PL199747B1 - Jednołańcuchowy wielofunkcyjny polipeptyd, polinukleotyd, wektor, komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, kompozycja, zastosowanie polipeptydu lub wektora lub polinukleotydu i zastosowanie polinukleotydu lub wektora oraz sposób identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów aktywacji lub stymulacji komórek T - Google Patents

Abstract

Opisano nowe jedno lancuchowe polipeptydy zawieraj ace przynajmniej dwa miejsca wiaz ace specyficzne wobec antygenu CD19 i CD3, odpowiednio. Ponadto ujawniono polipeptydy, w których powy zej opisany polipeptyd posiada przynajmniej jedn a dodatkow a domen e, korzystnie o ustalonej uprzednio funkcji. Ponadto, opisane s a polinukleotydy koduj ace wspomniane pelipeptydy, wektory zawieraj ace wspomniane polipeptydy oraz komórki gospodarza nimi transformowane i ich zastosowa- nie do produkcji wspomnianych polipeptydów. Ujawniono te z kompozycje, korzystnie kompozycje farmaceutyczne i diagnostyczne zawieraj ace dowolny ze wspomnianych poprzednio polipeptydów, polinukleotydów lub wektorów. Opisano takze zastosowanie powy zej wspomnianych polipeptydów, polinukleotydów i wektorów do przygotowywania kompozycji do immunoterapii, korzystnie skierowanej przeciwko uz lo sliwieniom komórek B takim jak ch loniak nieziarniczy. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest jednołańcuchowy wielofunkcyjny polipeptyd zawierający przynajmniej dwa miejsca wiążące specyficzne wobec antygenów CD19 i CD3, polinukleotyd kodujący taki polipeptyd, wektor zawierający taki polinukleotyd, komórka zawierająca taki wektor lub polinukleotyd, sposób wytwarzania polipeptydu, kompozycja do zastosowania terapeutycznego lub diagnostycznego, zawierająca taki polipeptyd, polinukleotyd lub wektor, zastosowanie polipeptydu lub wektora lub polinukleotydu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do immunoterapii, zwłaszcza specyficznej wobec uzłośliwionych komórek B, takich jak chłoniak nieziarniczy i zastosowanie polinukleotydu lub wektora do wytwarzania kompozycji do terapii genowej oraz sposób identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów aktywacji lub stymulacji komórek T.

W tekście tego opisu zacytowanych zostało kilka dokumentów. Każdy z zacytowanych dokumentów (włącznie z opisami producenta, instrukcjami itp.) jest włączony do tego opisu poprzez odesłanie, jednakże, nie oznacza to, że każdy z zacytowanych dokumentów stanowi w rzeczywistości stan techniki dla niniejszego wynalazku.

Pomimo znaczenia medycznego badania dotyczące chorób związanych z komórkami B, takich jak chłoniak nieziarniczy pozwoliły uzyskać zaledwie niewielką ilość użytecznych danych klinicznych, a tradycyjne zabiegi pozwalaj ą ce na leczenie takich schorzeń są ż mudne i nieprzyjemne i/lub wiążą się z wysokim ryzykiem wystąpienia nawrotu. Przykładowo, pomimo, że wysokodawkowa chemioterapia jako pierwszoplanowe leczenie zaawansowanego stadium chłoniaka nieziarniczego może poprawiać ogólną przeżywalność, to jednak wciąż około 50% pacjentów umiera na tę chorobę (2-4). Ponadto, słabo zaawansowana, podobna do chłoniaka nieziarniczego przewlekła białaczka limfatyczna i chł oniak z komórek pł aszcza są nadal nieuleczalne. Stymuluje to poszukiwanie alternatywnych strategii, takich jak immunoterapia. Przeciwciała specyficzne wobec cząsteczek z powierzchni komórkowej określane przez antygeny CD reprezentują unikalną możliwość uzyskania czynników terapeutycznych.

Ekspresja pewnych antygenów CD jest silnie ograniczona do specyficznych linii komórek limfohematopoetycznych a w przeciągu kilku ostatnich lat, przeciwciała skierowane przeciwko antygenom komórek limfoidalnych były stosowane do opracowywania leczenia efektywnego zarówno in vitro, jak i w eksperymentalnych modelach zwierzęcych (5-13). Pod tym względem CD19 stanowi bardzo użyteczny cel. CD19 jest ekspresjonowany przez ogół linii B od komórek pro B do dojrzałych komórek B, nie jest gubiony, jest jednolicie ekspresjonowany na wszystkich limfocytach, i nie jest obecny na komórkach macierzystych (8, 14). Interesującą możliwością jest zastosowanie bispecyficznych przeciwciał z jedną specyficznością wobec CD19 i inną wobec antygenu CD3 z komórek T. Jednakże, wadą bispecyficznych przeciwciał udostępnionych w ten sposób jest niska cytotoksyczność komórek T i zapotrzebowanie na czynniki kostymulujące w celu uzyskania zadowalającej aktywności biologicznej.

Zatem, problemem technicznym postawionym przed tym wynalazkiem jest dostarczenie środków i metod użytecznych do leczenia chorób związanych z komórkami B, takich jak rozliczne postaci chłoniaka nieziarniczego.

Przedmiotem wynalazku jest jednołańcuchowy wielofunkcyjny polipeptyd zawierający:

(a) pierwszą domenę zawierającą miejsce wiążące łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała specyficznie rozpoznającego antygen CD19; i (b) drugą domenę zawierającą miejsce wiążące łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała specyficznie rozpoznającego antygen CD3;

przy czym domeny są ułożone w kolejności VLCD19-VHCD19-VLCD3-VHCD3.

Korzystnie obydwie domeny są połączone przez łącznik polipeptydowy.

Korzystnie pierwsza i/lub druga domena imituje lub odpowiada regionowi VH i VL naturalnego przeciwciała.

Korzystniej przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem syntetycznym lub przeciwciałem humanizowanym.

Korzystniej przynajmniej jedna z domen jest jednołańcuchowym fragmentem regionu zmiennego przeciwciała.

Korzystniej łącznik polipeptydowy zawiera liczne reszty glicyny, alaniny i/lub seryny.

Korzystniej łącznik polipeptydowy zawiera liczne kolejne kopie sekwencji aminokwasowej.

Korzystniej łącznik polipeptydowy zawiera 1 do 5 reszt aminokwasowych.

Korzystniej łącznik polipeptydowy zawiera sekwencję aminokwasową Gly Gly Gly Gly Ser.

PL 199 747 B1

Jeszcze korzystniej pierwsza domena zawiera przynajmniej jeden CDR z regionu VH i VL zawierający sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA przedstawioną na Figurze 8, nukleotydy od 82 do 414 (VL) i nukleotydy od 460 do 831 (VH) i/lub druga domena zawiera przynajmniej jeden CDR z regionu VH i VL zawierający sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA przedstawioną na Figurze 8, nukleotydy od 847 do 1203 (VH) i nukleotydy od 1258 do 1575 (VL).

Jeszcze korzystniej miejsce wiążące pierwszej domeny wykazuje powinowactwo przynajmniej około 10^-7M; i/lub (a) miejsce wiążące drugiej domeny wykazuje powinowactwo mniejsze niż około 10^-7M.

Jeszcze korzystniej jest bispecyficznym jednołancuchowym przeciwciałem.

Jeszcze korzystniej zawiera przynajmniej jedną dodatkową domenę, przy czym korzystnie dodatkowa domena jest przyłączona wiązaniem kowalencyjnym lub niekowalencyjnym.

Jeszcze korzystniej przynajmniej jedna dodatkowa domena zawiera cząsteczkę efektorową posiadającą konformację dogodną dla aktywności biologicznej, zdolną do maskowania jonu lub selektywnego wiązania się ze stałym nośnikiem lub ustaloną wcześniej determinantą.

Przedmiotem wynalazku jest też polinukleotyd, charakteryzujący się tym, że w trakcie ekspresji koduje polipeptyd określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera polinukleotyd określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka, charakteryzująca się tym, że transfekowana jest polinukleotydem określonym powyżej lub wektorem określonym powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania polipeptydu określonego powyżej, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których hoduje się komórkę określoną powyżej i izoluje się polipeptyd z hodowli.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja do zastosowania terapeutycznego lub diagnostycznego, charakteryzująca się tym, że zawiera polipeptyd określony powyżej, polinukleotyd określony powyżej lub wektor określony powyżej.

Korzystnie jest kompozycją farmaceutyczną zawierającą ewentualnie dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnie jest kompozycją diagnostyczną ewentualnie dodatkowo zawierającą odpowiednie środki do detekcji.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polipeptydu określonego powyżej, polinukleotydu określonego powyżej lub wektora określonego powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia B-komórkowych złośliwych zmian nowotworowych, chorób autoimmunologicznych związanych z komórkami B lub utraty komórek B.

Korzystnie B-komórkowe złośliwe zmiany nowotworowe to chłoniak nieziarniczy.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie polinukleotydu określonego powyżej albo wektora określonego powyżej, do wytwarzania kompozycji do terapii genowej.

Korzystnie kompozycja przeznaczona jest do stosowania w leczeniu ludzi.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów aktywacji lub stymulacji komórek T, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których:

(a) hoduje, się komórki T i komórki CD19 pozytywne, zwłaszcza komórki B, w obecności polipeptydu określonego w zastrz. 1 do 15 i ewentualnie w obecności składnika zdolnego do wytworzenia wykrywalnego sygnału w odpowiedzi na aktywację komórek T składnikiem poddawanym skriningowi w warunkach pozwalają cych na aktywację komórki T; i (b) wykrywa się obecność lub nieobecność sygnału generowanego przez wzajemne oddziaływanie składnika z komórkami.

Określenie „pierwsza domena i „druga domena w tym wynalazku oznaczają, że jedno miejsce wiążące jest skierowane przeciwko markerowi komórek pan B CD19, który jest jednolicie ekspresjonowany na większości uzłośliwionych komórek B, natomiast drugie miejsce wiążące jest skierowane przeciwko antygenowi CD3 ludzkich komórek T.

Określenie miejsce wiążące stosowane w odniesieniu do tego wynalazku oznacza domenę zawierającą strukturę trójwymiarową zdolną do specyficznego wiązania się z ich epitopem podobnym do natywnych przeciwciał, wolnych fragmentów scFv lub jednego z odpowiadających łańcuchów immunoglobulinowych, dogodnie łańcucha VH. Zatem taka domena może obejmować domenę VH i/lub VL łańcucha przeciwciała lub immunoglobuliny, dogodnie przynajmniej domenę VH. Z drugiej strony, takie miejsca wiążące zawarte w polipeptydzie według wynalazku mogą zawierać przynajmniej jeden region determinujący dopasowanie (CDR) z przeciwciała lub łańcucha immunoglobuliny rozpoznający

PL 199 747 B1 antygeny CD19 i CD3, odpowiednio. W związku z tym, podkreśla się, że domeny miejsc wiążących obecne w polipeptydzie według wynalazku mogą pochodzić nie tylko z przeciwciał lecz także z innych białek wiążących CD19 i CD3, takich jak naturalnie występujące receptory powierzchniowe lub ligandy. Według wynalazku, takie miejsce wiążące jest zawarte w domenie.

Określenie polipeptyd wielofunkcyjny stosuje się do określenia polipeptydu zawierającego przynajmniej dwie sekwencje aminokwasowe pochodzące z różnych źródeł, tj. z różnych cząsteczek, ewentualnie pochodzące z różnych gatunków przy czym przynajmniej dwa z tych źródeł determinują miejsca wiążące. Zatem, takie miejsca wiążące determinują funkcje lub przynajmniej pewne funkcje takiego peptydu wielofunkcyjnego. Takie polipeptydy obejmują, przykładowo, bispecyficzne jednołańcuchowe przeciwciała (bsc).

Określenie jednołańcuchowy stosowane w związku z tym wynalazkiem oznacza, że wspomniana pierwsza i druga domena polipeptydu są połączone kowalencyjnie, dogodnie w postaci współliniowej sekwencji aminokwasowej mogącej być kodowaną przez cząsteczkę kwasu nukleinowego.

CD19 oznacza antygen, który jest ekspresjonowany przez linie B, takie jak komórki pro B i dojrzałe komórki B, nie jest gubiony, jest jednolicie ekspresjonowany na wszystkich chłoniakach, i nie jest obecny na komórkach macierzystych (8, 14).

CD3 oznacza antygen, który jest ekspresjonowany na komórkach T jako wielocząsteczkowy kompleks receptora komórek T, który składa się z trzech różnych łańcuchów CD3ε, CD3δ i CD3y. Skupianie CD3 na komórkach T, np. poprzez immobilizowane przeciwciała anty-CD3, prowadzi do aktywacji komórek T podobnej do włączania receptora komórek T, lecz niezależnie od ich typowej specyficzności klonalnej. Faktycznie, większość przeciwciał anty-CD3 rozpoznaje łańcuch CD3ε.

Przeciwciała specyficznie rozpoznające antygen CD19 lub CD3 są opisane w stanie techniki, np. w (24), (25) i (43), odpowiednio, i mogą być otrzymane tradycyjnymi metodami znanymi ze stanu techniki.

Bispecyficzne przeciwciała CD19xCD3, które nie są w postaci jednołańcuchowej, i które przekierunkowują cytotoksyczność komórek T na komórki chłoniaka w sposób zależny od MHC zostały już uznane za efektywne in vitro (5, 6, 9-11, 13, 43), w modelach zwierzęcych (7, 28) oraz w pewnych pilotażowych próbach klinicznych (12, 29, 30). Do tej pory przeciwciała te były konstruowane technikami hybrydhybrydom, poprzez kowalencyjne wiązanie przeciwciał monoklonalnych (31) lub techniką diaciał (43).

Intensywniejsze badania kliniczne były utrudnione przez fakt, że te przeciwciała wykazują niską aktywność biologiczną, w związku z czym wymagane było podawanie wysokich dawek a stosowanie samych przeciwciał nie dostarcza korzyści terapeutycznych. Ponadto, dostępność materiału o czystości klinicznej była ograniczona.

Bez wiązania się żadną teorią, uważa się, że stosowanie bispecyficznych tworów podobnych do opisanych powyżej, a zatem i wytworzonych polipeptydów, takich jak bispecyficzne przeciwciała CD19xCD3 jest zwykle zdolne do niszczenia CD19-pozytywnych komórek docelowych poprzez rekrutację cytotoksycznych limfocytów T bez potrzeby wstępnej i/lub jednoczesnej stymulacji komórek T. Pozostaje to w dużym kontraście ze wszystkimi znanymi bispecyficznymi przeciwciałami CD19xCD3 produkowanymi zgodnie z innymi układami cząsteczkowymi i zwykle nie zależy od poszczególnych specyficzności przeciwciała CD19 i CD3 zastosowanych w konstrukcji np. bispecyficznego przeciwciała jednołańcuchowego. Niezależność od jednoczesnej lub wstępnej stymulacji komórek T może istotnie wpływać na wyjątkowo wysoką cytotoksyczność zależną od polipeptydu według wynalazku, co zilustrowano przykładem bispecyficznego przeciwciała CD19xCD3 opisanego w przykładach.

Sposoby wytwarzania i oczyszczania polipeptydu według wynalazku są łatwe, ponieważ nie wiążą się one z problemami niskiej wydajności, występowaniem źle zdefiniowanych produktów ubocznych, lub pracochłonnymi procedurami oczyszczania (15-19) opisanymi dla przeciwciał specyficznych wobec CD19xCD3 produkowanych techniką hybryd-hybrydom, przez chemiczne sprzęganie lub odzyskiwanie z produkowanych bakteryjnie ciał inkluzyjnych, ze względu na fakt, że tworzy on małą, względnie zwartą strukturę. Następne zalety i nieoczekiwane właściwości polipeptydu według wynalazku zostaną omówione w załączonych przykładach, obejmujących pewne zalecane realizacje wynalazku poniżej, które ilustrują szeroki zakres wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem zastosowano ekspresję w układach eukariotycznych opracowaną do wytwarzania rekombinowanych, bispecyficznych jednołańcuchowych przeciwciał (1) w celu uzyskania rekombinowanego bispecyficznego jednołańcuchowego przeciwciała CD19xCD3 poprzez ekspresję w komórkach CHO. W pełni funkcjonalne przeciwciało można było łatwo oczyścić z supernatantu hodowli komórkowej, dzięki C-końcowemu znacznikowi histydynowemu (tag histydynowy) poprzez chromatografię na kolumnie z Ni-NTA. Specyficzne wiązanie do CD19 i CD3 zostało wykazane techPL 199 747 B1 niką FACS. Uzyskana cząsteczka bscCD19xCD3 (bispecyficzne jednołańcuchowe CD19xCD3) według wynalazku wykazała pewne nieoczekiwane właściwości, mianowicie:

- indukowała ona wysoką cytotoksyczność komórek T ukierunkowaną wobec chłoniaka in vivo i in vitro. Nawet przy bardzo niskich stężeniach 10-100 pg/ml i niskich stosunkach E(efektor)/T(cel), wynoszących od 5:1 do 2,5:1 obserwowano znaczną, specyficzną lizę linii komórek chłoniaka. Ponadto, 3 μg do 10 μg cząsteczki bscCD19xCD3 według wynalazku w zastosowaniu wspomagającym wykazało wyraźne i znaczące polepszenie statusu medycznego. W porównaniu ze znanymi przeciwciałami CD19xCD3 otrzymywanymi techniką hybryd-hybrydom lub techniką diaciał (które także reprezentują różne postacie) wykazującymi aktywność cytotoksyczną w zakresie kilku nanogramów/ml lub nawet μg/ml, przeciwciało bscCD19xCD3 według wynalazku wydaje się być dużo bardziej efektywne (5-7, 27, 43), co udokumentowano np. w przykładach 4, 5 i 7.

- Nawet niskie stężenia bscCD19xCD3 według wynalazku były zdolne do szybkiego indukowania cytotoksyczności skierowanej wobec chłoniaka (po 4 godzinach) przy niskim stosunku E:T bez konieczności wstępnej stymulacji komórek T. Dla kontrastu, tradycyjne przeciwciało bispecyficzne CD19xCD3 (5-7, 27) nie wykazywało znaczącej aktywności cytotoksycznej w tych warunkach (tj. bez wstępnej stymulacji komórek T, niski stosunek E:T) nawet dla wysokich stężeń do 3000 ng/ml. Pomimo, że indukowanie aktywności cytotoksycznej bez wstępnej stymulacji zostało także opisane w przypadku innych tradycyjnych przeciwciał CD19xCD3 efekt ten był obserwowany dla wysokich stężeń i wysokich stosunków E:T (100 ng/ml, 27:1) (9) w porównaniu z bscCD19xCD3 według wynalazku (100 pg/ml, 2,5:1). Ponadto, efekt cytotoksyczny tych tradycyjnych przeciwciał był obserwowany tylko po 1 dniu wstępnej stymulacji z bispecyficznym przeciwciałem, natomiast bscCD19xCD3 według wynalazku indukowało cytotoksyczność ukierunkowaną wobec chłoniaka już po 4 godzinach. Według wiedzy twórców wynalazku taka szybka i specyficzna aktywność cytotoksyczna niestymulowanych komórek T przy tak niskich stężeniach i stosunkach E:T nie została opisana dla innych bispecyficznych przeciwciał opisanych dotychczas. Pomimo, że dotychczasowe anty-p185HER2/anty-CD3 bispecyficzne przeciwciało F(ab)2 wykazywało zdolność do indukowania aktywności cytotoksycznej przy podobnych stężeniach jak w przypadku bscCD19xCD3 według wynalazku, przeciwciało to wymagało 24 godzinnej wstępnej stymulacji za pomocą IL-2 (32). Zatem, przeciwciało bscCD19xCD3 według wynalazku wykazuje unikalne właściwości cytotoksyczne odróżniające tę cząsteczkę od innych bispecyficznych przeciwciał poprzednio opisanych.

bscCD19xCD3 według wynalazku wpływa na efekty cytotoksyczne specyficzne wobec antygenów, co jest potwierdzane przez to, że:

- to przeciwciało nie powodowało lizy linii komórek plazmocytomy NCl i L363, które są liniami komórkowymi komórek B nie ekspresjonującymi antygenu CD19; i

- cytotoksyczność wobec komórek chłoniaka mogła być zablokowana przez macierzyste przeciwciało anty-CD19 HD37. (Przeciwciało HD37 pochodzi z hybrydomy HD37 (22)). Blokowanie ścieżki perforynowej przez wyłapywanie wapnia przez EGTA całkowicie blokuje cytotoksyczność zależną od bscCD19xCD3, sugerując, że specyficzna liza jest efektem zależnym od komórki T, a nie efektem bezpośrednim działania samego przeciwciała.

Podsumowując, przeciwciało bscCD19xCD3 skonstruowane według ogólnych zasad tutaj opisanych jest lepsze niż dotychczas opisane bispecyficzne przeciwciała CD19xCD3 ze względu na jego znaczącą wyższą aktywność biologiczną oraz możliwość jego szybkiej i łatwej produkcji, pozwalającej na otrzymywanie wystarczającej ilości materiału o wysokiej jakości nadającego się do klinicznych zastosowań.

Zatem, cząsteczki bscCD19xCD3 według wynalazku są odpowiednimi kandydatami do sprawdzenia w próbach klinicznych dotyczących terapeutycznej przydatności przeciwciał bispecyficznych w leczeniu chorób zależnych od komórek B, takich jak chłoniak nieziarniczy.

W zalecanej realizacji polipeptydu według wynalazku wspomniane domeny są połączone przez łącznik polipeptydowy. Taki łącznik może być umieszczony pomiędzy pierwszą i drugą domeną, przy czym łącznik polipeptydowy dogodnie może zawierać liczne, hydrofilowe, połączone wiązaniami peptydowymi aminokwasy łączące N-koniec pierwszej domeny z C-końcem drugiej domeny.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku wspomniana pierwsza i/lub druga domena opisanego powyżej polipeptydu imituje lub odpowiada regionowi VH i VL naturalnego przeciwciała. Przeciwciało dostarczające miejsce wiążące dla polipeptydu według wynalazku może być, np. przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem poliklonalnym, przeciwciałem chimerycznym, przeciwciałem humanizowanym, przeciwciałem bispecyficznym, przeciwciałem syntetycznym, fragmentem przeciwciała, takim jak fragmenty Fab, Fv lub scFv itp., lub chemicznie modyfikowaną pochodną jednego z nich. Przeciwciała monoklonalne

PL 199 747 B1 mogą być otrzymane, przykładowo, techniką pierwotnie opisaną przez Kohler i Milstein, Nature 256 (1975), 495, i Galfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, która obejmuje fuzję komórek mysiego szpiczaka z komórkami śledziony pochodzącymi od immunizowanego ssaka wraz z modyfikacjami znanymi ze stanu techniki.

Ponadto, przeciwciała lub ich fragmenty specyficzne wobec wspomnianych poprzednio antygenów, mogą być otrzymane metodami opisanymi przez np. Harlow i Lane „Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Przeciwciała mogą być otrzymywane z różnych gatunków, włącznie z człowiekiem. Gdy otrzymuje się pochodne tych przeciwciał technikami prezentacji na fagach można zastosować powierzchniowy rezonans plazmonowy, taki jak w przypadku systemu BIAcore, w celu zwiększenia efektywności przeciwciał fagowych, które wiążą się z epitopem antygenu CD19 lub CD3 (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995) 7-13). Produkcja przeciwciał chimerycznych została opisana przykładowo w WO 89/09622. Metody produkcji przeciwciał humanizowanych opisano np. w EP-A1 0 239 400 i WO 90/07861. Dodatkowym źródłem przeciwciał, które może być wykorzystane do realizacji niniejszego wynalazku są tzw. przeciwciała ksenogeniczne. Ogólne zasady produkcji przeciwciał ksenogenicznych, takich jak ludzkie przeciwciała w myszach zostały opisane w np.: WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 i WO 96/33735.

Przeciwciała nadające się do wykorzystania w wynalazku lub odpowiadające im łańcuch(y) immunoglobulinowe mogą być dodatkowo modyfikowane za pomocą konwencjonalnych technik znanych ze stanu techniki, przykładowo, poprzez zastosowanie aminokwasowych delecji, insercji, substytucji, addycji i/lub rekombinacji, i/lub innych modyfikacji znanych ze stanu techniki, osobno lub w ich wzajemnej kombinacji. Sposoby otrzymywania takich modyfikacji w sekwencji DNA określającej sekwencję aminokwasową łańcucha immunoglobuliny są dobrze znane fachowcom; patrz np. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. Odnośne modyfikacje są dogodnie prowadzone na poziomie kwasu nukleinowego.

W kolejnej korzystnej realizacji przynajmniej jedna domena opisanego powyżej polipeptydu jest jednołańcuchowym fragmentem zmiennego regionu przeciwciała.

Jak dobrze wiadomo, minimalny fragment przeciwciała, Fv, który posiada pełne miejsce rozpoznające i wiążące antygen, składa się z dimeru domeny zmiennej jednego ciężkiego i jednego lekkiego łańcucha (VH i VL) w niekowalencyjnym połączeniu. W tej konfiguracji, która odpowiada tej w natywnych przeciwciałach, trzy regiony determinujące dopasowanie (CDR) z każdej zmiennej domeny uczestniczą w definiowaniu miejsca wiążącego antygen na powierzchni dimeru VH-VL. Łącznie, sześć CDR odpowiada za specyficzność wiązania antygenu przez przeciwciało. Regiony szkieletowe (FR) flankujące CDR posiadają trzeciorzędową strukturę, która jest zasadniczo konserwowana w natywnych immunoglobulinach gatunków tak różnych jak mysz i człowiek. Te FR służą do utrzymywania CDR w odpowiedniej orientacji. Stałe domeny nie są wymagane do funkcji wiążącej, lecz mogą uczestniczyć w stabilizowaniu oddziaływań VH-VL. Nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv odpowiadająca tylko trzem CDR specyficznym wobec antygenu) posiada zdolność do rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż zazwyczaj z niższym powinowactwem niż całe miejsce wiążące (Painter, Biochem. 11 (1972), 1327-1337). Ważne jest, jednakże, aby domeny VH i VL były tak ułożone, aby miejsce wiążące antygen mogło odpowiednio sfałdować.

W korzystnej realizacji polipeptydów według wynalazku wspomniane domeny są ułożone w kolejności VLCD19-VHCD19-VLCD3-VHCD3, przy czym „VL i „VH oznaczają lekki i ciężki łańcuch zmiennej domeny specyficznych przeciwciał anty-CD19 i anty-CD3.

Co przedyskutowano powyżej, wspomniane miejsca wiążące są dogodnie połączone przez elastyczny łącznik, korzystnie łącznik polipeptydowy umieszczony pomiędzy wspomnianymi domenami, przy czym wspomniany łącznik polipeptydowy może zawierać liczne, hydrofilowe, połączone wiązaniami peptydowymi aminokwasy o długości wystarczającej, aby objąć odległość pomiędzy C-końcem pierwszej domeny zawierającej miejsce wiążące a N-końcem drugiej domeny zawierającej miejsce wiążące, gdy polipeptyd według wynalazku umieszczony w środowisku wodnym przyjmuje konformację odpowiednią do wiązania. Korzystnie, wspomniany łącznik polipeptydowy zawiera liczne reszty glicyny, alaniny i/lub seryny. Zgodnie z dalszą korzystną realizacją wynalazku wspomniany łącznik polipeptydowy zawiera liczne kolejne kopie sekwencji aminokwasowej. Zwykle, polipeptyd łącznikowy zawiera od 1 do 15 aminokwasów, chociaż łącznik dłuższy niż 15 aminokwasów może być także odpowiedni. W korzystnej realizacji wynalazku wspomniany łącznik polipeptydowy zawiera 1 do 5 reszt aminokwasowych.

W szczególnie korzystnej realizacji wynalazku łącznik polipeptydowy w polipeptydzie według wynalazku zawiera 5 aminokwasów. Jak pokazano w poniższych przykładach, wspomniany łącznik polipeptydowy korzystnie zawiera sekwencję aminokwasową Gly Gly Gly Gly Ser.

PL 199 747 B1

W kolejnej szczególnie korzystnej realizacji wynalazku, wspomniana pierwsza domena polipeptydu według wynalazku zawiera przynajmniej jeden CDR z regionu VH i VL zawierający sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA przedstawioną na Figurze 8 nukleotydy od 82 do 414 (VL) i nukleotydy od 460 do 431 (VH) i/lub wspomniana druga domena zawiera przynajmniej jeden CDR, korzystniej dwa, jeszcze korzystniej trzy CDR z regionu VH i VL zawierający sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA przedstawioną na Figurze 8 nukleotydy od 847 do 1203 (VL) i nukleotydy od 1258 do 1575 (VH), ewentualnie w połączeniu z regionami szkieletowymi występującymi wraz ze wspomnianymi CDR w macierzystych przeciwciałach. CDR zawarte w regionach zmiennych przedstawionych na Figurze 8, mogą być określone, przykładowo, według Kabat, „Sequence of Proteins of Immunological Interest (U.S.Department of Health and Human Service, trzecia edycja, 1983; czwarta edycja, 1987; piąta edycja, 1990). Fachowiec łatwo stwierdzi, że miejsce wiążące lub przynajmniej jeden CDR wywodzący się stamtąd może być zastosowany do skonstruowania polipeptydu według wynalazku. Dogodnie, wspomniany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA przedstawioną na Figurze 8, nukleotydy od 82 do 1575. Fachowiec stwierdzi, że miejsca wiążące z polipeptydu według wynalazku mogą być skonstruowane zgodnie z metodami znanymi ze stanu techniki np. opisanymi w EP-A1 0 451 216 i EP-A1 0 549 581.

Domeny miejsc wiążących peptydu według wynalazku dogodnie wykazują specyficzność przynajmniej zasadniczo identyczną ze specyficznością wiążącą np. przeciwciała lub łańcucha immunoglobuliny z którego pochodzą. Takie domeny miejsc wiążących wykazują powinowactwo wiązania do antygenu CD3 przynajmniej 10⁵M^-1, dogodnie nie większe niż 10⁷M^-1 dla antygenu CD3 i dogodnie do 10¹⁰M^-1 lub wyższe dla antygenu CD19.

W korzystnej realizacji polipeptydu według wynalazku (a) miejsce wiążące pierwszej domeny posiada powinowactwo przynajmniej około 10^-7M, dogodnie przynajmniej około 10^-9M i najdogodniej przynajmniej około 10^-11M; i/lub (b) miejsce wiążące drugiej domeny posiada powinowactwo mniejsze niż około 10^-7M, dogodnie mniej niż około 10^-6M i najdogodniej rzędu 10^-5M.

Zgodnie z realizacjami opisanymi powyżej, zalecane jest gdy miejsce wiążące rozpoznające antygen CD19 wykazuje wysokie powinowactwo aby wychwycić komórki docelowe, i które mają być zniszczone z wysoką efektywnością. Z drugiej strony, powinowactwo wiązania miejsca wiążącego rozpoznającego antygen CD3 powinno być rzędu tego, które posiada naturalny receptor CD3 lub takie jakie zwykle stwierdza się dla oddziaływań receptora komórek T z jego ligandem, to jest kompleksem peptyd-MHC na powierzchni komórki docelowej.

W innej korzystnej realizacji wynalazku, polipeptyd opisany powyżej jest bispecyficznym jednołańcuchowym przeciwciałem.

W innej korzystnej realizacji wynalazku, polipeptyd zawiera przynajmniej jedną dodatkową domenę, przy czym domeny te są połączone wiązaniem kowalencyjnym lub niekowalencyjnym.

Połączenie może być oparte na fuzji genetycznej zgodnie z metodami znanymi ze stanu techniki i opisanymi powyżej lub może być uzyskane poprzez np. chemiczne sieciowanie opisane np. w WO 94/04686. Dodatkowa domena obecna w polipeptydzie według wynalazku może być korzystnie przyłączona poprzez elastyczny łącznik, korzystnie łącznik polipeptydowy do jednej z domen miejsca wiążącego, przy czym wspomniany łącznik polipeptydowy zawiera liczne, hydrofilowe, połączone wiązaniami peptydowymi aminokwasy o długości wystarczającej aby połączyć odległość pomiędzy C-końcem jednej ze wspomnianych domen i N-końcem innej ze wspomnianych domen gdy polipeptyd według wynalazku umieszczony w środowisku wodnym przyjmuje konformację odpowiednią do wiązania. Korzystnie, łącznik polipeptydowy jest polipeptydem łącznikowym opisanym w powyższych realizacjach. Polipeptyd według wynalazku może ponadto zawierać łącznik ulegający trawieniu lub miejsce trawienia dla proteinazy, takiej jak enterokinaza; patrz także poniższe przykłady.

Ponadto, wspomniana dodatkowa domena może posiadać określoną uprzednio specyficzność lub funkcję. Przykładowo, dostępne publikacje dostarczają informacji dotyczących dostarczania substancji posiadających aktywność biologiczną takich jak leki, toksyny i enzymy do specyficznych miejsc ciała, w celu niszczenia lub umiejscawiania komórek nowotworowych lub indukowania miejscowego działania leku lub działania enzymatycznego. Proponowano, że można ten efekt osiągać poprzez łączenie bioaktywnej substancji z przeciwciałami monoklonalnymi (patrz np. Oxford University Press; oraz Ghose, J. Nat. Cancer Inst. 61 (1978), 657-676).

W tym kontekście, należy rozumieć, że polipeptydy według wynalazku mogą być także dalej modyfikowane technikami znanymi ze stanu techniki. Pozwala to na konstruowanie chimerycznych

PL 199 747 B1 białek zawierających polipeptyd według wynalazku i inne funkcjonalne sekwencje aminokwasowe, np. sygnały lokalizacji jądrowej, domeny transaktywacyjne, domeny wiążące. DNA, domeny wiążące hormony, tagi białkowe (GST, GFP, peptyd h-myc, FLAG, peptyd HA), które mogą pochodzić heterologicznych białek. Jak opisano w załączonych przykładach, polipeptyd według wynalazku może zawierać znacznik FLAG o długości około 8 aminokwasów; patrz figura 8.

Polipeptydy według wynalazku mogą być zastosowane do leczenia pacjentów cierpiących na zaburzenia B-komórkowe, takie jak chłoniak B-komórkowy, przewlekła białaczka limfatyczna z komórek B (B-CLL) i/lub choroby autoimmunologiczne związane z komórkami B, takie jak miastenia, choroba Basedowa, zapalenie tarczycy typu Hashimoto, lub zespół Goodpasture'a. Leczeniu takiemu może towarzyszyć, przykładowo, podawanie polipeptydów według wynalazku. Leczenie takie może wykorzystywać polipeptydy znakowane i nieznakowane.

Przykładowo, polipeptydy według wynalazku mogą być podawane jako znakowane wraz z czynnikiem terapeutycznym. Takie czynniki mogą być połączone bezpoś rednio lub poś rednio z przeciwciałem lub antygenem. Jednym z przykładów pośredniego sprzęgania jest stosowanie cząsteczki rozdzielającej (ang. spacer). Takie cząsteczki rozdzielające, kolejno, mogą być zarówno nierozpuszczalne jak i rozpuszczalne (Diener, Science 231 (1986), 148) i mogą być wybrane w celu umożliwienia uwalniania leków z antygenu w miejscu docelowym. Przykłady czynników leczniczych, które mogą być sprzężone z polipeptydami według wynalazku w celu prowadzenia immunoterapii są leki, radioizotopy, lektyny i toksyny. Leki, które mogą być sprzęgane z polipeptydami według wynalazku obejmują związki, które tradycyjnie są określanie jako leki, takie jak mitomycyna C, daunorubicyna i winblastyna.

W stosowaniu sprzężonych z radioizotopami polipeptydów według wynalazku w celu, np. immunoterapii, pewne izotopy mogą być bardziej zalecane niż inne, w zależności od czynników takich jak rozmieszczenie wśród leukocytów oraz stabilność i emisja. W zależności od odpowiedzi autoimmunologicznej, pewne czynniki emitujące mogą być dogodniejsze od innych. W immunoterapii zalecane są ogólnie radioizotopy emitujące cząstki α i β. Zalecane są krótkozasięgowe, wysokoenergetyczne radioizotopy emitujące cząstki α, takie jak ²¹²Bi. Przykładami radioizotopów, które mogą być sprzęgane z polipeptydami według wynalazku w celach terapeutycznych są ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹²At, ²¹¹Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd i ¹⁸⁸Re.

Lektyny to białka, zwykle izolowane z materiału roślinnego, które wiążą się do specyficznych cząsteczek cukrowych. Wiele lektyn jest także zdolnych do aglutynizacji komórek i stymulowania limfocytów. Jednakże rycyna jest toksyczną lektyną, która znalazła zastosowanie immunoterapeutyczne. Osiągnięto to przez wiązanie łańcucha peptydu α rycyny, który odpowiada za toksyczność z polipeptydem zdolnym do dostarczania miejscowo ukierunkowanego efektu toksycznego.

Toksyny są substancjami trującymi produkowanymi przez rośliny, zwierzęta lub mikroorganizmy, które w odpowiedniej dawce są często letalne. Toksoid błoniczy jest substancją produkowaną przez Corynebacterium diphteria, która może być stosowana w leczeniu. Toksyna ta składa się z podjednostki α i β, które mogą być rozdzielone w odpowiednich warunkach. Toksyczny składnik A może być związany z polipeptydem według wynalazku i zastosowany do miejscowo ukierunkowanego dostarczania do oddziałujących komórek B i komórek T, które są w bliskiej odległości dzięki wiązaniu się z polipeptydem według wynalazku.

Inne czynniki terapeutyczne takie jak opisane powyżej, które mogą być sprzęgane z polipeptydem według wynalazku, oraz odpowiednie protokoły ex vivo i in vivo, są znane, lub mogą być łatwo osiągnięte przez fachowca. Każdorazowo specjalista może zastosować polinukleotyd według wynalazku opisany poniżej kodujący dowolny z opisanych powyżej polipeptydów według wynalazku lub odpowiedni wektor zamiast materiału białkowego jako takiego.

Zatem, specjalista może łatwo stwierdzić, że polipeptyd według wynalazku może być stosowany do konstruowania innych polipeptydów o pożądanej specyficzności i funkcji biologicznej. Oczekuje się, że polipeptydy według wynalazku będą odgrywały ważną terapeutyczną i badawczą rolę w szczególności w medycynie, przykładowo w rozwijaniu nowych sposobów leczenia zaburzeń związanych z komórkami B, takich jak pewne postaci raka i chorób autoimmunologicznych lub jako interesujące narzędzie służące do analizowania i regulowania odpowiednich ścieżek przekazywania sygnału komórkowego.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku, wspomniana przynajmniej jedna dodatkowa domena zawiera cząsteczkę wybraną z grupy składającej się z cząsteczek efektorowych posiadających konformację przydatną do aktywności biologicznej, sekwencje aminokwasowe zdolne do maskowania jonów, i sekwencje aminokwasowe zdolne do selektywnego wiązania się z nośnikiem stałym lub ustalonym wcześniej antygenem.

PL 199 747 B1

Dogodnie, wspomniana dodatkowa domena może zawierać enzym, toksynę, receptor, miejsce wiążące, miejsce wiążące przeciwciało biosyntetyczne, czynnik wzrostu, czynnik różnicujący komórki, limfokinę, cytokinę, hormon, cząsteczkę wykrywalną zdalnie, anty-metabolit, atom radioaktywny lub antygen. Wspomniany antygen może być np. antygenem nowotworowym, antygenem wirusowym, antygenem drobnoustrojowym, alergenem, autoalergenem, wirusem, drobnoustrojem, polipeptydem, peptydem lub zbiorowiskiem komórek nowotworowych.

Ponadto, taka sekwencja zdolna do maskowania jonu może być dogodnie wybrana spośród kalmoduliny, metalotioneiny, jej funkcjonalnego fragmentu, lub sekwencji aminokwasowej bogatej w przynajmniej jeden spoś ród kwasu glutaminowego, kwasu asparaginowego, lizyny i argininy.

Ponadto, sekwencja polipeptydowa zdolna do selektywnego wiązania się ze stałym nośnikiem może być naładowaną dodatnio lub ujemnie sekwencją aminokwasową, sekwencją aminokwasową zawierającą cysteinę, awidyną, streptawidyną, funkcjonalnym fragmentem białka A ze Staphylococcus, GST, znacznikiem His, znacznikiem FLAG lub Lex A. Jak to opisano w przykładach, polipeptyd według wynalazku zobrazowany przykładowo przez jednołańcuchowe przeciwciało może być także ekspresjonowany z N-końcowym znacznikiem FLAG lub C-końcowym znacznikiem His, które umożliwiają łatwe oczyszczanie i detekcję. Znacznik FLAG stosowany w przykładzie zawiera 8 aminokwasów (patrz figura 8) i może być dogodnie stosowany zgodnie z wynalazkiem. Jednakże znacznik FLAG złożony z krótszych wersji znacznika FLAG zastosowanego w przykładach, takie jak sekwencja aminokwasowa Asp-Tyr-Lys-Asp, są także odpowiednie.

Cząsteczka efektorowa i sekwencje aminokwasowe opisane powyżej mogą być obecne w postaci wstępnej, która jest albo aktywna albo nieaktywna, i która może być usunięta, gdy np.: wejdzie w odpowiednie ś rodowisko komórkowe.

W najbardziej zalecanej realizacji, wspomniany receptor jest jednocześ nie powierzchniową czą steczką kostymulującą istotną do aktywacji komórek T, lub zawiera miejsce wiążące epitop lub miejsce wiążące hormon.

W najbardziej zalecanej realizacji taką powierzchniową czą steczką kostymulują c ą moż e być CD80 (B7-1) lub CD86 (B7-2).

W jeszcze innej realizacji zastosować można polinukleotydy, które po ekspresji kodują powyżej opisane polipeptydy. Takie polinukleotydy mogą być połączone z odpowiednimi sekwencjami kontrolującymi ekspresję znanymi ze stanu techniki w celu zapewnienia właściwej transkrypcji i translacji polipeptydu.

Wspomniany polinukleotyd może być np.: DNA, cDNA, RNA lub syntetycznie otrzymanym DNA, lub RNA lub rekombinacyjnie otrzymaną chimeryczną cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą dowolny z tych polinukleotydów, albo pojedynczo albo w ich kombinacji. Dogodnie wspomniany polinukleotyd stanowi część wektora. Takie wektory mogą zawierać dodatkowe geny, takie jak geny markerowe umożliwiające selekcję wspomnianego wektora w odpowiednich komórkach żywiciela i w odpowiednich warunkach. Dogodnie, polinukleotyd według wynalazku jest operacyjnie połączony z sekwencjami kontrolującymi ekspresję umoż liwiającymi ekspresję w komórkach eukariotycznych lub prokariotycznych. Ekspresja wspomnianego polinukleotydu obejmuje transkrypcję polinukleotydu do ulegającego translacji mRNA. Elementy regulatorowe zapewniające ekspresję w komórkach eukariotycznych, dogodnie komórkach ssaczych, są dobrze znane fachowcom. Obejmują one zwykle sekwencje regulatorowe zapewniające inicjację transkrypcji i ewentualnie zapewniające sygnały poli-A, zapewniające zakończenie transkrypcji i stabilizację transkryptu. Dodatkowe elementy regulatorowe mogą obejmować transkrypcyjne oraz translacyjne enhancery, i/lub naturalne lub heterologiczne regiony promotorowe. Możliwe elementy regulatorowe pozwalające na ekspresję w prokariotycznych komórkach żywiciela to np.: promotor PL, lac, trp lub lac Z E. coli, a przykładami elementów regulatorowych pozwalających na ekspresję w eukariotycznych komórkach gospodarza są promotor AOX1 lub GAL1 z drożdży lub promotor CMV, SV40, RSV (wirus mięsaka Rousa), enhancer CMV, enhancer SV40 lub intron globinowy komórek ssaków i innych komórek zwierzęcych. Poza elementami odpowiedzialnymi za inicjację transkrypcji, elementami regulatorowymi, mogą wystąpić także elementy terminacji transkrypcji, takie jak miejsce SV40-poli-A lub miejsce tk-poli-A, umieszczone za polinukleotydem. Ponadto, w zależności od układu ekspresyjnego stosuje się sekwencje liderowe zdolne do ukierunkowywania polipeptydu do przedziału komórkowego lub jego sekrecji do środowiska, które mogą być dodane do sekwencji kodującej polinukleotyd według wynalazku i są dobrze znane ze stanu techniki, patrz także poniższe przykłady. Sekwencja(e) liderowa jest (są) montowana w odpowiedniej fazie wraz z sekwencjami inicjacyjnymi, translacyjnymi, i terminacyjnymi, a dogodnie sekwencja liderowa zdolna do ukierunkowywania sekrecji ulegającego translacji białka, lub jego fragmentu, do prze10

PL 199 747 B1 strzeni peryplazmatycznej lub medium pozakomórkowego. Ewentualnie, heterologiczna sekwencja może kodować białko fuzyjne, obejmujące N-końcowy peptyd identyfikacyjny decydujący o pożądanej charakterystyce, np. stabilizacji lub uproszczonym oczyszczaniu ekspresjonowanego produktu rekombinacyjnego, patrz wyżej. W tym kontekście, odpowiednie wektory ekspresyjne, które są znane ze stanu techniki to np.: Okayama-Berg wektor ekspresyjny cDNA pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), lub pSPORT1 (GIBCO BRL).

Dogodnie sekwencjami kontrolującymi ekspresję będą układy promotorów eukariotycznych w wektorach zdolnych do transformowania transfekowanych komórek gospodarza eukariotycznego, lecz mogą być także stosowane sekwencje kontrolujące dla gospodarzy prokariotycznych. Przede wszystkim wektor powinien być wprowadzony do odpowiedniego gospodarza, gospodarz powinien być utrzymywany w odpowiednich warunkach pozwalających na wysoki poziom ekspresji sekwencji nukleotydowych, i jeśli to pożądane, prowadzi się następnie zbieranie i oczyszczanie polipeptydu według wynalazku, patrz np. przykłady.

Jak opisano powyżej, polinukleotyd według wynalazku może być stosowany osobno lub jako część wektora w celu ekspresji polipeptydu według wynalazku w komórkach, w celu np.: terapii genowej lub diagnozowania chorób kojarzonych z komórkami B.

Polinukleotydy lub wektory zawierające sekwencje DNA kodujące dowolny z opisanych powyżej polipeptydów można wprowadzać do komórek, które następnie produkują pożądany polipeptyd. Terapia genowa oparta na wprowadzaniu genów leczniczych do komórek technikami ex-vivo lub in-vivo jest jedną z najważniejszych możliwości stosowania przenoszenia genów. Odpowiednie wektory, metody lub systemy dostarczania genów dla terapii genowej ex-vivo lub in-vivo zostały opisane w znanym fachowcom stanie techniki np.: Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Andersen, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; lub Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 i cytowanych tu odsyłaczach. Polinukleotydy i wektory według wynalazku mogą być przeznaczone do bezpośredniego wprowadzania poprzez liposomy, lub wektory wirusowe (np. adenowirusy, retrowirusy) do komórek. Dogodnie, wspomniana komórka może być komórką zarodkową, embrionalną, komórką jajową lub pochodzącą z niej, lub najdogodniej komórką macierzystą. Przykładem embrionalnej komórki macierzystej może być między innymi komórka macierzysta opisana w Nagy, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90(1993), 8424-8428.

W związku z powyższym, polinukleotyd kodujący polipeptyd według wynalazku może być zawarty w wektorach, dogodnie plazmidowych, kosmidowych, wirusowych i bakteriofagach stosowanych tradycyjnie do inżynierii genetycznej. Dogodnie, wspomniany wektor jest wektorem ekspresyjnym i/lub wektorem do transferu genów lub ukierunkowywania. Wektory ekspresyjne pochodzące z wirusów, takich jak retrowirusy, wirus krowianki, wirusy związane z adenowirusami, wirusy opryszczki, lub wirusa brodawczaka bydlęcego, mogą być zastosowane do konstruowania wektorów rekombinacyjnych; patrz przykładowo, techniki opisane w Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. i Ausubel, Current Protocols in Molecular biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternatywnie wektory według wynalazku mogą być umieszczane w liposomach w celu dostarczania do komórki docelowej. Wektory zawierające polinukleotydy według wynalazku mogą być przenoszone do komórki gospodarza znanymi metodami, zależącymi często od typu gospodarza komórkowego. Przykładowo, transfekcja z chlorkiem wapnia jest często stosowana dla komórek prokariotycznych, natomiast traktowanie fosforanem wapnia lub elektroporacja mogą być stosowane do innych gospodarzy komórkowych; patrz Sambrook powyżej. Poddany ekspresji polipeptyd według wynalazku może być oczyszczany zgodnie ze standardowymi procedurami ze stanu techniki, obejmującymi wytrącanie siarczanem amonu, kolumny powinowactwa, kolumny chromatograficzne, elektroforezę żelową, i tym podobne; patrz Scopes, „Protein Purification, Springer Verlag, N.Y. (1982). Do zastosowań farmaceutycznych zalecane są zasadniczo czyste polipeptydy o homogenności około 90 do 95%, bardziej dogodnie o homogenności 98 do 99%. Po oczyszczeniu, częściowym lub do homogenności, jak jest to pożądane, polipeptydy według wynalazku mogą być stosowane terapeutycznie (obejmując stosowanie pozaustrojowe) lub wykorzystane do rozwijania i opracowywania procedur testowych.

Gdy przewiduje się zastosowania terapeutyczne polinukleotyd lub wektor opisany powyżej jest korzystnie zawarty w komórce. Korzystnie, wspomniana komórka jest eukariotyczna, dogodniej jest

PL 199 747 B1 komórką ssaczą. Oczywiście, drożdże i mniej zalecane prokariota, np. komórki bakteryjne, mogą być także wykorzystane, w szczególności do produkowania polipeptydu stosowanego jako środek diagnostyczny.

Polinukleotyd lub wektor według wynalazku, który jest obecny w komórce gospodarza może być albo wbudowany do genomu komórki gospodarza lub może być utrzymywany pozachromosomalnie.

Określenie „prokariotyczne obejmuje wszystkie bakterie, które mogą być transfekowane cząsteczkami DNA lub RNA w celu ekspresjonowania polipeptydu według wynalazku. Gospodarzami prokariotycznymi mogą być bakterie gram ujemne oraz gram dodatnie, takie jak przykładowo: E.coli, S.typhimurium, Serratia mercescens i Bacillus subtilis. Określenie „eukariotyczne obejmuje drożdże, rośliny wyższe, owady i dogodnie komórki ssacze. W zależności od gospodarza wykorzystanego w produkcji rekombinacyjnej, polipeptydy według wynalazku mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane. Polipeptydy według wynalazku mogą także obejmować inicjującą resztę aminokwasową metioniny. Polinukleotydy kodujące polipeptyd według wynalazku mogą być stosowane do transformowania lub transfekowania komórki gospodarza za pomocą technik powszechnie znanych fachowcom. Szczególnie zalecane jest stosowanie plazmidu lub wirusa zawierającego sekwencję kodującą polipeptyd według wynalazku i połączony z nim fuzyjnie do N-końca znacznik FLAG i/lub do C-końca znacznik His. Dogodnie, długość wspomnianego znacznika FLAG wynosi około 4 do 8 aminokwasów, dogodniej 8 aminokwasów. Sposoby przygotowywania fuzyjnych, operacyjnie połączonych genów i ich ekspresji w np. komórkach ssaczych i bakteriach są dobrze znane w stanie techniki (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.). Konstrukty genetyczne i sposoby tam opisane mogą być stosowane do ekspresji polipeptydu według wynalazku w gospodarzach eukariotycznych i prokariotycznych. Ogólnie, wektory ekspresyjne zawierające sekwencje promotorowe, które zwiększają efektywność transkrypcji wbudowanego polinukleotydu są stosowane w połączeniu z gospodarzem. Wektor ekspresyjny zwykle zawiera miejsce inicjacji replikacji, promotor, terminator oraz specyficzne geny zdolne do zapewnienia selekcji genotypowej transformowanych komórek. Ponadto, zwierzęta transgeniczne, dogodnie ssaki, zawierające komórki według wynalazku mogą być stosowane do produkcji na dużą skalę polipeptydu według wynalazku.

Sposób otrzymywania polipeptydu opisanego powyżej obejmuje hodowanie komórki według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji polipeptydu i izolowanie polipeptydu z komórki lub pożywki hodowlanej.

Transformowani gospodarze mogą być namnażani i hodowani w fermentorach zgodnie z technikami znanymi ze stanu techniki zapewniającymi optymalny wzrost. Polipeptyd według wynalazku może być następnie izolowany z pożywki (medium) hodowlanej, lizatów komórkowych, lub frakcji błon komórkowych. Izolowanie i oczyszczanie np. mikrobiologicznie ekspresjonowanych polipeptydów według wynalazku może być prowadzone technikami tradycyjnymi, takimi jak przykładowo preparatywna chromatografia rozdzielcza i immunologiczne rozdzielanie, takie jak przykładowo z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych specyficznych wobec np. znaczników polipeptydu według wynalazku lub jak to opisano w przykładach.

Zgodnie z wynalazkiem możliwa jest produkcja rekombinacyjna polipeptydów zawierających miejsca wiążące wykazujące powinowactwo i specyficzność wobec epitopów antygenów CD19 i CD3, odpowiednio, i ewentualnie dodatkowe domeny funkcjonalne. Zgodnie z wynalazkiem dostarczono dużą rodzinę polipeptydów zawierających takie miejsca wiążące do stosowania w terapii i diagnostyce. Fachowiec stwierdzi, że polipeptydy według wynalazku mogą być dodatkowo sprzęgnięte z innymi cząsteczkami opisanymi powyżej, dla np. ukierunkowywania leku lub zastosowań wizualizacyjnych. Takie sprzęganie może być prowadzone chemicznie po ekspresji polipeptydów albo miejsca przyłączania lub sprzęgania produktu mogą być otrzymywane poprzez odpowiednie zaprojektowanie polipeptydu na poziomie DNA. Następnie DNA są ekspresjonowane w odpowiednim układzie gospodarza, a ulegające ekspresji białka są odzyskiwane i denaturowane, gdy to potrzebne. Jak to opisano powyżej, miejsca wiązania pochodzą dogodnie ze zmiennych regionów przeciwciał. W związku z tym, technika hybryd-hybrydom umożliwia produkcję linii komórkowych dających sekrecję przeciwciał specyficznych zasadniczo wobec dowolnej pożądanej substancji wyzwalającej odpowiedź immunologiczną. RNA kodujący lekkie i ciężkie łańcuchy immunoglobuliny może być następnie otrzymywany z cytoplazmy hybrydomy. Część 5' mRNA może być wykorzystana do przygotowywania cDNA do stosowania w metodzie tu opisanej. DNA kodujący polipeptydy według wynalazku mogą być następnie ekspresjonowany w komórkach, dogodnie komórkach ssaczych.

W zależności od komórki gospodarza, techniki renaturacyjne mogą być wymagane do odzyskania właściwej konformacji. Jeśli to konieczne, substytucje punktowe dobrane w celu optymalizowania

PL 199 747 B1 wiązania mogą być przeprowadzane na poziomie DNA za pomocą tradycyjnej mutagenezy kasetowej lub innych metod inżynierii genetycznej. Przygotowywanie polipeptydów według wynalazku może także zależeć od znajomości sekwencji aminokwasowej (lub odpowiedniej sekwencji DNA lub RNA) aktywnych biologicznie białek, takich jak enzymy, toksyny, czynniki wzrostu, czynniki różnicowania komórek, receptory, antymetabolity, hormony lub różne cytokiny lub limfokiny. Takie sekwencje są znane w literaturze i udostępnione w bazach komputerowych. Przykładowo, polipeptyd według wynalazku może być konstruowany tak, aby np. zawierać fragment jednołańcuchowego Fv i pozakomórkową część ludzkiego białka stymulującego CD80 (B7-1) połączone przez łącznik (Gly4Ser1)1. Białko kostymulujące CD80 należy do superrodziny Ig. Jest silnie glikozylowanym białkiem o 262 aminokwasach. Bardziej szczegółowy opis został opublikowany przez Freeman, J.Immunol. 143 (1989), 2714-2722. Stabilna ekspresja może być prowadzona w np. komórkach CHO z niedoborem DHFR, opisanych przez Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566. Białko może być oczyszczane dzięki dołączonemu na C-końcu znacznikowi His za pomocą kolumny Ni-NTA (Mack, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92(1995), 7021-7025).

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera wspomniany polipeptyd, polinukleotyd albo wektor według wynalazku.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Przykłady odpowiednich nośników farmaceutycznych są znane fachowcom i obejmują buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej, wodę, emulsje, takie jak emulsje olej/woda, różne typy czynników zwilżających, roztwory sterylne itp. Kompozycje zawierające takie nośniki mogą być otrzymane dobrze znanymi technikami tradycyjnymi. Takie kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane pacjentowi w odpowiedniej dawce. Podawanie odpowiedniej kompozycji może przebiegać różnymi drogami, np. dożylnie, pozajelitowo, podskórnie, domięśniowo, poprzez podawane powierzchniowe i przezskórne. Dawkowanie określa się poprzez uwzględnienie czynników fizycznych i klinicznych. Wiedza medyczna pozwala stwierdzić, że dawkowanie dla danego pacjenta zależy od wielu czynników, obejmujących rozmiar pacjenta, powierzchnię ciała, wiek, rodzaj podawanych związków, płeć, czas i drogę podawania, ogólny stan zdrowia pacjenta, i inne leki podawane jednocześnie. Ogólnie dawkowanie i częstotliwość podawania kompozycji farmaceutycznej powinny leżeć w zakresie 1 μg do 10 mg jednostek na dzień. Jeśli podawanie jest podawaniem w postaci ciągłej infuzji, może ono wynosić od 1 μg do 10 mg jednostek na kilogram masy ciała na godzinę. Jednakże bardziej zalecane dawkowanie dla ciągłej infuzji powinno mieścić się w zakresie od 0,01 do 10 μg jednostek na kilogram masy ciała na godzinę. Szczególnie zalecane dawkowanie opisano poniżej. Postęp może być monitorowany okresowymi pomiarami. Dawkowanie może być różne, ale zalecane dawki do podawania dożylnego DNA wynoszą około od 10⁸ do 10¹² kopii cząsteczek DNA. Kompozycje według wynalazku mogą być podawane miejscowo lub układowo. Podawanie jest zazwyczaj pozajelitowe, np. dożylne. DNA może być także podawane bezpośrednio domiejscowo do określonego miejsca, np. metodą biolistyczną do wewnętrznego lub zewnętrznego miejsca docelowego lub poprzez cewnik do miejsca w żyle. Preparaty do podawania pozajelitowego obejmują sterylne wodne lub bezwodne roztwory, zawiesiny i emulsje. Przykłady bezwodnych rozpuszczalników to glikol polietylenowy, glikol propylenowy, oleje roślinne takie jak oliwa z oliwek, i estry organiczne do wstrzykiwań, takie jak oleinian etylu. Wodne nośniki obejmują wodę, roztwory wodno-alkoholowe, emulsje lub zawiesiny, obejmujące roztwór soli fizjologicznej i roztwory buforowane. Pozajelitowe nośniki obejmują roztwór chlorku sodu, dekstrozę Ringera, dekstrozę i chlorek sodu, roztwór Ringera z mleczanem, lub oleje stałe. Dożylne nośniki obejmują płyny zastępcze i zastępcze substancje odżywcze, zastępcze elektrolity (takie jak oparte na dekstrozie Ringera) i tym podobne. Środki konserwujące i inne dodatki mogą być także obecne, jak przykładowo, antybiotyki, przeciwutleniacze, czynniki chelatujące i gazy obojętne i tym podobne. Ponadto kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać nośniki białkowe, jak albumina surowicza lub immunoglobuliny, dogodnie pochodzenia ludzkiego. Ponadto kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać dodatkowe biologicznie czynne czynniki, w zależności od przewidywanego zastosowania kompozycji farmaceutycznej. Takimi czynnikami mogą być leki działające na układ żołądkowo-jelitowy, leki działające jako cytostatyki, leki chroniące przed hiperurykemią i/lub czynniki takie jak cząsteczki kostymulujące komórki T lub cytokiny znane ze stanu techniki.

Zgodnie z wynalazkiem uważa się, że różne polinukleotydy i wektory według wynalazku mogą być podawane zarówno osobno jak i w połączeniu, z wykorzystaniem standardowych wektorów i/lub systemów dostarczających geny, i ewentualnie wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką. Po podawaniu, wspomniane polinukleotydy lub wektory mogą ulec stabilnemu wbudowaniu do genomu pacjenta.

PL 199 747 B1

Z drugiej strony, mogą być zastosowane wektory wirusowe, które są specyficzne wobec pewnych komórek i tkanek i utrzymują się w tych komórkach. Odpowiednie kompozycje farmaceutyczne przygotowane zgodnie z wynalazkiem mogą być zastosowane do leczenia lub zapobiegania, lub opóźniania różnych rodzajów chorób, które wiążą się z zaburzeniami immunologicznymi i nowotworami.

Ponadto, możliwe jest zastosowanie w terapii genowej kompozycji farmaceutycznej według wynalazku zawierającej polinukleotyd lub wektor według wynalazku. Odpowiednie, systemy dostarczania genu mogą obejmować liposomy, systemy dostarczania wykorzystujące receptory, nagi DNA, i wektory wirusowe takie jak wirusy opryszczki, retrowirusy, adenowirusy, i wirusy związane z adenowirusami, i inne. Dostarczanie kwasów nukleinowych do specyficznego miejsca w ciele dla terapii genowej moż e być także prowadzone za pomocą systemu dostarczania biolistycznego, takiego jak opisany przez Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729). Dodatkowe metody dostarczania kwasów nukleinowych obejmują transfer genów przenoszonych przez cząsteczki, np. opisany przez Verma, Gene Ther. 15 (1998), 692-699. Należy rozumieć, że wprowadzane polinukleotydy i wektory ekspresjonują produkt genowy po wprowadzeniu do wspomnianej komórki i dogodnie pozostają w tym stanie podczas czasu życia tej komórki. Przykładowo, linie komórkowe stabilnie ekspresjonujące polinukleotyd pod kontrolą odpowiednich sekwencji nukleotydowych mogą być otrzymywane metodami znanymi fachowcom. Raczej zamiast stosowania wektorów ekspresyjnych zawierających wirusowe miejsce inicjacji replikacji, komórki gospodarza mogą być transformowane polinukleotydami według wynalazku i markerem selekcyjnym, albo na tym samym lub innym plazmidzie. Po wprowadzeniu obcego DNA, uzyskane komórki mogą być hodowane przez 1-2 dni na pożywce wzbogaconej, a następnie przenoszone do pożywki selekcyjnej. Marker selekcyjny zawarty w rekombinowanym plazmidzie nadaje oporność na selekcję i umożliwia selekcję komórek posiadających plazmid stabilnie wbudowany do ich chromosomu i dalszą hodowlę, klonowanie i otrzymywanie linii komórkowych. Takie modyfikowane linie komórkowe są także wyjątkowo przydatne w technikach skriningowych służących do wykrywania związków zaangażowanych w np. oddziaływania komórka B/komórka T.

Liczne systemy selekcyjne mogą być stosowane, obejmując, lecz nie ograniczając się do kinazy tymidynowej z wirusa HSV (Wigler, Cell 11 (1977), 223), fosforybozylotransferazy hipoksantynowoguaninowej (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026), i fosforybozylotransferazy adeninowej (Lowy, Cell 22 (1980), 817) w komórkach tk^-, hgprt^-, lub aprt^-, odpowiednio. Także oporność na antymetabolity może być wykorzystana jako baza selekcji dla dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), gpt, który nadaje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 (Colberre-Grapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1); hygro który nadaje oporność na higromycynę (Santerre, Gene 30 (1984), 147); lub puromycyna (pat, N-acetylo transferaza puromycynowa). Kolejne geny selekcyjne mogą być opisane, przykładowo, dla trpB, który umożliwia komórkom utylizować indol w miejsce tryptofanu, hisD, umożliwiający komórkom utylizować histinol w miejsce histydyny (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); i ODC (dekarboksylaza ornitynowa) zapewniająca oporność na inhibitor dekarboksylazy ornitynowej, 2-(difluorometylo)-DL-ornitynę, DFMO (McCologue, 1987, W: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory).

W innej realizacji kompozycja diagnostyczna może zawierać jeden z opisanych powyżej polipeptydów, polinukleotydów lub wektorów według wynalazku i ewentualnie odpowiedni środek do detekcji.

Polipeptydy według wynalazku nadają się także do stosowania w testach immunologicznych, w których mogą być one wykorzystane w fazie ciekłej lub zwią zane do no ś nika stał ego. Przykł adem testów immunologicznych, w których mogą być wykorzystane polipeptydy według wynalazku są kompetycyjne lub niekompetycyjne testy immunologiczne zarówno w postaci bezpośredniej jak i pośredniej. Przykładami takich testów immunologicznych są testy radioimmunologiczne (RIA), testy „kanapkowe (testy immunometryczne) i testy techniką Western blot.

Polipeptydy według wynalazku mogą być związane z różnymi nośnikami i stosowane do izolowania komórek specyficznie związanych z takimi polipeptydami. Przykłady takich dobrze znanych nośników obejmują szkło, polistyren, chlorek poliwinylu, polipropylen, polietylen, poliwęglan, dekstran, nylon, amylozy, naturalne i modyfikowane celulozy, metale koloidalne, poliakrylamidy, agarozy i magnetyt. Nośnik dla celów wynalazku może być zarówno rozpuszczalny jak i nierozpuszczalny.

Istnieje wiele znaczników i sposobów znakowania znanych fachowcom. Przykłady typów znaczników, które mogą być zastosowane w wynalazku obejmują enzymy, radioizotopy, metale kolo14

PL 199 747 B1 idalne, związki fluorescencyjne, związki chemiluminescencyjne, i związki bioluminescencyjne; patrz także realizacje omówione powyżej.

Polipeptydy, polinukleotydy i wektory według wynalazku opisane powyżej mogą być zastosowane do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia złośliwych zmian nowotworowych komórek B, związanych z komórkami B chorób autoimmunologicznych lub utraty komórek B.

Ostatnie badania kliniczne dotyczące przekierowywania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek T przez bispecyficzne przeciwciała wykazały zachęcające wyniki w leczeniu chłoniaka nieziarniczego (33), raka piersi i jajnika (34-37) i złośliwego glejaka (38). Biorąc pod uwagę fakty, że:

- przeciwciała bsc ze względu na ich niską masę cząsteczkową pozwalają na ich przenikanie do nowotworu (co pokazano dla fragmentów Fab i Fv) (39); oraz

- przeciwciała bsc są podejrzewane o obniżanie w sposób zależny od dawki i z ograniczaną dawką toksycznością wywoływaną przez układowe uwalnianie cytokin zależne od części Fc tradycyjnych przeciwciał bispecyficznych (40); i

- nawet niezmienione przeciwciało monoklonalne (skierowane przeciwko CD20) prowadzi do regresji nowotworu w zaawansowanych stadiach NHL (41, 42), oczekuje się, i zostało to faktycznie wykazane, że polipeptydy według wynalazku są pożądanymi cząsteczkami nadającymi się do dalszych ulepszeń terapeutycznych.

Zatem, w korzystnej realizacji kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest stosowana do leczenia chłoniaka nieziarniczego.

Zakresy dawkowania podawanych polipeptydów, polinukleotydów i wektorów według wynalazku są tej wielkości, jaka wystarcza do uzyskania pożądanego efektu, w którym objawy chorób związanych z komórkami B są złagodzone. Dawkowanie nie powinno być tak duże, aby powodowało skutki uboczne, takie jak niepożądane reakcje krzyżowe, reakcje anafilaktyczne, i tym podobne. Ogólnie rzecz biorąc dawka będzie zależeć od wieku, kondycji, płci i rozmiaru choroby pacjenta i może zostać określona przez osoby biegłe w dziedzinie. Dawka może być dopasowana przez lekarzy dla każdego przypadku. Uwidacznia się to w zakresie wspomnianych dawek np. od 0,01 μg do 10 mg polipeptydów opisanych w wynalazku. Szczególnie zalecana dawka waha się od 0,1 μg do 1 mg, a jeszcze bardziej zalecana od 1 μg do 100 mg, a najbardziej zalecana to dawka od 3 do 10 μg, np. jak to pokazano w przykładzie 7.

Sposób identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów aktywacji lub stymulacji komórek T według wynalazku obejmuje (a) hodowanie komórek CD19 pozytywnych (korzystnie komórek B) i komórek T w obecności polipeptydu według wynalazku i, ewentualnie w obecności składnika zdolnego do wytworzenia wykrywalnego sygnału w odpowiedzi na aktywację komórek T składnikiem poddawanym skriningowi w warunkach pozwalających na wzajemne oddziaływanie składnika z komórkami; i (b) wykrycie obecności lub nieobecności sygnału generowanego przez wzajemne oddziaływanie składników z komórkami.

Wykonanie to jest szczególnie przydatne do testowania zdolności składników jako cząsteczek kostymulujących. W metodzie tej, CD19 pozytywna komórka/ komórka- B powoduje początkowy sygnał aktywacji dla komórek T, z pominięciem klonowo-typowego receptora komórki T. Następnie może być określone zgodnie z wynalazkiem, który składnik mający być testowany jest wciąż potrzebny do właściwej aktywacji komórek T. W opisywanym sposobie CD19-pozytywna komórka/ komórka-B funkcjonuje jako komórka stymulująca łącząca cząsteczki bispecyficzne, które związane są z kompleksami CD3 na powierzchni tych samych komórek T. Biologiczne metody przeprowadzania hodowli, wykrywania i ewentualnie testowania są dobrze znane specjalistom z tej dziedziny.

Termin „składnik' opisywany w sposobie według wynalazku odnosi się do pojedynczej substancji lub wielu substancji, które mogą ale nie muszą być identyczne.

Wspomniane składnik(i) mogą być zawarte np. w ekstraktach komórkowych z roślin, zwierząt lub mikroorganizmów. Co więcej wspomniane składniki mogą być znane ze stanu techniki, ale dotychczas nie były znane jako posiadające zdolność do hamowania aktywacji komórek T lub przydatne jako kostymulujący czynnik komórek T. Wiele składników może być dodanych do pożywki hodowlanej lub wstrzykniętych do komórki.

Jeśli próbka zawierająca składnik(i) jest zidentyfikowana sposobem według wynalazku, to możliwe jest wyizolowanie składnika z pierwotnej próbki, zidentyfikowanej jako próbki zawierającej składnik będący przedmiotem zainteresowania, lub można podzielić pierwotną próbkę np. jeśli zawiera wiele różnych składników, tak aby zredukować liczbę różnych substancji na próbkę i powtórzyć sposób z podziałami pierwotnej próbki. Można określić czy wspomniana próbka lub składnik posiada poPL 199 747 B1 szukiwane właściwości sposobami znanymi dobrze w stanie techniki, takimi jak opisano tutaj w przykładach. W zależności od złożoności próbek kroki opisane powyżej mogą być powtarzane kilka razy, dogodnie aż próbka identyfikowana sposobem według wynalazku będzie zawierać ograniczoną ilość lub tylko jedną substancję. Dogodnie próbka obejmuje substancje o podobnych właściwościach chemicznych i/lub fizycznych, a najdogodniej substancje te są identyczne. Sposób według prezentowanego wynalazku może być łatwo przeprowadzony przez osoby biegłe w dziedzinie, np. zgodnie z innymi wcześniej opisanymi w stanie techniki testami komórkowymi oraz przy użyciu modyfikacji metod opisanych w przykładach. Co więcej specjaliści z danej dziedziny z łatwością rozpoznają jakie składniki i/lub komórki mogą być użyte w sposobie według wynalazku, np. interleukiny, lub enzymy, które mogą przekształcić pewien składnik do prekursora, który z kolei będzie stymulować lub tłumić aktywację komórki T. Takie przystosowywanie sposobu według wynalazku jest dobrze znane specjalistom z danej dziedziny i może być przeprowadzone bez dodatkowych eksperymentów.

Składniki, które mogą być wykorzystane w sposobie według wynalazku obejmują peptydy, białka, kwasy nukleinowe, przeciwciała, małe związki organiczne, ligandy, peptydomimetyki, PNA i tym podobne. Wspomnianymi składnikami mogą być także funkcjonalne pochodne lub analogii znanych aktywatorów komórek T lub inhibitorów. Sposoby przygotowania chemicznych pochodnych i analogów są dobrze znane specjalistom danej dziedziny i zostały opisane np. w Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. i Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Co więcej wspomniane pochodne i analogii mogą być testowane pod względem ich działania metodami dobrze znanymi w dziedzinie lub tak jak opisano, np. w przykładach. Co więcej peptydomimetyki i/ lub komputerowe projektowanie odpowiednich aktywatorów lub inhibitorów aktywacji komórek T mogą zostać użyte, np. zgodnie z metodami opisanymi poniżej. Odpowiednie programy komputerowe mogą zostać użyte do identyfikacji oddziałujących miejsc domniemanego inhibitora i przeciwciała opisanego w wynalazku przez komputerowe poszukiwanie komplementarnych motywów strukturalnych cząsteczek (Fassina, Immunometody 5(1994), 114-120). Także inne odpowiednie systemy komputerowe pomocne w projektowaniu białek i peptydów zostały opisane w stanie techniki, np. Berry, Biochem. Soc. Trans. 22(1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N.Y. Acad. Sci. 501(1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Rezultaty otrzymane z powyżej opisanych analiz komputerowych mogą być użyte w połączeniu ze sposobami opisanymi w wynalazku do, np. optymalizowania znanych aktywatorów komórek T lub inhibitorów. Odpowiednie peptydomimetyki mogą być także identyfikowane przez syntezę bibliotek kombinacyjnych peptydomimetyków przez kolejne modyfikacje chemiczne i testowanie uzyskanych składników, np. zgodnie ze sposobem opisanym tutaj i w przykładach. Sposób tworzenia bibliotek kombinacyjnych peptydomimetyków jest dobrze znany w danej dziedzinie, np. Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996) , 220-234 i Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Co więcej trójwymiarowe i/lub krystalograficzne struktury inhibitorów lub aktywatorów komórek B/ komórek T mogą zostać użyte do projektowania inhibitorów będących peptydomimetykami lub aktywatorów aktywacji komórek T, które mają być testowane sposobami opisanymi w wynalazku (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenberg, Bioorg. Med. Chem. 4(1996), 1545-1558).

Podsumowując, zgodnie z wynalazkiem dostarcza się sposób identyfikacji składników, które są zdolne do modulowania komórek B/ komórek T pośredniczących w odpowiedzi immunologicznej.

Składniki, które jak stwierdzono aktywują odpowiedzi pośredniczone przez komórkę B/ komórkę T mogą być użyte do leczenia raka i pochodnych chorób. Dodatkowo możliwe jest także specyficzne hamowanie chorób wirusowych, a także zapobieganie infekcjom wirusowym lub rozprzestrzenianiu się wirusa. Składniki zidentyfikowane jako supresory aktywacji lub stymulacji komórek T mogą być użyte przy transplantacji narządów w celu uniknięcia odrzucenia przeszczepu; zobacz także powyżej.

Składniki zidentyfikowane lub uzyskane zgodnie ze sposobem według wynalazku są zatem bardzo użyteczne w zastosowaniu diagnostycznym a szczególnie terapeutycznym. W związku z tym zgodnie z wynalazkiem można wytwarzać kompozycje farmaceutyczne zawierające składniki zidentyfikowane na etapie (b) powyżej opisanego sposobu według wynalazku w farmaceutycznie dopuszczalnej postaci. Co więcej przewiduje się, że wspomniany składnik może być zmodyfikowanym peptydomimetykiem. Metody tworzenia i użycia kombinacyjnych bibliotek peptydomimetyków są opisane w danej dziedzinie, np. Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 210-234, Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4(1996), 709-715, Beeley, Trends Biotechnol. 12(1994), 213-216, lub al-Obeidi, Mol. Biotech. 9(1998), 205-223.

Terapeutycznie użyteczne składniki zidentyfikowane sposobem według wynalazku mogą być podawane pacjentom metodą odpowiednią dla danego składnika, np. doustnie, dożylnie, pozajelitowo, przez skórnie, domięśniowo, przez zabiegi chirurgiczne lub przeszczepy (np. wraz ze składnikiem

PL 199 747 B1 będącym w formie macierzy stałej lub półstałej, biologicznie zgodnej i wchłanianej) w miejscu lub okolicach, w których pożądane jest działanie składnika. Dawki terapeutyczne są określone przez specjalistów danej dziedziny tak, aby były odpowiednie, zobacz powyżej.

Te i inne wykonania wynalazku są zawarte i objęte przez opis przykładów realizacji prezentowanego wynalazku.

Inna literatura dotycząca przeciwciał, metod, zastosowań i składników może być użyta zgodnie z prezentowanym wynalazkiem dzięki odnalezieniu jej w bibliotekach publicznych i bazach danych, używając do tego celu urządzeń elektronicznych. Na przykład publiczna baza danych „Medline może zostać użyta za pomocą Internetu, na przykład na stronie http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Inne adresy takie jak http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, są dobrze znane specjalistom danej dziedziny i mogą być także uzyskane przy użyciu, np. http://www.lycos.com. Przegląd informacji patentowych z dziedziny biotechnologii oraz innych istotnych źródeł informacji patentowych użytecznych do retrospektywnych badań a także dla obecnego stanu techniki został przedstawiony w Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Figury przedstawiają:

F i g u r a 1:

PAGE-SDS: Barwienie Coomassie blue fragmentu oczyszczonego bscCD19 x CD3 z różną zawartością białka. Masa cząsteczkowa (kDa) markerów jest pokazana po lewej stronie figury.

F i g u r a 2:

Analiza FACS z bscCD19xCD3 (200 μg/ml) rożnych linii komórek B CD19-pozytywnych (BJAB, SKW6.4, Blin-1, Daudi, Raji), linii komórek B, BL60, CD19-negatywnych i CD3-pozytywnych komórek Jurkat i pierwotnych ludzkich PBMC. Linie przerywane przedstawiają kontrole negatywne.

F i g u r a 3:

Cytotoksyczność bscCD19xCD3 w teście uwalniania ⁵¹Cr z niestymulowanymi ludzkimi PBMC i różnymi liniami komórek B. Efektor: stosunek komórek celowych 10:1, czas inkubacji 4h. Standardowe odchylenie dla wszystkich trzech powtórzeń wynosiło poniżej 7%.

F i g u r a 4:

Test na cytotoksyczność z uwalnianiem chromu z niestymulowanymi ludzkimi pierwotnymi komórkami PBL względem linii komórek plazmocytomy L363 i NCI i linii komórek chłoniaka Daudi E:T w stosunku 20:1, czas inkubacji 8h.

F i g u r a 5

Hamowanie cytotoksyczności bscCD19xCD3 przez macierzyste przeciwciała HD37 anty-CD19 w testach z uwalnianiem chromu, czas inkubacji 8 h, stosunek E:T 20:1, stężenie bscCD19xCD3 1 ng/ ml.

F i g u r a 6:

Test cytotoksyczności z niestymulowanymi PBMC względem komórek Daudi po dodaniu rosnącej ilości EGTA, stosunek 10:1, czas inkubacji 4h.

F i g u r a 7:

Cytotoksyczność bscCD19xCD3 w teście uwalniania ⁵¹Cr z niestymulowanymi ludzkimi PBMC i Blin-1 jako komórkami docelowymi w różnych stosunkach E:T, czas inkubacji 4h, stężenie konwencjonalnych bispecyficznych przeciwciał 3 μg/ml, stężenie bsc 17-1AxCD3 100 ng/ml; stosunek E:T tak jak przedstawiono na figurze.

F i g u r a 8:

Sekwencje DNA i białek przeciwciała bscCD19xCD3 (odmiana zawierająca znacznik FLAG). Liczby przedstawiają pozycję nukleotydów (nt), odpowiadająca sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona poniżej sekwencji nukleotydowej. Kodująca sekwencja DNA dla bispecyficznego przeciwciała zaczyna się w pozycji 1 i kończy w pozycji 1593. Pierwsze sześć nt (pozycja od -10 do -5) i ostatnie sześć nt (pozycja od 1596 do 1601) zawiera miejsca trawienia enzymu restrykcyjnego dla EcoRI i Sall, odpowiednio. Nukleotydy od 1 do 57 wyszczególniają sekwencje liderową, nukleotydy od 82 do 414 i od 460 do 831 kodują VLCD19 i VHCD19, odpowiednio; nukleotydy od 847 do 1203 i od 1258 do 1575 kodują VHCD3 i VLCD3, odpowiednio; i nukleotydy od 1576 do 1593 kodują znacznik His.

F i g u r a 9:

Zmniejszenie liczby pierwotnych (złośliwych) CD19+ komórek B przez rekrutację autologicznych pierwotnych T-limfocytów przez bscCD19xCD3.

A) Punkt początkowy (t=0): n=3x10⁶ PBL/ studzienkę posiano na 24-studzienkową płytkę do hodowli tkankowych w objętości 1 ml RMPI każda, uzupełnionej 10% FCS. Przedstawiono początkowy odsetek komórek B CD19+ jak również komórek T CD4+ i CD8+.

PL 199 747 B1

B-G) względna liczba komórek B i komórek T CD4+ oraz CD8+ po t = 5 dni inkubacji w temp. 37°C/5% CO2 w nieobecności (B-C) lub obecności (D-G) bscCD19xCD3 (stężenia jak przedstawiono) z lub bez 60 U/ml IL-2. Kontrole negatywne zawierają albo bispecyficzny pojedynczy łańcuch przeciwciała (17-1AxCD3) z nieistotną specyficznością komórek docelowych lub zupełnie nie zawierają bispecyficznego przeciwciała (C).

F i g u r a 10:

Etapy oczyszczania bscCD19xCD3.

F i g u r a 11:

Analiza techniką SDS-PAGE czystości bscCD19xCD3. Pokazano żel poliakryloamidowy barwiony Coomassie blue SDS 4-12%. Pasma 1 i 6, markery wielkości cząsteczek; pasmo 2, supernatant z hodowli komórek; pasmo 3, aktywna frakcja z chromatografii kationowymiennej, pasmo 4, aktywna frakcja z chromatografii powinowactwa chelatów kobaltu; pasmo 5, aktywna frakcja filtracji żelowej. Zostały analizowane równe zawartości białek (2 μg) z supernatantu hodowli komórkowych i różne frakcje kolumnowe. Wielkość w kDA podano po prawej stronie. Strzałki wskazują pozycję bscCD19xCD3.

F i g u r a 12:

Chromatografia kationowymienna bscCD19xCD3. Stężenie białka zostało zmierzone przez absorpcję przy długości 280 nm (mAU, lewa oś). Profil elucji białka jest pokazany na poziomej osi. Profil gradientu stężenia NaCl został pokazany na pionowej osi (%B, prawa oś) a zebrane frakcje zostały przedstawione przez linie łamane. BscCD19xCD3 został przedstawiony we frakcji F6.

F i g u r a 13

Chromatografia powinowactwa chelatów kobaltu dla bscCD19xCD3. Stężenie białka zostało zmierzone przez absorpcję przy długości fali 280 nm (mAU, lewa oś). Profil elucji białka jest pokazany na osi poziomej. Gradient imidazolu jest pokazany na prawej osi (%B, prawa oś) a zebrane frakcje są przedstawione przez linie łamane. BscCD19xCD3 został przedstawiony we frakcji F7.

F i g u r a 14:

Filtracja żelowa anty-CD19xanty-CD3. Stężenie białka zostało zmierzone przez absorpcję przy 280 nm (mAU, na lewej osi). Profil elucji białka jest pokazany na drugiej osi. Wykres pokazuje zebrane frakcje. BscCD19xCD3 zostało odnalezione we frakcji F7 odpowiadającej masie cząsteczkowej około 60 kDa.

F i g u r a 15:

Poziomy transferazy gamma-glutamylowej (GGT) we krwi w odpowiedzi na podawanie bscCD19xCD3. Poziomy GGT zostały określone przy użyciu standardowych metod biochemicznych i wyrażone w jednostce/ litr. Oś czasu pokazuje dni (d) od początku podania pierwszej dawki leku, natomiast zaczynając od zera, przez kolejne h pokazano poszczególne podawania leku. Strzałki pokazują czas podania leku.

F i g u r a 16:

Pomiary ultrasonograficzne śledziony pacjenta A-B.

A: Określenie rozmiaru śledziony 12 kwietnia 1999 roku przed terapią bscCD19xCD3. Figura przedstawia powiększoną śledzionę (rozmiar 146 mm x 69,2 mm) co jest spowodowane infiltracją złośliwych komórek B.

B: Określenie rozmiarów śledziony 16 kwietnia 1999 roku po podaniu 3 μg 14 kwietnia i 10 μg 15 kwietnia. Figura przedstawia skurczenie się śledziony do rozmiarów 132 mm x 58,9 mm spowodowane układowym podawaniem bscCD19xCD3. Rozbieżności pojedynczych pomiarów w stosunku do wielkości rozmiarów przedstawionych w Tabeli 1 są wyjaśnione przy pomocy określenia rozmiaru poszczególnych części organu używając do tego celu ultradźwięków w różnych płaszczyznach przestrzeni. Dwa wymiary są oznaczone przez (+) i (x).

F i g u r a 17

Liczba leukocytów we krwi w odpowiedzi na leczenie bscCD19xCD3. Liczba leukocytów jest podana w Giga częściach/ litr. Oś czasu pokazuje dni (d) po podaniu pierwszej dawki leku, natomiast zaczynając od zera, przez h pokazano kolejne pojedyncze podawania leku. Strzałki przedstawiają czas podania leku.

F i g u r a 18:

Poziomy białka C- reaktywnego (CRP) we krwi w odpowiedzi na leczenie bscCD19xCD3. Poziomy CRP zostały określone przy użyciu tradycyjnych metod biochemicznych i wyrażone w mg/dcl. Oś czasu przedstawia dni (d) po pierwszym podaniu leku, natomiast zaczynając od zera, przez h pokazano kolejne pojedyncze podania leku. Strzałki przedstawiają czas podania leku.

PL 199 747 B1

F i g u r a 19:

Poziomy czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF) we krwi w odpowiedzi na podawanie bscCD19xCD3. Poziomy TNF zostały określone przez ELISA i wyrażone w ng/ml. Oś czasu przedstawia dni (d) po pierwszym podaniu leku, natomiast zaczynając od zera, przez h pokazano kolejne pojedyncze podania leku. Strzałki przedstawiają czas podania leku.

F i g u r a 20:

Poziomy interleukiny 6 (IL-6) we krwi w odpowiedzi na bscCD19xCD3. Poziomy IL-6 zostały określone przez ELISA i wyrażone w pg/ml. Oś czasu przedstawia dni (d) po pierwszym podaniu leku, natomiast zaczynając od zera, przez h pokazano kolejne pojedyncze podania leku. Strzałki przedstawiają czas podania leku.

F i g u r a 21:

Poziomy interleukiny 8 (IL-8) we krwi w odpowiedzi na bscCD19xCD3. Poziomy IL-8 zostały określone przez ELISA i wyrażone w pg/ml. Oś czasu przedstawia dni (d) po pierwszym podaniu leku, natomiast zaczynając od zera, przez h pokazano kolejne pojedyncze podania leku. Strzałki przedstawiają czas podania leku.

F i g u r a 22:

Poziomy rozpuszczalnego receptora interleukiny 2 łańcucha alfa (IL-2R) we krwi w odpowiedzi na leczenie bscCD19xCD3. Poziomy IL-2R zostały określone przez ELISA i wyrażone w jednostkach/ ml. Oś czasu przedstawia dni (d) po pierwszym podaniu leku, natomiast zaczynając od zera, przez h pokazano kolejne pojedyncze podania leku. Strzałki przedstawiają czas podania leku.

Wynalazek został opisany zgodnie z następującymi przykładami biologicznymi, które są tylko uproszczoną ilustracją a nie ograniczeniem zakresu prezentowanego wynalazku.

P r z y k ł a d 1: Klonowanie zmiennych domen (V) immunoglobulin

Domeny V lekkiego łańcucha (VL) i V ciężkiego łańcucha (VH) z hybrydomy HD37 (22) zostały sklonowane zgodnie ze standardowymi metodami PCR (23). Synteza cDNA została przeprowadzona ze starterami oligo dT oraz polimerazą Taq.

Lista starterów

5'L1:

GAAGCACGCGTAGATATCKTGMTSACCCAAWCTCCA [SEQ ID NO: 1]

3'K:

GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC [SEQ ID NO:2]

5'H 1:

CAGCCGGCCATGGCGCAGGTSCAGCTGCAGSAG [SEQ ID NO: 3] 'G:

ACCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT [SEQ ID NO: 4]

5'VLB5RRV:

AGGTGTACACTCCATATCCAGCTGACCCAGTCTCCA [SEQ ID NO: 5]

3'VLGS15:

GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCTTTGATCTCGAGCTTGGTCCC [ SEQ ID NO:6]

5'VHGS15:

GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG [SEQ ID NO: 7]

3'VHBspE1:

AATCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG [SEQ ID NO: 8]

W celu amplifikacji domen V przez PCR uż yto startery 5'L1 i 3'K, flankują cej domeny VL oraz

5'H1 i 3'G dla ciężkiego łańcucha opierając się na starterach opisanych przez Dϋbel i inni. (24). cDNA fragmentu scFv anty-CD3 została dostarczona przez A. Traunecker (25).

P r z y k ł a d 2: Tworzenie bispecyficznych fragmentów jednołańcuchowych i ekspresja w eukariota.

W celu uzyskania fragmentu scFv anty-CD19, odpowiednie regiony VL- i VH- klonowane do oddzielnych wektorów plazmidowych służyły jako matryce do specyficznego PCR dla VL- i VH- używającego pary starterów oligonukleotydowych 5'VLB5RRV/3'VLGS15 i 5'VHGS15/3'VHBspEI, odpowiednio. Ponadto nakładające się sekwencje komplementarne zostały wprowadzone do produktów PCR, które łącząc się tworzą sekwencję kodującą łącznik polipeptydowy o długości 15 aminokwasów (Gly4Ser1)3 podczas kolejnych fuzji-PCR. Ten etap wykonano za pomocą pary starterów 5'VLB5RRV/3'VHBspEI i otrzymany w ten sposób produkt fuzji (lub raczej fragment scFv skierowany przeciw CD19) trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRV oraz BspEI i w ten sposób klonowano do

PL 199 747 B1 wektora bluescript KS (Stratagene) zawierającego sekwencję (klonowaną w miejscu EcoRI/Sall) kodującą bispecyficzne jednołańcuchowe przeciwciało anty- 17-1A/CD3 z N-końcowym znacznikiem FLAG [1] lub też jego zmodyfikowaną wersję, nie posiadającą epitopu / FLAG (21), skutkiem tego zastąpiono specyficzność skierowaną anty-17-1A przez specyficzność skierowaną anty-CD19 oraz zachowano 5-aminokwasowy (Gly4Ser1)1 łącznik łączący C-koniec fragmentu scFv anty-CD3, odpowiednio. Następnie, fragmenty DNA kodujące obie wersje bispecyficznego jednołańcuchowego przeciwciała antyCD19/anty-CD3 przy orientacji domen VLCD19-VHCD19-VHCD3-VLCD3 subklonowano za pomocą EcoRI/Sall do opisanego wektora ekspresyjnego pEF-DHRF [1], odpowiednio. Otrzymany plazmidowy DNA transfekowano poprzez zastosowanie elektroporacji do komórek CHO z niedoborem DHFR: selekcję, amplifikację genu oraz produkcję białka przeprowadzono zgodnie z opisem [1]. W kolejnych przykładach przedstawiono wyniki uzyskane dzięki zastosowaniu wersji bscCD19xCD3 zawierającej FLAG.

W wyniku oczyszczenia bscCD19xCD3 z supernatantu hodowli transfekowanych komórek CHO uzyskano 4 mg/litr supernatantu pohodowlanego. Przeciwciało bsc oczyszczono za pomocą techniki chromatografii powinowactwa i kolumny Ni-NTA, wykorzystując jego C-końcowy, zawierający histydynę fragment. Przeciwciało bsc eluowało z kolumny jako wyraźny pik przy stężeniu 200 mM imidazolu. Rozdział elektroforetyczny SDS-Page przeprowadzono według metody Laemmli (26), na 12% żelu, a nastę pnie, w celu analizy oczyszczonego przeciwciał a bsc, barwiono za pomocą Coomassie brilliant blue R250. Otrzymane dzięki zastosowaniu elektroforezy SDS-Page (Figura 1) wyniki potwierdzają oczekiwany rozmiar przeciwciała bsc (60 kDa).

P r z y k ł a d 3: Właściwości wiążące przeciwciała bsc-CD19xCD3

Specyficzność wiązania przeciwciała bsc z CD3 oraz CD19 pokazano na podstawie analizy przepływowej cytometrii CD3-pozytywnych komórek Jurkat, ludzkich komórek PBMC oraz wielu różnych CD19-pozytywnych linii komórek B chłoniaka, obejmujących Blin I, SKW6.4, Daudi, BJAB oraz

Raji. W badaniach wykorzystujących przepływową cytometrię oraz analizę uwalniania chromu zastosowano CD19-pozytywne linie komórek B Daudi, Raji, BJAB (chłoniak Burkitt'a), SKW6.4 (ludzka komórka B transformowana EBV) i Blin-1 (linia komórek prę B). Jurkat jest CD3-pozytywną linią komórek T; BL60 oraz linie komórkowe plazmocytomy NCI i L363 są negatywne względem obu cząsteczek powierzchniowych, CD3 i CD19. Linie komórkowe hodowano w kompletnym RPMI 1640 (Biochrom) w 10% FCS (GIBCO).

1x10⁶ komórek przemywano buforem PBS, zawieszano ponownie w 200 μl PBS z dodatkiem 10% Vernimmun (Centeon, Marburg, Niemcy) oraz 0,1% NaN3 i inkubowano przez 30 minut w 4°C. Po etapie wirowania (100 x g, 5 min.) komórki inkubowano w 50 μl bscCD19xCD3 (200 μg/ml w PBS z Venimmun i 0,1% NaN3) przez 30 minut w 4°C. Komórki przemywano dwukrotnie buforem PBS. W celu wykrycia przeciwciała bsc zastosowano przeciwciało połączone z FITC, skierowane przeciw znacznikowi His (Dianova). Pozostałe przeciwciało bsc 17-1AxCD3, produkowane w wyniku działania tego samego systemu ekspresji jak w przypadku bscCD19xCD3, lub przeciwciało przeciw znacznikowi His służyły same jako kontrole negatywne. Cytometrię przepływową wykonano za pomocą Becton Dickinson FACScan. Nie wykryto żadnego wiązania z komórkami BL60, które nie ekspresjonują ani CD19, ani też CD3 (Figura 2).

P r z y k ł a d 4: Aktywność cytotoksyczna przeciwciała bscCD19xCD3 przeciwko CD19 pozytywnym komórkom chłoniaka

Za pomocą testu uwalniania ⁵¹Cr potwierdzono wysoką cytotoksyczność przeciwciała bscCD19xCD3 względem kilku linii komórkowych chłoniaka (Figura 3). Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), jako komórki efektorowe, izolowano ze świeżych kożuszków limfocytarnych przypadkowych dawców za pomocą Lymphoprep™ (Nycomed) i, w celu usunięcia trombocytów, poddano kolejnym etapom wirowania w gradiencie (100 x g). CD19-pozytywne komórki B usuwano za pomocą Dynabeads M-450 CD19 (Dynal). Usunięte populacje komórek analizowano stosując cytometrię przepływową (Becton Dickinson), która wykazała usunięcie 99% komórek CD19-pozytywnych. Komórki PBMC inkubowano przez noc w 37°C, 5% CO2. Jako komórki docelowe zastosowano CD19 pozytywne linie komórek B (Raji, Blin I, Daudi, BJAB, SKW6.4). Cytotoksyczność mierzono w standardowej analizie uwalniania chromu, na okrągłodennych, 96-studzienkowych płytkach (Nunc), stosując kompletną pożywkę RPMI 1640 (Biochrom) z 10% FCS (GIBCO). Niestymulowane komórki PBMC, w objętości 80 μl pożywki dodawano do wszystkich studzienek zawierających 20 μl przeciwciała bsc o różnych stężeniach. Następnie dodano 100 μl docelowych komórek, znakowanych ⁵¹Cr (1 x 10⁴), płytki wirowano przez 3 minuty przy 100 x g i inkubowano przez 4 godziny w 37°C, 5% CO2. Po dodatkowym etapie wirowania pobrano 50 μl supernatantu znad komórek i analizowano pod kątem uwalniania ⁵¹Cr w liczniku promieniowania gamma (TopCount, Canberra Packard).

PL 199 747 B1

Spontaniczne uwalnianie mierzono przeprowadzając inkubację komórek docelowych bez komórek efektorowych lub przeciwciał i określano wartość maksymalną uwalniania w wyniku inkubacji docelowych komórek w obecności 10% Tritonu X-100. Inkubacja docelowych komórek wraz z przeciwciałem bsc, lecz bez komórek efektorowych nie dawała w rezultacie mierzalnej lizy komórek. Procent występowania lizy specyficznej został obliczony. Specyficzne uwalnianie (%)=[(cpm, eksperymentalne uwalnianie) - (cpm, spontaniczne uwalnianie)]/[(cpm, maksymalne uwalnianie) - (cpm, spontaniczne uwalnianie)] x 100. Wszystkie testy wykonano w trzech powtórzeniach. SD z potrójnie wykonanych oznaczeń we wszystkich eksperymentach wynosiło mniej niż 6%. W celu przybliżenia warunków in vivo, jako komórki efektorowe zastosowano niestymulowane komórki PBMC, pochodzące od zdrowych dawców. Szybka indukcja cytotoksyczności w ciągu 4 godzin mogła być obserwowana bez potrzeby jakiejkolwiek wcześniejszej stymulacji komórek T. Jako kontrolę użyto przeciwciało bsc o odmiennej specyficzności nowotworowej (bsc17-1AxCD3), lecz wytwarzane w tym samym systemie co przeciwciało bscCD19xCD3. Wykazywało ono aktywność lityczną nieznacznie wyższą od poziomu tła dla pożywki. Ponadto, nie obserwowano żadnej aktywności cytotoksycznej w przypadku użycia jako komórek docelowych komórek linii komórkowej plazmocytomy NCI oraz L363, które nie ekspresjonują CD19 (Figura 4). Analiza kompetycyjna, w której zastosowano wzrastające ilości CD19-specyficznego macierzystego przeciwciała monoklonalnego HD37, wykazała, że aktywność cytotoksyczna bscCD19xCD3 została niemal całkowicie zablokowana (Figura 5). Kontrole te pokazały, że efekty cytotoksyczności, w których uczestniczy bscCD19xCD3 są antygenowe specyficzne. W celu dostarczenia większej ilości informacji na temat mechanizmów komórkowych, doprowadzających do zabicia CD19pozytywnych komórek docelowych przez przeciwciało bscCD19xCD3, podjęto próbę zablokowania cytotoksyczności związanej z bscCD19xCD3 przez zastosowanie EGTA. Jak przedstawia Figura 6, aktywność cytotoksyczna bscCD19xCD3 może ulec całkowitemu zablokowaniu przez EGTA, co wskazuje na to, że specyficzna liza komórek jest raczej efektem wywołanym za pomocą komórek T (prawdopodobnie poprzez ścieżkę perforynową), niż bezpośrednim efektem (np. indukcji apoptozy) działania samego przeciwciała.

Stosując niestymulowane komórki T, nawet przy niższych niż 1 ng/ml stężeniach przeciwciała, obserwowano znaczny efekt cytotoksyczny względem komórek Blin-1 (Figura 7). Nawet przy względnie niskim stosunku E:T (5:1; 2.5:1) i bardzo niskim stężeniu przeciwciała 10-100 pg/ml, przeciwciało bscCD19xCD3 mogło szybko indukować specyficzną aktywność cytotoksyczną niestymulowanych komórek T (Figura 7). Przeciwnie, konwencjonalne bispecyficzne przeciwciało CD19xCD3, powstałe w wyniku zastosowania techniki hybryd-hybrydom (5-7, 27) nie wykazywało znaczącej aktywności cytotoksycznej w tych samych warunkach, nawet w stężeniach aż do 3000 ng/ml (Figura 7). Takie konwencjonalne bispecyficzne przeciwciało wymagało w celu indukowania specyficznej cytotoksyczności komórek T (nie przedstawiono na Figurze) dodatkowej wcześniejszej stymulacji komórek T oraz wysokich stężeń przeciwciała, około 100 ng/ml, co jest zgodne z danymi literaturowymi (5-7, 27).

P r z y k ł a d 5: Usunięcie pierwotnych (złośliwych) komórek B przez autologiczne komórki T w wyniku aktywności cytotoksycznej bscCD19xCD3

W celu oszacowania aktywności cytotoksycznej bscCD19xCD3 względem pierwotnych złośliwych komórek B, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) od pacjentów cierpiących z powodu B-CLL (przewlekłej białaczki limfatycznej z komórek B) były izolowane poprzez wirowanie w gradiencie Ficoll i hodowane w obecności lub przy braku bscCD19xCD3 przez 5 dni w 37°C/5% CO2, w pożywce RPMI 1640, uzupełnionej 10% FCS oraz, ewentualnie z 60 U/ml IL-2. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że limfocyty krwi obwodowej (PBL), w tym przypadku, izolowane od pacjenta z NHL (chłoniaka nie-Hodgkin'a), (który następnie został układowo leczony za pomocą bscCD19xCD3, patrz przykład 7) obejmowały 92,6% CD19-pozytywnych komórek B (=docelowych komórek) i 7,4% limfocytów CD3-pozytywnych (=komórek efektorowych), przy stosunku komórek T CD4/CD8 równym 2,6 : 4,8. Ogromna większość tych CD19-pozytywnych komórek B obejmowała komórki złośliwe. Zaszczepiono 3x10⁶ PBL /ml na studzienkę w objętości 1 ml każda do 24-studzienkowej płytki do hodowli komórkowej. Jako kontroli negatywnych użyto pożywki hodowlanej wraz z IL-2 oraz pożywki hodowlanej bez IL-2 z innym nieistotnym bispecyficznym przeciwciałem jednołańcuchowym bsc17-1AxCD3 (1) w stężeniu 0,5 μg/ml. Jak przedstawia Figura 9, nie wykryto w tych warunkach, po 5 dniach inkubacji, żadnego usunięcia komórek CD19-pozytywnych. Jednakże, dodanie bscCD19xCD3 w stężeniu 0,5 μg/ml lub 0,05 μg/ml (w obecności albo przy braku IL-2) spowodowało zabicie prawie wszystkich CD19-pozytywnych komórek B. Hodowane komórki w tym czasie obejmowały głównie limfocyty T, przy czym stosunek komórek T CD4/CD8 wynosił około 1:2 do 1:3. Potwierdza to wyjątkową cytotoksyczność bscCD19xCD3 względem komórek B CD19-pozytywnych,

PL 199 747 B1 ponieważ całkowite usunięcie pierwotnych komórek B przez autologiczne komórki T mogło być wywołane w obecności tak niskiego stężenia jak 50 ng/ml i przy bardzo niekorzystnym początkowym stosunku efektorowych komórek docelowych, niższym niż 1:10, nawet bez IL-2 lub innego rodzaju dodatkowej stymulacji komórek T.

P r z y k ł a d 6: Oczyszczenie bscCD19xCD3 do zastosowania terapeutycznego bscCD19xCD3 wytworzono wykorzystując komórki jajnikowe chomika chińskiego (CHO), stabilnie transfekowane wektorem ekspresyjnym (pEF-DHFR; patrz przykład 2), kodującym bscCD19xCD3 oraz, dodatkowo, heksahistydynę i znacznik FLAG. Komórki hodowano na pożywce pozbawionej surowicy (Rencyte) w reaktorze typu „hollow fiber (Unisyn). Zebrano 500 ml supernatantu znad hodowli komórkowej, a następnie sterylnie filtrowano przez 0,2 μm filtr (AcroCap; Pall Gelman).

Wykrycie i ilościowe oznaczenie bscCD19xCD3 wykonano za pomocą techniki western blotting, stosując pochodzące od myszy, skierowane przeciw FLAG IgG (Sigma) oraz kozie, skierowane przeciw mysiemu IgG, sprzężone z alkaliczną fosfatazą (Sigma). Wykrycie uzyskano dzięki zastosowaniu techniki chemoluminescencji, stosując system BCIP/NBT (Devitron). Stężenie białek określano metodą Bradford'a (Biorad), gdzie jako białko standardowe zastosowano wołowe IgG (Biorad). Czystość frakcji otrzymywanych z kolumny analizowano elektroforetycznie, stosując warunki redukujące w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS), w układzie Bis/Tris 4-12% gradient żelu (PAGE), z wykorzystaniem systemu buforów MOPS (Novex).

Oczyszczenie bscCD19xCD3 do homogenności wymagało użycia chromatografii kationowymiennej, chromatografii powinowactwa chelatów kobaltu oraz, w ostatnim etapie, filtracji żelowej. Takie etapy oczyszczania wykonano na podstawie standardowych protokołów (patrz poniżej). Schemat procedury oczyszczania przedstawiono na Figurze 10.

Chromatografia kationowymienna: supernatant znad hodowli komórek CHO łączono z podwójną objętością buforu C (30 mM kwas morfolinoetanosulfonowy [MES], 20 mMNaCl, 3 mM EDTA, 0,3 mM chlorowodorku benzamidyny, pH 5.5) i przepuszczano przez 70 ml kolumną kationowymienną SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) przy szybkości przepływu 20 ml/min. Kolumnę równoważono buforem A (20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 5,8). Po przemyciu buforem A w ilości 5 objętości kolumny wymywano bscCD19xCD3 za pomocą gradientu, 45% buforem B (20 mM MES, 1 M NaCl, pH 5,8) w buforze A. Do eluatu dodano 0,045 objętości 1 M Tris/HCl, pH 8,5, zawierającego 47 mM imidazolu, a następnie sterylnie filtrowano (0,2 μm; AcroCap). Figura 12 przedstawia typowy profil elucji chromatografii kationowymiennej. Frakcja 6 zawierała bscCD19xCD3.

Oczyszczanie metodą powinowactwa chelatów kobaltu: Pochodzący z kolumny kationowymiennej eluat przepuszczano z szybkością 2,5 ml/min. przez 10 ml kolumnę Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), zrównoważoną buforem AO (50 mM Na2HPO4, 400 mM NaCl, 500 mM imidazolu, pH 8,0). Kolumnę wstępnie równoważono roztworem 0,1 M chlorku kobaltu. Po przepłukaniu buforem AO w ilości 33 objętości kolumny, bufor A (50 mM Na2HPO4, 400 mM NaCl, 2 mM imidazolu, pH 6,4) i wytworzeniu gradientu 0-12% buforu B (50 mM Na2HPO4, 400 mM NaCl, 500 mM imidazolu, pH 6,4) w buforze A, eluowano w jednym etapie bscCD19xCD3, stosując 30 ml 100% buforu B. Eluat następnie sterylnie filtrowano a następnie zatężano około 10-krotne za pomocą MacroSep (Pall Gelman; selekcja 10 kDa). Figura 13 przedstawia typowy profil elucji chromatografii powinowactwa chelatów kobaltu. Przeciwciało bscCD19xCD3 wykryto w 7 frakcji.

Filtracja żelowa: Stężony eluat, pochodzący z kolumny powinowactwa chelatów kobaltu, przepuszczano z prędkością przepływu 0,75 ml/min. przez 124 ml-kolumnę High Load Superdex 200 (Pharmacia; stopień preparacyjny) zrównoważoną buforowanym fosforanem roztworem soli fizjologicznej (Gibco). bscCD19xCD3 eluował we frakcji o masie cząsteczkowej odpowiadającej około 55 kDa (Figura 14, frakcja nr 7). Pochodzącą z filtracji żelowej frakcję zawierającą bscCD19xCD3 uzupełniano 5% albuminy surowicy ludzkiej (Behring), a następnie sterylnie filtrowano przez 0,1 μ^ι filtr (Millex; Millipore).

Figura 11 przedstawia analizę SDS-PAGE, potwierdzającą wysoką zawartość bscCD19xCD3 w supernatancie znad hodowli komórkowej oraz różnych aktywnych frakcjach uzyskanych z kolumn chromatograficznych. BscCD19xCD3 okazało się głównym białkiem obecnym w supernatantach znad hodowli komórkowych (linia 2). Wysoko oczyszczone przeciwciało, anty-CD19 x anty-CD3, które zastosowano do terapii ludzi, nie wykazywało wykrywalnych zanieczyszczeń (Figura 11, linia 5).

PL 199 747 B1

P r z y k ł a d 7: Kliniczne zastosowanie bscCD19xCD3 u pacjenta z chłoniakiem z komórek B

Podczas okolicznościowego zastosowania, pacjent (A-B, płci żeńskiej, urodzony w 1937) cierpiący na przewlekłą białaczkę limfatyczną z komórek B (B-CLL) leczony był za pomocą bispecyficznego jednołancuchowego przeciwciała bscCD19xCD3.

Historia pacjenta i uzasadnienie:

Diagnoza wykazała obecność u pacjenta B-CLL w 1992. Podczas początkowej diagnozy określono, że schorzenie objęło zasięgiem różne obszary węzłów chłonnych oraz śledzionę; dodatkowo zaobserwowano anemię hemolityczną na tle autoimmunologicznym oraz niedobór immunoglobulin. Pacjent posiadał wole guzowate, które było leczone dawkami 2,5 mg/dzień karbimazolu i znajdowało się w stanie eutyreozy.

Pacjent podlegał wielocyklicznej chemoterapii chlorambucylem oraz prednizonem od 1992 do 1994 roku. Postępujące zmiany chorobowe spowodowały zmianę leczenia i rozpoczęcie podawania cyklofosfamidu, doksorubicyny, winkrystyny i prednizonu (CHOP, 8 cykli), co spowodowało złagodzenie objawów na ponad rok. Po kolejnym nawrocie choroby pacjenta poddano następnym 6 cyklom CHOP, a następnie zastosowano chlorambucyl i predizon oraz jeden cykl podawania samego chlorambucylu, co nie spowodowało jakiegokolwiek polepszenia stanu chorego. W grudniu 1998, w celu opanowania postępu powiększania śledziony, pacjenta poddano zabiegom naświetlania śledziony. Pacjent cierpiał na głęboką niedoczynność szpiku kostnego wraz z wieloma infekcyjnymi powikłaniami. Występowanie anemii oraz małopłytkowości wymagało częstych transfuzji czerwonych krwinek i substytucji płytek krwi.

Ze względu na zaawansowany stan choroby oraz zaburzone funkcjonowanie szpiku kostnego nie było wskazane dla pacjenta zastosowanie intensywniejszej chemioterapii lub wyższych dawek leków. Leczenie za pomocą przeciwciała skierowanego przeciw CD20, rituksimab, nie było w tym przypadku odpowiednie, ze względu na niedokładnie wykazane do tej pory jego działania na B-CLL.

Analizy FACS wykazały, że 95% komórek krwi obwodowej pacjenta było CD19-pozytywne, podczas gdy 77% komórek ekspresjonowało antygen CD20. Inkubacja komórek obwodowej krwi pacjenta wraz z bscCD19xCD3 pokazała wyraźne usunięcie CD19-pozytywnych komórek B (patrz przykład 5). W związku z tym lekarze podjęli decyzję o rozpoczęciu okolicznościowego leczenia pacjenta za pomocą nowego przeciwciała bscCD19xCD3. Pacjent został szczegółowo poinformowany o nowym związku oraz o potencjalnym ryzyku oraz korzyściach zastosowania tego składnika w leczeniu. Pacjent zrozumiał w pełni wyjaśnienia i wyraził pisemną zgodę na takie okolicznościowe zastosowanie.

Opis klinicznego podawania leku:

Przed rozpoczęciem leczenia pacjenta poddano klinicznym badaniom i rozległej analizie diagnostycznej w celu ustalenia zasięgu choroby i wykluczenia dodatkowych czynników ryzyka. Stan kliniczny pacjenta obejmował anemię, małopłytkowość i utratę masy, lecz nie wystąpiły uszkodzenia sercowo-naczyniowe lub inne powikłania stojące na przeszkodzie zastosowania bscCD19xCD3. W nocy poprzedzającej rozpoczęcie leczenia pacjent cierpiał na migrenowy ból głowy. Podczas leczenia za pomocą bscCD19xCD3 pacjent przebywał w sali szpitalnej intensywnej terapii, co zapewniało możliwość udzielenia szybkiej pomocy w nagłym wypadku. W celu zapobiegnięcia ostrym reakcjom cytokinowym i powikłaniom podczas lizy nowotworu, pacjent otrzymał profilaktyczne IV dawki 2 mg klemastyny (Tavegil^®) oraz 200 mg cymetydyny (Tagamet^®), jak również 300 mg allopurinolu i 20 mg omeprazolu (Antra^®).

Procesy alkalizacji i heparynizacji dokonywano podczas leczenia oraz w późniejszych okresach. Ponadto, pacjent podlegał niezbędnemu leczeniu objawowemu.

W celu kontrolowania biochemicznych, hematologicznych i immunologicznych parametrów u pacjenta pobierano próbki krwi przed i po podaniu leku.

Pierwsze podanie przeciwciała bscCD19xCD3 (14 kwiecień, 1999):

Pacjent otrzymał pierwszą dawkę 3 μg bscCD19xCD3, w izotonicznym buforze fosforanowym, zawierającym 5% ludzkiej albuminy surowicy krwi (HSA), w postaci 20 minutowego wlewu dożylnego. Podczas wlewu nie wystąpiły żadne niekorzystne skutki. Około 1 godziny po wlewie pacjent odczuwał dreszcze przez około 5 minut, a następnie wystąpiło pocenie się, umiarkowane obniżenie ciśnienia krwi o około 10 mmHg oraz umiarkowany wzrost temperatury ciała (+0,5°C) przez kilka godzin. Ponadto, bóle głowy uległy lekkiemu - nasileniu. Pacjent otrzymał kolejne 2 mg Tavegil^® oraz 200 mg Tagamet^®, 250 mg prednizolonu (Solu-Decortin^®) i 50 mg petydyny (Dolantin^®). Wszystkie objawy zanikły bez dalszych następstw tego samego dnia.

Drugie podanie przeciwciała bscCD19xCD3 (15 kwiecień, 1999):

Druga dawka, 10 μg, bscCD19xCD3 została podana dzień później, w tych samych warunkach. Około 1 godziny po wlewie pacjent odczuwał znaczne dreszcze, gorączkę (39.2°C), wystąpiła lekka hiperwentylacja oraz reakcja niedociśnieniowa. Pacjentowi podano 2 mg Tavegil, 200 mg Tagamet

PL 199 747 B1 i 300 mg Solu-Decortin oraz 15 mg pirytramidu (Dipidolor^®). W celu stabilizacji funkcji sercowonaczyniowych, pacjent otrzymał wlew dopaminy i uzupełnienie objętości płynów. W następstwie tego leczenia objawy uległy znacznemu osłabieniu. Pomimo tego, przeniesiono pacjenta na noc na oddział kardiologiczny, w celu zapewnienia odpowiedniego monitorowania funkcji życiowych i zapewnienia możliwości natychmiastowej interwencji. Pacjent powrócił na normalny oddział szpitalny następnego ranka, bez odczuwania dalszych powikłań.

W ciągu trzech kolejnych dni stwierdzono występowanie u pacjenta stanów podgorączkowych (około 37.2°C) i dzień po podaniu drugiej dawki, wystąpił niewielki wysięk opłucnowy (16 kwiecień, 1999) oraz łagodny obrzęk kończyn dolnych (18 kwiecień, 1999). Funkcje sercowo-naczyniowe nie uległy zmianie, a badania laboratoryjne nie wykazały znacznych zmian związanych z bezpieczeństwem stanu pacjenta, za wyjątkiem wzrostu γ-glutamylotransferazy po podaniu drugiej dawki bscCD19xCD3 (Figura 15).

Ze względu na to, że bscCD19xCD3 było tolerowane przez pacjenta a skutki uboczne znajdowały się pod kontrolą i podlegały leczeniu objawowemu, kontynuowano podawanie pacjentowi nowego przeciwciała bscCD19xCD3.

Kliniczna i immunologiczna skuteczność bscCD19xCD3:

Wyniki badań klinicznych:

Badania ultrasonograficzne śledziony oraz pięciu brzusznych i pachowych węzłów chłonnych zostały wykonane 1 dzień i 4 dni po podaniu drugiej dawki bscCD19xCD3. Już po 1 dniu od podania 10 μg dawki (16 kwiecień, 1999), wykazano pomniejszenie węzłów chłonnych, podobnie jak śledziony, o około 20%, w porównaniu ze stanem wyjściowym. Obserwacja ta została potwierdzona za pomocą drugiej oceny ultrasonograficznej 19 kwietnia, 1999. Masa śledziony zmalała o 350 g (z 1630 g w stanie wyjściowym, do 1280 g 19 kwietnia, 1999) (tabela 1; figura 16).

Wyniki hematologiczne:

Liczba białych krwinek, która obejmowała głównie złośliwe komórki B, zmalała podczas leczenia i następujących po nim dni (tabela 2; figura 17). Białko C-reaktywne (CRP) jest białkiem ostrej fazy reakcji, odzwierciedlającym aktywację komórek T i działanie cytokin prozapalnych. Po podaniu 10 μg bscCD19xCD3 ilość tego białka znacznie wzrosła, a następnie, podczas następnych 3 dni obserwacji, malała w sposób ciągły (tabela 2; figura 18).

Wyniki immunologiczne:

Poziom cytokin w surowicy, odzwierciedlający ostrą odpowiedź immunologiczną w wyniku podawania składnika, mierzono przed i w różnych odstępach czasu, po podawaniu nowego związku. Poziomy cytokin w surowicy oraz rozpuszczalnego receptora IL-2 określano ilościowo stosując test ELISA, zgodnie z zaleceniami producenta.

Zaobserwowano znaczny wzrost poziomu czynnika martwicy nowotworu TNF-α, zależny od zastosowanej dawki, w ciągu pierwszej godziny po podaniu bscCD19xCD3 (figura 19).

Wykazano również znaczny, zależny od dawki, wzrost interleukiny 6 (IL-6) oraz interleukiny 8 (IL-8). Ich maksymalne poziomy obserwowano 2 do 4 godzin po podaniu bscCD19xCD3 (figury 20, 21). Wszystkie cytokiny powróciły do wyjściowego poziomu w ciągu kilku godzin.

Poziom rozpuszczalnego receptora IL-2 podwyższony był już w stanie wyjściowym, co można wytłumaczyć dużą ilością złośliwych komórek B, ekspresjonujących receptor IL-2. W następstwie podawania nowego bscCD19xCD3 obserwowano wzrost ilości rozpuszczalnego receptora IL-2, co wskazuje na aktywację komórek efektorowych (figura 22).

Wnioski:

Nowe bscCD19xCD3 podawano w bezpieczny sposób pacjentowi cierpiącemu na oporną B-CLL. Tolerancja przyjmowania bscCD19xCD3, w dawkach 3 μg i 10 μg była akceptowalna i możliwa do kontrolowania za pomocą profilaktycznych pomiarów i leczenia objawowego.

Nowe bscCD19xCD3 powodowało skurczenie wcześniej powiększonej śledziony i węzłów chłonnych pacjenta, co wykazano badaniami ultrasonograficznymi. Ze względu na to, że powiększenie śledziony i węzłów chłonnych spowodowane było infiltracją złośliwych komórek B, zmniejszenie odzwierciedlało zniszczenie złośliwych komórek B w wyniku podawania bscCD19xCD3.

W wyraźnym przeciwieństwie do jakichkolwiek innych, znanych w dziedzinie bispecyficznych przeciwciał CD19xCD3, bispecyficzne przeciwciało CD19xCD3, zaprezentowane w wynalazku, (bscCD19xCD3) wykazuje kliniczną skuteczność względem chłoniaka nieziarniczego z komórek B, co wykazały pomiary zmniejszonych organów limfoidalnych przenikniętych komórkami B. Wykazano skuteczność kliniczną bscCD19xCD3 przy zaskakująco niskich dawkach, dobrze tolerowanych w wyniku

PL 199 747 B1 układowego podawania. Zatem, kliniczna skuteczność bscCD19xCD3 potwierdza jego wyjątkową aktywność cytotoksyczną, wykazaną w testach in vitro.

T a b e l a 1: Efekt bscCD19xCD3 na rozmiar węzł ów chłonnych i śledziony u pacjenta cierpiącego na chłoniaka B-komórkowego

Pomiary ultrasonograficzne

			12 kwiecień, 1999	16 kwiecień, 1999	19 kwiecień, 1999
węzły chłonne
Brzuszny	1)	54 x 29 x 14 mm	42 x 30 x 13 mm	42 x 30 x 14 mm
		2)	56 x 33 x 18 mm	43 x 33 x 18 mm	43 x 30 x 16 mm
		3)	46 x 32 x 27 mm	46 x 31 x 22 mm	47 x 32 x 23 mm
Pachowy	lewy	36 x 24 x 16 mm	34 x 22 x 15 mm	30 x 22 x 14 mm
		prawy	37 x 24 x 13 mm	33 x 20 x 11 mm	32 x 23 x 14 mm
Śledziona		270 x 146 x 69 mm	265 x 132 x 64 mm	265 x 128 x 63 mm
			1630 g	1340 g	1280 g

Rozmiary trzech brzusznych węzłów chłonnych, jednego lewego i jednego prawego pachowego węzła chłonnego oraz śledziony określono i zmierzono za pomocą sonografii, stosując urządzenie Toshiba SSA100. Rozmiary dla trzech wymiarów podano w milimetrach. Masę śledziony obliczono na podstawie jej rozmiarów i gęstości ultradźwiękowej.

T a b e l a 2. Poziomy we krwi wybranych markerów w odpowiedzi na traktowanie bscCD19xCD3

		Kwiecień 14, 1999	Kwiecień 15, 1999	Kwiecień 16, 1999	Kwiecień 17, 1999	Kwiecień 18, 1999	Kwiecień 19, 1999
	jednostki
GGT	U/l	22	24 (rano) - (po południu)	124 (g. 6.00) 107 (g.12.00)	96	89	87
LDH	U/l	618	536 (rano) 773 (po południu)	548	697	551	539
Leukocyty	Gpt/l	46,8	43.3 (rano) 22.3 (po południu)	36,9	37,0	28,3	36,6
Limfocyty	%	85	58,8 (rano) 82,0 (po południu)	60,9	64,4	65,5	88
CRP	mg/dl	<0,4	1,0 (rano) 0,7 (po południu)	5,2	2,5	2,0	0,7

Poziomy we krwi transferazy gamma-glutamylowej (GGT), dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i białka C-reaktywnego (CRP) określano standardowymi metodami biochemii klinicznej i wyrażono w jednostkach/ml (GGT), jednostkach/1 (LDH) i mg/dl (CRP). Liczba leukocytów została wyrażona w giga punktach/l, liczba limfocytów została przedstawiona jako odsetek całkowitych leukocytów. Poziomy podstawowe z 14 kwietnia, 1999, przed rozpoczęciem traktowania zostały podane w pierwszej linii. Odpowiedź na 3 μg bscCD19xCD3 z 15 kwietnia (które zostało podane 14 kwietnia) pokazano w drugiej linii. Odpowiedź na drugie traktowanie 10 μg związku tego samego dnia pokazano w trzeciej linii. Poziomy wybranych markerów we krwi w ciągu czterech dni po potraktowaniu podano w ostatnich czterech liniach.

PL 199 747 B1

Literatura

1. Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-5

2. Gianni, N Engl. J. Med. 336 (1997), 1290-7

3. Urba, J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (1990), 29-37

4. Fisher, Cancer (1994)

5. Bohlen, Blood 82 (1993), 1803-121

6. Bohlen, Cancer Res 53 (1993), 18:4310-4.

7. Bohlen, Cancer Res 57 (1997),1704-9.

8. Haagen, Clin Exp Immunol 90 (1992), 368-75.

9. Haagen, Cancer Immunol Immunother. 39 (1994), 391-6.

10. Haagen, Blood 84 (1994), 556-63.

11. Haagen, Blood 85 (1995), 3208-12.

12. Weiner, Leuk Lymphoma 16 (1995), 199-207.

13. Csoka, Leukemia 10 (1996), 1765-72.

14. Uckun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8603-7.

15. Staerz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 1453-7.

16. Lanzavecchia, Eur J Immunol 17 (1987), 105-11.

17. Mallender, J Biol Chem 269 (1994), 199-206.

18. Gruber, J Immunol 152 (1994), 5368-74.

19. Kostelny, J Immunol 148 (1992), 1547-53.

20. Mack, J Immunol 158 (1997), 3965-70.

21. Kufer, Cancer Immunol Immunother 45 (1997), 193-7.

22. Pezzutto, J Immunol 138 (1987), 2793-9.

23. Orlandi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3833-7.

24. Dubel, J Immunol Methods 175 (1994), 89-95.

25. Traunecker, Embo J 10 (1991), 3655-9.

26. Laemmli, Nature 227 (1970), 680-5.

27. Bohlen, J Immunol Methods 173 (1994), 55-62.

28. Demanet, Int J Cancer Suppl 7 (1992), 67-8.

29. De, J Hematother 4 (1995), 433-7.

30. Haagen, Leuk Lymphoma 19 (1995), 381-93.

31. Andersen, Blood 80 (1992), 2826-34.

32. Zhu, Int J Cancer 62 (1995), 319-24.

33. Hartmann, Blood 89(1997), 2042-7.

34. Valone, J Clin Oncol 13 (1995), 2281-92.

35. Valone, J Hematother 4 (1995), 471-5.

36. Bolhuis, Int J Cancer Suppl 7 (1992), 78-81.

37. Canevari, J Natl Cancer Inst 87 (1995), 1463-9

38. Nitta, Lancet 335 (1990), 368-71.

39. Yokota, Cancer Res 52 (1992), 3402-8.

40. Weiner, J Immunol 152 (1994), 2385-92.

41. Maloney, Blood 84 (1994), 2457-66.

42. Reff, Blood 83 (1994), 435-45.

43. Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772.

Claims (27)

1. Jednołańcuchowy wielofunkcyjny polipeptyd zawierający:

(a) pierwszą domenę zawierającą miejsce wiążące łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała specyficznie rozpoznającego antygen CD19; i (b) drugą domenę zawierającą miejsce wiążące łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała specyficznie rozpoznającego antygen CD3;

przy czym domeny są ułożone w kolejności VLCD19-VHCD19-VLCD3-VHCD3.

2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obydwie domeny są połączone przez łącznik polipeptydowy.

PL 199 747 B1

3. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że pierwsza i/lub druga domena imituje lub odpowiada regionowi VH i VL naturalnego przeciwciała.

4. Polipeptyd według zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem syntetycznym lub przeciwciałem humanizowanym.

5. Polipeptyd według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że przynajmniej jedna z domen jest jednołańcuchowym fragmentem regionu zmiennego przeciwciała.

6. Polipeptyd według zastrz. 2 do 5, znamienny tym, że łącznik polipeptydowy zawiera liczne reszty glicyny, alaniny i/lub seryny.

7. Polipeptyd według zastrz. 2 do 6, znamienny tym, że łącznik polipeptydowy zawiera liczne kolejne kopie sekwencji aminokwasowej.

8. Polipeptyd według zastrz. 2 do 7, znamienny tym, że łącznik polipeptydowy zawiera 1 do 5 reszt aminokwasowych.

9. Polipeptyd według zastrz. 2 do 8, znamienny tym, że łącznik polipeptydowy zawiera sekwencję aminokwasową Gly Gly Gly Gly Ser.

10. Polipeptyd według zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że pierwsza domena zawiera przynajmniej jeden CDR z regionu VH i VL zawierający sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA przedstawioną na Figurze 8, nukleotydy od 82 do 414 (VL) i nukleotydy od 460 do 831 (VH) i/lub druga domena zawiera przynajmniej jeden CDR z regionu VH i VL zawierający sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA przedstawioną na Figurze 8 nukleotydy od 847 do 1203 (VH) i nukleotydy od 1258 do 1575 (VL).

11. Polipeptyd według zastrz. 1 do 10, znamienny tym, że:

(a) miejsce wiążące pierwszej domeny wykazuje powinowactwo przynajmniej około 10^-7M; i/lub (b) miejsce wiążące drugiej domeny wykazuje powinowactwo mniejsze niż około 10^-7M.

12. Polipeptyd według zastrz. 1 do 11, znamienny tym, że jest bispecyficznym jednołańcuchowym przeciwciałem.

13. Polipeptyd według zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że zawiera przynajmniej jedną dodatkową domenę.

14. Polipeptyd według zastrz. 13, znamienny tym, że dodatkowa domena jest przyłączona wiązaniem kowalencyjnym lub niekowalencyjnym.

15. Polipeptyd według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że przynajmniej jedna dodatkowa domena zawiera cząsteczkę efektorową posiadającą konformację dogodną dla aktywności biologicznej, zdolną do maskowania jonu lub selektywnego wiązania się ze stałym nośnikiem lub ustaloną wcześniej determinantą.

16. Polinukleotyd, znamienny tym, że w trakcie ekspresji koduje polipeptyd określony w zastrz. 1 do 15.

17. Wektor, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd określony w zastrz. 16.

18. Komórka, znamienna tym, że transfekowana jest polinukleotydem określonym w zastrz. 16 lub wektorem określonym w zastrz. 17.

19. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w zastrz. 1 do 15, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których hoduje się komórkę określoną w zastrz. 18 i izoluje się polipeptyd z hodowli.

20. Kompozycja do zastosowania terapeutycznego lub diagnostycznego, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w zastrz. 1 do 15, polinukleotyd określony w zastrz. 16 lub wektor określony w zastrz. 17.

21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że jest kompozycją farmaceutyczną zawierającą ewentualnie dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

22. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że jest kompozycją diagnostyczną ewentualnie dodatkowo zawierającą odpowiednie środki do detekcji.

23. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 do 15, polinukleotydu określonego w zastrz. 16 lub wektora określonego w zastrz. 17 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia B-komórkowych złośliwych zmian nowotworowych, chorób autoimmunologicznych związanych z komórkami B lub utraty komórek B.

24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że B-komórkowe złośliwe zmiany nowotworowe to chłoniak nieziarniczy.

25. Zastosowanie polinukleotydu określonego w zastrz. 16 albo wektora określonego w zastrz. 17 do wytwarzania kompozycji do terapii genowej.

PL 199 747 B1

26. Zastosowanie według zastrz. 23 albo 24, albo 25, znamienne tym, że kompozycja przeznaczona jest do stosowania w leczeniu ludzi.

27. Sposób identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów aktywacji lub stymulacji komórek T, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

(a) hoduje się komórki T i komórki CD19 pozytywne, zwłaszcza komórki B, w obecności polipeptydu określonego w zastrz. 1 do 15 i ewentualnie w obecności składnika zdolnego do wytworzenia wykrywalnego sygnału w odpowiedzi na aktywację komórek T składnikiem poddawanym skriningowi w warunkach pozwalają cych na aktywację komórki T; i (b) wykrywa się obecność lub nieobecność sygnału generowanego przez wzajemne oddziaływanie składnika z komórkami.