RS55181B1 - Farmaceutske kompozicije sa rezistencijom na rastvorljivi cea - Google Patents

Description

[0001]Više od trideset godina je prošlo od kada su Gold i Freeđman prvi opisali karcinoembrionalni antigen (CEA) povezan sa tumorom u ekstraktima tkiva kancera humanog debelog creva (Gold and Freeđman; J. Exp. Med. 122 (1965); 467-481). U međuvremenu, otkriveno je 28 drugih gena/pseudogena srodnih CEA familiji gena. U pokušaju pojednostavljenja nomenklature korišćene za članove familije CEA gena, familija je nedavno preimenovana u "CEA-srodne ćelijske adhezione molekule " (CEACAMs) i nomenklatura njenih članova je objedinjena (Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249). Na primer, prema ovoj nomenklaturi, humani CEA (CD66e) je označen CEACAM5. Familija humanog CEA gena je klasterovana na hromozomu 19ql3.2 (Olsen et al. Genomics 23 (1994); 659-668). Njenih 29 gena i pseuđogena može se podeliti u tri podgrupe, tj. CEA podgrupa koja sadrži sedam eksprimiranih gena, podgrupa glikoproteina specifičnog za trudnoću (PSG) koja sadrži jedanaest eksprimiranih gena i treća podgrupa koja sadrži samo pseudogene (Hammarstrom, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249). Analiza aminokiselinskih sekvenci CEA i drugih Članova familije otkrila je da pripadaju superfamiliji imunoglobulina (Ig) (Williams and Barclav, Annul. Rev. Immunol. 6

(1988), 381-405). Svi članovi CEA podgrupe su vezani za površinu ćelijske membrane: glikoprotein žuči (CEACAM1; BGP1; TM-CEA; CD66a), član 1 CEA familije gena (CEACAMS; CGM1; CD66d) i član 7 CEA familije gena (CEACAM4; CGM7) imaju hidrofobne transmebranske domene, dok karcinoembrionalni antigen (karcinoembrionalni antigen-srodni ćelijski adhezioni molekul 5; CEACAM5; CEA; CD66e), nespecifični antigen sa unakrsnom reaktivnošću (CEACAM6; NCA; NCA-50/90; CD66c), član 2 CEA familije gena (CEACAM7; CGM2) i član 6 CEA familije gena (CEACAM8; CGM6; CD66b) su vezani za plazma membranu glikozilfosfatidilinozilol (GPI) lipidnim delovima. CEA proteini su visoko glikozilovani sa molekulskom težinom od do približno 300 kDa, zavisno od broja Ig domena.

[0002]U pogledu biološke aktivnosti CEA proteina, in vitro studije sa linijama tumorskih ćelija sugerisale su da CEA podfamilije uključujući glikoprotein žuči, CEA i nespecifični antigen sa unakrsnom reaktivnošcu mogu delovati kao homofilni i heterotipiĆni ćelijski adhezioni molekuli kada su eksprimirani na površini ćelije tumora (Oikawa et al.. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1992). 881-887: Zhou ei al.. Cancer Res. 53 (1993). 3817-3822). U skorije vreme. razmatrana je uloga CEA i nespecifičnog unakrsno reaktivnog antigena u urođenoj imunoj odbrani koja štiti debelo crevo ođ napada mikroba (Hammarstrom and Baranov, Trends Microbiol. 9 (2001). p. 119-125). Naročito, pretpostavljeno je da se ovi proteini vezuju i zarobljavaju mikroorganizme sprečavajući ih da dostignu i izvrše invaziju epitelnih ćelija mikrovila. |0003] Pretpostavljeno je da je CEA onkofetalni antigen koji je eksprimiran tokom fetusnog života, odsutan kod zdravog adulta i ponovo eksprimiran kod kancera. Međutim, CEA je takođe eksprimiran u normalnom adultnom tkivu. Na primer, glikoprotein žuči. CEA. nespecifični unakrsno reaktivni antigen i član 2 CEA familije gena eksprimirani su u normalnom humanom debelom crevu, naročito u zrelim kolumnarnim epilelijalnim ćelijama okrenutim ka lumenu creva i u visoko diferenciranim ćelijama na ulasku u kripte (Frangsmvr et al., Cancer Res. 55 (1995), 2963-2967: Frangsmvr et al.. Tumor Biol. 20 (1999), 277-292). Specifičnije, ovi proteini su lokalizovani na četkastoj granici glikokaliksa zrelih kolonocita koje ograničavaju slobodnu površinu lumena. Žučni glikoprotein, CEA i nespecifični unakrsno reaktivni antigen su takođe eksprimirani u brojnim tumorima epitelijalnog porekla (Hammarstrom, Sem. Cancer Biol. 9 (1999). 67-81; Shively and Beattv CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399). Već u kasnim 1970-tim i ranim 1980-tim, CEA je postao poželjan ciljni antigen za radioimunolokalizaciju kolorektalnih i drugih epitelnih tumora. Ovo je usled činjenice daje CEA prekomerno eksprimiran u 95% gastrointestinalnih i pankreasnih kancera, kao i kod većine sitnoćelijskih i nesitnoćelijskih karcinoma pluća. Takođe je eksprimiran kod karcinoma dojke i karcinoma skvamoznih ćelija i karcinoma glave i vrata (Primus et al., Cancer 42 (1978), 1540-1545). Zapravo, CEA je jedan od najviše korišćenih kliničkih tumor markera. Korišćen je kao serum tumor marker za kolorektalni i druge kancere usled njegove stabilnosti, njegove relativno ograničene ekspresije u normalnom adultnom tkivu i njegove visoke ekspresije u tumorima epitelijalnog porekla. Najveća masa CEA kod zdrave individue proizvedena je u debelom crevu. Tu je oslobođena iz apikalne površine zrelih kolumnarnih ćelija u lumen creva i nestaje sa fecesom. Sloga, samo veoma niski nivoi se normalno uočavaju u krvi zdravih individua. Na primer, CEA nivoi u krvi zdravih osoba su manji od 2mg/l. Nasuprot tome, CEA nivoi u serumu pacijenata sa kolorektalnim i drugim karcinomima su povećani, sa opsegom od više od 2000 mg/l (Thomson et al., PNAS 64

(1969), 161-167). Naročito, progresivni, maligni, ili kasni stadijumi epitelijalnih tumora često su praćeni sa visokim koncentracijama rastvorljivog (TA u serumu (Fletcher; Ann. Intern. Med. 104 (1986). 66-73). Poznato je da se komponente iz plazma membrane, uključujući CEA. kontinuirano ljušte sa površine kao vezikule izvedene iz plazma membrane (Tavlor and Black, J. Natl. Cancer Inst. 74 (1985). 859-866: Sack ct al.. J Clin Invest. 82 (1988), 586-93) koji preko dreniranja limfnih i krvnih sudova mogu završiti u krvi. Kako se povećava veličina tumora, više CEA će se akumulirati u krvi. Glavna upotreba određivanja CEA u serumu kao tumor markera je u postoperativnom praćenju kancera debelog creva. Povećani nivoi CEA bio je prvi indikator rekurentne bolesti kod 81% (Minton et al., Cancer 55 (1985). 1284-1290) i 89% (Wanebo et al. Surg. Gvnecol. Obstet. 169 (1989). 479-487) pacijenata, respektivno. Serum CEA nivoi se takođe mogu koristiti kao prognostički indikator (Mulcahv and Benson, Curr. Oncol. Rep. 1 (1999). 168-172).

|0004] Usled njegove prekomerne ekspresije u mnogim epitelijalnim kancerima CEA se ne koristi samo kao tumor marker već i kao target za antitumorsku terapiju. Na primer, gastrointestinalni kanceri čine veliki deo humanih epitelijalnih tumora, sa procenjenih 21.700 novih slučajeva kancera želuca i 135.400 novih slučajeva kolorektalnog kancera u Sjedinjenim Državama u 2001 godini (Greenlee; CA Cancer J Clin 51 (2001). 15-36). Kolorektalni kancer je treći najčešći malignitet i treći vodeći uzrok bolesti od kancera i kod muškaraca i kod žena (Ries; Cancer 88 (2000), 2398-2424). U pokušaju da se pronađu novi terapeutici protiv ovih tumora, istraživana su anti-CEA monoklonska antitela kao mogući terapeutici za CEA-pozitivne kancere (Murakami et al., Immunol. Invest. 25 (1996), 23-35). Jedan primer za pristup u kome su pacijenti sa malim tumorskim opterećenjem (što odgovara niskim serum CEA nivoima) uspešno tretirani je studija izvedena od strane Behr et al. U ovom pristupu,<L11>I-obeIežena varijanta labetuzumaba (labetuzumab je humanizovani oblik anti-CEA monoklonskog antitela MN-14; Behr ct al., Cancer, 94: 1373-1381, (2002), 1559-64) analizirana je u fazi II studije u kojoj je uključeno 30 CRC pacijenata sa melastazirajućom bolesti male zapremine hemorefraktorne na 5-fluorouracil i folinsku kiselinu ili u postavci sa aduvansom nakon metastaze u jetri. Data je pojedinačna injekcija<l3l>I-obeleženog labetuzumaba. Od 19 pacijenata koji su se mogli proceniti, 3 je imalo delimične remisije i osam je pokazalo minorne odgovore do 15 meseci trajanja. U postavci sa aduvansom. 7 ođ 9 pacijenata su bili bez bolesti do 3 godine, dok je stopa relapsa u kontrolnoj grupi bila 67% u istom vremenskom periodu. Serum CEA nivoi pacijenata bili su u opsegu od 3.9 - 45 ng/ml (Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, 2002). U drugoj studiji karakterisanoj po pacijentima sa niskim CEA serum nivoima (<5ng/ml), pokazano je da CEA radio-imunoterapija sa<13>'i-labetuzumabom (loc. cit.) poboljšava preživljavanje nakon resekcije metastaza kolorektalnog

kancera u jetri. 23 pacijenata je primilo dozu od 40-60 mCi/m2<ljl>I-labetuzumaba. Petogodišnje preživljavanje bilo je 51.3% za tretirane i 7.4% za kontrolne grupe, respektivno (Liersch et al.. JCO. 2005, ASCO Proc. Vol 23, No 16S: 3627). Ipak,lerapeutski pristupi koji se bave visokim koncentracijama CEA u serumu često su rezultovali u niskom ili bez anti-tumorskog odgovora. Na primer. u kliničkoj studiji izvedenoj da se proceni humanizovano anti-CEA monoklonsko antitelo u kliničkoj, CDR-graflovanoj verziji MN-14 (hMN-14; Sharkey, Cancer Res. 55 (23 Suppl) (1995) 5935s-5945s.) obeleženo je sa<l3l>I. 19 pacijenata sa uznapredovalim CEA-proizvodećim tumorima primili su<131>1 obeleženo hMN-14. Biodistribucija, tumor targeting, i farmakokinetičko ponašanje hMN-14 bilo je slično onom uočenom sa mišjim MN-14. Međutim, pacijenti sa povećanim CEA (> 200 ng/ml) u plazmi imali su više od 30% obeleženog antitela u kompleksu unutar 1 h nakon injekcije. U nekim od ovih pacijenata, povećana komplikacija je rezultovala u poboljšanom metabolizmu antitela sa rapidnijim klirensom iz krvi nego Što je uočeno kod pacijenata sa nižim plazma CEA (Sharkev, loc. cit.). U drugoj studiji faza I izvedenoj od strane Yu et al.,<131>I-obeleženo visoko afinitetno monoklonsko antitelo (mAb) protiv CEA, COL-1 (Muraro, Cancer Res. 45 (1985), 5769-80), istraživano je kod pacijenata sa gastrointestinalnim malignitetima. Naročito, analiziran je uticaj serum CEA i tumorske mase na farmakokinetiku. U tom smislu, 18 pacijenata sa uznapredovalim gastrointestinalnim malignitetima primilo je 20 mg COL-1 obeleženogsa13<1>I, sa dozama od 10 mCi/m<2>do 75 mCi/nr. Serum CEA nivo bio je u opsegu od 6 do 2739 ng/mL (srednja vrednost +/- SD, 500 +/- 639). 82% svih tumorom obuhvaćenih organa bilo je pozitivno i 58% svih lezija. Međutim, ponovo je uočeno da su povećani serum CEA (> 500 ng/mL) i tumorska masa bili u direktnoj korelaciji sa klirensom serum radioaktivnosti. Autori su zaključili da pacijenti sa veoma povišenim nivoima cirkulišućeg CEA i/ili povećanom tumorskom masom uklanjaju<I3I>I-obeleženi COL-1 brže iz cirkulacije (Yu et al., J. Cii. Oncol. 14 (1996), 1798-1809). Slični rezultati su dobijeni u studiji Hajjar et al. sa jod-131~obeleženim humanizovanim MN-14 anti-CEA monoklonskim antitelom kod pacijenata sa metastaziranim gastrointestinalnim i kolorektalnim kancerom. U ovoj fazi I studije, 21 pacijent ili nakon prethodne eksterne radijacione terapije ili nakon standardne hemoterapije tretirani su sa antitelom. 7 od 21 pacijenta imalo je humana anti-humana antitela (HAHAs). ali ne štetne efekte. Nije uočen antitumorski odgovor. Ponovo je pronađeno da povišeni plazma nivoi CEA povećavaju klirens antitela iz krvi i celog tela (Hajjar et al., Clin Colorectal Cancer, 2 (2002), 31-42) koji najmanje delimično mogu obezbediti objašnjenje nedostatka anti-tumorskog odgovora u ovoj studiji. Fenomen rapidnog klirensa terapeutskog antitela iz krvi i tela može se objasniti povećanim formiranjem imunih kompleksa koji se moraju brzo ukloniti iz tela da bi se sprećilo oštećenje organa. Nije se mogao uočiti terapeutski efekat kod pacijenata sa tumorom koji su uključeni u ove studije, najverovatnije usled rapidnog klirensa monoklonskih antitela. Kontermann (2005), Acta Pharmacologica Sinica Vol. 26, No. 1, 1-9 opisuje različita bispecifična CD3xCEA antitela. EP 491031 obezbeđuje CDR-graftovana CEA antitela. Da bi se prevazišli problemi izazvani formiranjem imunog kompleksa i rapidnog klirensa terapeutskih monoklonskih antitela koji su najverovatnije posredovani sa Fc delom antitela prepoznatih sa Fc receptorima imunih ćelija, u klinici su proizvedeni i analizirani derivati antitela (npr. scFv konstrukti) ili fragmenti (npr. Fab i Fab2 fragmenti) bez Fc dela. Većina ovih studija usmereni su na vizuelizaciju i detekciju/lokalizaciju tumora (videti npr. Chester et al., Cancer Chemother Pharmacol, 46

(2000) Suppl: S8-12; Maver et al., Clin Cancer Res, 6: (2000) 1711-1719; Begent et al.. Nat Med, 2 (1996): 979-984). Samo nekoliko studija je ispitivalo terapeutsku efikasnost takvih derivata/fragmenata na klinici. Na primer, u kliničkom pristupu od strane Francis et al.

(Francis, Br. J. Cancer 87(6) (2002), 600-607) proučavana je anti-tumorska aktivnost scFv-karboksipeptidaza konstrukta. U ovoj fazi I studije, antitelo usmerena enzimska prolek terapija (ADEPT) korišćena je kod pacijenata sa uznapredovalim korlorektalnim karcinomom ili drugim CEA proizvodećim tumorima. U tom smislu, A5CP, koji se sastoji od F(ab)2 fragmenta mišjeg monoklonskog antitela na CEA (A5B7) vezanog sa bakterijskim enzimom karboksipeptidazom (CPG2) kao antitelo-enzim targeting agens i ZD2767P. korišćen je prolek bis-jodo fenol iperit. Kao rezultat, u studiji nisu uočeni klinički ili radiološki odgovori. Nivoi serum CEA pre tretmana bili su u opsegu do 1000 ng/ml. Ove visoke koncentracije CEA u serumu tretiranih pacijenata sa tumorom mogu najmanje delimično biti odgovorne za izostanak antitumorskog odgovora uočenog u ovoj studiji.

|0005]U smislu prethodno datih problema, obezbcđivanje sredstava i postupaka za efikasne terapeutike za progresivne, maligne, ili kasne stadijume epitelijalnih tumora je veoma poželjno.

[0006]Shodno tome, jedan aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju, gde pomenuta farmaceutska kompozicija sadrži bispecifiČno jednolančano antitelo koje ima (a) prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CD3. i

(b) drugi vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CEA.

gde pomenuti vezujući domen specifičan za CEA sadrži

(i) CDR-H1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "SYWMII" (SEQ ID NO. 68), CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 67), CDR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73), CDR-L2 koji

ima aminokiselinsku sekvencu "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) i CDR-L3 koji ima aminokiselinsku sekvencu "MIV/HSGASAV" (SEQ IDNO. 71); (ii) CDR-H1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "SY\VMH" (SEQ ID NO. 68). CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "FILNKANGGTTE YAASVKG" (SEQ ID NO. 145), CDR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73). CDR-L2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) i CDR-L3 koji ima aminokiselinsku sekvencu "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO. 71); ili (iii) CDR-H1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TYAMH" (SEQ ID NO. 70), CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "LISNDGSNKYYADSVKG" (SEQ ID NO. 69). CDR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73). CDR-L2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) CDR-L3 koji ima aminokiselinsku sekvencu "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO. 71); i gde pomenuti drugi vezujući domen sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu "DX|X2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65), gde "Xi". "X2", "X3" ili "X4" predstavlja bilo koji aminokiselinski ostatak, i aminokiselinski ostatak "D" odgovara Kabat poziciji 95 CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 i aminokiselinski ostaci "FYFDY" odgovaraju Kabat pozicijama 100, 100a. 100b, 101, i 102, respektivno. CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7. U jednom primeru izvođenja, "Xf predstavlja "R" (Arginin). "F" (Fenilalanin), "M" (Metionin), "E"

(Glutaminska kiselina), ili "T" (Treonin); "X2" predstavlja "G" (Glicin), "Y" (Tirozin), "A"

(Alanin), "D" (Asparaginska kiselina), ili "S" (Serin); "Xy predstavlja "L" (Leucin), "F"

(Fenilalanin), "M" (Metionin), "E" (Glutaminska kiselina), ili "T" (Treonin); i "X4" predstavlja "R" (Arginin). "Y" (Tirozin), "A" (Alanin), "D" (Asparaginska kiselina), ili "S"

(Serin).

[0007] U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije pronalaska, pomenutu drugi vezujući domen specifičan za humani CEA ovde opisanog bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) koja odgovara Kabat pozicijama 95- 102 CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7.

[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje sredstva i postupke naročito pogodne za tretman pacijenata sa epitelijalnim tumorom sa visokim koncentracijama rastvorljivog CEA u njihovoj plazmi. Takve visoke koncentracije rastvorljivog CEA su pronađene u serumu/plazmi pacijenata sa epitelijalnim tumorom sa progresivnim tumorima, rekurentnim. metastazirajućim, tumorima kasnog stadijuma i za pacijente sa visokim tumorskim opterećenjem. Pronađeno je da se bispecifična jednolančana antitela sa CEA vezujućim domenom koja sadrže aminokiselinsku sekvencu "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) ne samo vezuju za CEA-pozitivne target ćelije, već takođe za rastvorljivi CEA; \ kleti Primer 3 i Sliku 2 ovog pronalaska; i EP BI 491031. Naznačena aminokiselinska sekvenca "DRGLRFYFDY" odgovara Kabat pozicijama 95 - 102 (SEQ ID NO. 66) CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 (Harwood. Br J Cancer. 54 (1986). 75-82). Iznenađujuće, iako se vezuju za rastvorljivi CEA, pomenuta bispecifična jednolančana antitela ubijaju CEA-noseće tumorske ćelije. Čak i u prisustvu visokih koncentracija rastvorljivog CEA (do 1 mg/ml rastvorljivog CEA je testirano). Drugim rečima. pomenuti bispecifični konstrukti nisu inhibirani rastvorljivim CEA u pogledu njihove citotoksične aktivnosti protiv CEA-pozitivnih tumorskih ćelija. Kao stoje prikazano u sledećim Primerima 5 i 8 (u kombinaciji sa Slikama 5, 6, 8, 10, 19. 20, 22 i 27), bispecifična jednolančana antitela sa CEA vezujućim domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu "DRGLRFYFDY" posredovala su u citotoksičnosti prema CEA-pozitivnim tumorskim ćelijama, u prisustvu čak i visokih koncentracija rastvorljivog CEA. Na primer. Slika 10 prikazuje citotoksični test CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata preusmerenih na Kato III ćelije (humana CEA-pozitivna ćelijska linija karcinoma želuca) u prisustvu rastućih količina rastvorljivog CEA antigena. Stimulisane humane CD8 pozitivne citotoksične T ćelije (CTLs) korišćene su kao efektorske ćelije. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-posredovana cilotoksičnost je rezistentnana rastvorljivi CEA. Nasuprot tome, CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-posredovana citotoksična aktivnost inhibirana je rastućim količinama rastvorljivog CEA. CEAI je varijabilni region izveden iz mišjeg mAb A5B7. dok je CEAII VFIVL izveden iz mAb T84.66. Važno je da je pronađeno da je aminokiselinska sekvenca "DRGLRFYFDY" dovoljna da posreduje u rezistenciji na rastvorljivi CEA kada se koristi u humanom CEA-vezujućem domenu (tj. humani vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CEA) anti-CEAxanti-CD3 bispecifičnih jednolančanih antitela; videti npr. Slike 19, 20, 22 i 27. U sleđećem, ovde opisana bispecifična jednolančana antitela su stoga označena kao rezistentna na rastvorljivi CEA antigen. Termin "rezistencija na rastvorljivi CEA antigen", "rezistentan na rastvorljivi CEA" ili srodni termini kao šio je ovde korišćeno odnose se na činjenicu da na citotoksičnost protiv CEA-pozitivnih target ili tumorskih ćelija posredovana pomenutim bispecifičnim jednolančanim antitelima ne utiču rastuće koncentracije rastvorljivog CEA. Naročito, citotoksična aktivnost nije inhibirana ni čak sa visokim koncentracijama rastvorljivog CEA (do 1 mg/ml je testirano). Kao što je prethodno dato. CEA nivoi u krvi zdravih individua su manji od 2ng/ml. Visoke koncentracije rastvorljivog CEA u serumu/plazmi pacijenata sa tumorom su karakteristične za progresivne, rekurentne, metastazirajuće, ili kasne stadijume tumora i za pacijente sa visokim tumorskim opterećenjem. Stoga, ovaj pronalazak obezbeduje sredstva i postupke nariočito pogodne za tretman pacijenata sa epitelijalnim tumorima sa tako visokim koncentracijama rastvorljivog CEA u njihovoj plazmi. Termin "visoke koncentracije rastvorljivog CEA" kao što je ovde korišćeno označava koncentraciju rastvorljivog CEA u serumu/plazmi koje su više od 10, 20. 50, 70, 80, 90 ili 100 ng/ml. Ove serum/plazma-CEA koncentracije mogu se odrediti, između ostalog, sa ELISA. Poželjno, pomenuta koncentracija rastvorljivog serum/plazma-CEA je veća od 100 ng/ml, kao što je određeno sa npr. ELISA.

[0009] Stvaranje pomenutih bispecifičnih jednolančanih antitela sa rezistencijom na ratsvorljivi CEA antigen nije bio jednostavan zadatak, kao što je očigledno iz sledećih Primera. Na primer, nisu se mogla proizvesti bispecifična jednolančana antitela sa CEA vezujućim domenima izvedena iz monoklonskog antitela (mAb) za koja je poznato da vezuju membranski vezan CEA, ali ne rastvorljivi CEA. tj. mAb PRI A3 (Durbin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (1994), 4313-7): Kada se koriste u formatu bispecifičnog jednolančanog antitela, nije se mogla postići ekspresija/sekrecija anti-CD3xanti-CEA bispecifičnim jednolančanim konstruktom. Kada je za generisanje upotrebljena humanizovana verzija PRI A3 (Durbin, loc. cit.), konstrukt bispecifičnog jednolančanog antitela bio je eksprimiran i izlučen iz ćelije domaćina. Međutim, nije se moglo dobiti vezivanje anti-CEA vezujućeg domena sa membranski vezanim CEA. Kada su generisana bispecifična jednolančana antitela izvedena iz dobro opisanih monoklonskih antitela T84.66 (Neumaier. M. et al., Cancer Res 50 (1990), 2128-34) ili MFE-23 (Boehm, M. K. Biochem J 2 (2000). 519-28), ova bispecifična antitela bila su visoko senzitivna na rastvorljivi CEA antigen, tj. njihova citotoksična aktivnost protiv CEA-pozitivnih target ili tumorskih ćelija je blokirana u prisustvu rastvorljivog CEA antigena. Kako je pronađeno da se pomenuti konstrukt vezuje za rastvorljivi CEA, zaključeno je da rastvorljivi CEA antigen sprečava antitelo za vezivanje membranski vezanog CEA, čime se blokira antitelo-posredovana citotoksična aktivnost. Na primer. Slika 7 prikazuje citotoksični test CEA-reaktivnog bispecifičnog jednolančanog konstrukta preusmerenog na CHO ćelije transficirane sa CEA u prisustvu rastvorljivog humanog CEA. Stimulisane humane CD8 pozitivne citotoksične T ćelije (CTLs) su korišćene kao efektorske ćelije. Citotoksična aktivnost CEAII VHVLxSEQ ID N0.77 VHVL je jasno inhibirana sa rastućim količinama rastvorljivog CEA. CEAII VHVL je izveden iz mAb T84.66: SEQ ID N0.77 je anti-CD3 VH-VL domen. Rezistencija na rastvorljivi CEA antigen može se naći samo za bispecifična jednolančana antitela, čiji CEA vezujući domen ima aminokiselinsku sekvencu "DRGLRFYFDY" CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 (Harvvood, Br J Cancer. 54

(1986), 75-82). Kao za MFE-23- i T84.66-izvedene bispecifične jednolančane konstrukte.

A5B7-izvedena bispecifična jednolančana antitela vezuju se za rastvorljivi CEA. U svetlu rezultata dobijenih za MFE-23- i T84.66-izvedene bispecifične jednolančane konstrukte, nije se moglo očekivati da rastvorljivi CEA ne utiče na citotoksičnu aktivnost kod A5B7-izvedenih konstrukata jednolančanih bispecifičnih antitela.

[0010] Kao što je dato prethodno, mnogi terapeutski pristupi usmereni protiv CEA-nosećih epitelijalnih tumora kod ljudi su ozbiljno otežani prisustvom visokih nivoa rastvorljivog CEA antigena u plazmi pacijenata sa kancerom. Na primer, povećano formiranje imunog kompleksa i klirensa terapeutskih anti-CEA monoklonskih antitela u prisustvu visokih koncentracija CEA u plazmi uočeno je u nekoliko kliničkih studija. Dodatno, rastvorljivi CEA antigen - često prisutan u visokim koncentracijama u serumu pacijenata sa kancerom sa progresivnim tumorima, rekurentnim kancerom. metastazirajućim tumorima, visokim opterećenjem tumorom, ili kasnim stadijumima tumora - blokira terapeutike usmerene protiv CEA-pozitivnih tumorskih ćelija, stoga sprečavajući prepoznavanje i destrukciju tumorskih ćelija. Stoga, stvarna količina terapeutika koji dostiže tumor je smanjena, što rezultuje u smanjenom, niskom ili čak izostanku anti-tumorske aktivnosti. Ovo ograničenje onemogućava npr. antitelo-zasnovane pristupe na one pacijente sa veoma niskim količinama rastvorljivog CEA antigena sa malo verovatnim sprečavanjem interakcije terapeutik-tumorska ćelija. U ovom pronalasku, nađeno je da je moguće generisati bispecifična jednolančana antitela-terapeutike sa specifičnošću za humani CD3 i humani CEA, gde je citotoksična aktivnost usmerena protiv tumorskih ćelija rezistentna na čak visoke koncentracije rastvorljivog CEA antigena (do Img/ml rastvorljivog CEA je testirano). Ovaj nalaz je potpuno neočekivan u pogledu Činjenice da se bispecifična jednolančana antitela pronalaska vezuju za rastvorljivi CEA antigen (videti Primer 3 i Slika 2 ovog pronalaska; videti takođe EP BI 491031). Ipak, ovde dcfinisana bispecifična jednolančana antitela su potpuno rezistentna na prisustvo čak visokih nivoa rastvorljivih CEA u svojoj citotoksičnoj aktivnosti prema tumorskim ćelijama. Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje sredstva i postupke naročito pogodne za tretman pacijenata sa tumorom sa visokim koncentracijama rastvorljivog CEA u njihovoj plazmi, kao što je uočeno npr. tokom progresije tumora, za rekurentni kancer, za metastaze, za pacijente sa visokim tumorskim opterećenjem, kasnijeg stadijuma tumora.

[0011] U skladu sa ovim pronalaskom, termin "farmaceutska kompozicija" odnosi se na kompoziciju za primenu na humanog pacijenta. Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži kompoziciju za parenteralnu, transdermalu, intraluminalnu, intraarterijalnu, intratekalnu i/ili intranazalnu primenu ili direktno injekcijom u tkivo. Naročito je predviđeno daje pomenuta kompozicija primenjena na pacijenta preko infuzije ili injekcije. Primena pogodnih kompozicija može se izvesti na različite načine, npr.. intravenskom, intraperitonealnom. polkožnom. intramuskularnom, topiklanom ili intradermalnom primenom. Kompozicija ovog pronalaska može dalje sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su dobro poznati u tehnici i uključuju fosfatno puferovani fiziološki rastvor, vođu, različite tipove ovlaživača. sterilnih rastvora, lipozoma, itd.. Kompozicije koje sadrže takve nosače mogu se formulisati doboro poznatim konvencionalnim postupcima. Ove kompozicije se mogu primeniti na subjekta u pogodnoj dozi koja se može odrediti npr. studijama sa povećanjem doze primenom rastućih doza bispecifičnog jednolančanog antitela koje pokazuje rezistenciju na ovde opisani rastvorljivi serum CEA antigen. Kao što je prethodno dato. ovde opisano bispecifično jednolančano antitelo sa rezistencijom na rastvorljivi serum CEA antigen može se pogodno koristiti u tretmanu pacijenata sa kancerom sa visokim koncentracijama CEA u serumu, kao što su progresivni tumori, rekurentni kancer. metastazi raj ući tumori, visoko tumorsko opterećenje, ili kasniji stadij umi tumora. Ove kompozicije se takođe mogu primeniti u kombinaciji sa drugim prtoeinskim ili neproteinskim lekovima, npr. u obliku ko-terapije. Ovi lekovi se mogu primeniti simultano sa kompozicijom koja sadrži ovde opisano bispecifično jednolančano antitelo ili odvojeno pre ili posle primene pomenutog bispecifičnog antitela u vremenski defmisanim intervalima i dozama. Dozni režim će determinisati odgovorni lekar i klinički faktori. Kao što je poznato u medicini, doze za bilo kog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, određenog jeđinjenja koje se primenjuje, pola, vremena i puta primene. opšteg zdravlja, i drugih lekova koji se istovremeno primenjuju. Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, i suspenzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol. polietilen glikol, biljna ulja, i injektabilni organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, vodene rastvore, ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferisane medijume. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringer-ovu dekstrozu, dekstrozu i natrij um hlorid. ili Ringer-laktat. Intravenski nosači uključuju sredstva za obnavljanje tečnosti i hranijivih materija, sredstva za obnavljanje elektrolita (kao što su oni zasnovani na Ringer-ovoj dekstrozi), i slično. Konzervansi i drugi aditivi mogu biti prisutni kao što su. na primer, antimikrobna sredstva, anti-oksidanti, helatirajući agensi, inertni gasovi i slično. Dodatno, kompozicije ovog pronalaska mogu sadržati proteinske nosače, kao što su, npr., serum albumin ili imunoglobulin, poželjno humanog porekla. Predviđeno je da ko-lerapija sadrži, kao dodatak bispecifičnom jednolančanom antitelu kao što je ovde definisano dodatne biološki aktivne agense, zavisno od nameravane upotrebe kompozicije. Takvi agensi mogu biti lekovi koji deluju na gastrointestinalni sistem, lekovi koji deluju kao antineoplastični agensi, hemoterapeutici. citostatici. lekovi koji sprečavaju hiperurikemiju. lekovi koji inhibiraju imunoreakcije (npr. kortikosteroidi). lekovi koji moduiišu inflamatorni odgovor, lekovi koji deluju na cirkulatorni sistem i/ili agensi kao što su citokini poznati u tehnici. Poželjno, bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano je formulisano u puferu, stabilizatoru i surfaktantu. Pufer može biti fosfatni, citratni, sukcinatni ili acetatni pufer. Stabilizator može biti aminokiselina(e) i/ili šećer. Surfaktanti mogu biti deterdženti, PEGs, ili slično. Poželjnije, bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano je formulisano u citratu. lizinu, trehalozi i Tvveen 80. Kao razblaživač farmaceutske kompozicije pronalaska, poželjan je izotonični fiziološki rastvor i Tween 80.

[0012] Kao što je ovde korišćeno, "bispecifično jednolančano antitelo" označava jedan polipeptidni lanac koji sadrži dva vezujuća domena. Svaki "vezujući domen" kao sto je ovde korišćeno sadrži jedan varijabilni region iz teškog lanca antitela ("VH region"). gde se VH region prvog vezujućeg domena specifično vezuje za pomenuti prvi molekul. tj. humani CD3 molekul, i VH region drugog vezujućeg domena specifično vezuje za humani CEA, kao što je detaljnije dato u nastavku. Dva vezujuća domena su izborno međusobno povezana kratkim polipeptidnim spejserom koji generalno sadrži 5 aminokiselina. Svaki vezujući domen može dodatno sadržati jedan varijabilni region iz lakog lanca antitela ("VL region"), VH region i VL region unutar svakog od prvog i drugog vezujućeg domena međusobno su povezani preko polipeptidnog linkera, na primer tipa opisanog i za koji je tražena zaštita u EP BI 623679, ali u svakom slučaju dovoljno dugačkog da omogući da se VH region i VL region prvog vezujućeg domena i VH region i VL region drugog vezujućeg domena međuspbno upare tako da su, zajedno, sposobni da sc vezuju za respektivne prve i druge molekule. Raspored V regiona prvog i drugog vezujućeg domena može biti VH-VL ili VL-VH. Poželjno, raspored prvog vezujućeg domena koji se specifično vezuje za humani CD3 je VH-VL, kao što je prikazano u sledećim Primerima. Predviđeno je da prvi vezujući domen može biti lociran N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na drugi vezujući domen. Stoga, raspored vezujućih domena bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde može biti VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3, VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3. VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA ili VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA. Poželjno, pomenuti prvi vezujući domen specifičan za CD3 lociranje C-terminalno u odnosu na drugi vezujući domen. Poželjnije, vezujući domeni bispecifičnih jednolančanih antitela definisani ovde su rapoređeni po ređosledu VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 ili VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3. Još poželjnije, raspored je VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3. Najpoželjniji je konstrukt bispecifičnog jednolančanog antitela A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO. 77 VHVL kao što je definisan u SEQ ID NO. 34. Predviđeno je da prvi i/ili drugi vezujući domeni bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde mogu biti ne-humanog porekla (tj. izvedeni iz ne-humanih sekvenci). Na primer. pomenuti prvi i/ili drugi vezujući domeni mogu biti izvedeni iz mišjih monoklonskih antitela. Međutim, bispecifična jednolančana antitela izvedena iz mišjih antitela mogu biti prepoznata kao strana, kada se primenjuju na humane pacijente. Stoga, pomenuti prvi i/ili drugi vezujući domeni bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde su poželjno humanog porekla (tj. izvedena iz humanih sekvenci). Takvi humani vezujući domeni koji se specifično vezuju sa CEA ili CD3 mogu se identifikovati npr. sa tehnikama zasnovanim na fagnom prikazu. Takođe je predviđeno da je npr. VH region prvog (ili drugog) vezujućeg domena humani VH region, dok odgovarajući VL region prvog (ili drugog) vezujućeg domena može biti ne-humanog porekla. Takvi vezujući domeni mogu se takođe označiti kao himerni vezujući domeni. Ili jedan od pomenutih vezujućih domena je ne-humanog porekla, dok je drugi humanog porekla, rezultujući u himernom bispecifičnom jednolančanom antitelu. Pomenuti prvi i/ili drugi vezujući domeni mogu biti dodatno modifikovani da bi se smanjila imunogenost bispecifičnog jednolančanog antitela opisanog ovde. kada se primenjujc na humane pacijente. Na primer, najmanje jedan od pomenutog prvog ili drugog vezujućeg domena bispecifičnog jednolančanog antitela definisanih ovde može biti humanizovan, CDR-graftovan, himerni i/ili deimunizovani ili humani, kao što je mnogo detaljnije dato u nastavku. Takođe je predviđeno da je polipeptidni linker koji povezuje VH i VL region unutar prvog i/ili drugog vezujućeg domena je deimunizovan. Poželjno, polipeptidni linker koji povezuje VH i VL region unutar deimunizovanog prvog vezujućeg domena (specifičnog za CD3) je deimunizovani polipeptidni linker koji ima sekvencu "GEGTSTGS(G2S)2GGAD" (SEQ ID NO. 141). Dodatno je predviđeno, da jedan ili oba od pomenutih vezujućih domena bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde nosi takozvane "tagove" koji se mogu koristiti npr. za ekspresiju proteina, prečišćavanje, detekciju ili obogaćivanje, kao što su Flag-tagovi, c-myc-tagovi, GST-tagovi ili His-tagovi. Na primer, za Flag-tag najviše upotrebljavani hidrofilni oktapeptid sada je DYKDDDDK (Chubet and Brizzard. Biotechniques 20

(1996): 136-141) iako nedavne studije sugerišu da kraći peptid. DYKD, može biti prepoznat sa skoro istoim afinitetom od sirane Ml monoklonskog antitela (Knappik A. Pluckthun A; Biotechniques 17 (1994):754-761). Flag-tagovi. c-myc-tagovi. GST-tagovi, His-tagovi ili slični mogu biti pozicionirani na N-terminusu ili C-lerminusu bispecifičnih jednolančanih antitela kao što je, na primer, tag-VHCEA-VLCEA-VHCD3-VL.CD3 ili VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3-tag. Izvori za i karakteristike takvih tagova za svrhe ekspresije, detekcije ili prečišćavanja su dobro opisani u tehnici; videti npr. Lichlv, Protein Expr Purif. 41 (2005), 98-105. |0013]Kao što je ovde korišćeno, termin "jednolančani Fv" ili "scFv" odnosi se na fragmente antitela koji sadrže VH i VL domene antitela. gde su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Varijabilni domeni mogu biti raspoređeni u redosledu VH-VL ili VL-VH. Generalno, Fv polipeptid dodatno sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv videti Pluckthun in The Pharmacologv of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York. pp. 269-315 (1994). U specifičnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na anti-CEA scFvs izvede iz bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde.

[0014]Prema ovom pronalasku, termin "vezujući domen" ili "varijabilni region" korišćen u kontekstu sa Ig-izvedenom interakcijom sa antigenom sadrži fragmente i derivate polipeptida koji najmanje sadrže jedan CDR izveden iz antitela, fragmenta antitela ili njihovih derivata. Pronalaskom je predviđeno, da drugi vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CEA bispecifičnog jednolančanog antitela definisanog ovde sadrži najmanje jedan CDR, poželjno CDR-H3, poželjno deo CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7 sa aminokiselinskom sekvencom "FYFDY" (SEQ ID NO. 112) koja odgovara Kabat pozicijama 100, 100a, 100b, 101, i 102, respektivno, CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7; još poželjnije sa aminokiselinskom sekvencom "DX1X2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65), gde "Xi", "X2<M>, "X:," ili "X4" predstavlja bilo koji aminokiselinski ostatak, a aminokiselinski ostatak "D" odgovara Kabat poziciji 95 CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7 i aminokiselinski ostaci "FYFDY" odgovaraju Kabat pozicijama 100. 100a. 100b, 101, i 102, respektivno, CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7. Predviđeno je da "Xi". "X2", "X3" or "X4" odgovaraju Kabat pozicijama 96 ("Xi"), 97 ("X2"). 98 ("X3") i 99 ("X4"), respektivno, CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7, predstavljaju aminokiselinski ostatak "R" (Arginin), "G" (Glicin). "L" (Leucin), "Y" (Tirozin). "A" (Alanin), "D"

(Asparaginska kiselina), "S" (Serin), "W" (Triptofan). "F" (Fenilalanin) ili "T" (Treonin). Ovde, isključeno je iz obima pronalaska da "Xi", "X2". "X3" i "X4" predstavljaju istu aminokiselinu, npr. da "Xi", "X2", "X3" i "X4" su svi "F" (Fenilalanin). Poželjno, "Xi" predstavljaju "R" (Arginin). "F" (Fenilalanin), "M" (Metionin), "E" (Glutaminska kiselina), ili "T" (Treonin); "X2" predstavlja "G" (Glicin), "Y" (Tirozin). "A" (Alanin). "D" (Asparaginska kiselina), ili "S" (Serin); "X3" predstavljaju "L" (Leucin), "F" (Fenilalanin). "M" (Metionin),

"R" (Glutaminska kiselina), ili "T" (Treonin); i "X4" predstavlja "R" (Arginin). "Y" (Tirozin). "A" (Alanin). "D" (Asparaginska kiselina), ili "S" (Serin). Ili najpoželjnije drugi vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CEA bispecifičnog jednolančanog antitela definisanog ovde sadrži kompletni CDR-H3 iz A5B7 sa aminokiselinskom sekvencom "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) koja odgovara Kabat pozicijama 95 - 102 CDRH3 iz A5B7. Kao što je pokazano u sledećim Primerima. citotoksična aktivnost bispecifičnog jednolančanog antitela definisanog ovde koje sadrži pomenutu mAb A5B7-izvedenu CDR-H3 "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) aminokiselinsku sekvencu u drugom vezujućem domenu koji interaguje sa CEA protiv tumorskih ćelija rezistentna je na rastvorljivi CEA antigen, čime je omogućen tretman pacijenata sa tumorom sa visokim koncentracijama serum CEA u njihovoj plazmi. Određivanje CDRs je poznalo stručnjacima; videti npr. http://vAvw.bioinf.org.uk/abs/#cdrid. Numerisanje aminokiselinskih sekvenci u antitelima može se izvesti npr. prema Kabat šemi numerisanja opisanoj u tehnici; videti npr. Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, anđ C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine.

[0015]Najpoželjnije i kao što je dokumentovano u priključenim primerima, "bispecifično jednolančano antitelo" koje se upotrebljava u farmaceutskoj kompozicji pronalaska je bispecifični jednolančani Fv (scFv) sa deimunizovanim anti-CD3 vezujućim domenom (WO 2005/040220) i humanim anti-CEA vezujućim domenom koji sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu "DRGLRFYFDY" koja odgovara Kabat pozicijama 95 - 102 (SEQ ID NO. 66) CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7. Bispecifični jednolančani molekuli poznati su u tehnici i opisani su npr. u WO 99/54440 ili Mack, PNAS, (1995), 92. 7021-7025.

[0016]Termin "jednolančani" kao što je korišćeno u skladu sa ovim pronalaskom označava da su pomenuti prvi i drugi vezujući domen bispecifičnog jednolančanog konstrukta kovalentno vezani, poželjno u obliku kolinearne aminokiselinske sekvence koja se može kodirati jednim molekulom nukleinske kiseline.

[0017]Kao što je ovde korišćeno, "humano" se odnosi na vrstuHomo sapiens."Humani" molekul, npr. humani CEA ili humani CD3 (CD3 epsilon). je stoga varijanta tog molekula kao što je prirodno eksprimiran uHomo sapiens.

[0018]Termin "epitelijalni tumor" kao što je ovde korišćeno označava tumor epitelijalnog porekla koji je CEA pozitivan (Cancer Medicine; 6th ed.; Kufe, Donald W.; Pollock. Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C, Jr.; Gansler, l ed S.; Flolland. James F.; Frei III. Emil. editors. Hamilton (Canada): BC Decker Inc. 2003; http://wvw.dkfz.de; http:// www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.himl). Epitelijalni tumor koji treba tretirati može biti gastrointestinalni adenokarcinom. adenokarcinom dojke ili adenokarcinom pluća. Pomenuti gastrointestinalnni adenokarcinom je poželjno kolorektalni, pankreasni, ezofagijalni ili adenokarcinom želuca. Kao što je ovde đato, farmaceutska kompozicija pronalaska je naročito pogodna za tretman pacijenata sa progresivnim tumorima, metastazama, rekurentnim kancerom. kasnim sladijumom epitelijalnog tumora, visokim opterećenjem epitelijalnog tumora, ili pacijenata sa tumorom sa koncentracijama CEA u serumu većim od 100 ng/ml (kao Što je određeno npr. sa ELISA), karakteri san im visokim nivoima rastvorljivog CEA antigena u plazmi pacijenata sa tumorom. Takođe je unutar obima pronalaska da je pomenuta farmaceutska kompozicija korišćena nakon hirurškog uklanjanja primarnog tumora. Na primer. diseminirane rezidualne tumorske ćelije izvedene iz ćelija epitelijalnog tumora koje proizvode CEA takođe odbacuju CEA u njihove mikrosredine. Stoga, u okruženjima ovih tumorskih ćelija nivo rastvorljivog CEA je takođe visok. Shodno tome. rezistencija na rastvorljivi CEA citotoksične aktivnosti farmaceutskih kompozicija pronalaska predstavlja prednost takođe za tretman minimalne rezidualne bolesti. Predviđeno je da se pomenute farmaceutske kompozicije mogu primeniti u periodu u kome se smanjuju nivoi serumskog CEA (usled uklanjanja izvora CEA, tj. primarnog tumora) da bi se ubile preostale ćelije tumora. Farmaceutske kompozicije mogu takođe biti korisne nakon uklanjanja primarnog tumora, u slučaju da se serum CEA nivoi povećavaju usled formiranja sekundarnih tumora ili metastaza. Koncentracija CEA u serumu može se odrediti npr. sa CEA ELISA testovima (videti npr. IBL CEA EIA, IBL Hamburg. Germanv). Kao što je prethodno đato, u mnogim antitelo-zasnovanim terapeutskim pristupima, Pomenuti serum CEA inhibira vezivanje antitela za membranski vezan CEA na tumorskim ćelijama i blokira aktivnost antitela, time pogoršavajući uspeh anti-tumorske terapije.

[0019] Kao što je ovde korišćeno, termin "specifično se vezuje" ili srodni izrazi kao što je "specifično vezuje" ili "specifična reaktivnost sa'prema" itd. odnosi se na sposobnost prvog i/ili drugog vezujućeg domena bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde definisano da razlikuje respektivni prvi i/ili drugi molekul do tog stepena da, iz pula brojnih različitih molekula kao potencijalnih vezujućih partnera, samo pomenuti respektivni prvi i/ili drugi molekul je/su vezani, ili je/su značajno vezani. Takva merenja vezivanja mogu se rutinski izvesti npr. na Biacore aparatu, sa ELISA. FACS analizom ili slično. Specifičnije, prvi vezujući domen bispecifičnog jednolančanog antitela kao sto je ovde definisano vezuje se za humani CD3. poželjno humani CD3 epsilon. Drugi vezujući domen bispecifičnih jednolančanih antitela kao što su ovde definisana vezuje se za antigen epitelijalnog tumora, tj. humani CEA (karcinoembrionalni antigen, karcinoembrionalni antigen-srodni ćelijski adhezioni molekul 5; CEACAM5; CD66e). kao što je dato u nastavku. Termin "specifično se vezuje" označava u skladu sa ovim pronalaskom da je molekul bispecifičnog jednolančanog antitela sposoban da specifično interaguje sa i/ili da se vezuje za najmanje dva. tri. Četiri, pet, šest, sedam, osam ili čak više aminokiselina svakog od humanih target molekula kao što je ovde definisano. Pomenuti termin se odnosi na specifičnost molekula antitela, tj. njegovu sposobnost da napravi razliku između specifičnih regiona humanog target molekula kao stoje ovde definisano. Specifična interakcija mesta-interakcije-sa-antigenom sa njegovim specifičnim antigenom može rezultovati u inicijaciji signala, npr. usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena, itd. Dodatno, primer pomenutog vezivanja može biti specifičnost po "principu ključa i brave". Stoga, specifični motivi u aminokiselinskoj sekvenci mesta-interakcije-sa-antigenom i antigeni se međusobno vezuju kao rezultat njihove primarne, sekundarne ili tercijarne strukture kao i rezultat sekundarnih modifikacija pomenute strukture. Specifična interakcija mesta-interakcije-sa-antigenom sa njegovim specifičnim antigenom može takođe rezultovati i u vezivanju pomenutog mesta sa antigenom. "Specifično vezivanje" antitela je karakterisano primarno sa dva parametra: kvalitativnim parametrom (vezujući epitop. iligdese anittelo vezuje) i kvantitativni parametar (afinitet vezivanja, ilikoliko snažnose vezuje na mestu vezivanja). Koji epitop je vezan sa antitelom se može pogodno odrediti npr. poznatom FACS metodologijom, peptiđ-spot mapiranjem epitopa, masenom spektroskopijom ili peptidnom ELISA. Snaga kojom se antitelo vezuje za određeni epitop može se pogodno odrediti npr. poznatim Biacore i/ili ELISA metodologijama. Kombinacija takvih tehnika omogućava izračunavanje signal:šum odnosa kao reprezentativne merc specifičnosti vezivanja. U takvom signakšum odnosu, signal predstavlja snagu vezivanja antitela za epitop od interesa, dok šum predstavlja snagu vezivanja antitela za druge, nesrodne epitope koji se razlikuju od epitopa od interesa. Poželjno, signakšum odnos za epitop od interesa koji je oko 50-puta veći nego za druge epitope različite od epitopa od interesa može se uzeti kao indikacija da se procenjivano antitelo vezuje za epitop od interesa na specifičan način, tj. "specifično se vezuje". Termin "specifično vezivanje" ili "specifična interakcija" kao što je korišćeno u skladu sa ovim pronalaskom znači da bispecifični jednolančani konstrukt nema unakrsnu reakciju ili suštinski nema unakrsnu reakciju sa polipeptidima slične strukture. Unakrsna rcaktivnost panela bispecifičnih jednolančanih konstrukata koji se istražuju može se testirati, na primer. procenom vezivanja pomenutog panela bispecifičnog jednolančanog konstrukta pod konvencionalnim uslovima (videti. npr.. Harlow and Lane. Antibodies: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1988 and Using Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press. 1999) sa polipeptidima od interesa kao i sa određenim brojem manje ili više (strukturno i/ili funkcionalno) blisko srodnih polipeptida. Na primer, unutar je obima pronalaska da se prvi vezujući domen bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska vezuje za humani CEA (karcinoembrionalni antigen; CEACAM5; CEA; CD66e) tj. i za rastvorljivi CEA antigen i za membranski vezan CEA, dok su bispecifična antitela koja se vezuju za druge članove CEA familije, kao što je žučni glikoprotein (CEACAM1; BGP1; TM-CEA; CD66a), isključeni iz pomenutog obima. Primeri za specifičnu interakciju mesta-interakcije-sa-antigenom sa specifičnim antigenom obuhvataju specifičnost liganda za njegov receptor. Pomenuta definicija naročito obuhvata interakciju liganada koji indukuju signal po vezivanju za njihov specifični receptor. Primeri odgovarajućih liganada obuhvataju citokine koji interaguju/vezuju se za/sa njihovim specifičnim citokin receptorima. Takođe naročito obuhvaćeno pomenutom definicijom je vezivanje mesta-interakcije-sa-antigenom to sa antigenima kao što su antigeni selektin familije, integrini i familije EGF sličnih hormonu rasta. Sledeći primer pomenute interakcije, koji je takođe naročito obuhvaćen pomenutom definicijom, je interakcija antigene determinatne (epitopa) sa mestom vezivanja antigena antitela. Termin "vezuje se za/interaguje sa" može se takođe odnositi na konformacioni epitop, strukturni epitop ili diskontinuirani epitop koji se sastoji od dva regiona humanih target molekula ili njegovih delova. U kontekstu ovog pronalaska, konformacioni epitop je definisan sa dve ili više diskretnih aminokiselinskih sekvenci razdvojenih u primarnoj sekvenci koje dolaze zajedno na površinu molekula kada se polipeptid spakuje u nativni protein (Sela, (1969) Science 166, 1365 and Laver. (1990) Cell 61, 553-6). Termin "diskontinuirani epitop" označava u kontekstu pronalaska nelinearne epitope koji su sastavljeni od ostataka iz udaljenih delova polipeptidnog lanca. Ovi ostaci dolaze zajedno na površinu molekula kada se polipeptidni lanac savije u trodimenzionalnu strukturu da bi napravio konformacioni/strukturni epitop. |0020| "CD3" kao sto je ovde korišćeno označava antigen koji je eksprimiran na T-ćelijama kao deo multimolekularnog T-ćelijskog receptornog kompleksa i koji se sastoji od najmanje pet različitih lanaca, CD3-gama, -delta, -epsilon, -zeta, i -eta. Klasterovanje CD3 na T-ćelijama, npr., sa imobilisanim anti-CD3-antitelima, vodi do T-ćelijske aktivacije slične angažovanju T-ćelijskog receptora ali nezavisno ođ njegove klon tipične specifičnosti. U stvari, većina anti-CD3-antite1a prepoznaje CD3 epsilon-lanac. Aminokiselinska sekvenca humanog CD3 epsilon je prikazana u GenBank pristupni broj NM 000733 i sadrži SEQ ID NO. 111. |002I]"CEA" označava karcinoembrionalni antigen (karcinoembrionalni antigen-srodni ćelijski adhezioni molekul 5; CEACAM5; CEA: CD66e). antigen eksprimiran u velikom broju tumora epitelijalnog porekla (Hammarstrom. Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shivelv and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985). 355-399). Aminokiselinska sekvenca humanog CEA je prikazana u GenBank pristupni broj NM_004363 i sadrži SEQ ID NO. 76. (0022]U ovom pronalasku, iznenađujuće je nađeno da je moguće generisati antitelo-zasnovane terapeutike sa speci fičnošću za humani CD3 i humani CEA. gde je citotoksična aktivnost usmerena protiv tumorskih ćelija rezistentna na čak visoke koncentracije rastvorljivog CEA antigena. Ovaj nalaz je potpuno neočekivan u pogledu činjenice da se bispecifična jednolančana antitela pronalaska vezuju za rastvorljivi CEA antigen. Na primer. kada su generisani konstrukti bispecifičnih jednolančanih antitela izvedena iz monoklonskih antitela T84.66 ili MFE-23. ova antitela su bila visoko osetljiva na rastvorljivi CEA antigen, tj. njihova citotoksična aktivnost bila je blokirana u prisustvu rastvorljivog CEA antigena. Inhibicija citotoksične aktivnosti pomenutih konstrukata sa rastvorijivim CEA takođe nije mogla biti prevaziđena povećanim količinama antitela. Takođe je pronađeno da su ovi konstrukti sposobni da se vežu za rastvorljivi CEA. U pogledu toga, zaključeno je da rastvorljivi CEA antigen sprečava antitelo da ispolji svoju citotosičnu aktivnost. Nasuprot tome. bispecifična jednolančana antitela kao što su ovde definisana su potpuno rezistentna na prisustvo čak i visokih nivoa rastvorljivog CEA u njihovoj citotoksičnoj aktivnosti prema tumorskim ćelijama. Dodatno, usled njhove visoke citotoksične aktivnosti, pomenuti bispecifični konstrukti kao što je ovde definisano ispoljavaju njihovu biološku aktivnost čan i pri niskim koncentracijama. Stoga, niske količine farmaceutskih kompozicija koje sadrže bispecifična jednolančana antitela kao što je ovde definisano dovoljne su da se postigne terapeutski efekat u pacijentima sa epitelijalnim tumorom karakterisanim sa visokim koncentracijama rastvorljivog CEA u njihovom serumu/plazmi. Visoke koncentracije rastvorljivog CEA u serumu/plazmi pacijenata sa epitelijalnim tumorom karakteristične su za progresivne, rekurentne, metastazirajuće, ili kasne stadij ume tumora i za pacijente sa visokim tumorskim opterećenjem. Ono što još više iznenađuje, pronađeno je da je aminokiselinska sekvenca "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) koja odgovara Kabat pozicijama 95 - 102 CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7 dovoljna da posreduje u rezistenciji na rastvorljivi CEA antigen kada je korišćen u humanom CEA-vezujućem domenu (tj. humani vezujući domeni koji se specifično vezuju za humani CEA) iz anti-CEAxanti-CD3 bispecifičnih jednolančanih antitela. Usled njihovog humanog porekla, pomenuti konstrukti su nisko ili nisu uopšte imunogeni kada se primenjuju na humane pacijente sa tumorom. Ukratko, farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifična jednolančana antitela kao što je ovde definisano naročito su korisne za tretman pacijenata sa epitelijalnim tumorom sa visokim koncentracijama rastvorljivog CEA u njihovoj plazmi, kao što je uočeno npr. tokom progresije tumora, za rekurentni kancer, za metastaze, za pacijente sa visokim tumorskim opterećenjem, ili kasnim stadij umom tumora.

[0023] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije pronalaska, pomenuti prvi vezujući domen specifičan za CD3 bispecifičnih jednolančanih antitela ovde definisanih je lociran C-terminalno u odnosu na drugi vezujući domen.

[0024] Unutar obima pronalaska i svih njegovih primera izvođenja, redosled rasporeda prvog i drugog vezujućeg domena na jednom polipeptidnom lancu, tj. unutar bispecifičnog jednolančanog antitela definisanog ovde, je relevantan. Predviđeno je da raspored vezujućih domena bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde može biti VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3, VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3. VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA ili VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA. Kao što je prikazano u sledećim primerima. prednosti kao što su ovde opisane su naročito ostvarive kada je prvi vezujući domen (koji se speciifcno vezuje za CD3) lociran C-terminalno u odnosu na drugi vezujući domen. tj. bliže C-tenninusu bispecifičnog jednolančanog antitela nego drugi vezujući domen. Poželjno je da je prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CD3 raspoređen u VH-VL orijentaciji. Na primer, vezujući domeni ovde definisanih bispecifičnih jednolančanih antitela mogu biti raspoređeni u redosledu VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 ili V LCE A - V H C EA-V HCD3 - VLCD3. Kao što je ovde korišćeno, "N-terminalno u odnosu na" ili "C-terminalno u odnosu na" i njihove gramatičke varijante označavaju relativnu lokaciju unutar primarne aminokiselinske sekvence pre nego položaj na apsolutnom N- ili C-tenninusu bispecifičnog jednolančanog antitela. Stoga, kao neograničavajući primer. prvi vezujući domen koji je "lociran C-terminalno u odnosu na drugi vezujući domen" jednostavno označava da je prvi vezujući domen lociran na karboksil strani drugog vezujućeg domena unutar bispecifičnog jednolančanog antitela. i ne isključuje mogućnost da je dodatna sekvenca, na primer tag kao što je prethodno dato, ili drugo proteinsko ili neproteinsko jedinjenje kao što je radioizotop, locirana na krajnjem C-tenninusu bispecifičnog jednolančanog antitela.

[0025] Poželjno, pomenuti vezujući domeni bispecifičnih jednolančanih antitela definisani ovde raspoređeni su u redosledu VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 ili VLCEA-VHCEA-VHCD3-VI.CD3. Još poželjnije, raspored je V LCE A-VHC E A-VH C D3 - V LC D3. Najpoželjniji je konstrukt bispecifičnog jednolančanog antitela A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO. 77 VHVL kao što je definisano u SEQ ID NO. 34. |0026| Poželjno je da drugi vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CEA of bispecifičnog jednolančanog antitela definisanog ovde sadrži najmanje jedan CDR, poželjno CDR-H3, poželjnije deo CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 sa aminokiselinskom sekvencom "FYFDY" (SEQ ID NO. 112) koja odgovara Kabat pozicijama 100, 100a, 100b, 101. i 102, respektivno, CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7; još poželjnije sa aminokiselinskom sekvencom "DX1X2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65). gde "X,", "X2", "X3" ili "X4" predstavljaju bilo koji aminokiselinski ostatak, i aminokiselinski ostatak "D" odgovara Kabat poziciji 95 CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 i aminokiselinski ostaci "FYFDY" odgovaraju Kabat pozicijama 100, 100a, 100b. 101, i 102, respektivno. CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7. Ovde, "Xi", "X2", "X3" i "X4" odgovaraju Kabat pozcijama 96 ("Xi"), 97 ("X2"). 98 ("X3") i 99 ("X4"), respektivno, CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7. Predviđeno je da "Xi". "X2", "X3" ili "X.r predstavljaju aminokiselinski ostatak "R" (Arginin), "G" (Glicin), "L" (Leucin), "Y" (Tirozin), "A"

(Alanin), "D" (Asparaginska kiselina), "S" (Serin). "W" (Triptofan), "F" (Fenilalanin) ili "T"

(Treonin). Ovde, isključeno je iz obima patentnih zahteva pronalaska da "Xf. "X2", "X3" i "X4" predstavljaju istu aminokiselinu, npr. da "Xi". "X2", "X3" i *'X4" su svi "F" (Fenilalanin). Poželjno, "Xi" predstavlja "R" (Arginin), "F" (Fenilalanin). "M" (Metionin), "E"

(Glutaminska kiselina), ili "T" (Treonin); "X2" predstavlja "G" (Glicin), "Y" (Tirozin), "A"

(Alanin), "D" (Asparaginska kiselina), ili "S" (Serin); "X3" predstavlja "L" (Leucin), "F"

(Fenilalanin), "M" (Metionin), "E" (Glutaminska kiselina), ili "T (Treonin); i "X4" predstavlja "R" (Arginin), "Y" (Tirozin), "A" (Alanin), "D" (Asparaginska kiselina), ili "S"

(Serin). Još poželjnije, drugi vezujući domen specifičan za humani CEA sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu "RFYFDY" (SEQ ID NO. 113), "LRFYFDY" (SEQ ID NO. 114), "GLRFYFDY" (SEQ ID NO. 115), ili "RGLRFYFDY" (SEO ID NO. 116) CDR-H3 monoklonskog antitela A5B7. Najpoželjniji je CDRH3 A5B7 sa aminokiselinskom sekvencom "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) koja odgovara Kabat pozicijama 95 ("D", Asparaginska kiselina), 96 ("R"; Arginin). 97 ("G": Glicin), 98 ("L"; Leucin), 99 ("R"; Arginin), 100 ("F"; Fenilalanin), 100a ("Y"; Tirozin), 100b ("F"; Fenilalanin), 101 fD"; Asparaginska kiselina), i 102 ("Y"; Tirozin), respektivno. Numerisanje prema Kabat sistemu je dato npr. u Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gotlesman, and C. Foeller. 1991.

Sequcnces of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Ccnter for Biotechnologv Information, National Library of Medicine.

Kao što je prikazano u sledećim Primerima, citotoksična aktivnost ovde definisanog bispecifičnog jednolančanog antitela koje sadrži pomenutu mAb A5B7-izvedenu CDR-H3 "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) aminokiselinsku sekvencu u drugom vezujućem domenu koji interaguje sa CEA protiv ćelija tumora, rezistentna je na rastvorljivi CEA antigen, čime se omogućava tretman pacijenata sa tumorom sa visokim koncentracijama serum CEA u njihovoj plazmi.

|0027| Može biti poželjno da se dodatno mođifikuje ova A5B7-izvedena "DRGLRFYFDY" CDR-H3 aminokiselinska sekvenca npr. da bi se popravio afinitet za CEA target antigen (na ćelijama epitelijalnog tumora) i/ili da optimizuje "finu specifičnost" bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde definisano. U tu svrhu, u aminokiselinskoj sekvenci "DX1X2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65)". različiti aminokiselinski ostaci mogu se testirati na pozicijama "Xi", "X2<H>, "X3" i/ili "X4" (koje odgovaraju Kabat pozicijama 96 ("Xi"). 97 ("X2"), 98 ("X3") i 99 ("X4"), respektivno, CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7) da bi se identifikovao modifikovani CDR-H3 sa poboljšanim afinitetom i/ili finom specifičnošću. Na primer, "Xi", "X2<M>, "X3" ili "X4" može predstavljati aminokiselinski ostatak "R" (Arginin), "G" (Glicin), "L" (Leucin). "Y" (Tirozin). "A" (Alanin). "D" (Asparaginska kiselina), "S" (Serin), "W" (Triptofan), "F" (Fenilalanin) ili "T" (Treonin). Ovde, jedna, dve, tri ili sve četiri od naznačenih "X" pozicija mogu biti izmenjene u poređenju sa originalnom "RGLR" aminokiselinskom sekvencom na Kabat pozicijama 96 do 99 u CDR-H3 "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) aminokiselinskoj sekvenci. Međutim, isključeno je iz obima patentnih zahteva pronalaska da "Xi". "X2". "X3<M>i "X4" predstavljaju istu aminokiselinu, npr. da "Xi", "X2<M>, "X3" i "X4" su svi "F" (Fenilalanin). Prethodno pomenute modifikacije A5B7-izvedene "DRGLRFYFDY" CDR-H3 aminokiselinske sekvence mogu se postići postupcima poznatim u tehnici, kao što je PCR korišćenjem randomizovanih prajmera, koja omogućava generisanje bispecifičnih jednolančanih antitela sa takvim modifikacijama CDRH3 regiona u CEA-vezujućem domenu. Afinitet ili fina specifičnost ovih modifikovanih bispecifičnih jednolančanih antitela može se testirati postupcima opisanim u tehnici, npr. sa ELISA, Biacore ili FACS analiza. Rezistencija bispecifičnog jednolančanog antitela sa takvim modifikovanim CDR-H3 na rastvorljivi CEA antigen može se testirati u citotoksičnim testovima u prisustvu rastućih koncentracija rastvorljivog CEA, kao Što je opisano u sledećim Primerima.

[0028] Poželjnije, pomenuti drugi vezujući domen specifičan za humani CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde sadrži SEQ ID NO. 65 ili 66 i/ili CDR-H1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "SYWMH" (SEQ ID NO. 68) i/ili CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "FIRN KAN GGTTE Y A A S V KG" (SEQ ID NO. 67) ili "FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 145). Stoga, pomenuti drugi vezujući domen specifičan za humani CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde može sadržati jedan, dva ili tri CDR-H regiona kao što je prethodno definisano. Alternativno, pomenuti drugi vezujući domen specifičan za humani CEA bispecifičnog jednolančanog antitela definisanog ovde sadrži SEQ ID NO. 65 ili 66 i/ili CDR-H 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TYAMH" (SEQ ID NO. 70) i/ili CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "LISNDGSNKYYADSVKG" (SEQ ID NO. 69). Sloga, alternativno, pomenuti drugi vezujući domen specifičan za humani CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde mogu sadržati jedan, dva ili tri CDR-H regiona kao što je prethodno definisano. Još poželjnije, pomenuti drugi vezujući domen specifičan za humani CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde dodatno jednom, dve ili tri CDR-H regiona kao što je prikazano prethodno sadrži CDR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73) i/ili CDR-L2 koji ima aminoksielinsku sekvencu "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) i/ili CDR-L3 koji ima aminokiselinsku sekvencu "MINVHSGASAV" (SEQ ID NO. 71).

[0029] Aminokiselinska sekvenca VH regiona drugog vezujućeg regiona specifičnog za humani CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde je poželjno SEQ ID NO.

60 koja sadrži "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) što odgovara Kabat pozicijama 95 - 102 CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 i CDR-H 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "SYWMH" (SEQ ID NO. 68) i CDR-H2 koja ima aminokiselinsku sekvencu

"FIRNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 67).

[0030] Aminokiselinska sekvenca VH regiona drugog vezujućeg domena specifičnog za humani CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde je poželjno SEQ ID NO. 146 koja sadrži "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) što odgovara Kabat pozicijama 95 - 102 CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 i CDR-H 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "SYWMFI" (SEQ ID NO. 68) i CDR-II2 koji ima aminokiselinsku sekvencu

"FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 145).

[0031] Aminokiselinska sekvenca VH regiona drugog vezujućeg domena specifičnog za humani CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde je poželjno SEQ ID NO.

58 ili SEQ ID NO. 62 koja sadrži "DRGLRFYFDY" (SEO ID NO. 66) što odgovara Kabat pozicijama 95 - 102 CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 i CDR-H 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TYAMH" (SEQ ID NO. 70) i CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "LISNDGSNKYYADSVKG" (SEQ ID NO. 69).

[0032j VL region drugog vezujućeg domena specifičnog za humani CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde je poželjno SEQ ID NO. 64 koja sadrži CDR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73) i CDR-L2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) i CDR-L3 koji ima aminokiselinsku sekvencu *'M1WHSGASAV" (SEQ ID NO. 71).

[0033] Kao što je prethodno dato, redosled rasporeda varijabilnih regiona drugog vezujućeg domena koji se specifično vezuje za CEA može biti VH-VL ili VL-VH. Oba rasporeda su unutar obima pronalaska. Za drugi vezujući domen koji sadrži VH iz SEQ ID NO. 60 i VL iz SEQ ID NO. 64, VH-VL raspored je prikazan u SEQ ID NO. 52, dok je VL-VH raspored prikazan u SEQ ID NO. 122. Za drugi vezujući domen koji sadrži VH iz SEQ ID NO. 146 i VL iz SEQ ID NO. 64, VH-VL raspored je prikazan u SEQ ID NO. 147. Za drugi vezujući domen koji sadrži VH iz SEQ ID NO. 58 i VL iz SEQ ID NO. 64, VH-VL raspored je prikazan u SEQ ID NO 50, dok je VL-VH raspored prikazan u SEQ ID NO. 120. Za drugi vezujući domen koji sadrži VII iz SEQ ID NO. 62 i VL iz SEQ ID NO. 64. VH-VL raspored je prikazan u SEQ ID NO. 54. dok je VL-VH raspored prikazan u SEQ ID NO. 124. Za drugi vezujući domen koji sadrži VH iz SEQ ID NO. 56 i VL iz SEQ ID NO. 64. VH-VL raspored je prikazan u SEQ ID NO. 48, dok je VLVH raspored prikazan u SEQ ID NO. 118.

[0034] Još poželjnije. V regioni drugog vezujućeg domena specifičnog za CEA bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde izabrani su iz grupe koju čini: (a) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 60 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64; (b) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 146 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEO ID NO. 64; (c) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 58 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64; (d) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 62 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64: i (e) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 56 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64. |0035] Najpoželjnije, pomenuto bispecifično jednolančano antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čini: (a) aminokiselinska sekvenca kao sto je prikazana u bilo kojoj od SEQ ID NOs. 6. 8, 16. 18. 24. 26. 32, 34, 40. 42, 126, 130, 134 ili 143; (b) aminokiselinska .sekvenca kodirana od strane sekvence nukleinske kiseline kao što je prikazano u SEQ IDNOs. 5, 7, 15. 17. 23, 25. 31, 33. 39. 41, 125, 129. 133 ili 142; i (c) aminokiselinska sekvenca kodirana od strane sekvence nukleinske kiseline koja je degenerisana kao rezultat genetskog koda u nukleotidnu sekvencu iz (b).

[0036]U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije pronalaska, pomenuti epitelijalni tumor koji se tretira je gastrointestinalni adenokarcinom dojke, ili adenokarcinom pluća. Pomenuti gastrointestinalni adenokarcinom je poželjno kolorektalni, pankreasni, ezofagijalni ili adenokarcinom želuca.

[0037]Poželjnije, pomenuta farmaceutska kompozicija pronalaska je za tretman progresivnih tumora, kasnog stadijuma tumora, pacijenata sa tumorom sa visokim tumorskim opterećenjem, metastazirajućih tumora, ili pacijenata sa tumorom sa koncentracijom CEA u serumu višom od 100 ng/ml. Pomenuta koncentracija CEA u serumu može se odrediti npr. sa

ELISA.

[0038]U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije pronalaska, najmanje jedan od pomenutih prvih ili drugih vezujućih domena bispecifičnih jednolančanih antitela definisanih ovde je himerni, humanizovan. CDR-graftovan. i/ili deimunizovan iii humani.

[0039]Termin "himerni" kao što je ovde korišćen definisan je prethodno. Termin "humani" vezujući domen, npr. humani vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CEA kao što je ovde korišćeno podrazumeva da označava da bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano sadrži aminokiselinsku sekvencu(e) sadržane u repertoaru antitela humane klicine linije ili repertoaru antitela koji ima najmanje aminokiselinsku sekvencu "FYFDY" koja odgovara Kabat pozicijama 100, 100a. 100b, 101. i 102 (SEQ ID NO. 112) CDR-H3 mišjeg monoklonskog antitela A5B7 ili A5B7-izvedeno CDR-H3 kao što je prethodno definisano. Bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano može se takođe smatrati humanim ukoliko se sastoji od (a) sekvence(i) koja odstupa(ju) od njene(njihovih) najbliže(ih) sekvence(i) humane klicine linije ne više nego što je očekivano usled somatske hipermutacije. Dodatno, antitela mnogih ne-humanih sisara, na primer glodara kao što su miševi i pacovi, sadrže VH CDR aminokiselinske sekvence za koje se očekuje da takođe postoje u eksprimiranom repertoaru humanih antitela. Bilo koja takva sekvenca(e) humanog ili ne-humanog porekla za koju se može očekivati da postoji u eksprimiranom humanom repertoaru takođe bi se smatrala "humanom" za sve svrhe ovog pronalaska. |0040]Kao što je ovde korišćeno. termini "humanizovano". "humanizacija" ili "slično humanom" naizmenično su koiršćeni da označavaju bispecifično jednolančano antitelo koje sadrži u najmanje jednom od njegovih vezujućih domena najmanje jedan region koji određuje komplementarnost ("CDR") iz ne-humanog antitela ili njegovog fragmenta. Humanizacioni pristupi su opisani na primer u WO 91/09968 i US 6.407.213. Kao neograničavajući primeri. termin obuhvata slučaj u kojem varijabilni region najmanje jednog vezujućeg domena sadrži jedan CDR region, na primer treći CDR region VH. iz druge ne-humane životinje, na primer glodara, kao i slučaj u kojem oba varijabilna regiona sadrže na svakom od njihovih respektivnih prvih, drugih i trećih CDRs, CDRs iz pomenute ne-humane životinje. U slučaju da su svi CDRs vezujućeg domena bispecifičnog jednolančanog antitela zamenjeni sa njihovim odgovarajućim ekvivalentima iz, na primer, glodara. tipično se govori o "CDR-graftingu", i podrazumeva se da je ovaj termin obuhvaćen terminom "humanizovano" ili njegovim gramatički srodnim varijantama kao što je ovde korišćeno. Termin "humanizovano" ili njegove gramatički srodne varijante takođe obuhvataju slučajeve u kojima, kao dodatak zameni jednog ili više CDR regiona sa VH i/ili VL prvog i/ili drugog vezujućeg domena, dalje mutacije (npr. supstitucije) najmanje jednog aminokliselinskog ostatka unutar okvirnih ("FR") regiona između CDRs su izvedene tako da aminokiseline na toj/tim pozicijama odgovaraju aminokiselinama na toj/tim pozicijama kod životinje iz koje su izvedeni CDR regioni koji su korišćeni za zamenu. Kao što je poznato u tehnici, takve individualne mutacije su često načinjene u okvirnim regionima nakon CDR-graftinga da bi se vratio originalni afinitet vezivanja ne-humanog antitela korišćenog kao CDR-donor za njegov target molekul. Termin "humanizovano" može dalje obuhvatati aminokiselinsku supstituciju(e) u CDR regionima ne-humane životinje u aminokiselinu(e) odgovarajućeg CDR regiona iz humanog antitela, dodatno aminokiselinskim supstitucijama u okvirnim regionima kao što jc prethodno opisano.

[0041]Kao što je ovde korišćeno, termin "deimunizovano" ili "deimunizacija" označava modifikaciju prvog i/ili drugog vezujućeg domena vis-a-vis originalnog konstrukta divljeg tipa činjenjem pomenutog konstrukta divljeg tipa ne-imunogenim ili manje imunogenim kod ljudi. Deimunizacioni pristupi su perikazani npr. u WO 00/34317, WO 98/52976. WO 02/079415 ili WO 92/10755. Termin "deimunizovani" takođe se odnosi na konstrukte, koji pokazuju smanjenu sklonost ka generisanju T ćelijskih epitopa. U skladu sa ovim pronalaskom, termin" smanjena sklonost ka generisanju T ćelijskih epitopa " odnosi se na uklanjanje T-ćelijskih epitopa koji dovode do specifične T-ćelijske aktivacije. Dodatno, "smanjena sklonost ka generisanju T ćelijskih epitopa" označava supstituciju aminokiselina koje doprinose formiranju T ćelijskih epitopa. tj. supstituciju aminokiselina. koje su esencijalne za formiranje T ćelijskog epitopa. Drugim recima, "smanjena sklonost ka generisanju T ćelijskih epitopa" odnosi se na smanjenu imunogenost ili smanjeni kapacitet da indukuju antigen nezavisnu T ćelijsku proliferaciju. Termin "T-ćelijski epitop" odnosi se na kratke peptidne sekvence koje se mogu osloboditi tokom degradacije peptida. polipeptida ili proteina unutar ćelija i biti nakon toga prikazane od strane molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) da bi se inicirala aktivacija T ćelija; videti između ostalog \VO 02/066514. Za peptide prikazane sa MHC klase II takva aktivacija T ćelija može dovesti do odgovora antitela direktnom stimulacijom T ćelija da proizvedu pomenuta antitela. "Smanjena sklonost ka generisanju T ćelijskih epitopa" i/ili "deimunizacija" može se meriti tehnikama poznatim u tehnici. Poželjno, de-imunizacija proteina može se testirati in vitro sa testom proliferacije T ćelija. U ovom testu izvršen je skrining PBMCs od donora koje predstavljaju > 80 % HLA-DR alela u svetu u odnosu na proliferaciju kao odgovor ili na divlji tip ili deimunizovane peptide. Idealno proliferacija ćelija je detektovana samo nakon punjenja antigen-prikazujućih ćelija sa peptidima divljeg tipa. Alternativno, deimunizacija se može testirati ekspresijom HLA-DR tetramera koji predstavljaju sve haplotipove. Ovi tetrameri se mogu testirati u odnosu na vezivanje peptida ili se mogu napuniti sa peptidnim supstuituentima za antigen-prikazujuće ćelije u testovima proliferacije. Da bi se testiralo da li su deimunizovani peptidi prikazani na HLA-DR haplotipovima, može se meriti vezivanje npr. fluorescentno-obeleženih peptida na PBMCs. Dodatno, deimunizacija se može dokazali određivanjem da li su antitela protiv deimunizovanih molekula stvorena nakon primene na pacijenta. Poželjno, molekuli izvedeni iz antitela su deimunizovani u okvirnim regionima i većina CDR regiona nisu modifikovani da bi se generisala smanjena sklonost da se indukuju T ćelijski epitopi tako da se ne utiče na afinitet vezivanja CDR regiona. Cak i eliminacija jednog T ćelijskog epiotpa rezultuje u smanjenoj imunogenosti. Ukratko, prethodni pristupi pomažu da se smanji imunogenost terapeutskih bispecifičnih jednolančanih antitela kao sto je ovde definisano kada se primenjuju na pacijente sa epitelijalnim tumorom. Na primer, prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za CD3 kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 77 je deimunizovan; videti takođe WO2005/040220. Poželjno, raspored V regiona u ovom CD3-vezujućem domenu je VH-VL.

[0042]U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično jednolančano antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOs. 6. 8, 16, 18, 24, 26, 32. 34, 40, 42. 126. 130, 134 ili 143; (b) aminokiselinska sekvenca kodirana od strane sekvence nukleinske kiseline prikazana u SEQ IDNOs. 5. 7. 15. 17.23.25,31.33. 39,41, 125. 129. 133 ili 142; i (c) aminokiselinske sekvence kodirane od strane nukleinske sekvence koja je đegenerisana kao rezultat genetskog koda u nukelotiđnu sekvencu iz (b.

|0043JU jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži bispecifična jednolančana antitela kao što je prethodno definisano. Poželjno, pomenuta bispecifična jednolančana antitela kao što su prethodno defmisana korišćena su kao farmaceutske kompozicije za tretman epitelijalnog tumora ili epitelijalnih tumora kod ljudi. Pomenuti epitelijalni tumor(i) je (su) CEA pozitivni. Citotoksična aktivnost ovih farmaceutskih kompozicija protiv CEA-pozitivnih ćelija epitelijalnog tumora je rezistentna na čak visoke koncentracije rastvorljivog CEA antigena u plazmi pacijenata sa tumorom. Dodatno, pomenuta bispecifična jednolančana antitela kao što su prethodno defmisana ili anti-CEA scFvs izvedena iz njih mogu se koristiti kao dijagnostičke kompozicije za otkrivanje epitelijalnog tumora ili epitelijalnih tumora kod ljudi kao što je detaljnije dato u nastavku. Termin "hibridizuje pod stringentnim uslovima" kao što je ovde korišćeno odnosi se na nukleinske kiseline koje su sposobne da hibridizuju, pod stringentnim hibridizacionim uslovima, sa sekvencama prikazanim u SEQ ID NOs. 5. 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33. 39, 41, 125, 129, 133 ili 142. ili njihovim komplementom, i koje kodiraju bispecifično jednolančano antitelo koje ima citotoksičnu aktivnost protiv CEA-pozitivnim tumorskim ćelijama. "Stringentni hi bridi zacioni us I ovi" odnose se na inkubaciju preko noći na 42 °C u rastvoru koji sadrži 50% formamida, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trinatrijum citrat). 50 mM natrijum fosfat (pH 7.6), 5x Denhardt-ov rastvor. 10% dekstran sulfat, i 20 mg/ml denaturisane, fragmentisane DNK iz sperme lososa, nakon Čega su filteri isprani u 0.1x SSC na oko 65° C. Da lije bilo koji određeni molekul nukleinske kiseline ili poiipeptida najmanje 80%, 85%. 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa nukleotidnom ili aminokiselinskom sekvencom defmisanom ovde može se odrediti konvencionalno korišćenjem poznatih kompjuterskih programa. Poželjan postupak za određivanje sveukupno najboljeg poklapanja između sekvence iz upita (sekvence definisane ovde) i predmetne sekvence, takođe označeno kao globalno poravnanje sekvenci, može se odrediti korišćenjem FASTDB kompjuterskog programa zasnovanog na algoritmu od Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990)). Kod poravnanja sekvenci. i sekvenca iz upita i predmetna sekvenca su DNK sekvence. RNK sekvenca se može porediti pretvaranjem U u T.

|0044|Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano.

Pomenula nukleinska kiselina može se koristiti npr. za pristupe genske terapije da hi se tretirao epitelijalni tumor kod ljudi, kao što je detaljnije dato u nastavku.

[0045]Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kao što je prethodno definisano. Poželjno, pomenuti vektor dalje sadrži regulalornu sekvencu koja je operativno vezana za pomenutu sekvencu nukleinske kiseline definisane prethodno. Poželjnije, pomenuti vektor je ekspresioni vektor. Dodatno, vektor ovog pronalaska može takođe biti vektor za transfer gena ili targeting gena. Genska terapija, koja je zasnovana na uvođenju terapeutskih gena ili nukleinskih kiselina u ćelije sa ex-vivo ili in-vivo tehnikama je jedna od najvažnijih primena transfera gena. Pogodni vektori, postupci ili sistemi za dopremanje gena za in-vitro ili in-vivo gensku terapiju opisani su u literaturi i poznati su stručnjaku; videti, npr., Giordano. Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996). 911-919; Anderson, Science 256 (1992). 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodua. Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998). 2243-2251; Verma, Nature 389

(1997). 239-242; Anderson. Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapv 4 (1997), 393-400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; \VO 94/29469; WO 97/00957; US 5,580,859; US 5,589,466; US 4,394,448 or Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7

(1996), 635-640, i reference citirane u njima. Molekuli nukleinske kiseline i vektori kao što je ovde definisano mogu biti dizajnirani za direktno uvođenje ili za uvođenje preko lipozoma, virusnih vektora (npr. adenovirusnih, retrovirusnih), elektroporacijom, ili drugim sistemima dopremanja u ćeliju. Dodatno, bakulovirusni sistem se može koristiti kao eukariotski ekspresioni sistem za molekule nukleinske kiseline kao što je ovde definisano. Uvođenje i genski terapeutski pristup bi trebalo da. poželjno, dovedu do ekspresije funkcionalnog konstrukta bispecifičnog jednolančanog antitela kao Što je ovde definisano, pri Čemu je pomenuti eksprimirani konstrukt bispecifičnog jednolančanog antitela naročito koristan u tretmanu, ublažavanju i/ili prevenciji epitelijalnog tumora kod ljudi.

[0046]U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži domaćina transformisanog ili transficiranog sa vektorom ili nukelinskom kiselinom kao što je prethodno definisano. |0047|Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju kao što je ovde definisano. koja dalje sadrži proteinsko jedinjenje sposobno da obezbedi aktivacioni signal za imune efektorske ćelije. |0048]Poželjno, farmaceutska kompozicija dalje sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata.

[0049] U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije kao što je prethodno definisano. pri čemu pomenuti postupak sadrži kultivisanje domaćina kao što je prethodno definisano pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde definisano i rekuperovanje proizvedenog bispecifičnog jednolančanog antitela iz kulture. (0050] Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na upotrebu bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde definisano ili kao što je proizvedeno postupkom kao što je ovde definisano, molekula nukleinske kiseline kao što je ovde definisano. vektora kao što je ovde definisano ili domaćina kao što je ovde definisano za pripremu farmaceutske kompozicije za prevenciju, tretman ili ublažavanje epitelijalnog tumora kod ljudi. Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju pronalaska ili kao što je proizvedena prema postupku dalom prethodno za upotrebu u postupku prevencije, tretmana ili ublažavanja epitelijalnog tumora kod ljudi. Stručnjak, naročito zaduženi lekar može proceniti uspešan tretman pacijenta koji ima potrebu za primenom bispecifičnog molekula/bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska. Shodno tome, šema primene kao i doza i vreme primene može biti procenjeno od strane pomenutog stručnjaka: Odgovarajuće "ublažavanje" i/ili "tretman" koje treba proceniti definisano je u nastavku. Kao što je ovde korišćeno. "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" farmaceutske kompozicije pronalaska u kontekstu epitelijalnih tumora odnosi se na onu količinu terapeutskog agensa dovoljnu da uništi, modifikuje, kontroliše ili ukloni primarno, regionalno ili matastazirajuće tumorsko tkivu. Terapeutski efikasna količina može se odnositi na količinu terapeutskog agensa koja je dovoljna da odloži ili minimizuje širenje epitelijalnih tumora. Terapeutski efikasna količina može se takođe odnositi na količinu terapeutskog agensa ili farmaceutskog agensa koja obezbeđuje terapeutsku korist u tretmanu ili upravljanju epitelijalnim tumorima. Dodatno, terapeutski efikasna količina u odnosu na terapeutski agens ili farmaceutski agens pronalaska znači da je količina terapeutskog agensa ili farmaceutskog agensa zasebno, ili u kombinaciji sa drugim terapijama, koja obezbeđuje terapeutsku korist u tretmanu ili upravljanju epitelijalnim tumorom. Korišćeno u vezi sa količinom biospecifiČnog jednolančanog antitela definisanog ovde, termin može obuhvatati količinu koja poboljšava sveukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava neželjene efekte, ili pojačava terapeutsku efikasnost ili sinergiju (kao što je ovde definsano) sa drugim terapeutskim agensom. Poželjno, terapeutski efikasna količina terapeutika poboljšava sveukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava neželjene efekte, ili pojača terapeutsku efikasnost ili sinergiju sa drugim terapeutskim agensom u tretmanu epitelijalnog tumora. Na primer, bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definsano može izazvati smanjenje prečnika epitelijalnog tumora od 20% ukoliko je primenjeno na pacijenta kao mono-terapija. Nasuprot tome, drugi terapeutik npr. anti-kancer agens kao sto je definisano u nastavku, može izazvati smanjenje tumora od 10%. Međutim, ukoliko su bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano i pomenuti drugi terapeutik primenjeni u kombinaciji u obliku ko-terapije, može se uočiti smanjenje tumora od 50%. Takav efekat se podrazumeva kao sinergistički efekat kao što je ovde korišćeno. Kao što se ovde odnosi na. termin "terapija" odnosi se na bilo koju šemu primene, postupak i/ili agens koji se može koristiti za prevenciju, tretman ili ublažavanje epitelijalnog tumora. Termin "prevencija, tretman ili ublažavanje epitelijalnog tumora" je detaljnije dato u nastavku. Termini "terapije" i "terapija" može se odnositi na biološku terapiju, suportivnu terapiju, hemoterapiju, terapiju zračenjem i/ili druge terapije korisne u tretmanu, prevenciji ili ublažavanju epitelijalnog tumora, ili jednog ili više njegovih simptoma. Kao što je ovde korišćeno. termin "tretirati", "tretman" i "tretiranje" u kontekstu primene terapije ili terapija na pacijenat odnosi se na smanjenje ili ublažavanje napredovanja, težine, i/ili trajanja epitelijalnog tumora. Pomenuti epitelijalni tumor(i) mogu biti povezani sa aberantnom ekspresijom npr.. prekomernom ekspresijom ili aktivnošću CEA. i/ili ublažavanjem jednog ili više njegovih simptoma koje rezultuje iz primene jedne ili više terapi ja (uključujući primenu jednog ili više farmaceutskih ililerapeutskih agenasa). [00511 Najpoželjniji način primene je intravenska primena tokom datog vremena/vremenskog perioda. Dok se bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano može primeniti samo, poželjna je primena u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača dobro su poznati u tehnici i uključuju fosfatno puferisani fiziološki rastvori, voda, lipozomi, različiti tipovi ovlaživača. sterilni rastvori, itd. Kompozicija koja sadrži takve nosače može se formulisati dobro poznatim konvencionalnim postupcima. Ove farmaceutske kompozicije mogu se primeniti na subjekta sa pogodnom dozom. Dozni režim biće određen od strane odgovornog lekara i kliničkih faktora. Kao što je dobro poznato u medicinskoj tehnici, doze za bilo kog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela pacijenta, starosti, određenog jedinjenja koje se primenjuje, pola, vremena i načina primene. opšteg zdravstvenog stanja, i drugih lekova koji se istovremeno primenjuju. Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili ne-vodene rastvore, i suspenzije. Primeri ne-vodenih rastvora su propilen glikol, polietilen glikol. i injektabilni organski estri kao sto je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, vodene rastvore, ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferisane medij ume. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum klorida, Ringer-ova dekstroza, dekstroza i natrijum hlorid, Ringer-ova laktoza, ili neisparljiva ulja. Intravenski nosači uključuju sredstva za obnavljanje tečnosti i nutrijenata. sredstva za obnavljanje elektrolita (kao što su ona zasnovana na Ringer-ovoj đekstrozi). i slično. Takođe mogu biti prisutni konzervansi i drugi aditivi kao što su. na primer, antimikrobna sredstva, anli-oksidanli, helatirajući agensi, i inertni gasovi i slično. Dodatno, kompozicija može sadržati proteinske nosače, kao, npr., serum albumin ili imunoglobulin, poželjno humanog porekla. Predviđeno je da ko-terapija može sadržati, dodatno proteinskom bispecifičnom jednolančanom antitelu dodatne biološki aktivne agense, u zavisnosti od nameravane upotrebe farmaceutske kompozicije. Takvi agensi mogu biti agensi koji deluju na gastrointestinalni sistem, agensi koji deluju kao citostalici. agensi koji sprečavaju hiperurikemiju, agensi koji inhibiraju imune reakcije (npr. kortikosteroidi, FK506), lekovi koji deluju na cirkulatorni sistem i/ili agensi kao što su T-ćelijski kostimulatorni molekuli ili citokini poznati u tehnici. Poželjno, bispecifčno jednolančano antitelo kao što je ovde definisano formulisano je u puferu, stabilizatoru i surfaktantu. Pufer može biti fosfatni, citratni, sukcinatni ili acetatni pufer. Stabilizator može biti aminokiselina(e) i/ili šećer. Surfaktanti mogu biti deterdženti, PEGs, ili slično. Poželjnije, bispecifično jednolančano antitelo kao sto je ovde definisano je formulisano u citratu, lizinu, trehalozi i Tween 80. Kao razblaživač za pomenutu farmaceutsku kompoziciju, poželjni su izotonični fiziološki rastvor i Tween 80.

[0052] Termin "ublažavanje" kao što je ovde korišćeno odnosi se na poboljšanje ili ublažavanje težine bolesti, tj. epitelijalnog tumora. Na primer. takvo ublažavanje može biti postizanje stabilne bolesti - ili još poželjnije - smanjenje epitelijalnih tumora, tj. minimalni, delimični odgovor ili kompletan odgovor, usled primene farmaceutskih kompozicija pronalaska. "Stabilna bolest" se odnosi na stanje bolesti kod koje se ne može uočiti značajno napredovanje/rast tumora ili otkriti sa kliničkim i/ili histološkim dijagnostičkim postupcima. Na primer, smanjenje tumora veće od 50% smanjenja zbira površina preseka indeksiranih lezija može se smatrati "delimičnim odgovorom". "Potpuni odgovor" označava stanje u kojem se ne može detektovati lezija(e) nakon tretmana. Odgovor sa smanjenjem tumora između stabilne bolesti i delimičnog odgovora može se smatrati minimalnim odgovorom. Na primer, 20%, 25% ili 30% smanjenja zbira površina preseka indeksiranih lezija može se označiti kao minimalni odgovor. Termin "ublažavanje" kao što je ovde korišćeno obuhvata takođe smanjenje broja epitelijalnih tumora. On dodatno označava prevenciju/usporavanje napredovanja tumora. Dodatno, poboljšanje ukupnog preživljavanja tretiranih pacijenata sa tumorom u poredenju sa netretiranim pacijentima može se smatrati "ublažavanjem" kao što jc ovde korišćeno. Ovo je mutatis mutandis primenjivo na poboljšanje preživljavanja bez napredovanja ili preživljavanja bez relapsa tretiranih pacijenata sa tumorom u poredenju sa netretiranim pacijentima sa tumorom. Dodatno, termin "ublažavanje" može se takođe odnositi na smanjenje intenziteta simptoma epitelijalnog tumora, koje rezultuje u npr. poboljšanju kvaliteta života tretiranih pacijenata sa tumorom. [0053|Termin "prevencija epitelijalnog tumora" kao što je ovde korišćen treba shvatiti na sledeći način: Nakon hirurškog uklanjanja primarnog epitelijalnog tumora iz humanog pacijenta i/ili nakon hemoterapeutskog ili radiološkog trelmana primarnog epitelijalnog tumora, može se desiti da se ne mogu sve ćelije tumora eliminisati iz tela. Međutim, ove preostale tumorske ćelije mogu dovesti do rekurentnog kancera, tj. lokalnog vraćanja i/ili metastaza kod pacijenata. Metastaza je česta komplikacija kancera. ipak proces preko koga se ćelije kancera diseminiraju iz primarnog tumora da bi obrazovale udaljene kolonije je slabo poznat. Metastazirajući kanceri su skoro bez izuzetka neizlečivi što povlači neophodnost novih terapeutskih modaliteta. Farmaceutska kompozicija pronalaska može se koristiti da ubije ove diseminirane tumorske ćelije da bi se sprečilo formiranje sekundarnih tumora (poreklom od tumorskih ćelija koje ostaju u telu nakon primame terapije). Na taj način, farmaceutska kompozicija pomaže da se spreči formiranje lokalnog vraćanja i/ili metastaza kod pacijenata sa tumorom.

[0054]Uspeh anti-tumorske terapije može se pratiti ustanovljenim standardnim postupcima za respektivne entitete bolesti, npr. može se koristiti kompjuterska tomografija, rendgen, tomografija sa nuklearnom magnetnom rezonancom (npr. za procenu odgovora na osnovu National Cancer Institute-kriterijuma [Cheson (1999). J. Clin. Oncol.; 17(4): 1244]), skeniranje pozitron-emisionom tomografijorn, endoskopija, sortiranje fluorescencijom aktiviranih ćelija, aspiracija kostne srži, pleuralne ili peritonealne tečnosti, tkiva/histologija, i različiti klinički hemijski parametri specifični za epitelijalni tumor (npr. koncentracija rastvorljivog CEA u serumu) i drugi ustanovljeni standardni postupci. Dodatno« mogu se koristiti testovi koji određuju T ćelijsku aktivaciju; videti npr. WO99/054440. Takođe se može koristiti statistika za određivanje ukupnog preživljavanja, preživljavanja bez napredovanja ili preživljavanja bez relapsa tretiranih pacijenata sa tumorom u poredenju sa netretiranim pacijentima sa tumorom.

[0055]Poželjno, pomenuti epitelijalni tumor je gastrointestinalni adenokarcinom, adenokarcinom dojke ili adenokarcinom pluća. Pomenuti gastrointestinalni adenokarcinom je poželjnije kolorektalni, pankreasni, ezofagijalni ili adenokarcinom želuca.

[0056]Još poželjnije, pomenuta farmaceutska kompozicija pronalaska je za tretman progresivnih tumora, kasnog stadijuma tumora, pacijenata sa tumorom sa visokim tumorskim opterećenjem, metastazirajućih tumora, ili pacijenata sa tumorom sa koncentracijom CEA u serumu većom od 100 ng/ml (kao stoje određeno npr. sa ELISA).

[0057]U drugom poželjnom primeru izvođenja upotreba ili postupaka pronalaska, pomenuta farmaceutska kompozicija kao što je ovde definisano pogodna je za primenu u kombinaciji sa dodatnim lekom, tj. kao deo ko-terapije.

[0058]U određenim primerima izvođenja, bispecifično jednolančano antitelo ili farmaceutska kompozicija kao što je ovde definisano primenjena je u kombinaciji sa jednom ili više drugih terapija. U određenim primerima izvođenja, bispecifično jednoInačano antitelo ili farmaceutska kompozicija kao sto je ovde definisano primenjena je istovremeno sa jednom ili više drugih terapija. Poželjno, takve terapije su korisne za tretman epitelijalnih tumora. Termin "istovremeno" nije ograničeno na primenu farmaceutskih kompozicija ili terapeutskih agenasa u tačno isto vreme, već pre znači da je bespecifično jednolančano antitelo ili farmaceutska kompozcija kao što je ovde definisano i drugi agens(i) su primenjeni na pacijenta u nizu i unutar vremenskog intervala tako da bispecifično jednolančano antitelo ili farmaceutska kompozicija kao što je ovde definisano mogu delovati zajedno sa drugim agensom da bi se obezbedila povećana korist nego ako su primenjeni drugačije. Na primer, svaki terapeutski agens može se primeniti istovremeno ili sekvencijalno u bilo kom redosledu u različitim vremenima; međutim, ukoliko nisu primenjeni istovremeno, treba da budu primenjeni u dovoljno bliskom vremenu tako da se obezbedi željeni terapeutski efekat. Svaki terapeutski agens može se primeniti zasebno, u bilo kom odgovarajućem obliku i bilo kojim pogodnim načinom. U drugim primerima izvođenja, bispecifično jednolančano antitelo ili farmaceutska kompozicija kao što je ovde definisano primenjeni su pre, istovremeno ili nakon operacije. Poželjno operacija kompletno uklanja lokalizovane epitelijalne tumore ili smanjuje veličinu velikih epitelijalnih tumora. Operacija se takođe može izvršiti kao preventivna mera ili da bi se olakšao bol. |0059]Dozne količine i učestalost primene koji su ovde obezbeđeni obuhvaćeni su terminom "teraputski efikasnom" kao što je prethodno definisano. Doza i učestalost dodatno će tipično varirati u skladu sa faktorima specifičnim za svakog pacijenata u zavisnosti od primenjenih specifičnih terapeutskih ili profilaktičkih agenasa, težine i tipa epitelijalnog tumora, načina primene, kao i starosti, telesne težine, odgovora, i medicinske istorije bolesti pacijenta. Pogodni režimi se mogu izabrati od strane stručnjaka razmatranjem takvih faktora i praćenjem, na primer, doza objavljenih u literaturi i preporučenih u Phvsicians' Desk Reference (59th ed.. 2005).

[0060]U nekim primerima izvođenja, terapija primenom bispecifičnog jednolančanog antitela ili farmaceutske kompozicije kao što je ovde definisano kombinovana je sa primenom jedne ili više terapija kao što su hemoterapije. terapije zračenjem, hormonske terapije, i/ili biološke terapije/imunoterapije. Terapeutski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, proteinske molekule, uključujući, ali se ne ograničavajući na, peptide. polipeptide, proteine, uključujući posttranslaciono modifikovane proteine, antitela itd.; ili male molekule (manje od 1000 daltona). neorganska ili organska jedinjenja; ili molekule nukelinskih kiselina uključujući dvolančane ili jednolančane DNK, ili dvolančane ili jednolanČane RNK. kao i molekule nukleinske kiseline sa trostrukim heliksom. Terapeutski agensi mogu biti izvedeni iz bilo kog poznatog organizma (uključujući, ali se ne ograničavajući na, životinje, biljke, bakterije, gljive, i praživotinje ili viruse) ili iz biblioteke sintetičkih molekula.

[0061]U specifičnom primeru izvođenja, postupci i upotrebe pronalaska obuhvataju primenu bispecifičnog jednolančanog antitela ili farmaceutske kompozicije kao što je ovde definisano u kombinaciji sa primenom jednog ili više terapeutskih agenasa koji su inhibitori kinaza kao što je Gefilinib (Iressa), Erlotinib (Tarceva). anti-EGFR-antitela (npr. Cetuximab; Erbitux), ili anti-Her2/neu-antitela (npr. Trastuzumab; Herceptin) opisanih u tehnici; videti npr,, Hardie and Manks (1995) The Protein Kinase Facts Book. 1 and II. Acadcmic Press, San Diego, California.

[0062]U sledećem specifičnom primeru izvođenja, postupci i upotrebe pronalaska obuhvataju primenu bispecifičnog jednolančanog antitela ili farmaceutske kompozicije kao što je ovde definisano u kombinaciji sa primenom jednog ili više terapeutskih agenasa koji su inhibitori angiogeneze kao što su anti-VEGF-antitela (npr. Bevacizumab; Avastin). mala molekularna jedinjenja (npr. Vatalanib ili Sorafenib) ili COX-inhibitori opisani u tehnici.

[0063]U sledećem spedifičnom primeru izvođenja, postupci i upotrebe pronalaska obuhvataju primenu bispecifičnog jednolančanog antitela ili farmaceutske kompozicije kao što je ovde definisano u kombinaciji sa primenom jednog ili više terapeutskih agenasa koji su anti-kancer agensi kao što su 5-Fluorouracil, Leucovorin, Capecitabine, Oxaliplatin, Irinotecan, Gemcitabine, Doxorubicin, Epirubicin, Etoposide, Cisplatin. Carboplatin, Taxanes (npr. Docetaxel, Paclitaxel) opisani u tehnici.

[0064]Poželjno, ko-terapija pacijenta sa epitelijalnim tumorom koja koristi bispecifično jednolančano antitelo ili farmaceutsku kompoziciju kao što je ovde definisano u kombinaciji sa (a) dodatnim terapeutskim agcnsom(agensima) rczultuje u sinergističkom efektu. Kao što je ovde korišćeno, termin "sinergistički" odnosi se na kombinaciju terapija (npr., kombinaciju bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde definisano i (a) dodatnog terapeutskog agensa(agenasa) kao što je prethodno dato) koja je efikasnija od aditivnih efekata bilo koje dve ili više pojedinačne terapije (npr., jednog ili više terapeutskih agenasa). Na primer, bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano može izazvati smanjenje prečnika epitelijalnog tumora od 20% ukoliko je primenjeno na pacijenta kao monoterapija. Nasuprot tome, drugi terapeutik npr. anti-kancer agens kao što je definisano u nastavku, može izazvati smanjenje tumora od 10%. Međutim, ukoliko su oba i bispecifično jednolančano antitelo kao Što je ovde definisano i pomenuti drugi terapeutik primenjeni u kombinaciju u obliku ko-terapije. može se uočiti smanjenje tumora od 50%. Sinergistički efekat kombinacije terapija (npr., kombinacije bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde definisano i (a) dodatnog terapeutskog agensa(agenasa) kao što je prethodno dato) omogućava upotrebu nižih doza jedne ili više terapija (npr., jednog ili više terapeutskih agenasa) i/ili manje čestu primenu pomenutih terapija na pacijenta sa bolešću, npr. epitelijalnim tumorom. Sposobnost da se koriste niže doze terapije (npr., terapeutskih agenasa) i/ili da se primene pomenute terapije rede smanjuje toksičnost povezanu sa primenom pomenutih terapija na subjekta bez smanjenja efikasnosti pomenutih terapija u prevenciji ili tretmanu bolesti, npr. epitelijalnog tumora. Dodatno, sinergistički efekat može rezultovati u poboljšanoj efikasnosti terapija (npr., terapeutskih agenasa) u prevenciji, upravljanju, tretmanu i/ili ublažavanju epitelijalnog tumora (koji može biti povezan sa aberantnom ekspresijom (npr., prekomernom ekspresijom) ili aktivnošću CEA). Konačno, sinergistički efekat kombinacije terapija (npr., terapeutskih agenasa) može izbeći ili smanjiti štetne ili neželjene sporedne efekte povezane sa upotrebom bilo koje pojedinačne terapije.

[0065] U pomenutoj ko-terapiji, aktivni agens može biti izborno uključen u istu farmaceutsku kompoziciju kao bispecifično jednolančano antitelo definisano ovde, ili može biti uključeno u posebnu farmaceutsku kompoziciju. U ovom poslednjem slučaju, pomenuta zasebna farmaceutska kompozicija je pogodna za primenu pre, simultano ili nakon primene pomenute farmaceutske kompozeije koja sadrži bispecifično jednolančano antitelo kao što je ovde definisano. Dodatni lek ili farmaceutska kompozicija može biti neproteinsko jedinjenje ili proteinsko jedinjenje. U slučaju da je dodatni lek proteinsko jedinjenje, pogodno je da je proteinsko jedinjenje sposobno da obezbeđi aktivacioni signal za imune efektorske ćelije. Poželjno, pomenuto proteinsko jedinjenje ili neproteinsko jedinjenje može se primeniti simultano ili nesimultano sa bispecifičnim jednolančanim antitelom kao što je ovde definisano, molekulom nukleinske kiseline kao što je ovde definisano, vektor kao što je ovde definisano, ili domaćin kao što je ovde definisano. Poželjno, pomenuti subjekat koji se tretira je čovek. |0066]U sledećem primeru izvođenja, bispecifično jednolančano antitelo ili anti-CEA scFvs kao što je ovde definisano može biti konjugovano sa dijagnostičkim ili detektabilnhn agensom. Takva dijagnoza i detekcija može se postići vezivanjem antitela ili scFv sa detektabilnom supstancom na primer za različite enzime, kao što je peroksidaza rena. alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, ili acetilholinesteraza; prostetičke grupe, kao što su streptavidin/biotin i avidin/biotin; fluorescentni materijali, kao što su. umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein. dansil hlorid ili fikoeritrin; luminescentni materijali kao Što su. luminol: bioluminescentni materijali, kao što su luciferaza, luciferin, i ekvorin; radioaktivni materijali i izotopi, kao što je kobalt (^Co), inđijum (,lsIn, ll3ln, !l2In, '"<I>n), jod (<13l>l,<125>I. l2-f. I2II). ili itrijum (<m>Y), pozitron emitujući metali korišćenjem različitih pozitron emisionih tomografija. i neradioaktivni paramagnetski metalni joni. |0067JTehnike za konjugaciju grupa sa antitelima su dobro poznate. Grupe se mogu konjugovati sa antitelima bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući, ali se ne ograničavajući na aldehid/Schiff vezu, sulfhidril vezu. kiselu labilnu vezu. cis-akonitil vezu, hiđrazon vezu, enzimatski degradabilnu vezu; videti generalno Garnett, 2002. Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216. Dodatne tehnike za konjugovanje grupa sa antitelima su dobro poznate, videti, npr., Arnon et al.. Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapv. In Monoclonal Antibodies And Cancer Therapv. Reisfeld et al. (eds.). pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985). Postupci za fuzionisanje ili konjugovanje antitela sa polipeptidnim grupama poznati su u tehnici; videti. npr; Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539. Fuzionisanje antitela sa grupom ne mora biti direktno, ali se može desiti preko linker sekvenci. Takvi linker molekuli su opšte poznati u tehnici i opisani u Denardo et al., 1998. Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al.. 1999. Bioconjug. Chem. 10:553. |0068]U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na komplet koji sadrži bispecifično jednolančano antitelo kkao što je ovde definisano. molekul nukleinske kiseline kao što je ovde definisano, vektor kao što je ovde definisano, ili domaćina kao što je ovde definisano.

[0069]Ovi i drugi primeri izvođenja opisani su i obuhvaćeni opisom i Primerima ovog pronalaska. Rekombinantne tehnike i postupci u imunologiji su opisani npr. in Sambrook et al. Molecular CIoning: A Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 3rd edition 2001; Lefkovits; Immunologv Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular CIoning Manual; Cold Spring Laboratorv Press, 2002. Dodatna literatura koja se odnosi na bilo koje od antitela, postupke, upotrebe i jedinjenja koja treba upotrebiti u skladu sa ovim pronalaskom mogu se dobiti iz javnih biblioteka i baza podataka, korišćenjem na primer elektronskih uređaja. Na primer, javna baza podataka "Medline". dostupna na Internetu, može se koristiti, na primer na http://www.ncbi.nlm. nih.qov/PubMed/medline.htrnl. Druge baze podataka i adrese , kao što je http: //www.ncbi.nim.nih.qov/. http://wvw.infobioaen.fr/, http://www.fmi.ch/bioloqv/researchtools.html. http://www.tiqr.orQ/. Poznati su stručnjacima i mogu se takođe dobiti korišćenjem, npr., http://wwvv.lvcos.com. Za teme u vezi tumora videti npr. http://www.nih.gov ili http://www.dkfz.de.

|0070] Slike prikazuju:

Slika 1: Analiza FACS vezivanja različitih humanih CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata sa CHO ćelijama transficiranim sa humanim CEA i CD3 pozitivnim HPB-A11 ćelijama, respektivno. Kao pozitivna kontrola za vezivanje sa CEA, korišćeno je monoklonsko antitelo Col-1. Za kontrolu vezivanja sa humanim CD3, korišćen je CD19xCD3 bispecifični jednolančani konstrukt kao što je opisan u W0 99/054440. U ovoj pozitivnoj kontroli, debela linija predstavlja ćelije inkubirane sa 10 mg/ml prečišćenog CD19xCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela koje je nakon toga inkubirano sa anti-His antitelom i antitelom za detekciju. Tanka linija histograma odražava negativnu kontrolu: ćelija inkubirana sa anti-His antitelom i antitelom za detekciju. Vezujuća aktivnost za humani (membranski vezan) CEA i humani CD3 bile su detektabilne za CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAI VLVHxSEQ ID N0.77 VHVL. CEAII VHVLxSEQ ID N0.77 VHVL, CEAII1 VLVHxSEQ ID N0.77 VHVL i CEAIII VHVLxSEQ ID N0.77 VHVL. U respektivnim histogramima koji odgovaraju bispecifičnim jednolančanim antitelima kao što je opisano u pronalasku, tanka linija predstavlja negativnu kontrolu, svetla debela linija predstavlja ćelije inkubirane sa supematantom kulture, dok tamna debela (sasvim desno) linija predstavlja ćelije inkubirane sa 10 mg/ml prečišćenog bispecifičnog jednolančanog antitela.

Slika 2: Vezujući signali bispecifičnog jednolančanog anti-CEA/anti-CD3 antitela CEAI

VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL, CEAII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL i CEAIII

VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL i anti-CEA antitela Col-1 sa raslvorljivim CEA detektovanim sa direktnim ELISA. CEAI VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (anti-CEA vezujući domen izveden iz mAb A5B7), CEAII VHVLxSEQ ID N0.77 VHVL (anti-CEA vezujući domen izveden iz mAb T84.66), i CEAIII VHVLxSEQ ID N0.77 VHVL (anti-CEA vezujući domen izveden iz mAb MFE-23) bispecifična jednolančana antitela i mišje monoklonsko antitelo Col-1 specifično vezano za imobilisani rastvorljivi humani CEA. Nije uočen signal vezivanja u odsustvu rastvorljivog CEA antigena (PBS kontrola).

Slika 3: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO ćelije transficirane sa CEA. u odsustvu rastvorljivog CEA. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Da bi se demonstrirala specifičnost preusmerene lize, ne-CEA reaktivni bispecifični jednolančani konstrukt bio je uključen kao negativna kontrola. Mogla se pokazati citotoksična aktivnost protiv humanih CEA-transi!ciranih target ćelija (CHO-CEA+ ćelije) za različite rasporede domena, tj. za SEQ ID N0.77 VHVLxCEAl VHVL i SEQ ID N0.77 VHVLxCEAI VLVH (oba konstrukta sa anti-CD3 vezujućim domenom N-terminalno). kao i za CEAI VLVHxSEQ ID N0.77 VHVL i CEAI VHVLxSEQ ID N0.77 VHVL (anli-CD3 vezujući domen C-terminalno). Nelransiicirane CHO ćelije (bez humanog CEA) korišćene su kao negativna kontrola.

Slika 4: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO ćelije transficirane sa CEA. u odsustvu rastvorljivog CEA. Da bi se demonstrirala specifičnost preusmerene lize, netransficirane CHO ćelije su uključene kao negativna kontrola. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. CEA I-HL (CEAI VHVLxSEQ ID N0.77 VHVL), CEA II1-LH (CEAIII VLVHxSEQ

ID N0.77 VHVL), CEA III-HL (CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL). i CEA II HL

(CEAII VIIVLxSEQ ID NO.77 VHVL) pokazali su citotoksičnu aktivnost protiv humanih CEA-transifciranih CHO ćelija. Netransficirane CHO ćelije (bez humanog CEA) korišćene su kao negativna kontrola za CEA I-LH (CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL), CEA III-HL

(CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL) i CEA II HL (CEAII VHVLxSEQ ID NO.77

VHVL). CEAI označava varijabilni region izveden iz mišjeg mAb A5B7. CEAII je varijabilni region izveden iz mišjeg mAb T84.66 i CEAIII odnosi se na varijabilni region iz mišjeg mAb MFE-23.

Slika 5: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO ćelije transficirane sa CEA u prisustvu rastvorljivog humanog CEA. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Citotoksična aktivnost posredovana sa CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL i CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL nije inhibirana sa rastućim količinama rastvorljivog humanog CEA, do 1 mg/ml. CEAI je varijabilni region izveden iz mišjeg mAb A5B7.

Slika 6: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO ćelije transficirane sa CEA u prisustvu rastvorljivog humanog CEA. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Citotoksična aktivnost posredovana sa SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL i SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH nije inhibirana sa rastućim količinama rastvorljivog humanog CEA. do 1 mg/ml. CEAI je varijabilni region izveden iz mišjeg mAb A5B7.

Slika 7: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukt preusmerio je T ćelije da liziraju CHO ćelije transficirane sa CEA u prisustvu rastvorljivog humanog CEA. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Citotoksična aktivnost CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL je inhibirana povećanjem količina rastvorljivog CEA. CEAII VHVL je izveden iz mAb T84.66.

Slika 8:Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO ćelije transficirane sa CEA u prisustvu rastvorljivog humanog CEA. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Dok je CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-posredovana citotoksičnost rezistentna na inhibiciju sa rastvorljivim CEA antigenom, CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-posredovana citotoksična aktivnost je inhibirana sa čak malim količinama rastvorljivog CEA. CEAIII VHVL je izveden iz mAb MFE-23, dok je CEAI varijabilni region izveden iz mišjeg mAb A5B7.

Slika9: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju Kato III ćelije u prisustvu rastućih količina rastvorljivog CEA antigena. Nativni humani PBMCs su korišćeni kao efektorske ćelije. CEAII VHVLxSEQ ID NO. 77-posredovana citotoksična aktivnost nije rezistentna na rastvorljivi CEA. CEAII VHVL je izveden iz mAb T84.66.

Slika 10:Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju Kato III ćelije u prisustvu rastućih količina rastvorljivog CEA antigena. Stimulisane humane CDS pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-posredovana citotoksičnost je rezistentna na rastvorljivi CEA. Nasuprot tome, CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-posredovana citotoksična aktivnost je inhibirana sa rastućim količinama rastvorljivog CEA. CEAII VHVL je izveden iz mAb T84.66, dok je CEAI varijabilni region izveden iz mišjeg mAb A5B7.

Slika 11:Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO ćelije transficirane sa CEA u prisustvu povećanih količina rastvorljivog CEA antigena. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-posredovana citotoksična aktivnost je inhibirana sa rastućim količinama rastvorljivog CEA. CEAII VHVL je izveden iz mAb T84.66.

Slika 12:Protočno citometrijska analiza periplazmatskih preparata koji sadrže Flag-obeležene fragmente scFv proteina iz izabranih klonova. Periplazmatski preparati rastvorljvih fragmenata scFv proteina dodati su u 100.000 do 200.000 CEA-transficirane CFIO ćelije. Za detekciju monoklonsko anti-Flag antitelo je korišćeno nakon čega je korišćeno PE-obeleženo poliklonsko anti-mišje antitelo. ScFvs vezivanje za ćelije mereno je povećanjem u intenzitetu fluorescencije u poredenju sa ćelijama koje su inkubirane samo sa samim PBS. Intenzitet fluorescencije je blotovan na X-osi, broj događaja je blotovan na Y-osi. Negativna kontrola (PBS i reagensi za detekciju) je prikazana kao puna kriva, respektivni scFvs prikazani su ako sive linije. Pomeranje udesno pokazuje pozitivno vezivanje za ćelije. Svi scFvs. tj. A-121. A-183, A-240, A-3 13, A-290, A-315, A4-35, A4-52 i MP2-A5. vezuju se za membranski vezani CEA na CHO ćelijama. Svaki od scFv se sastoji od mišjeg A5B7 VH regiona i humanog VL regiona, kao što je opisano u Primeru 6.

Slika 13:Protočno citometrijska analiza periplazmatskih preparata koji sadrže Flag-obeležene fragmente scFv proteina iz izabranog. Periplazmatski preparati fragmenata rastvorljivog scFv proteina dodati su u 100,000 do 200,000 CEA transficirane CHO ćelije. Detekcija je izvedena monoklonskim anti-Flag antitelom nakog čega je upotrebljeno PE-obeleženo poliklonsko anti-mišje antitelo. ScFvs vezivanje za ćelije mereno je preko povećanja u intenzitetu fluorescencije u poredenju sa ćelijama koje su inkubirane sa samim PBS. Intenzitet fluorescencije je blotovan na X-osu, broj događaja je blotovan na is Y-osu. Negativna kontrola (PBS i reagensi za detekciju) prikazana je kao puna kriva, respektivni scFvs su prikazani kao sive linije. Pomeranje udesno pokazuje pozitivno vezivanje za ćelije. Potpuno humani scFv konstrukti MP510 3-A5.3. MP510_3-B9.1. i MP510_3-D8.1 vezuju se za membranski vezani CEA na CHO ćelijama. Svaki od ovih scFvs sastoji se od humanog VH regiona i humanog VL regiona A240, kao što je prikazano u Primeru 7. 240 Vlambda.3 je scFv koji se sastoji od mišjeg A5B7 VH regiona i humanog VL A-240 regiona. Ovaj konstrukt takođe pokazuje CEA-vezujuću aktivnost.

Slika 14:Analiza FACS vezivanja različitih humanih CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata sa Kato III ćelijama i HPB-A11 ćelijama, respektivno. Debela linija predstavlja ćelije inkubirane sa supernatantom ćeli jske kulture transfici ranih CHO ćelija inkubiranih sa anti-His antitelom i antitelom za detekciju. Tanka linija histograma odražava negativnu kontrolu: ćelije inkubirane sa anti-His antitelom i antitelom za detekciju. Humani konstrukti bispecifičnog jednolančanog antitela A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, i D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL vezuju se za humani CEA na Kato ćelijama i za humani CD3 na HPB-A11 ćelijama. CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL sa VH regionom CEA vezujućim domenom izvedenim iz mAb A5B7 pokazuje istu vezujuću aktivnost.

Slika15: Citotoksični test naznačenih CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata preusmerenih na CHO ćelije transficirane sa CEA. u odsustvu rastvorljivog CEA. Stimulisane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Citotoksična aktivnost se mogla detektovati za A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL. B9 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL, D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL i CEAI VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL. CEAI VH je VH region izveden iz mAb A5B7.

Slika16: Citotoksični test naznačenih CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata preusmerenih na CHO ćelije transficirane sa CEA. u odsustvu rastvorljivog CEA. Stimulisane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Ova slika demonstrira citotoksičnu aktivnost A240 VL-A5 VHxSEQ ID NO.77 VHVL. A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, A240 VL-D8 VHx SEQ ID NO.77 VHVL. i A240 VL-CEAI VHx SEQ ID NO.77 VHVL.

Slika17: Citotoksični test naznačenih CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata preusmerenih na CHO ćelije transficirane sa CEA, u odsustvu rastvorljivog CEA. Stimulisane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Citotoksičnost protiv CEA+ target ćelija prikazana je za SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VIlVLxD8 VII-A240 VL. SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VH-A240 VL i SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH.

Figure18:Citotoksični test naznačenih CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata preusmerenih na CHO ćelije transficirane sa CEA, u odsustvu rastvorljivog CEA. Stimulisane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Citotoksična aktivnost je prikazana za SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-A5 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-D8 VH, i SEQ ID NO.77 VHVLx A240VL-CEAI VH i SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH.

Slika 19:Citotoksični test naznačenih CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata preusmerenih na CHO ćelije transficirane sa CEA, u prisustvu rastućih količina rastvorljivog CEA antigena. Stimulisane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Slika demonstrira rezistenciju citotoksične aktivnosti konstrukata humanih bispecifičnih jednolančanih antitela na rastvorljivi CEA antigen, kao što je dato primerom A5 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL and B9 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL.

Slika 20:Citotoksični test naznačenih CEA-reaktivnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata preusmerenih na CHO ćelije transficirane sa CEA. u prisustvu rastućih količina rastvorljivog CEiA antigena. Stimulisane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Konstrukti humanog bispecifičnog jednolančanog antitela D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL i CEAI VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVLlakođe pokazuju rezistenciju na rastvorljivi CEA antigen.

Slika21: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifilni jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO ćelije transficirane sa CEA. u odsustvu rastvorljivog CEA. Da bi se demonstrirala specifičnost preusmerene lize, netransficirane CHO ćelije su uključene kao negativna kontrola. Stimulisane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL. SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH. SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL, B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, i SEQ ID NO.77 VHVLxCEA I VHVL pokazali su citotoksični. aktivnost protiv humanih CEA-transifciranih CHO ćelija.

Slika 22: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO-CEA+ ćelije u prisustvu rastućih količina rastvorljivog CEA antigena. Stimulisane CD8+ T ćelije su korišćene kao efektorske ćelije. A240 VL-B9 VHx SEQ ID NO.77 VHVL-posredovana citotoksična aktivnost je rezistentna na rastvorljivi CEA.

Slika 23: Katjon izmenjivački hromatogram visoke rezolucije bispecifičnog jednolančanog konstrukta A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, plava linija (gornja kriva) prikazuje naelektrisane izoforme proteina. Jedan pik je detektovan koji prikazuje visoku homogenost konstrukta.

Slika24: Test stabilinosti proteina zasnovan na proceni citotoksičnosti nakon inkubacije humane plazme 24h. CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukt preusmeren na CHO ćelije transficirane sa CEA, u odsustvu rastvorljivog CEA. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Slika demonstrira stabilnost u plazmi bispecifičnog jednolančanog konstrukta A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL u humanoj plazmi. Na citotoksičnu aktivnost konstrukta ne utiču proteini u plazmi pod fiziološkim uslovima.

Slika25: Katjon izmenjivački hromatogram visoke rezolucije bispecifičnog jednolančanog konstrukta SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL, plava linija (gornja kriva) prikazuje naelektrisane izoforme proteina. Slika demonstrira homogenost bispecifičnog jednolančanog konstrukta SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL.

Slika26: Test stabilinosti proteina zasnovan na proceni citotoksičnosti nakon inkubacije humane plazme 24h. CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukt preusmeren na CHO ćelije transficirane sa CEA, u odsustvu rastvorljivog CEA. Stimulisane humane CD8 pozitivne CTLs korišćene su kao efektorske ćelije. Slika demonstrira stabilnost u plazmi bispecifičnog jednolančanog konstrukta SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL u humanoj plazmi. Na citotoksični. aktivnost konstrukta ne utiču proteini u plazmi pod fiziološkim uslovima.

Slika 27: Naznačeni CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukti preusmerili su T ćelije da liziraju CHO-CEA+ ćelije u prisustvu rastućih količina CEA antigena. Stimulisane humane CD8+ T ćelije su korišćene kao efektorske ćelije. Bispecifični jednolančani konstrukt SEQ ID NO.77 VFIVLxE12 VH-A240 VL posredovao je citotoksičnu aktivnost koja je rezistentna na rastvorljivi CEA.

[0071] Sledeći Primeri i Iustruj u pronalazak: PRIMER 1: Generisanje CHO ćelija transficiranih sa humanim CEA

(karcinoembrionalni antigen-srodni ćelijski adhezioni molekul 5; CEACAM5)

[0072] CEA-pozitivne Kato III ćelije (humana ćelijska linija karcinoma želuca; ATCC HTB-103) korišćene su da se dobije ukupna RNK koja je izolovana prema instrukcijama iz priručnika kompleta (Qiagen, RNeasv Mini Kit). Dobijena RNK je korišćena za sintezu cDNK randomizovano prjamovanom reverznom transkripcijom. Za kloniranje sekvence u punoj dužini CEA antigena, korišćeni su sledeći oligonukleotidi: 5' CEACAM5 EcoRI

GAATTCGCCACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCC (SEQ ID NO. 74) i 3" CEACAM5 Sal I

GTCGACCTATATCAGAGCAACCCC (SEQ ID NO. 75). PCR (denaturacija na 93 °C 5 min, aniling na 58°C 1 min, elongacija na 72°C 1 min za prvi ciklus; denaturacija na 93°C 1 min, aniling na 58°C 1 min, elongacija na 72°C 1 min 30 ciklusa: terminalna ekstenzija na 72°C 5 min) je korišćena za amplifikaciju kodirajuće sekvence. PCR proizvod je nakon toga digestovan sa EcoRI i Sali, vezan u odgovarajuće digestovani ekspresioni vektor pEF-DHFR, i transformisan u E.coli. Izolovana plazmiđna DNK je sekvencirana i upoređena sa ustanovljenom nukleotidnom sekvencom CEACAM5 (NM 004363 u National Center for biotechnologv infomiation, http://vvwvv.ncbi.nlm.nih.gov/). Prethodno pomenute procedure su izvedene prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular CIoning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (1989; 2001). Klon sa verifikovanom nukleotidnom sekvencom je transficiran u DHFR deficijentne CHO ćelije za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama je izvedena kao što je opisano u Kaufmann (Kaufmann R.J., Methods Enzvmol. 185 (1990), 537-566). Amplifikacija gena konstrukta indukovana je rastućim koncentracijama MTX do finalne koncentracije od do 20 nM MTX. Transficirane ćelije su testirane u odnosu na ekspresiju CEA antigena korišćenjem FACS testa. U tu svrhu.

2.5x10° transficiranih ćelija je inkubirano sa 5 ug/ml mišjeg monoklonskog antitela COL-1 (No. MS-613-P1ABX, Neomakers: Fremont. CA. USA). Vezivanje antitela je detektovano sa R-fikoeritrin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab<*>)2 fragment, kozjim anti-miŠjim IgG, Fc-gama fragment specifičnim antitelom, razbiaženim 1:100 u 50 ul PBS sa 2% FCS (dobijen od Dianova. Hamburg, Germany). Ćelije su analizirane protočnom citometrijom na FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg). FACS bojenje i merenje intenziteta fluorescencije izvedeno je kao što je prikazano u Current Protocols in Immunology (Coligan. Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002). Kao rezultat, transfektanti su pokazali jasno pozitivno bojenje za humani CEA antigen.

PRIMER 2: Generisanje CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela

|0073]Generalno, molekuli bispecifičnog jednolančanog antitela, gde svaki sadrži domen sa vezujućom specifičnošću za humani CEA antigen kao i deimunizovani domen sa vezujućom specifičnošću za humani CD3 antigen prikazan u SEQ ID NO.77 dizajnirani su kao što je dato u Tabeli 1. Raspored V regiona u ovom CD3 vezujućem domenu je uvek VH-VL. Ovaj deimunizovani anti-CD3 vezujući domen korišćen u bispecifičnim jednolančanim antitelima kao što je ovde definisano prethodno je opisan, npr. u WO2005/040220.

1. Formati molekula bispecifičnog jednolančanog antitela koje sadrži anti- CEA i anti- CD3

specifičnosti ( Tabela 1)

[0074]Prethodno pomenuti konstrukti koji sadrže varijabilne regione lakog lanca (VL) i varijabilne regione teškog lanca (VH) specifične za humani CEA antigen izveden iz monoklonskih antitela, hibridoma ili dobijen vođenom selekcijom fagnog prikaza (PDGS) dobijeni su sintezom gena i nakon toga kloniranjem u ekspresioni vektor koji sadrži CD3-specifične VH i VL kombinacije. Stvaranje pomenutih bispecifičnih jednolančanih konstrukata takođe se može izvesti prema rekombinantnim tehnikama opisanim npr. u Sambrook (loc.cit.). Detaljna instrukcija za to je obezbeđena npr. u WO 99/054440. Anti-CD3 vezujući domen odgovara de-imunizovanom domenu sa vezujućom specifičnošću za humani CD3 antigen. Raspored V regiona deimunizovanog anti-CD3 vezujućeg domena u bispecifičnim jednolančanim konstruktima koji su opisani ovde uvek je VH-VL. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca pomenutog VH-VL domena prikazana u SEQ ID NO. 77. CEAI, CEAII i CEAIII specifičnom za humani karcinoembrionalni antigen sadrži varijabilne regione lakog lanca (VL) i teškog lanca (VH) izvedene iz mAbs A5B7 (Chester, K. A. et al.. Ini J Cancer 57 (1994), 67-72), T84.66 (Neumaier, M. et al., Cancer Res 50

(1990). 2128-34) and MFE-23 (Boehm, M. K. Biochem J 2 (2000). 519-28), respektivno. A5, B9, D8, i E12 su humani VH regioni specifični za humani CEA, dok je A240 humani VL region sa istom specifičnošću. Generisanje humanih A5, B9, D8, E12 i A240 V regiona je opisano detaljno u Primerima 6 i 7. Odgovarajuće nukleotidne i aminokiselinske sekvence svih bispecifičnih jednolančanih antitela opisanih ovde prikazane su u listingu sekvenci.

|0075]U sledećem je detaljnije opisano generisanje CEA I VLVH x SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO.6) konstrukta. Generisanje drugih prethodno pomenutih konstrukata može se izvesti shodno tome uz obaveznu implementaciju modifikacija postupaka koje su dobro poznate stručnjacima. Da bi se generisali molekuli bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadrži prethodno pomenutu CEAI specifičnost i deimunizovani anti-CD3 (SEQ ID NO.77) specifičnost prvo su varijabilni regioni CEAI dobijeni sintezom gena prema standardnim protokolima morali biti modifikovani sa PCR da bi se dobio odgovarajući fragment

jednolančanog Fv antitela. U tu svrhu korišćena je PCR fuzija u dva koraka da bi se amplifikovala sekvenca koja kodira varijabilne regione. Set odgovarajućih prajmera dizajniran je da bi se izveli PCR-zasnovani koraci kloniranja, što na kraju rezultuje u jednolančanom antitelu koje povezuje dva varijabilna domena sa linkerom od 15 aminokiselina ([Gly4Ser]3) u redosledu VL-Linker-VH.

(0076]Ukratko korišćene su sledeće kombinacije prajmera:

[0077]Nukleotidne sekvence oligonukleotiđnih prajmera date su u nastavku:

[0078]Da bi se generisalo jednolančano antitelo, izvedena su dva PCR sa respektivnim kombinacijama prajmera koji su prethodno opisani kao PCR korak 1 i 2. Tokom ovih PCR preklapajuće komplementarne sekvence su uvedene u PCR-proizvode (koji potiču od respektivnih linker prajmera) koje su se kombinovale da bi dale kodirajući! sekvencu linkera od 15 aminokiselina tokom fuzione PCR koja sledi. Nakon toga amplifikovani VH i VL domeni su spojeni u ovoj fuzionoj PCR u kojoj su bili neophodni samo spoljni prajmeri i oba PCR-proizvoda. Rezultujuće scFv antitelo je ograničeno sa 5" kraja sa mestom koje prepoznaje restrikcioni enzim BsrGl i na 3" kraju sa mestom koje prepoznaje restrikcioni enzim BspEl. Dodavanje BsrGl mesta je izvedeno da bi se omogućilo fuzija u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom mišjeg imunoglobulin lider peptida kao što je opisano u WO2005/040220. BspEl mesto je stvoreno da bi se omogućila fuzija u okviru čitanja sa sekvencom koja kodira CD3 specifično jednolančano antitelo da bi se generisalo bispecifično jednolančano antitelo. Da bi se postigla fuzija jednolančanih Fv antitela i da bi se omogućila eukariotska ekspresija, kodirajuća sekvenca CEA specifičnog jednolančanog Fv antitela je klonirana preko BsrGl i BspEl u pEFDHFR ekspresioni vektor (pEFDHFR je opisan u Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) koji sadrži de-imunizovano anti-CD3 jednolančano Fv antitelo kao što je opisano u WO2005/040220; u ovom pronalasku označeno kao SEQ ID NO.77. pojedinačni klonovi konstrukta su izolovani i sekvencirani sa prajmerima komlpementarnim ograničavajućim regionima u ekspresionom vektoru prema standardnim protokolima (Sambrock, Molecular CIoning; A Laboratorv Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbour laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (1989)). Za dodatne eksperimente izabran je klon konstrukta sa verifikovanom nukelotidnom sekvencom.

2. Ekspresija i prečišćavanje CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela

(0079]Bispecifična jednolančana antitela su eksprimirana u ćelijama ovarijuma kineskog hrčka (CHO). Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama izvedena je kao Što je opisano u Kaufmann (loc. cil.). Amplifikacija gena konstrukata indukovana je rastućim koncentracijama MTX do finalne koncentracije od do 20 nM MTX. Nakon dva pasaža stacionarne kulture ćelije su uzgajane u roler bocama sa CHO modifikovanim DMEM medij umom (HiQ®, HiClone) 7 dana pre sakupljanja. Ćelije su uklonjene centrifugiranjem i supernatanl sa eksprimiranim proteinom uskladišten je na -20°C. Akta® FPLC System (Pharmacia) i Unicorn® Software korišćeni su za hromatografiju. Sve hemikalije su bile istraživačkog kvaliteta i kupljene od Sigma (Deisenhofen) ili Merck (Darmstadt). Afinitetna hromatografija sa imobilisanim metalnim jonima ("IMAC") izvedena je korišćenjem Fractogel® kolone (Merck) koja je napunjena sa ZnCh prema protokolu obezbeđenom od strane proizvođača. Kolona je ekvilibrisana sa puferom A2 (20 mM natrijum fosfatni pufer pH 7.5, 0.4 M NaCl) i supernatant ćelijske kulture (500 ml) primenjen je na kolonu (10 ml) sa stopom protoka od 3 ml/min. Kolona je isprana sa puferom A2 da bi se uklonio nevezani uzorak. Vezani protein je eluiran korišćenjem 2 koraka gradijenta pufera B2 (20 mM natrijum fosfatni pufer pH 7.5, 0.4 M NaCl, 0.5 M Imidazol) prema sledećem: Korak 1: 20% pufer B2 u 6 zaprem ina kolone;

Korak 2: 100% pufer B2 u 6 zapremina kolone.

[0080]Eluirane frakcije proteina iz koraka 2 pulovane su za dalje prečišćavanje.

[0081]Gel filtraciona hromatografija je izvedena na Sephadex S200 HiPrep koloni (Pharmacia) ekvilibrisanoj sa PBS (Gibco). Eluirani uzorci proteina (stopa protoka 1 ml/min) podvrgnuti su standardnom SDS-PAGE i Western Blot za detekciju. Pre prečišćavanja. kolona je kalibrisana za određivanje molekulske težine (komplet markera za molekulsku težinu, Sigma MW GF-200). Koncentracije proteina su određene korišćenjem test boje za proteine (MicroBCA, Pierce) i IgG (Biorad) kao proteinskog standarda.

[0082]CEAxCD3 bispecifična jednolančana antitela izolovana su procesom prečišćavanja IMAC iz dva koraka i gel filtracijom. Glavni proizvod je imao molekulsku težinu od oko 52 kDa pod nativnim uslovima kao Što je određeno gel filtracijom u PBS. Ova molekulska težina odgovara bispeciličnom jednolančanom antitelu. Svi konstrukti su prečišćeni prema ovom postupku.

[0083]Prečišćeni protein bispecifičnog jednolančanog antitela analiziran je sa SDS PAGE pod redukujućim uslovima izvedenim sa prethodno izlivenim 4-12% Bis Tris gelovima (Invitrogen). Priprema i primena uzorka izvedeni su prema protokolu obezbeđenom od strane proizvođača. Molekulska težina određena je sa MultiMark proteinskim standardom (Invitrogen). Gel je obojen sa koloidnim Coomassie (Invitrogen protokol). Čistoća izolovanog proteina bila je >95% kao što je određeno sa SDS-PAGE.

[0084]Western Blot je izveden korišćenjem Optitran® BA-S83 membrane i Invitrogen Blot Module prema protokolu obezbeđenom od strane proizvođača. Korišćena antitela su usmerena prema His Tag (Penta His, Qiagen) i kozjem-anti-mišjem Ig obeleženim sa alkalnom tbsfatazom (AP) (Sigma). i BCIP/NBT (Sigma) kao supstrat. Bispecifično jednolančano antitelo moglo se specifično detektovati sa Westem Blot. Jedna traka je detektovana na 52 kD što odgovara molekulu prečišćenog bispecifičnog jednolančanog antitela.

3. Analiza protočno citometrijskog vezivanja CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela

|0085]Da bi se testirala funkcionalnost konstrukata u odnosu na sposobnost vezivanja za membranski vezan humani CEA i humani CD3. izvedena je FACS analiza. U tu svrhu, korišćene su humane CEA-transficirane CHO ćelije i CD3 pozitivne humane T ćelije leukemijske ćelijske linije HPB-AII (DSMZ. Braunschvveig. ACC483). 200,000 CEA pozitivnih CHO ćelija ili 200,000 HPB-AII ćelija inkubirano je u 30 min na ledu sa 50^1 čistog ćelijskog supcmatanta CHO ćelijskih kultura gde svaka eksprimira bispecifična antitela sa različitim aranžmanima VH i VL regiona CEA i CD3 (kao što je prethodno opisano). Ćelije su isprane dva puta u PBS i vezivanje konstrukta je detektovano sa neobeleženim mišjim Penta His antitelom (razblaženo 1:20 u 50 ul PBS sa 2% FCS; Qiagen), koje se specifično vezuje za ćelijski vezan konstrukt preko C-terminalnog histidinskog taga konstrukta. Usledio je korak ispiranja da bi se uklonio nevezani mišje Penta His antitelo. Vezana anti-His antitela su detektovana sa Fc gama-apecifičnim antitelom (Dianova) konjugovanim sa fikoeritrinom, razblaženom 1:100 u 50 (.il PBS sa 2% FCS. Kao pozitivna kontrola za vezivanje za humani CEA, korišćeno je monoklonsko antitelo Col-1 (videti Primer 3). Za kontroiu vezivanja za humani CD3, upotrebljen je CD19xCD3 bispecifični

jednolančani konstrukt kao što je opisan u WO 99/054440. Kao negativna kontrola korišćen je svež medij um kulture umesto supematanta kulture.

[0086] Ćelije su analizirane protočnom citometrijom (FACS-Calibun Becton Dickinson, Heidelberg). FACS bojenje i merenje intenziteta fluorescencije izvedeno je kao što je opisano u Current Protocols in ImmunoIogy (Coligan. Kruisbeek. Margulies, Shevach and Strober. Wiley-Interscience, 2002).

[0087] Kao što je prikazano na Slici 1. nekoliko rasporeda domena bispecifičnih jednolančanih antitela, tj. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8), CEAI

VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 6), CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ

ID NO. 10), CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 12) i CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 14), vezani za humani membranski vezani CEA i humani CD3. Kao negativna kontrola, korišćeni su medij um kulture i 1. i 2. antitela za detekciju.

PRIMER 3: Vezivanje CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela na rastvorljivi humani CEA

[0088] Da bi se odredila specifičnost protiv rastvorljivog humanog CEA, različita CEAxCD3 bispecifična jednolančana antitela su testirana u ELISA.

[0089] U tu svrhu, rastvorljivi humani CEA antigen je prvo biotinilovan. Biotinilacija je postignuta u PBS sa 5% DMSO (Sigma) sa petnaestostrukim viškom EZ-Link Sulfo NHS-LC-LC-Biotin (Pierce) 1 Čas na sobnoj temperaturi u mikseru za uzorak (Dynal). Za razdvajanje slobodnog Biotina i biotinilovanog CEA antigena, test je prekomerno dijaliziran na PBS prema standardnim protokolima. Zadržana bioaktivnost biotin-obeleženog CEA potvrđena je u ELISA eksperimentima sa vezivanjem.

[0090] Direktna ELISA da bi se odredila specifičnost CEAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela protiv rastvorljivog humanog CEA izveden je prema standardnim procedurama. Ukratko, 50 ul/komorici PBS ili rastvorljivog biotinilovanog humanog CEA (Abcam; 5 ug/ul in lxPBS) imobilizovano je na 96-komornoj streptavidin-obloženoj ELISA ploči (Nunc) inkubacijom na 4 °C oko 16 Časova. Nakon ispiranja sa 200 ml vode po komorici je dodato 200 ul blokirajućeg rastvora (PBS/3 % BSA). Nakon blokiranja 1 h na sobnoj temperaturi uklonjen je blokirajući rastvor. Sva naknadna ispiranja (200 ul/komorici of lxPBS/0.05%

(v/v) Tween20) i koraci inkubacije izvedeni su na sobnoj temperaturi. Nakon jednog ispiranja. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8; anti-CEA deo izveden iz mAb A5B7). CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 10: anti-CEA deo izveden iz mAb

T84.66), i CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 14: anti-CEA deo izveden iz mAh MFE-23) bispecifična jednolančana antitela. i mišje monoklonsko antitelo CEA/CD66 Ab-3 (Col-1; Dunn) inkubirani su u različitim koncentracijama (0.5 ug/ul i 5 ug/).il u lxPBS: 50 ul/komorici) 1 čas. lxPBS (50 ul/komorici) dodat je kao kontrola za nespecifično vezivanje. Nakon 3 koraka ispiranja dodato je 50 ul/komorici Penta-His IgG (Qiagen; 2 ug/ul u lxPBS) za detekciju His-obeleženih bispecifičnih jednolančanih antitela. Nakon toga. komorice su isprane 3 puta i inkubirane sa 50 ul kozjim anti mišjim Fc gama-specifičnim antitelom obeleženim peroksidazoni rena (Jackson ImmuneResearch; 1:1000 u lxPBS) I Čas. Nakon ispiranja 3 puta ELISA je razvijena dodavanjem rastvora ABTS supstrata (Roche) i apsorbanca je merena na talasnoj dužini od 405 nm.

[0091 j Slika 2 prikazuje apsorbancu različitih bispecifičnih jednolančanih antitela detektovanih u ELISA. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8; anti-CEA deo izveden iz mAb A5B7). CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 10; anti-CEA deo izveden iz mAb T84.66), i CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 14; anti-CEA deo izveden iz mAb MFE-23) bispecifična jednolančana antitela i mišje monoklonsko antitelo Col-1 specifično se vezuju za rastvorljivi humani CEA. Signal vezivanja nije uočen u odsustvu CEA antigena (PBS kontrola). Ukratko, anti-CEA vezujući domeni izvedeni iz mAbs A5B7, T84.66 i MFE-23 vezuju se i za rastvorljivi i za membranski vezan CEA.

PRIMER 4: Bioaktivnost CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela

|0092[ Bioaktivnost generisanih CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela analizirana je in vitro citotoksičnim testom osobađanja hroma korišćenjem humane Kato III ćelijske linije karcinoma želuca ili humani-CEA-transficiranih CHO ćelija kao target ćelija i stimulisanih humanih CD8 pozitivnih T ćelija ili nativnih PBMC kao efektorskih ćelija, respektivno.

[0093] Generisanje stimulisanih CD8+ T ćelija izvedeno je kao što sledi: Petri šolja (145 mm prečnika, greiner bio-one) prethodno je obložena sa anti-CD3 antitelom (OKT3 Janssen-Cilag GmbH, Orthoclone 1 mg/ml; finalna koncentracija lug/ml) i anti-CD28 antitelom (BD, 1 mg/ml; finalna koncentracija lug/ml) 1 čas na 37°C. Nakon inkubacionog perioda, nevezani protein je uklonjen jednim korakom ispiranja sa PBS. Sveže PBMC's su izolovane iz periferne krvi (30 - 50 ml) centrifugiranjem u Ficoll gradijentu prema standardnim protokolima. 3 - 5 x IO<7>PBMCs su dodate prethodno obeleženoj petri šolji u 150 ml RPMI 1640 / 10% FCS / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron) i stimulisane 2 dana. Trećeg dana ćelije su sakupljene, jednom isprane sa RPMI 1640 i prenete u veliku T-bocu. IL-2 je dodat finalnoj koncentraciji od 20 U/ml i ponovo kultivisan jedan dan. CD8+ CTLs su izolovane uz pomoć CD8 negativnog kompleta za izolaciju (Dynal Biotech) prateći instrukcije iz priručnika. Nativne PBMCs su korišćene direktno nakon centrifugiranja u Ficoll gradijentu bez procedure stimulacije. Target ćelije su dva puta isprane sa PBS i obeležene sa 11.1 MBq<5l>Cr u finalnoj zapremini od lOOul RJ<5>MI sa 50% FCS 45 minuta na 37°C. Nakon toga, obeležene target ćelije su isprane 3 puta sa 5 ml RPMI i zatim su korišćene u citotoksičnom testu. Test je izveden u 96 komornoj ploči sa okruglim dnom u ukupnoj zapremini od 250ul sa dodatkom RPMI (kao prethodno) sa E:T odnosom od 10:1 koji odgovara 5000 target ćelija i 50000 efektorskih ćelija po komorici. Za procenu konstrukata primenjene su početna koncentracija od lug/ml bispecifičnih jednolančanih molekula u test zapremini i 12 njihovih trostrukih razblaženja. Vreme testa je bilo 18 časova i citotoksičnost je merena kao relativne vrednosti oslobođenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maksimalne lize (dodatak Triton-X) i spontane lize (bez efektorskih ćelija). Sva merenja su urađena u triplikatu. Merenje aktivnosti hroma u supernatantima izvedeno je sa Wizard 3 gammacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Germanv). Analiza eksperimentalnih podataka izvedena je sa Prism 4 for Windows (verzija 4.02, GraphPad Sofhvare Inc., San Diego, California, USA). Sigmoidalne krive odgovora na dozu tipično su imale R<2>vrednosti >0.90 kao što je određeno softverom. ECso vrednosti izračunate programom za analizu korišćene su za poređenje bioaktivnosti.

[0094]Slika 3 prikazuje citotoksičnu aktivnost protiv humani CEA-transifciranih target ćelija (CHO-CEA+ ćelije) za različite rasporede domena, tj. za SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL (SEQ ID NO. 4) i SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH (SEQ ID NO. 2) (oba konstrukta sa anti-CD3 delom N-terminalno). kao i za CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 6) i CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8) (anti-CD3 C-terminalno). Netransficirane CHO ćelije (bez humanog CEA) korišćene su kao negativna kontrola.

[0095]Na Slici 4, CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8), CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 12). CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 14), i CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 10) prikazali su citotoksičnu aktivnost protiv humanih CEA-transifciranih CHO ćelija. Netransficirane CHO ćelije (bez humanog CEA) korišćene su kao negativna kontrola. Kao što je prethodno dato. CEAI označava varijabilni region izveden iz mišjeg mAb A5B7, CEAII je varijabilni region region izveden iz mišjeg mAb T84.66 i CEAIII se odnosi na varijabilni region iz mišjeg mAb MFE-23.

[0096) Ukratko, svi testirani konstrukti pokazali su citotoksičnu aktivnost protiv (humani) CEA eksprimirajućih Kato III i humani CEA-transficiranih CHO ćelija, u odsustvu humanog

CEA.

Primer 5: Bioaktivnost CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela specifičnih u prisustvu rastvorljivog CEA antigena

[0097] Kompetitivni testovi su izvedeni kao što je opisano u Primeru 4. uz sledeći izuzetak: bioaktivnost CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela testirana je u prisustvu različitih koncentracija rastvorljivog humanog CEA antigena. Korišćeni rastvorljivi humani CEA antigen (AbCAM Ltd. Cambridge UK) izolovan je iz metastazirajućeg karcinoma debelog creva iz jetre jednog pacijenta. Eksperimentalno, kompetitivni test je izvden prethodnom inkubacijom date količine bispecifičnog jednolančanog antitela sa rastućim količinama rastvorljivog humanog CEA antigena (ili 0 ug/ml; 0.1 ug/ml: 1 ug/ml. ili 0 ug/ml; 0.004 ug/ml; 0.02 ug/ml; 0.1 ug/ml; 0.5 ug/ml; 1 ug/ml) 30 minuta na 37°C pre dodavanja ćelija. Ostatak testa je izveden kao što je opisano u Primeru 4. Rezultati ovih kompetitivnih eksperimenata prikazani su na Slikama 5 do 11.

[0098] Citotoksična aktivnost bispecifičnih jednolančanih antitela CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 10; videti Slike 7 i 9 do 11) sa anti-CEA delom izvedenim iz mAb T84.66, i CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 12; videti Sliku 8) sa anti-CEA regionom izvedenim iz mAb MFE-23. protiv humani CEA-pozitivnih target ćelija drastično je inhibirana sa rastućim količinama rastvorljivog humanog CEA antigena. Kao što je prethodno dato, pomenuti konstrukti se vezuju i za membranski vezan i za rastvorljivi humani CEA antigen; videti npr. Primere 2 i 3 i Slike 1 i 2. Stoga, najverovatnije, rastvorljivi humani CEA sprečava anti-CEA deo pomenutih bispecifičnih jednolančanih antitela da se veže za membranski vezan humani CEA na target ćelijama, na primer CHO-CEA+ ili Kato 111 tumor ćelije, čime se inhibira citotoksična aktivnost posredovana pomenutim konstruktima antitela.

[0099] Nasuprot tome, iznenađujuće je nađeno da su bispecifična jednolančana antitela sa anti-CEA delom izvedena iz mAb A5B7 rezistentna na raslvorljvi humani CEA: Na primer, citotoksična aktivnost posredovana sa CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 6; videti Sliku 5), CEAI VIIVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8; videti Slike 5, 8 i 10), SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL (SEQ ID NO. 4; videti Sliku 6) i SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH (SEQ ID NO. 2; videti Sliku 6) nije inhibirana rastućim količinama rastvorljivog humanog CEA. čak ni sa visokim koncentracijama (] ug/ml). Ovo se nije moglo očekivati u pogledu činjenice da se anti-CEA deo pomenutih bispecifičnih jednolančanih antitela vezuje za rastvorljivi humani CEA (Slika 2). Umeslo toga. mogla se očekivati inhibicija citotoksične aktivnosti protiv CEA-pozitivnih target ćelija sa rastućim količinama rastvorljivog humanog CEA, kao Što je to slučaj sa T84.66- and MFE-23-izvedeni konstruktima: videti prethodno.

[0100]Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije sa citotoksičnom anti-tumorskom aktivnošću u čak i u prisustvu visokih nivoa rastvorljivog CEA antigena. Stoga, ove farmaceutske kompozicije su naročito pogodne za tretman pacijenata sa tumorom sa visokim koncentracijama rastvorljivog CEA antigen u njihovoj plazmi, kao što su pacijenti sa progresivnim epitelijalnim tumorima, metastazi raj ući m epitelijalnim tumorima, visokim tumorskim opterećenjem, kasnim sladijumom epitelijalnih tumora ili pacijenata sa tumorom sa koncentracijom CEA u serumu većom od 100 ng/ml, kao što je određeno sa ELISA.

PRIMER 6: Selekcija humanih VL regiona

[0101]Da bi se obezbedile farmaceutske kompozicije sa smanjenom imunogenošću kada se primenjuju na pacijente sa kancerom, generisana su humana bispecifična jednolančana antitela sa rezistencijom na rastvorljivi CEA antigen. U prvom koraku, izolovani su humani VL regioni sa rezistencijom na rastvorljivi CEA. Stoga, cilj ovog eksperimenta je selekcija humanih VL regiona koji se mogu upariti sa majčinskim, mišjim VH monoklonskog antitela (mAb) A5B7.

1. Biotinilacija rastvorljivog humanog CEA antigen

|0102]Za selekciju fagne biblioteke, rastvorljivi CEA antigen je biotinilovan. Biotinilacija je postignuta u PBS koji sadrži 5% DMSO (Sigma) sa petnaestostrukim viškom EZ-Link Sulfo NHS-LC-LC-Biotin (Pierce) 1 čas na sobnoj temperaturi u mikseru za uzorke (Dynal). Za razdvajanje slobodnog Biotina i biotinilovanog CEA antigena, test je prekomemo dijaliziran na PBS prema standardnim protokolima. Zadržana bioaktivnost biotin-obeleženog CEA potvrđena je u ELISA vezujućim eksperimentima.

2. Izolacija RNK iz humanih B- ćelija

[0103]100 mL krvi je uzeto iz pet zdravih humanih đonora. Mononukleame ćelije iz periferne krvi (PBMCs) izolovane su u licoll-gradijentu prema standardnim postupcima. Ukupna RNK je izolovana iz izolovanih ćelija korišćenjem RNeasv® Midi Kit (OJAGEN) prateći uputstva proizvođača. cDNK je sintetisan prema standardnim postupcima (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989.2001).

3. PCR- amplifikacija varijabilnih regiona lakog lanca ( VL- regioni)

(0104]Za izolaciju DNK V-regiona lakog lanca, RT-PCR je izvedena korišćenjem Vkappa-(5'-huVKl-Sacl-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 78), 5'-huVK2/4-Sacl-200l (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 79), 5'-huVK3-Sacl-2001 (5'-GAGCCGCACGAGCCCGAGCT CGTGVVTGACR CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 80), 5'-huVK5-Sacl-2001 (5'-GAGCCGCACGAGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC-3')

(SEQ ID NO. 81), 5'-huVK6-Sacl-2001 (5'-GAGCCGCACGAGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 82), 3'-hu-Vk-Jl-Spel-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCACCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC-3') (SEQ ID

NO. 83), 3'-hu-Vk-J2/4-Spel-BsiWI (5'-G ACG AC ACT AGTTGC AGCCA CCGTACGTTT GATCTCCASC TTGGTCC-3') (SEQ ID NO. 84). 3'-hu-Vk-J3-Spel-BsiWI (5'-G ACG AC ACT AGTTGC AGCCA CCGTACGTTT GATATCCACT TTGGTCC-3') (SEQ ID

NO. 85), 3'-hu-Vk-J5-Spel-BsiWI(5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC-3') (SEQ ID NO. 86)) i V lambda (5'-huVLla-SacI-2001 (GAG

CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG TTG ACG CAG CCG CCC TC) (SEQ ID NO. 87),

5'-huVLlb-SacI-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCA CCC TC) (SEQ ID NO. 88), 5'-huVL2-Sacl-2001 (GAG CCG CAG GAG CCC GAG CTC GCC CTG ACT CAG CCT SCC TCC GT) (SEQ ID NO. 89), 5"-huVL4-Sacl-2001 (ACC

TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAR YCM YCC TCT GC) (SEQ ID NO. 90), 5'-huVL5-Sacl2001 (ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCR SCT TCC) (SEQ ID NO. 91), 5'-huVL6-Sacl-2001 (ACC TGCGAG CTC ATG CTG ACT CAG CCC CAC TC) (SEQ ID NO. 92), 5"-huVL3/9-Sacl-2001 (GAG CCG CAC GAG CCCGAG CTC GWG CTG ACT CAG CCA CCY TC) (SEQ ID NO. 93), 5"-huVL7/8-Sacl-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG GTG ACY CAG GAG CCM TC) (SEQ ID NO. 94), 3'-hu-Vlam-Blnl-Spel-2001 (CGT GGG ACT AGTCTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT) (SEQ ID NO. 95), 3"-hu-Vlam2-Blnl-Spel-2002: CGT GGG ACT AGT CTT GGGCTG ACC GAG GAC GGT)

(SEQ ID NO. 96) setova prajmera. RNK iz humanih B-ćelija prepisana je u cDNK (kao stoje prethodno opisano) i korišćena kao šablon DNK u PCR reakcijama. Po PCR reakciji, jedan S'-prajmer je kombinovan sa jednim 3'-prajmerom. Broj različitih PCR reakcija determinisan je brojem mogućih kombinacija 5'- i 3'-prajmera. Sledeći PCR-program je korišćen za amplifikaciju: Denaturacija na 94°C 15 sekundi, aniling prajmera na 52°C 50 sekundi i ekstenzija prajmera na 72°C 90 sekundi izvedeni su u 40 ciklusa, nakon čega je izvršena finalna ekstenzija na 72°C 10 minuta. DNK V-fragmenata lakog lanca su zatim izolovane prema standardnim protokolima.

4. Konstrukcija biblioteke - kloniranje pula humanog VL

[0105]Biblioteka fagnog prikaza je generalno konstruisana na osnovu standardnih postupaka, kao što je na primer opisano u "Phage Displav: A Laboratorv Manual"; Ed. Barbas, Burton. Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratorv Press. 2001.

[0106]Prajmeri izabrani za PCR amplifikaciju dali su 5'-Sacl i 3'-Spel mesta prepoznavanja za V-fragmente lakog lanca. Postavljene su četiri reakcije ligacije, svaka se sastojala od 400 ng fragmenata lakog lanca (Sacl-Spel digestovani, 2 x kappa i 2 x lambda) i 1400 ng fagemida pComb3H5BHis (Sacl-Spel digestovano; veliki fragment; ovaj vektor je opisan u disertaciji Dr. Ralf Lutterbuse). Četiri rezultujuća pula V-lakog lanca antitela su zatim svaki transformisani u 300 mL elektrokompetentne Escherichia coli XL1 Blue elektroporacijom (2.5 kV. 0.2 cm gap kiveta, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) što je rezultovalo u veličinama biblioteke nezavisnih klonova

kappal: 2x10<8>

kappa2: 6 x 10<7>

lambdal: 9x10<7>

lambda2: 6 x 107

DNK fragmenti kapa (laki lanac) iz različitih PCR amplifikacija su ponderovani za svaku ligaciju kao što sledi: svaki 5'-prajmer definiše specifičnu grupu. LInutar ovih grupa 3'-prajmeri đefinišu podgrupe. Kapa podgrupe su ponderovane 1:2:1:1 što odgovara prajmerima 3'-hu-Vk-Jl-Spel-BsiWI : 3,-hu-Vk-J2/4-Spel-BsiWI : 3<*->hu-Vk-J3-Spel-BsiWI : 3'-hu-Vk-J5-Spel-BsiWI. Grupe su ponderovane prema distribuciji njihove klicine linije 1:1:1:0.2:0.2 što odgovara prajmerima 5'-huVKl-Sac-2001 : 5"-huVK3-Sac-2001 : 5*-huVK2/4-Sac-2001 : 5'-huVK5-Sac-2001 : 5"-huVK6-Sac-2001.

DNK fragmenti lambda (laki lanac) iz različitih PCR amplifikacija su ponderovani za svaku ligaciju kao što sledi: 5"-prajmer definiše specifičnu grupu. Unutar ovih grupa 3"-prajmeri definišu podgrupe. Lambda podgrupe su ponderovane 3:1 što odgovara prajmerima 3'-hu-Vlam-Blnl-Spel-2001: 3'-hu-Vlam2-Blnl-Spel-2002. Grupe su ponderovane prema distribuciji njihovih klicinih linija 1:1:2:2:2:3 što odgovara prajmerima 5'-huVLla-SacI-2001: 5'-huVLlb-Sacl-2001 : 5'-huVL2-Sacl-2001: 5"-huVL4-Sacl-2001 + 5"-huVL5-Sacl-2001 : 5'-huVL6-Sacl-200i + 5'-huVL7/8-Sacl-2001 : 5'-huVL3/9-Sacl-2001. Nakon elektroporacije svaka reakcija je inkubirana u SOC buljomi (Fluka) za fenotipsku ekspresiju. Dve kapa kulture su kombinovane kao i dve lambda kulture. Rezultujuća kapa kultura i rezultujuća lambda kultura su svaka zatim inkubirane preko noći u 500 mL SB selekcionog medijuma koji sadrži 50 u g/mL karbenicilina i 2 % vv/v glukoze. Sledećeg dana, ćelije su sakupljene centrifugiranjem i priprema plazmida je izvedena korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta za pripremu plazmida (Qiagen).

5. Konstrukcija biblioteke antitela - humani VL - majčinski VH

[0107) PCR je izveden da bi se amplifikovao majčinski VH mAb A5B7 iz vektora koji sadrži pomenuti majčinski VH. Za amplifikaciju je praćen PCR protokol prema standardnim procedurama korišćenjem S'-prajmera 5'-AVH-Xhol (5"-GTC ACA CTC GAG TCA GGA GGA GGC TTG GTA C-3') (SEQ ID NO. 97) i 3"-prajmera 3'-AVH-BstEII (5'-GTC ACA GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3' (SEQ ID NO. 98). Nakon prečišćavanja proizvoda amplifikacije od približno 350 bp iz analitičkog agaroznog gela, DNK fragment je isečen sa restrikcionim enzimima BstEII i Xhol. Fagemiđ pComb3H5BHis (ovaj vektor je opisan u disertaciji Dr. Ralf Lutterbuse) je odgovarajuće digestovan i veliki fragment je vezan sa prethodno pomenutim fragmentom. Nakon transformacije u E. coli XL1 blue, pojedinačni klon je kultivisan u 100 mL SB medijuma (koji sadrži 50 mg/mL karbenicilina) i plazmid je pripremljen prema standardnim protokolima. Uspešno kloniranje je potvrđeno sekvenciranjem insercije (Sequiserve, Munich). Ovaj vektor pComb3H5BHis/majčinski VH iz mAb A5B7 isečen je sa restrikcionim enzimima Sacl i Spel. Izolovan je veliki fragment vektora. Plazmid-DNK koja sadrži Vkapa- i Vlambda biblioteku isečena je sa restrikcionim enzimima Sacl i Spel. Mali Vkappa - i respektivni Vlambda fragment (svaki oko 350 bp) izolovani su prema standardnim protokolima. 1200 ng fragmenta vektora je vezano sa smešom od po 200 ng svakog Vkappa i Vlambda fragmenata. Reakcija ligacije je transformisana u 300 mL elektrokompetentne E. coli XL1 Blue elektroporacijom (2.5 kV, 0.2 cm gap kiveta, 25 mF,

200 Ohm) što je rezultovalo u ukupnoj veličini scFv biblioteke od 1.2 x 10<8>nezavisnih klonova.

10108]Nakon fenotipske ekspresije i spore adaptacije na karbenicilin. biblioteka antitela je preneta u SBCarbenicillin (50 mg/mL) selekcioni medij um. Biblioteka antitela je zatim inficirana sa infektivnom dozom od 1 x IO12 čestica helper faga VCSM13 što je rezultovalo u proizvodnji i izlučivanju filamentoznog Ml3 faga, gde je svaka čestica faga sadržavala jednolančanu pComb3H5BHis-DNK koja kodira polu-humani scFv-fragment i prikazivala odgovarajući scFv-protein kao translacionu fuziju sa proteinom III omotača faga.

6. Selekcija fagnog prikaza humanog VL

[0109]Cestice faga koje nose scFv-repertoar sakupljene su iz supernatanta kulture sa PEG8000/NaCl precipitacijom i centrifugiranjem. Zatim je oko 1 x 10" do 1 x IO<12>scFv čestica faga resuspendovano u 0.5 mL TBS/1% BSA i inkubirano sa biotinilovanim rastvorljivim CEA, koji je imobilisan u Streptavidin obloženim komoricama ELISA ploče (Nunc) 1 h. 10 ug antigen/ml PBS rastvora (50 ul) inkubirano je preko noći na 4°C u streptavidin obloženim komorama, isprano jednom sa vodom, i nakon toga blokirano 1 čas na 37°C sa 200 ul 3% BSA u TBS, koji je uklonjen nakon inkubacije. scFv fag koji se nisu specifično vezali za target antigen eliminisani su sa koracima ispiranja sa TBS/0,05 % Tvveen. Ova procedura ispiranja je ponovljena do 10 puta u sledećim rundama. |0110]Nakon ispiranja, vezujući entiteti su eluirani korišćenjem HCl-glicina, pH 2.2. Nakon neutralizacije sa 2 M Tris, pH 12, eluat je korišćen za infekciju svežih neinficiranih E. coli XLI Blue kulture. Da bi se eluirali preostali visoko vezujući entiteti 50 uL sveže E. coli XL1 blue kulture (OD600 > 0.5) dodato je u komorice i inkubirano 15 minuta. Obe kulture su zatim pomešane i ćelije uspešno transdukovane sa kopijom fagemida, koja kodira humani scFv-fragment, ponovo su selektovani u odnosu na rezistenciju na karbenicilin i nakonloga inficirane sa VCMS13 helper fagom da bi se započela druga runda prikaza antitela i in vitro selekcija. Plazmidna DNK koja odgovara 4 runde paninga izolovana je iz E. coli kultura. Za proizvodnju rastvorljivog scFv-protein, VH-VL-DNK fragmenti su isečeni iz plazmida (Xhol-Spel), i klonirani preko istih restrikcionih mesta u plazmid pComb3H5BFlag/His, u kome ekspresioni konstrukt (npr. scFv) uključuje Fiag-tag (TGDYKDDDDK) (SEQ ID NO. 99) između scFv i His6-tag i dodatni proteini faga su deletirani. Nakon ligacije svaki pul (različite runde paninga) plazmidne DNK je transformisana u 100 uL E. coli TG1 kompetentnih za toplotni šok i postavljene na karbenicilin LB-agar. Pojedinačne kolonije su uzete i inokulisane ti 120 uL LB karb (50ug/mL) 1% glukoze u 96-komornim pločama (Greiner). Komorice su zapečaćene sa semipermeabilnom membranom (Greiner) i ploče su inkubirane preko noći u šejkiranom inkubatoru na 37°C (master ploča). Zatim je 10 ul kultura sa master ploče prcneto u drugu 96 komornu ploču (radna ploča) koja sadrži 90 uL LB karb (50ug/mL) 0.1% glukoze po komorici. Nakon inkubacije 4 h u šejkiranom inkubatoru na 37°C. scFv proizvodnja je indukovana dodavanjem 20 ul LB karb 6 mM IPTG svakoj komorici. Nakon sledećeg koraka inkubacije preko noći na 30°C uz Šejkiranje, ćelije su lizirane u lh inkubaciji na sobnoj temperaturi sa 40 ul pufera za lizu (400 mM borna kiselina. 320 mM NaCl, 4 mM EDTA pH 8, 2.5 mg/mL lizozim). Rezidualne ćelije i ćelijski otpad razdvojeni su centrifugiranjem 12 minuta na 1,900 x g (Hettich). Supernatanti koji sadrže scFv molekule su zatim testirani u odnosu na vezivanje u protočno citometrijskim testovima. CHO ćelije transficirane sa humanim CEA korišćene su kao CEA-pozitivna ćelijska linija. Testovi ćelijskog vezivanja izvedeni su inicijalnom inkubacijom između 100.000 i 200,000 ćelija sa periplazmatskim preparatom koji sadrži humani scFv ili relevantne kontrole. Nakon inkubacije ćelije su isprane u PBS/1 % FCS (fetalni teleći serum) i dodatno inkubirane sa 5-10 ug/ml anti-FLAG M2 antitela (Sigma). Nakon što su ćelije ponovo isprane, inkubirane su sa poiiklonskim, PE-obeleženim anti-mišjim antitelima (Dianova) i nakon toga analizirane sa protočnom citometrijom. Oko 600 klonova je testirano u odnosu na vezujuće signale na CEA-pozitivnim CHO ćelijama. Dobijeno je 27 pozitivnih klonova. Nakon sekvenciranja respektivne scFv DNK, dobijeno je ukupno 9 različitih sekvenci. Slika 12 prikazuje vezivanje devet različitih polu-humanih scFv (tj. mišjeg A5B7 VH-humanog VL) konstrukata sa različitim ćelijskim linijama kao što je mereno protočno citometrijskom analizom. Slika sadrži više dijagrama, jedan za svaki testirani konstrukt. LI bilo kom datom dijagramu, crna distribucija prikazuje intenzitet fluorescencije za ćelije inkubirane samo sa PBS u odsustvu bilo kog konstrukta ali sa svim odgovarajućim agensima za detekciju kao što je korišćeno za detekciju scFvs. Na ovaj način, bilo koje uočeno pomeranje fluorescencije može se definitivno pripisati scFv konstruktu pre nego agensu za detekciju ili puferu. Pomeranja u fluorescenciji koja su indikativna za vezivanje konstrukta za respektivnu ćelijsku liniju prikazane su sivom linijom na svakom dijagramu. Generalno, veće pomeranje od. tj. dalje od (crne) kontrole ukazuje na jače vezivanje, dok manje pomeranje od. tj. bliže (crnoj) kontroli ukazuju na slabije vezivanje.

[0111] Sa slike 12 može se videti da konstrukti A-121. A-l 83. A-240, A-3 13. A-290, A-315. A4-35, A4-52, MP2-A5 pokazuju jasna pomeranja u intenzitetu fluorescencije u poredenju sa respektivnom kontrolom, što ukazuje na vezivanje scFvs za membranski vezan CEA na CHO target ćelijama. U sledećem, humani VL region scFv A-240 (SEQ ID NO. 48) izabran je i korišćen za izolaciju humanog VH regiona. Pomenuti humani VL region je prikazan na SEQ ID NOs. 63 (nukleotidna sekvenca) i 64 (aminokiselinska sekvenca).

PRIMER 7: Konstrukcija biblioteka antitela i selekcija fagnog prikaza humanih VH regiona rezistentnih na rastvorljivi CEA antigen

|0I12] Cilj sledećih eksperimenta je selekcija seta humanih VH regiona rezistentnih na rastvorljvi CEA antigen koji se uparuje sa humanim VL regionom scFv A-240, izabran kao što je oppisano u Primeru 6. Pomenuti humani VL region je prikazan u SEQ ID NOs. 63 (nukleotidna sekvenca) i 64 (aminokiselinska sekvenca).

1. Izolacija RNK iz mononuklearnih ćelija periferne krvi ( PBMCs)

|0113] 100 mL krvi je uzeto od pet zdravih humanih donora. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) izolovane su sa ficoll-gradijentom prema standardnim postupcima. Ukupna RNK je izolovana iz PBMCs korišćenjem RNeasv® Midi Kit (QIAGEN) praćenjem uputstava proizvođača. cDNK je sintetisana prema standardnim postupcima (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratorv Press 1989,2001).

2. PCR- amplifikacija varijabilnih regiona teškog lanca ( VH- regioni)

[0114] VH biblioteka je konstruisana i imenovana Lib 134-VH. Ova VH-biblioteka se sastoji od humanog repertoara FR1 -CDR 1-FR2-CDR2-FR3 iz PCR amplifikovanih VH-regiona prethodno opisanog PBMC pula, operativno povezanog sa VH CDR3 majčinskog antitela praćen sa humanom FR4 sekvencom klicine linije. Za izolaciju humanih šablonskih VH-regiona, izvedena je RT-PCR korišćenjem S'-VFI-specifičnog seta prajmera (5'-huVH 1,3,5-Xhol-2001 (5'-AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G-3') (SEQ ID NO. 100). 5'-huVH4-Xhol-2001 (5'-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3') (SEQ ID NO. 101), 5'-huVH4B-Xhol-2001 (5'-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3') (SEQ ID NO. 102)) i seta od dva 3'-VH-specifičnih prajmera (3'-hu-VH-BstEII-2001 (5'-CTG AGG AGA CGG TGA CC-3') (SEQ ID NO. 103). 3'-hu-VH-J3-BstEII-2001 (5'-CTG AAG AGA CGG TGA CC-3') (SEQ ID NO. 104)). Po PCR reakciji, jedan 5'-prajmer je kombinovan sa jednim 3<*->prajmerom; broj različitih PCR reakcija je određen sa brojem mogućih kombinacija5'-i 3'-prajmera. PBMC cDNK od pet donora korišćena je kao izvor VH gena. Sledeći PCR-program je korišćen za amplifikaciju: Denaturacija na 94°C 15 sekundi, aniling prajmera na 52°C za 50 sekundi i ekstenzija prajmera na 72°C 60 sekundi izvedena je u 40 ciklusa, praćena sa finalnom ekstenzijom na 72°C 10 minuta. Proizvodi amplifikacije sa veličinom od oko 350 bp izolovani su prema standardnim postupcima. Za izolaciju Lib 134-VH-regiona. RT-PCR je izvedena u dva koraka. Prvo, humani VH-segmenti teškog lanca (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) su PCR-amplifikovani iz izolovanih šablonskih VH fragmenata korišćenjem istog 5'-VH specifičnog seta prajmera kao što je prethodno opisano (5'-huVHl,3,5-Xhol-2001, 5'-huVH4-Xhol-2001, 5'-huVH4B-Xhol-2001: SEQ ID NOs. 100-102) i 3'-specifičnog seta prajmera (3'-A134-VHl A (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT YGC ACA GTA ATA CAC GGC -3') (SEQ ID NO. 105). 3'-A134-VHlB (5"-GTA GTC

AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT YGC ACA GTA ATA CAY RGC -3')

(SEQ ID NO. 106), 3'-A134-VH3A (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT TGY ACA GTA ATA CAC RGC -3') (SEQ ID NO. 107), gde naznačeno "T" se takođe može zameniti sa "A". "C" ili "G". 3'-A134-VH3B (5'-GTA GTC AAA GTA GAA

CCG TAG CCC CCT ATC TCT TGC ACA GTA ATA CAA RGC -3') (SEQ ID NO. 108),

gde naznačeni "T" može takođe biti zamenjen sa "A". "C" ili "G". 3"-A134-VH4 (5'-GTA

GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT SGC ACA GTA ATA CAC RGC -

3') (SEQ ID NO. 109)) za humane VH podfamilije 1. 3 i 4 koje se poklapaju u sasvim terminalnom regionu FR3.

Korišćene su sledeće kombinacije prajmera:

a) 5'-huVHl,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134-VHlA

b) 5'-huVH1.3,5-Xhol-2001 x 3'-A134-VHlB

c) 5'-huVHl,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134-VH3A

d) 5'-huVHl,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134-VH3B

e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-A134-VH4

0 5'-huVH4B-Xhol-2001 x 3'-A134-VH4

[0115]Po PCR reakciji, jedan 5'-prajmer je kombinovan sa 3'-prajmerom; broj različitih PCR reakcija je određen preko broja mogućih kombinacija 5'- i 3'-prajmera. Sledeći PCR-program je korišćen za amplifikaciju: Denaturacija na 94°C 15 sekundi, aniling prajmera na 52°C 50 sekundi i ekstenzija prajmera na 72°C 90 sekundi izvedena je u 40 ciklusa, praćeno sa finalnom ekstenzijom na 72°C 10 minuta. Kroz ovaj korak PCR i respektivnu sekvencu 3'-prajmera, humani VH segmenti su produženi za deo majčinskog VH CDR3, koji je zatim zauzvrat mesto prajminga za drugi korak PCR 3'-prajmera. Ovi VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) DNK-fragmenti su zatim uzeti kao šabloni u drugoj PCR reakciji ponovnim korišćenjem respektivnih 5'VH-specifičnog prajmera i univerzalnog 3" prajmera koji se poklapa sa univerzalnim 3<7->terminusom amplifikovanih DNK-iragmenata (3' A134-JH6-BstEII, 5'-CGA GAC GGT

GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CC -3")

(SEQ IDNO. 110).

|0116]Sledeći PCR-program je korišćen za amplifikaciju:

Denaturacija na 94°C 15 sekundi, aniling prajmera na 52°C 50 sekundi i ekstenzija prajmera na 72°C 60 sekundi izvedeni su u 40 ciklusa, praćeno sa finalnom ekstenzijom na 72°C 10 minuta. DNK V-fragmenata izolovane su prema standardnim protokolima.

3. Konstrukcija biblioteke - kloniranje humanog VH pula

|0117]U drugoj rundi gorenavedenog postupka, izabran je humani VL iz scFv A-240 identifikovan u prvoj, prethodnoj selekciji (videti Primer 6), i nakon toga kombinovan sa bibliotekom humanih VH fragmenata u cilju generisanja humanog scFv. Biblioteka fagnog prikaza je generalno konstruisana na osnovu standardnih procedura, kao što je na primer opisano u "Phage Displav: A Laboratorv Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 2001.

[0118]DNK-fragmenti teškog lanca iz različitih PCR amplifikacija su ponderovani za svaku ligaciju kao što sledi:

a:b:c:d:e:f= 3:1:3:1:1:1, gde a-f imaju sledeća značenja:

a) 5'-huVHL3,5-Xhol-2001 x 3'-A134-VHlA

b) 5'-huVHl,3,5-Xhol-2001 x 3,-A134-VHlB

c) 5'-huVHl,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134-VH3A

d) 5'-huVH1.3,5-Xhol-2001 x 3'-A134-VH3B

e) 5'-huVH4-Xhol-2001 x 3'-A134-VH4

1) 5'-huVH4B-Xhol-2001 x 3'-A134-VH4

[0119]Jedna reakcija ligacije je postavljena tako da se sastoji od 400 ng pula humanog Lib 134-VH fragmenta (Xhol-BstEII digestovan) i 1200 ng plazmida pComb3H5BHis/A-240 VL (DNK koji kodira VL region scFv A-240 je kloniran preko restrikcionih mesta Sacl i Spel u pComb3H5BHis prema standardnim procedurama). Rezultujući pul antitela humanog VH je zatim transformisan u 300 uL elektrokompetentnog Escherichia coli XL1 Blue elektroporacijom (2.5 kV. 0.2 cm gap kiveta, 25 mF. 200 Ohm, Biorad gene-pulser) što je rezultovalo u veličini biblioteke od 0.8 x 108 nezavisnih klonova ukupno. Nakon elektroporacije test je inkubiran u SOC buljonu (Fluka) za fenotipsku ekspresiju. Svaka kultura je zatim inkubirana preko noći u 500 mL SB sclckcionog medijuma koji sadrži 50Ug/mL karbenicilina i 2 % v/v glukoze. Sledećeg dana. ćelije kulture su sakupljene centrifugiranjem i priprema plazmida je izvedena korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta za pripremu plazmida (Qiagen) da bi se sačuvala DNK biblioteka. 1.5 ug ovog plazmidnog pula koji kodira respektivni scFv pul je zatim elektroporacijom uveden u E. coli XLlblue (2.5 kV, 0.2 cm gap kiveta, 25 mF. 200 Ohm, Biorad gene-pulser) što je rezultovalo u veličini bilioteke od 2.4 x IO<9>nezavisnih klonova ukupno. Nakon fenotipske ekspresije i spore adaptacije na karbenicilin biblioteka antitela je preneta u SB-Carbenicillin (50 ug/mL) selekcioni medijum. Biblioteka antitela je zatim inficirana sa infektivnom dozom od 1 x 1012 čestica helper faga VCSM13 što je rezultovalo u proizvodnji i sekreciji filamentoznog Ml3 faga, gde je svaka čestica faga sadržala jednolančani pComb3H5BPIis-DNK koji je kodirao humani scFv-fragment i prikazao odgovarajući scFv-protein kao translacionu fuziju sa proteinom III omotača faga.

4. Selekcija fagnog prikaza humanih VH

[0120]Čestice faga koje nose humani scFv-repertoar sakupljene su iz supematanta kulture sa PEG8000/NaCl precipitacijom i centrifugiranjem. Zatim je oko i x 10" do 1 x IO<12>scFv čestica faga resuspendovano u 0.5 mL TBS/1% BSA i inkubirana sa biotinilovanim rastvorljivim CEA, koji je imobilisan u Streptavidin obloženim komoricama ELISA ploče (Nunc) 1 h. 10 ug antigen/ml PBS rastvora (50 ul) inkubiran je preko noći na 4°C u streptavidin obloženim komoricama, jednom isprano sa vodom, praćeno sa blokiranjem 1 čas na 37°C sa 200 ul 3% BSA u TBS, koji je uklonjen nakon inkubacije. scFv fag koji se nije specifično vezao3a target antigen eliminisan je koracima ispiranja sa TBS/0,05 % Tween. Ova procedura ispiranja je ponovljena do 10 puta u dodatnim rundama. Nakon ispiranja, vezujući entiteti su eluirani korišćenjem HCl-glicina, pH 2.2. Nakon neutralizacije sa 2 M Tris, pH 12, eluat je korišćen za inficiranje sveže neinficirane E. coli XL1 Blue kulture. Da se eluiraju preostali visoko vezujući entiteti 50 uL sveže E. coli XL1 blue kulture (OD600 > 0.5) dodato je komoricama i inkubirano 15 minuta. Obu kulture su zatim pomešane i ćelije uspešno transdukovane sa kopijom fagemida, koji kodira humani scFv-fragment, ponovo su selektovane u odnosu na rezistenciju na karbenicilin i nakon toga inficirane sa VCMS13 helper fagom da bi se započela druga runda prikaza antitela i in vitro selekcija. Plazmidna DNK koja odgovara 4 runde paninga izolovana je iz E. coli kultura. Za proizvodnju rastvorljivog scFv-proteina, VH-VL-DNK fragmenti su isečeni iz plazmida (Xhol-Spel), i klonirani preko istih restrikcionih mesta u plazmidu pComb3H5BFlag/His. u kojem ekspresioni konstrukt (npr. scFv) uključuje Flag-tag (TGDYKDDDDK; SEQ ID NO. 99) između scFv i FIis6-taga i dodatni proteini faga su deletirani. Nakon ligacije svaki pul (različite runde paninga) plazmiđne DNK je transformisan u 100 uL E.coli TG1 kompetentne za toplotni šok i postavljeni na karbenicilin LB-agar. Pojedinačne kolonije su uzete i inokulisane u 120 uL LB karb (50 ug/ml.) I % glukoze u 96-komorne ploče (Greiner). Komorice su zapečaćene sa semipermeabilnom membranom (Greiner) i ploče su inkubirane preko noći na 37°C u šejkiranom inkubatoru (master ploča). Zatim 10 uL kulture sa master ploče je preneto u drugu 96 komornu ploču (radna ploča) sa 90 uL LB karb (50 ug/mL) 0.1% glukoze po komorici. Nakon inkubacije 4 h u šejkiranom inkubatoru na 37°C, scFv proizvodnja je indukovana dodavanjem 20 uL LB karb 6 mM IPTG u svaku komoricu. Nakon još jednog koraka inkubacije preko noći na 30°C uz šejkiranje. ćelije su lizirane u lh inkubaciji na sobnoj temepraturi sa 40 uL pufera za lizu (400 mM borna kiselina, 320 mM NaCl, 4 mM EDTA pH 8, 2.5 mg/mL lizozim). Rezidulane ćelije i ćelijski otpad odvojeni su centrifugiranjem 12 minuta na 1,900 x g (Hettich).

[0121]Supernatanti koji sadrže scFv molekule su zatim testirani u odnosu na vezivanje u protočno citometrijskim testovima vezivanja. CHO ćelije transficirane sa humanim CEA su korišćeni kao CEA-pozitivna ćelijska linija. Testovi ćelijskog vezivanja su izvedeni inicijalnim inkubiranjem između 100.000 i 200,000 ćelija sa periplazmatskom pripremom koje sadrže humani scFv ili relevantne kontrole. Nakon inkubacije ćelije su isprane u PBS/1 % FCS (fetalni teleći serum) i dodatno inkubirane sa 5-10 ug/ml anti-FLAG M2 antitela. Nakon što su ćelije bile ponovo isprane, inkubirane su sa poliklonskim, PE-obeleženim antimišjim antitelima (Dianova) i nakon toga analizirane sa protočnom citometrijom. 46 klonova je testirano za vezujuće signale na CEA-pozitivne CHO ćelije. Sve su pokazale pozitivne signale. Nakon sekvenciranja respektivne scFv DNK ukupno 9 različitih sekvenci je dobijeno, od kojih je osam prikazivalo visok stepen homologije. Humani konstrukti MP510_3-A5.3 (MP510-A5; SEQ ID NO. 50), MP510_3-B9.1 (MP511-B9; SEQ ID NO.

52), MP510 3-D8.1 (MP511-D8; SEQ ID NO. 54) su selektovani za dalju karakterizaciju. Odgovarajuće aminokiselinske sekvence su prikazane u listingu sekvenci. Periplazmatski ekstrakti pomenutih humanih konstrukata MP510-A5. MP511-B9, MP511-D8 kao i poluhumani konstrukt A-240 Vlambda.3 (mišji VI I A5B7/humani VL A240; SEQ ID NO. 48) su dodatno analizirani u protočno citometrijskim eksperimentima sa CEA-pozitivnim i - negativnim ćelijskim linijama. Može se videti sa Slike 13. da humani konstrukti MP510-A5 (SEO ID NO. 50). MP511-B9 (SEQ ID NO. 52). MP511-D8 (SEQ ID NO. 54) jasno pokazuju uočljiva pomeranja u intenzitetu fluorescencije u poredenju sa respektivnom polu-humanom kontrolom A-240 Vlambda.3 (mišji VH A5B7/humani VL A240; SEQ ID NO. 48). Stoga, humani scFv konstrukti pokazuju jaču vezujuću aktivnost za membranski vezani humani CEA nego poluhumani konstrukt A-240 Vlambda.3. Dodatno, svi humani konstrukti su prikazali jasno vezivanje za CEA-pozitivne humane KATO III ćelije (humana ćelijska linija kancera želuca), dok nijedan od njh nije pokazao vezivanje sa CEA-negativnim, netransficiranim CHO ćelijama kao i sa CEA-negativnim humanim NALM 6 ćelijama (humana B ćelijska linija) (podaci nisu prikazani).

PRIMER 8: Generisanje i citotksična aktivnost humanih CEAxCD3 bispecifičnih

jednolančanih antitela

1. Rasporedi

[0122]U sledećem koraku, generisani su različiti rasporedi domena molekula humanog bispecifičnog jednolančanog antitela. Ovi molekuli sadrže humani anti-CEA vezujući domen (čije generisanje je opisano u Primeru 7, prethodno navedeno) i de-imunizovani vezujući domen sa specifičnošću za humani CD3 antigen prikazan u SEQ ID NO.77 VHVL su dizajnirani kao što je dato u Tabeli I; videti takođe Primer 2, prethodno navedeno. Svi konstrukti bispecifičnih jednolančanih antitela sa humanim anti-CEA vezujućim domenima opisanim ovde (očigledno) se vezuju za rastvorljivi humani CEA antigen jer su izolovani nakon Četiri runde selekcije fagnog prikaza na rastvorljivom CEA antigenu imobilisanom na ELISA pločama.

[0123]Naročito, sledeći rasporedi su generisani:

(a) humani anti-CEA deo lociran N-terminalno:

(i) VH-VL orijentacija anti-CEA:

(b) humani anti-CEA deo lociran C-terminalno:

(i) VH-VL orijentacija anti-CEA:

[0124] CEAI VH (SEQ ID NO. 56) označava VI I region izveden iz mišjeg mAb A5B7, dok se CEAI VHVL ili CEAI VLVH odnosi na VH-VL domen i VL-VH domen, respektivno, izveden iz mAb A5B7. A240 odgovara humanom VL regionu (videti SEQ ID NO. 64 i Primer 7). Shodno tome, npr. CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 16) odgovara bispecifičnom konstruktu sa poiu-humanim CEA-vezujućim domenom koji ima mišji VH region iz mAb7 i humani VL region A240. Za kloniranje biblioteke humanih antitela, nukleotidne sekvence koje kodiraju originalne N-terminuse A240 VL regiona morali su se konvertovati u restrikciona mesta. U A5 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 126), SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL# (SEQ ID NO. 128), B9 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 130). SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL#

(SEQ ID NO. 132), D8 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 134), and SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL# (SEQ ID NO. 136). originalni N-tcrminusi su ponovo uvedeni.

Konstrukt bispecifičnog jednolančanog antitela SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240VL (SEQ ID NO. 143) razlikuje se od SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL (SEQ ID NO. 36) konstrukta u samo jednom aminokiselinskom ostatku: CDR-II2 sekvenca u E12 VH je "FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 145). dok je u B9 VH to "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 67). Humani E12 VH region je izolovan kao sto je dato u Primeru 7.

2. Ekspresija, prečišćavanje i protočno citometriiska analiza

[0125]Ekspresija, prečišćavanje i protočna citometrijska analiza ovih humanih CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela izvedena je postupcima opisanim u Primeru 2, prethodno navedeno.

3. Vezujuća aktivnost

[0126]Kao što je primerom dato na Slici 14, konstrukti humanog bispecifičnog jednolančanog antitela A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 24), B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 40) i CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 16) vezuju se za CEA-pozitivne humane Kato III ćelije i za CD3-pozitivne HPB- ALL ćelije.

4. Citotoksična aktivnost u odsustvu rastvorljivog CEA antigena

[0127]Citotoksična aktivnost protiv CHO-CEA+ target ćelija je pokazana za sledeće rasporede domena humanih bispecifičnih jednolančanih antitela: Za konstrukte sa anti-CEA delom lociranom N-terminalno i VH-VL orijentacijom anti-CEA dela. Slika 15 prikazuje citotoksičnu aktivnost za A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 24), B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 40) i CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 16). Slika 16 pokazuje citotoksičnu aktivnost za VL-VH orijentaciju anti-CEA domena (lociranog N-terminalno) za A240 VL-A5 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 26), A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34), A240 VL-D8 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 42), i A240 VL-CEAI VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 18).

[0128)Za konstrukte sa anti-CEA delom lociranim C-terminalno i VH-VL orijentacijom anti-CEA dela. Slika 17 prikazuje citotoksičnost protiv CEA+ target ćelija za SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL (SEQ ID NO. 30), SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL (SEQ ID NO. 36). SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL (SEQ ID NO. 44). i SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VH-A240VL (SEQ ID NO. 20). SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI LH je korišćena kao pozitivna kontrola. Slika 18 prikazuje citotoksičnu aktivnost konstrukata sa VL-VH orijentacijom anti-CEA domena (lociranom C-terminalno) za SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-A5 VH (SEQ ID NO. 28). SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-B9VH (SEQ ID NO. 38). SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-D8VH (SEQ ID NO. 46). and SEQ ID NO.77 VHVLx A240VL-CEAIVH (SEQ ID NO. 22). SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI LH (SEQ ID NO. 2) je korišćena kao pozitivna kontrola.

[0129]Slika 21 prikazuje citotoksičnu aktivnost konstrukata bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadrže humani B9 VH region i humani A240 VL region u različitim rasporedima: A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34), SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH (SEQ ID NO. 38), SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 36), i B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32) prikazali su citotoksičnu akti vnost protiv humani CEA-transficiranih CI IO ćelija.

5. Rezistencija humanih CEAxCD3 bispecifičnih jednolančanih antitela na rastvorljivi CEA

antigen

[0130]Kompetitivni testovi u prisustvu rastvorljivog humanog CEA antigena za humana bispecifična jednolančana antitela izvedeni su kao što je dato u Primeru 5, prethodno navedeno. Slike 19 i 20 pokazuju rezistenciju citotoksične aktivnosti na rastvorljivi CEA antigen takođe za humane konstrukte, kao što je primerom dato za konstrukte A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 24). B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 40) i CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL(SEQ ID NO. 16); za rezistenciju na rastvorljvi CEA iz miša izvedenih bispecifičnih jednolančanih antitela videti Primer 5. Dodatno, Slika 22 prikazuje da CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukt A240 VL-B9 VHx SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) preusmerava T ćelije da liziraju CHO-CEA+ ćelije u prisustvu rastućih količina rastvorljivog CEA antigena. Ovaj eksperiment pokazuje da je takođe A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL-posredovana citotoksična aktivnost rezistentna na rastvorljivi CEA. Konačno, kao što se može zaključiti sa Slike 27. citotoksična aktivnost posredovana bispecifičnim jednolančanim konstruktom SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VI. (SEQ ID NO. 143) rezistentna je na rastvorljivi CEA.

[0131] Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije sa citotoksičnom anti-tumorskom aktivnošću u prisustvu čak visokih nivoa rastvorljivog CEA antigena. Kao što je prethodno dato. visoke serum koncentracije CEA kod pacijenata sa epitelijalnim tumorima smanjuju uspeh anti-CEA antitelo-zasnovanih terapeutika. Stoga, farmaceutske kompozicije pronalaska su naročito pogodne za tretman pacijenata sa progresivnim epitelijalnim tumorima (npr. sekundarnim, metastazirajućim tumorima nakon hirurškog uklanjanja primarnih tumora), malignih epitelijalnih tumora, visokog opterećenja (epitelijalnim) tumorom i kasnog stadijuma epitelijalnih tumora karakterisanih sa visokim koncentracijama rastvorljivog CEA antigena u serumu/plazmi pomenutih pacijenata. Dodatno, takođe se očekuje da se farmaceutske kompozicije pronalaska primenjuju u malim dozama. Dodatno, malo je verovatno da su pomenute farmaceutske kompozicije imunogene kada se primenjuju na pacijente usled humanog porekla anti-CEA dela i deimunizovanog anti-CD3 dela bispecifičnih jednolančanih antitela u farmaceutskim kompozicijama pronalaska. Dodatno, očekuje se da farmaceutske kompozicije pronalaska obezbeđuju visoku penetraciju tumora usled male molekulske težine i male veličine bispecifičnih jednolančanih konstrukata. Dodatno, za tretman tumora koristiće se male količine bispecifičnih jednolančanih antitela usled visoke citotoksičnosti pomenutih molekula. Kako se očekuje đa se male količine primenjuju na pacijente, takođe se očekuje da su smanjeni štetni efekti po pacijenta. Konačno, bispecifična jednolančana antitela bez rezistencije na rastvorljvi CEA bila bi visoko osetljiva Čak i na male koncentracije rastvorljivog CEA antigena u palzmi pacijenata sa tumorom jer bi se primenjivale u niskim koncentracijama, kao što je prethodno dato. Ovaj problem je takođe prevaziđen farmaceutskim kompozicijama pronalaska.

PRIMER 9: Procena proteinske homogenosti prečišćenog monomera A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) sa katjonizmenjivačkom hromatografijom visoke rezolucije

[0132] Da bi se dodatno okarakterisala homogenost prečišćenog A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) konstrukta, frakcija izolovanog monomera podvrgnuta je katjonizmenjivačkoj hromatografiji visoke rezolucije. Hromatografija je izvedena na MiniS koloni (Mini S PE 4.6/50 CatX 0.8 ml; GE Healthcare 17-5005-01), ekvilibrisanoj sa 20mM MES pufera pH 5.5. Uzorak je razblažen 1:3 sa istim puferom pre punjenja u kolonu. Vezani protein je eluiran sa gradijentom ekvilibracionog pufera koji sadrži 1 M NaCl: 0-30% u 60 zaprcmina kolone. Preostali protein je eluiran u 3 zaprcmine kolone 1 M NaCl. Rezultujući hromatogram je prikazan na Slici 23 i pokazuje homogenu proteinsku frakciju sa pojedinačnim glavnim pikom.

PRIMER 10: Plazma stabilnost A240 VL-B9 VHxSEQIDNO.77 VHVL (SEQIDNO.

34)

[0133] Plazma stabilnost A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) konstrukta je testirana pod različitim inkubacionim uslovima nakon čega je korišćen standardan citotoksični test zasnovan na oslobađanju 51 -hroma kao što je opisano u Primeru 4.

[0134] Humani plazma pul sa krvlju pet zdravih donora generisan je sakupljanjem krvi u EDTA-obloženim špricevima. Ćelijske komponente su uklonjene centrifugiranjem i gornja plazma faza je sakupljena i nakon toga pulovana. A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) konstrukt je ili inkubiran na 37°C ili 4°C u prisustvu ili u odsustvu plazme. Kao kontrole, konstrukt je razblažen neposredno pre citotoksičnog testa u plazmi ili RPMI 1640 medijumu, respektivno. CHO-CEA+ su služile kao target ćelije; stimulisane CD8+ T ćelije su korišćene kao efektorske ćelije. Efektontarget (E:T) odnos bio je 10:1. Trajanje testa je bilo 18 časova.

[0135] Kao što je prikazano na Slici 24, CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukt A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) pokazao se kao veoma stabilan; nije uočen gubitak citotoksične aktivnosti nakon inkubacije u humanoj plazmi 24 časa na 37°C.

PRIMER 11: Procena proteinske homogenosti prečišćenog monomera SEQIDNO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (SEQIDNO. 143) sa katjonizmenjivačkom hromatografijom visoke rezolucije

[0136] Eksperiment je izveden po analogiji sa Primerom 9, osim što je analizirana SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 143). Rezultujući hromatogram je prikazan na Slici 25 i prikazuje homogenu proteinsku frakciju sa pojedinačnim glavnim pikom.

PRIMER12: Plazma stabilnost SEQIDNO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (SEQIDNO. 143)

[0137] Eksperiment je izveden po analogiji sa Primerom 10, osim što je analizirana SEQ ID NO.77 VHVL x E12 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 143). Kao što je prikazano na Slici 26, CEA-reaktivni bispecifični jednolančani konstrukt SEQ ID NO.77 VHVL x E12 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 143) pokazao se kao veoma stabilan: nije uočen gubitak citotoksične aktivnosti nakon inkubacije u humanoj plazmi 24 časa na 37°C.

LI STINI G SEKVENCI

[0138]

Claims (33)

1. Farmaceutska kompozicija za tretman epitelijalnog tumora kod ljudi, gde pomenuta farmaceutska kompozicija sadrži bispecifično jednolančano antitelo koje ima (a) prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CD3. i (b) drugi vezujući domen koji se specifično vezuje za humani CEA. gde pomenuti drugi vezujući domen specifičan za humani CEA sadrži (i) CDR-H1 koji ima aminokiselinsku sekcencu "SYWMH" (SEQ ID NO. 68), CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 67), CDR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73). CDR-L2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) i CDR-L3 koji ima aminokiselinsku sekvencu "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO. 71); (ii) CDR-H 1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "SYWMH" (SEQ ID NO. 68), CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 145). CDR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73), CDR-L2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) i CDR-L3 koji ima aminokiselinsku sekvencu "MIAVHSGASAV" (SEQ IDNO. 71); ili (iii) CDR-H1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TTAMH" (SEQ IDNO. 70), CDR-H2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "LISNDGSNKYYADSVKG" (SEQ ID NO. 69). CDR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu "TLRRGINVGAYSIY" <SEQ ID NO. 73), CDR-L2 koji ima aminokiselinsku sekvencu "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) i CDR-L3 koji ima aminokiselinsku sekvencu "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO. 71); i gde pomenuti drugi vezujući domen sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu "DX1X2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65), gde "Xi", "X2", "X3" ili" XA"predstavlja bilo koji aminokiselinski ostatak, i aminokiselinski ostatak "D" odgovara Kabat poziciji 95 CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7 i aminokiselinski ostaci "FYFDY" odgovaraju Kabat pozicijama 100, 100a, 100b, 101, i 102, respektivno. od CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7.

2. farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 1. gde - "Xi" predstavlja "R" (Arginin). "F" (Fenilalanin), "M" (Metionin), "E" (Glutaminska kiselina), ili "T" (Treonin); - "X2" predstavlja "G" (Glicin), "Y" (Tirozin), "A" (Alanin). "D" (Asparaginska kiselina), ili "S" (Serin); -" X3"predstavlja "L" (Leucin), "F" (Fenilalanin), "M" (Metionin), "E" (Glutaminska kiselina), ili "T" (Treonin); i - " Xt" predstavlja "R" (Arginin). "Y" (Tirozin), "A" (Alanin). "D" (Asparaginska kiselina), ili "S" (Serin).

3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2. gde pomenuti drugi vezujući domen specifičan za humani CEA sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) koja odgovara Kabat pozicijama 95 - 102 CDR-H3 iz mišjeg monoklonskog antitela A5B7.

4. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3. gde je pomenuti prvi vezujući domen specifičan za CD3 lociran C-terminalno.

5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde su pomenuti vezujući domeni raspoređeni po redosledu VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 ili VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3.

6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde aminokiselinska sekvenca VH regiona drugog vezujućeg domena specifičnog za humani CEA je SEQ ID NO. 60 ili 146.

7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde aminokiselinska sekvenca VH regiona drugog vezujućeg domena specifičnog za humani CEA je SEQ ID NO. 58 ili SEQ ID N0.62.

8. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7. gde aminokiselinska sekvenca VL regiona drugog vezujućeg domena specifičnog za humani CEA je SEQ ID NO. 64.

9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, gde su V regioni drugog vezujućeg domena specifičnog za CEA izabrani iz grupe koju čini: (a) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 60 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64; (b) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 146 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64 (c) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 58 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64; (d) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 62 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64; i (e) VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 56 i VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO. 64.

10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9. gde pomenuto bispecifično jednolančano antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOs. 6. 8, 16. 18.

24, 26. 32, 34, 40, 42, 126. 130, 134 ili 143; (b) aminokiselinske sekvence kodirane sa sekvencom nukleinske kiseline kao što je prikazano uSEQ IDNOs. 5. 7, 15, 17,23,25,31,33,39,41, 125, 129. 133 ili 142; i (c) aminokiselinske sekvence kodirane sa sekvencom nukleinske kiseline koja je degenerisana kao rezultat genetičkog koda u nukleotidnu sekvencu iz (b)..

11.Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, gde pomenuto bispecifično jednolančano antitelo sadrži His-tag.

12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, gde je pomenuti epitelijalni tumor gastrointestinalni adenokarcinom. adenokarcinom dojke ili adenokarcinom pluća.

13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12, gde je pomenuti gastrointestinalni adenokarcinom kolorektalni, pankreasni, ezofagijalni ili adenokarcinom želuca.

14. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, gde je pomenuta farmaceutska kompozicija za tretman progresivnih tumora, kasnog stadijuma tumora, pacijenata sa tumorom sa visokim tumorskim opterećenjem, metastazirajućih tumora, ili pacijenata sa tumorom sa koncentracijom CEA u serumu većom od 100 ng/ml.

15. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, gde je najmanje jedan od pomenutih prvog i drugog vezujućeg domena himerni, humanizovan, CDR-graftovani, i/ili deimunizovani ili humani.

16. Farmaceutska kompozicija koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bispecifično jednolančano antitelo kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15.

17. Farmaceutska kompozicija koja sadrži vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kao što je definisano u patentnom zahtevu 16.

18. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 17. gde pomenuti vektor dodatno sadrži regulatornu sekvencu koja je operativno vezana za pomenutu sekvencu nukleinske kiseline đefinisane u patentnom zahtevu 16.

19. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 17 ili 18. gde je pomenuti vektor ekspresioni vektor.

20. Farmaceutska kompozicija koja sadrži domaćina transformisanog ili transficiranog sa nukleinskom kiselinom definisanom u patentnom zahtevu 16 ili vektor dcfinisan u bilo kom od patentnih zahteva 17 do 19.

21. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 20. koja dodatno sadrži proteinsko jedinjenje sposobno da obezbedi aktivacioni signal za imune efektorske ćelije.

22. Proces za proizvodnju farmaceutske kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 21, pomenuti proces sadrži kultivisanje domaćina definisanog u patentnom zahtevu 20 pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15 i rekuperaciju proizvedenog bispecifičnog jednolančanog antitela iz kulture.

23. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 22. koja dalje sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata.

24. Upotreba bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, molekula nukleinske kiseline kao što je definisano u patentnom zahtevu 16, vektor kao što je definisan u bilo kom od patentnih zahteva 17 do 19, ili domaćin kao što je definisan u patentnom zahtevu 20, za pripremu farmaceutske kompozicije za prevenciju, tretman ili ublažavanje epitelijalnog tumora kod ljudi.

25. Upotreba prema patentnom zahtevu 24. gde je pomenuti epitelijalni tumor gastrointestinalni adenokarcinom, adenokarcinom dojke ili adenokarcinom pluća.

26. Upotreba prema patentnom zahtevu 25. gde je pomenuti gastrointestinalni adenokarcinom kolorektalni. pankreasni, ezofagijalni ili adenokarcinom želuca.

27. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 24 do 26, gde je farmaceutska kompozicija za tretman progresivnih tumora, kasnog stadij uma tumora, pacijenata sa tumorom sa visokim tumorskim opterećenjem, metastazirajućih tumora, ili pacijenata sa tumorom sa koncentracijom CEA u serumu većom od 100 ng/ml.

28. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 27, gde je pomenuta farmaceutska kompozicija pogodna za primenu u kombinaciju sa dodatnim lekom.

29. Llpotreba prema patentnom zahtevu 28, gde je pomenuti dodatni lek neproteinsko jedinjenje ili proteinsko jedinjenje.

30. Upotreba prema patentnom zahtevu 29, gde je pomenuto proteinsko jedinjenje sposobno da obezbedi aktivacioni signal za imune efektorske ćelije.

31. Upotreba prema patentnom zahtevu 29 ili 30, gde je pomenuto proteinsko ili neproteinsko jedinjenje primenjeno simultano ili ne-simultano sa bispecifiČnim jednolančanim antitelom kao stoje definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15. molekul nukleinske kiseline kao što je definisano u patentnom zahtevu 16. vektor kao što je definisan u bilo kom od patentnih zahteva 17 do 19, ili domaćin kao sto je definisano u patentnom zahtevu 20.

32. Komplet koji sadrži bispecifično jednolančano antitelo kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, molekul nukleinske kiseline kao što je definisano u patentnom zahtevu 16. vektor kao Što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 17 do 19. ili domaćin kao što je definisano u patentnom zahtevu 20.

33. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 14 ili upotreba prema patentnom zahtevu 27, gde je pomenuta koncentracija CEA u serumu determinisana sa ELIS A.