesis, wydanie 2, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, praca zbiorowa „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom 1, 2, 3, 5 i 9, Academic Press, New-York, (1980-1987); Rodansky i in. „The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New-York (1984), które załącza się na zasadzie odsyłacza.

Grupy funkcyjne składowych aminokwasów na ogół muszą być zabezpieczone podczas reakcji sprzęgania w celu uniknięcia powstawania niepożądanych wiązań. Grupy zabezpieczające, które można stosować wymieniono w Greene, „Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York (1981) i Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom 3, Academic Press, New York (1981), których ujawnienia niniejszym załącza się na zasadzie odsyłacza.

Grupę α-karboksylową reszty C-końcowej zazwyczaj zabezpiecza się w formie estru (CPG), który można rozszczepić z wytworzeniem kwasu karboksylowego. Grupy zabezpieczające, które można stosować obejmują: 1) estry alkilowe takie jak metyl, trimetylosililoetyl i t-butyl, 2) estry aryloalkilowe takie jak benzyl i podstawiony benzyl lub 3) estry, które można rozszczepić metodą traktowania łagodną zasadą lub łagodnymi środkami redukującymi takimi jak trichloroetyl i estry fenacylowe.

Grupa α-aminowa każdego aminokwasu sprzęganego z wydłużającym się łańcuchem peptydowym musi być zabezpieczona (APG). Stosować można dowolną grupę zabezpieczającą znaną w tej dziedzinie. Przykłady takich grup obejmują: 1) grupy acylowe takie jak formyl, trifluoroacetyl, ftalii i p-toluenosulfonyl; 2) aromatyczne grupy karbaminianowe takie jak benzylooksykarbonyl (Cbz lub Z) i podstawione benzylooksykarbonyle, i 9-fluorenylometylooksykarbonyl (Fmoc); 3) alifatyczne grupy karbaminianowe takie jak tert-butylooksykarbonyl (Boc), etoksykarbonyl, diizopropylometoksykarbonyl i allilooksykarbonyl; 4) cykliczne grupy alkilokarbaminianowe takie jak cyklopentylooksykarbonyl i adamantylooksykarbonyl; 5) grupy alkilowe takie jak trifenylometyl i benzyl; 6) trialkilosilil taki jak trimetylosilil; i 7) grupy zawierające tiol takie jak fenylotiokarbonyl i ditiasukcynoil. Korzystną grupą zabezpieczającą grupę α-aminową jest albo Boc lub Fmoc. Wiele odpowiednio zabezpieczonych pochodnych aminokwasów do syntezy peptydów jest dostępnych w handlu.

Grupę zabezpieczającą grupę α-aminową ostatnio dodanej reszty aminokwasu odcina się przed sprzęganiem następnego aminokwasu. Gdy stosuje się grupę Boc, metodami z wyboru są kwas trifluorooctowy, czysty lub w dichlorometanie lub HCl w dioksanie lub w octanie etylu. Uzyskaną sól amoniową następnie zobojętnia się albo przed sprzęganiem lub in situ z zastosowaniem zasadowych roztworów takich jak wodne bufory lub trzeciorzędowe aminy w dichlorometanie lub acetonitrylu, lub dimetyloformamidzie. Gdy stosuje się grupę Fmoc, reagentami z wyboru są piperydyna lub podstawiona piperydyna w dimetyloformamidzie, ale można stosować dowolną drugorzędową aminę. Odbezpieczanie prowadzi się w temperaturze pomiędzy 0°C i temperaturą pokojową (RT), zazwyczaj 20-22°C.

Wszelkie aminokwasy posiadające grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym trzeba zabezpieczyć podczas wytwarzania peptydu, stosując dowolne z opisanych powyżej grup. Fachowcy w tej dziedzinie wiedzą, że wybór i zastosowanie odpowiednich grup zabezpieczających grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym zależy od aminokwasu i obecności innych grup zabezpieczających w peptydzie. Wybór takich grup zabezpieczających jest ważny, gdyż grup nie można usunąć podczas odbezpieczania i sprzęgania grupy α-aminowej.

Np. gdy jako grupę zabezpieczającą grupę α-aminową stosuje się Boc odpowiednie są następujące grupy zabezpieczające łańcuch boczny: p-toluenosulfonyl (tosyl) można stosować do zabezpieczania grupy aminowej w łańcuchu bocznym aminokwasów takich jak Lys i Arg; acetamidometyl,

PL 199 419 B1 benzyl (Bn) lub t-butylosulfonyl można stosować do zabezpieczania łańcucha bocznego cysteiny zawierającego siarczek; etery benzylowe (Bn) można stosować do zabezpieczania hydroksylu w łańcuchach bocznych seryny, treoniny lub hydroksyproliny; i estry benzylowe można stosować do zabezpieczania karboksylu w łańcuchach bocznych kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego.

Gdy do zabezpieczenia grupy α-aminowej wybrano Fmoc, zazwyczaj można stosować grupy zabezpieczające na bazie tert-butylu. Na przykład, Boc można stosować dla lizyny i argininy, eter tertbutylowy dla seryny, treoniny i hydroksyproliny, i ester tert-butylowy dla kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego. Trifenylometyl (trityl) można stosować do zabezpieczania cysteiny zawierającej siarczek w łańcuchu bocznym.

Gdy W oznacza amid (w), wówczas P1 sprzęga się z odpowiednią aminą przed sprzęganiem z P2. Takie reakcje aminowania będą łatwe do przeprowadzenia dla fachowców w tej dziedzinie.

Po zakończeniu wydłużenia peptydu wszystkie grupy zabezpieczające usuwa się. Gdy stosuje się syntezę w fazie ciekłej, grupy zabezpieczające usuwa się w dowolny sposób podyktowany wyborem grup zabezpieczających. Te procedury są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie.

Gdy stosuje się syntezę w fazie stałej, peptyd odcina się od żywicy jednocześnie z usunięciem grup zabezpieczających. Gdy w syntezie stosuje się zabezpieczenie Boc, korzystnie traktuje się bezwodnym HF zawierającym dodatki takie jak siarczek dimetylu, anizol, tioanizol lub p-krezol w temperaturze 0°C w celu odłączenia peptydu od żywicy. Odłączenie peptydu można także przeprowadzić z zastosowaniem innych reagentów kwasowych takich jak mieszaniny kwas trifluorometanosulfonowy/kwas trifluorooctowy. Jeśli stosuje się zabezpieczenie Fmoc, N-końcową grupę Fmoc odcina się z zastosowaniem opisanych wcześniej reagentów. Inne grupy zabezpieczające i peptyd usuwa się z żywicy stosując roztwór kwasu trifluorooctowego i różne dodatki takie jak anizol itp.

Synteza osłaniającej grupy B i grup P6, P5, P4 i P3.

Różne osłaniające grupy B wprowadza się w celu zabezpieczenia grup P4, P5 lub P6 lub dowolnej części peptydu z zastosowaniem odpowiedniego chlorku acylu lub chlorku sulfonylu, które są albo dostępne w handlu lub których synteza jest dobrze znana w tej dziedzinie.

Różne grupy P6 do P3 są dostępne w handlu lub ich synteza jest dobrze znana w tej dziedzinie. l. Synteza grup P2.

1.1 Synteza prekursorów:

A) Synteza pochodnych chlorowcoarylometanu.

Wytwarzanie chlorowcometylo-8-chinoliny IId prowadzi się zgodnie z procedurą K.N. Campbell i in., J. Amer. Chem. Soc., (1946), 68, 1844.

W skrócie, kwas 8-chinolinokarboksylowy IIa przekształca się w odpowiedni alkohol Ile metodą redukcji odpowiedniego halogenku acylu Ilb środkiem redukującym takim jak wodorek litowoglinowy. Traktowanie alkoholu Ilb odpowiednim kwasem halogenowym daje pożądaną chlorowcopochodną IId. Specyficzne rozwiązanie tego sposobu podano w Przykładzie 1A.

B) Synteza pochodnych aryloalkoholu:

Pochodne 2-fenylo-4-hydroksychinoliny IIIc wytwarza się według Giardina i in. (J. Med. Chem., (1997), 40, 1794-1807).

PL 199 419 B1

R²² i R²¹B = alkil, OH, SH, atom chlorowca, NH2, NO2

Benzoiloacetamid (IIla) kondensuje się z odpowiednią aniliną (IlIb) i otrzymaną iminę poddaje reakcji cyklizacji z kwasem polifosforowym, z wytworzeniem odpowiedniej 2-fenylo-4-hydroksychinoliny (IIIc). Specyficzne rozwiązanie tego sposobu podano w Przykładach 1B i 1C.

1.2. Synteza P2

A) Syntezę 4-podstawionej proliny (w której podstawnik R2 jest przyłączony do pierścienia poprzez atom węgla) (o wskazanej stereochemii):

prowadzi się według Schematu IV zgodnie z procedurami opisanymi przez J. Ezquerra i in. (Tetrahedron, (1993), 38, 8665-8678) i C. Pedregal i in. (Tetrahedron Lett., (1994), 35, 2053-2056).

W skrócie, kwas Boc-piroglutaminowy zabezpiecza si ę w formie estru benzylowego. Traktowa20 nie mocną zasadą taką jak diizopropyloamidek litu, a następnie dodanie czynnika alkilującego (Br-R²⁰20 lub I-R²⁰) daje pożądane związki IVe, po redukcji amidu i odbezpieczeniu estru.

B) Synteza O-podstawionej-4-(R)-hydroksyproliny:

Gdy R oznacza aryl, aryloalkil, Het lub (niższy alkil)-Het, proces można prowadzić zgodnie z procedurą opisaną przez E.M. Smith i in. (J. Med. Chem. (1988), 3J., 875-885). W skrócie, dostępną w handlu Boc-4(R)-hydroksyprolinę traktuje się zasadą taką jak wodorek sodu lub KtBuO i uzyskany 20 20 20 alkoholan poddaje się reakcji z chlorowco-R (Br-R , I-R itp.), z wytworzeniem pożądanych związków. Specyficzne rozwiązania tego sposobu przedstawiono w Przykładach 2, 3 i 4B.

C) Alternatywnie, gdy R²⁰ oznacza aryl lub Het, związki można także wytworzyć na drodze reakcji Mitsunobu (Mitsunobu (1981), Synthesis, Styczeń, 1-28; Rano i in., (1995), Tet. Lett. 36(22), 3779-3792; Krchnak i in., (1995), Tet. Lett. 36(5), 62193-6196; Richter i in., (1994), Tet. Lett. 35(27), 4705-4706). W skrócie, dostępny w handlu ester metylowy Boc-4(S)-hydroksyproliny traktuje się odpowiednim aryloalkoholem lub tiolem w obecności trifenylofosfiny i azodikarboksylanu dietylu (DEAD) i uzyskany ester poddaje się hydrolizie do kwasu. Specyficzne rozwią zania tego sposobu przedstawiono w Przykładzie 4A.

PL 199 419 B1

Alternatywnie, reakcję Mitsunobu można prowadzić w fazie stałej (Schemat V). 96-studzienkową płytkę syntezatora Model 396 (advanced ChemTech) napełnia się próbkami związku związanego na żywicy (Va) i dodaje się rozmaite aryloalkohole lub tiole i odpowiednie reagenty. Po inkubacji, każdy produkt (Vb) związany na żywicy przemywa się, osusza i odłącza od żywicy.

Reakcję Suzuki (Miyaura i in., (1981), Synth. Comm. 11, 513; Sato i in., (1989), Chem. Lett., 1405; Watanabe i in., (1992), Synlett., 207; Takayuki i in., (1993), J. Org. Chem. 58, 2201; Frenette I in., (1994), Tet. Lett. 35(49). 9177-9180; Guiles i in., (1996), J. Org. Chem. 61, 5169-5171) moż na także stosować w celu dalszej obróbki podstawnika arylowego.

2. Synteza grup P1 (2-podstawiony kwas 1-aminocyklopropylokarboksylowy)

Syntezę przeprowadzono według schematu VI.

PL 199 419 B1

a) W skrócie, di-zabezpieczony malonian VIa i 1,2-dichlorowcoalkan VIb lub cykliczny siarczan VIc (zsyntetyzowany według K. Burgess i Chun-Yen KE (Synthesis, (1996), 1463-1467) poddaje się reakcji w warunkach zasadowych, z wytworzeniem diestru VId.

b) Przeprowadza się regioselektywną hydrolizę mniej rozbudowanego przestrzennie estru z wytworzeniem kwasu VIe.

c) Ten kwas VIe poddaje się przegrupowaniu Curtiusa, z wytworzeniem mieszaniny racemicznej pochodnych kwasu 1-aminocyklopropylokarboksylowego VIf z podstawnikiem R¹ w położeniu syn do grupy karboksylowej. Specyficzne rozwiązanie tej syntezy przedstawiono w Przykładzie 5.

d, e) Alternatywnie, selektywne otrzymywanie estru z kwasu VIe z zastosowaniem odpowiedniego halogenku (P*CI) lub alkoholu (P*OH) daje diester VIg, przy czym ester P* jest kompatybilny z selektywną hydrolizą estru P. Hydroliza estru P daje kwas VIh.

f) Przegrupowanie Curtiusa na związku VIh daje racemiczną mieszaninę pochodnych kwasu 1-aminocyklopropylokarboksylowego VII z postawnikiem R¹ w położeniu anti do grupy karboksylowej. Specyficzne rozwiązanie tej syntezy przedstawiono w Przykładzie 10.

Alternatywną syntezę do otrzymywania pochodnych VIf (gdy R¹ oznacza winyl i jest w położeniu syn do grupy karboksylowej) opisano poniżej.

Traktowanie dostępnej w handlu iminy VIIa z zastosowaniem 1,4-dichlorowcobutenu VIIb w obecnoś ci zasady daje, po hydrolizie uzyskanej iminy VIIe, zwią zek VIId posiadają cy podstawnik allilowy w położeniu syn względem grupy karboksylowej. Ten proces opisano w Przykładzie 11.

Rozdzielanie wszystkich powyższych mieszanin enancjomerów przy atomie węgla 1 (VIe i VIId) można prowadzić poprzez:

1) enzymatyczne rozdzielanie (Przykłady 9 i 13);

2) krystalizację z chiralnym kwasem (Przykład 14); lub

3) chemiczną derywatyzację (Przykład 6).

Po rozdzielaniu, określenie bezwzględnej stereochemii można przeprowadzić tak, jak to przedstawiono w Przykładzie 7.

Rozdzielanie i określanie stereochemii można prowadzić w taki sam sposób dla mieszanin enancjomerów przy atomie węgla 1, w którym podstawnik przy C2 jest w pozycji anti do grupy karboksylowej (VIi).

Zgodnie z tym, wynalazek następnie obejmuje sposób wytwarzania analogu peptydu o wzorze (I), w którym P1 oznacza podstawioną resztę kwasu aminocyklopropylokarboksylowego, zawierający etap:

sprzęgania peptydu wybranego z grupy obejmującej: APG-P6-P5-P4-P3-P2; APG-P5-P4-P3P2; APG-P4-P3-P2; APG-P3-P2; i APG-P2;

ze związkiem pośrednim P1 o wzorze:

PL 199 419 B1 w których R1 oznacza C1-6alkil lub C2-6alkenyl ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, CPG oznacza grupę zabezpieczającą karboksyl i APG oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową, i P6 do P2 mają powyżej zdefiniowane znaczenia.

Na koniec, wynalazek także obejmuje zastosowanie związku pośredniego o wzorze:

w których R1 oznacza C1-6alkil lub C2-6alkenyl ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, do otrzymywania związku o wzorze I zdefiniowanego powyżej.

P r z y k ł a d y

Niniejszy wynalazek ilustrują bardziej szczegółowo następujące nieograniczające przykłady.

Temperatury podano w stopniach Celsjusza. Procenty roztworu odpowiadają stosunkowi wagi do objętości, i proporcje roztworu odpowiadają stosunkowi objętości do objętości, jeśli nie zaznaczono tego inaczej. Widma jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) rejestrowano na spektrometrze Bruker 400 MHz; przesunięcia chemiczne (δ) przedstawiono w częściach na milion. Szybką chromatografię prowadzono na żelu krzemionkowym (SiO2) zgodnie z procedurą Still'a (W.C. Still i in., J. Org. Chem., (1978), 43, 2923).

Skróty stosowane w przykładach obejmują Bn: benzyl; Boc: tert-butylooksykarbonyl {Me3COC(O)}; BSA: albumina surowicy bydlęcej; CHAPS: 3-[(3-cholamidopropylo)-dimetyloamonio]-1-propanosulfonian; DBU: 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undek-7-en; CH2Cl2=DCM: chlorek metylenu; DEAD: azodikarboksylan dietylu; DIAD: azodikarboksylan diizopropylu; DIPEA: diizopropyloetyloamina; DMAP: dimetyloaminopirydyna; DCC: 1,3-dicykloheksylokarbodiimid; DME: 1,2-dimetoksyetan; DMF: dimetyloformamid; DMSO: dimetylosulfotlenek; DTT: ditiotreitol lub treo-1,4-dimerkapto-2,3-butanodiol; DPPA: azydek difenylofosforylu; EDTA: kwas etylenodiaminatetraoctowy; Et: etyl; EtOH: etanol; EtOAc: octan etylu; Et2O: eter dietylowy; HATU: heksafluorofosforan 0-7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy; HPLC: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa; MS: spektrometria masowa (MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Dizorption lonization-Time of Flight); FAB: bombardowanie szybkimi atomami; LAH: wodorek litowoglinowy; Me: metyl; MeOH: metanol; MES: kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy; NaHMDS: bis(trimetylosililo)amidek sodu; NMM: N-metylomorfolina; NMP: N-metylopirolidyna; Pr: propyl; Succ: 3-karboksypropanoil; PNA: 4-nitrofenyloamina lub p-nitroanilid; TBAF: fluorek tetra-n-butyloamoniowy; TBTU: tetrafluoroboran 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy; TCEP: chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny; TFA: kwas trifluorooctowy; THF: tetrahydrofuran; TIS: triizopropylosilan; TLC: chromatografia cienkowarstwowa; TMSE: trimetylosililoetyl; Tris/HCl: chlorowodorek tris(hydroksymetylo)-aminometanu.

Jednostki budulcowe P2

P r z y k ł a d 1A. Synteza bromometylo-8-chinoliny (1A).

Do dostępnego w handlu kwasu 8-chinolinokarboksylowego (2,5 g, 14,4 mmol) dodano czysty chlorek tionylu (10 ml, 144 mmola). Tę mieszaninę ogrzewano w temperaturze 80°C przez 1 godzinę przed oddestylowaniem nadmiaru chlorku tionylu pod zmniejszonym ciśnieniem. Do uzyskanego brunatnawego ciała stałego dodano absolutny EtOH (15 ml), ogrzewano w temperaturze 80°C przez 1 godzinę, po czym zatężono pod zmniejszonym ciś nieniem. Pozostałość podzielono pomiędzy EtOAc i nasycony wodny NaHCO3 i fazę organiczną osuszono (MgSO4), przesą czono i zatężono, uzyskują c brunatnawy olej (2,8 g). Tę substancję (około 14,4 mmola) dodano kroplami w ciągu 35 minut do zawiesiny LAH (0,76 g, 20,2 mmola)/Et2O, ochłodzonej do temperatury -60°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano powoli do temperatury -35°C przez 1,5 godziny przed zakończeniem reakcji. Reakcję za30

PL 199 419 B1 trzymano dodając powoli MgSO4 * 10 H2O przez 30 minut i następnie uwodniony THF. Mieszaninę podzielono pomiędzy Et2O i 10% wodny NaHCO3. Fazę organiczną osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono, uzyskując ż ółtawe ciało stałe (2,31 g, 80% łącznie z 2 etapów) odpowiadające alkoholowi. Alkohol (2,3 g, 11,44 mmola) rozpuszczono w mieszaninie AcOH/HBr (20 ml, 30% roztworu od firmy Aldrich) i ogrzewano w temperaturze 70°C przez 2,5 godziny. Mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do suchej masy, podzielono pomiędzy EtOAc (100 ml) i nasycony wodny NaHCO3, po czym osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono, uzyskując pożądany związek (1) w postaci brunatnawego ciała stałego (2,54 g, 100%).

P r z y k ł a d 1B. Synteza 2-fenylo-4-hydroksychinoliny (1B)

Dostępny w handlu benzoilooctan etylu (6,00 g, 31,2 mmola) ogrzewano w temperaturze 85°C (szczelnie zamknięta probówka) w 75 ml 30% NH4OH przez 2 godziny. Ciało stałe uzyskane po oziębieniu przesączono i ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w wodzie przez 2 godziny. Roztwór ekstrahowano trzy razy z zastosowaniem CH2Cl2. Warstwy organiczne połączono, osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono.

Żółtą pozostałość poddano szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym, eluując mieszaniną EtOAc:heksan (3:7), uzyskując odpowiedni amid w postaci białego ciała stałego, 1,60 g, wydajność 31%.

Ten amid (250 mg, 1,53 mmola) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną, stosując aparat Deana-Starka, z aniliną (143 mg, 1,53 mmola) i chlorowodorkiem aniliny (10 mg, 0,08 mmola) w toluenie (10 ml) przez 16 godzin. Roztwór zatężono, uzyskując brunatny olej, który zmieszano z kwasem polifosforowym (2 g) i ogrzewano w temperaturze 135°C przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną wylano do wody i wartość pH uregulowań do 8 z zastosowaniem 5 M NaOH. Wodną zawiesinę ekstrahowano dwukrotnie octanem etylu. Warstwy organiczne połączono, przemyto solanką, osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono. Pozostałość poddano szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym, eluując 3% MeOH w octanie etylu, uzyskując 2-fenylo-4-hydroksychinolinę (2), 67 mg, wydajność 20%.

¹H NMR (DMSO-d6) δ 8,11(d, J=7Hz, 1H), 7,86-7,83(m, 2H), 7,77(d, J=8Hz, 1H), 7,68(dd, J=8, 7Hz, 1H), 7,61-7,58(m, 3H), 7,35(dd, J=8, 7Hz, 1H), 6,34(s, 1H).

P r z y k ł a d 1C. Synteza 4-hydroksy-2-fenylo-7-metoksychinoliny (1C)

4-hydroksy-2-fenylo-7-metoksychinolina (e).

Roztwór benzoilooctanu etylu (b) (100,0 g, 0,52 mola), m-anizydynę (a) (128,1 g, 1,04 mola) i mieszaninę 4N HCl/dioksan (5,2 ml) w toluenie (1,0 l) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 6,25 godziny w aparacie Deana-Starka. Ochłodzony roztwór toluenowy przemyto kolejno wodnym 10% HCl (2 x 300 ml), 1N NaOH (2 x 300 ml), H2O (300 ml) i solanką (150 ml). Fazę toluenową

PL 199 419 B1 osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując mieszaninę 1,2:1,0 estru c i amidu d (144,6 g, wydajność surowego produktu 45%/38%) w postaci ciemnobrunatnego oleju. Surowy olej ogrzewano w temperaturze 280°C przez 80 minut, podczas oddestylowywania EtOH. Otrzymane ciemne ciało stale po ochłodzeniu roztarto z CH2Cl2 (200 ml). Zawiesinę przesączono i uzyskane ciało stałe przemyto CH2Cl2/ uzyskując związek e (22,6 g, 17% ze związku a) w postaci beżowego ciała stałego.

¹H NMR (DMSO-d6) δ 8,00(d, J=9,0Hz, 1H), 7,81-7,82(m, 2H), 7,57-7,59(m, 3H), 7,20(d, J=2,2Hz, 1H), 6,94(dd, J=9,0, 2,2Hz, 1H), 6,26(s, 1H), 3,87(s, 3H).

4-chloro-2-fenylo-7-metoksychinolina (1C).

Zawiesinę związku e (8,31 g, 33,1 mmola) w POCl3 (90 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 2 godziny (po ogrzewaniu otrzymano klarowny roztwór). Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość podzielono pomiędzy 1N NaOH (reakcja egzotermiczna, 10N NaOH dodano w celu utrzymania wysokiej wartości pH) i EtOAc (500 ml). Warstwę organiczną przemyto H2O (100 ml) i solanką (100 ml), następnie osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując związek 1C (8,60 g, 96%) w postaci jasnożółtego ciała stałego.

¹H NMR (DMSO-d6) δ 8,28-8,30(m, 2H), 8,20(s, 1H), 8,10(d, J=9,1Hz, 1H), 7,54-7,58(m, 3H), 7,52(d, J=2,5Hz, 1H), 7,38(dd, J=9,1, 2,5Hz, 1H), 3,98(s, 3H).

Tę reakcję powtórzono trzy razy i zawsze uzyskiwano wydajność 96-98%, znacznie większa od 68% wydajności opublikowanej w J. Med. Chem. 1997, 40, 1794.

P r z y k ł a d 2. Synteza Boc-4(R)-(naftalen-1-ylometoksy)proliny (2).

Dostępną w handlu Boc-4(R)-hydroksyprolinę (5,00 g, 21,6 mmola) rozpuszczono w THF (100 ml) i ochłodzono do temperatury 0°C. Przez 10 minut dodawano porcjami wodorek sodu (60% dyspersja w oleju, 1,85 g, 45,4 mmola) i zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodano 1-(bromometylo)naftalen (8,00 g, 36,2 mmola) (wytworzony zgodnie z opisem podanym przez E.A. Dixon i in., Can. J. Chem., (1981), 59, 2629-2641) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 18 godzin. Mieszaninę wylano do wody (300 ml) i przemyto heksanem. Warstwę wodną zakwaszono 10% wodnym roztworem HCl i ekstrahowano dwukrotnie octanem etylu. Warstwy organiczne połączono i przemyto solanką, osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (heksan:octan etylu:kwas octowy 49:49:2), uzyskując tytułowy związek w postaci bezbarwnego oleju (4,51 g, wydajność 56%).

Analiza ¹H NMR (DMSO-d6) wykazała obecność dwóch rotamerów: (8,05(m, 1H), 7,94 (m, 1H), 7,29(d, J=14Hz, 1H), 7,55-7,45(m, 4H), 4,96(m, 2H), 4,26 (brs, 1H), 4,12(dd, J=J=8Hz, 1H), 3,543,42(m, 2H), 2,45-2,34(m, 1H), 2,07-1,98(m, 1H) 1,36(s, (3/9) 9H), 1,34(s, (6/9) 9H).

P r z y k ł a d 3. Synteza Boc-4(R)-(S-chinolinometoksy)proliny (3).

Boc-4(R)-hydroksyprolinę (1,96 g, 8,5 mmola) w bezwodnym THF (20 ml) dodano do zawiesiny NaH (1,4 g, 60% w oleju, 34 mmole) w THF (100 ml). Tę mieszaninę mieszano 30 minut przed dodaniem bromometylo-8-chinoliny według Przykładu 1 (2,54 g, 11,44 mmola) w THF (30 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 70°C (5 godzin) przed ostrożnym usunięciem nadmiaru NaH z zastosowaniem uwodnionego THF. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciś nieniem i uzyskaną substancję rozpuszczono w EtOAc i H2O. Zasadową fazę wodną oddzielono i zakwaszono 10% wodnym roztworem HCl do wartości pH ~5, po czym ekstrahowano EtOAc (150 ml). Fazę orga32

PL 199 419 B1 niczną osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono, uzyskując brunatny olej. Oczyszczanie metodą szybkiej chromatografii (eluent: mieszanina 10% MeOH/CHCl3) dało pożądany związek w postaci jasnożółtego ciała stałego (2,73 g, 86%). HPLC (97,5%).

Analiza ¹H-NMR (DMSO-d6) wykazała obecność rotamerów w stosunku 6:4, δ 12-11,4(bs, 1H), 8,92(2 x d, J=4,14 i 4,14Hz, 1H), 8,38(2 x d, J=8,27 i 8,27Hz, 1H), 7,91(d, J=7,94Hz, 1H), 7,77(d, J=7,0Hz, 1H), 7,63-7,54(m, 2H), 5,14(2 x s, 2H), 4,32-4,29(m, 1H), 4,14-4,07(m, 1H), 3,52-3,44(m, 2H), 2,43-2,27(m, 1H), 2,13-2,04(m, 1H), 1,36 i 1,34(2 x s, 9H).

P r z y k ł a d 4A. Wytwarzanie Boc-4(R)-(7-chlorochinolino-4-okso)proliny (4A)

Dostępny w handlu ester metylowy Boc-4(S)-hydroksyproliny (500 mg, 2,04 mmola) i 7-chloro4-hydroksychinolinę (440 mg, 2,45 mmola) umieszczono w suchym THF (10 ml) o temperaturze 0°C. Dodano trifenylofosfinę (641 mg, 2,95 mmola), a następnie powoli dodano DIAD (426 mg, 2,45 mmola). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 godzin. Mieszaninę reakcyjną następnie zatężono, rozpuszczono w octanie etylu i ekstrahowano trzy razy z zastosowaniem 1N HCl. Fazę wodną zalkalizowano stosując Na2CO3 i ekstrahowano dwukrotnie octanem etylu. Warstwy organiczne połączono, osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono, uzyskując żółty olej. Olej oczyszczono metodą szybkiej chromatografii, uzyskując ester metylowy związku 4A w postaci białego ciała stałego, 498 mg, wydajność 58%.

Ten ester metylowy (400 mg, 0,986 mmola) hydrolizowano stosując 1M wodny wodorotlenek sodu (1,7 ml, 1,7 mmola) w metanolu (4 ml), w temperaturze 0°C, przez 3 godziny. Roztwór zatężono w celu usunięcia metanolu i zobojętniono stosując 1m. wodny roztwór HCl. Zawiesinę zatężono do suchej masy i rozpuszczono w metanolu (20 ml), sole odsączono i przesącz zatężono, uzyskując pożądany związek (4A) w postaci białego ciała stałego, 387 mg, wydajność ilościowa.

¹H NMR (DMSO-d6) (mieszanina rotamerów około 1:1) δ 8,74(d, J=5Hz, 1H), 8,13-8,09(m, 1H), 7,99 i 7,98(s, 1H), 7,58(d, J=9Hz, 1H), 7,02(d, J=5Hz, 1H), 5,26-5,20(m, 1H), 4,10- 4,01(m, 1H), 3,813,72(m, 1H), 3,59(dd, J=12, 10Hz, 1H), 2,41-2,31(m, 2H), 1,34 i 1,31(s, 9H).

P r z y k ł a d 4B. Synteza Boc-4(R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)proliny (4B)

1-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4(R)-[(7-metoksy-2-fenylo-4-chinolinylo)oksy]-L-prolina (4B).

Tert-butanolan potasu (8,16 g, 72,7 mmola) dodawano małymi porcjami, przez 15 minut, do roztworu dostępnej w handlu 4-(S)-hydroksyproliny (6,73 g, 29,1 mmola) w DMSO (83 ml) i utrzymywano w temperaturze 25°C. Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 1,5 godziny. Chloro-2-fenylo-7-metoksychinolinę 1C (8,61 g, 32,0 mmole) dodawano w 4 porcjach przez 15 minut do mieszaniny reakcyjnej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 25°C przez 19 godzin.

Uzyskaną zawiesinę wylano do H2O (650 ml) i przemyto Et2O (3 x 150 ml) w celu usunięcia nadmiaru chlorochinoliny (później stwierdzono, że bardziej efektywny jest EtOAc). Warstwę wodną zakwaszono 1N wodnym roztworem HCl (38 ml obliczono dla wymaganego 1,5 równoważnika, 43,6 ml) do wartości pH 4-5. Białe ciało stałe, które wytrąciło się odzyskano przez odsączenie. Wilgotne ciało stałe osuszono

PL 199 419 B1 pod zmniejszonym ciśnieniem nad P2O5, uzyskując pochodną proliny 4B (12,6 g, 91%, zawierającą

2,3% wagowych DMSO) w postaci beżowego ciała stałego.

¹H NMR (DMSO-d6) δ (mieszanina rotamerów 2:1) 8,27(d, J=7,0Hz, 2H), 8,00, 7,98(2d, J=9,2, -9,2Hz, 1H), 7,48-7,56(m, 3H), 7,45, 7,43 (2s, 1H), 7,39(d, J=2,5Hz, 1H), 7,17(dd, J=9,2, 2,5Hz, 1H), 5,53-5,59(m, 1H), 4,34-4,41(m, 1H), 3,93(s, 3H), 3,76(szeroki s, 2H), 2,63-2,73(m, 1H), 2,32-2,43(m, 1H), 1,36, 1,33 (2s, 9H).

Jednostki budulcowe P1

P r z y k ł a d 5. Synteza mieszaniny izomerów (1R,2R)/(1S,2R) kwasu 1-amino-2-etylocyklopropylokarboksylowego

a) Do zawiesiny chlorku benzylotrietyloamoniowego (21,0 g, 92,19 mmola) w 50% wodnym roztworze NaOH (92,4 g w 185 ml H2O) dodano kolejno malonian di-tert-butylu (20,0 g, 92,47 mmola) i 1,2-dibromobutan (30,0 g, 138,93 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano energicznie przez noc w temperaturze pokojowej, następnie dodano mieszaninę wody z lodem. Surowy produkt ekstrahowano CH2Cl2 (3x) i kolejno przemyto wodą (3x) i solanką. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono. Pozostałość poddano szybkiej chromatografii (7 cm, 2 do 4% Et2O w heksanie), uzyskując pożądaną pochodną cyklopropanu 5c (19,1 g, 70,7 mmola, wydajność 76%).

¹H NMR (CDCl3) δ 1,78-1,70(m, 1H), 1,47(s, 9H), 1,46(s, 9H), 1,44-1,39(m, 1H), 1,26-1,64 (m, 3H), 1,02(t, 3H, J=7,6Hz).

b) Do zawiesiny tert-butanolanu potasu (6,71 g, 59,79 mmola, 4,4 równoważnika) w suchym eterze (100 ml) w temperaturze 0°C dodano H₂O (270 pl, 15,00 mmoli, 1,1 równoważnika). Po 5 minutach do zawiesiny dodano diester związku 5c (3,675 g, 13,59 mmola) w eterze (10 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, następnie wylano do mieszaniny wody z lodem i przemyto eterem (3x). Warstwę wodną zakwaszono 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego w temperaturze 0°C i ekstrahowano AcOEt (3x). Połączone warstwy organiczne przemyto kolejno wodą (2x) i solanką. Po zwykłej obróbce (Na2SO4, przesączenie, zatężenie) wydzielono pożądany kwas 5d w postaci jasnożółtego oleju (1,86 g, 8,68 mmola, wydajność 64%).

¹H NMR (CDCl3) δ 2,09-2,01(m, 1H), 1,98(dd, J=3,8, 9,2Hz, 1H), 1,81-1,70(m, 1H), 1,66(dd, J=3,0, J=8,2Hz, 1H), 1,63-1,56(m, 1H), 1,51(s, 9H), 1,0(t, J=7,3Hz, 3H).

c) Do kwasu 5d (2,017 g, 9,414 mmola) w suchym benzenie (32 ml) dodano kolejno Et3N (1,50 ml, 10,76 mmola, 1,14 równoważnika) i DPPA (2,20 ml, 10,21 mmola, 1,08 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3,5 godziny, a następnie dodano 2-trimetylosililoetanol (2,70 ml, 18,84 mmola, 2,0 równoważniki). Temperaturę wrzenia utrzymywano przez noc, następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono Et2O i kolejno przemyto 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, wodą, nasyconym wodnym NaHCO3, wodą (2x) i solanką. Po zwykłej obróbce (MgSO4, przesączenie, zatężenie) pozostałość oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (5 cm, mieszanina 10% AcOEt-heksan), uzyskując pożądany karbaminian 5e (2,60 g, 7,88 mmola, wydajność 84%) w postaci jasnożółtego oleju.

MS (FAB) 330 (MH⁺); ¹H NMR (CDCl3) δ 5,1(bs, 1H), 4,18-4,13(m, 2H), 1,68-1,38(m, 4H), 1,45(s, 9H), 1,24-1,18(m, 1H), 1,00-0,96(m, 5H), 0,03(s, 9H).

d) Do karbaminianu 5e (258 mg, 0,783 mmola) dodano 1,0M roztwór TBAF w THF (940 pl, 0,94 mmola, 1,2 równoważnika). Po 4,5 godzinach dodano dodatkową ilość 1,0M TBAF (626 pl, 0,63 mmola, 0,8 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, ogrze34

PL 199 419 B1 wano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 30 minut i następnie rozcieńczono AcOEt. Roztwór przemyto kolejno wodą (2x) i solanką.

Po zwykłej obróbce (MgSO4, przesączenie, zatężenie) wydzielono pożądaną aminę 5f (84 mg, 0,453 mmola, wydajność 58%) w postaci jasnożółtej cieczy.

¹H NMR (CDCl3) δ 1,96(bs, 2H), 1,60-1,40(m, 2H), 1,47(s, 9H), 1,31-1,20(m, 1H), 1,14(dd, J=4,1, 7,3Hz, 1H), 1,02(dd, J=4,1, 9,2Hz, 1H), 0,94(t, J=7,3Hz, 3H).

P r z y k ł a d 6. Chemiczne rozdzielanie izomerów (1R, 2R)/(1S, 2R) karboksylanu t-butylo-1-amino-2-etylocyklopropylu (według Przykładu 5)

Związek 5e według Przykładu 9 (8,50 g, 25,86 mmola) potraktowano mieszaniną 1M TBAF/THF (26 ml) w temperaturze wrzenia przez 45 minut. Ochłodzoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc, przemyto wodą (3x) i solanką (1x), następnie osuszono (MgSO4), przesączono i zątężono, uzyskując wolną aminę w postaci jasnożółtego oleju. Wolną aminę rozpuszczono w bezwodnym CH2Cl2 (120 ml) i dodano kolejno NMM (8,5 ml, 77,57 mmola), związek 2 (Przykład 2) (10,08 g, 27,15 mmola) i HATU (11,79 g, 31,03 mmola).

Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, następnie poddano opisanej uprzednio obróbce. Surową mieszaninę diastereoizomerów rozdzielono metodą szybkiej chromatografii (eluent - mieszanina heksan: Et2O; 25:75), uzyskując dipeptyd 6a (mniej polarna plamka elucyjna) w postaci białej pianki (4,42 g; 64% wydajności teoretycznej) i 6b (bardziej polarna plamka elucyjna) w postaci pianki o barwie kości słoniowej (4 g, 57% wydajności teoretycznej) . Na tym etapie udało się rozdzielić oba izomery, ale ich bezwzględna stereochemia pozostaje nieznana.

P r z y k ł a d 7. Określanie bezwzględnej stereochemii związków 6a i 6b metodą korelacji ze znanym (1R-amino-2R-etylocyklopropylokarboksylanem t-butylu

Prof. A. Charette, z Uniwersytetu w Montrealu, uzyskał związek 7a o bezwzględnej stereochemii przestawionej powyżej, którą określono metodą krystalografi rentgenowskiej (J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 12721). Związek 7a (13,2 mg, 0,046 mmola) rozpuszczono w mieszaninie 1M HCl/EtOAc

PL 199 419 B1 (240 μΐ) i mieszano w przybliżeniu przez 48 godzin. Mieszaninę zatężono do suchej masy, uzyskując związek 7b w postaci jasnożółtej pasty, który sprzężono ze związkiem 2 (18 mg, 0,049 mmola) zgodnie z opisem według Przykładu 6, stosując NMM (20,3 μί, 0,185 mmola) i HATU (21,1 mg, 0,056 mmola) w CH2Cl2. Surową substancję oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (eluent heksan: Et2O; 50:50), uzyskując dipeptyd 7c w postaci oleju (7,7 mg; 31%). Metodą porównania TLC, HPLC i NMR dipeptydu 7c stwierdzono, że jest on identyczny jak mniej polarny związek 6a otrzymany według Przykładu 6, zatem zidentyfikowano bezwzględną stereochemię związku 6a jako (1R,2R).

P r z y k ł a d 8. Wytwarzanie izomerów (1R,2R)/(1S,2R) kwasu 1-Boc-amino-2-etylocyklopropylokarboksylowego (8a):

Karbaminian 5e według Przykładu 5 (2,6 g, 7,88 mmola) mieszano przez 40 minut w TPA, w temperaturze 0°C. Mieszaninę następnie zatężono i rozcieńczono THF (10 ml). Dodano wodny roztwór NaOH (700 mg, 17,5 mmol w 8,8 ml H2O), a następnie roztwór w THF (13 ml) (Boc)2O (2,06 g, 9,44 mmola, 1,2 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej (pH utrzymywano na poziomie 8, dodając gdy to konieczne 10% wodny roztwór NaOH), następnie rozcieńczono H2O, przemyto Et2O (3x) i zakwaszono w temperaturze 0°C 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego. Warstwę wodną ekstrahowano EtOAc (3x) i kolejno przemyto H2O (2x) i solanką. Po zwykłej obróbce (MgSO4, przesączenie, zatężenie) wydzielono pożądany Boc-zabezpieczony aminokwas (8a) (788 mg, 3,44 mmola, wydajność 44%).

¹H NMR (CDCl3) δ 5,18(bs, 1H), 1,64-1,58(m, 2H), 1,55-1,42(m, 2H), 1,45(s, 9H), 1,32-1,25 (m, 1H), 0,99(t, 3H, J=7,3Hz).

Wytwarzanie izomerów (1R,2R)/(1S,2R) estru metylowego kwasu 1-Boc-amino-2-etylocyklopropylokarboksylowego (8b):

Boc-pochodną związku 8a (0,30 g, 1,31 mmola) rozpuszczono w Et2O (10 ml) i potraktowano świeżo przygotowanym roztworem diazometanu w Et2O, w temperaturze 0°C, aż do uzyskania żółtego zabarwienia nieznacznego nadmiaru diazometanu. Po wymieszaniu przez 20 minut w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną zatężono do suchej masy, uzyskując związek 8b w postaci klarownego bezbarwnego oleju (0,32 g, 100%).

¹H NMR (CDCl3) δ 5,1(bs, 1H) , 3,71(s, 3H), 1,62-1,57(m, 2H), 1,55(s, 9H), 1,53-1,43(m, 1H), 1,28-1,21(m, 2H), 0,95(t, J=7,3Hz, 3H).

P r z y k ł a d 9. Enzymatyczne rozdzielanie izomerów (1R,2R)/(1S, 2R) Boc-1-amino-2-etylocyklopropylokarboksylanu metylu

PL 199 419 B1 *Analiza metodą HPLC z zastosowaniem kolumny Chiralcel® OD-H **Inne estry są także dopuszczalne (np. Et)

a) Mieszaninę enancjomerów (1S,2R)/(1R,2R) estru metylowego kwasu 1-Boc-amino-2-etylokarboksylowego według Przykładu 8 (0,31 g, 1,27 mmola) rozpuszczono w acetonie (3 ml) i następnie rozcieńczono wodą (7 ml), szybko mieszając. Wartość pH roztworu uregulowano do 7,5, stosując 0,05M wodny roztwór NaOH przed dodaniem enzymu Alcalase® [ekstrakt 2.4L z firmy Novo Nordisk Industrials] (300 mg). Podczas inkubacji pH stabilizowano stosując NaOH i do monitorowania dodawania roztworu NaOH zastosowano pH-stat. Po 40 godzinach mieszaninę rozcieńczono EtOAc i H2O (z 5 ml nasyconego roztworu NaHCO3) i fazy rozdzielono. Fazę wodną zakwaszono 10% wodnym roztworem HCl i ekstrahowano EtOAc, osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono, uzyskując kwas 9a (48,5 mg). Bezwzględną stereochemię określono z zastosowaniem korelacji opisanej w Przykładach 6 i 7.

b) Traktowanie próbki kwasu 9a diazometanem w Et2O dało ester metylowy, a następnie analiza HPLC z zastosowaniem chiralej kolumny [Chiralcel® OD-H, mieszanina 2,5% izopropanol/heksan, izokratyczna] wykazała obecność izomeru (S,R) w proporcji 51:1.

a') Fazę organiczną osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono, uzyskując niezhydrolizowane estry (0,248 g). Tę substancję poddawano powyższej obróbce enzymatycznej aż do uzyskania stabilnej wartości pH (98 godzin). Po ekstrakcji, jak poprzednio, odzyskano 0,146 mg (100%) niezhydrolizowanego estru. Analiza metodą HPLC z zastosowaniem chiralnej kolumny wykazała stosunek >50:1 w przewadze izomeru (1R,2R).

b') Fazę wodną zakwaszono 10% wodnym roztworem HCl i ekstrahowano EtOAc, osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono, uzyskując analog kwasu (82 mg). Część tej substancji potraktowano diazometanem i następnie zanalizowano jak poprzednio metodą HPLC z zastosowaniem chiralnej kolumny, uzyskując stosunek 65:1 dla pochodnej (1S,2R).

P r z y k ł a d 10. Synteza izomerów (1R,2S)/(1S,2S) kwasu 1-amino-2-etylocyklopropylokarboksylowego

Wychodząc z kwasu 5d opisanego w Przykładzie 5:

c) Do związku 5d (1,023 g, 4,77 mmola) w CH₃CN (25 ml) dodano kolejno DBU (860 pl/ 5,75 mmola, 1,2 równoważnika) i bromek allilu (620 pl, 7,16 mmola, 1,5 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej i następnie zatężono. Pozostałość rozcieńczono Et2O i kolejno przemyto 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego (2x), H2O, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, N2O (2x) i solanką. Po zwykłej obróbce (MgSO4, przesączenie, zątężenie) wydzielono pożądany ester 10a (1,106 g, 3,35 mmola, wydajność 91%) w postaci bezbarwnego oleju.

MS (FAB) 255 (MH⁺); ¹H NMR (CDCl3) δ 5,96-5,86(m, 1H), 5,37-5,22(m, 2H), 4,70-4,65(m, 1H), 4,57-4,52(m, 1H), 1,87-1,79(m, 1H), 1,47(s, 9H), 1,45-1,40(m, 1H), 1,33-1,24(m, 3H), 1,03(t, J=7,3Hz, 3H).

PL 199 419 B1

d) Do estru 10a (1,106 g, 4,349 mmola) w suchym CH2Cl2 (5 ml) w temperaturze pokojowej dodano TFA (5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1,5 godziny i następnie zatężono, uzyskując związek 10b (854 mg, 4,308 mmola, wydajność 99%).

MS (FAB) 199 (MH⁺); ¹H NMR (CDCl3) δ 5,99-5,79(m, 1H), 5,40-5,30(m, 2H), 4,71-4,62 (m, 2H), 2,22-2,00(m, 2H), 1,95-1,88(m, 1H), 1,84-1,57(m, 2H), 0,98(t, J=7,3Hz, 3H).

e) Do kwasu 10b (853 mg, 4,30 mmola) w suchym benzenie (14,8 ml) dodano kolejno Et3N (684 pl, 4,91 mmola, 1,14 równoważnika) i DPPA (992 pi, 4,60 mmola, 1,07 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 4,5 godziny, a następnie dodano 2-trimetylosililoetanol (1,23 ml, 8,58 mmola, 2,0 równoważniki). Temperaturę wrzenia utrzymywano przez noc, następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono Et2O i kolejno przemyto 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, wodą, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, wodą (2x) i solanką. Po zwykłej obróbce (MgSO4, przesączenie, zatężenie) pozostałość poddano szybkiej chromatografii (5 cm, mieszanina 10 do 15% AcOEt-heksan), uzyskując karbaminian 10c (1,212 g, 3,866 mmola, wydajność 90%) w postaci jasnożółtego oleju.

MS (FAB) 314 (MH⁺); ¹H NMR (CDCl3) δ 5,93-5,84(m, 1H), 5,32-5,20(m, 2H), 5,05(bs, 1H),

4.60- 4,56(m, 2H), 4,20-4,11(m, 2H), 1,71-1,60(m, 3H), 1,39-1,22(m, 1H), 1,03(t, J=7,6Hz, 3H), 0,960,86(m, 1H), 0,04(s, 9H).

f) Do karbaminianu 10c (267 mg, 0,810 mmola) dodano 1,0M roztwór TBAF w THF (1,62 ml, 1,62 mmola, 2,0 równoważniki). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 30 minut i następnie rozcieńczono AcOEt. Roztwór przemyto kolejno wodą (2x) i solanką. Po zwykłej obróbce (MgSO4, przesączenie, zatężenie) wydzielono pożądaną aminę 10d (122 mg, 0,721 mmola, wydajność 89%) w postaci jasnożółtej cieczy.

¹H NMR (CDCl3) δ 5,94-5,86(m, 1H), 5,31-5,22(m, 2H), 4,58(d, J=5,7Hz, 2H), 1,75(bs, 2H),

1.61- 1,53(m, 2H), 1,51-1,42(m, 2H), 1,00(t, J=7,3Hz, 3H), 0,70-0,62(m, 1H).

P r z y k ł a d 11. Synteza izomerów (1R, 2S)/(1S, 2S) 1-amino-2-winylocyklopropylokarbo-

a) Do roztworu THF (180 ml) tert-butanolanu potasu (4,62 g, 41,17 mmola, 1,1 równoważnika) w temperaturze -78°C dodano dostępną w handlu iminę 11a (10,0 g, 37,41 mmola) w THF (45 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury 0°C i mieszano w tej temperaturze przez 40 minut. Mieszaninę następnie ochłodzono ponownie do temperatury -78°C w celu dodania 1,4-dibromobutenu związku 11b (8,0 g, 37,40 mmola) i następnie mieszano w temperaturze 0°C przez 1 godzinę i ochłodzono ponownie do temperatury -78°C w celu dodania tert-butanolanu potasu (4,62 g, 41,17 mmola, 1,1 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną na koniec mieszano jeszcze przez 1 godzinę w temperaturze 0°C i zatężono, uzyskując związek 11c. b, c, d) Związek 11c rozpuszczono w Et3O (265 ml) i potraktowano 1N wodnym roztworem HCl (106 ml). Po 3,5 godzinach, w temperaturze pokojowej warstwy rozdzielono i warstwę wodną przemyto Et2O (2x) i zalkalizowano nasyconym wodnym roztworem NaHCO3. Pożądaną aminę ekstrahowano Et2O (3x) i połączone organiczne ekstrakty przemyto solanką. Po zwykłej obróbce (MgSO4, przesączenie, zatężenie) pozostałość potraktowano 4N roztworem HCl w dioksanie (187 ml, 748 mmola). Po zatężeniu chlorowodorek 11d wydzielono w formie brązowego ciała stałego (2,467 g, 12,87 mmola, wydajność 34%).

PL 199 419 B1 ¹H NMR (CDCl3) δ 9,17(bs, 3H), 5,75-5,66(m, 1H), 5,39(d, J=17,2Hz, 1H), 5,21(d, J=10,2Hz, 1H), 4,354,21(m, 2H), 2,77-2,70(m, 1H), 2,05(dd, J=6,4, 10,2Hz, 1H), 1,75(dd, J=6,4, 8,3Hz, 1H), 1,33(t, J=7,0Hz, 3H).

P r z y k ł a d 12. Wytwarzanie izomerów (1R,2S/1S,2S) estru etylowego kwasu 1-Bocamino-2-winylocyklopropylokarboksylowego

Chlorowodorek 11d (1,0 g, 5,2 mmola) i (Boc)2O (1,2 g, 5,7 mmola) rozpuszczono w THF (30 ml) i potraktowano DMAP (0,13 g, 1,04 mmola, 0,2 równoważnika) i diizopropyloetyloaminą (2,8 ml, 15,6 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano 24 godziny przed rozcieńczeniem EtOAc (40 ml) i przemyto kolejno nasyconym roztworem NaHCO3 (wodnym), 5% wodnym roztworem HCl i nasyconą solanką. Fazę organiczną osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono, uzyskując po oczyszczeniu metodą szybkiej chromatografii (15% EtOAc/heksan) związek 12a (0,29 g, 23%).

¹H NMR (CDCl3) δ 5,80-5,72(m, 1H), 5,29-5,25(dd, J=17,2, 17,2Hz, 1H), 5,24-5,1(bs, 1H), 5,10(dd, J=9,2, 9,2Hz, 1H), 4,22-4,13(m, 2H), 2,15-2,04(m, 1H), 1,85-1,73(bs, 1H), 1,55-1,5(m, 1H), 1,49(s,9H), 1,26(t, J=7,3Hz, 3H).

P r z y k ł a d 13. Enzymatyczne rozdzielanie izomerów (1R,2S)/(1S,2S) 1-amino-2-winylo-cyklopropylokarboksylanu etylu

*Analiza metodą HPLC, z zastosowaniem kolumny Chiralcel® OD-H

a) Racemiczną pochodną 12a (0,29 g, 1,14 mmola) rozpuszczono w acetonie (5 ml) i rozcieńczono

H2O (10 ml). Przed dodaniem Alcalase® (300 mg) wartość pH uregulowano do 7,2 przy pomocy 0,2N wodnego roztworu NaOH. W celu utrzymania stałej wartości pH podczas inkubacji, roztwór NaOH dodawano przez dozujący pH-stat w czasie 9 dni, aż do dodania teoretycznej ilości zasady. Przeprowadzając ekstrakcję kwas/zasada, zgodnie z opisem według Przykładu 9, wydzielono niezhydrolizowany ester (0,15 g, 100%) i zhydrolizowaną substancję (0,139 g, 95%). Analiza niezhydrolizowanego estru metodą HPLC, z zastosowaniem chiralnej kolumny wykazała proporcję 43:1 pożądanego związku 13c. Związek 206 (w którym R1 oznacza winyl, Tabela 2) uwodorniano (10,8 mg, 0,015 mmola w 1 ml EtOH, z zastosowaniem około 1 ml 20% Pd(OH)2, pod ciśnieniem 1 atm H2, przez 45 minut), uzyskując związek 214 (w którym R1 oznacza etyl, Tabela 2). Związkowi 214 przypisano stereochemię (1R,2R) w oparciu o chemiczną korelację zgodnie z opisem według Przykładów 6 i 7, co wskazuje, że związek 206 (R1 = winylo) ma taką samą konfigurację bezwzględną jak związek 13c (1R,2S ponieważ R1=winyl).

Warunki analizy HPLC: Chiralcel® OD-H (4,6 mm x 25 cm), warunki izokratyczne z zastosowaniem jako fazy ruchomej 2,5% roztworu izopropanol/heksan.

P r z y k ł a d 14. Rozdzielanie izomerów (1R,2S)/(1S,2S) karboksylanu 1-amino-2-winylocyklopropylu metodą krystalizacji z kwasu dibenzoilo-D-winowego

PL 199 419 B1

Do roztworu surowego racemicznego (1S,2S i 1R,2S) 1-amino-2-winylocyklopropylokarboksylanu etylu [otrzymanego z estru etylowego N-(difenylometyleno)glicyny (25,0 g, 93,5 mola) zgodnie z opisem według Przykładu 13] w EtOAc (800 ml) dodano kwas dibenzoilo-D-winowy (33,5 g, 93,5 mola). Mieszaninę ogrzano do temperatury wrzenia, pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie ochłodzono do temperatury 0°C. Białe ciało stałe otrzymano po 30 minutach. Ciało stałe odsączono, przemyto EtOAc (100 ml) i osuszono na powietrzu. Ciało stałe zawieszono w acetonie (70 ml), sonikowano i przesączono (3x). Następnie ciało stałe krystalizowano dwukrotnie z gorącego acetonu (zbiór A). Ługi macierzyste zatężono i pozostałość krystalizowano trzy razy z gorącego acetonu (zbiór B). Te dwa zbiory bezpostaciowych białych ciał stałych soli kwasu dibenzoilo-D-winowego połączono (5,53 g) i zawieszono w mieszaninie Et2O (250 ml) i nasyconego roztworu NaHCO3 (150 ml). Warstwę organiczną przemyto solanką, osuszono (MgSO4) i przesączono. Przesącz rozcieńczono 1N roztworem HCl/Et2O (100 ml) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Oleistą pozostałość zatężono z CCI4, uzyskując chlorowodorek 1(R)-amino-2(S)-winylocyklopropanokarboksylanu etylu (940 mg, wydajność 11%) w postaci białego higroskopijnego ciała stałego, dla którego bezwzględną stereochemię określono przez korelację ze związkiem 13c według Przykładu 13.

[a]²⁵D +39,5°C (c 1,14 MeOH); [α]²⁵365 +88,5°C (c 1,14 MeOH); ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,07 (szeroki s, 2H), 5,64(ddd, J=17,2, 10,4, 8,7Hz, 1H), 5,36(dd, J=17,2, 1,6Hz, 1H), 5,19(dd, J=10,4, 1,6Hz, 1H), 4,24-4,16(m, 2H), 2,51-2,45(m, piki rozbudowane przestrzennie przez DMSO, 1H), 1,84(dd, J=10,0, 6,0Hz, 1H), 1,64(dd, J=8,3, 6,0Hz, 1H), 1,23(t, J=7,1Hz, 3H); MS (ESI) m/z 156 (MH)⁺; czystość enancjomeryczną określono jako 91% nadmiar enancjomeryczny, metodą analizy HPLC (kolumna CHIRALPAK AS®, Hex:i-PrOH) pochodnej Boc. (Przykład 13).

Jednostki budulcowe P4-P2

P r z y k ł a d 15. Synteza jednostki: Ac-Chg-Chg-Pro (4(R)-naftalen-1-ylometoksy)-OH (15g)

Boc·

OH o

Boc·

15c opisany w Przykładzie 2

15a

15b

Boc-Chg·

15d

15e

Ac-Chg-Chg·

15f

Ac-Chg-Chg·

15g

PL 199 419 B1

Związek 15a (identyczny jak związek 2 według Przykładu 2) (4,45 g, 11,98 mmola) rozpuszczono w bezwodnym CH3CN (60 ml), kolejno dodano DBU (2,2 ml, 14,38 mmola) i bromek allilu (1,1 ml, 13,18 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano 24 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę zatężono, uzyskany olej rozcieńczono EtOAc i wodą, i kolejno przemyto wodą (2x) i solanką (1x). Warstwę EtOAc osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono do suchej masy. Żółty olej oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (eluent: heksan:EtOAc; 90:10 do 85:15), uzyskując produkt 15b w postaci żółtego oleju (związek 2, 4,17 g; wydajność 85%).

MS (FAB) 412 MH⁺; ¹H NMR (CDCl3), mieszanina rotamerów, około 1:2, δ (d, J=8Hz, 1H), 7,87(d, J=8Hz, 1H), 7,82(d, J=8Hz, 1H), 7,55-7,41(m, 4H), 5,95-5,85(m, 1H), 5,34-5,21(m, 2H), 5,034,88(m, 2H), 4,70-4,56(m, 2H), 4,48 & 4,39(t, J=8, 15Hz, 1H), 4,28-4,23(m, 1H), 3,81-3,55(m, 2H), 2,46-2,36(m, 1H), 2,13-2,05(m, 1H), 1,44 & 1,41(s, 9H).

Związek 15b (2,08 g, 5,05 mmola) traktowano przez 30 minut, w temperaturze pokojowej mieszaniną roztworem 4N HCl/dioksan. Zatężenie do suchej masy dało odpowiednią aminę-HCl w postaci oleju. Aminę-HCl 15c rozpuszczono w bezwodnym DCM (25 ml) i kolejno dodano NMM (2,2 ml, 20,22 mmola), Boc-Chg-OH^H₂O (1,53 g, 5,56 mmola) i TBTU (1,95 g, 6,07 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, następnie rozcieńczono EtOAc i kolejno przemyto 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego (2x), nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (2x), wodą (2x) i solanką (1x). Warstwę EtOAc osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono do suchej masy, uzyskując surowy produkt 15d w postaci żółtawo-białej pianki (około 2,78 g, wydajność 100%).

MS (FAB) 551,4 MH⁺; ¹H NMR (CDCl3) δ 8,03 (d, J=8Hz, 1H), 7,86(bd, J=8,5Hz, 1H), 7,84(d, J=8Hz, 1H), 7,56-7,40(m, 4H), 5,92-5,85(m, 1H), 5,31(dd, J=1, 17Hz, 1H), 5,22(dd, J=1, 10Hz, 1H), 5,17(d, J=9Hz, 1H), 5,05(d, J=12Hz, 1H), 4,91(d, J=12HZ, 1H), 4,67-4,60(m, 3H), 4,31-4,27(m, 2H), 4,16(bd, J=11Hz, 1H), 3,71(dd, J=4, 11Hz, 1H), 2,47-2,41 (m, 1H), 2,08-1,99(m, 1H), 1,85-1,63(m, 5H), 1,44-1,40(m, 1H), 1,36(s, 9H), 1,28-1,00(m, 5H).

Surowy dipeptyd 15d (około 5,05 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (25 ml), jak opisano w syntezie związku 15c. Surowy chlorowodorek sprzężono z Boc-Chg-OH^H₂O (1,53 g, 5,55 mmola), z zastosowaniem NMM (2,22 ml, 20,22 mmola) i TBTU (1,95 g, 6,07 mmola) w DCM (25 ml), jak opisano w syntezie związku 15d, uzyskując surowy tripeptyd 15e w postaci żółtej oleistej pianki. Surową substancję oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (eluent: heksan:EtOAc; 80:20 do 75:25), uzyskując tripeptyd 15e w postaci białej pianki (2,75 g; wydajność 79%, łącznie z 2 etapów).

MS (FAB) 690,5 MH⁺; ¹H NMR (CDCl3), głównie jeden rotamer, δ 8,06(d, J=8Hz, 1H), 7,87(bd, J=8,5Hz, 1H), 7,82(d, J=8Hz, 1H), 7,57-7,40(m, 4H), 6,41(d, J=8,5Hz, 1H), 5,92-5,84(m, 1H), 5,31(dd, J=1, 17Hz, 1H), 5,23(dd, J=1, 10,5Hz, 1H), 5,04(d, J=12Hz, 1H), 4,98(bd, J=7Hz, 1H), 4,93(d, J=12Hz, 1H), 4,63-4,58(m, 4H), 4,29-4,25 (m, 1H), 4,10-4,07(m, 1H), 3,90-3,84(m, 1H), 3,72(dd, J=4, 11Hz, 1H), 2,48-2,40(m, 1H), 2,07-1,99(m, 1H), 1,83-1,55 (m, 12H), 1,43(s, 9H), 1,23-0,89(m, 10H).

Tripeptyd 15e (2,75 g, 3,99 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (20 ml) jak opisano w syntezie związku 15c. Surowy chlorowodorek rozpuszczono w bezwodnym DCM (20 ml), kolejno dodano NMM (1,75 ml, 15,94 mmola) i bezwodnik octowy (752 pl, 7,97 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, następnie rozcieńczono EtOAc. Warstwę organiczną przemyto kolejno 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego (2x), nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (2x) , wodą (2x) i solanką (1x), osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono do suchej masy, uzyskując surowy tripeptyd 15f w postaci białej pianki (2,48 g, wydajność 98%).

MS (FAB) 632,4 MH+I; ¹H NMR (CDCl3), głównie jeden rotamer, δ 8,06(bd, J=8Hz, 1H),7,87 (bd, J=8Hz, 1H), 7,83(d, J=8Hz, 1H), 7,58-7,40(m, 4H), 6,36(d, J=9Hz, 1H), 6,01(d, J=9Hz, 1H), 5,945,83(m, 1H), 5,34-5,28(m, 1H), 5,25-5,21(m, 1H), 5,05(d, J=12Hz, 1H), 4,94(d, J=12Hz, 1H), 4,644,57(m, 4H), 4,30-4,23(m, 2H), 4,12-4,08(m, 1H), 3,73(dd, J=4, 11Hz, 1H), 2,49-2,42(m, 1H), 2,082,01(m, 1H), 1,99(s, 3H), 1,85-1,53(m, 11H), 1,25-0,88(m, 11H).

Surowy tripeptyd 15f (2,48 g, 3,93 mmola) rozpuszczono w bezwodnej mieszaninie CH3CN:DCM (20 ml). Kolejno dodano trifenylofosfinę (53,5 mg, 0,200 mmola) i katalizator tetra-kis(trifenylofosfino)-pallad (0) (117,9 mg, 0,102 mmola), a następnie pirolidynę (353,9 pl, 4,24 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc i 10% wodnym roztworze kwasu cytrynowego i następnie przemyto jeszcze dwukrotnie 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, wodą (2x) i solanką (1x). Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono. Surowy produkt roztarto z Et2O:DCM (85:15), uzyskując po przesączeniu tripeptyd 15g w postaci białego ciała stałego (2,09 g, wydajność 90%).

PL 199 419 B1

MS (FAB) 592,4 MH⁺ 614,3 (M+Na)⁺; ¹H NMR (CDCl3), głównie jeden rotamer, δ 8,08(d, J=8Hz, 1H), 7,93(bd, J=9Hz, 1H), 7,88(bd, J=8Hz, 1H), 7,82(d, J=8Hz, 1H), 7,57-7,41(m, 4H), 6,47(d, J=8,5Hz, 1H), 5,05(d, J=12,5HZ, 1H), 4,94(d, J=12,5Hz, 1H), 4,73(t, J=9,5, 19Hz, 1H), 4,44-4,35(m, 2H), 4,26(bs, 1H), 4,19(d, J=11,5Hz, 1H), 3,75(dd, J=4, 11Hz, 1H), 2,47(bdd, J=7,5, 13,5HZ, 1H), 2,20-2,11(m, 1H), 2,04(s, 3H), 1,88-1,41(m, 11H), 1,30-0,80(11H).

P r z y k ł a d 16. Synteza jednostki Ac-Chg-Val-Pro(4(R)-naftalen-1-ylometoksy)

16e

Związek 16a (2,89 g, 7,02 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (30 ml), jak opisano w syntezie związku 15c. Surowy chlorowodorek sprzęgano z Boc-Val-OH (1,53 g, 7,73 mmola), z zastosowaniem NMM (3,1 ml, 28,09 mmola) i TBTU (2,71 g, 8,43 mmola) w DCM (35 ml) przez 3 1/2 godziny, jak opisano w syntezie związku 15d, uzyskując surowy dipeptyd 16b w postaci oleistej pianki o barwie kości słoniowej (około, 3, 60 g, wydajność 100%).

MS (FAB) 509,3 MH^- 511,3 MH⁺ 533,2 (M+Na)⁺; ¹H NMR (CDCl3) δ 8,04(bd, J=8Hz, 1H), 7,87(bd, J=7Hz, 1H), 7,82(d, J=8Hz, 1H), 7,56-7,40(m, 4H), 5,93-5,85(m, 1H), 5,34-5,28(m, 1H), 5,245,19(m, 2H), 5,04(d, J=12Hz, 1H), 4,92(d, J=12Hz, 1H), 4,67-4,60(m, 3H), 4,31-4,26(m, 2H), 4,11-4,09 (m, 1H), 3,72(dd, J=4, 11Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,07-1,99(m, 1H), 1,44-1,36(m, 1H), 1,37(s, 9H), 1,01(d, J=7Hz, 3H), 0,93(d, J=7Hz, 3H).

Surowy dipeptyd 16b (około 7,02 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (30 ml), jak opisano w syntezie związku 15c. Surowy chlorowodorek sprzężono z Boc-Chg-OH^H₂O (2,13 g, 7,73 mmola), z zastosowaniem NMM (3,1 ml, 28,09 mmola) i TBTU (2,71 g, 8,43 mmola) w CH2Cl2 (35 ml), jak opisano w syntezie związku 15d, uzyskując surowy tripeptyd 16c w postaci pianki o barwie kości słoniowej (około 4,6 g, wydajność 100%).

MS (FAB) 648,5 MH⁺ 672,4 (M+Na)⁺; ¹H NMR (CDCl3) δ 8,06(bd, J=8Hz, 1H),7,87 (bd, J=7,5Hz, 1H), 7,82(bd, J=8Hz, 1H), 7,57-7,40(m, 4H), 6,46(bd, J=8,5Hz, 1H), 5,94-5,84(m, 1H), 5,31(dd, J=1, 17Hz, 1H), 5,23(dd, J=1, 10,5Hz, 1H), 5,03(d, J=12Hz, 1H), 5,00-4,97(m, 1H), 4,93(d, J=12Hz, 1H), 4,63-4,59(m, 4H), 4,29-4,27(m, 1H), 4,10-4,07(m, 1H), 3,92-3,86(m, 1H), 3,72(dd, J=5, 11Hz, 1H), 2,48-2,41(m, 1H),2,101,99(m, 1H), 1,76-1,57(m, 6H), 1,43(s, 9H), 1,20-0,92(m, 6H), 1,00(d, J=7Hz, 3H), 0,93(d, J=7Hz, 3H).

PL 199 419 B1

Surowy tripeptyd 16c (około 7,02 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (30 ml), jak opisano w syntezie związku 15c. Następnie surowy chlorowodorek potraktowano bezwodnikiem octowym (1,33 ml, 14,05 mmola) i NMM (3,1 ml, 28,09 mmola) w CH2Cl2 (35 ml), jak opisano w syntezie związku 15d. Surowy produkt oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (eluent: heksan:EtOAc; 30:70), uzyskując acetylowany zabezpieczony tripeptyd 16d w postaci białej pianki (3,39 g, wydajność 81% dla 3 etapów).

MS (FAB) 590,3 MH⁺ 592,4 MH⁺ 614,4(M+Na)⁺; ¹H NMR (CDCl3), głównie jeden rotamer, δ 8,06(d, J=8Hz, 1H), 7,88(bd, J=8Hz, 1H), 7,83(d, J=8Hz, 1H), 7,58-7,41 (m, 4H), 6,37(d, J=9Hz, 1H), 5,97(d, J=8,5Hz, 1H), 5,94-5,84(m, 1H), 5,31(dd, J=1, 17Hz, 1H), 5,24(dd, J=1, 10,5Hz, 1H), 5,05(d, J=12Hz, 1H), 4,94(d, J=12Hz, 1H), 4,66-4,57 (m, 4H), 4,31-4,22 (m, 2H), 4,11-4,05(m, 1H), 3,73(dd, J=4,5, 11Hz, 1H), 2,50-2,43(m, 1H), 2,09-2,01(m, 2H), 2,00(s, 3H), 1,68-1,55(m, 5H), 1,150,89(m, 6H), 0,99(d, J=7Hz, 3H), 0,91(d, J=7Hz, 3H).

Acetylowany tripeptyd 16d (3,39 g, 5,73 mmola) odbezpieczono z zastosowaniem katalizatora tetrakis(trifenylofosfino)-palladu (0) (172,1 mg, 0,149 mmola) z trifenylofosfiną (78,1 mg, 0,298 mmola) i pirolidyną (516 μί, 6,19 mmola) w mieszaninie bezwodnego CH₃CN:DCM o proporcji 1:1 (30 ml), jak opisano w syntezie związku 15g. Surowy produkt w postaci jasnożółtej pianki roztarto z mieszaniną Et2O:DCM (85:15), uzyskując po przesączeniu tripeptyd 16e w postaci białawego ciała stałego (3,0 g; wydajność 95%).

MS (FAB) 550,3 MH^-; ¹H NMR (CDCl3) δ 8,08(d, J=8Hz, 1H), 8,04(bd, J=9Hz, 1H), 7,88(bd, J=7,5Hz, 1H), 7,82(d, J=8Hz, 1H), 7,58-7,37(m, 5H), 5,05(d, J=12Hz, 1H), 4,94(d, J=12Hz, 1H), 4,61(t, J=9,5, 19,5Hz, 1H), 4,46-4,37(m, 2H), 4,27(bs, 1H), 4,17(d, J=11Hz, 1H), 3,74(dd, J=4, 11Hz, 1H), 2,49(bdd, J=7,5, 13Hz, 1H), 2,17-2,09(m, 1H), 2,04(s, 3H), 2,03-1,94(m, 1H), 1,79(bd, J=12,5Hz, 1H), 1,62-1,43(m, 5H), 1,08-0,85(m, 5H), 1,00(d, J=7Hz, 3H), 0,90(d, J=7Hz, 3H).

Związki z Tabel 1 do 4

P r z y k ł a d 17. Synteza związku 104 z Tabeli 1

PL 199 419 B1

Związek 17a (4,27 g, 7,93 mmola, opisany jako związek 6a według Przykładu 6) traktowano roztworem 4N HCl/dioksan (40 ml) przez 5 godzin, jak opisano dla związku 15c. Surowy chlorowodorek rozpuszczono w THF (10 ml) i dodano roztwór NaOH (348,7 mg, 8,72 mmola) w H2O (5 ml), a następnie wkroplono (Boc)2O (1,73 g, 7,93 mmola) rozpuszczony w THF (13 ml). Wartość pH utrzymywano na poziomie 8 przez odpowiednie dodawanie 10% wodnego roztworu NaOH. Mieszaninę reakcyjną mieszano energicznie, następnie rozcieńczono Et2O i H2O i ekstrahowano jeszcze raz Et2O. Warstwę wodną zakwaszono do wartości pH 3 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc (3x). Połączone ekstrakty EtOAc przemyto H2O (2x), solanką (1x), osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono do suchej masy, uzyskując surowy związek 17b w postaci pianki o barwie kości słoniowej (około 7,93 mmola).

MS (FAB) 481,3 MH⁺; ¹H NMR (CDCl3), mieszanina rotamerów, około 1:1, δ 8,04(bd, J=7,5Hz, 1H), 7,87(bd, J=7,5Hz, 1H), 7,82(d, J=7,5Hz, 1H), 7,56-7,40(m, 5H), 4,96(bs, 2H), 4,33(t, J=7,5, 14,5Hz, 1H), 4,21-4,09(m, 0,5H), 3,99-3,84(m, 0,5H), 3,78-3,75(m, 0,5H), 3,68-3,62(m, 0,5H), 3,613,42(m, 1H), 2,55-2,41(m, 1H), 2,22-2,11(m, 1H), 1,61-1,52(m, 3H), 1,43(s, 9H), 1,40-1,31(m, 1H), 1,25-1,19(m, 1H), 0,99(t, J=7,5, 14,5Hz, 3H).

Związek 17b (około 7,93 mmola) traktowano DBU (1,18 ml, 93 mmola) i bromkiem allilu (4,12 ml, 47,61 mmola) w bezwodnym CH3CN (40 ml) przez 48 godzin, jak opisano dla związku 15b, uzyskując allilowany dipeptyd 17c w postaci pianki o barwie kości słoniowej (3,54 g; wydajność 86%, łącznie z 2 etapów).

MS (FAB) 521,3 MH⁺ 545,2 (M+Na)⁺; ¹H NMR (CDCl3), mieszanina rotamerów, około 1:1, δ 8,05(bd, J=8Hz, 1H), 7,86(bd, J=7,5Hz, 1H), 7,82(d, J=8Hz, 1H), 7,55-7,40(m, 5H), 5,88-5,79(m, 1H), 5,27(bd, J=17,5Hz, 1H), 5,18(bd, J=10Hz, 1H), 5,03-4,89(m, 2H), 4,63-4,50(m, 2H), 4,44-4,19(m, 2H), 4,00-3,40(m, 2H), 2,70-2,02(m, 2H), 1,66-1,35(m, 5H), 1,44(s, 9H), 0,95(t, J=7,5, 14,5Hz, 3H).

Surowy dipeptyd 17c (1,18 g, 2,26 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (35 ml), jak opisano dla związku 15c. Surowy chlorowodorek sprzężono z Boc-Chg-OH· H₂O (684 mg, 2,48 mmola), z zastosowaniem NMM (993 ul, 9,03 mmola) i TBTU (870 mg, 2,71 mmola) w DCM (11 ml), jak opisano dla związku 15d, uzyskując surowy tripeptyd 17d w postaci pianki o barwie kości słoniowej (1,41 g; 95%).

MS (FAB) 660,4 MH⁺ 662,3 MH⁺; ¹H NMR (CDCI3), głównie jeden rotamer, δ 8,03(bd, J=8Hz, 1H), 7,85(bd, J=8Hz, 1H), 7,81(d, J=8Hz, 1H), 7,56-7,39(m, 5H), 5,88-5,77(m, 1H), 5,26(dd, J=1,5, 17Hz, 1H), 5,15(dd, J=1,5, 10,5Hz, 1H), 5,12(s, 1H), 5,02-4,92(m, 2H), 4,72-4,59(m, 1H), 4,57-4,46(m, 1H), 4,42-4,35(m, 1H), 4,33-4,20(m, 1H), 4,02-3,90(m, 1H), 3,78-3,70(m, 1H), 3,67-3,51(m, 1H), 2,71-2,61(m, 1H), 2,12-2,02(m, 1H), 1,79-1,48 (m, 10H), 1,45-1,39(m, 1H), 1,38(s, 9H), 1,25-1,01(m, 5H), 0,94(t, J=7,5, 14Hz, 3H).

Surowy tripeptyd 17d (265 mg, 0,400 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (3 ml), jak opisano dla związku 15c. Surowy chlorowodorek sprzężono z Boc-Chg-OH· H₂O (143,3 mg, 0,521 mmola), z zastosowaniem NMM (176 pl, 1,60 mmola) i TBTU (154,3 mg, 0,481 mmola) w DCM (3 ml), jak opisano dla związku 15d, uzyskując surow tetrapeptyd 17e w postaci pianki o barwie kości słoniowej (około 0,400 mmola; 100%).

MS (FAB) 799,5 MH⁺ 801,5 MH⁺ 823 (M+Na)⁺; ¹H NMR (CDCl³), mieszanina rotamerów, około 1:1, δ 8,05(bd, J=8,5Hz, 1H), 7,87(bd, J=7,5Hz, 1H), 7,81(d, J=8,5Hz, 1H), 7,55-7,40(m, 4H), 7,37(s, 1H), 6,586,41(m, 1H), 5,89-5,78(m, 1H), 5,26(bdd, J=1,5, 17Hz, 1H), 5,16 (bdd, J=1,5, 10,5Hz, 1H), 5,20-4,92(m, 3H), 4,68-4,58(m, 2H), 4,57-4,47(m, 1H), 4,43-4,26(m, 1H), 3,99-3,81(m, 2H), 3,78-3,60(m, 2H), 2,67-2,60(m, 1H), 2,11-2,02(m, 1H), 1,78-1,42(m, 14H), 1,44 i 1,43(s, 9H), 1,25-0,91(m, 13H), 0,95(t, J=7,5, 15Hz, 3H).

Surowy tetrapeptyd 17e (około 0,400 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (3 ml), jak opisano dla związku 15c. Następnie surowy chlorowodorek potraktowano z bezwodnikiem octowym (83 pl, 0,884 mmola) i NMM (194 pl, 1,77 mmola) w DCM (3 ml), jak opisano dla związku 15f, uzyskując surowy acetylowany tetrapeptyd 17f w postaci pianki o barwie kości słoniowej (około 0,400 mmola).

MS (FAB) 741,5 MH⁺ 743,4 MH⁺ 765,4 (M+Na)⁺; ¹H NMR (CDCl3) δ 8,05(bd, J=8,5Hz, 1H), 7,87(bd, J=7,5Hz, 7,82(d, J=8,5Hz, 1H), 7,55-7,41(m, 4H), 7,39(s, 6,63-6,48(m, 1H), 6,01(d, J=8,5Hz, 1H), 5,90-5,79(m, 5,27 (bdd, J=1,5, 17Hz, 1H), 5,16(bdd, J=1,5, 10,5Hz, 1H), 5,01(d, J=12Hz, 1H), 4,96(d, J=12Hz, 1H), 4,69-4,48(m, 3H), 4,44-4,37(m, 1H), 4,36-4,22(m, 1H), 3,96(dd, J=4, HHz, 1H), 3,78-3,60(m, 2H), 2,67-2,59(m, 1H), 2,10-2,00(m, 1H), 2,01(s, 3H), 1,78-1,48(m, 13H), 1,45-1,35(m, 1H), 1,26-0,89(m, 13H), 0,95(t, J=7,5, 15Hz, 3H).

Acetylowany tetrapeptyd 17f (około 0,400 mmola) odbezpieczono z zastosowaniem katalizatora tetrakis(trifenylofosfino)palladu (0) (11,3 mg, 0,010 mmola) z trifenylofosfiną (5,12 mg, 0,020 mmola) i pirolidyną (34 pl, 0,406 mmola) w mieszaninie bezwodnego CH3CN:DCM o proporcji 1:1 (2 ml), jak opisano dla związku 15g. Surowy produkt oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (eluent - najpierw EtOAc, następnie mieszanina 1,92% HOAc, 3,85% MeOH w DCM), uzyskując po liofilizacji tetrapeptyd, związek 104 z Tabeli 1, w postaci białawego bezpostaciowego ciała stałego (193,1 mg; wydajność 73% dla 5 etapów).

PL 199 419 B1

MS (FAB) 701,4 MH⁺ 703,4 MH⁺ 725,4 (M+Na)⁺; ¹H NMR (DMSO), mieszanina rotamerów, około 1:5, δ 8,57 i 8,32(s, 1H), 8,04(d, J=7,5Hz, 1H), 7,94(bd, J=7,5Hz, 1H), 7,88(d, J=8Hz, 1H), 7,837,78(m, 2H), 7,58-7,30(m, 4H), 4,99(d, J=12Hz, 1H), 4,90(d, J=12Hz, 1H), 4,44-4,29(m, 2H), 4,294,05(m, 3H), 3,87-3,73(m, 1H), 2,23-2,13(m, 1H), 2,05-1,95(m, 1H), 1,91 i 1,84(s, 3H), 1,75-1,40(m, 15H), 1,29-0,84(m, 12H), 0,91(t, J=7,5, 14,5Hz, 3H).

P r z y k ł a d 18. Synteza związku 105 z Tabeli 1

18a 18b związek 105

Związek 18b, tj. odpowiadający związkowi 5f według Przykładu 5, sprzężono z wytworzonym wcześniej tripeptydem 18a, opisanym uprzednio, według Przykładu 15. Dokładniej, związek 18b (około 0,521 mmola) połączono ze związkiem 18a (323,6 mg, 0,547 mmola) w DCM (3 ml) i NMM (172 pl,

1,562 mmola), a następnie dodano HATU (237,6 mg, 0,625 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin, a potem poddano ją obróbce, jak opisano dla związku 15d, uzyskując surowy tetrapeptyd w postaci mieszaniny racemicznej przy Pl. Oba izomery częściowo rozdzielono metodą szybkiej chromatografii (eluent: toluen:EtOAc; 40:60). Połączenie pierwszych eluujących frakcji dało mieszaninę 9:1, w której analogiczny ester tert-butylowy 17f stanowił składnik większościowy (58 mg). Frakcje środkowe zawierały różne proporcje odpowiednich estrów tertbutylowego związku 17f i t-butylo-wego związku 105 (163 mg). Później eluujące frakcje dały odpowiednio ester tert-butylowy związku 105 jako izomer większościowy (75,8 mg).

Ten drugi ester (74 mg, 0,0975 mmola) rozpuszczono w roztworem 4N HCl/dioksan (2 ml), mieszano w temperaturze pokojowej przez 5,5 godziny, następnie zatężono do suchej masy, uzyskując olej. Oczyszczanie metodą szybkiej chromatografii (eluent - najpierw EtOAc, następnie mieszanina 1,92% HOAc, 3,85% MeOH, w DCM) dało po liofilizacji związek 105, w postaci białego bezpostaciowego ciała stałego (38,7 mg, wydajność 56%).

Analiza HPLC wykazała proporcję 3:1 związku 105 do związku 104; dane MS i NMR dla związku 105: MS (FAB) 701,5 MH⁺ 703,5 MH⁺ 725,6 (M+Na)⁺; ¹H NMR (DMSO), mieszanina rotamerów, około 1:2,5, δ 8,76 i 8,34(s, 1H), 8,05(bd, J=7,5Hz, 1H), 7,94(bd, J=8Hz, 1H), 7,88(d, J=8,5Hz, 1H), 7,85-7,78(m, 2H), 7,597,43(m, 4H), 4,99(d, J=12Hz, 1H), 4,89(d, J=12Hz, 1H), 4,41-4,05(m, 5H), 3,82-3,66(m, 1H), 2,25-2,11(m, 1H), 2,11-1,98(m, 1H), 1,90 i 1,84(s, 3H), 1,78-1,40 (m, 15H), 1,39-0,82(m, 12H), 0,90(t, J=7, 14Hz, 3H).

P r z y k ł a d 19. Synteza związków 103 z Tabeli 1. Postępując według procedury opisanej dla syntezy związku 104, według Przykładu 17, mieszaninę izomerów 1(R), 2(R) i 1(R), 2(S) związku pośredniego związku 10d, wytworzonego według Przykładu 10, sprzężono ze związkiem 2, uzyskując mieszaninę izomerycznych związków pośrednich związków 19a i 19b

Postępując według procedur według Przykładu 18, izomeryczne związki 19a i 19b rozdzielono i transformowano do ich odpowiedniego związku o wzorze 1; w celu wydzielenia odpowiedniego związku 103, z Tabeli 1.

PL 199 419 B1

Dane widmowe; związek 103: stosunek rotamerów określona metodą NMR: około (1:8,7); MS (FAB) m/2: 703 (MH⁺); ¹H-NMR (DMSO-d6) δ 8,21-8,09(bs, 1H), 8,05(bd, J=7,63Hz, 1H), 7,94(bd, J=7,0Hz, 1H), 7,91-7,83(m, 2H), 7,83-7,76(m, 1H), 7,59-7,5(m, 3H), 7,5-7,43(m, 1H), 4,99(d, J=11,8Hz, 1H), 4,89(d, J=11,8Hz, 1H), 4,43-4,30(m, 3H), 4,23-4,16(m, 1H), 4,13(bd, J=10,8Hz, 1H), 3,71(dd, J=11,1, 4Hz, 1H), 2,2-2,02(m, 2H), 1,87 i 1,84(2xs, 3H), 1,81-1,71(m, 2H), 1,70-1,40(m, 12H), 1,26-1,06(m, 4H), 1,04-0,83(m, 11H), 0,59(m, 1H).

P r z y k ł a d 20. Synteza związku 108 z Tabeli 1

Surowy tetrapeptyd 17e według Przykładu 17 (około 0,963 mmola) potraktowano roztworem

4N HCl/dioksan (5 ml), jak opisano dla związku 15c. Surowy chlorowodorek sprzęgano z Boc-(D)Glu(O-allil)-OH (331,9 mg, 1,155 mmola) z zastosowaniem NMM (423 μΙ, 3,850 mmola) i TBTU (370,8 mg, 1,155 mmola) w DCM (5 ml), przez 3 godziny, w temperaturze pokojowej, jak opisano dla związku 15d. Surowy pentapeptyd 20b otrzymano w postaci pianki o barwie kości słoniowej (około 933,9 mg, 0,963 mmola).

MS (FAB) 968,6 MH^- 970,6 MH+ 992,5 (M+Na); ¹H NMR (CDCl₃), mieszanina rotamerów, około 1:4, δ 8,05(d, J=8,5Hz, 1H), 7,87(bd, J=7,5Hz, 1H), 7,81(d, J=8,5Hz, 1H), 7,58-7,34(m, 5H), 6,77-6,25(m, 2H), 5,98-5,77(m, 2H), 5,38-5,21(m, 4H), 5,16(dd, J=1,5, 10,5Hz, 1H), 5,06-4,89(m, 2H), 4,68-4,13(m, 7H), 3,96-3,52(m, 4H), 2,69-2,38(m, 3H), 2,23-1,87(m, 2H), 1,78-1,37(m, 17H), 1,46 i 1,44(s, 9H), 1,22-0,87 (m, 11H), 0,95(t, J=7, 14,5Hz, 3H).

Surowy pentapeptyd 20b (około 0,963 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (5 ml), jak opisano dla związku 15c. Surowy chlorowodorek sprzężono z Boc-Asp(O-allil)-OH (315,6 mg, 1,155 mmola), z zastosowaniem NMM (423 μ^ 3,85 mmola) i TBTU (370,8 mg, 1,155 mmola) w DCM (5 ml), jak opisano dla związku 15d. Surowy heksapeptyd 20c otrzymano w postaci pianki o barwie kości słoniowej (około 1,083 g, 0,963 mmola).

MS (FAB) 1147,6 (M+Na)⁺; ¹H NMR (CDCl3), mieszanina rotamerów, około 1:1, δ 8,06(bd, J=8Hz, 1H), 7,86(d, J=8Hz, 1H), 7,81(d, J=8Hz, 1H), 7,59-7,39(m, 5H), 7,39-6,34(m, 4H), 5,98-5,76 (m, 3H), 5,38-5,10(m, 6H), 5,10-4,89(m, 2H), 4,66-4,05(m, 10H), 3,87-3,58(m, 4H), 3,30-2,65(m, 2H), 2, 65-1,89(m, 3H), 1,79-1,33(m, 19H), 1,47 & 1,45(s, 9H), 1,33-0,86(m, 14H).

Surowy heksapeptyd 20c (około 0,963 mmola) potraktowano roztworem 4N HCl/dioksan (5 ml), jak opisano dla związku 15c. Surowy chlorowodorek acetylowano z bezwodnikiem octowym (182 μ^ 1,193 mmola) i NMM (423,5 μ^ 3,850 mmola) w DCM (5 ml), jak opisano dla związku 15f, uzyskując surowy acetylowany tetrapeptyd. Piankową pozostałość oczyszczono metodą szybkiej chromatografii

PL 199 419 B1 (eluent: najpierw heksan:EtOAc 20:80 do 10:90 i następnie czysty EtOAc), uzyskując acetylowany heksapeptyd 20d w postaci pianki o barwie kości słoniowej (528 mg, wydajność 51% dla 4 etapów).

MS (FAB) 1067,6 (MH+) 1089,6 (M+Na).

Acetylowan heksapeptyd 20d (528 mg, 0,495 mmola) rozpuszczono w DCM (3 ml) i potraktowano wstępnie zmieszanym, przez 15 minut, roztworem katalizatora tetrakis(trifenylofosfino)-palladu (0) (90 mg, 0,078 mmola) i pirolidyny (134 pi, 1,603 mmola) w DCM (3 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin, a potem odparowano rozpuszczalnik. Surowy produkt oczyszczono częściowo metodą rozcierania z mieszaniną Et2O:DCM (85:15), następnie, oczyszczono w dwu porcjach metodą preparatywnej HPLC. Połowę częściowo oczyszczonej substancji rozpuszczono z lodowatym HOAc (5 ml), przesączono poprzez filtr Millipore®: Millex®- HV 0,45um i wstrzyknięto do zrównoważonej kolumny w odwróconym układzie faz typu Whatman Partisil® 10-ODS-3 (2,2 x 50cm), C18. Program oczyszczania: gradient liniowy przy przepływie 15 ml/minutę, 230 pm, nastrzyk przy 5% A; gdy cały HOAc eluowano, rozpoczął się program - przy 5% A przez 10 minut, 5-58% A w czasie 70 min; A: 0,06% TFA/CH3CN; B: 0,06% TFA/H2O. Frakcje zanalizowano metodą analitycznej HPLC, odpowiednie frakcje z obu procesów oczyszczania HPLC zebrano i liofilizowano, uzyskując pożądany heksapeptyd, związek 108, w formie białego bezpostaciowego ciała stałego (218,3 mg, wydajność 47%).

MS (FAB) 945,5 MH^- 947,4 MH⁺ 969,5 (M+Na)⁺ 985,4 (M+K)⁺; ¹H NMR (DMSO), mieszanina rotamerów, około 1:9, δ 8,55 i 8,31(s, 1H), 8,16(d, J=7,5Hz, 1H), 8,11(d, J=8Hz, 1H), 8,05(d, J=8,5Hz, 1H), 7,97-7,85(m, 2H), 7,88(d, J=8,5Hz, 1H), 7,75(d, J=9Hz, 1H), 7,59-7,39(m, 4H), 4,99(d, J=12Hz, 1H), 4,89(d, J=12Hz, 1H), 4,53(dd, J=7, 14Hz, 1H), 4,08-4,45(m, 6H), 3,77(bdd, J=4, 11Hz, 1H), 2,64(dd, J=6,5, 16,5Hz, 1H), 2,48-2,41(m, 1H), 2,25-2,12(m, 3H), 2,07 i 1,82(s, 3H), 2,04-1,86(m, 2H), 1,80-1,35(m, 14H), 1,32-0,80(m, 14H), 0,91(t, J=7,5, 14,5Hz, 3H).

P r z y k ł a d 21. Synteza związku 301 z Tabeli 3

Roztwór monohydratu wodorotlenku litu (23 mg, 0,56 mmola) w H2O (4 ml) dodano do roztworu estru związku 21a (45 mg, 0,185 mmola, opisanego uprzednio jako izomer (R,R) związku 9c) w MeOH (3,5 ml) i THF (3,5 ml). Uzyskany roztwór mieszano energicznie przez 16 godzin i następnie podzielono pomiędzy EtOAc (60 ml) i 10% wodny roztwór HCl (20 ml). Fazę organiczną oddzielono, osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono, uzyskując odpowiedni kwas z wydajnością ilościową.

Tę substancję (około 0,185 mmola) połączono z (S)-(-)-a-metylobenzyloaminą (27 mg, 0,22 mmola), HATU (77 mg, 0,20 mmola) i DIPEA (0,11 ml, 0,65 mmola) w DMF (5 ml). Po 20 godzinach mieszaninę

PL 199 419 B1 reakcyjną zatężono. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc i roztwór przemyto kolejno nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3, 10% wodnym roztworem HCl i solanką, po czym osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie metodą szybkiej chromatografii (eluent: 35% roztwór EtOAc/heksan) dało 11 mg (28%) sprzężonego produktu 21b. Tę substancję (11 mg, 0,033 mmola) traktowano roztworem 4N HCl/dioksan przez 35 minut. Następnie mieszaninę reakcyjną zatężono do suchej masy, uzyskując chlorowodorek odpowiedniej aminy. Drugi produkt sprzężono ze związkiem:

(33 mg, 0,036 mmola, wytworzonym metodami analogicznymi do opisanych według Przykładu 15 i 20), HATU (14 mg, 0,036 mmola) i DIPEA (0,116 ml, 0,02 mmola) w DMF (4 ml). Po wymieszaniu przez 16 godzin mieszaninę reakcyjną zatężono. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc. Roztwór przemyto kolejno nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, 10% wodnym roztworem HCl i solanką, osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując białe ciało stałe. Tę substancję (około 0,033) rozpuszczono w EtOH (6 ml) i potraktowano octanem amonu (7 mg, 0,09 mmola) i 10% Pd/C (10 mg) w atmosferze gazowego wodoru. Po 3 godzinach mieszaninę reakcyjną przesączono poprzez ziemię okrzemkową. Przesącz zatężono do suchej masy. Następnie pozostałość rozpuszczono w DMSO i oczyszczono metodą preparatywnej HPLC, uzyskując po liofilizacji białe ciało stałe (17,6 mg, wydajność 57% dla dwu etapów).

Dane widmowe: MS (FAB) ES^- 932,6 (M-H)^-, 954,5 (M-Na)^-; HRMS obliczono dla C48H67N7O12 (MH⁺) 934,49261, znaleziono: 934,49010; ¹H NMR (DMSO-d6) δ 8,90(s, 1H), 8,24(d, J=7,95Hz, 1H), 8,14(d, J=7,63Hz, 1H), 7,99(d, J=8,26Hz, 1H), 7,79(d, J=8,9Hz, 1H), 7,75(d, J=8,26Hz, 1H), 7,427,17(m, 10H), 5,00(kwintet, J=7,63Hz, 1H), 4,7(m, 1H), 4,52(d, J=11,76Hz, 1H), 4,43(d, J=11,4Hz, 1H), 4,33-4,2(m, 6H), 3,70(dd, J=11,4 i 11,1Hz, 2H), 2,63(dd, J=5,7 i 5,7Hz, 1H), 2,45(dd, J=7,95 i 7,95Hz, 1H), 2,21-2,11(m, 3H), 2,07-1,97(m, 1H), 1,93-1,83(m, 2H), 1,81(S, 3H), 1,78-1,63(m, 2H), 1,54-1,41(m, 2H), 1,39(d, J=7,0Hz, 3H), 1,29(dd, J=7,94 i 7,63Hz, 1H), 1,15 (kwintet, J=7,0Hz, 1H), 1,05(m, 1H), 0,90(d, J=6,36Hz, 6H), 0,88-0,83(m, 1H), 0,71(m, 9H).

P r z y k ł a d 22. Związek 107 z Tabeli 1 zsyntetyzowano sposobem według Przykładu 17. Stosunek rotamerów określono metodą NMR (1:7,6); MS (FAB) m/z: 675 (MH⁺); ¹H-NMR (DMSO-d6) δ 8,35-8,19(bs, 1H), 8,04(d, J=7,63Hz, 1H), 7,93(bd, J=7,31Hz, 1H), 7,88(d, J=8,27Hz, 1H), 7,867,79(m, 2H), 7,59-7,49(m, 3H), 7,46(dd, J=7,95, 7,95Hz, 1H), 4,98(d, J=11,8Hz, 1H), 4,89(d, J=11,8Hz, 1H), 4,40-4,34(m, 1H), 4,32(bs, 1H), 4,29-4,24(m, 1H), 4,22-4,15(m, 1H), 4,09(d, J=11,8Hz, 1H), 3,74(dd, J=11,1, 4Hz, 1H), 2,20-2,12(m, 1H), 2,05-1,94(m, 2H), 1,84(s, 3H), 1,72-1,42(m, 7H), 1,20-1,13(m, 1H), 1,08-0,87(m, 13H), 0,85(d, J=6,68Hz, 6H).

P r z y k ł a d 23. Związek 114 z Tabeli 1 zsyntetyzowano sposobem według Przykładu 17. Stosunek rotamerów określony metodą NMR (1:7,5); MS (FAB) m/z: 747 (M+Na⁺); ¹H-NMR (DMSOd6) δ 8,40-8,24(bs, 1H), 8,07-8,01(m, 1H), 7,96-7,91(m, 1H), 7,87(d J=8,26Hz, 1H), 7,85-7,78(m, 2H), 7,58-7,49(m, 3H), 7,46(dd, J=7,95, 7,95Hz, 1H), 7,30-7,21(m, 4H), 7,20-7,14(m, 1H), 4,98(d, J=11,8Hz, 1H), 4,89(d, J=11,8Hz, 1H), 4,40-4,34 (m, 1H), 4,34-4,29(m, 1H), 4,29-4,25(m, 1H), 4,224,15(m, 1H), 4,09(d, J=11,8Hz, 1H), 3,74(dd, J=11,1, 4Hz, 1H), 2,95-2,79(m, 2H), 2,21-2,11(m, 1H), 2,05-1,94(m, 2H), 1,89-1,83(2xs, 3H), 1,63-1,41(m, 7H), 1,38-1,30(m, 1H), 1,27-1,22(m, 1H), 1,120,94(m, 5H), 0,89(d, J=6,4Hz, 3H), 0,84(d, J=6,4Hz, 3H).

P r z y k ł a d 24. Związek 118 z Tabeli 1 zsyntetyzowano sposobem według Przykładu 17. Stosunek rotamerów określony metodą NMR około (1:6,3); MS (FAB) m/z: 677,4 (MH⁺); ¹H-NMR (DMSO-d6) δ 8,58 i 8,38(2xbs, 1H), 8,04(d, J=7,63Hz, 1H), 7,93(d, J=7,63Hz, 1H), 7,91-7,81(m, 3H), 7,597,49(m, 3H), 7,49-7,43(m, 1H), 4,98(d, J=12,1Hz, 1H), 4,89(d, J=12,1Hz, 1H), 4,41-4,29(m, 2H), 4,294,14(m, 2H), 4,1(d, J=10,8Hz, 1H), 3,74(bd, J=7,63Hz, 1H), 2,21-2,12(m, 1H), 2,04-1,92(m, 2H), 1,90 i 1,84(2xs, 3H), 1,63-1,41(m, 9H), 1,39-1,26(m, 3H), 1,21-1,15(m, 1H), 1,06-0,92(m, 5H), 0,92-0,80(m, 9H).

P r z y k ł a d 25. Związek 116 z Tabeli 1 zsyntetyzowano sposobem według Przykładu 17. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 8,36(s, 1H), 8,14(d, J=8Hz, 1H), 8,04(d, J=8Hz, 1H), 7,99(d, J=9Hz, 1H), 7,79(d, J=9Hz, 1H), 7,33-7,26(m, 5H), 4,54-4,42(m, 3H), 4,30-4,21(m, 5H), 4,06(d, J=11Hz, 1H), 3,69(dd, J=Hz,

PL 199 419 B1

1H), 2,62(dd, J=16, 10Hz, 1H), 2,47-2,42(m, 1H), 2,18-2,14(m, 3H), 2,02-1,87(m, 2H), 1,82(s, 3H), 1,741,66 (m, 2H), 1,54-1,47(m, 2H), 1,38-1,27(m, 2H), 1,21-1,18(m, 1H), 0,97-0,85(m, 11H), 0,80-0,70(m, 7 H).

P r z y k ł a d 26. Związek 121 z Tabeli 1 zsyntetyzowano sposobem według Przykładu 17. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,12(d, J=6Hz, 1H), 8, 64(s, 1H), 8,30(d, J=8Hz, 1H), 8,12(d, J=9Hz, 1H), 8,05(dd, J=8, 7Hz, 1H), 7,97 (d, J=8Hz, 1H), 7,80(dd, J=8, 7Hz, 1H), 7,66(d, J=9Hz, 1H), 7,54(d, J=6Hz, 1H) , 5,70-5,61 (m, 2H), 5,26(d, J=17Hz, 1H), 5,07(d, J=12Hz, 1H), 4,52(d, J=12Hz, 1H), 4,39(dd, J=9, 8Hz, 1H), 4,23-4,12(m, 2H), 4,03-3,99(m, 1H), 2,66-2,54(m, 1H), 2,35-2,28(m, 1H), 2,08(dd, J =9, 17Hz, 1H), 2,01-1,93(m, 1H), 1,83(s, 3H), 1,65-1,46(m, 5H), 1,41-1,38(m, 1H), 1,24-1,20(dd, J=9, 5Hz, 1H), 01,05-0,78(m, 12 H).

P r z y k ł a d 27. Związek 205 z Tabeli 2 zsyntetyzowano sposobem według Przykładu 17. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,14(d, J=6Hz, 1H), 8,60(s, 1H), 8,32(d, J=8Hz, 1H), 8,14-8,06(m, 2H), 7,98(d, J8Hz, 1H), 7,82(dd, J=8,7Hz, 1H), 7,66(d, J=9Hz, 1H), 7,55(d, J=8Hz, 1H), 5,75-5,66(m, 2H), 5,22(d, J=17Hz, 1H), 5,07(d, J=10Hz, 1H), 4,50(d, J=12Hz, 1H), 4,39(dd, J=9, 9Hz, 1H), 4,23-4,08(m, 3H), 2,56-2,50(m, 1H), 2,362,28(m, 1H), 2,04-1,97(m, 1H), 1,82(s, 3H), 1,62-1,41(m,7H), 1,24(dd, J=5,4Hz, 1H), 0,94-0,75(m, 12 H).

P r z y k ł a d 28. Związek 117 z Tabeli 1 zsyntetyzowano sposobem według Przykładu 20. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 8,36(s, 1H), 8,17(d, J=8Hz, 1H), 8,09(d, J=8Hz, 1H), 8,04(d, J=8Hz, 1H), 7,967,92(m, 2H), 7,87(d, J=8Hz, 1H), 7,77(d, J=9Hz, 1H), 7,56-7,45(m, 4H), 4,99(d, J=12Hz, 1H), 4,89(d, J=12Hz, 1H), 4,52(dd, J=14, 7Hz, 1H), 4,37-4,12(m, 6H), 3,78-3,73(m, 1H), 2,63(dd, J=17, 6Hz, 1H), 2,47-2,42(m, 1H), 2,22-2,16(m, 3H), 2,04-1,86(m, 2H), 1,82(s, 3H), 1,77-1,71(m, 1H), 1,69-1,42(m, 8H), 1,30(kwintet, J=8Hz, 1H), 1,20(dd, J=12, 8Hz, 1H), 1,10-0,85(m, 15H), 0,76-0,72(m, 1H).

P r z y k ł a d 29. Związek 120 z Tabeli 1 zsyntetyzowano sposobem według Przykładu 20. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 8,34(s, 1H), 8,12(d, J=8Hz, 1H), 8,05(d, J=8Hz, 1H), 7,95-7,87(m, 3H), 7,81(d, J=9Hz, 1H), 7,64-7,52(m, 4H), 7,46(dd, J=8, 7Hz, 1H), 4,99(d, J=12Hz, 1H), 4,89(d, J=12Hz, 1H), 4,63(dd, J=14, 7Hz, 1H), 4,37-4,14(m, 4H), 3,74(dd, J=11,4Hz, 1H), 3,41-3,35(m, 2H), 2,61(dd, J=16, 7Hz, 1H), 2,44(dd, J=16, 8Hz, 1H), 2,20-2,15(m, 1H), 2,04-1,96(m, 3H), 1,82(s, 3H), 1,70-1,64(m, 1H), 1,56-1,43(m, 7H), 1,30 (kwintet, J=8Hz, 1H), 1,20(dd, J=8, 5Hz, 1H), 0,99-0,72(m, 21H).

P r z y k ł a d 30. Klonowanie, ekspresja i oczyszczanie rekombinacyjnej proteazy NS3 HCV typu 1b. Osocze zakażonego HCV pacjenta otrzymano poprzez zewnętrzną współpracę (Bernard Willems MD, Hopital St-Luc, Montreal, Canada i dr Donald Murphy, Laboratoire de Sante Publique du Quebec, Ste-Anne de Bellevue, Kanada). Pełnej długości matrycowy cDNA genomu HCV skonstruowano z zastoswaniem inżynierii genetycznej z fragmentów DNA otrzymanych techniką odwrotnej transkrypcji-PCR (RT-PCR) RNA osoczowego i z zastosowaniem specyficznych primerów wybranych na podstawie homologii pomiędzy innymi szczepami genotypu 1b. Z ustalenia całej sekwencji genomu, genotyp 1b przypisano do izolatu HCV według klasyfikacji Simmonds i in. (J. Clin. Microbiol., (1993), 31, str. 1493-1503). Wykazano, że sekwencja aminokwasów niestrukturalnego obszaru NS2-NS4B jest w ponad 93% identyczna z genotypem 1b HCV (izolaty BK, JK i 483) i w 88% identyczna z genotypem 1a HCV (izolat HCV-1). Fragment DNA kodujący polipeptydowy prekursor (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) wytworzono techniką PCR i wprowadzono do eukariotycznych wektorów ulegających ekspresji. Po przejściowej transfekcji, obecność dojrzałego białka NS3 dowiodła obróbki polipeptydu, w której pośredniczy proteaza NS3 HCV, co sprawdzono z zastosowaniem analizy bibułowej Westerna. Nie obserwowano dojrzałego białka NS3 przy ekspresji prekursora polipeptydowego zawierającego mutację S1165A, która inaktywuje proteazę NS3, co potwierdza funkcjonalność proteazy NS3 HCV.

Fragment DNA kodujący proteazę rekombinacyjną NS3 HCV (aminokwas 1027 do 1206) sklonowano w bakteryjnym wektorze ulegającym ekspresji pET11d. Ekspresję proteazy NS3 w E. coli BL21(DES)pLysS indukowano przez inkubację z 1 mM IPTG przez 3 godziny, w temperaturze 22°C. Typowa fermentacja (18 l) dała w przybliżeniu 100 g mokrej pasty komórkowej. Komórki ponownie zawieszono w buforze lizującym (3,0 ml/g) składającym się z 25 mM fosforanu sodu, pH 7,5, 10% glicerolu (objętościowo), 1 mM EDTA, 0,01% NP-40 i przechowywano w temperaturze -80°C. Komórki rozmrożono i homogenizowano po dodaniu 5 mM DTT. Następnie dodano do homogenatu chlorek magnezu i DNa-zę w końcowych stężeniach odpowiednio 20 mM i 20 pg/ml. Po 25-minutowej inkubacji w temperaturze 4°C, homogenat sonikowano i odwirowywano przy 15000xg, przez 30 minut, w temperaturze 4°C. Następnie wartość pH supernatantu uregulowano do 6,5 z zastosowaniem 1M roztworu fosforanu sodu.

Do 2-etapowej procedury oczyszczania opisanej w opisie patentowym nr WO 95/22985 (który wprowadza się tu na zasadzie odsyłacza) dodano dodatkowy etap w postaci chromatografii filtracyjnej na żelu. W skrócie, supernatant z bakteryjnego ekstraktu wprowadzono do kolumny SP HiTrap (Pharmacia) uprzednio zrównoważonej przy szybkości przepływu 2 ml/minutę w buforze A (50 mM fosforan sodu, pH 6,5, 10% glicerol, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,01% NP-40). Kolumnę następnie

PL 199 419 B1 przemyto buforem A zawierającym 0,15M NaCl i proteazę eluowano przez zastosowanie 10 objętości kolumny NaCl w liniowym gradiencie 0,15 do 0,3M. Frakcje zawierające proteazę NS3 zebrano i rozcieńczono do końcowego stężenia NaCl 0,1M. Enzym następnie oczyszczono na kolumnie HiTrap Heparin (Pharmacia) zrównoważonej w buforze B (25 mM fosforan sodu, pH 7,5, 10% glicerol, 5 mM DTT, 0,01% NP-40). Próbkę wprowadzono przy szybkości przepływu 3 ml/minutę. Następnie kolumnę przemyto buforem B zawierającym 0,15M NaCl przy szybkości przepływu 1,5 ml/minutę. Przeprowadzono dwuetapowe przemycie w obecności buforu B zawierającego 0,3 lub 1M NaCl. Proteazę odzyskano w 0,3M NaCl, rozcieńczono 3-krotnie buforem B, ponownie wprowadzono do kolumny HiTrap Heparin i eluowano buforem B zawierającym 0,4 M NaCl. Na koniec, frakcje zawierające proteazę NS3 wprowadzono do kolumny Superdex 75 HiLoad 16/60 (Pharmacia) zrównoważonej w buforze B zawierającym 0,3M NaCl.

Czystość proteazy NS3 HCV otrzymanej ze zgromadzonych frakcji oceniono na więcej niż 95% metodą SDS-PAGE z następującą po niej analizą densytometryczną.

Enzym przechowywano w temperaturze -80°C, rozmrażano na lodzie i rozcieńczano tuż przed użyciem.

P r z y k ł a d 31. Test radiometryczny proteazy rekombinacyjnej NS3 HCV/peptydu kofaktorowego NS4A. Enzym sklonowano, poddano ekspresji i wytworzono według protokołu opisanego w Przykładzie 36. Enzym przechowywano w temperaturze -80°C, rozmrożono na lodzie i tuż przed użyciem rozcieńczono w buforze testowym zawierającym peptyd kofaktorowy NS4A.

Substrat użyty w teście radiometrycznym proteazy NS3/peptydu kofaktorowego NS4A, DDIVPCSMSYTW, jest rozszczepiany przez enzym pomiędzy resztami cysteinową i serynową. Sekwencja DDIVPC-SMSYTW odpowiada naturalnemu miejscu rozerwania NS5A/NS5B, w którym reszta cysteinowa w P2 została zastąpiona proliną. Peptydowy substrat DDIVPC-SMSYTW i wskaźnik biotyna-DDIVPCSMS[¹²⁵I-Y]TW inkubuje się z rekombinowaną proteazą NS3 i peptydem kofaktorowym NS4A KKGSVVIVGRIILSGRK (stosunek molowy enzym:kofaktor 1:100) bez lub w obecności inhibitorów. Rozdzielanie substratu od produktów przeprowadza się przez dodanie do mieszaniny testowej pokrytych awidyną kulek agarozowych, a następnie mieszaninę przesącza się. Ilość produktu SMS[¹²⁵I-Y]TW znalezionego w przesączu pozwala na obliczenie procentowej konwersji substratu i procentowego hamowania.

A. Reagenty

Tris i Tris-HCl (UltraPure) otrzymano z firmy Gibco-BRL. Glicerol (ultraczysty), MES i BSA zakupiono od firmy Sigma. TCEP otrzymano z firmy Pierce, DMSO z firmy Aldrich i NaOH z firmy Anachemia.

Bufor testowy: 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 30% (waga/objętość) glicerol, 1 mg/ml BSA, 1 mM TCEP (TCEP dodano tuż przed użyciem z 1M roztworu podstawowego w wodzie).

Substrat: DDIVPCSMSYTW, końcowe stężenie 25 μΜ (z 2 mM roztworu podstawowego w DMSO przechowywanego w temperaturze -20°C w celu uniknięcia utleniania).

Wskaźnik: zredukowany monojodowany substrat, biotyna DDIVPC SMS[¹²⁵I Y]TW (stężenie końcowe ~1 nM).

Proteaza NS3 HCV typu 1b, stężenie końcowe 25 nM (z roztworu podstawowego w 50 mM fosforanie sodu, pH 7,5, 10% glicerolu, 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,01% NP-40).

Peptyd kofaktorowy NS4A: KKGSWIVGRIILSGRK, stężenie końcowe 2,5 μM (z 2 mM roztworu podstawowego w DMSO przechowywanego w temperaturze -20°C).

B. Protokół

Test prowadzono na 96-studzienkowej płytce polistyrenowej z Costar. Każda studzienka zawierała:

μl substratu/wskaźnika w buforze testowym;

± 10 μl inhibitora w mieszaninie 20% DMSO/bufor testowy;

μl proteazy NS3 1b/peptydu kofaktorowego NS4 (stosunek molowy 1:100).

Przygotowano także próbę ślepą (bez inhibitora i enzymu) i kontrolną (bez inhibitora) na tej samej płytce testowej.

Reakcję enzymatyczną zainicjowano przez dodanie roztworu enzym/peptyd NS4A i mieszaninę testową inkubowano przez 40 minut w temperaturze 23°C, delikatnie mieszając. Dodano dziesięć (10) μl 0,5N NaOH i 10 μl IM MES, pH 5,8, w celu przerwania reakcji enzymatycznej.

Dodano dwadzieścia (20) μl agarozowych kulek pokrytych awidyną (zakupionych od firmy Pierce) na płytce filtracyjnej Millipore MADP N65. Mieszaninę testową przeniesiono na płytkę filtracyjną i inkubowano przez 60 minut w temperaturze 23°C, delikatnie mieszając.

PL 199 419 B1

Zawrtość płytek przesączono z zastosowaniem urządzenia Millipore Multiscreen Vacuum Manifold Filtration i 40 pl przesączu przeniesiono na nieprzezroczystą 96-studzienkową płytkę zawierającą 60 pl płynu scyntylacyjnego na studzienkę.

Przesączę zliczono na przyrządzie Packard TopCount z zastosowaniem protokołu dla ciekłego ¹²⁵ I przez 1 minutę.

% hamowania obliczono z następującego równania:

100-[(liczba impulsówbadana-liczba impulsówślepa)/(liczba impulsówkontrola-liczba impulsówślepa) x100]

Zastosowano nieliniową krzywą dopasowaną do modelu Hilla dla danych dotyczących hamowanie-stężenia, 50% stężenie skuteczne (IC50) obliczono stosując oprogramowanie SAS (Statistical Software System; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

P r z y k ł a d 32. Test pełnowymiarowego heterodimeru białkowego NS3-NS4A. Obszar niekodujący NS2-NS5B-3' sklonowano metodą RT-PCR do wektora pCR®3 (Invitrogen) z zastosowaniem RNA ekstrahowanego z osocza osobnika zakażonego HCV genotyp 1b (dostarczonego przez dr Bernarda Willemsa, Hopital St-Luc, Montreal, Quebec, Kanada). Następnie subklonowano obszar DNA NS3-NS4A metodą PCR do wektora ekspresji bakulowirusa pFastBac™ HTa (Gibco/BRL). Sekwencja wektora obejmowała obszar kodujący 28-resztową N-końcową sekwencję, która zawierała marker heksahistydynowy. Do uzyskania rekombinowanego bakulowirusa użyto systemu ekspresji bakulowirusa Bac-to-Bac™ (Gibco/BRL). Pełnowymiarowy dojrzały heterodimer białkowy NS3 i NS4A (HisNS3-NS4AFL) poddano ekspresji przez zainfekowanie 10⁶ komórek Sf21/ml rekombinowanym bakulowirusem przy krotności infekcji 0,1-0,2, w temperaturze 27°C.

Zainfekowaną kulturę zebrano 48 do 64 godzin później przez odwirowanie w temperaturze 4°C. Peletkę komórkową homogenizowano w 50 mM NaPO4, pH 7,5, 40% glicerolu (waga/objętość), 2 mM βmerkaptoetanolu, w obecności koktailu inhibitorów proteazy. Następnie ekstrahowano His-NS3-NS4AFL z lizatu komórkowego, traktując go 1,5% NP-40, 0,5% Triton X-100, 0,5M NaCl i DNazą. Po ultrawirowaniu, rozpuszczalny ekstrakt rozcieńczono 4-krotnie i związano w kolumnie chelatującej atomami Ni, Pharmacia Hi-Trap. His-NS3-NS4AFL eluowano w >90% w czystej formie (co oszacowano przy pomocy SDS-PAGE), z zastosowaniem imidazolu w gradiencie 50 do 400 mM. His-NS3-NS4AFL przechowywano w temperaturze -80°C w 50 mM fosforanie sodu, pH 7,5, 10% (waga/objętość) glicerolu, 0,5 M NaCl, 0,25 M imidazolu, 0,1% NP-40. Rozmrożono go na lodzie i rozcieńczono tuż przed użyciem.

Aktywność proteazową His-NS3-NS4AFL oceniano w 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,25 M cytrynianu sodu, 0,01% (waga/objętość) n-dodecylo-p-D-maltozydzie, 1 mM TCEP. Pięć (5) pM wewnętrznie unieczynnionego substratu antranililo-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO2)TW-OH w obecności inhibitora w różnych stężeniach inkubowano z 1,5 nM His-NS3-NS4AFL przez 45 minut w temperaturze 23°C. Końcowe stężenie DMSO nie przekraczało 5,25%.

Reakcję zakończono przez dodanie 1M MES, pH 5,8. Fluorescencję N-końcowego produktu monitorowano na fluorometrze Perkin-Elmer LS-50B zaopatrzonym w czytnik płytkek 96-studzienkowych (długość fali wzbudzenia: 325 nm; długość fali emisji: 423 nm).

Zastosowano nieliniową krzywą dopasowaną do modelu Hilla dla danych dotyczących hamowania-stężenia, 50% stężenie skuteczne (1059) obliczono stosując oprogramowanie SAS (Statistical Software System; SAS Institu-te, Inc. Gary, N.C.).

P r z y k ł a d 33. Test komórkowy proteazy NS3. Test prowadzono z komórkami Huh-7, ludzką linią komórkową pochodzącą z raka wątroby, kotransfekowanymi 2 strukturami DNA:

- pierwsza daje ekspresję polipeptydu zawierającego niestrukturalne białka HCV skondensowane z tTA w następującym porządku: NS3-NS4A-NS4B-NS5A-ITA (pod nazwą NS3);

- druga daje ekspresję białka reporterowego, wydzielniczej zasadowej fosfatazy, w warunkach kontroli tTA (pod nazwą SEAP).

Polipeptyd musi być rozszczepiany przez proteazę NS3, aby uwolnić dojrzałe białka. Uważa się, że przy uwalnianiu dojrzałych białek, wirusowe białka tworzą kompleks przy błonie siateczki wewnątrzplazmatycznej, podczas gdy tTA migruje do jądra i transaktywuje gen SEAP. Tak więc, redukcja aktywności proteolitycznej NS3 powinna prowadzić do zmniejszenia ilości dojrzałego tTA i zatem zmniejszenia aktywności SEAP.

W celu kontroli innych wpływów związków, przeprowadzono równoległą transfekcję, w której strukturę, w której ulega ekspresji tylko tTA (pod nazwą tTA) kotransfekowano strukturą SEAP w taki sposób, że aktywność SEAP nie zależała od aktywności proteolitycznej NS3.

PL 199 419 B1

Protokół testu: Komórki Huh-7, hodowane w CHO-SFMII + 10% FCS (płodowa surowica bydlęca), kotransfekowano albo NS3 i SEAP albo tTA i SEAP, z zastosowaniem protokołu FuGene (Boehringer Mannheim). Po 5 godzinach w temperaturze 37°C, komórki przemyto, trypsynizowano i osadzono (w ilości 80000 komórek/studzienkę) na 96-studzienkowych płytkach zawierających testowane związki w różnych stężeniach. Po 24-godzinnym okresie inkubacji, pobrano próbkę ośrodka i aktywność SEAP w tej próbce zmierzono z zastosowaniem zestawu Phospha-Light (Tropix).

W celu uzyskania EC50 przeprowadzono analizę procentowego hamowania aktywności SEAP w stosunku do stężenia związku przy pomocy oprogramowania SAS.

Następnie oceniano toksyczność związku (TC50) z zastosowaniem testu MTT jak następuje:

pl roztworu MTT (5 mg/ml ośrodka) dodano do studzienki i inkubowano w temperaturze 37° przez 4 godziny;

ośrodek usunięto i dodano 50 pl 0,01N HCl + 10% Triton X-100;

po wytrząsaniu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę, gęstość optyczną każdej studzienki odczytano przy długości fali 595 nm.

TC50 obliczono w ten sam sposób jak EC50.

P r z y k ł a d 34. Testy specyficzności. Specyficzność związków określono wobec rozmaitych proteaz serynowych: elastazy ludzkich leukocytów, świńskiej elastazy trzustkowej i bydlęcej trzustkowej α-chymotrypsyny i jednej proteazy cysteinowej: katepsyny B wątroby ludzkiej. W wszystkich przypadkach zastosowano protokół dla 96-studzienkowej płytki z użyciem kolorymetrycznego substratu p-nitroaniliny (pNA) specyficznego dla każdego enzymu. Każdy test obejmował 1 godzinną wstępną inkubację enzymu z inhibitorem w temperaturze 30°C, po czym następowało dodanie substratu i hydroliza do =30% konwersji, co zmierzono na czytniku mikropłytek UV Thermomax®. Stężenia substratu utrzymywano na możliwie niskim poziomie w porównaniu z KM w celu zmniejszenia współzawodnictwa substratu. Stężenia związku wahały się od 300 do 0,06 pM zależnie od ich mocy.

Końcowe warunki dla każdego testu były następujące:

mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M Na2SO4, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01%Tween-20 z;

[100 pM Succ-AAPF-pNA i 250 pM α-chymotrypsyny], [133 pM Succ-AAA-pNA i 8 nM świńskiej elastazy], [133 pM Succ-AAV-pNA i 8 nM elastazy leukocytów]; lub

[100 mM NaHPO4 pH 6, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 1 mM TCEP, 0,01%Tween-20, 30 pM Z-FR-pNA i 5 nM katepsyny B (enzym podstawowy był aktywowany w buforze zawierającym 20 mM TCEP przed użyciem)].

Reprezentatywny przykład dla świńskiej elastazy trzustkowej podano poniżej:

Do polistyrenowej 96-studzienkowej płytki o płaskim dnie dodano z zastosowaniem programu obsługi dla cieczy Biomek (Beckman):

pl buforu testowego (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA);

pl roztworu enzymu (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 40 nM świńskiej elastazy trzustkowej); i pl roztworu inhibitora (50 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 1,5 mM-0,3 pM inhibitora, 15% objętościowo DMSO).

Po 60 minutach wstępnej inkubacji w temperaturze 30°C, dodano do każdej studzienki 20 pl roztworu substratu (50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,5 M Na2SO4, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 665 pM SuccAAA-pNA), a następnie mieszaninę inkubowano w temperaturze 30°C przez 60 minut, po którym to czasie absorbancję odczytano na czytniku płytek UV Thermomax®. Rzędy studzienek przydzielono próbom kontrolnym (bez inhibitora) i ślepym (bez inhibitora i enzymu).

Kolejne 2-krotne rozcieńczenia roztworu inhibitora wykonano na oddzielnej płytce z zastosowaniem programu obsługi dla cieczy, stosując 50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 15% DMSO. Wszystkie inne testy specyficzności przeprowadono podobnym sposobem.

Procent hamowania obliczono z zastosowaniem wzoru:

[1-((UVbadana-UVślepa)/(UVkontrola-UVślepa))]x100

Zastosowano nieliniową krzywą dopasowaną do modelu Hilla dla danych dotyczących hamowania-stężenia, 50% stężenie skuteczne (IC50) obliczono stosując oprogramowanie SAS (Statistical Software System; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

Tabele związków

Związki według wynalazku poddano albo jednemu lub obu testom według Przykładów 37 i 38 i stwierdzono, że są aktywne przy IC50 poniżej 50 pM (A); poniżej 5 pM (B) lub poniżej 0,5 pM (C).

PL 199 419 B1

Aktywność w komórkach i specyficzność:

Reprezentatywne związki według wynalazku poddano także testowi dla surogatu komórkowego według Przykładu 33 oraz jednemu lub kilku testom według Przykładu 34. Np. stwierdzono, że związek 233 z Tabeli 2 ma IC50 1 nM w teście według Przykładu 32. EC50 oszacowane testem według

Przykładu 33 wynosi 5,4 μM podczas gdy innych efektów (tTA) nie można było wykryć przy stężeniach do 120 μM. Związek 233 poddano także testowi MTT i określono, że TC₅₀ wynosi powyżej 120 μM, co wskazuje, że ten związek nie jest toksyczny w skutecznym stężeniu. W testach specyficzności według Przykładu 34, ten sam związek dał następujące aktywności: HLE >75 μM; PPE >75 μM; α-chymotrypsyna >75 μM; katepsyna B >75 μM.

Te wyniki wskazują, że ta rodzina związków jest silnie specyficzna wobec proteazy NS3.

W poniższych tablicach obejmujących związki według wynalazku zastosowano następujące skróty: MS: dane spektrometrii masowej; Ac: acetyl; Bn: benzyl; Chg: cykloheksyloglicyna (kwas 2-amino-2-cykloheksylooctowy); Dnl: dansyl; O-Bn: benzylooksyl; Pip: kwas pipekolinowy; Tbg: tert-butyloglicyna.

T a b e l a 1

PI

Tabela 1	B	P6	P5	P4	P3	^r2	Rl	PI	MS	Zakres
nr związku								Ci-C₂	(MH+)	aktyw- ności
101	Ac			Chg	Val	OBn	Et	IR, 2R	613,4	A
102	Ac			Chg	Val	OBn	Et	IR, 2?	613,4	A
103	Ac			Chg	Chg	l-NpCHpO	Et	IR, 2?	703	B
104	Ac			Chg	Chg	l-NpCH₂O	Et	IR, 2R	703,4	B
105	Ac			Chg	Chg	l-NpCH₂0	Et	1S,2S	703,5	B
106	Ac			Chg	Val	l-NpCH₂O	Me	IR, 2?	649,5	A
107	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	CHMe₂	IR, 2?	M+Na 699	B
108	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Chg	l-NpCH₂O	Et	1R,2R	947,4	C
109	Ac			Chg	Val	l-NpCH₂O	ch₂o CH_?Ph	IR, 2?	M+Na 777,4	A
110	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	ch₂och₂p h	IR, 2?	M+Na 777,4	A
111	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂)	(CH₂)2Ph	IR, 2?	M+Na 761	A
112	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Et	IR,2R	M+Na 685	B
113	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Et	1S, 2S	M+Na 685	A

PL 199 419 B1

Tabela 1	B	P6	P5	P4	P3	*2	*1	Pl	MS	Zakres
nr zwią-								Cp-c₂	(MH⁺)	aktyw-
zku										ności
114	Ac	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Bn	IR,2?	M+Na	A
									747
115	AC	-	-	Chg	Val	l-NpCH₂O	Bn	IR, 2?	M+Na	A
									747
116	Ac	Asp	D-Glu	He	Val	Obn	Et	IR, 2R		c
117	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Val	l-NpCH₂O	Et	IR, 2R	M+Na	C
									929,4
118	Ac			Chg	Val	l-NpCHgO	Pr	IR, 2?	677,4	B
119	Ac			Chg	Val	1-NpCHgO	Pr	IR, 1?	677,4	A
120	Ac	Asp	D-Val	Chg	Val	l-NpCH₂O	Et	IR, 2R	M+Na	C
									899,5
121	Ac	-	-	Chg	Val		winyl	1S,2R	648,3	B

122	Ac	-	-	Chg	Val		etyl	1R,2S	726,6	c
123	Ac	-		Chg	Val		propyl	IR, 2R	740,3	c

PL 199 419 B1

Tabela 2 Nr związku	P6	P5	P4	P3	R2	^Ri	MS (MH+)	Zakres aktywno- ści
211			Chg	Val	9 A ^H vu 0 \	ch=ch₂	754,3	C
212	Asp	D- Glu	Chg	Val	ęo	ch=ch₂	968,4	C
213	-	-	Chg	Val	θχρο 0	ch=ch₂	719,3	B
214	-	-	Chg	Val	0 \ 1 J 0 \	etyl	726,4	C
215	-	—	Val	Chg	0 \	CH=CH₂	648,3	C
216	-	-	Chg	Val		ch=ch₂	781,6	C
217	-	-	Chg	Val	\ o (7 ZA	ch=ch₂	690,6	B
218			Chg	Val	U U ^H MU 0 \	ch=ch₂	776,4	C
219			Chg	Val	\ X ^H uu 0	ch=ch₂	759,3	Cl

PL 199 419 B1

Tabela 2 Nr związku	P6	P5	P4	P3	^2	*1	MS (MH+)	Zakres aktywno- ści
220			Chg	Val	9° 0 \	ch=ch₂	795,3	Cl
221	-	-	Chg	Val	r^N 0 0	ch=ch₂	796,3	C
222	Asp	D- Glu	Chg	Tbg	0 \	ch=ch₂	982,4	C
223			Chg	Val	/-0 ^a °\	ch=ch₂	825,3	C
224	-		Chg	Tbg	\	ch=ch₂	798,3	C
225	-	-	Chg	Val	Μ-γ-γίγ⁰^ 0 \	ch=ch₂	784,2	C
226			Chg	Val	Ol n 0 \	ch=ch₂	752,2	C

PL 199 419 B1

Tabela 2 Nr związku	P6	P5	P4	P3	^r2	*1	MS (MH+)	Zakres aktywno- ści
227			Chg	Val	0 Nx/\^N 0 \	CH=CH₂	715,4	B
228	-	-	Chg	Tbg	/ o °^z	ch=ch₂	692,2	C
229	-	-	Chg	Val	/ O O— M o	ch=ch₂	743,2	C
230			Chg	Val	„n-n N X , . \	ch=ch₂	716,3	C
231	—	—	Chg	Tbg	0 \	ch=ch₂	738,3	C
232		-	Chg	Tbg	Χ/Χχ 0 \	ch=ch₂	796,4	c
233			Chg	Tbg	/ o ΛΛ jO“°^Z	ch=ch₂	768,3	c
234			Chg	Tbg	Ογ^Νγχ 0 \	ch=ch₂	739,4	c

PL 199 419 B1

Tabela 2 Nr związku	P6	P5	P4	P3	^R2	^R1	MS (MH⁺)	Zakres aktywno- ści
235			Chg	Val	CF. O \	winyl	782,2	C
236	Asp	D- Glu	He	Val	O-Bn	winyl	829,3	C
237	-	-	Chg	Val	λΤΑλ λ	winyl	768,4	B
238	Asp	D- Glu	Chg	Tbg	O o /	winyl	1012, 6	C

* Br stosunek izomerów 5,5:2

PL 199 419 B1

Tabela 4

P4 P3

Tablica 4	B	Y	P4	P3	^R2	Rl	MS	Zakres
Nr związku							(MH⁺)	aktyw- ności
401	Ac	Me	Chg	Tbg	/ o za	winyl	782,3	C

Tabela 5

Tablica 5 „ _{T T} 4 - „ 1,, , 11J. Zi W 1^4 AU	B	^r20	MS	Zakres akt ywn osci
501	Cv 0		802,4	c
502	ο^^Νχ ^N II 0	0 \	852,4	c
503	O	0 \	851,3	c

PL 199 419 B1

Tabela 5 nr związku	B	^r2 0	MS	Zakres aktywności
504	0	0 \	851,3	C
505	0	0 \	851,3	C
506	Η	Ao T ' 0 \	696,3	C
507	°w._r 0	1 0 \	871,4	C
508	oo._r ιΓ 0	0 \	855,4	C
509	Η		726,7	C
510	CO - II 0	/ o ZA AOT^ozZ ZA	901,7	C
511	Dni		959,4	C

PL 199 419 B1

Claims

1. Związek o wzorze (I) w tym jego racematy, diastereoizomery i izomery optyczne:

w którym a oznacza 0 lub 1; b oznacza 0 lub 1; Y oznacza H lub C1-6alkil;

R6 oznacza C1-6alkil podstawiony przez karboksyl;

R5 oznacza C1-6alkil ewentualnie podstawiony przez karboksyl;

R4 oznacza C1-10alkil, C3-7cykloalkil lub C4-10(alkilocykloalkil);

R3 oznacza C1-10alkil, C3-7cykloalkil lub C4-10(alkilocykloalkil);

R2 oznacza CH2-R20 NH-R20, O-R20 lub S-R20 w których

R20 oznacza nasycony lub nienasycony C3-7cykloalkil lub C4-10(alkilocykloalkil), ewentualnie mono-, di- lub tri-podstawiony przez R21, lub R20 oznacza C6 lub C10aryl, lub C7-16aryloalkil ewentualnie mono-, di- lub tri-podstawiony przez R21, lub R20 oznacza Het lub (C1-6alkil)-Het ewentualnie mono-, di- lub tri-podstawiony przez R21, gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny zawierający 1 atom azotu lub 10-członowy bicykliczny heterocykl zawierający 1 do 4 atomów azotu;

przy czym R22 oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino ewentualnie mono- lub di-podstawiony przez C1-6alkil; sulfonyl; NO2; OH; SH; atom chlorowca; chlorowcoalkil; karboksyl; amid lub (C1-6alkilo)amid;

P4 oznacza aminokwas cykloheksyloglicynę (Chg);

P3 oznacza aminokwas walinę (Val);

P2 oznacza benzyloksy (O-Bn);

P1 oznacza racemiczną grupę o wzorze

PL 199 419 B1 i W oznacza OH.

2. Zwią zek według zastrz. 1, w którym

B oznacza H lub pochodną acylową o wzorze R7C(O)-, w którym R7 oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; C3-7cykloalkil ewentualnie podstawiony przez hydroksyl; amido ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil lub Het; C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil lub Het, wszystkie ewentualnie podstawione przez C1-6alkil lub hydroksyl, gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-członowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 lub 2 atomy N.

3. Związek według zastrz. 2, w którym R7 oznacza C1-6alkil lub Het, gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-członowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 lub 2 atomy N.

4. Zwią zek według zastrz. 3, w którym wymieniony Het jest wybrany z grupy obejmują cej:

6. Zwią zek według zastrz. 5, w którym B oznacza acetyl.

7. Związek według zastrz. 1, w którym B oznacza R7-SO2 i R7 oznacza C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil lub Het, wszystkie ewentualnie podstawione przez C1-6alkil, przy czym Het oznacza 6czło-nowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-członowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 lub 2 atomy N.

8. Związek według zastrz. 1, w którym R6, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny Asp lub Glu.

9. Zwią zek według zastrz. 8, w którym R6, gdy wystę puje, oznacza ł a ń cuch boczny Asp.

10. Związek według zastrz. 1, w którym a oznacza 0 i wówczas R6 nie występuje.

11. Związek według zastrz. 1, w którym R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny aminokwasu wybranego z grupy obejmującej: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-tertbutyloglicynę (Tbg) i L-Tbg.

12. Związek według zastrz. 11, w którym R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny D-Asp, D-Val lub D-Glu.

13. Związek według zastrz. 12, w którym R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny D-Glu.

14. Związek według zastrz. 1, w którym R4 oznacza łańcuch boczny aminokwasu wybranego z grupy obejmują cej: Val, cykloheksyloglicynę (Chg), Tbg, Ile lub Leu.

15. Związek według zastrz. 14, w którym R4 oznacza łańcuch boczny Chg lub Ile.

16. Związek według zastrz. 15, w którym R4 oznacza łańcuch boczny Chg.

PL 199 419 B1

17. Związek według zastrz. 1, w którym Y oznacza H lub Me.

18. Związek według zastrz. 17, w którym Y oznacza H.

19. Związek według zastrz. 1, w którym R3 oznacza łańcuch boczny aminokwasu wybranego z grupy obejmującej: Ile, Chg, Val lub Tbg.

20. Związek według zastrz. 19, w którym R3 oznacza łańcuch boczny Val, Chg lub Tbg.

21. Związek według zastrz. 20, w którym R3 oznacza łańcuch boczny Val lub Tbg.

22. Związek według zastrz. 1, w którym R2 oznacza S-R20/O-R20, w których R20 oznacza C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil, Het lub -CH2-Het, wszystkie ewentualnie mono-, di- lub tri-podstawione przez R21 gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny zawierający 1 atom azotu lub 10-członowy bicykliczny heterocykl zawierający 1 do 4 atomów azotu;

przy czym R21 oznacza C1-6alkil, C1-6alkoksyl; amino, mono- lub di-(C1-6alkilo)amino; amido ewentualnie mono-podstawiony przez C1-6alkil, C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil, Het lub (C1-6alkil)-Het; NO2; OH; atom chlorowca; trifluorometyl; karboksyl; C6 lub C10aryl, C7-10aryloalkil lub Het, gdzie Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spoś ród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; oraz wymieniony aryl, aryloalkil lub Het są ewentualnie podstawione przez R22;

przy czym R22 oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino; mono- lub di-(C1-6alkilo)amino; (C1-6alkilo)amid; NO2; OH; atom chlorowca; trifluorometyl; lub karboksyl.

23. Związek według zastrz. 22, w którym R21 oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino; di-(C1-6alkilo)amino; (C1-6alkilo)amid; C6 lub C10aryl lub Het, gdzie Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; oraz wymieniony aryl lub Het są ewentualnie podstawione przez R22, przy czym R22 oznacza C1-6alkoksyl; amino; di-(C1-6alkilo)amino; (C1-6alkilo)amid; atom chlorowca lub trifluorometyl.

24. Związek według zastrz. 22, w którym R2 oznacza 1-naftylometoksyl; 2-naftylometoksyl; benzyloksyl, 1-naftyloksyl; 2-naftyloksyl; lub chinolinoksyl niepodstawiony, mono- lub di-podstawiony przez R21, gdzie R21 ma znaczenie zdefiniowane w zastrz. 22.

25. Związek według zastrz. 22, w którym R2 oznacza 1-naftylometoksyl; lub chinolinoksyl niepodstawiony, mono- lub di-podstawiony przez R21, przy czym R21 ma znaczenie zdefiniowane w zastrz. 22.

26. Związek według zastrz. 25, w którym R2 oznacza:

w którym R21A oznacza amido ewentualnie podstawiony przez C1-6alkil, C6 lub C10aryl, C7-16aryloalkil lub Het; C6 lub C10aryl lub Het są ewentualnie podstawione przez R22, przy czym Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; i R22 oznacza amino, di-(C1-6alkilo)amino; lub (C1-6alkilo)amid: i R21B oznacza C1-6alkil; C1-6alkoksyl; amino; di-(C1-6alkilo)amino; (C1-6alkilo)amid; NO2; OH; atom chlorowca; trifluorometyl; lub karboksyl.

27. Związek według zastrz. 26, w którym R21A oznacza C6 lub C10aryl lub Het, wszystkie ewentualnie podstawione przez R22 gdzie Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; i R22 oznacza amino, dimetyloamino lub acetamido.

28. Związek według zastrz. 26, w którym R21B oznacza C1-6alkoksyl lub di-(C1-6alkilo)amino.

29. Związek według zastrz. 28, w którym R21B oznacza metoksyl.

30. Związek według zastrz. 1, w którym asymetryczny atom węgla w pozycji 1 ma konfigurację R, reprezentowany przez następujące konfiguracje bezwzględne:

w których R1 ma znaczenie zdefiniowane w zastrz. 1.

PL 199 419 B1

31. Związek według zastrz. 30, w którym podstawnik R1 przy P1 jest w orientacji syn względem grupy karbonylowej, co reprezentuje następująca bezwzględna konfiguracja:

w której R1 oznacza metyl, etyl, propyl, winyl, przy czym wszystkie są ewentualnie podstawione przez atom chlorowca.

32. Związek według zastrz. 31, w którym R1 oznacza etyl, winyl lub bromowinyl.

33. Związek według zastrz. 32, w którym R1 oznacza winyl.

34. Związek według zastrz. 1, w którym W oznacza hydroksyl lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub ester; lub (C1-6alkilo)amino, di-(C1-6alkilo)amino lub aminoaryloalkil.

35. Związek według zastrz. 32, w którym W oznacza hydroksyl lub N(R13a)R13b, w którym R13a i R13b oznaczają niezależ nie H, aryl, lub C1-6alkil ewentualnie podstawiony przez hydroksyl lub fenyl; lub ich farmaceutycznie dopuszczalną sól.

36. Związek według zastrz. 35, w którym W oznacza -OH, -NH-benzyl lub -NH-CH(Me)Ph.

37. Związek według zastrz. 36, w którym W oznacza -OH lub -NH-(S)CH(Me)-fenyl.

38. Związek według zastrz. 34, w którym gdy W oznacza ester, ester wybrany jest z grupy obejmującej: C1-6alkoksyl, fenoksyl lub arylo (C1-6alkoksyl).

39. Związek według zastrz. 38, w którym wymieniony ester oznacza metoksyl, etoksyl, fenoksyl, benzyloksyl lub PhCH(Me)-O-.

40. Związek o wzorze I według zastrz. 1, w którym B oznacza H, C1-6alkil-C(O)- lub Het-C(O)-; gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-członowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 albo 2 atomy azotu;

R6, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny Asp lub Glu;

R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny D- lub L-: Asp, Glu, Val lub Tbg;

Y oznacza H lub metyl;

R4 oznacza łańcuch boczny Val, Chg, Tbg, Ile lub Leu;

R3 oznacza atom wodoru lub łańcuch boczny Ile, Chg, Val lub Tbg;

R₂ oznacza 1-naftylometoksyl, 2-naftylometoksyl, O-Bn,

PL 199 419 B1 gdzie Het w każdym wypadku jest niezależnie wybrany spośród pirydylu, morfolinylu, tetrazolilu i benzodioksolilu; i R22 oznacza amino, di-(C1-6alkilo)amino, (C1-6alkilo)amid, NO2, OH, atom chlorowca, CF3 lub COOH;

P1 oznacza układ cyklopropylowy o wzorach w których R1 oznacza etyl, winyl lub bromowinyl; i

W oznacza hydroksyl lub N(R13a)R13b, w którym R13a i R13b oznaczają niezależ nie H, aryl lub C1-6alkil ewentualnie podstawiony przez hydroksyl lub fenyl; lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub ester.

41. Związek o wzorze I według zastrz. 1, w którym B oznacza H, acetyl lub Het-C(O)-; gdzie Het oznacza 6-członowy monocykliczny pierścień heterocykliczny lub 10-członowy bicykliczny heterocykl, każdy zawierający 1 albo 2 atomy azotu;

R6, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny Asp; R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny D-Asp, D-Glu lub D-Val; Y oznacza H; R4 oznacza łańcuch boczny Chg lub Ile; R3 oznacza łańcuch boczny Val, Chg lub Tbg; R2 oznacza 1-naftylometoksyl, benzyloksyl, 4-chinolinoksyl lub,

P1 oznacza układ cyklopropylowy o wzorze w którym R1 oznacza Et lub CH=CH2 lub CH=CHBr; i W oznacza hydroksyl lub NH-(S)-CHMePh, lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

42. Związek o wzorze I według zastrz. 1, w którym B oznacza acetyl; R6, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny Asp; R5, gdy występuje, oznacza łańcuch boczny D-Glu; Y oznacza H; R4 oznacza łańcuch boczny Chg; R3 oznacza łańcuch boczny Val lub Tbg; R2 oznacza:

P1 oznacza:

W oznacza hydroksyl, lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub ester.

PL 199 419 B1

43. Związek według zastrz. 40 reprezentowany wzorem:

w którym B, P6, P5, P4, P3, R2 i R1 mają zdefiniowane poniżej znaczenia:

Tabela 1 nr związku B P6 P5 P4 P3 r₂ ^R1 PI ^cl“^c2 101 Ac - - Chg Val OBn Et IR, 2R 102 Ac - - Chg Val OBn Et IR, 2?

103 Ac - - Chg Chg l-NpCH₂O Et IR,2?

104 Ac - - Chg Chg l-NpCH₂O Et 1R,2R 105 Ac - - Chg Chg l-NpCH₂O Et 1S, 2S 106 Ac - - Chg Val l-NpCH₂O Me IR, 2?

107 Ac - - Chg Val l-NpCH₂O CHMe₂ IR, 2?

108 Ac Asp D-Glu Chg Chg l-NpCH₂O Et 1R,2R 109 Ac Chg Val l-NpCH₂O CH₂O CH₂Ph IR,2?

110 Ac - - Chg Val l-NpCH₂O CH₂OCH₂Ph IR, 2?

111 Ac - - Chg Val l-NpCH₂) (CH₂)2Ph IR, 2?

112 Ac - - Chg Val l-NpCH₂O Et IR, 2R 113 Ac - - Chg Val l-NpCH₂O Et 1S,2S 114 Ac - - Chg Val ł-NpCH₂O Bn IR, 2?

115 Ac - - Chg Val l-NpCH₂O Bn IR, 2?

116 Ac Asp D-Glu He Val Obn Et IR, 2R 117 Ac Asp D-Glu Chg Val l~NpCH₂O Et IR, 2R 118 Ac - - Chg Val l-NpCH₂O Pr IR, 2?

119 Ac - - Chg Val l-NpCH₂O Pr IR, 1?

120 Ac Asp D-Val Chg Val l-NpCH₂O Et IR, 2R 121 Ac - Chg Val winyl 1S, 2R 122 Ac - - Chg Val °ęo etyl 1R,2S 123 Ac - - Chg Val φυ propyl 1R,2R

PL 199 419 B1

44. Związek według zastrz. 40 reprezentowany wzorem:

w którym P6, P5, P4, P3, R2 i R1 mają zdefiniowane poniżej znaczenia:

Tabela 2 Nr związku P6 P5 P4 P3 «2 Rl 201 202 - Chg Chg Val Chg OBn l-NpCH₂O ch-ch₂ ch=ch₂ 203 - - Chg Va ] 1-NpCH₂O ch=ch₂ 204 Chg Val OBn CH=CHBr* 205 - - Chg Val ch=ch₂ 206 - - Chg Val Męo ch=ch₂ 207 - - Chg Tbg ch=ch₂ 208 - - Chg Val \ ch=ch₂ 209 - - Chg Val ch-ch₂ 210 - Chg Val 0 \ ch=ch₂ 211 Chg Val Uio ^H UJ 0 \ . ch=ch₂ 212 Asp D-Glu Chg Val ch=ch₂ 21 3 - - Chg Val o \ ch=ch₂ 214 - - Chg Val 0 kJO 0 \ etyl

PL 199 419 B1 Tabela 2 Nr związku P6 P5 P4 P3 ‘ R-2 ' ^R1 215 Val Chg 1 0 \ CH=CH₂ 216 - - Chg Val /'U- \ ch=ch₂ 217 - - Chg Val ch=ch₂ 218 - Chg Val Ό s N > 0 \ ch=ch₂ 219 - - Chg Val n^/N~i S ' N N UU 0 \ ch=ch₂ 220 Chg Val O ^AOęo o \ ch=ch₂ 221 - - Chg Val ^h Uu 0 \ ch=ch₂ 222 Asp D-Glu Chg Tbg ch=ch₂ 223 Chg Val /~i O._T, ^H UU 0 \ ch=ch₂

PL 199 419 B1 Tabela 2 Nr związku P6 P5 Ρ4 P3 R2 Rl 224 - Chg Tbg / o ej) ry/ ch=ch₂ 225 - - Chg Val 0 \ ch=ch₂ 226 - - Chg Val °XCT i 0 \ ch=ch₂ 227 Chg Val V LYp 0 \ ch=ch₂ 228 - - Chg Tbg / o <FA χ // ch=ch₂ 229 - - Chg Val \ ch=ch₂ 230 - - ( Chg Val A \ ch=ch₂ 231 - - Chg Tbg 0 \ ch=ch₂ 232 - - Chg Tbg θγ^τ0Γ°Υ 0 \ ch=ch₂

PL 199 419 B1

45. Związek według zastrz. 40 reprezentowany wzorem:

w którym B, P6, P5, P4, P3, R2, R1 i W mają zdefiniowane poniżej znaczenia:

Tabela 3 nr związku B P6 P5 P4 P3 ^R2 ^R1 W 301 Ac Asp D-Glu Ile Val Obn El NH-(S)- CHMePh 302 Dni Asp D-Glu Chg Tbg ΟγγγΡ \ winyl OH

46. Związek według zastrz. 40 reprezentowany wzorem:

PL 199 419 B1 w którym B, Y, P4, P3, R2 i R1 maj ą zdefiniowane poniż ej znaczenia:

Tabela 4 Nr związku B Y P4 P3 ^R2 ^R1 401 Ac Me Chg Tbg / o ZA za winyl

47. Związek według zastrz. 40 reprezentowany wzorem:

w którym B i R20 zdefiniowane poni ż ej znaczenia:

PL 199 419 B1

48. Związek heksapeptydowy o wzorze I według zastrz. 43, wybrany z grupy obejmującej związki o numerach: 108; 116; 117; i 120.

49. Związek heksapeptydowy o wzorze I według zastrz. 44, wybrany z grupy obejmującej związki o numerach: 212; 222; 236; i 238.

50. Związek heksapeptydowy o wzorze I według zastrz. 45, wybrany z grupy obejmującej związki o numerach: 301 i 302.

51. Związek tetrapeptydowy o wzorze I według zastrz. 43, wybrany z grupy obejmującej związki o numerach: 122; i 123.

52. Związek tetrapeptydowy o wzorze I według zastrz. 44, wybrany z grupy obejmującej związki o numerach: 202; 203; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211; 214; 215; 216; 218; 219; 220; 221; 223; 224; 225; 226; 228; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235.

53. Związek tetrapeptydowy o wzorze I według zastrz. 46, wybrany z grupy obejmującej związki o numerach: 401.

54. Związek tetrapeptydowy o wzorze I według zastrz. 47, wybrany z grupy obejmującej związki o numerach: 501; 502; 503; 504; 505; 506; 507; 508; 509; 510; i 511.

55. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera skuteczną przeciw wirusowi zapalenia wątroby C ilość związku o wzorze I z zastrz. 1, lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru, w mieszance z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub środkiem pomocniczym.

56. Zastosowanie związku o wzorze I z zastrz. 1 lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C u ssaków.

57. Zastosowanie związku o wzorze I z zastrz. 1 lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru w ilości inhibitującej proteazę NS3 wirusa zapalenia wątroby C do wytwarzania leku do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby C.

58. Zastosowanie związku o wzorze I z zastrz. 1 lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusem zapalenia wątroby C u ssaków, leku zawierającego skuteczną przeciw wirusowi zapalenia wątroby C ilość kombinacji związku o wzorze I z zastrz. 1, lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli lub estru, oraz interferon.

59. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 55, znamienna tym, że zawiera drugi środek przeciwwirusowy wybrany z grupy zawierającej rybawirynę lub amantadynę.

60. Sposób wytwarzania analogu peptydu o wzorze (I) z zastrz. 1, w którym P1 oznacza podstawioną resztę kwasu aminocyklopropylokarboksylowego, znamienny tym, że zawiera etap, w którym:

sprzęga się ze związkiem pośrednim P1 o wzorze;

PL 199 419 B1 w którym R1 oznacza C1-6alkil lub C2-6alkenyl ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, CPG oznacza grupę zabezpieczającą karboksyl i P6 do P2 mają znaczenia zdefiniowane według zastrz. 1.

61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że grupę zabezpieczającą karboksyl (CPG) wybiera się z grupy obejmującej:

estry alkilowe, estry aryloalkilowe i estry ulegające rozpadające się pod wpływem łagodnej zasady lub łagodnych środków redukcyjnych.

62. Sposób wytwarzania analogu peptydu o wzorze (I) z zastrz. 1, w którym P1 oznacza podstawioną resztę kwasu aminocyklopropylokarboksylowego, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym:

sprzęga się ze związkiem pośrednim P1 o wzorze:

w którym R1 oznacza etyl, winyl lub bromowinyl, CPG oznacza grupę zabezpieczającą karboksyl i P6 do P2 mają znaczenia zdefiniowane w zastrz. 1.

63. Sposób według zastrz. 62, znamienny tym, że grupę zabezpieczającą karboksyl (CPG) wybiera się z grupy obejmującej:

64. Sposób wytwarzania analogu peptydu o wzorze (I) z zastrz. 1, w którym P1 oznacza podstawioną resztę kwasu aminocyklopropylokarboksylowego, znamienny tym, że zawiera etap, w którym:

sprzęga się ze związkiem pośrednim P1 o wzorze:

w którym R1 oznacza CPG grupę zabezpieczającą karboksyl i P6 do P2 mają znaczenia zdefiniowane w zastrz. 1.

65. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że grupę zabezpieczającą karboksyl (CPG) wybiera się z grupy obejmującej:

66. Zastosowanie analogu aminokwasu o wzorze:

w którym R1 oznacza C1-6alkil lub C2-6alkenyl ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, do otrzymywania związku o wzorze I z zastrz. 1.

67. Zastosowanie analogu aminokwasu o wzorze:

PL 199 419 B1 w którym R1 oznacza etyl, winyl lub bromowinyl, do otrzymywania związku o wzorze I z zastrz. 1. 68. Zastosowanie analogu aminokwasu o wzorze:

do otrzymywania związku o wzorze I z zastrz. 1.