PL201546B1

PL201546B1 - Method of creation of transgenic mammal

Info

Publication number: PL201546B1
Application number: PL355353A
Authority: PL
Inventors: Leszek Kaczmarek; Marek Maleszewski; Witold Konopka
Original assignee: Leszek Kaczmarek; Witold Konopka; Marek Maleszewski
Priority date: 2002-08-05
Filing date: 2002-08-05
Publication date: 2009-04-30
Also published as: PL355353A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka nie będącego człowiekiem. Sposób jest wydajny i nie wymaga stosowania samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych.The invention provides a method for obtaining a transgenic non-human mammal. The method is efficient and does not require the use of pseudopregnant females as surrogate mothers.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201546 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 355353 ^{(51) Int.Cl.} (12) PATENT DESCRIPTION (19) PL (11) 201546 (13) B1 (21) Application number: 355353 ^{(51) Int.Cl.}

C12N 15/06 (2006.01) A01K 67/027 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 05.08.2002 (54)C12N 15/06 (2006.01) A01K 67/027 (2006.01) (22) Date of filing: 05/08/2002 (54)

Sposób otrzymywania transgenicznego ssakaMethod of obtaining a transgenic mammal

(76) Uprawniony i twórca wynalazku:(76) Rightholder and creator of the invention: (43) Zgłoszenie ogłoszono:(43) The application was announced: Kaczmarek Leszek,Komorów,PLLeszek Kaczmarek, Komorów, Poland 09.02.2004 BUP 03/04 09.02.2004 BUP 03/04 Maleszewski Marek,Warszawa,PL Konopka Witold,Knurów,PLMarek Maleszewski, Warsaw, Poland Witold Konopka, Knurów, Poland (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:(45) The patent was granted on: 30.04.2009 WUP 04/09 30/04/2009 WUP 04/09 (74) Pełnomocnik: Rafał Witek, WTS Rzecznicy Patentowi(74) Attorney: Rafał Witek, WTS Patent Attorneys

⁽⁵⁷⁾ Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka nie będącego człowiekiem. Sposób jest wydajny i nie wymaga stosowania samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych. ⁽⁵⁷⁾ The invention provides a method for obtaining a transgenic non-human mammal. The method is efficient and does not require the use of pseudopregnant females as surrogate mothers.

PL 201 546 B1PL 201 546 B1

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka niebędącego człowiekiem, przykładowo szczura.The subject of the invention is a method for obtaining a transgenic non-human mammal, for example a rat.

Otrzymywanie transgenicznych gryzoni zostało najwcześniej opracowane dla myszy. Znana (tradycyjna) metoda otrzymywania transgenicznych ssaków, przykładowo szczurów jest adaptacją wcześniejszych metod opracowanych dla myszy i polega na izolowaniu zapłodnionych komórek jajowych (tzw. embrionów jednokomórkowych) z jajowodów samic po wywołanej superowulacji i odbytej kopulacji (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., and Lacy, E. (1994). Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Second Edition. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)) wprowadzaniu metodami in vitro obcego DNA do wyizolowanych embrionów jednokomórkowych, a następnie wprowadzeniu zmodyfikowanych embrionów doprowadzonych do stadium dwukomórkowego do jajowodów matek zastępczych, którymi są samice w ciąży urojonej (szczegółowy opis poszczególnych etapów: Methods in Molecular Biology, Vol. 18: Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, D.Murphy i A. Carter, Humana Press Inc., Totowa, NJ). Matki zastępcze otrzymuje się wcześniej w wyniku odbytej kopulacji z bezpłodnymi (vasektomizowanymi) samcami.The development of transgenic rodents was first developed for mice. The known (traditional) method of obtaining transgenic mammals, for example rats, is an adaptation of earlier methods developed for mice and involves isolating fertilized egg cells (so-called one-cell embryos) from the oviducts of females after induced superovulation and copulation (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., and Lacy, E. (1994). Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Second Edition. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)), introducing foreign DNA into the isolated one-cell embryos by in vitro methods, and then introducing the modified embryos brought to the two-cell stage into the oviducts of surrogate mothers, who are pseudopregnant females (detailed description of the individual stages: Methods in Molecular Biology, Vol. 18: Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, D. Murphy and A. Carter, Humana Press Inc., Totowa, NJ). Surrogate mothers are obtained by copulating with sterile (vasectomized) males.

Patent US5489742 zastrzega szczurzy model reumatoidalnego zapalenia stawów. Wykorzystano tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych szczurów. Szczepy szczurów transgenizowanych to: LEW i F344 Superowulacja wywołana jest poprzez ciągły wlew hormonu FSH (patrz też Armstrong, D. T. and Opavsky, M. A. (1988). Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biol. Reproduct. 39, 511-518). Embriony transferowano zaraz po mikroinjekcji (w stadium jednokomórkowym). Jako matki zastępcze wykorzystano samice rasy Sprague-Dawley (łączone z veaectomizowanymi samcami).Patent US5489742 claims a rat model of rheumatoid arthritis. A traditional method for generating transgenic rats was used. The transgenic rat strains were LEW and F344. Superovulation is induced by continuous infusion of FSH (see also Armstrong, D. T. and Opavsky, M. A. (1988). Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biol. Reproduct. 39, 511-518). Embryos were transferred immediately after microinjection (at the one-cell stage). Sprague-Dawley females (mated with veneectomized males) were used as surrogate mothers.

Opis EP0683226 ujawnia jedynie transgenezę myszy. Wykorzystywana jest standardowa procedura stosująca samice w ciąży urojonej jako matki zastępcze.The description of EP0683226 discloses only mouse transgenesis. The standard procedure is to use pseudopregnant females as surrogate mothers.

Zgłoszenie WO9314200 opisuje zwierzęcy model choroby Alzheimera. Opisana została transgenizacja zarówno myszy jak i szczurów. W przypadku myszy ujawniona technika polega na modyfikowaniu embrionalnych komórek macierzystych (ES). Procedura transgenizacji szczurów przebiega zasadniczo metodą tradycyjną. Jako szczep szczurów transgenizowanych wykorzystano: Sprague-Dawley. Superowulacja była wywołana poprzez jednorazową podskórną iniekcję PMSG bez użycia hCG. Embriony transferowane zaraz po mikroinjekcji. Jako samice na matki zastępcze wykorzystano samice w ciąży urojonej rasy Sprague-Dawley. W treści opisu opisano procedurę otrzymywania szczurów ale jak się wydaje otrzymano tylko myszy.Application WO9314200 describes an animal model of Alzheimer's disease. Transgenication of both mice and rats is described. In the case of mice, the disclosed technique involves modifying embryonic stem (ES) cells. The rat transgenication procedure is essentially traditional. The transgenic rat strain used was Sprague-Dawley. Superovulation was induced by a single subcutaneous injection of PMSG without the use of hCG. Embryos were transferred immediately after microinjection. Pseudopregnant Sprague-Dawley females were used as surrogate mothers. The application describes the procedure for obtaining rats, but it appears only mice were obtained.

Patent US6372956 dotyczy transgenicznych szczurów ekspresjonujących ludzki CD4 i ludzki receptor chemokin. Treść ujawnienia nie obejmuje szczegółowego opisu procedury transgenizacji szczurów. Ograniczono się zaledwie do stwierdzenia, że zostały one przygotowane na zamówienie na podstawie kontraktów m.in przez dr Mullinsa z Edinburga, prawdopodobnie procedurą tradycyjną.Patent US6372956 concerns transgenic rats expressing human CD4 and the human chemokine receptor. The disclosure does not include a detailed description of the transgenic rat procedure. It merely states that the rats were custom-made under contracts, among others, by Dr. Mullins of Edinburgh, likely using traditional procedures.

Zgłoszenie WO9915640 opisuje jedynie otrzymywanie transgenicznych myszy.Application WO9915640 only describes the preparation of transgenic mice.

Również w opisie JP2001238681 nie ujawniono opisu metody transgenizacji innej niż tradycyjna. Podobna uwaga aktualna jest również w odniesieniu do treści zgłoszenia WO0160984. Zgłoszenie WO0160151 dotyczy szczurzego modelu ludzkiego raka prostaty. W treści opisu ujawniono, że wykorzystano szczep Sprague-Dawley, brak jednak szczegółowego opisu metody. Również w patencie US6235885 ujawniono jedynie tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych myszy.Similarly, JP2001238681 does not disclose a description of a transgenic method other than the traditional one. A similar observation applies to application WO0160984. Application WO0160151 concerns a rat model of human prostate cancer. The description discloses that the Sprague-Dawley strain was used, but there is no detailed description of the method. Patent US6235885 also discloses only a traditional method for obtaining transgenic mice.

WO0184921 opisuje tradycyjną metodę produkcji transgenicznego szczura z użyciem szczepu Sprague-Dawley i samic w ciąży urojonej.WO0184921 describes a traditional method for producing a transgenic rat using the Sprague-Dawley strain and pseudopregnant females.

JP3219821 opisuje sposób otrzymywania transgenicznego szczura. W porównaniu do metody tradycyjnej, istota ujawnionej metody polega na zsynchronizowaniu podawania hormonów z cyklem naturalnym. Wykorzystano samice w ciąży urojonej.JP3219821 describes a method for obtaining a transgenic rat. Compared to traditional methods, the essence of the disclosed method lies in synchronizing hormone administration with the natural cycle. Females with a pseudopregnancy were used.

Wspólnym elementem znanych metod otrzymywania transgenicznych szczurów jest wykorzystywanie samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych dla transplantowanych embrionów transgenicznych gryzoni.A common element of known methods for obtaining transgenic rats is the use of pseudopregnant females as surrogate mothers for transplanted transgenic rodent embryos.

Powszechnie wiadomo jednak, że w odróżnieniu od myszy, otrzymywanie samic większych ssaków w ciąży urojonej wiąże się z problemami, które stanowią istotną przeszkodę w efektywnym wykorzystywaniu tradycyjnej metody produkowania transgenicznych ssaków, np. szczurów (porównaj Wells T., Carter D., Journal of Neuroscience Methods, 108 (2001) 111-130)). W przypadku myszy, o odbytej kopulacji z bezpłodnym samcem, ś wiadczy obecność czopa kopulacyjnego w pochwieIt is well known, however, that, unlike in mice, obtaining pseudopregnant females of larger mammals is associated with problems that constitute a significant obstacle to the effective use of the traditional method of producing transgenic mammals, e.g. rats (compare Wells T., Carter D., Journal of Neuroscience Methods, 108 (2001) 111-130). In the case of mice, the presence of a copulatory plug in the vagina indicates that copulation with an infertile male has taken place.

PL 201 546 B1 samicy. Natomiast u dorosłych ssaków większych niż myszy, np. szczurów, czop kopulacyjny występuje bardzo rzadko. Ponadto wykluczone jest badanie samic na obecność plemników w wymazie pochwowym, ze względu na użycie vasektomizowanych samców, które nie dostarczają plemników (Charreau B. i wsp. 1996, Transgenic Research 1996, vol. 5, 223-23). Trudności w identyfikowaniu samic znajdujących się w ciąży urojonej prowadzą do obniżenia wydajności tradycyjnej metody otrzymywania transgenicznych zwierząt, poprzez błędne wykorzystanie jako matki zastępczej samicy nie będącej w ciąży, co powoduje zmniejszenie lub całkowite wyeliminowanie szansy transferowanych embrionów na implantację. Prowadzi to do znacznego obniżenia liczby samic, u których ciążą przebiega normalnie i rodzi się zmienione genetycznie potomstwo. Podsumowując, można uznać tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych zwierząt za niedostatecznie wydajną i nadmiernie rozbudowaną.PL 201 546 B1 female. However, in adult mammals larger than mice, e.g., rats, the copulatory plug is very rare. Furthermore, testing females for sperm in vaginal smears is precluded due to the use of vasectomized males, which do not contribute sperm (Charreau B. et al. 1996, Transgenic Research 1996, vol. 5, 223-23). Difficulties in identifying females with pseudopregnancy lead to a decrease in the efficiency of the traditional method of obtaining transgenic animals through the erroneous use of a non-pregnant female as a surrogate mother, which reduces or completely eliminates the chance of implantation of transferred embryos. This leads to a significant reduction in the number of females with normal pregnancies and the birth of genetically altered offspring. In summary, the traditional method of obtaining transgenic animals can be considered insufficiently efficient and excessively complex.

Celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonej metody otrzymywania transgenicznych ssaków, cechującej się większą wydajnością i łatwością wykonania niż metody dotychczas znane. W szczególności taka metoda powinna rozwiązywać wszystkie problemy związane z uzyskaniem samic na matki zastępcze.The aim of this invention is to provide an improved method for obtaining transgenic mammals, characterized by greater efficiency and ease of implementation than previously known methods. In particular, such a method should solve all the problems associated with obtaining female surrogate mothers.

Tak określony cel został nieoczekiwanie zrealizowany w niniejszym wynalazku.The purpose thus defined has been unexpectedly achieved in the present invention.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka innego niż człowiek charakteryzujący się tym, że: (a) izoluje się zarodek z zapłodnionej samicy, (b) uzyskuje się in vitro transgeniczny zarodek wprowadzając obce DNA do komórki zarodka prowadząc mikroiniekcję obcego DNA, korzystnie plazmidu pTRGFP, do wyizolowanego zarodka, przy czym przed mikroiniekcją zarodek izolowany z bańki jajowodu inkubuje się w roztworze hialuronidazy, a następnie w medium M2 w atmosferze CO2, natomiast mikroiniekcję obcego DNA prowadzi się do jednego z dwóch przedją drzy, a nastrzyknięty zarodek inkubuje się w medium M2 w atmosferze CO2, (c) transplantuje się transgeniczny zarodek do jajowodów drugiej samicy uprzednio zapłodnionej plemnikiem drugiego samca i uzyskuje transgenicznego potomka, przy czym transgenicznego potomka identyfikuje się poprzez stwierdzenie braku dominującej cechy fenotypowej kodowanej jedynie przez materiał genetyczny drugiego samca, a skuteczność transgenizacji potwierdza się stwierdzając obecność obcego DNA lub jego fragmentu w komórce potomka nieposiadającego dominującej cechy fenotypowej.The subject of the invention is a method for obtaining a transgenic non-human mammal, characterized in that: (a) an embryo is isolated from a fertilized female, (b) a transgenic embryo is obtained in vitro by introducing foreign DNA into an embryo cell by microinjecting the foreign DNA, preferably the pTRGFP plasmid, into the isolated embryo, wherein before the microinjection, the embryo isolated from the oviduct ampulla is incubated in a hyaluronidase solution and then in M2 medium in a CO2 atmosphere, while the microinjection of the foreign DNA is carried out into one of the two pronuclei, and the injected embryo is incubated in M2 medium in a CO2 atmosphere, (c) the transgenic embryo is transplanted into the oviducts of a second female previously fertilized with sperm of a second male and a transgenic offspring is obtained, wherein the transgenic offspring is identified by determining the absence of a dominant phenotypic trait encoded only by the genetic material of the second male, and the effectiveness of transgenic transformation is confirmed by the presence of foreign DNA or its fragment in the cell of the offspring that does not have a dominant phenotypic trait.

Korzystnie, w etapie (a) pierwszą samicę kontaktuje się z pierwszym samcem, po czym izoluje się z jej jajowodów zarodek. Korzystnie ssakiem jest szczur, przy czym korzystnie jako pierwszą samicę stosuje się samicę rasy Wistar. Korzystnie jako pierwszego samca stosuje się samca rasy Wistar. Równie korzystnie przed krzyżowaniem pierwszej samicy podaje się pierwszą gonadotropinę, korzystnie PMSG, a następnie drugą gonadotropinę, korzystnie hCG. Korzystnie gonadotropinę PMSG podaje się dootrzewnowe w ilości 20 IU na 52-54 godziny przed podaniem drugiej gonadotropiny hCG, którą podaje się dootrzewnowo w ilości 25 IU w dniu kopulacji. Równie korzystnie w etapie (b) skuteczność transgenizacji potwierdza się stwierdzając obecność obcego DNA lub jego fragmentu w komórce potomka nieposiadają cego dominują cej cechy fenotypowej. Korzystnie bezpo ś rednio przed mikroiniekcją zarodek izolowany z bańki jajowodu inkubuje się w roztworze hialuronidazy przez 15 minut, następnie inkubuje się przez 2-3 godziny w medium M2 w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Korzystnie mikroiniekcję roztworu obcego DNA prowadzi się do jednego z dwóch przedjądrzy, a następnie nastrzyknięty zarodek inkubuje się w medium M2 w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 do dnia następnego. Korzystnie jako drugą samicę stosuje się samicę rasy Wistar. Korzystnie jako drugiego samca stosuje się samca rasy Brown Norway. Korzystnie dominującą cechą fenotypową jest brązowe ubarwienie. Korzystnie w etapie (c) przed transplantacją drugą samicę krzyżuje się z drugim samcem, a skuteczność kopulacji potwierdza się stwierdzając obecność plemników w wymazie z pochwy. Korzystnie w etapie (c) przenosi się dwukomórkowy zarodek transgeniczny do jajowodu znieczulonej samicy.Preferably, in step (a), a first female is contacted with a first male, and an embryo is isolated from her oviducts. Preferably, the mammal is a rat, and preferably, the first female is a Wistar female. Preferably, the first male is a Wistar male. Equally preferably, before mating the first female, a first gonadotropin, preferably PMSG, is administered, followed by a second gonadotropin, preferably hCG. Preferably, the PMSG gonadotropin is administered intraperitoneally in an amount of 20 IU 52-54 hours before the administration of the second gonadotropin, hCG, which is administered intraperitoneally in an amount of 25 IU on the day of copulation. Equally preferably, in step (b), the transgenic efficacy is confirmed by determining the presence of foreign DNA or a fragment thereof in a cell of the offspring not possessing the dominant phenotypic trait. Preferably, immediately before microinjection, the embryo isolated from the oviduct ampulla is incubated in a hyaluronidase solution for 15 minutes, followed by incubation for 2-3 hours in M2 medium at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. Preferably, the foreign DNA solution is microinjected into one of the two pronuclei, and the injected embryo is then incubated in M2 medium at 37°C in a 5% CO2 atmosphere until the following day. Preferably, a Wistar female is used as the second female. Preferably, a Brown Norway male is used as the second male. Preferably, the dominant phenotypic trait is brown coloration. Preferably, in step (c), before transplantation, the second female is mated with a second male, and the success of copulation is confirmed by determining the presence of sperm in a vaginal smear. Preferably, in step (c), the two-cell transgenic embryo is transferred into the oviduct of the anesthetized female.

Nieoczekiwanie, przełamując dotychczasowe schematy obowiązujące w metodach otrzymywania transgenicznych gryzoni, zrezygnowano ze stosowania samic w ciąży urojonej i jako matki zastępcze użyto samice w normalnej ciąży. Identyfikacja transgenicznego potomstwa jest możliwa dzięki odpowiedniemu doborowi genotypów wykorzystywanych w sposobie gamet, a w korzystnej realizacji sposobu poprzez odpowiedni dobór genotypów wykorzystywanych samców i samic. Jedynie plemnik, a tym samym samiec, wykorzystany do zapł odnienia matki zastępczej przenosi dominują c ą , ł atwą do stwierdzenia cechę fenotypową (np. kolor sierści).Unexpectedly, breaking the established traditions of transgenic rodent production, the use of pseudopregnant females was abandoned and normally pregnant females were used as surrogate mothers. Identification of transgenic offspring is possible through the appropriate selection of genotypes used in the gamete method, and in a favorable implementation of the method, through the appropriate selection of genotypes of the males and females used. Only the sperm, and thus the male, used to fertilize the surrogate mother transmits a dominant, easily identifiable phenotypic trait (e.g., coat color).

W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku samice na matki zastępcze krzyżowane są z pł odnymi samcami, a obecność plemników (czyli stwierdzenie ciąży) ustalana jest poprzez wymazIn a preferred embodiment of the method according to the invention, female surrogate mothers are crossed with fertile males and the presence of sperm (i.e. pregnancy) is determined by a smear test.

PL 201 546 B1 pochwowy. W przypadku szczurów zastosowanie samców brązowych szczepu BN (gen koloru sierści - brą zowy - jest dominują cy) pozwala na odróż nienie potomstwa pochodzą cego z normalnej ciąży (kolor sierści brązowy) od potomstwa, które rozwinęło się z embrionów poddanych mikroiniekcji (kolor biały). Zmienione genetycznie embriony (mikroiniekcja) pochodzą z krzyżówki białej samicy Wistar i biał ego samca Wistar.PL 201 546 B1 vaginal. In rats, the use of brown males of the BN strain (the brown coat color gene is dominant) allows for the distinction of offspring from normal pregnancies (brown coat color) from offspring developed from microinjected embryos (white). Genetically altered embryos (microinjected) are derived from a cross between a white Wistar female and a white Wistar male.

Nieoczekiwanie, zaprezentowany sposób posiada liczne zalety w porównaniu z dotychczas znanymi metodami otrzymywania transgenicznych ssaków. Przede wszystkim jest on pozbawiony wszystkich wad związanych ze stosowaniem samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych, gdzie ciąża indukowana jest sztucznie poprzez kopulację z bezpłodnym (vasectomizowanym) samcem. Nie ma już konieczności przeprowadzania trudnego identyfikowania samic w ciąży urojonej. W ten sposób wyeliminowano także możliwość pomyłki w identyfikowaniu transgenicznego potomstwa i pomylenia go z potomstwem zapłodnionej samicy mylnie uznanej za samicę w ciąży urojonej (gdyż istnieje ryzyko nie pełnej vasectomii).Unexpectedly, the presented method offers numerous advantages over previously known methods for generating transgenic mammals. First and foremost, it avoids all the drawbacks associated with using pseudopregnant females as surrogate mothers, where pregnancy is artificially induced through copulation with an infertile (vasectomized) male. The difficult task of identifying pseudopregnant females is no longer necessary. This also eliminates the possibility of misidentifying transgenic offspring and confusing them with the offspring of a fertilized female mistakenly identified as a pseudopregnant female (due to the risk of incomplete vasectomy).

Zwiększa to istotnie wydajność metody, a także ułatwia jej realizację.This significantly increases the efficiency of the method and also facilitates its implementation.

Przebieg ciąży naturalnej jest dużo korzystniejszy niż ciąży urojonej, co również poprawia wydajność i jakość uzyskiwanego potomstwa transgenicznego.The course of natural pregnancy is much more favorable than that of a false pregnancy, which also improves the yield and quality of the obtained transgenic offspring.

Opis wynalazku uzupełniono następującymi figurami:The description of the invention is supplemented by the following figures:

Figura 1 to mapa konstruktu genetycznego TR-GFP użytego do wytworzenia szczurów transgenicznych, PhCMV-1 - promotor tetracyklinowy (ref. Plazmid pUHD10-3, prof. Heramann Bujard, http://www.zmbh.uni-heidelberg.de/Bujard/default.html), EGFP-1 - wektor zawierający gen EGFP - zielone białko fluorescencyjne (Clontech) http://www.clontech.com;Figure 1 is a map of the TR-GFP genetic construct used to generate transgenic rats, PhCMV-1 - tetracycline promoter (ref. Plasmid pUHD10-3, Prof. Heramann Bujard, http://www.zmbh.uni-heidelberg.de/Bujard/default.html), EGFP-1 - vector containing the EGFP gene - green fluorescent protein (Clontech) http://www.clontech.com;

Figura 2 przedstawia wynik reakcji PCR genotypowania osobników założycielskich F0 szczurów transgenicznych TR-GFP, M - marker wielkości DNA, 4,5,7,8 - przykładowe negatywne osobniki, 9,13,20,22 - transgeniczne osobniki TR-GFP, (+), (-) - kontrola pozytywna i negatywna reakcji PCR. Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku została ona zilustrowana poniższymi przykładami. Błędne byłoby jednak ograniczanie zakresu wynalazku jedynie do tych przykładowych realizacji.Figure 2 shows the result of PCR genotyping of F0 founders of TR-GFP transgenic rats, M - DNA size marker, 4,5,7,8 - exemplary negative individuals, 9,13,20,22 - TR-GFP transgenic individuals, (+), (-) - positive and negative controls of the PCR reaction. For a better understanding of the essence of the invention, it is illustrated by the following examples. However, it would be incorrect to limit the scope of the invention only to these exemplary embodiments.

P r z y k ł a d 1. Procedura otrzymywania transgenicznych ssaków na przykładzie szczurówExample 1. Procedure for obtaining transgenic mammals using rats as an example

W procedurze transgenizacji wykorzystuje się dwa rodzaje szczepów szczurów hodowlanych:Two types of breeding rat strains are used in the transgenic procedure:

1. Wistar - kolor sierści biały1. Wistar - white coat color

2. BN (ang. Brown Norway) - kolor sierści brązowy2. BN (Brown Norway) - brown coat color

Dzień 1.Day 1.

Siedem samic szczurzych szczepu hodowlanego Wistar nastrzyknąć dootrzewnowo 20 IU gonadotropiny PMSG. Użyć samic 5-6 tygodniowych. Iniekcję wykonać o godzinie 10.00.Inject seven female Wistar rats intraperitoneally with 20 IU of PMSG gonadotropin. Use 5-6 week old females. Inject at 10:00 AM.

Dzień 2.Day 2.

Umieścić 20 samic Wistar 8-15 tygodniowych, przeznaczonych na matki zastępcze w klatkach hodowlanych, w których wcześniej przebywały samce.Place 20 Wistar females, 8-15 weeks old, intended as foster mothers in the breeding cages previously used by males.

Dzień 3.Day 3.

Samice z dnia pierwszego nastrzyknąć dootrzewnowe(o) gonadotropiną hCG 25 IU o godzinie 15.00. Następnie umieścić samice w klatkach z dorosłymi płodnymi samcami Wistar (1 samiec + 1 samica).Inject day one females intraperitoneally with 25 IU hCG gonadotropin at 3 p.m. Then place females in cages with adult fertile Wistar males (1 male + 1 female).

Dzień 4.Day 4.

Zrobić wymaz z pochwy samicom z dnia 3 i sprawdzić obecność w wymazie plemników, świadczących o odbytej w nocy kopulacji. Następnie samice pozytywne (takie, u których stwierdzono obecność plemników) znieczulić poprzez wstrzyknięcie 1 ml środka Nembutal w dawce 60 mg/ml, a następnie przerwać rdzeń kręgowy. Wyciąć jajowody każdej z samic i umieścić w medium M2. Następnie przenieść do roztworu hialuronidazy i wyizolować embriony jednokomórkowe z bańki jajowodu. Inkubować embriony w roztworze hialuronidazy przez 15 minut, w celu oddzielenia komórek pęcherzykowych od embrionów. Przenieść embriony do medium M2 i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Opisane czynności wykonać przed godziną 12.00. Mikroiniekcję roztworu DNA o stężeniu 2 ng/μΐ rozpocząć o godzinie 14.00 (przedjądrza są wtedy dobrze widoczne). Roztwór DNA przygotować w następujący sposób: liniowy fragment DNA wyizolować z żelu agarozowego, oczyścić przy pomocy zestawu Qiaex II (Qiagen), odsolić przy pomocy membranTake a vaginal swab from the day 3 females and check for sperm in the swab, indicating that copulation occurred during the night. Then, anesthetize positive females (those with sperm detected) with a 1 ml injection of Nembutal at a dose of 60 mg/ml, followed by severing the spinal cord. Cut out the oviducts of each female and place them in M2 medium. Then, transfer them to hyaluronidase solution and isolate single-cell embryos from the oviduct ampulla. Incubate the embryos in hyaluronidase solution for 15 minutes to separate the follicular cells from the embryos. Transfer the embryos to M2 medium and incubate in an incubator at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. Complete this procedure before 12:00 noon. Microinjection of the 2 ng/μA DNA solution should begin at 2 p.m. (pronuclei are then clearly visible). Prepare the DNA solution as follows: isolate the linear DNA fragment from the agarose gel, purify using the Qiaex II kit (Qiagen), and desalt using membranes.

Millepore, a następnie przefiltrować przez filtr o średnicy porów 0,22 μm. Mikroiniekcję wykonać do jednego z dwóch przedjądrzy każdego embrionu, a następnie nastrzyknięte embriony inkubować do następnego dnia. O godzinie 15.00 połączyć samice Wistar z dnia drugiego z samcami płodnymi BN (1 samiec + 2 samice).Millepore, then filter through a 0.22 μm filter. Microinject one of the two pronuclei of each embryo, and then incubate the injected embryos until the following day. At 3:00 PM, pair the day 2 Wistar females with fertile BN males (1 male + 2 females).

PL 201 546 B1PL 201 546 B1

Dzień 5.Day 5.

Samicom Wistar połączonym z samcami BN dnia poprzedniego zrobić wymaz pochwowy na obecność plemników. Pozytywne samice użyć do transplantacji nastrzykniętych embrionów. Samice - matki zastępcze - znieczulić wodzianem chloralu w dawce 250 mg/kg masy ciała, a następnie 2-komórkowe, nastrzyknięte DNA embriony przetransferować do jajowodów samic.Wistar females mated with BN males the previous day should have their vaginal swabs tested for sperm. Positive females should be used for transplantation of injected embryos. Surrogate females should be anesthetized with chloral hydrate at a dose of 250 mg/kg body weight, and then the two-cell, DNA-injected embryos should be transferred into the oviducts of the females.

Dzień 27-28. Narodziny potomstwa matek zastępczych:Day 27-28. Birth of offspring to surrogate mothers:

1. koloru białego - potencjalnie transgeniczne, powstałe z nastrzykniętych embrionów - krzyż ówka Wistar x Wistar1. white - potentially transgenic, derived from injected embryos - Wistar x Wistar cross

2. koloru brązowego - z naturalnej ciąży samic Wistar - krzyżówka BN x Wistar2. brown - from natural pregnancy of Wistar females - BN x Wistar cross

Dzień 48-49.Day 48-49.

Genotypowanie (stwierdzenie obecności transgenu) u białego potomstwa z wykorzystaniem metody PCR lub Southern blotting.Genotyping (determining the presence of the transgene) in white offspring using PCR or Southern blotting.

P r z y k ł a d 2. Otrzymywanie transgenicznych szczurów zawierających konstrukt TR-GFP.Example 2. Obtaining transgenic rats containing the TR-GFP construct.

Metodę opisaną w przykładzie 1 użyto do otrzymania szczurów transgenicznych zawierających konstrukt TR-GFP (gen reporterowy GFP - ang. Green Fluorescent Protein) patrz Figura 1. Nastrzyknięto 150 embrionów, z których do stadium 2-komórkowego rozwinęło się około 70. Dwukomórkowe embriony transplantowano do 5 matek zastępczych, które urodziły 23 białe osobniki. Następnie izolowano DNA z tkanek białego potomstwa i wykonano reakcję PCR na obecność transgenu w genomie zwierząt - patrz figura 2. Wśród 23 białych szczurów obecność transgenu stwierdzono u czterech. W porównaniu z danymi Iiteraturowymi (Charreau B. i wsp. 1996, supra) osią gnię to wię kszą wydajność procesu transgenizacji, wyniki przedstawiono w Tabeli 1.The method described in Example 1 was used to obtain transgenic rats containing the TR-GFP (GFP reporter gene - Green Fluorescent Protein) construct (see Figure 1). 150 embryos were injected, of which approximately 70 developed to the 2-cell stage. The 2-cell embryos were transplanted into 5 foster mothers, which gave birth to 23 white individuals. DNA was then isolated from the tissues of the white offspring and PCR was performed to determine the presence of the transgene in the genome of the animals (see Figure 2). Among the 23 white rats, the presence of the transgene was detected in four. Compared with literature data (Charreau B. et al. 1996, supra), this resulted in a higher efficiency of the transgenic process; the results are presented in Table 1.

T a b e l a 1T a b l e 1

Porównanie wydajności poszczególnych metod transgenizacji szczurówComparison of the efficiency of individual rat transgenic methods

Wybrane grupy badawczeSelected research groups my we Charreau et al..Charreau et al.. Hochi et al..Hochi et al.. Mullins et al..Mullins et al.. Liczba urodzonych osobników Number of individuals born 23 23 116 116 66 66 8 8 (% przetransferowanych embrionów)(% of embryos transferred) (32,9)(32.9) (17,4)(17.4) (22)(22) (brak danych)(no data available) Liczba osobników transgenicznych Number of transgenic individuals 4 4 5 5 10 10 5 5 (% urodzonych)(% of births) (17,3)(17.3) (4,3)(4.3) (15)(15) (62)(62) Liczba osobników transgenicznych (% embrionów poddanych mikroinjekcji)Number of transgenic individuals (% of microinjected embryos) 2,6 2.6 0,5 0.5 1,2 1.2 brak danych no data

Ponadto przeprowadzono eksperymenty mające potwierdzić funkcjonowanie zintegrowanego transgenu. Doświadczenia wykonane na hodowlach pierwotnych fibroblastów pobranych z uszu potwierdziły prawidłowy wzór ekspresji u wszystkich czterech osobników. Następnie skrzyżowano transgeniczne osobniki założycielskie z nietransgenicznymi szczurami Wistar i u otrzymanego potomstwa, przy pomocy reakcji PCR (figura 2.) przeprowadzono badania na obecność transgenu. Prawidłową transmisję płciową, czyli przekazywanie transgenu potomstwu stwierdzono we wszystkich czterech przypadkach. Wyniki gromadzi Tabela 2.Furthermore, experiments were conducted to confirm the functioning of the integrated transgene. Experiments performed on cultures of primary fibroblasts collected from the ears confirmed the correct expression pattern in all four individuals. Transgenic founders were then crossed with non-transgenic Wistar rats, and the resulting offspring were tested for the presence of the transgene using PCR (Figure 2). Normal sexual transmission, i.e., the transmission of the transgene to offspring, was observed in all four cases. The results are summarized in Table 2.

T a b e l a 2T a b l e 2

Wzór przekazywania transgenu TR-GFP w poszczególnych liniach szczurów transgenicznych TR-GFPPattern of TR-GFP transgene transmission in individual lines of TR-GFP transgenic rats

Linie szczurów transgenicznychTransgenic rat lines 9 9 13 13 20 20 22 22 Liczba osobników potomnych pokolenia F1Number of offspring of the F1 generation 17 17 23 23 23 23 27 27 Liczba osobników transgenicznych potomstwa F1Number of transgenic F1 offspring 10 10 10 10 3 3 17 17 Procent osobników transgenicznych potomstwa F1Percentage of transgenic individuals in the F1 offspring 58% 58% 43% 43% 13% 13% 63% 63%

PL 201 546 B1PL 201 546 B1

Claims

Patent claims

A method for the preparation of a transgenic non-human mammal characterized by:

a.the embryo is isolated from the ignition of the female,

b. a transgenic embryo is obtained in vitro by introducing foreign DNA into an embryo cell by microinjecting foreign DNA, preferably pTRGFP plasmid, into an isolated embryo, whereby prior to microinjection the embryo isolated from the tubal bulb is incubated in a hyaluronidase solution and then in M2 medium in an atmosphere CO2, while the microinjection of foreign DNA is carried out into one of the two pronuclei, and the injected embryo is incubated in the M2 medium in a CO2 atmosphere,

c. the transgenic embryo is transplanted into the fallopian tubes of the second female, previously fertilized with the sperm of the second male, and a transgenic descendant is obtained, where the transgenic descendant is identified by stating the absence of a dominant phenotypic feature encoded only by the genetic material of the other male, and the effectiveness of transgenation is confirmed by stating the presence of foreign DNA or a fragment thereof in a cell of a descendant not having a dominant phenotypic trait.

2. The method according to p. The method of claim 1, wherein in step (a) the first female is contacted with the first male, followed by isolating the embryo from its fallopian tubes.

3. The method according to p. The method of claim 2, wherein the mammal is a rat, preferably a Wistar female is used as the first female.

4. The method according to p. The method of claim 2, wherein the mammal is a rat, preferably a male Wistar breed is used as the first male.

5. The method according to p. A method according to claim 2, characterized in that prior to mating the first female, a first gonadotropin, preferably PMSG, is administered, followed by a second gonadotropin, preferably hCG.

6. The method according to claim 5. The method of claim 5, wherein the mammal is a rat, wherein the PMSG gonadotropin is administered intraperitoneally in an amount of 20 IU 52-54 hours prior to the administration of the second hCG gonadotropin, which is administered intraperitoneally in an amount of 25 IU on the day of mating.

7. The method according to claim The method of claim 1, wherein in step (b) the effectiveness of the transgenation is confirmed by the presence of foreign DNA or a fragment thereof in the cell of the descendant not having a dominant phenotypic trait.

8. The method according to p. The method according to claim 7, characterized in that immediately before microinjection, the embryo isolated from the tubule of the fallopian tube is incubated in a hyaluronidase solution for 15 minutes, then incubated for 2-3 hours in M2 medium at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2.

9. The method according to p. The method according to claim 7 or 8, characterized in that the microinjection of the foreign DNA solution is carried out into one of the two pronuclei, and then the injected embryo is incubated in M2 medium at 37 ° C in a 5% CO2 atmosphere until the next day.

10. The method according to p. The method of claim 1, wherein the mammal is a rat, preferably a Wistar female is used as the second female.

11. The method according to p. The method of claim 1, wherein the mammal is a rat, preferably a Brown Norway male is used as the second male.

12. The method according to p. The process of claim 11, characterized in that brown color is the dominant phenotypic trait.

13. The method according to p. The method of claim 1, wherein in step (c) prior to transplantation, the second female is mated with the second male, and the copulation efficiency is confirmed by the presence of sperm in the vaginal swab.

14. The method according to p. The process of claim 1, characterized in that in step (c) the two-cell transgenic embryo is transferred into the fallopian tube of an anesthetized female.