PL201716B1 - Zastosowanie przeciwciała specyficznie wiążącego się do integryny alfa 6 w leczeniu zwłóknienia wątroby - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie przeciwcia la, które specyficznie wiaze si e do integryny a? ß6 i blokuje wi azanie ligandu do integryny av ß6 do wytwarzania leku do leczenia zw lóknienia w atroby u pacjenta. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała, które specyficznie wiąże się do integryny ανβ6 i blokuje wiązanie ligandu do integryny ανβ6 w leczeniu zwłóknienia wątroby u pacjenta.

Integryny są heterodimerycznymi receptorami adhezji komórkowej złożonymi z dwóch podjednostek, α i β. Integryna ανβ6 jest receptorem fibronektyny i tenascyny ujawnianym głównie przez komórki nabłonka. W zdrowych tkankach naczelnych β6 mRNA i proteina są rzadko wykrywane, aczkolwiek β6 jest ujawniana podczas rozwoju płodu, gojenia się rany i przy pewnych nowotworach nabłonka. Jeśli podjednostka β6 jest ujawniana przez linię komórkową raka okrężnicy, gdzie normalnie nie występuje, ujawnianie podjednostki nadaje zwiększoną zdolność do proliferacji. Terminalna -COOH regionu 11 aminokwasu, unikatowa w podjednostce β6, jest niezbędna do zwiększenia aktywności proliferacyjnej integryny ανβ6 (Agrez, et al., J. Cell. Biol., 127: 547-556 (1994). Ekspresja β6 jest indukowana w komórkach nabłonka pęcherzyków podczas urazu wywołanego iniekcją żywych bakterii oraz ekspresja β6 jest obserwowana w ogniskach podklinicznych stanów zapalnych, jak również w rozmaitych próbkach klinicznych od pacjentów z przewlekł ym lub ostrym stanem zapalnym pł uc lub nerek (Breuss, et al., J. Cell Sci., 108: 2241-2251 (1995)).

Huang, et al. (J. Cell Biol., 133: 921-928 (1996)) ujawnił homozygotyczne myszy, o nieistotnych mutacjach genu kodującego podjednostkę β6, z brakiem młodzieńczego owłosienia związanym z infiltracją makrofagów do skóry oraz z akumulowanymi aktywowanymi limfocytami wokół przewodzących dróg oddechowych w płucach.

Zwłóknienie płuc jest typowym zaburzeniem uważanym za skutek destruktywnego działania produktów uwalnianych przez leukocyty (patrz na przykład Marshall, et al., Int. J. Biochem. Cell Bio., 29: 107-120 (1997)). Indukowany bleomycyną uraz płuc i zwłóknienie płuc są powiązane i mogą zależeć od gromadzenia i aktywacji limfocytów (Schrier, D.J., et al., Am. J. Pathol., 116: 270-278 (1984)). Wśród proponowanych terapii wobec miąższowego urazu płuc i zwłóknienia płuc istnieją terapeutyczne podejścia „antycytokinowe (Coker, et al., Thorax, 52(2): 294-296 (1997)).

Jednakże, aktualne terapie wobec ostrego urazu płuc i zwłóknienia płuc są w większości niewłaściwe (patrz na przykład King, et al., „Idiopathyic Pulmonary Fibrosis and other Interstinial Lung Diseases of Unknown Etiology w Textbook of Respiratory Medicine, Murray i Nadel, ed., W.B. Saunders, Filadelfia, PA, str. 1827-1839 (1994)). Zatem istnieje zapotrzebowanie na terapie wobec ostrego urazu płuc i zwłóknienia płuc. Do tego i innych zapotrzebowań odnosi się obecny wynalazek.

Jednym aspektem obecnego wynalazku jest sposób leczenia ostrego urazu płuc pacjenta, obejmujący podawanie pacjentowi dawki terapeutycznej antagonisty ανβ6. Wynalazek dostarcza również sposoby inhibitowania przerzutów płucnych obejmujące podawanie pacjentowi terapeutycznej dawki antagonisty ανβ6. Dalszym aspektem wynalazku jest sposób leczenia zwłóknienia płuc pacjenta, obejmujący podawanie pacjentowi terapeutycznej dawki antagonisty ανβ6.

Dalszym aspektem wynalazku jest ciało monoklonalne wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 12382.

Dalszym aspektem wynalazku jest hybrydoma ATCC HB 12382.

Krótki opis rysunków

Fig. 1A jest wykresem porównującym zawartość płucnej hydroksyproliny u myszy ujawniających nieistotne mutacje genu podjednostki integryny β6 z myszami kontrolnymi w obecności bleomycyny (blm) lub solanki (sal).

Fig. 1B jest fotografią trichromowego wybarwienia sekcji dolnych płuc, demonstrującym gęste akumulowanie kolagenowych matryc zewnątrzkomórkowych w płucach traktowanych bleomycyną myszy typu ulicznego (β6 +/+) ale nie β6-/- w 30 dni po podaniu.

Fig. 2 jest wykresem porównującym przyrost wody w płucach u myszy typu ulicznego (β6+/+) w porównaniu z β 6-/- w obecnoś ci bleomycyny (blm) lub solanki (sal).

Fig. 3 jest wykresem porównującym gromadzenie się limfocytów u myszy typu ulicznego (β6+/+) i β 6-/- po podaniu bleomycyny (blm) lub solanki (sal).

Szczegółowy opis wynalazku

Obecny wynalazek dostarcza sposoby i kompozycje do leczenia ostrego urazu płuc, takiego jak (nie ograniczając zakresu) uraz płuc wynikły z zakażenia bakteryjnego, wstrząsu krwotocznego, inhalacji środków toksycznych i indukowanego bleomycyną i innymi lekami urazu płuc. W dodatku, kompozycje według wynalazku są użyteczne w leczeniu zwłóknienia w nabłonkach organów, takich jak płuco, wątroba, nerka, pęcherz i przełyk.

PL 201 716 B1

Kompozycje takie mogą być dostarczane profilaktycznie lub terapeutycznie pacjentom, mającym lub zagrożonym pojawieniem się objawów ostrego urazu lub zwłóknienia płuc. Na przykład pacjenci, którzy byli eksponowani na toksyczny środek inhalacyjny, byliby prawdopodobnie leczeni po takiej ekspozycji, podczas gdy pacjent otrzymujący bleomycynę mógłby być leczony profilaktycznie i/lub terapeutycznie. Zazwyczaj kompozycje według wynalazku są podawane w reżymie dziennym przez co najmniej okres 1-5 dni, aczkolwiek pacjenci ze zdiagnozowanym zwłóknieniem płuc, chorobą postępującą, mogą otrzymywać terapeutyczne dawki przez okresy miesięcy i lat. Niniejszym używana „dawka terapeutyczna oznacza dawkę, która zapobiega, łagodzi, zmniejsza objawy lub inaczej ogranicza powagę objawów u pacjenta.

W pewnych praktycznych realizacjach według wynalazku s ą dostarczone antagoniści ανβ6. Tacy antagoniści stanowią (nie ograniczając zakresu) przeciwciała, które specyficznie wiążą się z β6; przeciwciała, które specyficznie wiążą się z ligandem ανβ6; ligandy ανβ6; antysensowne kwasy nukleinowe; niepeptydowe i mimetyzujące peptydy analogi takich ligandów.

Przeciwciała mogą być syntetyczne, monoklononalne lub poliklonalne, i mogą być wytwarzane technikami dobrze znanymi w dziedzinie. W korzystnej praktycznej realizacji antagonista jest przeciwciałem, które specyficznie rozpoznaje region cytoplazmatyczny podjednostki β6 (na przykład patrz Weinacker, et al., J. Cell. Bio., 269: 1-9 (1994)). Do celów terapeutycznych „ludzkie przeciwciała monoklonalne mające ludzkie niezmienne i zmienne regiony są często korzystne, ponieważ minimizują reakcję immunologiczną pacjenta względem tych przeciwciał. Przeciwciała takie mogą być generowane przez immunizację zwierząt transgenicznych, które mają ludzkie geny immunoglobuliny. Patrz Jakobovits, et al., Ann. NY Acad. Sci., 764: 525-535 (1995). W połączeniu z syntetycznymi i półsyntetycznymi przeciwciałami, terminy takie winny objąć, nie ograniczając zakresu, fragmenty przeciwciał, izotypowo przekształcone przeciwciała, przeciwciała humanizowane (np. mysz-człowiek, człowiekmysz i podobne), hybrydy, przeciwciała o mnogiej specyficzności, pseudocząsteczki-całkowicie syntetyczne przeciwciała i podobne.

Zgodnie z poniższym omówieniem, przeciwciała mogą być poddane skriningowi co do zdolności blokowania wiązania ligandu do ανβ6 i/lub innych właściwości, takich jak zdolność do zapobiegania in vivo indukowanemu bleomycyną zwłóknieniu płuc. Przykładowym przeciw-e6 przeciwciałem monoklonalnym jest 10D5 (depozyt w ATCC, nr HB 12382, zdeponowany 6 sierpnia 1997).

W innych praktycznych realizacjach według wynalazku stosowanymi antagonistami są peptydy, polipeptydy lub cząstki mimetyzujące peptydy, zaprojektowane jako ligandy ανβ6 na podstawie obecności domeny komórki adhezji, kwasu arginino-glicyno-asparaginowego (RGD). Projektowanie takich cząsteczek jako ligandów integryn jest zilustrowane, na przykład, w Pierschbacher, et al., J. Cell. Biochem., 56: 150-154 (1994); Ruoslahti, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol., 12: 697-715 (1996); Chorev, et al., Biopolymers, 37: 367-375 (1995); Pasqualini, et al., J. Cell. Biol., 130: 1189-1196 (1995); i Smith, et al., J. Biol. Chem., 269: 32788-32795 (1994).

W pewnych praktycznych realizacjach według wynalazku cząsteczki antysensownych kwasów nukleinowych są używane jako antagoniści ανβ6. Cząsteczki antysensownych kwasów nukleinowych są komplementarnymi łańcuchami kwasów nukleinowych zaprojektowanymi do wiązania ze specyficzną sekwencją nukleotydów w celu inhibitowania wytwarzania docelowej proteiny. Sekwencja nukleotydowa podjednostki integryny β6 została ujawniona w U.S.S.N 07/728 215, złożonym 11 lipca 1991, który odnośnik jest niniejszym w całości dołączony. Środki te mogą być stosowane samodzielnie lub w połączeniu z innymi antagonistami. Antysensowny antagonista może być dostarczony jako antysensowny nukleotyd, taki jak RNA (patrz na przykład Murayama, et al., Antisence Nucleic Acid Drug. Dev., 7: 109-114 (1997)). Antysensowne geny mogą być również dostarczone w wirusowym wektorze, jak na przykład w wirusie zapalenia wątroby B (patrz na przykład Ji, et al., J. Viral. Hepat., 4: 167-173 (1997)); w adenowirusie (patrz na przykład Xiao, et al., Brain Res., 756: 76-83 (1997); lub w innych układach obejmujących, nie ograniczając zakresu, HVJ (wirus Sendai)-układ liposomowego dostarczania genu (patrz na przykład Kaneda, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 811: 299-308 (1997)); „wektor peptydowy (patrz na przykład Vidal, et al., CR Acad. Sci., III 32: 279-287 (1997)); jako gen w episomie lub plazmidowy wektor (patrz na przykład Cooper, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 94: 6450-6455 (1997), Yew, et al., Hum. Gene Ther., 8: 575-584 (1997)); jako gen w agregacie peptyd-DNA (patrz na przykład Niidome, et al., J. Biol. Chem., 272: 15307-15312 (1997)); jako „nagi DNA (patrz na przykład U.S. 5 580 859 i U.S. 5 589 466); oraz w lipidowych układach wektorowych (patrz na przykład Lee, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 14: 173-206 (1997)).

PL 201 716 B1

Działanie potencjalnych antagonistów ανβ6 może być poddane skriningowi z użyciem rozmaitych technik znanych w dziedzinie i/lub ujawnionych w obrębie obecnego zgłoszenia, takich jak zabezpieczanie przez zwłóknieniem indukowanym bleomycyną na modelu myszy; inhibitowanie proliferacji komórek nowotworowych (Agrez, et al., J. Cell. Bio., 127: 547-556 (1994)); i inhibitowanie migracji komórek i/lub inhibitowanie adhezji komórek (patrz część eksperymentalna - przykłady).

Liczne właściwe postacie preparatów antagonistów według wynalazku znajdują w preparatyce znanej wszystkim chemikom-farmaceutom: Remington's Pharmaceutical Sciences (15-te wydanie, Mack Publishing Company, Easton, Pensylwania (1975)), szczególnie w części 87 autorstwa Blaug'a i Seymour'a. Preparaty te obejmują na przykł ad proszki, pasty, maś ci, galaretki, woski, oleje, lipidy, bezwodne bazy absorpcyjne, emulsje olej w wodzie i woda w oleju, emulsje z karbowaksami (glikole polietylenowe o zróżnicowanych ciężarach cząsteczkowych), półstałe żele i półstałe mieszaniny zawierające karbowaks.

Ilości składnika aktywnego niezbędne dla skutecznej terapii będą uzależnione od wielu czynników, łącznie ze sposobem podawania, rejonem docelowym, stanem fizjologicznym pacjenta i innymi podawanymi lekarstwami. A zatem podawane dawki winny być odmiareczkowywane w celu zoptymalizowania bezpieczeństwa i skuteczności. Zwykle, dawki stosowane in vitro mogą stanowić użyteczna wskazówkę co do ilości użytecznych przy podawaniu in situ składników aktywnych. Testy na zwierzętach pod względem skutecznych dawek w leczeniu konkretnych zaburzeń, dostarczają dalszych wskazań do przewidywania dawek dla ludzi. Rozmaite uwarunkowania są ujawnione na przykład w Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7-me wydanie (1985), MacMillian Publishing Company, Nowy Jork i Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-te wydanie (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pensylwania. Omówione są tam sposoby podawania, łącznie z podawaniem doustnym, dożylnym, dootrzewnowym, domięśniowym, przezskórnym, donosowym, jonoforetycznym i podobnymi.

Kompozycje według wynalazku mogą być podawane w rozmaitych dawkach jednostkowych, zależnie od sposobu podawania. Na przykład postacie dawek jednostkowych odpowiednie do podawania doustnego obejmują stałe postacie dawek, takie jak proszki, tabletki, pigułki, kapsułki i drażetki oraz ciekłe postacie dawek, takie jak eliksiry, syropy i zawiesiny. Składniki aktywne mogą być również podawane pozajelitowo w sterylnych, ciekłych postaciach dawek. Kapsułki żelatynowe zawierają składnik aktywny oraz, jako składniki nieaktywne, sproszkowane nośniki, takie jak glukoza, laktoza, sukroza, mannitol, skrobia, celuloza lub pochodne celulozy, stearynian magnezowy, kwas stearynowy, sól sodowa sacharyny, talk, węglan magnezowy i podobne. Przykładami dodatkowych składników nieaktywnych, które mogą być dodane w celu zapewnienia żądanego koloru, smaku, stabilności, zdolności buforowej, dyspergowalności lub innych znanych żądanych cech, są czerwony tlenek żelaza, żel krzemionkowy, laurylosiarczan sodowy, ditlenek tytanu, jadalna biała farba i podobne. Podobne rozcieńczalniki mogą być użyte do wytworzenia prasowanych tabletek. Zarówno tabletki i kapsułki mogą być wytwarzane jako produkty o przedłużonym uwalnianiu w celu zapewnienia ciągłego uwalniania lekarstwa przez okres godzin. Tabletki prasowane mogą być powlekane cukrem lub powlekane filmem w celu zamaskowania jakiegokolwiek nieprzyjemnego smaku i zabezpieczenia tabletek przed czynnikami atmosferycznymi, lub powlekane dojelitowo w celu uzyskania selektywnej dezintegracji w drogach żołądkowo-jelitowych. Ciekłe postacie dawek do podawania doustnego mogą zawierać środki barwiące i smakowe, dla ułatwienia przyjmowania przez pacjenta.

Stężenie kompozycji według wynalazku w preparatach farmaceutycznych może być szeroko zróżnicowane, tj. od poniżej około 0,1%, zwykle lub co najmniej około 2% do aż 20% do 50% wagowych lub więcej, i jest dobierane głównie pod kątem objętości płynu, lepkości itd., odpowiednio do danego, wybranego sposobu podawania.

Kompozycje według wynalazku mogą być podawane poprzez liposomy. Liposomy obejmują emulsje, pianki, micelle, nierozpuszczalne warstwy monomolekularne, ciekłe kryształy, dyspersje fosfolipidowe, warstwy o strukturze płytkowej i podobne. W tych preparatach kompozycja według wynalazku, która ma być dostarczana, jest wbudowana jako część liposomu, sama lub w połączeniu z cząsteczką, która wiąże się z żądanym celem, takim jak przeciwciało, lub z innymi kompozycjami terapeutycznymi lub immunogenicznymi. Zatem, liposomy zarówno wypełnione lub pokryte żądaną kompozycją według wynalazku mogą być dostarczane ogólnoustrojowo, lub mogą być skierowane do danej tkanki, do której liposomy dostarczają wybrane kompozycje peptydowe - terapeutyczne/immunogeniczne.

PL 201 716 B1

Liposomy stosowane według wynalazku są tworzone ze standardowych lipidów tworzących pęcherzyki, które ogólnie obejmują nienaładowane i naładowane ujemnie fosfolipidy oraz sterol, taki jak cholesterol. Przy doborze lipidów należy kierować się np. wielkością liposomu, labilnością wobec kwasów i stabilnością liposomów w strumieniu krwi. Rozmaite sposoby otrzymywania liposomów są dostępne i ujawnione w np. Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), opis patentowy U.S. nr 4 235 871, 4 501 728, 4 837 028 i 5 019 369, które odnośniki są niniejszym dołączone.

Zawiesina liposomowa zawierająca kompozycje według wynalazku może być podawana dożylnie, lokalnie, miejscowo itd. w dawce, która zmienia się w zależności między innymi od sposobu podawania, dostarczanej kompozycji według wynalazku i zaawansowania leczonej choroby.

W przypadku kompozycji stałych mogą być użyte typowe nietoksyczne nośniki stałe klasy farmaceutycznej, które obejmują na przykład mannitol, laktozę, skrobię, stearynian magnezowy, sól sodową sacharyny, talk, celulozę, glukozę, węglan magnezowy i podobne. W przypadku podawania doustnego, farmaceutycznie dopuszczalna nietoksyczna kompozycja jest tworzona poprzez dołączenie jakichkolwiek zwykle stosowanych zaróbek, takich jak te nośniki uprzednio wyliczone, oraz zwykle 10-95% składnika aktywnego, to jest jednej lub więcej kompozycji według wynalazku, a bardziej korzystnie w stężeniu 25%-75%.

Do podawania aerozolowego kompozycje według wynalazku są korzystnie dostarczane w postaci subtelnego proszku, łącznie z surfaktantem i propelentem. Typowe składy procentowe kompozycji według wynalazku to 0,01%-20% wagowych, korzystnie 1%-10%. Surfaktant, oczywiście, musi być nietoksyczny i korzystnie rozpuszczalny w propelencie. Reprezentatywnymi środkami tego rodzaju są estry lub częściowe estry kwasów tłuszczowych, zawierające od 6 do 22 atomów węgla, takich kwasów jak kapronowy, oktanowy, laurynowy, palmitynowy, stearynowy, linolowy, linolenowy, oleostearynowy i oleinowy, z alifatycznym alkoholem wielowodorotlenowym lub jego cyklicznym bezwodnikiem. Mogą być używane estry mieszane, takie jak mieszane lub naturalne glicerydy. Surfaktanty mogą stanowić 0,1%-20% wagowych kompozycji, korzystnie 0,25-5%. Resztę kompozycji stanowi zwykle propelent. Może być również dodany nośnik, jeśli żądane, jak np. lecytyna do dostarczania donosowego.

Produkty według wynalazku mogą być w dodatku dostarczane jako układy depotowe, w postaci kapsułkowanej lub jako implanty, z użyciem technik dobrze znanych w dziedzinie. Podobnie produkty mogą być dostarczane pompą do danej tkanki.

Jakikolwiek z powyższych preparatów może być odpowiedni do leczenia i terapii według obecnego wynalazku, pod warunkiem, że składnik aktywny w preparacie nie jest dezaktywowany przez preparat i preparat jest fizjologicznie kompatybilny.

Poniższe przykłady są dostarczone w celu zilustrowania pewnych aspektów obecnego wynalazku i nie stanowią ograniczenia jego zakresu.

Przykłady eksperymentalne

I. Wprowadzenie

Zwłóknienie płuc jest typowym zaburzeniem, którego przyczyną, jak uważa się, są destruktywne działania produktów uwalnianych przez leukocyty. Aczkolwiek nabłonek oddechowy jest uszkadzany w trakcie rozwoju zwłóknienia, to jak uprzednio wykazano, same komórki nabłonka nie uczestniczą w tym procesie. Zbadaliś my działanie bleomycyny - leku, który wywołuje zwłóknienie płuc, na myszach ujawniających nieistotne mutacje pojedynczego genu podjednostki integryny (β6), że jest wyłącznie ograniczone do komórek nabłonka. Myszy β6-/- były niezwykle chronione przed zwłóknieniem indukowanym bleomycyną. Terapie nakierowane na tę integrynę mogłyby zatem dostarczyć nowe podejścia do leczenia tego na ogół nieuleczalnego zaburzenia.

Integryna ανβ6 jest ujawniana wyłącznie przez komórki nabłonka, z reguły podczas organogenezy i reakcji urazowej. Myszy β6-/- wykazywały nadmierne reakcje zapalne na urazy skórne i dróg oddechowych, ale rozwijały się i rozmnażały normalnie (Huang, X.Z., et al., J. Cell Biol., 133: 921-928 (1996)).

II. Dezaktywowanie genu podjednostki integryny β6 zabezpiecza myszy przed zwłóknieniem płuc indukowanym bleomycyną.

Toksyczność płucna bleomycyny była badana poprzez iniekcję dotchawiczną (0,03 jednostek (u) w 60 μ l solanki) lub zaróbki - solanki (60 μ l) myszom ulicznego typu (β 6+/+) i PS-/- w róż nym wieku i różnej pł ci szczepu 129SVEMS. Zwł óknienie p ł uc oceniano 15, 30 i 60 dnia po podaniu poprzez zbadanie morfologii płuc i poprzez pomiar zawartości hydroksyproliny oraz wskaźnika depozytu kolagenu. Zwłóknienie było znaczne u myszy typu ulicznego traktowanych bleomycyną po 30 dniach i postępo6

PL 201 716 B1 wało do 60 dnia (fig. 1A - 1B). W przeciwieństwie, morfologia płuc myszy β6-/- pozostawała prawie normalna w trakcie eksperymentu, jedynie z niewielkimi plamami zwłóknienia; zawartość płucna hydroksyproliny nie była istotnie różna w żadnym momencie od tej zmierzonej dla myszy traktowanych solanką. To odkrycie nie było szczególnym dla myszy 129 czystej rasy, ponieważ podobne wyniki otrzymano dla potomków po skrzyżowaniu 129 z C57B1/6. Te nieoczekiwane wyniki wskazały, że ekspresja integryny ανβ6 jest konieczna do indukowania zwłóknienia płuc.

W celu określenia roli ανβ6 we wczesnych stadiach zwłóknienia indukowanego bleomycyną, zbadaliśmy zawartość wody płucnej, markera obrzęku płucnego, będącej wynikiem zwiększonej przepuszczalności naczyniowej, 1, 5 i 15 dnia po podaniu bleomycyny lub solanki. U myszy typu ulicznego woda płucna zwiększała się do maksimum przez 5 dni i pozostawała zwiększona do 15 dni po podaniu bleomycyny (fig. 2). Jak i przed zwłóknieniem płuc, myszy β6-/- były w większości zabezpieczone przed tym wczesnym efektem bleomycyny, co dowodziło roli nabłonkowego ανβ6 przed rozwinięciem przecieku naczyniowego indukowanego bleomycyną.

Uprzednio podaliśmy, że myszy β6-/- wykazują nadmierne reakcje zapalne komórek monojądrowych na skórze i w drogach oddechowych (Huang, X.Z., et al., J. Cell Biol., 133: 921-928 (1996)). Indukowany bleomycyną uraz płuc i zwłóknienie płuc są powiązane i mogą zależeć od gromadzenia się i aktywacji limfocytów (Schrier, D.J., et al., Am. J. Pathol., 116: 270-278 (1984)). W celu określenia, czy odporność myszy β6-/- na uraz indukowany bleomycyną i zwłóknienie płuc jest wynikiem zmiany w gromadzeniu lub aktywacji limfocytów, zliczyliś my limfocyty CD4+ i CD8+ i oceniliś my aktywację limfocytów poprzez pomiar ekspresji receptora interleukiny-2 (CD25) w komórkach otrzymanych z rozdrobnionych pł uc myszy traktowanych solanką lub bleomycyną 5 i 15 dnia po podaniu. Zgodnie z naszym uprzednim doniesieniem więcej komórek CD4+, CD8+ i CD25+ było w płucach myszy β6-/niż zwierząt typu ulicznego. Bleomycyną indukuje olbrzymi przyrost ilości limfocytów ujawniających CD4 i CD8 i znaczący przyrost procentowego udziału limfocytów ujawniających CD25 (fig. 3), zarówno u myszy ulicznego typu jak i β 6-/-. Zarówno u myszy ulicznego typu jak i β 6-/- gromadzenie i aktywacja limfocytów w płucach były maksymalne w 5 dni po podaniu bleomycyny i zaczynały ustępować dnia 15. Nie ograniczając się do żadnej teorii, dane te sugerują, że brak gromadzenia lub aktywacji limfocytów u myszy β6-/- prawdopodobnie nie jest efektem, w wyniku którego są one chronione przed działaniem bleomycyny uszkadzającym płuca.

Oddziaływanie integryn z ich matrycowymi ligandami pośredniczy w szeregu ważnych funkcjach komórkowych, łącznie z proliferacją (Agrez, M., et al., J. Cell Blol., 127: 547-556 (1994)), przetrwaniem (Lukacs, N.W., et al., Eur. J. Immunol., 25: 245-251 (1995)) i ekspresją cytokin (Miyake, S., et al., J. Exp. Med., 177: 863-868 (1993)) i metaloproteinaz (Werb, Z., et al., J. Cell. Biol., 109: 877-889 (1989)). Podjednostka β6, jak doniesiono, tworzy pojedynczy heterodimer integryny, ανβ6 i jest ograniczona do komórek nabłonka. Równolegle z szybkim indukowaniem ekspresji ανβ6 w następstwie urazu nabłonka, lokalne stężenia co najmniej dwóch ligandów tej integryny (fibronektyny i tenascyny) zwiększają się. Uprzednio podaliśmy, że ekspresja ανβ6 odgrywa rolę w terminacji reakcji zapalnych komórek monojądrowych skóry i dróg oddechowych płuc (Huang, X.Z., et al., J. Cell. Biol., 133: 921928 (1996)). Wyniki tutaj podane wskazują, że ta integryna również odgrywa krytyczną rolę w indukowaniu urazu płuc i zwłóknienia płuc w reakcji na bleomycynę.

Komórki nabłonka oddechowego przez długi czas były uważane za składniki biernej bariery, oddzielającej inne komórki płuc od potencjalnie toksycznych składników wdychanego powietrza. Jednakże, na tej powierzchni rozdzielającej komórki są właściwie umiejscowione do inicjowania i pośredniczenia w lokalnych reakcjach na uraz. Ostatnie dowody sugerują, że komórki nabłonka oddechowego mają zdolność do syntetyzowania i wydzielania licznych protein, które mogą inicjować i pośredniczyć w reakcjach na uraz, łącznie z chemokinami (np. interleukina-8, GROa, GROy, RANTES, GMCSF, MlP-1a i MCP-1), innymi cytokinami (np. IL-6, IL-11 i IL-15) oraz czynnikami wzrostu (np. TGFe).

Nie ograniczając się do żadnej teorii, jednym możliwym mechanizmem według którego ανβ6 może uczestniczyć w rozwoju urazu płuc i zwłóknienia płuc, jest pośredniczenie w ekspresji jednej lub więcej z tych protein.

Obecne terapie przy zwłóknieniu płuc są na ogół niewłaściwe. Wyniki obecnego badania wskazują, że komórki nabłonka oddechowego i nabłonkowe integryny ανβ6 odgrywają istotną rolę w patogenezie miąższowego urazu płuc i zwłóknieniu płuc, i że terapie specyficznie wyznaczone do oddziaływania z funkcjonowaniem tej integryny są użyteczne w leczeniu tych na ogół nieuleczalnych chorób płuc.

PL 201 716 B1

III. Wytwarzanie przeciwciała blokującego

A. Wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego

W celu wytworzenia przeciwciał przeciw ανβ6, myszy β6-/- immunizowano zarówno keratynocytami otrzymanymi z myszy typu ulicznego lub rekombinacyjnym wydzielonym ludzkim ανβ6 (Weinacker, et al., J. Biol. Chem., 269: 6940-6948 (1994)) w adiuwancie Freunda. Zebrano limfocyty śledzionowe myszy i łączono z komórkami szpiczaka zgodnie ze standardowymi procedurami. Komórki SW

480 e6-trasfekowane i szablonem użyto do skriningu supernatantu z użyciem cytometrii przepływowej. Przeciwciała, które rozpoznawały komórki SW480 e6-transfekowane, ale nie rozpoznawały transfekowanych szablonem były używane w dalszych eksperymentach.

B. Charakterystyka przeciwciał monoklonalnych

W celu wytworzenia przeciwciał przeciw mysiemu ανβ6, użyto wydzielonego ludzkiego ανβ6 i mysich keratynocytów jako immunogenów u myszy β6-/- pochodzenia 129/C57. Supernatanty z wygenerowanych hybrydom poddano skriningowi co do różnicującego wybarwiania dla komórek SW480 transfekowanych szablonem i β6. Uzyskane przeciwciała CSe6 i 10D5 wybarwiały zarówno ludzki β6 ujawniany na komórkach SW480 i mysi β6 na keratynocytach typu ulicznego. CSe6 był dalej charakteryzowany poprzez immunoprecypitację mysiego lizatu keratynocytowego znaczonego (³⁵S). To przeciwciało wytrąca heterodimery o odpowiedniej masie cząsteczkowej, będące ανβ6, z keratynocytów β6+/+, ale nie z keratynocytów β6-/-, wskazując, że te przeciwciała są specyficzne dla integryny ανβ6.

Zbadaliśmy również Cse6 i 10D5 pod względem aktywności blokowania poprzez przeprowadzenie oznaczeń adhezji komórek z komórkami SW480 e6-transfekowanymi i mysimi keratynocytami na fibronektynie. Jednakże, tylko 10D5 wykazywał aktywność blokowania na mysich komórkach. 10d5 inhibitował migrację keratynocytów typu ulicznego na fibronektynie w tym samym stopniu, co obserwowany dla β6-/- keratynocytów.

C. Oznaczenie adhezji komórkowej

96-studzienkowe polistyrenowe płytki mikromiareczkowe do hodowli nie-tkankowych (Linbro/Titerek, Flow Laboratories, McLean, VA) powleczono witronektyną, fibronektyną lub kolagenem. 100 μl roztworu zawierającego różne ilości matrycy dodano do studzienek i inkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Po inkubowaniu, studzienki spłukano PBS, następnie blokowano 1% BSA w pozbawionym surowicy DMEM w 37°C przez 30 minut. Studzienki kontrolne napełniono 1% BSA w DMEM. Komórki zebrano tak, jak przy oznaczeniu migracji i zawieszono ponownie w pozbawionym surowicy KGM, a następnie dodano do każdej powleczonej proteiną studzienki w obecności lub w nieobecności PMA. Do eksperymentów blokowania komórki inkubowano z przeciwciałami przez 5 minut w 4°C przed wyłożeniem na płytki. Płytki wirowano (wierzchem do góry), przy 10 x g przez 5 minut, a następnie inkubowano przez 1 godzinę w 34°C w wilgotnym 7% CO2. Komórki nie przylegające oddzielono przez wirowanie wierzchem na dół, przy 48 x g przez 5 minut. Komórki przylegające utrwalono 1% formaldehydem i wybarwiono 0,5% fioletem krystalicznym, a następnie studzienki spłukano PBS. Względna liczba komórek w każdej studzience została oceniona poprzez pomiar absorbancji przy 595 nm czytnikiem płytek (Microplate Reader, Bio-Rad).

D. Oznaczenie migracji

Oznaczenie migracji komórek przeprowadzono na płytkach ze studzienkami porowatymi powleczonych matrycą (pory 8 μm, Costar, Cambridge, MA). Spodnią powierzchnię membrany powleczono kolagenem (10 μg/ml), fibronektyną (10 μg/ml) lub witronektyną (10 μg/ml) w PBS na 1 godzinę w 37°C i blokowano 1% BSA. Pierwotne, hodowane keratynocyty zebrano trypsyną/EDTA i trypsynę dezaktywowano sojowym inhibitoren trypsyny. Komórki zawieszono w pozbawionym surowicy KGM i rozłożono na płytkach w górnej komorze z gęstością 3,6 x 10⁴/studzienka w 100 μl środowiska, w obecności lub w nieobecności octanu mirystylu (PMA, 10 ng/ml). W eksperymentach inhibitowania, przeciwciała dodano do górnej i dolnej komory w obecności PMA. Po 6 godzinach inkubowania komórki utrwalono 2% formaldehydem i wybarwiono 0,5% fioletem krystalicznym w 1% formaldehydzie. Komórki z górnej komory usunięto, a komórki na spodniej powierzchni zliczono przy użyciu siatki 10x i silnego powiększenia (40x). Pola wielokrotne zliczono i uśredniono dla każdych badanych warunków.

IV. Myszy pozbawione β6 wykazują obniżoną zapadalność na przerzuty płucne.

Linia myszy transgenicznych, która spontanicznie rozwija raka piersi z przerzutami (myszy MMTV-mTAg) została skrzyżowana wsobnie z myszami pozbawionymi beta-6. Potomstwo myszy pozbawione β6 rozwijało szybko wzrastający pierwotny nowotwór sutka, ale wykazywało znacznie obniżoną zapadalność i rozszerzanie się przerzutów płucnych w porównaniu z wylęgiem, który ujawniał β6.

PL 201 716 B1

Immunohistochemia wykazywała, że β6 jest silnie ujawniany wokół brzegów przerzutowych zmian chorobowych. Sugeruje to, że β6 jest potrzebne do zmaksymalizowania przerzutów w tym modelu.

Ponieważ myszy pozbawione β6 mają przewlekłe zapalenie płuc, jest możliwe, że ograniczenie przerzutów wynika z występowania stanu zapalnego płuc oddziaływującego z rozwojem przerzutów. Przeprowadzono dwa eksperymenty w celu wyjaśnienia tego problemu:

1. Linia komórkowa ujawniająca β6 pochodząca od pierwotnego nowotworu została wstrzyknięta myszom syngenicznym, które były zarówno ulicznego typu lub pozbawione β6. Przerzuty płucne szybko pojawiły się w obu grupach myszy, sugerując, że występowanie stanu zapalnego u myszy pozbawionych β6 nie oddziaływuje z rozwojem komórek nowotworowych w płucach.

2. Linie komórkowe pochodzące z nowotworów myszy zarówno pozbawionych β6 lub typu ulicznego wstrzyknięto syngenicznym myszom typu ulicznego. Linie komórkowe typu ulicznego niezmiennie prowadziły do nowotworu płuc, podczas gdy linie komórkowe pozbawione β6 nie. Eksperyment ten sugeruje, że komórka nowotworowa β6 jest konieczna do zmaksymalizowania przerzutów w tym układzie.

Wszystkie odnośniki (obejmujące książki, artykuły, publikacje, opisy patentowe i zgłoszenia patentowe) tu cytowane są w całości niniejszym dołączone.

Aczkolwiek wynalazek został ujawniony w połączeniu z jego konkretnymi praktycznymi realizacjami, jest zrozumiałe, że możliwe są dalsze modyfikacje i obecne zgłoszenie obejmuje jakiekolwiek odmiany, zastosowania lub adaptacje wynalazku naśladujące jego podstawowe zasady, i obejmuje takie odejścia od obecnego wynalazku, jakie wynikają ze znanej lub typowej praktyki w dziedzinie, której wynalazek dotyczy, i jakie mogą mieć zastosowanie do zasadniczych cech powyżej przytoczonych oraz jakie mieszczą się w zakresie wynalazku i w granicach załączonych zastrzeżeń patentowych.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie przeciwciała, które specyficznie wiąże się do integryny ανβ6 i blokuje wiązanie ligandu do integryny avp6 do wytwarzania leku do leczenia zwłóknienia wątroby u pacjenta.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że przeciwciało podaje się terapeutycznie.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że przeciwciało podaje się profilaktycznie.