PL201978B1

PL201978B1 - Novel salts of halogenethylguanines as inhibitors of viruses of Flaviviridae family as well as therapeutic agents exhibiting antiviral properties

Info

Publication number: PL201978B1
Application number: PL346996A
Authority: PL
Inventors: Peter Borowski; Maria Bretner; Krzysztof Felczak; Tadeusz Kulikowski; Herbert Schmitz
Original assignee: Inst Biochemii I Biofizyki Pan
Priority date: 2001-04-09
Filing date: 2001-04-09
Publication date: 2009-05-29
Also published as: PL346996A1

Abstract

1. Nowe sole halogenoetyloguanin jako inhibitory wirusów z rodziny Flaviviridae będące solami litowcowymi 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza atom chloru, bromu lub jodu, a M+ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy.1. New halogenoethylguanine salts as inhibitors of viruses from the Flaviviridae family, which are alkali metal salts of 7- and 9-halogenoethylguanines of general formulas 1a and 1b, in which R is a chlorine, bromine or iodine atom, and M+ is a sodium, potassium or lithium cation.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku są nowe sole halogenoetyloguanin, będące solami litowcowymi 7-halogenoetyloguanin o wzorze ogólnym 1a, w którym R oznacza chlor, brom lub jod, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy oraz sole litowcowe 9-halogenoetyloguanin o wzorze ogólnym 1b, w którym R oznacza chlor, brom lub jod, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy, wykazujące aktywność przeciwko wirusom RNA(+) z rodziny Flaviviridae.The present invention relates to new haloethylguanine alkylene salts of the general formula 1a, in which R is chlorine, bromine or iodine and M ⁺ is a sodium, potassium or lithium cation and 9-haloethylguanine alkali metal salts of general formula 1b, wherein R is chlorine, bromine or iodine and M ⁺ is a sodium, potassium or lithium cation with activity against RNA (+) viruses from the Flaviviridae family.

Przedmiotem wynalazku są również środki lecznicze zawierające znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze, które jako składniki czynne zawierają sole litowcowe halogenoetyloguanin o wzorze ogólnym 1a lub 1b, w którym R oznacza chlor, brom lub jod, a M⁺oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy, wykazujące aktywność przeciwko wirusom RNA(+) z rodziny Flaviviridae.The invention also relates to medicaments containing known, pharmaceutically acceptable carriers and auxiliaries, the active ingredients of which contain halogenoethylguanine alkali salts of general formula 1a or 1b, in which R is chlorine, bromine or iodine and M ⁺ is a sodium, potassium or lithium, showing activity against RNA (+) viruses from the Flaviviridae family.

Związki będące przedmiotem wynalazku mają w szczególności właściwości inhibitorowe w stosunku do wirusów RNA(+) z rodziny Flaviviridae, będące rezultatem aktywacji RNA helikazy wirusów Flaviviridae, takich jak wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus Zachodniego Nilu (WNV), wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE) i wirus dengi (DEN).The compounds of the invention have, in particular, inhibitory properties against RNA (+) viruses of the Flaviviridae family as a result of RNA activation of Flaviviridae helicase viruses such as hepatitis C virus (HCV), West Nile virus (WNV), Japanese hepatitis virus brain disease (JE) and dengue virus (DEN).

Stan wiedzyState of the art

W dotychczasowym stanie wiedzy znane są tylko następujące halogenoalkilopochodne guaniny: 7-chloroetyloguanina (Piper i wsp., J. Med. Chem. 1980, 23, 357-364, Parker i wsp., Blochem. Biophys. Res. Commun. 1986, 139. 31-36: Ramzaeva i wsp., Synth. Commun. 1989, 19, 3121-3128).In the prior art, only the following haloalkyl guanines are known: 7-chloroethylguanine (Piper et al., J. Med. Chem. 1980, 23, 357-364, Parker et al., Blochem. Biophys. Res. Commun. 1986, 139 31-36: Ramzaeva et al., Synth. Commun. 1989, 19, 3121-3128).

Związki te były znane i stosowane jedynie jako inhibitory fosforybozylotransferazy hypoksantynowo-guaninowej (Piper i wsp., J. Med. Chem. 1980, 23, 357-364).These compounds have been known and used only as inhibitors of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Piper et al., J. Med. Chem. 1980, 23, 357-364).

Nie są dotychczas znane ich właściwości lecznicze i biomedyczne.Their healing and biomedical properties are as yet unknown.

Związki te ponadto są nierozpuszczalne w wodzie, co w poważnym stopniu utrudnia ich zastosowanie jako leków, szczególnie przy podawaniu dożylnym i dootrzewnowym.Moreover, these compounds are insoluble in water, which seriously complicates their use as medicaments, especially when administered intravenously and intraperitoneally.

Nieoczekiwanie okazało się, że 9-chloroetyloguanina oraz 7-chloroetyloguanina zwiększają aktywność RNA helikazy od 220% do 850% przy stężeniu odpowiednio 250 μΜ i 200 μΜ oraz ED₅₀150 pM i 120 pM.Surprisingly, it was found that 9-chloroethylguanine and 7-chloroethylguanine increased the RNA activity of the helicase from 220% to 850% at a concentration of 250 µΜ and 200 µΜ, respectively, and an ED _{50 of} 150 µM and 120 µM.

Okazało się również, że związki zwiększające aktywność rozwijającą helikazy należące do 7i 9-chloroetylo pochodnych guaniny wiążą się do allosterycznego miejsca regulacyjnego enzymu wywołując zmianę jego konformacji i jego rozwinięcie, co z kolei zwiększa dostępność substratu DNA/RNA do miejsc katalitycznych i powoduje przekształcenie dwuniciowego DNA lub RNA do jednoniciowych struktur.It also turned out that compounds increasing the activity of developing helicases belonging to 7 and 9-chloroethyl derivatives of guanine bind to the allosteric regulatory site of the enzyme, causing a change in its conformation and its unfolding, which in turn increases the availability of the DNA / RNA substrate to catalytic sites and transforms double-stranded DNA or RNA for single-stranded structures.

Związki powyższe nie zwiększają szybkości hydrolizy ATP, ani nie zmieniają powinowactwa enzymu do ATP i mogą być stosowane w kombinacji z modulatorami aktywności NTPazy/helikazy działającymi przez bezpośrednie oddziaływanie z miejscem wiążącym ATP lub RNA. Związki według wynalazku są to nieznane do tej pory sole 7- i 9-halogenoetyloguanin o selektywnym działaniu przeciwko wirusom z rodziny Flaviviridae.The above compounds do not increase the rate of ATP hydrolysis, nor change the affinity of the enzyme for ATP, and can be used in combination with modulators of NTPase / helicase activity acting by direct interaction with an ATP or RNA binding site. The compounds according to the invention are hitherto unknown 7- and 9-haloethylguanine salts with selective action against viruses of the Flaviviridae family.

Istotą wynalazku są nowe, rozpuszczalne w wodzie sole 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza chlor, brom lub jod, a Μ⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy.The subject of the invention is the new, water-soluble 7- and 9-haloethylguanine salts of general formulas 1a and 1b, in which R is chlorine, bromine or iodine, and Μ ⁺ is a sodium, potassium or lithium cation.

Związki te wykazują selektywną aktywność przeciwko wirusom z rodziny Flaviviridae opartą na mechanizmie aktywacji wirusowej RNA helikazy.These compounds show selective activity against viruses from the Flaviviridae family based on the mechanism of viral RNA helicase activation.

Ogólna metoda otrzymywania soli litowcowych 7- i 9-halogenoetyloguanin polega na tym, że 7- lub 9-halogenoetyloguaninę dodaje się mieszając do roztworu odpowiedniego wodorotlenku litowcowego (sodowego, potasowego lub litowego). Resztki nie rozpuszczonego osadu odsącza, przesącz zatęża w niskiej temperaturze, korzystnie od 0-10°C, pod próżnią od 0,01 mm Hg do 0,1 mm Hg do sucha i suszy, korzystnie nad pięciotlenkiem fosforu, pod próżnią, w wysokiej temperaturze od 120 do 140°C.The general method for the preparation of the 7- and 9-haloethylguanine alkali metal salts is that the 7- or 9-haloethylguanine is added to a solution of the appropriate alkali metal hydroxide (sodium, potassium or lithium) under stirring. The residual undissolved precipitate is filtered off, the filtrate is concentrated at low temperature, preferably 0-10 ° C, under a vacuum of 0.01 mm Hg to 0.1 mm Hg, until dry and dried, preferably over phosphorus pentoxide, under vacuum, at high temperature from 120 to 140 ° C.

Otrzymane sole posiadają widma UV i NMR podobne do widm ich macierzystych zasad.The resulting salts have UV and NMR spectra similar to those of their parent bases.

Środki lecznicze o działaniu przeciwko wirusom Flaviviridae według wynalazku, zawierające znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i/lub środki pomocnicze charakteryzują się tym, że jako składniki czynne zawierają sole litowcowe 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach ogólnych 1a i 1b, w których R oznacza atom chloru, bromu lub jodu, a Μ⁺ oznacza kation sodowy, potasowy lub litowy.The medicaments with activity against Flaviviridae viruses according to the invention, containing known pharmaceutically acceptable carriers and / or auxiliaries, are characterized in that the active ingredients contain the 7- and 9-haloethyl guanine alkali metal salts of the general formulas 1a and 1b, in which R is chlorine, bromine or iodine and Μ ⁺ represents a sodium, potassium or lithium cation.

W szczególnie korzystnej wersji środek leczniczy według wynalazku zawiera jako substancję czynną sól sodowa 7-chloroetyloguaniny.In a particularly preferred embodiment, the medicament according to the invention comprises 7-chloroethylguanine sodium as active ingredient.

PL 201 978 B1PL 201 978 B1

Według niniejszego zgłoszenia przy zastosowaniu środków leczniczych, tj. soli litowcowych halogenoetyloguanin, nie obserwuje się żadnego znamiennego działania cytotoksycznego przy stężeniu większym od 300 μΜ przy silnym efekcie wirostatycznym (IC₅₀ 7-120 μg/ml) w komórkach Vero E6, natomiast zwiększa się rozpuszczalność w wodzie.According to the present application, no significant cytotoxic effect is observed with the use of therapeutic agents, i.e. haloethylguanine alkali metal salts at concentrations greater than 300 μΜ with a strong virostatic effect (IC ₅₀ 7-120 μg / ml) in Vero E6 cells, while the solubility increases in the water.

Środki lecznicze według wynalazku mają postać typowych preparatów farmaceutycznych, sporządzonych zgodnie z ogólnie przyjętymi technikami farmaceutycznymi, z użyciem znanych nośników i substancji pomocniczych. Postać preparatów jest dobierana zależnie od drogi podawania: preparaty mogą być stosowane w postaci przeznaczonej do wstrzykiwań, zwłaszcza do wstrzykiwań dożylnych i dootrzewnowych lub w postaci przeznaczonej do podawania doustnego, np. roztworów, emulsji, tabletek, tabletek powlekanych, tabletek dojelitowych oraz kapsułek.The medicaments according to the invention are in the form of conventional pharmaceutical preparations, prepared according to generally accepted pharmaceutical techniques with the use of known carriers and auxiliary substances. The form of the preparations is selected depending on the route of administration: the preparations can be used in the form intended for injection, especially for intravenous and intraperitoneal injection, or in the form intended for oral administration, e.g. solutions, emulsions, tablets, coated tablets, gastro-resistant tablets and capsules.

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące wynalazek, nie ograniczające jego zakresu.The following are non-limiting examples illustrating the invention.

P r z y k ł a d I. Otrzymywanie soli litowcowych 7-halogenoetyloguaninExample I. Preparation of 7-haloethylguanine alkali metal salts

7-halogenoetyloguaninę dodano do równoważnej ilości 1N roztworu odpowiedniego wodorotlenku litowego, mieszano 1 h, resztki nierozpuszczonego osadu odsączono, przesącz zatężono w temperaturze 5°C, pod próżnią 0,01 mm Hg do sucha i suszono nad pięciotlenkiem fosforu, pod próżnią, w temperaturze 120°C.7-haloethylguanine was added to an equivalent amount of a 1N solution of the appropriate lithium hydroxide, stirred for 1 h, any undissolved solids were filtered off, the filtrate was concentrated at 5 ° C, under 0.01 mm Hg vacuum to dryness and dried over phosphorus pentoxide under vacuum at 120 ° C.

Otrzymane sole posiadały widma UV i NMR podobne do widm ich macierzystych zasad.The resulting salts had UV and NMR spectra similar to those of their parent bases.

P r z y k ł a d II. Otrzymywanie soli litowcowych 9-halogenoetyloguaninP r z x l a d II. Preparation of 9-haloethylguanine alkali metal salts

9-halogenoetyloguaninę dodano do równoważnej ilości 1N roztworu odpowiedniego wodorotlenku sodowego, mieszano 1,5 h, resztki nie rozpuszczonego osadu odsączono, przesącz zatężono w temperaturze 10°C, pod próżnią 0,01 mm Hg do sucha i suszono nad pięciotlenkiem fosforu, pod próżnią, w temperaturze 140°C.9-haloethylguanine was added to an equivalent amount of 1N corresponding sodium hydroxide solution, stirred 1.5 h, residual undissolved precipitate was filtered off, the filtrate was concentrated at 10 ° C, under a vacuum of 0.01 mm Hg to dryness and dried over phosphorus pentoxide under vacuum. at 140 ° C.

P r z y k ł a d III. Oznaczanie aktywności przeciwwirusowejP r x l a d III. Determination of antiviral activity

Badanie będącej przedmiotem wynalazku aktywności przeciwwirusowej (ED50) prowadzi się stosując wirus WNV (ATCC, szczep VR-82) oraz komórki Vero E6. Komórki hoduje się na 24-miejscowych płytkach i poddaje działaniu różnych stężeń 7- i 9-halogenoetyloguanin o wzorach 1 i 2, w których R oznacza chlor, brom, jod, a M⁺ oznacza kation sodowy, potasowy i litowy, rozpuszczonych w medium. Roztwór podstawowy otrzymuje się przez ich rozpuszczenie w sulfotlenku dimetylowym, wodzie lub mieszaninie woda-sulfotlenek dimetylowy.Testing of the antiviral activity (ED50) of the invention is carried out using WNV virus (ATCC, strain VR-82) and Vero E6 cells. Cells are grown in 24-site plates and exposed to varying concentrations of 7- and 9-haloethylguanine of Formulas 1 and 2, wherein R is chlorine, bromine, iodine and M ⁺ is sodium, potassium and lithium cations dissolved in the medium. The stock solution is obtained by dissolving them in dimethyl sulfoxide, water or a water-dimethyl sulfoxide mixture.

Komórki Vero E6 hoduje się w medium RPMI-1640 zawierającym 10% cielęcej surowicy płodowej (Gibco), 100: g/ml ampicyliny i 80: g/ml gentamycyny. Komórki w logarytmicznej fazie wzrostu zakażono wirusem WNV (ATCC szczep VR-82) jak to uprzednio opisano (Wengler i wsp., Virology 1990, 177, 795-801).Vero E6 cells are grown in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum (Gibco), 100: g / ml ampicillin and 80: g / ml gentamicin. Cells in log phase growth were infected with WNV (ATCC strain VR-82) as previously described (Wengler et al., Virology 1990, 177, 795-801).

W celu oznaczenia aktywności przeciwwirusowej badanych związków 5 x 105 komórek zawiesza się w 1 mi medium RPMI-1640 i osadza w 24-miejscowej płytce hodowlanej, inkubuje przez 24 h i dodaje do kompletnego medium. W celu zakażenia komórek dodaje się wirusowe inoculum w medium i adsorbuje przez 3 h w 37°C. Następnie inoculum usuwa się przemywając komórki dwukrotnie przy użyciu medium i dodatkowo inkubuje przez 2 dni w obecności wyżej wymienionych związków, w warunkach wyżej opisanych.To determine the antiviral activity of test compounds, 5x10 5 cells are resuspended in 1 ml of RPMI-1640 medium and plated in a 24-place culture plate, incubated for 24 h and added to complete medium. For cell infection, viral inoculum is added to the medium and adsorbed for 3 h at 37 ° C. The inoculum is then removed by washing the cells twice with medium and additionally incubated for 2 days in the presence of the above-mentioned compounds under the conditions described above.

Kinetykę replikacji wirusów mierzy się przy użyciu ilościowego oznaczania RNA wirusa WNV, jak podano poniżej.The viral replication kinetics are measured using WNV RNA quantification as outlined below.

Ilościowe oznaczenie wirusowego RNAQuantification of viral RNA

Medium z płytek usuwa się, jednokomórkowe warstwy przemywa się świeżym medium, a preparatykę RNA prowadzi stosując „RNeasy RNA preparation kit” (Qiagen) wg procedury zalecanej przez producenta. Wirusowy RNA jest ilościowo oznaczany drogą obserwacji rzeczywistego czasu działania 5'-nukleazy w układzie RT-PCR.The medium from the plates is removed, the unicellular layers are washed with fresh medium, and the RNA preparation is carried out using the "RNeasy RNA preparation kit" (Qiagen) according to the manufacturer's recommended procedure. Viral RNA is quantified by observing the actual 5'-nuclease runtime in an RT-PCR system.

Do amplifikacji fragmentu 151 par zasad w rejonie NS3 wirusa WNV stosuje się primery Wn S1 (5'-TGC TGA TAT GAT TGA CCC TTT TCA -3') i Wn AS1(5'-AGT GTA AGT AAT GCC TCC AAAThe primers Wn S1 (5'-TGC TGA TAT GAT TGA CCC TTT TCA -3 ') and Wn AS1 (5'-AGT GTA AGT AAT GCC TCC AAA are used to amplify the 151 bp fragment in the NS3 region of the WNV virus).

CAA-3').CAA-3 ').

Produkty PCR oznacza się przy użyciu próbki WnP1 (5'-TTC GCA AGA GGT GGA CAG CCA-3'). Koniec 3' próbki znakuje się przy użyciu TAMRA (6-karboksylo-N,N,N',N'-tetrametylorodamina) i fosforyluje, żeby zapobiec elongacji podczas PCR. Koniec 5' próbki znakuje się FAM (6-karboksylofluoresceina). RT-PCR przeprowadza się stosując „Platinum RT-PCR ThermoScript One-Step System” (Life Technologies) zalecany przez producenta.PCR products are determined using a WnP1 sample (5'-TTC GCA AGA GGT GGA CAG CCA-3 '). The 3 'end of the sample is labeled with TAMRA (6-carboxyl-N, N, N', N'-tetramethylrhodamine) and phosphorylated to prevent elongation during PCR. The 5 'end of the sample is labeled with FAM (6-carboxylfluorescein). RT-PCR is performed using the "Platinum RT-PCR ThermoScript One-Step System" (Life Technologies) recommended by the manufacturer.

PL 201 978 B1PL 201 978 B1

Mieszanina reakcyjna zawiera 280 nanomoli primerów WnS1 i WnAS1, 140 nanomoli próbkiThe reaction mixture contains 280 nanomoles of WnS1 and WnAS1 primers, 140 nanomoles of sample

WnP1 i 40 μg/ml BSA w 20 μΐ buforu używanego do reakcji.WnP1 and 40 µg / ml BSA in 20 µΐ reaction buffer.

Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,8 μl „ThermoScript Reverse Transcriptase/Platinum Tag enzyme mix” i 2 μl otrzymanego roztworu RNA. Obróbkę termiczną przeprowadza się w aparacie „Light Cycer TM” (Roche Molecular Biochemicals). Obejmuje ona odwrotną transkrypcję w 50°C przez 20 min, denaturację w 95°C przez 5 min oraz 45 cykli w 95°C przez 5 s i w 60°C przez 20 s (Wittner i wsp., Biotechnigue, 1977, 22, 176-181). Podczas przebiegu PCR próbkę WnP1 trawi się dzięki aktywności 5'-nukleolitycznej Tag DNA polimerazy, specyficznie przyłączającej się do nagromadzonego produktu PCR z udziałem wirusa WNV (Holland i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 7276-7280). Trawienie próbki uwalnia FAM z barwnika TAMRA powodując wzrost specyficznej dla FAM fluorescencji w procesie PCR (Litvak i wsp., PCR Methods and Applications 1995, 4, 357-362). Fluorescencję FAM mierzy się w kanale detekcyjnym F1 (530 nm) i dzieli przez wartość fluorescencji zmierzonej w kanale F2 (640 nm). W celu uzyskania standardu dla realno-czasowego PCR przed preparatyką RNA silnie pozytywny roztwór podstawowy wirusa rozcieńcza się negatywnym lizatem komórkowym. Ilość wirusowego RNA w jednej jednostce PCR jest określana jako najmniejsze możliwe rozcieńczenie, które może być amplifikowane w pięciu na pięć replikacyjnych reakcji. Procedura ilościowego oznaczania wirusowego RNA została uprzednio opisana (De Silva i wsp., Biochemica 1998, 2, 12-15.)0.8 µl of "ThermoScript Reverse Transcriptase / Platinum Tag enzyme mix" and 2 µl of the obtained RNA solution are added to the reaction mixture. The thermal treatment is carried out in a "Light Cycer TM" apparatus (Roche Molecular Biochemicals). It includes reverse transcription at 50 ° C for 20 min, denaturation at 95 ° C for 5 min, and 45 cycles at 95 ° C for 5 sec and 60 ° C for 20 sec (Wittner et al., Biotechnigue, 1977, 22, 176- 181). During the PCR run, the WnP1 sample is digested by the 5'-nucleolytic activity of Tag DNA polymerase that specifically binds to the accumulated WNV-mediated PCR product (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 7276-7280) . Sample digestion releases FAM from the TAMRA dye causing an increase in FAM-specific fluorescence in the PCR process (Litvak et al., PCR Methods and Applications 1995, 4, 357-362). The FAM fluorescence is measured in the F1 detection channel (530 nm) and divided by the value of fluorescence measured in the F2 channel (640 nm). The high positive virus stock is diluted with negative cell lysate prior to RNA preparation to obtain a real-time PCR standard. The amount of viral RNA in one PCR unit is defined as the lowest possible dilution that can be amplified in five out of five replication reactions. The procedure for quantifying viral RNA has been previously described (De Silva et al., Biochemica 1998, 2, 12-15.)

P r z y k ł a d IV. Preparat soli sodowej 7-chiloroetyloguaniny w postaci proszku do przygotowywania roztworów do wstrzykiwańP r x l a d IV. Preparation of 7-chiloroethylguanine sodium in the form of a powder for the preparation of injection solutions

Sól sodową 7-chloroetyloguaniny rozciera się w moździerzu lub młynie kulowym do drobnokrystalicznego proszku, który z kolei rozpuszcza się w apyrogennej wodzie redestylowanej mieszając i ogrzewając w taki sposób, żeby uzyskać roztwór o stężeniu 5 mg/ml.7-Chloroethylguanine sodium salt is ground in a mortar or ball mill to a fine crystalline powder, which in turn is dissolved in apyrogenic redistilled water while stirring and heating to obtain a 5 mg / ml solution.

Claims

Patent claims

1. New halogenoethylguanine salts as inhibitors of viruses from the Flaviviridae family, 7- and 9-halogenoethylguanine alkali salts of general formulas 1a and 1b, in which R represents a chlorine, bromine or iodine atom, and M ⁺ represents a sodium, potassium or lithium cation.

2. Anti-viral medicaments, in particular against viruses of the Flaviviridae family, containing known, pharmaceutically acceptable carriers and / or adjuvants, characterized in that the active ingredients contain 7- and 9-halogenethylguanine alkali salts of general formulas 1a and 1b, where R is chlorine, bromine or iodine and M ⁺ is sodium, potassium or lithium.

3. Agents according to p. 8. A composition according to claim 2, characterized in that the active ingredient is 7-chloroethylguanine sodium.