PL201546B1 - Sposób otrzymywania transgenicznego ssaka - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka nie będącego człowiekiem. Sposób jest wydajny i nie wymaga stosowania samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201546 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 355353 ^{(51) Int.Cl.}

C12N 15/06 (2006.01) A01K 67/027 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 05.08.2002 (54)

Sposób otrzymywania transgenicznego ssaka

	(76) Uprawniony i twórca wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	Kaczmarek Leszek,Komorów,PL
09.02.2004 BUP 03/04	Maleszewski Marek,Warszawa,PL Konopka Witold,Knurów,PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2009 WUP 04/09	(74) Pełnomocnik: Rafał Witek, WTS Rzecznicy Patentowi

⁽⁵⁷⁾ Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka nie będącego człowiekiem. Sposób jest wydajny i nie wymaga stosowania samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych.

PL 201 546 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka niebędącego człowiekiem, przykładowo szczura.

Otrzymywanie transgenicznych gryzoni zostało najwcześniej opracowane dla myszy. Znana (tradycyjna) metoda otrzymywania transgenicznych ssaków, przykładowo szczurów jest adaptacją wcześniejszych metod opracowanych dla myszy i polega na izolowaniu zapłodnionych komórek jajowych (tzw. embrionów jednokomórkowych) z jajowodów samic po wywołanej superowulacji i odbytej kopulacji (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., and Lacy, E. (1994). Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Second Edition. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)) wprowadzaniu metodami in vitro obcego DNA do wyizolowanych embrionów jednokomórkowych, a następnie wprowadzeniu zmodyfikowanych embrionów doprowadzonych do stadium dwukomórkowego do jajowodów matek zastępczych, którymi są samice w ciąży urojonej (szczegółowy opis poszczególnych etapów: Methods in Molecular Biology, Vol. 18: Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, D.Murphy i A. Carter, Humana Press Inc., Totowa, NJ). Matki zastępcze otrzymuje się wcześniej w wyniku odbytej kopulacji z bezpłodnymi (vasektomizowanymi) samcami.

Patent US5489742 zastrzega szczurzy model reumatoidalnego zapalenia stawów. Wykorzystano tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych szczurów. Szczepy szczurów transgenizowanych to: LEW i F344 Superowulacja wywołana jest poprzez ciągły wlew hormonu FSH (patrz też Armstrong, D. T. and Opavsky, M. A. (1988). Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biol. Reproduct. 39, 511-518). Embriony transferowano zaraz po mikroinjekcji (w stadium jednokomórkowym). Jako matki zastępcze wykorzystano samice rasy Sprague-Dawley (łączone z veaectomizowanymi samcami).

Opis EP0683226 ujawnia jedynie transgenezę myszy. Wykorzystywana jest standardowa procedura stosująca samice w ciąży urojonej jako matki zastępcze.

Zgłoszenie WO9314200 opisuje zwierzęcy model choroby Alzheimera. Opisana została transgenizacja zarówno myszy jak i szczurów. W przypadku myszy ujawniona technika polega na modyfikowaniu embrionalnych komórek macierzystych (ES). Procedura transgenizacji szczurów przebiega zasadniczo metodą tradycyjną. Jako szczep szczurów transgenizowanych wykorzystano: Sprague-Dawley. Superowulacja była wywołana poprzez jednorazową podskórną iniekcję PMSG bez użycia hCG. Embriony transferowane zaraz po mikroinjekcji. Jako samice na matki zastępcze wykorzystano samice w ciąży urojonej rasy Sprague-Dawley. W treści opisu opisano procedurę otrzymywania szczurów ale jak się wydaje otrzymano tylko myszy.

Patent US6372956 dotyczy transgenicznych szczurów ekspresjonujących ludzki CD4 i ludzki receptor chemokin. Treść ujawnienia nie obejmuje szczegółowego opisu procedury transgenizacji szczurów. Ograniczono się zaledwie do stwierdzenia, że zostały one przygotowane na zamówienie na podstawie kontraktów m.in przez dr Mullinsa z Edinburga, prawdopodobnie procedurą tradycyjną.

Zgłoszenie WO9915640 opisuje jedynie otrzymywanie transgenicznych myszy.

Również w opisie JP2001238681 nie ujawniono opisu metody transgenizacji innej niż tradycyjna. Podobna uwaga aktualna jest również w odniesieniu do treści zgłoszenia WO0160984. Zgłoszenie WO0160151 dotyczy szczurzego modelu ludzkiego raka prostaty. W treści opisu ujawniono, że wykorzystano szczep Sprague-Dawley, brak jednak szczegółowego opisu metody. Również w patencie US6235885 ujawniono jedynie tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych myszy.

WO0184921 opisuje tradycyjną metodę produkcji transgenicznego szczura z użyciem szczepu Sprague-Dawley i samic w ciąży urojonej.

JP3219821 opisuje sposób otrzymywania transgenicznego szczura. W porównaniu do metody tradycyjnej, istota ujawnionej metody polega na zsynchronizowaniu podawania hormonów z cyklem naturalnym. Wykorzystano samice w ciąży urojonej.

Wspólnym elementem znanych metod otrzymywania transgenicznych szczurów jest wykorzystywanie samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych dla transplantowanych embrionów transgenicznych gryzoni.

Powszechnie wiadomo jednak, że w odróżnieniu od myszy, otrzymywanie samic większych ssaków w ciąży urojonej wiąże się z problemami, które stanowią istotną przeszkodę w efektywnym wykorzystywaniu tradycyjnej metody produkowania transgenicznych ssaków, np. szczurów (porównaj Wells T., Carter D., Journal of Neuroscience Methods, 108 (2001) 111-130)). W przypadku myszy, o odbytej kopulacji z bezpłodnym samcem, ś wiadczy obecność czopa kopulacyjnego w pochwie

PL 201 546 B1 samicy. Natomiast u dorosłych ssaków większych niż myszy, np. szczurów, czop kopulacyjny występuje bardzo rzadko. Ponadto wykluczone jest badanie samic na obecność plemników w wymazie pochwowym, ze względu na użycie vasektomizowanych samców, które nie dostarczają plemników (Charreau B. i wsp. 1996, Transgenic Research 1996, vol. 5, 223-23). Trudności w identyfikowaniu samic znajdujących się w ciąży urojonej prowadzą do obniżenia wydajności tradycyjnej metody otrzymywania transgenicznych zwierząt, poprzez błędne wykorzystanie jako matki zastępczej samicy nie będącej w ciąży, co powoduje zmniejszenie lub całkowite wyeliminowanie szansy transferowanych embrionów na implantację. Prowadzi to do znacznego obniżenia liczby samic, u których ciążą przebiega normalnie i rodzi się zmienione genetycznie potomstwo. Podsumowując, można uznać tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych zwierząt za niedostatecznie wydajną i nadmiernie rozbudowaną.

Celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonej metody otrzymywania transgenicznych ssaków, cechującej się większą wydajnością i łatwością wykonania niż metody dotychczas znane. W szczególności taka metoda powinna rozwiązywać wszystkie problemy związane z uzyskaniem samic na matki zastępcze.

Tak określony cel został nieoczekiwanie zrealizowany w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka innego niż człowiek charakteryzujący się tym, że: (a) izoluje się zarodek z zapłodnionej samicy, (b) uzyskuje się in vitro transgeniczny zarodek wprowadzając obce DNA do komórki zarodka prowadząc mikroiniekcję obcego DNA, korzystnie plazmidu pTRGFP, do wyizolowanego zarodka, przy czym przed mikroiniekcją zarodek izolowany z bańki jajowodu inkubuje się w roztworze hialuronidazy, a następnie w medium M2 w atmosferze CO2, natomiast mikroiniekcję obcego DNA prowadzi się do jednego z dwóch przedją drzy, a nastrzyknięty zarodek inkubuje się w medium M2 w atmosferze CO2, (c) transplantuje się transgeniczny zarodek do jajowodów drugiej samicy uprzednio zapłodnionej plemnikiem drugiego samca i uzyskuje transgenicznego potomka, przy czym transgenicznego potomka identyfikuje się poprzez stwierdzenie braku dominującej cechy fenotypowej kodowanej jedynie przez materiał genetyczny drugiego samca, a skuteczność transgenizacji potwierdza się stwierdzając obecność obcego DNA lub jego fragmentu w komórce potomka nieposiadającego dominującej cechy fenotypowej.

Korzystnie, w etapie (a) pierwszą samicę kontaktuje się z pierwszym samcem, po czym izoluje się z jej jajowodów zarodek. Korzystnie ssakiem jest szczur, przy czym korzystnie jako pierwszą samicę stosuje się samicę rasy Wistar. Korzystnie jako pierwszego samca stosuje się samca rasy Wistar. Równie korzystnie przed krzyżowaniem pierwszej samicy podaje się pierwszą gonadotropinę, korzystnie PMSG, a następnie drugą gonadotropinę, korzystnie hCG. Korzystnie gonadotropinę PMSG podaje się dootrzewnowe w ilości 20 IU na 52-54 godziny przed podaniem drugiej gonadotropiny hCG, którą podaje się dootrzewnowo w ilości 25 IU w dniu kopulacji. Równie korzystnie w etapie (b) skuteczność transgenizacji potwierdza się stwierdzając obecność obcego DNA lub jego fragmentu w komórce potomka nieposiadają cego dominują cej cechy fenotypowej. Korzystnie bezpo ś rednio przed mikroiniekcją zarodek izolowany z bańki jajowodu inkubuje się w roztworze hialuronidazy przez 15 minut, następnie inkubuje się przez 2-3 godziny w medium M2 w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Korzystnie mikroiniekcję roztworu obcego DNA prowadzi się do jednego z dwóch przedjądrzy, a następnie nastrzyknięty zarodek inkubuje się w medium M2 w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 do dnia następnego. Korzystnie jako drugą samicę stosuje się samicę rasy Wistar. Korzystnie jako drugiego samca stosuje się samca rasy Brown Norway. Korzystnie dominującą cechą fenotypową jest brązowe ubarwienie. Korzystnie w etapie (c) przed transplantacją drugą samicę krzyżuje się z drugim samcem, a skuteczność kopulacji potwierdza się stwierdzając obecność plemników w wymazie z pochwy. Korzystnie w etapie (c) przenosi się dwukomórkowy zarodek transgeniczny do jajowodu znieczulonej samicy.

Nieoczekiwanie, przełamując dotychczasowe schematy obowiązujące w metodach otrzymywania transgenicznych gryzoni, zrezygnowano ze stosowania samic w ciąży urojonej i jako matki zastępcze użyto samice w normalnej ciąży. Identyfikacja transgenicznego potomstwa jest możliwa dzięki odpowiedniemu doborowi genotypów wykorzystywanych w sposobie gamet, a w korzystnej realizacji sposobu poprzez odpowiedni dobór genotypów wykorzystywanych samców i samic. Jedynie plemnik, a tym samym samiec, wykorzystany do zapł odnienia matki zastępczej przenosi dominują c ą , ł atwą do stwierdzenia cechę fenotypową (np. kolor sierści).

W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku samice na matki zastępcze krzyżowane są z pł odnymi samcami, a obecność plemników (czyli stwierdzenie ciąży) ustalana jest poprzez wymaz

PL 201 546 B1 pochwowy. W przypadku szczurów zastosowanie samców brązowych szczepu BN (gen koloru sierści - brą zowy - jest dominują cy) pozwala na odróż nienie potomstwa pochodzą cego z normalnej ciąży (kolor sierści brązowy) od potomstwa, które rozwinęło się z embrionów poddanych mikroiniekcji (kolor biały). Zmienione genetycznie embriony (mikroiniekcja) pochodzą z krzyżówki białej samicy Wistar i biał ego samca Wistar.

Nieoczekiwanie, zaprezentowany sposób posiada liczne zalety w porównaniu z dotychczas znanymi metodami otrzymywania transgenicznych ssaków. Przede wszystkim jest on pozbawiony wszystkich wad związanych ze stosowaniem samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych, gdzie ciąża indukowana jest sztucznie poprzez kopulację z bezpłodnym (vasectomizowanym) samcem. Nie ma już konieczności przeprowadzania trudnego identyfikowania samic w ciąży urojonej. W ten sposób wyeliminowano także możliwość pomyłki w identyfikowaniu transgenicznego potomstwa i pomylenia go z potomstwem zapłodnionej samicy mylnie uznanej za samicę w ciąży urojonej (gdyż istnieje ryzyko nie pełnej vasectomii).

Zwiększa to istotnie wydajność metody, a także ułatwia jej realizację.

Przebieg ciąży naturalnej jest dużo korzystniejszy niż ciąży urojonej, co również poprawia wydajność i jakość uzyskiwanego potomstwa transgenicznego.

Opis wynalazku uzupełniono następującymi figurami:

Figura 1 to mapa konstruktu genetycznego TR-GFP użytego do wytworzenia szczurów transgenicznych, PhCMV-1 - promotor tetracyklinowy (ref. Plazmid pUHD10-3, prof. Heramann Bujard, http://www.zmbh.uni-heidelberg.de/Bujard/default.html), EGFP-1 - wektor zawierający gen EGFP - zielone białko fluorescencyjne (Clontech) http://www.clontech.com;

Figura 2 przedstawia wynik reakcji PCR genotypowania osobników założycielskich F0 szczurów transgenicznych TR-GFP, M - marker wielkości DNA, 4,5,7,8 - przykładowe negatywne osobniki, 9,13,20,22 - transgeniczne osobniki TR-GFP, (+), (-) - kontrola pozytywna i negatywna reakcji PCR. Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku została ona zilustrowana poniższymi przykładami. Błędne byłoby jednak ograniczanie zakresu wynalazku jedynie do tych przykładowych realizacji.

P r z y k ł a d 1. Procedura otrzymywania transgenicznych ssaków na przykładzie szczurów

W procedurze transgenizacji wykorzystuje się dwa rodzaje szczepów szczurów hodowlanych:

1. Wistar - kolor sierści biały

2. BN (ang. Brown Norway) - kolor sierści brązowy

Dzień 1.

Siedem samic szczurzych szczepu hodowlanego Wistar nastrzyknąć dootrzewnowo 20 IU gonadotropiny PMSG. Użyć samic 5-6 tygodniowych. Iniekcję wykonać o godzinie 10.00.

Dzień 2.

Umieścić 20 samic Wistar 8-15 tygodniowych, przeznaczonych na matki zastępcze w klatkach hodowlanych, w których wcześniej przebywały samce.

Dzień 3.

Samice z dnia pierwszego nastrzyknąć dootrzewnowe(o) gonadotropiną hCG 25 IU o godzinie 15.00. Następnie umieścić samice w klatkach z dorosłymi płodnymi samcami Wistar (1 samiec + 1 samica).

Dzień 4.

Zrobić wymaz z pochwy samicom z dnia 3 i sprawdzić obecność w wymazie plemników, świadczących o odbytej w nocy kopulacji. Następnie samice pozytywne (takie, u których stwierdzono obecność plemników) znieczulić poprzez wstrzyknięcie 1 ml środka Nembutal w dawce 60 mg/ml, a następnie przerwać rdzeń kręgowy. Wyciąć jajowody każdej z samic i umieścić w medium M2. Następnie przenieść do roztworu hialuronidazy i wyizolować embriony jednokomórkowe z bańki jajowodu. Inkubować embriony w roztworze hialuronidazy przez 15 minut, w celu oddzielenia komórek pęcherzykowych od embrionów. Przenieść embriony do medium M2 i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Opisane czynności wykonać przed godziną 12.00. Mikroiniekcję roztworu DNA o stężeniu 2 ng/μΐ rozpocząć o godzinie 14.00 (przedjądrza są wtedy dobrze widoczne). Roztwór DNA przygotować w następujący sposób: liniowy fragment DNA wyizolować z żelu agarozowego, oczyścić przy pomocy zestawu Qiaex II (Qiagen), odsolić przy pomocy membran

Millepore, a następnie przefiltrować przez filtr o średnicy porów 0,22 μm. Mikroiniekcję wykonać do jednego z dwóch przedjądrzy każdego embrionu, a następnie nastrzyknięte embriony inkubować do następnego dnia. O godzinie 15.00 połączyć samice Wistar z dnia drugiego z samcami płodnymi BN (1 samiec + 2 samice).

PL 201 546 B1

Dzień 5.

Samicom Wistar połączonym z samcami BN dnia poprzedniego zrobić wymaz pochwowy na obecność plemników. Pozytywne samice użyć do transplantacji nastrzykniętych embrionów. Samice - matki zastępcze - znieczulić wodzianem chloralu w dawce 250 mg/kg masy ciała, a następnie 2-komórkowe, nastrzyknięte DNA embriony przetransferować do jajowodów samic.

Dzień 27-28. Narodziny potomstwa matek zastępczych:

1. koloru białego - potencjalnie transgeniczne, powstałe z nastrzykniętych embrionów - krzyż ówka Wistar x Wistar

2. koloru brązowego - z naturalnej ciąży samic Wistar - krzyżówka BN x Wistar

Dzień 48-49.

Genotypowanie (stwierdzenie obecności transgenu) u białego potomstwa z wykorzystaniem metody PCR lub Southern blotting.

P r z y k ł a d 2. Otrzymywanie transgenicznych szczurów zawierających konstrukt TR-GFP.

Metodę opisaną w przykładzie 1 użyto do otrzymania szczurów transgenicznych zawierających konstrukt TR-GFP (gen reporterowy GFP - ang. Green Fluorescent Protein) patrz Figura 1. Nastrzyknięto 150 embrionów, z których do stadium 2-komórkowego rozwinęło się około 70. Dwukomórkowe embriony transplantowano do 5 matek zastępczych, które urodziły 23 białe osobniki. Następnie izolowano DNA z tkanek białego potomstwa i wykonano reakcję PCR na obecność transgenu w genomie zwierząt - patrz figura 2. Wśród 23 białych szczurów obecność transgenu stwierdzono u czterech. W porównaniu z danymi Iiteraturowymi (Charreau B. i wsp. 1996, supra) osią gnię to wię kszą wydajność procesu transgenizacji, wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1

Porównanie wydajności poszczególnych metod transgenizacji szczurów

	Wybrane grupy badawcze
my	Charreau et al..	Hochi et al..	Mullins et al..
Liczba urodzonych osobników	23	116	66	8
(% przetransferowanych embrionów)	(32,9)	(17,4)	(22)	(brak danych)
Liczba osobników transgenicznych	4	5	10	5
(% urodzonych)	(17,3)	(4,3)	(15)	(62)
Liczba osobników transgenicznych (% embrionów poddanych mikroinjekcji)	2,6	0,5	1,2	brak danych

Ponadto przeprowadzono eksperymenty mające potwierdzić funkcjonowanie zintegrowanego transgenu. Doświadczenia wykonane na hodowlach pierwotnych fibroblastów pobranych z uszu potwierdziły prawidłowy wzór ekspresji u wszystkich czterech osobników. Następnie skrzyżowano transgeniczne osobniki założycielskie z nietransgenicznymi szczurami Wistar i u otrzymanego potomstwa, przy pomocy reakcji PCR (figura 2.) przeprowadzono badania na obecność transgenu. Prawidłową transmisję płciową, czyli przekazywanie transgenu potomstwu stwierdzono we wszystkich czterech przypadkach. Wyniki gromadzi Tabela 2.

T a b e l a 2

Wzór przekazywania transgenu TR-GFP w poszczególnych liniach szczurów transgenicznych TR-GFP

	Linie szczurów transgenicznych
9	13	20	22
Liczba osobników potomnych pokolenia F1	17	23	23	27
Liczba osobników transgenicznych potomstwa F1	10	10	3	17
Procent osobników transgenicznych potomstwa F1	58%	43%	13%	63%

PL 201 546 B1

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania transgenicznego ssaka innego niż człowiek, znamienny tym, że

   a. izoluje się zarodek z zapł odnionej samicy,

   b. uzyskuje się in vitro transgeniczny zarodek wprowadzają c obce DNA do komórki zarodka prowadząc mikroiniekcję obcego DNA, korzystnie plazmidu pTRGFP, do wyizolowanego zarodka, przy czym przed mikroiniekcją zarodek izolowany z bańki jajowodu inkubuje się w roztworze hialuronidazy, a następnie w medium M2 w atmosferze CO2, natomiast mikroiniekcję obcego DNA prowadzi się do jednego z dwóch przedjądrzy, a nastrzyknięty zarodek inkubuje się w medium M2 w atmosferze CO2,

   c. transplantuje się transgeniczny zarodek do jajowodów drugiej samicy uprzednio zapł odnionej plemnikiem drugiego samca i uzyskuje transgenicznego potomka, przy czym transgenicznego potomka identyfikuje się poprzez stwierdzenie braku dominującej cechy fenotypowej kodowanej jedynie przez materiał genetyczny drugiego samca, a skuteczność transgenizacji potwierdza się stwierdzając obecność obcego DNA lub jego fragmentu w komórce potomka nieposiadającego dominującej cechy fenotypowej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) pierwszą samicę kontaktuje się z pierwszym samcem, po czym izoluje się z jej jajowodów zarodek.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że ssakiem jest szczur, przy czym korzystnie jako pierwszą samicę stosuje się samicę rasy Wistar.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że ssakiem jest szczur, przy czym korzystnie jako pierwszego samca stosuje się samca rasy Wistar.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że przed krzyżowaniem pierwszej samicy podaje się pierwszą gonadotropinę, korzystnie PMSG, a następnie drugą gonadotropinę, korzystnie hCG.
6. 6. Sposób wedł ug zastrz. 5, znamienny tym, ż e ssakiem jest szczur, przy czym gonadotropinę PMSG podaje się dootrzewnowo w ilości 20 IU na 52-54 godziny przed podaniem drugiej gonadotropiny hCG, którą podaje się dootrzewnowo w ilości 25 IU w dniu kopulacji.
7. 7. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e w etapie (b) skuteczność transgenizacji potwierdza się stwierdzając obecność obcego DNA lub jego fragmentu w komórce potomka nieposiadającego dominującej cechy fenotypowej.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że bezpoś rednio przed mikroiniekcją zarodek izolowany z bańki jajowodu inkubuje się w roztworze hialuronidazy przez 15 minut, następnie inkubuje się przez 2-3 godziny w medium M2 w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.
9. 9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, ż e mikroiniekcję roztworu obcego DNA prowadzi się do jednego z dwóch przedjądrzy, a następnie nastrzyknięty zarodek inkubuje się w medium M2 w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 do dnia następnego.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ssakiem jest szczur, przy czym korzystnie jako drugą samicę stosuje się samicę rasy Wistar.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ssakiem jest szczur, przy czym korzystnie jako drugiego samca stosuje się samca rasy Brown Norway.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że dominującą cechą fenotypową jest brązowe ubarwienie.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (c) przed transplantacją drugą samicę krzyżuje się z drugim samcem, a skuteczność kopulacji potwierdza się stwierdzając obecność plemników w wymazie z pochwy.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (c) przenosi się dwukomórkowy zarodek transgeniczny do jajowodu znieczulonej samicy.