PL202067B1 - Sposoby transformacji roślin oraz zastosowanie Agrobacterium w sposobie transformacji - Google Patents
Sposoby transformacji roślin oraz zastosowanie Agrobacterium w sposobie transformacjiInfo
- Publication number
- PL202067B1 PL202067B1 PL351895A PL35189500A PL202067B1 PL 202067 B1 PL202067 B1 PL 202067B1 PL 351895 A PL351895 A PL 351895A PL 35189500 A PL35189500 A PL 35189500A PL 202067 B1 PL202067 B1 PL 202067B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- plant
- agrobacterium
- target
- transformation method
- target tissue
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 79
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title description 48
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 104
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 63
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 162
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 31
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 30
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 25
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 25
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 22
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 15
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 9
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 8
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 8
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 8
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 7
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 claims description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 6
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 5
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 5
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 claims description 4
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 claims description 4
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 claims description 4
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims description 4
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 claims description 4
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 claims description 4
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000015094 jam Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 claims description 3
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 claims description 3
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000127993 Elaeis melanococca Species 0.000 claims description 2
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 claims description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 18
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 84
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 21
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 19
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 19
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 8
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 6
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 4
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 101150087998 Su-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 2
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- JMSVCTWVEWCHDZ-UHFFFAOYSA-N syringic acid Chemical compound COC1=CC(C(O)=O)=CC(OC)=C1O JMSVCTWVEWCHDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M (E)-Ferulic acid Natural products COC1=CC(\C=C\C([O-])=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 229910000906 Bronze Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100494773 Caenorhabditis elegans ctl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010049994 Chloroplast Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 description 1
- 101100112369 Fasciola hepatica Cat-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical compound CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100005271 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cat-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 101100121891 Pisum sativum SBEI gene Proteins 0.000 description 1
- 101100504555 Pisum sativum SBEII gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000702292 Tobacco yellow dwarf virus Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 229930003571 Vitamin B5 Natural products 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 101000662549 Zea mays Sucrose synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- VGPYEHKOIGNJKV-UHFFFAOYSA-N asulam Chemical compound COC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 VGPYEHKOIGNJKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000010974 bronze Substances 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N copper tin Chemical compound [Cu].[Sn] KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 125000005594 diketone group Chemical group 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N ferulic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N 0.000 description 1
- 229940114124 ferulic acid Drugs 0.000 description 1
- KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N ferulic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001785 ferulic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010050792 glutenin Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002545 isoxazoles Chemical class 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 229920001195 polyisoprene Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 230000008128 stamen development Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- YIBXWXOYFGZLRU-UHFFFAOYSA-N syringic aldehyde Natural products CC12CCC(C3(CCC(=O)C(C)(C)C3CC=3)C)C=3C1(C)CCC2C1COC(C)(C)C(O)C(O)C1 YIBXWXOYFGZLRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N trans-isoferulic acid Natural products COC1=CC=C(C=CC(O)=O)C=C1O QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N vanillin Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1O MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N vanillin Natural products COC1=CC(O)=CC(C=O)=C1 FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012141 vanillin Nutrition 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000009492 vitamin B5 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011675 vitamin B5 Substances 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy sposobu transformacji obejmuj acego inokulacj e i kokultywacj e docelowej tkanki z docelowej ro sliny z Agrobacterium w czasie gdy tkanka docelowa jest w swoim naturalnym srodowisku ro slinnym, a nast epnie wytworzenie ro sliny transgenicznej przez odró znicowanie i regene- racj e tkanki docelowej, w którym inokulacj e prowadzi si e przez bezpo srednie i aktywne podanie Agro- bacterium do tkanki. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sposoby transformacji roślin oraz zastosowanie Agrobacterium w sposobie transformacji.
Wynalazek dotyczy dziedziny transformacji roślin, w szczególności transformacji zbóż, szczególnie przy użyciu Agrobacterium tumefaciens lub dowolnego innego gatunku Agrobacterium (dalej określane jako „Agrobacterium”). Do niedawna możliwe było tylko stosowanie bezpośrednich metod transformacji do produkcji transgenicznych roślin zbóż. Bombardowanie z zastosowaniem strzelby cząsteczkowej jest najczęściej w tym celu stosowanym sposobem. Ostatnio w literaturze pokazały się doniesienia wykazujące, że niektóre ze zbóż mogą być modyfikowane genetycznie z zastosowaniem Agrobacterium (Hiei i wsp., Plant Mol. Biol. (1997) 35:205-218); Ishida i wsp., Nature Biotechnol. (1996) 14:745-750; Cheng i wsp., Plant Physiol. (1997) 115:971-980; Tingay i wsp., The Plant Journal 11:1369-1376 (1997)).
Wydajności transformacji podawane w literaturze wykazują szeroką zmienność dla różnych zbóż. Typowo podawano niskie wartości dla kukurydzy (Ishida 1996) dla systemu, który silnie zależy od genotypu. Dla ryżu także opisano niskie wydajności, a szczególnie niskie poziomy opisano dla pszenicy. W tych wszystkich systemach stosuje się Agrobacterium podawane in vitro, do wyizolowanej tkanki, która jest w trakcie odróżnicowywania lub jest już odróżnicowana.
Jak przedstawiono powyżej, opisane są systemy transformacji zbóż z udziałem Agrobacterium dla ryżu (Hiei, 1997), kukurydzy (Ishida, 1996), pszenicy (Cheng, 1997) i jęczmienia (Tingay, 1997). Wspólną cechą tych metod jest to, że eksplanty, korzystnie niedojrzałe zarodki lub pochodzące od nich embriogenne kalusy są izolowane z tkanki dawcy i zaszczepiane Agrobacterium in vitro.
Hess i współpracownicy (Plant Science 72: 233-244, (1990) podjęli próby transformacji pszenicy przez pipetowanie Agrobacterium na kłoski pszenicy. Celem autorów opisanym w tym doniesieniu było uzyskanie przenoszenia genów przez transformację pyłku i następnie odzyskanie transformowanych nasion po normalnym zapłodnieniu. Nie próbowano ani nie sugerowano usunięcia tkanki z zaszczepionego kłoska dla dalszej selekcji i regeneracji w hodowli.
Inni naukowcy opisali transformację kukurydzy i ryżu z udziałem Agrobacterium przez inokulację wierzchołków pędów (Gould J. (1991) Plant Physiol. 95:426-434; Park SH (1996) Plant Molecular Biology 32: 1135-1158). Tu również celem była transformacja linii płciowej i uzyskanie transformowanych nasion. Ten szlak regeneracji jest odrębny od stosowanego w sposobie według wynalazku. Faktycznie, określonym celem tych sposobów jest unikanie regeneracji roślin przechodzącego przez odróżnicowanie tkanki i przybyszową regenerację.
W publikacjach patentów US 5,177,010 i 5,187,073 (Goldman i wsp.) ujawnione są sposób transformacji kukurydzy i Graminaeae, odpowiednio, obejmujący zranienie nowo powstałych siewek i inokulację Agrobacterium. Ponownie, celem tego sposobu jest transformacja komórek linii płciowej w siewce, co nastę pnie prowadzi do powstania narzą dów rozrodczych w dojrzał ej roś linie i pozwala na odzyskanie transformowanego pyłku z rośliny.
Innym procesem, który był badany przez osoby próbujące rozwinąć transformację roślin jest agroinfekcja. Patent US 5,469,597 (Grimsley i wsp.) ujawnia sposób wprowadzania wirusowego DNA do roślin z użyciem Agrobacterium. Po inokulacji siewek kukurydzy z Agrobacterium, które do własnego DNA ma wstawione DNA z wirusa plamistości kukurydzy, twórcy zaobserwowali pojawianie się objawów choroby, wskazujące na proliferację wirusa w komórkach roślin. Agrobacterium działa więc jako nośnik do wprowadzania wirusowego DNA do rośliny, po czym wirus jest zdolny do powodowania zakażenia ogólnoustrojowego. Jednak nie ma dowodów, że agroinfekcja powoduje transformację roślin, tzn. przeniesienie wirusowego DNA do genomu rośliny. O ile w opisie patentu rozważa się transformację, to jest ona adresowana do tkanek merystematycznych aby uzyskać transformację komórek płciowych.
Wynalazek dotyczy sposobu transformacji obejmującego inokulację i kokultywację docelowej tkanki z docelowej rośliny z Agrobacterium, w czasie gdy tkanka docelowa jest w swoim naturalnym środowisku roślinnym, a następnie wytworzenie rośliny transgenicznej przez odróżnicowanie i regenerację tkanki docelowej, w którym inokulację prowadzi się przez bezpośrednie i aktywne podanie Agrobacterium do tkanki, korzystnie roślina transgeniczna jest rośliną płodną.
Wynalazek dotyczy również sposobu transformacji obejmującego inokulację i kokultywację docelowej tkanki z docelowej rośliny z Agrobacterium, w czasie gdy tkanka docelowa jest w swoim naturalnym
PL 202 067 B1 środowisku roślinnym, a następnie wytworze nie odróżnicowanej tkanki z tkanki docelowej, w którym inokulację prowadzi się przez bezpośrednie i aktywne podanie Agrobacterium do tkanki.
Korzystnie zranienie komórek docelowych w docelowej tkance jest utrzymywane na minimalnym poziomie lub całkowicie wykluczone.
Korzystnie przynajmniej część odróżnicowania tkanki docelowej przeprowadza się in vitro.
Korzystnie roślina docelowa jest dwuliścienna lub jednoliścienna, korzystniej roślina docelowa należy do rodziny Gramineae, jeszcze korzystniej roślina docelowa jest wybrana z grupy składającej się z pszenicy, jęczmienia, kukurydzy, ryżu, owsa, żyta, sorgo i prosa.
Korzystnie roślina docelowa jest wybrana z grupy składającej się z rzepaku, papryki, soi, słonecznika, buraka cukrowego, dyniowatych, szparaga, cebuli, palmy olejowej, jam i banana.
Równie korzystnie docelowa tkanka jest zarodkiem, kwiatostanem, zalążnią, szypułką liścia lub pylnikiem.
W równie korzystnym sposobie transformacji docelowa tkanka jest niedojrzałym zarodkiem, niedojrzałym kwiatostanem, niedojrzałą zalążnią lub niedojrzałym pylnikiem.
Korzystnym docelowym obszarem dla inokulacji jest styk między dwoma warstwami komórek, które są w ścisłym kontakcie.
W innym korzystnym sposobie transformacji około czasu inokulacji Agrobacterium nie jest dodawany czynnik indukujący Agrobacterium vir.
W kolejnym korzystnym sposobie transformacji około czasu kokultywacji Agrobacterium nie jest dodawany indukujący czynnik Agrobacterium vir.
Korzystnie inokulację Agrobacterium prowadzi się przez iniekcję zawiesiny Agrobacterium do tkanki docelowej za pomocą strzykawki.
Równie korzystnie inokulację Agrobacterium prowadzi się z minimalnymi uszkodzeniami tkanki docelowej.
Ponadto korzystnie transfomowaną docelową tkanką roślinną jest kalus, korzeń, pęd lub cała roślina (korzystnie płodna), nasiono lub inny materiał zdolny do reprodukcji.
W tym nowym sposobie docelowa tkanka jest inokulowana i kokultywowana z Agrobacterium w czasie gdy tkanka docelowa jest w swoim naturalnym ś rodowisku roś linnym. W ten sposób tkanka docelowa nadal się rozwija według normalnych szlaków fizjologicznych i czasowych. Następnie tkanka docelowa jest usuwana ze swojego normalnego środowiska i skierowana na szlak odróżnicowania i regeneracji aby wytworzyć roślinę transgeniczną. Korzystnie roślina transgeniczna jest płodną rośliną transgeniczną.
W niniejszym wynalazku okreś lenie „w swoim naturalnym ś rodowisku roś linnym” obejmuje wszystkie warunki, w których tkanka docelowa jest zdolna do rozwoju według zasadniczo normalnych szlaków fizjologicznych i czasowych. Takie warunki obejmują to, że tkanki docelowe są in vivo, tkanka docelowa jest nadal w, na lub przymocowana do rośliny (na przykład tkanka docelowa jest zarodkiem w nasionie lub cię tej rozł odze) lub tkanka docelowa, która nadal jest w tym samym ś rodowisku komórkowym w jakim byłaby, gdyby nadal znajdowała się na roślinie (na przykład na tkance docelowej będącej zarodkiem w obrębie wyizolowanego nasiona, lub części wyizolowanego nasiona). Inne przykłady obejmują niedojrzałe kwiatostany nadal w obrębie wiązki liścia lub przynajmniej nadal przyłączone do rośliny i niedojrzałego pylnika, podczas gdy jest on nadal umieszczony w nierozwiniętym pączku kwiatowym.
Odróżnicowanie oznacza skupienia komórek takie jak kalus, które wykazują niezorganizowany wzrost.
Oprócz tego, że tkanka docelowa jest w środowisku takim jak na roślinie, Agrobacterium jest w środowisku, które bardziej przypomina naturalne środowisko bakterii. Tak więc jest prawdopodobne, że Agrobacterium będzie działać bardziej skutecznie w procesie transformacji tkanki docelowej, niż gdy jest skierowane na wyizolowaną tkankę na szalce Petriego.
Jedną z konsekwencji tych dwóch czynników jest możliwość uzyskania wyższej wydajności transformacji pożądanego transgenu do tkanek docelowych czego wynikiem będzie wyższa wydajność wytwarzania roślin transgenicznych.
Jednym z pierwszych etapów w większości protokołów transformacji jest zranienie tkanki docelowej. W przypadku Agrobacterium może być to wskazane z dwóch powodów - aby wyeksponować komórki uważane za odpowiadające na transformację i które są zdolne do regeneracji (szczególnie u gatunków Gramineae) i aby zaindukować Agrobacterium do przenoszenia T-DNA. Jedna z opublikowanych metod opisanych dla pszenicy, która nie obejmuje zranienia, jednak nadal wymaga stosowania
PL 202 067 B1 czynnika zwilżającego (Silwet lub kwas pluronowy) lub infiltracji pod próżnią (WO 97/48814). Z wszystkimi tymi sposobami nieodłącznie zwią zane jest okreś lone uszkodzenie tkanki, z którym łączone jest obniżenie zdolności do regeneracji.
W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku ranienie komórek docelowych w tkance docelowej jest utrzymywane na minimalnym poziomie lub całkowicie wykluczone, może być stosowany zwilżacz, choć nie jest to niezbędne. Może zajść znaczne uszkodzenie tkanki w czasie procedury dostarczania, ale nawet wtedy większość komórek docelowych, do których są następnie adresowane Agrobacterium pozostaje nieuszkodzonych i ich zdolność do regeneracji nie ulega upośledzeniu.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zaszczepienie Agrobacterium korzystnie przeprowadza się przez naniesienie zawiesiny Agrobacterium na tkankę docelową odpowiednim urządzeniem do dostarczania np. strzykawką Hamiltona.
Rozwiązania według wynalazku pozwoliły na opracowanie systemu do transformacji roślin, korzystnie zbóż, z udziałem Agrobacterium, który obejmuje zakażenie tkanki docelowej. Wykazano, że system ten jest wysoce skuteczny i daje powtarzalne wyniki.
Tkanka docelowa może być dowolną tkanką, która może być następnie umieszczona w fazie hodowli tkankowej, i z której może zregenerować roślina. Szczególnie odpowiednia tkanka do celowa obejmuje zarodek, kwiatostan, zalążnię, podstawę liścia, lub pylnik. Zarodek, kwiatostan, zalążnia lub pylnik są korzystnie niedojrzałe.
Gdy tkanka docelowa jest zarodkiem, docelowym obszarem do inokulacji jest obszar styku między dwoma warstwami komórek, które są w ścisłym kontakcie, np. powierzchnia rozwijającej się tarczki i przylegająca parenchyma skrobiowa endospermu. Agrobacterium musi być dostarczany do tego styku z minimalnym uszkodzeniem tkanki docelowej w stopniu takim, że zdolność do regeneracji nie jest niekorzystnie zmieniana. Informacje dostępne w znanym stanie techniki nie pozwalały przewidzieć, że uda się uzyskać tak skuteczną i powtarzalną technikę.
W sposobie transformacji wedł ug wynalazku tkanka docelowa jest inokulowana i kokultywowana z Agrobacterium. Po tym regenerowana jest roślina transgeniczną przez odróżnicowanie i regenerację tkanki docelowej. Tak więc po inokulacji i kokultywacji prowadzi się odróżnicowanie tkanki docelowej. Z tej odróżnicowanej tkanki uzyskuje się roślinę za pomocą standardowych procedur znanych w dziedzinie. Po inokulacji i kokultywacji, tkanka docelowa jest korzystnie przenoszona do bardziej odpowiedniego środowiska dla wymaganego odróżnicowania i następnej regeneracji rośliny. Tak więc przynajmniej część odróżnicowania tkanki docelowej (po inokulacji i kultywacji) jest przeprowadzana in vitro. Regeneracja rośliny można również korzystnie przeprowadzać in vitro.
Jedną zadziwiającą cechą sposobu według wynalazku (przynajmniej dla niedojrzałych zarodków pszenicy) jest częste wytwarzanie wielokrotnych zdarzeń transformacji z jednego wyizolowanego eksplantu. W dziedzinie (Cheng i wsp. 1997) wszystkie rośliny pochodzące z tego samego eksplantu są na ogół uważane za klony danego zdarzenia. W tym sposobie nie można zrobić tego założenia, jako że z jednego eksplantu często powstaje kilka roślin, każda z odrębnym wzorem integracji, potwierdzanym przy analizie typu Southerna. Jednym z możliwych wyjaśnień, co nie powinno być przyjmowane jako ograniczające dla wynalazku, mógłby być brak zranienia w najbardziej zdolnych do regeneracji komórkach przed zastosowaniem Agrobacterium. Częstotliwość transferu T-DNA jest większa w komórkach, które nadal mają zdolność do dalszego rozwoju.
Cechą transformacji zbóż często opisywaną jako kluczowa jest indukcja Agrobacterium przez włączenie w podłożach do inokulacji i/lub kokultywacji czynnika indukującego Agrobacterium vir (Hiet i wsp., 1997, Cheng i wsp., 1997). Takie czynniki indukujące obejmują acetosyryngon, wanilinę, kwas ferulowy, katechol i kwas syryngowy. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają skuteczną transformację Agrobacterium w zbożach, przy czym nie jest konieczny żaden czynnik indukujący. W szczególności uzyskano udaną transformację pszenicy przez Agrobacterium bez czynnika indukującego wykazując, że żaden czynnik indukujący nie był konieczny do skutecznego do starczania T-DNA. Gdy tkanką docelową jest niedojrzały zarodek i jego naturalne środowisko roślinne jest dostarczane przez niedojrzałe nasiono uważa się że Agrobacterium, wydaje się być dostatecznie zaindukowane naturalnie, przez komórki niedojrzałego zarodka. Jednym możliwym wyjaśnieniem tego, które nie powinno być interpretowane jako ograniczające jest, że komórki, które tworzą naturalne środowisko roślinne przylegające do lub będące dokoła tkanki docelowej są odpowiedzialne za indukcję Agrobacterium. Usunięcie zarodków z naturalnego środowiska wydaje się pozbawiać tkankę docelową dostępnych związków które mogą pomagać w indukcji Agrobacterium.
PL 202 067 B1
Niniejszy wynalazek pozwala na wprowadzenie pożądanego transgenu lub heterologicznego kwasu nukleinowego do tkanki roślinnej i umożliwia uzyskanie płodnej rośliny transgenicznej. Jest to szczególnie przydatne w wytwarzaniu transgenicznych roślin jednoliściennych, ponieważ ze znanymi sposobami transformacji wiążą się trudności i niskie wydajności transformacji. Odpowiednie rośliny jednoliścienne obejmują szparagi, cebulę, palmę olejową, jam, banan, w szczególności dowolny z gatunków rodziny Gramineae, szczególnie zbóż (tych traw, których owoce są stosowane jako pokarm dla ludzi) takich jak pszenica, jęczmień, kukurydza, ryż, owies, żyto, sorgo i proso.
Sposób według wynalazku można też stosować do roślin dwuliściennych, w szczególności gdy istnieje system hodowli tkankowej, lub może być opracowany, obejmujący fazę kalusa. Odpowiednie rośliny dwuliścienne obejmują rzepak, groch, paprykę, soję, słonecznik, burak cukrowy i dyniowate i drzewa takie jak drzewo kauczokodajne, sosny i eukaliptus.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem heterologiczny kwas nukleinowy jest takim, który nie jest normalnie spotykany w T-DNA Agrobacterium lub rośliny, która ma być transformowana. Stosowane określenie heterologiczny kwas nukleinowy obejmuje wszystkie syntetycznie uzyskane i biologicznie pochodzące geny, które mogą być wprowadzane do roślin za pomocą inżynierii genetycznej, w tym, ale nie ograniczając się do, geny nie pochodzące od roślin, geny zmodyfikowane, geny syntetyczne, części genów i geny z dowolnego gatunku roślin. Heterologiczny kwas nukleinowy korzystnie zawiera kodujący region białka lub polipeptydu lub określoną cząsteczkę antysensowną, z flankującymi sekwencjami regulatorowymi, które promują jego ekspresję w uzyskanej roślinie jednoliściennej.
Sposoby konstrukcji heterologicznych kwasów nukleinowych dla udanej transformacji roślin są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i te same sposoby konstrukcji mogą być stosowane do wytwarzania użytecznych heterologicznych kwasów nukleinowych. Weising i wsp. (1988) (Annual Rev. Genet. 22:241), którego publikacja jest tu włączona jako odniesienie, opisują odpowiednie składniki, które obejmują promotory, sekwencje poliadenylacji, geny markerów do selekcji, geny reporterowe, enhancery, introny, i tym podobne i dostarczają odpowiednich referencji dla ich kompozycji. Odpowiednie sposoby konstrukcji opisane są w Sambrook i wsp. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habror, NY).
Ogólnie plazmid zawierający heterologiczny gen kwasu nukleinowego będzie stosunkowo mały, tzn. mniej niż 30 kb, aby zminimalizować wrażliwość na fizyczną, chemiczną lub enzymatyczną degradację, co do której wiadomo, że wzrasta ze zwiększeniem rozmiaru genu.
Odpowiednie heterologiczne kwasy nukleinowe lub transgeny do zastosowania obejmują wszystkie kwasy nukleinowe, które dostarczą lub zwiększą korzystną cechę powstałej transgenicznej rośliny. Na przykład kwas nukleinowy może kodować białko lub transkrypty antysensownego RNA aby promować zwiększone wartości pożywienia, wyższe wydajności, oporność na szkodniki, oporność na choroby i tym podobne. Reprezentatywne kwasy nukleinowe obejmują na przykład gen bakteryjny dapA dla zwiększenia poziomu lizyny; gen endotoksyny Bt lub inhibitor proteazy dla oporności na owady, geny peptydów litycznych dla oporności na choroby, EPSPS bakterii lub roślin dla oporności na herbicyd glifosat (US 4,940,835. US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,312,910, US 5,633,435, US 5,627,061, US 5,310,667, WO 97/04103), HPPD bakterii lub roślin (WO 96/38567, WO 98/02562) dla oporności na herbicydy inhibitory HPPD (tzn. diketony, izoksazole itd.), geny bar lub pat dla oporności na glufozynian, chitynazę lub endo 1,3-B-glukozydaza glukanu dla właściwości grzybobójczych. Kwas nukleinowy może również być wprowadzany, aby działał jako narzędzie genetyczne w celu generacji mutantów i/lub aby pomóc w identyfikacji, znakowaniu genetycznym lub izolacji odcinków genów roślin.
Przykłady genów pożytecznych dla modyfikacji jakości obejmują geny dla enzymów biosyntezy lub degradacji skrobi np. syntazy skrobi, enzymy rozgałęziające skrobi (np. SBEI, SBEII, SSSI i DBEI z pszenicy ujawnione w W099/14314) i geny biał ek zapasowych ziarna np. biał ka podjednostki gluteniny (przykłady zobacz W097/25419), gliadyny, hordeiny. Sztuczne geny męskiej sterylności np. barnaza (EP-A-0344029) i PR-glukanaza (W092/11379) pod kontrolą odpowiedniego promotora są również użyteczne w wytwarzaniu nasion mieszańcowych.
Geny mogą być też wprowadzane w celu produkcji farmaceutycznie czynnych związków w roślinie lub poprawy jakości odżywczej roślin (biofarmacja i pokarmy funkcjonalne).
Dodatkowe przykłady można znaleźć w Weising, powyżej.
Plazmid zawierający heterologiczny kwas nukleinowy, który ma być wprowadzony do rośliny będzie na ogół zawierał marker do selekcji lub gen reporterowy lub oba, aby ułatwić identyfikację i selekcję transformowanych komórek. Alternatywnie, marker selekcyjny może być niesiony na oddzielnym wektorze
PL 202 067 B1 i stosowany w procedurze kotransformacji. Zarówno markery selekcyjne i geny reporterowe mog ą być flankowane przez odpowiednie sekwencje regulacyjne, aby pozwolić na ekspresję w roślinach. Pożyteczne markery selekcyjne są dobrze znane w dziedzinie i obejmują na przykład geny oporności na antybiotyki i herbicydy. Specyficzne przykłady takich genów są ujawnione w Weising i wsp., powyżej. Korzystnym genem markera selekcyjnego jest gen su1 nadający oporność na sulfonamidy (EP-B-0369637). Inne markery selekcyjne znane w dziedzinie obejmują sekwencje kodujące fosfotransferazy higromycyny B (hpt), które mogą pochodzić z E. coli, gen fosfotransferazy aminoglikozydu transpozonu Tn5 (AphII), który koduje oporność na antybiotyki kanamycynę, neomycynę i G418 jak i te geny, które kodują oporność lub tolerancję na glifosat, bialofos, metotreksat, imidazolinony, sulfonylomoczniki, bromoksynil, dalapon i tym podobne. Geny markerów selekcyjnych, które na dają tolerancję na herbicydy mają także znaczenie handlowe w powstałych transformowanych roślinach.
Geny reporterowe, które kodują łatwo oznaczalne białka markerowe są dobrze znane w dziedzinie. Na ogół gen reporterowy jest genem, który nie jest obecny lub wyrażany przez organizm lub tkankę biorcy i który koduje białko, którego ekspresja jest wyrażana przez jakąś łatwo wykrywalną cechę np. zmianę fenotypu lub aktywność enzymatyczną. Przykłady takich genów są dostarczone w Weising i wsp., powyż ej. Korzystne geny obejmuj ą acetylotransferazę chloramfenikolu (cat) z Tn9 E. coli, gen betaglukuronidazy (gus) z locus uidA E. coli, zielone białko fluoryzujące (GFP) z Aequoria victoria, i gen lucyferazy (luc) ze świetlika Photinus pyralis.
Użyteczne sekwencje regulatorowe obejmują dowolne konstytutywne, indukowalne, specyficzne tkankowo lub narządowo, lub promotor specyficzny w stosunku do stadium rozwoju, który może być wyrażany w określonych komórkach rośliny. Takie odpowiednie promotory są ujawnione w Weising i wsp., powyżej. Poniżej podana jest reprezentatywna lista promotorów odpowiednich do stosowania: regulatorowe sekwencje z T-DNA A. tumefaciens, w tym syntaza mannopiny, syntaza nopaliny i syntaza oktopiny; promotor dehydrogenazy alkoholowej z kukurydzy; promotory indukowane przez światło takie jak gen małej podjednostki karboksylazy rybulozo bisfosforanu z różnych gatunków i promotor głównego białka wiążącego chlorofil a/b; promotory histonu (EP 507 698), promotory aktyny, promotor ubikwityny 1 z kukurydzy (Christensen i wsp. (1996) Transgenic Res. 5:213); promotory 35S i 19S z wirusa mozaiki kalafiora; regulowane w rozwoju promotory takie jak promotory waxy, zein lub bronze z kukurydzy jak i syntetyczne lub naturalne promotory, które są albo indukowane albo konstytutywne, obejmując promotory wykazujące ekspresję specyficzną w stosunku do na rządu lub ekspresję w specyficznych stadiach rozwojowych rośliny, takie jak promotor alfa-tubuliny ujawniony w US 5,635,618.
Inne elementy takie jak introny, enhancery, sekwencje poliadenylacji i tym podobne mogą być obecne w kwasie nukleinowym. Te elementy muszą być zgodne z resztą konstruktu genetycznego. Takie elementy mogą być konieczne, ale nie muszą, dla funkcjonowania genu, choć mogą umożliwiać lepszą ekspresję lub funkcjonowanie genu przez wpływ na transkrypcję, stabilność mRNA lub tym podobne. Takie elementy mogą być włączone w kwasie nukleinowym według potrzeb, aby uzyskać optymalne funkcjonowanie transformującego genu w roślinie. Na przykład można umieścić pierwszy intron Adh1S kukurydzy między promotorem i sekwencją kodującą danego heterologicznego kwasu nukleinowego. Wiadomo, że gdy intron jest włączony do konstruktu genu, ogólnie wzmaga ekspresję białka w komórkach kukurydzy (Callis i wsp. (1987) Genes Dev. 1:1183). Inne odpowiednie introny obejmują pierwszy intron genu shrunken-1 kukurydzy (Maas i wsp. (1991) Plant Mol. Biol. 16:199); pierwszy intron katalazy rycyny (cat-1) (Ohta i wsp. (1990) Plant Cell Physiol. 31:805); drugi intron genu katalazy ziemniaka ST-LSI (Vacanneyt i wsp. (1990) Mol. Gen. Genet. 220:245); intron DSV wirusa żółtej karłowatości tytoniu (Morris i wsp. (1992) Virology 187:633)actin-1(act-1-intron z ryżu (McElroy i wsp. (1990) Plant cell 2: 163), i intron 1 izomerazy triozofosforanu (TPI) (Snowden i wsp. (1996) Plant Mol. Biol. 31:689). Jednak często można uzyskać dostateczną ekspresję wystarczająca do odpowiedniego działania markera selekcyjnego bez intronu (Battraw i wsp. (1990) Plant Mol. Biol. 15:527).
Aby adresować białko kodowane przez heterologiczny gen do chloroplastów komórek roślinnych plazmid zawierający heterologiczny kwas nukleinowy może też zawierać sekwencje kodujące peptyd tranzytowy. Takie peptydy są dobrze znane osobom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie i mogą obejmować pojedynczy peptyd tranzytowy jak i wielokrotne peptydy tranzytowe uzyskane za pomocą sekwencji kodujących przynajmniej dwa peptydy tranzytowe. Jeden z korzystnych peptydów tranzytowych to Zoptymalizowany Peptyd Tranzytowy ujawniony w US 5,636,618 obejmujący w kierunku transkrypcji pierwszą sekwencję DNA kodują c ą pierwszy peptyd tranzytowy chloroplastu,
PL 202 067 B1 drugą sekwencje DNA obejmującą N-końcową domenę dojrzałego białka naturalnie sterowanego do chloroplastów i trzecią sekwencję DNA kodującą drugi peptyd tranzytowy chloroplastu.
W celu ustalenia czy dana kombinacja heterologicznego kwasu nukleinowego i komórek rośliny odbiorcy może być odpowiednia do stosowania jak zostało to opisane, plazmid może również zawierać gen reporterowy. Pozwala to na oznaczenie ekspresji heterologicznego genu reporterowego w odpowiednim momencie po wprowadzeniu kwasu nukleinowego do komórek biorcy. Takie korzystne oznaczenie obejmuje stosowanie genu betaglukorunidazy (gus) E. coli opisanego przez Jeffersona i wsp. (1987) EMBO J. 6.3901, która to publikacja włączona jest jako odniesienie.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają wytworzenie płodnych roślin transgenicznych, które zawierają jeden lub więcej interesujących transgenów. Nasiona lub inne materiały do namnażania z roś liny mogą być zastosowane do uzyskania nastę pnych pokoleń transgenicznych roś lin (w tym potomstwa), które zawierają jeden lub więcej transgenów wprowadzonych opisanym sposobem. Takie następne pokolenia roślin (w tym potomstwo) i materiał do namnażania obejmujący nasiona są możliwe do wytworzenia stosując rozwiązania według niniejszego wynalazku.
Wynalazek również dotyczy zastosowania Agrobacterium w sposobie transformacji obejmującym inokulację i kokultywację docelowej tkanki z docelowej rośliny z Agrobacterium, w czasie gdy tkanka docelowa jest w swoim naturalnym środowisku roślinnym, a następnie wytwarzanie materiału rośliny transgenicznej przez odróżnicowanie tkanki docelowej, w którym inokulacja jest prowadzona przez bezpośrednie i aktywne podanie Agrobacterium do tkanki.
W korzystnym zastosowaniu Agrobacterium transgeniczny materiał roślinny jest odróżnicowywany i ewentualnie regenerowany w celu wytworzenia kalusa, korzenia, pędu lub materiału roślinnego (korzystnie płodnego).
Odróżnicowana tkanka może być dowolnie regenerowana do rośliny transgenicznej. Jednak są sytuacje, w których są stosowane odróżnicowana tkanka sama, lub jakakolwiek część rośliny z niej wygenerowana. Takie sytuacje obejmują przechowywanie odróżnicowanej tkanki przez określony czas przed dalszym jej stosowaniem i odzyskanie z hodowli komórek pożytecznych produktów roślinnych takich jak na przykład wtórne metabolity roślinne.
Odróżnicowana tkanka może być regenerowana, tak by utworzyć na przykład tkankę kalusa, całe rośliny, płodne całe rośliny, korzenie, pędy, nasiona lub inny materiał do namnażania.
Za pomocą sposobu według wynalazku można uzyskać transformowaną tkankę roślinną. Taki transformowany materiał roślinny obejmuje kalusy, materiały korzenia, całe rośliny, nasiona lub inny materiał do namnażania, a uzyskiwane rośliny są korzystnie płodne.
Są różne przyczyny, które powodują, że obecny wynalazek jest udany, i które powodują, że docelowa tkanka jest bardziej podatna na transformację przez Agrobacterium podczas, gdy jest nadal w naturalnym ś rodowisku roś linnym. Nie chcą c w ż aden sposób ograniczać wynalazku proponuje się następujące przyczyny, które przyczyniają się do uzyskania korzyści z wynalazku.
1. Komórki docelowe w swym naturalnym środowisku roślinnym szybko się dzielą, prawdopodobnie bardziej niż w hodowli tkankowej.
2. Unikanie obróbki po izolacji (tzn. inokulacji i kokultywacji) zwiększa potencjał dla tworzenia kalusa jak i potencjał do regeneracji.
3. Różne komórki rozwijającej się tkanki docelowej są eksponowane na Agrobacterium (w porównaniu ze stanem techniki) specyficznie te, które mogą być subepidermalne i uważane są za łatwiejsze do regeneracji.
4. Brak zranienia (wymaganego dla większości innych protokołów transformacji) powoduje, że prawie wszystkie komórki, które były transformowane są zdolne do dalszego rozwoju.
5. Połączenie dwóch etapów inokulacji i kokultywacji zmniejsza stres, którym zazwyczaj jest poddawana tkanka docelowa przez te dwa oddzielne etapy hodowli tkankowej.
6. Naturalne środowisko nasiona jest bardziej korzystne dla normalnego rozwoju komórek, w obecności Agrobacterium niż gdy są przełożone do środowiska hodowli tkankowej.
7. Komórki powierzchniowe będą bardziej miękkie w dowolnej tkance docelowej i będą stanowić mniejszą barierę dla Agrobacterium niż po ekspozycji na powietrzu.
Sposób transformacji według niniejszego wynalazku może być opisany według następującej „ogólnej” metodologii. Bardziej szczegółowa metoda jest podana w przykładach.
Następująca ogólna metodologia jest opisana dla inokulacji zarodków (w nasionach).Specjalista w dziedzinie bę dzie wiedział , ż e ogólny sposób mo ż e być dopasowany do innych tkanek docelowych.
PL 202 067 B1
Przygotowanie konstruktów i przeniesienie do Agrobacterium
Wektory binarne, superbinarne, pGreen lub kointegracyjne zawierające odpowiednie geny i markery selekcyjne i/lub geny reporterowe przenoszono do Agrobacterium za pomocą róż nych dostępnych sposobów np. krzyżówki trójrodzicielskie, elektroporacja. Stosowany Agrobacterium może być dowolnym standardowym, na ogół inaktywowanym szczepem Agrobacterium tumefaciens lub rhizogenes obejmującym, ale nie ograniczonym do:
LBA4404 (Hoekema i wsp., Nature (1983) 303:179-180)
EHA101 (Hood i wsp., J. Bacteriol. (1986) 168:1291-1301
Inaktywowany C58, na przykład pMP90 (Koncz i Schell, M.G.G. (1986) 204, 383-396
LBA4404 zawierający pTOK233 (Hiei i wsp., Plant J. (1994) 6:271-282).
Przygotowanie Agrobacterium do doświadczeń
Agrobacterium inkubowano w lub na podłożach z odpowiednimi antybiotykami selekcyjnymi w 25-30°C przez 2-3 dni. Bakterie nastę pnie zebrano i zawieszono ponownie w TSIM1 (podł o ż a MS z 100 mg/l mio-inozytolu, 10g/l glukozy, 50 mg/l bufor MES pH 5,5) lub innym podobnym podłożu hodowlanym, które może też zawierać acetosyringon. Zwilżacz, np. kwas pluronowy F68 może być także włączony i inne czynniki indukujące dla Agrobacterium mogą być dowolnie stosowane np. opiny lub inne metabolity wtórne roślin.
Przygotowanie materiału roślinnego
Materiałem wyjściowym dla tego protokołu jest kwiatostan rośliny jednoliściennej (na ogół zboża), po pewnym czasie po dojrzeniu pręcików. Wszystkie stadia inokulacji i kokultywacji mogą być przeprowadzone w kwiatostanie gdy jest nadal na nienaruszonej roślinie. Jednak w celu ułatwienia i odgraniczenia, korzystnie przeprowadza się usunięcie części roślin, które niosą kwiatostany. Tym niemniej kwiatostan pozostaje w swym naturalnym środowisku roślinnym nawet gdy część rośliny jest z niej usunię ta.
Na przykład rozłogi pszenicy lub te z dowolnego innego zboża około 8-16 dni po dojrzewaniu pręcików zbiera się z roślin hodowanych w szklarni lub Conviron (pokój z kontrolowanym środowiskiem). Następnie eksponuje się niedojrzałe nasiona, ale pozostawiając je przyłączone do rośliny. Na przykład w pszenicy plewy każdego kłoska i plewki bocznej dwóch kwiatów są starannie usuwane aby wyeksponować niedojrzałe nasiono. Na ogół odkrywa się tylko dwa nasiona w każdym kłosku. Procedurę tę przeprowadza się wzdłuż całej długości kwiatostanu.
Inokulacja niedojrzałych nasion
Zawiesinę Agrobacterium inokuluje się do niedojrzałego nasiona w pozycji około styku tarczka:
endosperm, stosując dowolny odpowiedni przyrząd do dostarczania na przykład strzykawkę Hamiltona. Objętość dostarczanej zawiesiny bakteryjnej wynosi na ogół 1 μΐ ale może być różna w zależności na przykład od wielkości nasiona.
Na przykład rozłogi umieszcza się w wodzie lub w roztworze odżywczym (ewentualnie przykryte torbą plastykową, aby zapobiec odwodnieniu nasion) i umieszcza w podświetlanym inkubatorze na 2-5 dni (korzystnie 2 lub 3 dni). Temperatura inkubatora może być różna w zależności od gatunku zboża, ale na ogół mieści się w zakresie od 20-25°C.
Izolacja i hodowla zarodków
Po inokulacji niedojrzałe nasiona usuwa się i sterylizuje powierzchniowo. Izoluje się niedojrzałe zarodki i umieszcza na odpowiednim podłożu dla wytwarzania kalusów jak podali przykładowo Weeks i wsp. Plant Physiol. 102:1077-1084, 1993; Vasil i wsp., Biotech. 11:1553-1558, 1993; Ishida i wsp., 1996. Następnie zarodki z powodzeniem przenosi się stosując dowolną odpowiednią procedurę hodowli tkankowej, obejmującą etapy selekcyjne jeśli, jest to wymagane, co powoduje regenerację rośliny transgenicznej, korzystnie uzyskanie rośliny transgenicznej.
Niniejszy wynalazek będzie obecnie opisany z odniesieniem następujących nieograniczających przykładów.
W przykładach odnoszą się do następujących figur:
Figura 1, na której przedstawiono strategię klonowania dla pSCVsulugi
Figura 2, na której przedstawiono mapę plazmidu pSCVsulugi.
Figura 3, na której przedstawiono przejściową ekspresję GUS w niedojrzałym zarodku barwionym histochemicznie 4 dni po inokulacji in vivo i kokultywacji pokazując niebieskie plamy i „kreski”.
Figura 4, na której przedstawione są obszary kalusa wyrażającego GUS histochemicznie barwionego jeden miesiąc po inokulacji in vivo i kokultywacji, pokazujące obszary zabarwione ciemno niebiesko.
PL 202 067 B1
Figura 5, na której przedstawiono szczegóły z figury 4: i pokazano barwiony na ciemno niebiesko, wyraźny obszar kalusa z potencjałem do regeneracji.
Figura 6, na której przedstawiono mapę plazmidu pSBUSulugi.
Figura 7, na której przedstawiono mapę plazmidu pSCV1.2GI.
Figura 8, na której przedstawiono przejściową ekspresję GUS w niedojrzałych liścieniach soi.
P r z y k ł a d 1 Transformacja pszenicy za pomocą metody inokulacji nasion - z ekspresją przejściową i wytworzeniem transformowanego kalusa
Przygotowanie konstruktu
W celu transformacji przygotowano nastę pują ce konstrukty (Figura 1): fragment 4175 bp Hindlll z pAHC25 (Christensen i wsp., Plant Mol. Biol. (1992) 18:675-689) wprowadzono do pIC19H (Marsh i wsp., Gene (1984) 32:481-485) przecię tego Hindlll (uzyskując plazmid pAAA). Fragment BamHI, Sstl intronu GUS z pUC-Top10-GUS INT (Weinmann i wsp., Plant J. (1994) 5:559-569) zastępuje fragment BamHI, Sstl GUS z pAAA aby dać pBBB. Fragment XhoI, Xbal zawierający SulR z pWP258 (opisany w zgł oszeniu patentowym W098/49316) wprowadzono do pSCV1, który był przecię ty Sall, Xbal (Firek i wsp., Plant Mol. Biol. (1993) 22:129-142) uzyskują c wektor pEEE. Fragment Hindlll pUbi-GUSint z pBBB wklonowano do cię tego Hindlll pEEE aby wytworzyć pSCVSulugi (patrz Figura 2).
Konstrukt ten wprowadzono do inaktywowanego superwirulentnego szczepu Agrobacterium tumefaciens EHA101, zawierającego pEHA101 (Hood i wsp., J. Bacteriol. (1986) 168:1291-1310) za pomocą elektroporacji i następnie selekcji na 50 mg/l kanamycyny i 70 mg/l gentamycyny.
Przygotowanie Agrobacterium do eksperymentów
Agrobacterium inkubowano na zestalonych podłożach YEP z 20 mg/l siarczanu kanamycyny w 27°C przez 2 dni. Bakterie następnie zebrano i ponownie zawieszono w TSIM1 (podłoż a MS ze 100 mg/ml mio-inozytolu, 10 g/l glukozy, 50 mg/l buforu MES pH 5,5) zawierające 400 μΜ acetosyringonu do gęstości optycznej 2,4 przy 650 nm.
Przygotowanie materiału roślinnego
Rozłogi pszenicy (wariant pszenicy jarej uzyskanej od Nickerson Seeds Ltd., Rothwell, Lines) około 14 dni po dojrzeniu pręcików (zarodki o długości około 1 mm) zbierano z roślin hodowanych w szklarni, które miały 50 cm łodygę rozłogi (22/15°C temperatura dzień/noc z uzupełnionym światłem aby uzyskać 16 godzinny dzień). Wszystkie liście następnie usuwano poza liściem flagowym i liść flagowy oczyszczano aby usunąć zanieczyszczające spory grzybów. Osłonki każdego kłoska i plewkę boczną starannie usuwano aby wyeksponować niedojrzałe nasiono. Na ogół odkrywano tylko dwa nasiona w każdym kiosku. Procedurę tę przeprowadzano wzdłuż całej długości kwiatostanu. Na kłosy napylano następnie 70% IMS jako krótką sterylizację powierzchniową.
Inokulacja rozłogów
Zawiesina Agrobacterium była inokulowana na niedojrzałym nasionie około pozycji granicy tarczka: endosperma, stosując 10 μl strzykawkę Hamiltona tak, że inokulowano wszystkie eksponowane nasiona. Rozłogi następnie umieszczano w wodzie, przykryte przezroczystą torbą plastykową aby zapobiec odwodnianiu nasion i umieszczano w podświetlanym inkuba torze na 3 dni w 23°C, 16 godzinny dzień, 45 mEm-2s-1PAR.
Izolacja i hodowla zarodka
Po 3 dniach kokultywacji inokulowane niedojrzałe nasiona usunięto i sterylizowano powierzchniowo (30 sekund w 70% etanolu, następnie 20 minut w 20% Domestos, a następnie dokładne płukanie w sterylnej destylowanej wodzie). Niedojrzałe zarodki (w sumie 136) izolowano aseptycznie i umieszczano na podłożach W3 (jak opisano w zgłoszeniu patentowym W098/49316) z dodatkiem 150 mg/l Timentin (W3T) i tarczką do góry (20 zarodków na szalkę). Kultury umieszczano w 25°C w świetle (16 godzinny dzień, 80 mEm-2s-1PAR).
Po 3 dniach hodowli na W3T usunięto 50 zarodków i umieszczono w roztworze X-gluc (Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. (1987) 5:386-405) w 37°C na 16 godzin, aby ocenić ekspresję GUS. Rozwój osi zarodka na pozostałych zarodkach oceniano 5 dni po izolacji, a oś usuwano, gdy było to konieczne, dla poprawy produkcji kalusa. Osiem dni po izolacji usunięto 31 kolejnych zarodków i zabarwiono jak uprzednio.
Pozostałe 55 zarodków utrzymywano na W3T przez 4 tygodnie z przeniesieniem do świeżych podłoży po 2 tygodniach po izolacji.
Jeden miesiąc po izolacji zarodków pozostałe kalusy po chodzące z zarodków oceniono pod kątem zdolności embriogennej i barwiono pod kątem ekspresji GUS.
PL 202 067 B1
Wyniki
Barwienie histochemiczne 4 dni po inokulacji
Niektóre wyizolowane zarodki wykazywały ślady uszkodzenia przez igłę jako wynik procedury inokulacji. Bardzo rzadko było to związane z jakąkolwiek ekspresją GUS określaną histochemicznie.
Ekspresja GUS w zarodkach pojawiała się w trzech postaciach.
1. Standardowe niebieskie plamki GUS jak udokumentowano w stanie techniki, patrz Fig. 3.
2. Małe niebieskie kreski zawierające kilka połączonych komórek, które wydają się wyrażać GUS w tym samym stopniu, patrz Figura 3.
3. Duże bloki ciemnoniebieskiego barwienia na tarczce i osi zarodka, które zaczynały się jako plamy lub kreski i szybko wnikały w duże obszary tkanki tak, że niemożliwe było określenie ilościowe.
Kombinacja wyników z 1 i 2 dała średnio 6 plam na zarodek, z zakresem 0-64 plamek.
Kontrolne zarodki (30) pochodzące z zaszczepień EHA101 niosące tylko pEHA101 nie dały barwienia jakiegokolwiek na niebiesko z X-gluc. Także nie zaobserwowano barwienia EHA101 zawierającego SCVsulugi.
Barwienie histochemiczne 14 dni po inokulacji
Wzory barwienia tych zarodków były nieco inne niż te widziane po 4 dniach. Barwienie było zazwyczaj w postaci małych plamek, lub czasem jako małe obszary. Średnia liczba plamek/obszarów na zarodek wynosiła 3, z zakresem od 0-25. Zarodek z maksymalną liczbą zdarzeń barwienia miał także więcej z mniej często obserwowanych niebieskich „stref” na tkance tarczek.
Rozwój kalusa
Po wzroście przez 4 tygodnie, kalus pochodzący z za szczepionych zarodków był bardzo podobny do kalusa kontrolnego uzyskanego z niezaszczepionych zarodków. Obecność bakterii nie wydawała się znacząco zmniejszać zdolności embriogennej kalusa pochodzącego od zaszczepionych zarodków.
Barwienie histochemiczne jeden miesiąc po inokulacji
Z pozostał ych 55 niedojrzał ych kalusów, które był y za barwione x-gluc 16 wykazał o dowody na ekspresję GUS w postaci ciemno zabarwionych błękitnych komórek. W 6 z tych kalusów zaobserwowano całkiem duże ciemnoniebieskie obszary barwienia, do 1 mm w średnicy i przedstawiające się jako wysoce wyodrębnione obszary, patrz Figura 4. Trzy z niebieskich regionów wykazywały trójwymiarową strukturę w postaci protruzji komórek z powierzchni kalusa (jak na Figurze 3) i były ocenione jako posiadające dobry potencjał do regeneracji w embriogennym kalusie.
Odzyskanie z tego eksperymentu trzech stabilnych zdarzeń transformacji z dobrym potencjałem do regeneracji sugeruje, że ten sposób daje wysoką wydajność transformacji.
P r z y k ł a d 2 Transformacja pszenicy z wykorzystaniem sposobu inokulacji nasion - transformacja i regeneracja roślin transgenicznych
Postępowano jak w przykładzie 1 poza tym, że inokulowano i izolowano 187 zarodków i były one poddane etapowi selekcji
Selekcja transformowanego kalusa
Po 12 dniach hodowli na W3T, przeniesiono embriogenne kalusy na podłoża W3 z 2mg/l Asulam i 150 mg/l Timentin (W32AT). Kalusy trzymano na tych podłożach przez 2 kolejne tygodnie i następnie każdy kalus dzielono na fragmenty 2 mm ponownie wysiewano na W32AT.
Po dalszych 2 tygodniach hodowli całą tkankę oceniano pod kątem rozwoju embriogennego kalusa i dowolny kalus wykazujący oznaki dalszego rozwoju po 4 tygodniach z selekcją przenoszono do podłoży regeneracyjnych (RMT-MS z 40 g/l maltozy i 150 mg/l Timentin, pH 5,8, zestalonej 6 g/l agarozy, Sigma typ I). Pędy regenerowano przez 4 tygodnie na tym pod łożu i następnie przenoszono na MS30 z 150 mg/l Timentin dla wydłużania pędów i ukorzeniania.
Transformację określano za pomocą jednego lub więcej z następujących sposobów:
a) barwienie histochemiczne GUS (Jefferson, 1987) przy najmniej na korzeniach i na liściach
b) analizę PCR genu su1.
3
Analizę PCR przeprowadzono na genomowym DNA wyekstrahowanym z 1-2 cm3 świeżego materiału liścia stosując metodę minipreparatów opisaną przez Stacey i Isaac (Methods in Molecular Biology tom 28: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes, 9-15, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)). Reakcje PCR przeprowadzono stosując startery zaprojektowane aby zamplifikować fragment 380 bp Su1 (5' TTGTGCGGTTCTTCGAGGCG 3' i 5'TGCGCTTCGCAGATCTCCAG 3'. Warunki reakcji były następujące „gorący start” (94°C, 3 min), a następnie 30 cykli denaturacji (95°C,
PL 202 067 B1
s), hybrydyzacji (60°C, 30s), wydłużania (73°C, 2 min) oraz 1 cykl w 73°C (5 min) a następnie przetrzymywane w 24°C.
c) analiza typu Southerna
Analizę typu Southerna przeprowadzono na DNA z ekstrakcji na pełną skalę (9 ml) z roztartej liofilizowanej tkanki (Stacey i Isaac, 1994). Próbki DNA doprowadzono do 0,2 mg/ml i strawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll, EcoRI i KpnI. Trawienie enzymami restrykcyjnymi, elektroforezę w żelu i przenoszenie pod próż nią przeprowadzono jak opisali Stacey i Isaac (1994). Sondy Sul i GUS znakowane digoksygeniną wytworzono za pomocą PCR według metody McCreery i Helentjaris (Methods in Molecular Biology, tom 28: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes, 107-112, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)).
d) Analiza segregacyjna pokolenia T1
Analizę przeprowadzono przez barwienia histochemiczne skiełkowanych siewek.
roś liny reprezentujące 2 oddzielne zdarzenia transformacji (wydajność 1,1%) regenerowano, ich próbki liści i korzeni wykazywały silną ekspresję GUS za pomocą barwienia histochemicznego. Stabilną transformację potwierdzono za pomocą analizy typu Southern i ocenę segregacji genów u potomstwa.
W oddzielnym eksperymencie zaszczepiono 116 zarodków i zregenerowano GUS dodatnich linii transgenicznych.
Uzyskane wydajności (1,1 i 3,4%) są porównywalne z uzyskanymi z innymi kombinacjami wektorów i szczepów bakteryjnych (patrz przykład 5).
P r z y k ł a d 3 Transformacja kukurydzy z wykorzystaniem sposobu inokulacja nasion - ekspresja przejściowa, produkcja transgenicznego kalusa i regeneracja transformowanych roślin
Przygotowanie konstruktu
Jak w przykładzie 1
Przygotowanie Agrobacterium do eksperymentów
Agrobacterium inkubuje się na zestalonych podłożach YEP z odpowiednimi antybiotykami w 27°C przez 2 dni. Bakterie następnie się zbiera i ponownie zawiesza w TSIM1 (podłoże MS z 100 mg/l mio-inozytolu, 10g/l glukozy, 50 mg/l buforu MES pH 5,5) zawierającego 100-400 mM acetosyringonu do gęstości 2,0-2,4 przy 650 nm.
Przygotowanie materiału roślinnego
Wycina się fragmenty roślin kukurydzy, odmiana A188 (hodowane w szklarni w 20-35°C, 16 godzinny dzień) tak by zawierały przynajmniej węzeł łodygowy poniżej i węzeł łodygowy powyżej kolby/kaczanu, 6-14 dni po rozwoju pręcików, i z zachowaniem przynajmniej jednego liścia. Łuski liści z kolby starannie odciąga się by wyeksponować niedojrzałe nasiono i usuwa wszystkie jedwabiste włoski.
Przy pomocy ostrego narzędzia starannie usuwa się i wyrzuca co drugi podłużny rząd niedojrzałych nasion i na całość lekko napyla się 70% etanol.
Zaszczepianie kolb kukurydzy
Zaszczepianie jak w przykładzie 1. Fragmenty roślin następnie umieszczano w wodzie i łuski liści ponownie umieszczano na kaczanie by zapobiec odwodnieniu - może też być zalecane przykrycie torbą plastykową. Materiał następnie umieszczano w oświetlonym inkubatorze w 23-25°C na 2-5 dni.
Izolacja i hodowla zarodków
Jak opisał to Ishida i wsp., 1997, zarodki usuwa się 2 dni po izolacji w celu analizy ekspresji przejściowej, i resztę poddaje etapowi selekcji aby zregenerować stabilnie transformowane rośliny kukurydzy.
P r z y k ł a d 4 Przejściowa ekspresja w niedojrzałych zarodkach pszenicy po inokulacji nasion w nieobecnoś ci induktora acetosyringonu
Przygotowanie konstruktu
Jak w przykładzie 1
Przygotowanie Agrobacterium do eksperymentów
Jak w przykładzie 1 poza tym, że acetosyringon wyłączono z podłoży do inokulacji i stosowano niższe stężenie Agrobacterium (OD 2,1 przy 650 nm).
Przygotowanie materiału roślinnego
Jak w przykładzie 1.
Zaszczepianie rozłogów
Jak w przykładzie 1.
Izolacja i hodowla zarodków
PL 202 067 B1
Jak w przykładzie 1. Po 2 dniach na W3T oceniono 77 zarodków pod kątem ekspresji GUS za pomocą analizy histochemicznej na X-gluc.
Wyniki
Były widoczne niebieskie plamy/kreski na górnych i dolnych powierzchniach tarczki i w wielu przypadkach plamki - wydawały się być włączone do struktury tarczki, to znaczy były między górnym i dolnym naskórkiem. U kilku zarodków nie było w ogóle widać ekspresji GUS. Średnia liczba plam na zarodek wynosiła 25,4 z zakresem od 0-252.
Inne wykonania
Należy zauważyć, że choć wynalazek jest opisany w szczegółowym uprzednim opisie ma on jedynie na celu przykładowe ilustrowanie wykonania wynalazku, ale nie ograniczanie jego zakresu. Inne aspekty, korzyści i modyfikacje mieszczą się w zakresie przedstawionych poniżej zastrzeżeń.
P r z y k ł a d 5 Stabilna transformacja pszenicy sposobem inokulacji nasion
Przygotowanie konstruktu i wprowadzenie do szczepu Agrobacterium LBA4404
Fragment XhoI, Xbal zawierający SulR z pWP258 (patrz Przykład 1) wprowadzono do przeciętego XhoI, Xbal pSB11 (Komari i wsp., Plant J. (1996) 10:165-174) tworząc pFFFII. Fragment Hindlll pUbi-GUSint z pBBB (patrz przykład 1) wklonowano do pFFFII strawionego Hindlll dając pSB11Sulugi (patrz Figura 6).
Konstrukt wprowadzono do szczepu Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB1) (Komari i wsp., 1996) za pomocą elektroporacji i następującej selekcji na 50 mg/l spektynomycyny aby wytworzyć za pomocą rekombinacji superbinarny wektor pSB111Sulugi.
Przygotowanie bakterii do inokulacji
Agrobacterium hodowano i zawieszono stosując sposób z przykładu 1 ale ze zmiennymi ilościami acetosyringonu (0-400 mM) w podłożach do inokulacji.
Inokulacja nasion
Sposób z przykładu 1, eksperymenty zawierające 50-300 zarodków, patrz Tabela 1.
Hodowla tkankowa wyizolowanych zarodków
Patrz przykład 2.
Wyniki
Patrz Tabela 1.
Dane w Tabeli 1 reprezentują udane eksperymenty - wykluczono kilka eksperymentów, w których nie uzyskano roślin. Transformację określano za pomocą jednej lub więcej z następujących metod:
a) Barwienie histochemiczne GUS (Jefferson, 1987) przy najmniej na korzeniach i liściach.
b) Analiza PCR genu su1.
c) Analiza typu Southern.
d) Analiza segregacji pokolenia T1.
Wydajności transformacji
Wydajności transformacji z udanych eksperymentów były porównywalne z lub wyższe od wszystkich opublikowanych wydajności transformacji dla pszenicy (Vasil i wsp., Bio/Technology (1992), 10; 667-674, Weeks i wsp., Plant Physiol. (1993), 102; 1077-1084, Nehra i wsp., Plant J. (1994) 5: 285-297, Becker i wsp., Plant J. (1994) 5: 299-307, Zhou i wsp., Plant Cell Reo. (1995), 15: 159-163, Cheng i wsp. (1997)).
Wzory integracji
Zakres wzorów integracji genów linii transformowanych był od prostych insercji z mendlowskim dziedziczeniem do linii z wieloma kopiami mającymi do siedmiu kopii T-DNA.
P r z y k ł a d 6 Transformacja kukurydzy sposobem inokulacji nasion - przejś ciowa ekspresja i regeneracja transformowanych roś lin
Przygotowanie konstruktów
Jak w przykładzie 1
Albo LBA 4404(pSB131) opisany przez Ishida i wsp., 1997.
Przygotowanie Agrobacterium do eksperymentów
Agrobacterium inkubowano na zestalonych podłożach YEP z odpowiednimi antybiotykami w 27°C przez 2 dni. Bakterie nastę pnie zbierano i ponownie zawieszano w TSIM1 (podł o ż e MS z 100 mg/l mio-inozytolu, 10g/l glukozy, 50 mg/l buforu MES pH 5,5) zawierającego 100-400 mM acetosyringonu do gęstości 2,0-2,4 przy 650 nm.
PL 202 067 B1
Przygotowanie materiału roślinnego
Wycinano fragmenty kukurydzy (Zea mays) odmiana A188 lub Hi II (hodowane w szklarni w 20-35°C, 16 godz. dzień) tak by zawierały przynajmniej węzeł łodygowy poniżej i węzeł łodygowy powyżej kolby, 6-14 dni po dojrzeniu pręcików, i z zachowaniem przynajmniej jednego liścia. Łuski liści z kolby starannie odciąga się by wyeksponować niedojrzałe nasiono i usuwa całe jedwabne włoski. Na kolbę lekko napylono 70% etanol.
Zaszczepianie kolb kukurydzy
Zaszczepianie jak w przykładzie 1. Fragmenty roślin następnie umieszczono w wodzie i liście łusek ponownie umieszczono na kaczanie oraz umieszczono na nich folię plastykową, aby zapobiec odwodnieniu nasion. Materiał następnie umieszczono w oświetlonym inkubatorze w 23-25°C na 2-5 dni. Izolacja i hodowla zarodków
Po kokultywacji kolbę sterylizowano 20 minut w 20% roztworze Domestos. Zarodki następnie izolowano aseptycznie, płukano dwa razy w LSinf (Ishida i wsp., 1997) uzupełnionym 250 mg/l cefotaksymu i przenoszono do podłoża LSD do indukcji kalusów (Ishida i wsp., 1997) na 2-10 dni w ciemności w 25°C.
Zarodki oglądano 2 dni po izolacji w celu badania ekspresji przejściowej i resztę poddano etapowi selekcji, aby zregenerować stabilnie transformowane rośliny kukurydzy jak opisali Ishida i wsp., 1997.
Wyniki
Jak widać w Tabeli 2 inokulacja niedojrzałych zarodków w obrębie nasiona dla kukurydzy doprowadziła do przeniesienia T-DNA i ekspresji genu GUS w obu stosowanych szczepach i dla obu odmian. Choć tylko 3-10% niedojrzałych zarodków wyrażało GUS po kokultywacji, zregenerowano rośliny oporne na fosfinotricynę i wyrażały one gen GUS. Częstości transformacji można uważać za stosunkowo wysokie biorąc pod uwagę fakt, że liczba zarodków wziętych do selekcji była niska. To także wskazuje, że jeśli nawet przeniesienie DNA jest niższe niż w tradycyjnym pełnym systemie in vitro (Ishida i wsp., 1997) inokulacja zarodka w naturalnym środowisku nasiona powoduje adresowanie do komórek, które mają lepszy potencjał do regeneracji.
Wyniki te także pokazują, że powyższa metoda może być stosowana do innych gatunków jednoliściennych i nie jest zależna od odmiany pod względem etapu transformacji.
P r z y k ł a d 7 Wytwarzanie transgenicznych roślin Brassica napus przez zaszczepienie Agrobacterium do podstawy szypułek liścieni
Przygotowanie konstruktu
Fragment Hindlll P35S-nptII-tNOS wyizolowany z pCaMVNEO (Fromm i wsp., Nature (1996), 319: 791-793) wstawiono do pSCV1 (Firek i wsp., Plant Mol. Biol. (1993) 22:129-142) aby uzyskać pSCV1.2. Fragment p35S-gus-intron-polyACaMVHindIII (Vancanneyt i wsp., M.G.G. (1990), 220: 245-250) wstawiono w miejsce Smal pSCV1.2, uzyskując pSCV1.2G1 (Figura 7).
Konstrukt ten wprowadzono do szczepu Agrobacterium tumefaciens C58pMP90 (Koncz i Schell, 1986).
Przygotowanie siewek
Nasiona Brassica napus RV31, odmiana jara, sterylizowano powierzchniowo stosując 15% Domestos przez 20 minut, a następnie długo płukano wodą sterylną aby usunąć patogeny grzybowe i bakteryjne. Nasiona (110) następnie umieszczono na podłożach do kiełkowania (podłoża MS z 20 g/l sacharozy) w słojach Beatsona (10 nasion na słój) i umieszczono w 25°C z 16 godz. fotoperiodem na 3 dni. Siewki w ten sposób skiełkowane są w stadium, gdy liścienie i z nimi związane płatki już wyszły, ale nie są w pełni wykształcone.
Przygotowanie Agrobacterium
C58pMP90 SCV1.2G1 zaszczepiono do 10 ml podłoża mg/l z odpowiednią selekcją antybiotykiem i hodowano w 28°C na wytrząsarce rotacyjnej przez około 24 godziny. Nocną hodowlę następnie żwirowano przy 2000 obr/min przez 20 minut i odrzucono supernatant. Osadzone bakterie ponownie zawieszono w płynnej MS (podłoża MS zawierające 30 g/l sacharozy) do OD650nm około 2,0 (2,175).
Inokulacja Agrobacterium
Zawiesinę bakteryjną (0,5 - 1,0 μθ wstrzyknięto do obszaru na podstawie każdej szypułki liścienia stosując 10 μl strzykawkę Hamiltona. Siewki następnie przenoszono do 20°C na 2 dni.
Indukcja kalusa i regeneracja roślin
Liścienie wycinano z siewek i hodowano zasadniczo jak w metodzie Moloney i wsp., Plant Cell Reports (1989) 8: 238-242. Powierzchnia wyciętych szypułek liścieni Brassica napus hodowanych w ten sposób przechodzi krótki okres rozwoju kalusa z wyeksponowanej tkanki wiązki naczyniowej
PL 202 067 B1 zanim wytworzą się merystemy pędu w tym kalusie w ciągu 8 dni hodowli (Ono i wsp., Plant Cell Reports (1994) 14:13-17).
Wyniki
Zregenerowano 6 transformowanych pędów z 200 wyciętych płatków liścieni, co ustalono za pomocą barwienia X-gluc na gen GUS i analizę PCR na gen NptII, co odpowiada wydajności transformacji 3,0%. Wykazano za pomocą analizy PCR, że jeszcze jedna linia zawiera gen, ale nie miała aktywności GUS sprawdzanej za pomocą barwienia x-gluc. Analiza generacji T1 z 5 transformowanych linii wyrażających GUS za pomocą barwienia x-gluc wykazała transmisję genu GUS do następnego pokolenia z następującymi wynikami:
| Rośliny T1 oceniane pod kątem aktywności GUS | |||
| Linia | Dodatnie | Ujemne | Stosunek |
| 1 | 10 | 10 | 1:1 |
| 2 | 9 | 0 | 9:0 |
| 3 | 21 | 0 | 21:0 |
| 4 | 19 | 0 | 19:0 |
| 5 | 14 | 1 | 14:1 |
Dyskusja
Zaszczepienie Agrobacterium do podstawy szypułek liścieni podczas gdy są jeszcze przyłączone do siewki stanowi wyraźne odejście od opublikowanego systemu transformacji, gdzie szypułki są najpierw wycinane i następnie stosowany jest Agrobacterium. Choć jest to fizycznie trudne do przeprowadza nie, metoda ta okazała się wyjątkowo skuteczna nawet przy niewielkiej wprawie. Po kilku latach doświadczenia stosując standardową opublikowaną metodę i te samą odmianę Brassica napus, można uzyskać rutynową wydajność transformacji 5-10%. Uzyskanie 3,0% przy drugiej próbie (we wstępnym eksperymencie uzyskano 1 transformowany pęd z 80 eksplantów - 1,25%) stosując nowy sposób jest zadziwiające. Oznacza to możliwość za stosowania opisanego sposobu dostarczania genów do dowolnego gatunku, dla którego istnieje system hodowli tkankowej z fazą kalusa - zarówno dla roślin jednoliściennych czy dwuliściennych.
P r z y k ł a d 8 Transformacja soi sposobem inokulacji nasion - ekspresja przejściowa
Przygotowanie konstruktu
Szczep Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 transformowano superbinarnym wektorem pVec 035 zawierającym gen GUS intron sterowany przez promotor 35S CaMV (dostarczony przez B. Pelissier, Aventis Crop Science, Lyon, Francja).
Przygotowanie Agrobacterium do eksperymentów
Agrobacterium inkubowano na zestalonych podłożach YEP z odpowiednimi antybiotykami w 27°C przez 2 dni. Bakterie nastę pnie zbierano i ponownie zawieszano w TSIM1 (podło ż e MS z 100 mg/l mio-inozytolu, 10g/l glukozy, 50 mg/l buforu MES pH 5,5) zawierający 100-400 μΜ acetosyringonu do gęstości 2,0 -2,4 przy 650 nm.
Przygotowanie materiału roślinnego
Rośliny soi Glycine max cv Jack hodowano w szklarni w temperaturze 23-25°C z uzupełnianym światłem, tak aby uzyskać 14 godzinny dzień.
Inokulacja nasion soi
Niedojrzałe zarodki inokulowano gdy zarodki miały 3-7 mm wielkości. Wstrzyknięcie 0,5-1 μl zawiesiny Agrobacterium przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1 przez dostarczenie zawiesiny między dwoma liścieniami, przez strąk i podłużnie do zarodka. Rośliny następnie inkubowano w 23-25°C przez 2-5 dni.
Izolacja i hodowla zarodków
Po kokultywacji niedojrzałe zarodki usuwano i sterylizowano przez 20 minut w 20% roztworze Domestos. Następnie aseptycznie izolowano zarodki i przenoszono do podłoża do indukcji kalusów MSI (podłoże MS i witaminy B5 z 60 g/l sacharozy i 40 mg/l 2,4-D, zestalone 3g/l Phytagel, doprowadzone do pH 7) uzupełnione 350 mg/l cefotaksymu w warunkach świetlnych w 27°C. Po 2-10 dniach zarodki stosowano do histochemicznego barwienia GUS aby ocenić wydajność przeniesienia T-DNA.
Wyniki
Jak pokazano w Tabeli 3, zaszczepienie niedojrzałych zarodków soi w obrębie nasiona i strąka doprowadziło do przeniesienia T-DNA i ekspresji GUS. GUS-dodatnie plamy lub obszary były szeroko rozprzestrzenione na niedojrzałych zarodkach i niekoniecznie były związane z miejscami zranienia (Figura 8). W odróżnieniu od sposobu transformacji SAAT liścieni soi (Santarem i wsp., Plant Cell
PL 202 067 B1
Report (1998), 17: 752-759) ta technika dostarcza łatwiejszy protokół transformacji i wyższy potencjał regeneracji, jako że docelowe komórki nie są zranione.
P r z y k ł a d 9 Transformacja nasion słonecznika za pomocą sposobu inokulacji nasion - ekspresja przejściowa Przygotowanie konstruktu
C58C1(pGV2260) (Simpson i wsp., Plant Mol. Biol. (1986), 6: 403-416) (pBin 19) (Bevan, Nuc. Acids Res. (1984), 12: 8711-8121).
C58MP90 (pSCV1.2GI) (patrz przykład 7).
Przygotowanie Agrobacterium do eksperymentów
Agrobacterium inkubowano na zestalonych podłożach YEP z odpowiednimi antybiotykami w 27°C przez 2 dni. Bakterie następnie zbierano i ponownie zawieszano w TSIM1 (podłoże MS z 100 mg/l mio-inozytolu, 10g/l glukozy, 50 mg/l buforu MES pH 5,5) zawierającym 0-400 μΜ acetosyringonu do gęstości 2,0 -2,4 przy 650 nm.
Przygotowanie materiału roślinnego
Rośliny słonecznika Helianthus annuus cv HA300B hodowano w szklarni 15-30°C z uzupełnionym światłem aby uzyskać 14 godzinny dzień.
Zaszczepianie nasion słonecznika
Niedojrzałe zarodki inokulowano 10 do 25 dni po dojrzeniu pręcików. Wstrzyknięcie 1 μl zawiesiny Agrobacterium przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1 przez mikropor aby dostarczyć to między dwa liścienie. Następnie inkubowano główkę w 22-25°C przez 2-5 dni.
Izolacja i hodowla zarodków
Po kokultywacji niedojrzałe nasiona usuwano i sterylizowano przez 20 minut w 20% roztworze Domestos. Następnie aseptycznie izolowano zarodki i przenoszono do podłoża do indukcji kalusów (podłoże MS z 30 g/l sacharozy, zestalone agarem 10g/l, pH 5,7 i uzupełnione 0,5 mg/l NAA, 0,5 g/l BAP i 500 mg/l cefatoksymem) i hodowano w 21-24°C, 16 godzinny dzień, 30 mEm-2s-1PAR. Po 2-10 dniach zarodki stosowano do histochemicznego barwienia GUS aby ocenić wydajność przeniesienia T-DNA.
Jak pokazano w Tabeli 4, inokulacja niedojrzałych zarodków słonecznika w obrębie nasiona doprowadziła do transferu T-DNA i ekspresji genu GUS z obydwoma stosowanymi szczepami (5,9-65,4%). GUS dodatnie plamy zlokalizowano głównie na liścieniach, ale zlokalizowano także zdarzenia transformacji w hipokotylu. Tylko dwa doświadczenia były przeprowadzone aby ocenić potencjał metody inokulacji nasion do transformacji niedojrzałych zarodków słonecznika. Nieoczekiwanie, okazała się być bardzo skuteczna choć kluczowym parametrem wydaje się być rozwój niedojrzałych zarodków.
Claims (33)
1. Sposób transformacji obejmujący inokulację i kokultywację docelowej tkanki z docelowej rośliny z Agrobacterium, w czasie gdy tkanka docelowa jest w swoim naturalnym środowisku roślinnym, a następnie wytworzenie rośliny transgenicznej przez odróżnicowanie i regenerację tkanki docelowej, znamienny tym, że inokulację prowadzi się przez bezpośrednie i aktywne podanie Agrobacterium do tkanki.
2. Sposób transformacji według zastrz. 1, znamienny tym, że roślina transgeniczna jest rośliną płodną.
3. Sposób transformacji według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zranienie komórek docelowych w docelowej tkance jest utrzymywane na minimalnym poziomie lub całkowicie wykluczone.
4. Sposób transformacji według jednego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że przynajmniej część odróżnicowania tkanki docelowej przeprowadza się in vitro.
5. Sposób transformacji według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że roślina docelowa jest dwuliścienna lub jednoliścienna.
6. Sposób transformacji według zastrz. 5, znamienny tym, że roślina docelowa należy do rodziny Gramineae.
7. Sposób transformacji według zastrz. 6, znamienny tym, że roślina docelowa jest wybrana z grupy składającej się z pszenicy, jęczmienia, kukurydzy, ryżu, owsa, żyta, sorgo i prosa.
8. Sposób transformacji według zastrz. 5, znamienny tym, że roślina docelowa jest wybrana z grupy składającej się z rzepaku, papryki, soi, słonecznika, buraka cukrowego, dyniowatych, szparaga, cebuli, palmy olejowej, jam i banana.
PL 202 067 B1
9. Sposób transformacji według jednego z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że docelowa tkanka jest zarodkiem, kwiatostanem, zalążnią, szypułką liścia lub pylnikiem.
10. Sposób transformacji według jednego z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że docelowa tkanka jest niedojrzałym zarodkiem, niedojrzałym kwiatostanem, niedojrzałą zalążnią lub niedojrzałym pylnikiem.
11. Sposób transformacji według zastrz. 10, znamienny tym, że docelowym obszarem dla inokulacji jest styk między dwoma warstwami komórek, które są w ścisłym kontakcie.
12. Sposób transformacji według jednego z zastrz. od 1 do 11, znamienny tym, że około czasu inokulacji Agrobacterium nie jest dodawany czynnik indukujący Agrobacterium vir.
13. Sposób transformacji według jednego z zastrz. od 1 do 12, znamienny tym, że około czasu kokultywacji Agrobacterium nie jest dodawany indukujący czynnik Agrobacterium vir.
14. Sposób transformacji według jednego z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że inokulację Agrobacterium prowadzi się przez iniekcję zawiesiny Agrobacterium do tkanki docelowej za pomocą strzykawki.
15. Sposób transformacji według jednego z zastrz. od 1 do 14, znamienny tym, że inokulację Agrobacterium prowadzi się z minimalnymi uszkodzeniami tkanki docelowej.
16. Sposób transformacji według zastrz. 1, znamienny tym, że transfomowaną docelową tkanką roślinną jest kalus, korzeń, pęd lub cała roślina (korzystnie płodna), nasiono lub inny materiał zdolny do reprodukcji.
17. Sposób transformacji obejmujący inokulację i kokultywację docelowej tkanki z docelowej rośliny z Agrobacterium, w czasie gdy tkanka docelowa jest w swoim naturalnym środowisku roślinnym, a nastę pnie wytworzenie odróż nicowanej tkanki z tkanki docelowej, znamienny tym, ż e inokulację prowadzi się przez bezpośrednie i aktywne podanie Agrobacterium do tkanki.
18. Sposób transformacji według zastrz. 17, znamienny tym, że zranienie komórek docelowych w docelowej tkance jest utrzymywane na minimalnym poziomie lub całkowicie wykluczone.
19. Sposób transformacji według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że przynajmniej część odróżnicowania tkanki docelowej przeprowadza się in vitro.
20. Sposób transformacji według dowolnego z zastrz. 17-19, znamienny tym, że roślina docelowa jest dwuliścienna lub jednoliścienna.
21. Sposób transformacji według zastrz. 20, znamienny tym, że roślina docelowa należy do rodziny Gramineae.
22. Sposób transformacji według zastrz. 21, znamienny tym, że roślina docelowa jest wybrana z grupy składającej się z pszenicy, jęczmienia , kukurydzy, ryżu, owsa, żyta, sorgo i prosa.
23. Sposób transformacji według zastrz. 20, znamienny tym, że roślina docelowa jest wybrana z grupy skł adają cej się z rzepaku, papryki, soi, sł onecznika, buraka cukrowego, dyniowatych, szparaga, cebuli, palmy olejowej, jam i banana.
24. Sposób transformacji według jednego z zastrz. 17-23, znamienny tym, że docelowa tkanka jest zarodkiem, kwiatostanem, zalążnią, szypułką liścia lub pylnikiem.
25. Sposób transformacji według jednego z zastrz. 17-23, znamienny tym, że docelowa tkanka jest niedojrzałym zarodkiem, niedojrzałym kwiatostanem, niedojrzałą zalążnią lub niedojrzałym pylnikiem.
26. Sposób transformacji według zastrz. 25, znamienny tym, że docelowym obszarem dla inokulacji jest styk między dwoma warstwami komórek, które są w ścisłym kontakcie.
27. Sposób transformacji według jednego z zastrz. 17-26, znamienny tym, że około czasu inokulacji Agrobacterium nie jest dodawany czynnik indukujący Agrobacterium vir.
28. Sposób transformacji według jednego z zastrz. 17-27, znamienny tym, że około czasu kokultywacji Agrobacterium nie jest dodawany indukujący czynnik Agrobacterium vir.
29. Sposób transformacji według jednego z zastrz. 17-28, znamienny tym, że inokulację Agrobacterium prowadzi się przez iniekcję zawiesiny Agrobacterium do tkanki docelowej za pomocą strzykawki.
30. Sposób transformacji według jednego z zastrz. od 17-29, znamienny tym, że inokulację Agrobacterium prowadzi się z minimalnymi uszkodzeniami tkanki docelowej.
31. Sposób transformacji według zastrz. 17, znamienny tym, że transfomowaną docelową tkanką roślinną jest kalus, korzeń, pęd lub cała roślina (korzystnie płodna), nasiono lub inny materiał zdolny do reprodukcji.
32. Zastosowanie Agrobacterium w sposobie transformacji obejmującym inokulację i kokultywację docelowej tkanki z docelowej rośliny z Agrobacterium, w czasie gdy tkanka docelowa jest w swoim naturalnym środowisku roślinnym, a następnie wytwarzanie materiału rośliny transgenicznej przez
PL 202 067 B1 odróżnicowanie tkanki docelowej, znamienne tym, że inokulacja jest prowadzona przez bezpośrednie i aktywne podanie Agrobacterium do tkanki.
33. Zastosowanie Agrobacterium według zastrz. 32, znamienne tym, że transgeniczny materiał roślinny jest odróżnicowywany i ewentualnie regenerowany w celu wytworzenia kalusa, korzenia, pędu lub materiału roślinnego (korzystnie płodnego).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99420097 | 1999-04-19 | ||
| PCT/EP2000/004177 WO2000063398A1 (en) | 1999-04-19 | 2000-04-19 | Plant transformation method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL351895A1 PL351895A1 (en) | 2003-06-30 |
| PL202067B1 true PL202067B1 (pl) | 2009-05-29 |
Family
ID=8242287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL351895A PL202067B1 (pl) | 1999-04-19 | 2000-04-19 | Sposoby transformacji roślin oraz zastosowanie Agrobacterium w sposobie transformacji |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7285705B1 (pl) |
| EP (1) | EP1171621B1 (pl) |
| JP (1) | JP2002541853A (pl) |
| CN (1) | CN1347457A (pl) |
| AR (1) | AR023576A1 (pl) |
| AT (1) | ATE312183T1 (pl) |
| AU (1) | AU775949B2 (pl) |
| BG (1) | BG106105A (pl) |
| BR (1) | BR0011140A (pl) |
| CA (1) | CA2369428C (pl) |
| CZ (1) | CZ301610B6 (pl) |
| DE (1) | DE60024607T2 (pl) |
| DK (1) | DK1171621T3 (pl) |
| ES (1) | ES2252008T3 (pl) |
| HU (1) | HU228627B1 (pl) |
| IL (1) | IL145686A0 (pl) |
| PL (1) | PL202067B1 (pl) |
| WO (1) | WO2000063398A1 (pl) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6586661B1 (en) | 1997-06-12 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid |
| AU2001286843A1 (en) | 2000-08-30 | 2002-03-13 | North Carolina State University | Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein |
| DE60128149D1 (en) | 2000-11-07 | 2007-06-06 | Univ North Carolina State | Putrescin-n-methyltransferasepromotor |
| CN1638655A (zh) | 2001-06-08 | 2005-07-13 | 韦克多烟草有限公司 | 修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平 |
| AU2005268917B2 (en) | 2004-08-02 | 2010-05-20 | Basf Plant Science Gmbh | Method for isolation of transcription termination sequences |
| EP2166099B1 (en) | 2005-03-08 | 2012-12-19 | BASF Plant Science GmbH | Expression enhancing intron sequences |
| CN100360677C (zh) * | 2005-05-13 | 2008-01-09 | 吉林省农业科学院 | 一种植物转基因方法 |
| BRPI0612671A2 (pt) | 2005-06-23 | 2010-11-30 | Basf Plant Science Gmbh | métodos melhorados para a produção de plantas férteis zea mays (milho) estavelmente transformadas |
| EP2100962A1 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-16 | Biogemma | Plants having improved resistance to pathogens |
| CN102802405A (zh) | 2009-06-11 | 2012-11-28 | 先正达参股股份有限公司 | 原位核酸短暂表达的一种方法 |
| CA2768955C (en) | 2009-07-29 | 2018-07-17 | Japan Tobacco Inc. | A method of gene introduction into triticum plant using agrobacterium, and a method of producing transformed triticum plant |
| EP2354232A1 (en) | 2010-02-08 | 2011-08-10 | Genoplante-Valor | Improvement of the grain filling of wheat through the modulation of NADH-glutamate synthase activity |
| AU2011275697B2 (en) | 2010-07-09 | 2016-07-21 | Genoplante-Valor | Preformed defense in plants |
| WO2012038528A1 (en) | 2010-09-23 | 2012-03-29 | Genoplante-Valor | Plants resistant to fungal pathogens and methods for production thereof |
| WO2013097940A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Genoplante-Valor | Plants having a modulated content in seed proteins and method for production thereof |
| EP2687605A1 (en) | 2012-07-19 | 2014-01-22 | Biogemma | Method for performing homologous recombination |
| EP2722391A1 (en) | 2012-10-22 | 2014-04-23 | Biogemma | Method for plant improvement |
| EP3075741A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-05 | Biogemma | Method of plant improvement using aspartate kinase - homoserine dehydrogenase |
| EP3130675A1 (en) | 2015-08-10 | 2017-02-15 | Genoplante-Valor | Method for plant improvement |
| CN106755083B (zh) * | 2016-12-22 | 2019-06-14 | 中国科学院华南植物园 | 一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法 |
| EP3704140A1 (en) | 2017-10-31 | 2020-09-09 | Vilmorin & Cie | Wheat comprising male fertility restorer alleles |
| WO2020161261A1 (en) | 2019-02-06 | 2020-08-13 | Vilmorin & Cie | New gene responsible for cytoplasmic male sterility |
| CN118613587A (zh) | 2021-10-19 | 2024-09-06 | 利马格兰集团 | 植物中的靶向基因整合 |
| CN114223426A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-25 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种单子叶植物叶片液体注射方法 |
| EP4311430A1 (en) | 2022-07-28 | 2024-01-31 | Limagrain Europe | Chlorotoluron tolerance gene and methods of use thereof |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5102796A (en) * | 1983-04-15 | 1992-04-07 | Lubrizol Genetics, Inc. | Plant structural gene expression |
| US4658082A (en) * | 1984-07-25 | 1987-04-14 | Atlantic Richfield Company | Method for producing intact plants containing foreign DNA |
| US6664109B2 (en) * | 1985-01-17 | 2003-12-16 | Calgene Llc | Transformation system with Ti or Ri plasmid |
| US5024944A (en) * | 1986-08-04 | 1991-06-18 | Lubrizol Genetics, Inc. | Transformation, somatic embryogenesis and whole plant regeneration method for Glycine species |
| DK0672752T3 (da) * | 1993-09-03 | 2004-10-04 | Japan Tobacco Inc | Fremgangsmåde til transformering af monocotyledoner ved anvendelse af scutella af uudviklede embryoner |
| CZ86798A3 (cs) * | 1996-06-21 | 1999-03-17 | Monsanto Company | Fertilní transgenní rostlina pšenice, způsob její přípravy, buňky a semena této rostliny |
| ES2151338B1 (es) * | 1997-03-05 | 2001-07-01 | Inia | Procedimiento de transformacion genetica de plantas adultas de especies leñosas. |
| UY25037A1 (es) * | 1997-06-13 | 1998-12-11 | Shell Int Research | Un proceso para producir material vegetal modificado geneticamente que comprende una o mas secuencias de adn de interes establemente incorporadas |
| FI104907B (fi) * | 1997-09-18 | 2000-04-28 | Univ Helsinki Licensing | Rypsin Agrobacterium-välitteinen transformaatio |
| US5994624A (en) * | 1997-10-20 | 1999-11-30 | Cotton Incorporated | In planta method for the production of transgenic plants |
-
2000
- 2000-04-19 CZ CZ20013744A patent/CZ301610B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-04-19 BR BR0011140-6A patent/BR0011140A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-04-19 WO PCT/EP2000/004177 patent/WO2000063398A1/en not_active Ceased
- 2000-04-19 CA CA2369428A patent/CA2369428C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-19 AR ARP000101883A patent/AR023576A1/es active IP Right Grant
- 2000-04-19 HU HU0200926A patent/HU228627B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-04-19 IL IL14568600A patent/IL145686A0/xx unknown
- 2000-04-19 US US09/959,137 patent/US7285705B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-19 AU AU50650/00A patent/AU775949B2/en not_active Ceased
- 2000-04-19 EP EP00935000A patent/EP1171621B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-19 ES ES00935000T patent/ES2252008T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-19 CN CN00806271A patent/CN1347457A/zh active Pending
- 2000-04-19 PL PL351895A patent/PL202067B1/pl unknown
- 2000-04-19 JP JP2000612477A patent/JP2002541853A/ja not_active Withdrawn
- 2000-04-19 DE DE60024607T patent/DE60024607T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-19 AT AT00935000T patent/ATE312183T1/de active
- 2000-04-19 DK DK00935000T patent/DK1171621T3/da active
-
2001
- 2001-11-13 BG BG106105A patent/BG106105A/bg unknown
-
2007
- 2007-08-10 US US11/837,143 patent/US7803988B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-09-27 US US12/891,056 patent/US8115061B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2369428C (en) | 2011-06-28 |
| CN1347457A (zh) | 2002-05-01 |
| ATE312183T1 (de) | 2005-12-15 |
| AU775949B2 (en) | 2004-08-19 |
| AU5065000A (en) | 2000-11-02 |
| US20080047036A1 (en) | 2008-02-21 |
| BR0011140A (pt) | 2002-02-26 |
| EP1171621B1 (en) | 2005-12-07 |
| JP2002541853A (ja) | 2002-12-10 |
| ES2252008T3 (es) | 2006-05-16 |
| CZ20013744A3 (cs) | 2002-01-16 |
| CZ301610B6 (cs) | 2010-04-28 |
| US7285705B1 (en) | 2007-10-23 |
| CA2369428A1 (en) | 2000-10-26 |
| AR023576A1 (es) | 2002-09-04 |
| US8115061B2 (en) | 2012-02-14 |
| DK1171621T3 (da) | 2006-03-13 |
| PL351895A1 (en) | 2003-06-30 |
| DE60024607T2 (de) | 2006-08-10 |
| IL145686A0 (en) | 2002-06-30 |
| EP1171621A1 (en) | 2002-01-16 |
| BG106105A (bg) | 2002-06-28 |
| WO2000063398A1 (en) | 2000-10-26 |
| DE60024607D1 (de) | 2006-01-12 |
| HUP0200926A2 (en) | 2002-07-29 |
| US20110078827A1 (en) | 2011-03-31 |
| HU228627B1 (hu) | 2013-04-29 |
| US7803988B2 (en) | 2010-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7803988B2 (en) | Plant transformation method | |
| Hiei et al. | Improved protocols for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens | |
| Atif et al. | Gene transfer in legumes | |
| Olhoft et al. | L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells | |
| AU738153B2 (en) | Methods for the production of stably-transformed, fertile wheat employing agrobacterium-mediated transformation and compositions derived therefrom | |
| US6420630B1 (en) | Methods for tissue culturing and transforming elite inbreds of Zea mays L. | |
| Zheng et al. | Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Allium cepa L.: the production of transgenic onions and shallots | |
| US20120192318A1 (en) | Transformation system for Camelina sativa | |
| AU2007204597B2 (en) | Method of producing transgenic graminaceous cells and plants | |
| JP2002533090A (ja) | 植物形質転換法 | |
| US20040123342A1 (en) | Monocotyledonous plant transformation | |
| Karthikeyan et al. | Agrobacterium-mediated transformation of leaf base derived callus tissues of popular indica rice (Oryza sativa L. sub sp. indica cv. ADT 43) | |
| Spiral et al. | Transgenic coffee (Coffea species) | |
| Bao-Feng et al. | Agrobacterium-mediated transformation of Kentucky bluegrass | |
| Kudo et al. | TRANSFORMATION OF CHRYSANTHEMUM (DENDRANTHEMA GRANDI-FLORUM (RAMAT.) KITAMURA) VIA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS | |
| Begum et al. | INHERITED ALTERATION UTILIZING THE COTYLEDONARY NODE OF PEANUTS (ARACHIS HYPOGAEA L.) AS A TRANSPLANT AND A PROMOTER-LESS GUS:: EPSPS FUSION GENE-DERIVED VECTOR. | |
| Firoozabady et al. | Agrobacterium-mediated transformation | |
| Ozcan | Tissue culture in pea and engineering a marker gene for specific expression in target cells for plant transformation | |
| Aragäo | Genetic transformation of common bean via particle bombardment | |
| Sumithra | Genetic transformation studies in cotton | |
| Otani et al. | Transgenic Sweet Potato (Ipomoea batatas L. Lam.) | |
| Luo | Soybean transformation and analysis of transformed tissues using PCR | |
| VIA | FRANCISCO JL ARAGÃO |