PL202340B1 - Pochodna benzoporfiryny, sposób jej wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca oraz jej zastosowanie jako czynnika fotoaktywnego - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest projektowanie i synteza zwi azków przydatnych w terapii fotodyna- micznej i w pokrewnych zastosowaniach technologii zwi azków fotoaktywnych. W szczególno sci przed- miotem wynalazku jest pochodna benzoporfiryny, sposób jej wytwarzania, kompozycja farmaceutycz- na j a zawieraj aca oraz jej zastosowanie jako czynnika fotoaktywnego. Wynalazek umo zliwia wytwa- rzania pewnej klasy pochodnych benzoporfiryn z kontrolowan a mo zliwo scia uzyskiwania pochodnych na trzech z czterech podstawników karboksylowych. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest projektowanie i synteza związków przydatnych w terapii fotodynamicznej i w pokrewnych zastosowaniach technologii związków fotoaktywnych. W szczególności przedmiotem wynalazku jest pochodna benzoporfiryny, sposób jej wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca oraz jej zastosowanie jako czynnika fotoaktywnego.

Wynalazek umożliwia wytwarzania pewnej klasy pochodnych benzoporfiryn z kontrolowaną możliwością uzyskiwania pochodnych na trzech z czterech podstawników karboksylowych.

Terapia fotodynamiczna (photodynamic therapy - PDT) polega zasadniczo na podawaniu związków zdolnych do absorpcji światła, typowo z zakresu widzialnego lecz także z zakresu bliskiego ultrafioletu, a następnie na naświetlaniu określonych miejsc obiektu, w których to miejscach chce się uzyskać żądany efekt toksyczny, modyfikujący lub inhibitujący. Początkowo w terapii PDT stosowano hematoporfirynę i związki pokrewne w leczeniu nowotworów gdyż okazało się, że związki te lokują się w miejscach zawierających szybko dzielące się komórki. Następnie nowotwór naświetlano światłem absorbowanym przez hematoporfirynę co powodowało rozpad (destrukcję) otaczającej tkanki. Wykazano później, że terapia PDT przydatna jest w leczeniu płytek miażdżycowych tętnic, łuszczycy i w leczeniu chorób ocznych niekoniecznie zwią zanych z nowotworami.

W patencie Stanów Zjednoczonych US Patent Nr 5,171,749 i patentach udzielonych dla pokrewnych zastosowań US Patent Nr 5,283,255; 5,399,583; 4,883,790; 4,920,143 i 5,095,030 (wszystkie włączono tutaj jako odnośniki) opisano i zastrzeżono klasę związków fotoaktywnych w terapii PDF określoną jako monohydrobenzoporfiryny lub „BPD. Tę klasę związków otrzymano w reakcji Dielsa-Aldera pomiędzy mono- lub dipodstawionym alkinem a protoporfiryną-IX; uzyskane związki można poddawać dalej izomeryzacji, redukcji i/lub przekształcaniu w pochodne otrzymując wielką klasę związków BPD. Jak ujawniono w tych patentach szczególnie przydatna podklasa tej grupy związków pochodzi z hydrolizy lub częściowej hydrolizy grup estrowych w 2-karboksyetylowych łańcuchach bocznych w pierścieniach C i D. Zabezpieczenie tych grup poprzez estryfikację podczas reakcji Dielsa-Aldera prowadzi początkowo do powstania produktów zawierających grupy 2-karboalkoksyetylowe. Stwierdzono, że można łatwo przeprowadzić hydrolizę tych grup pozostawiając wszystkie grupy karboalkoksylowe produktu reakcji Dielsa-Aldera pochodzące z dikarboalkoksyalkinu zasadniczo całkowicie niezhydrolizowane. Prowadzi to uzyskania czterech źródłowych związków przedstawionych na Rysunku 1: BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA i BPD-DB; rysunek ten zaczerpnięto z patentu US Patent Nr 5,171,749. Na rysunku tym R¹ i R² oznaczają grupy karboalkoksylowe, typowo grupę karbometoksylową lub karboetoksylową i R oznacza alkil (1-6C).

Zbliżone związki opisano również w publikacji Can.J.Chem., 75,262-275 (1997).

Stwierdzono, że BPD-MA posiadają szczególnie korzystne właściwości dla terapii PDT i są aktualnie badane i stosowane klinicznie. Niemniej jednak istnieje nadal potrzeba opracowania dodatkowych specyficznych form czynników fotoaktywnych tak aby rozszerzyć repertuar związków fotoaktywnych do stosowania przy rozmaitych wskazaniach medycznych, w których, jak wspomniano powyżej, stosuje się terapię PDT. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania dotychczas nieujawnionych i niedostępnych przedstawicieli klasy związków pokrewnych do związków ujawnionych w wyżej cytowanych patentach; specyficzne i kontrolowane przekształcanie w tych związkach trzech podstawników karboksylowych w pochodne prowadzi do uzyskania nowej grupy związków fotoaktywnych o pożądanych właściwościach. Do związków tych należy forma „trikwasu jak również szczególnie przydatny homotriester, w którym wszystkie trzy grupy karboksylowe trikwasu zestryfikowane są glikolem etylenowym.

Związek i sposób według wynalazku stanowią szczególnie użyteczne uzupełnienia w repertuarze związków przydatnych w terapii fotodynamicznej jak również stanowią sposób na metodyczne rozszerzanie tego repertuaru. W metodach według wynalazku wykorzystuje się możliwość dopracowania warunków reakcji hydrolizy w taki sposób aby otrzymać w reakcji dotychczas nieujawnioną formę trikwasu dla grupy monohydrobenzoporfirynowych związków fotoaktywnych oraz możliwość przeprowadzania w sposób kontrolowany otrzymanych trzech grup karboksylowych w pochodne.

PL 202 340 B1

Przedmiotem wynalazku jest pochodna benzoporfiryny o wzorze:

i jego sole, w którym:

R^{1 * *} oznacza alkil (1-6C);

Y oznacza -OH; n oznacza liczbę cał kowitą 1-6 każdy X oznacza niezależnie -OH lub -OR⁴, w którym R⁴ oznacza niepodstawiony rodnik węglowodorowy 1-10C i

R⁵ oznacza winyl.

Korzystnie, Y i oba X oznaczają -OH i n oznacza 2.

PL 202 340 B1

Korzystnie, pochodna ta stanowi „trikwas o wzorze:

Korzystnie, Y oznacza OH i oba X oznaczają -OR⁶, w którym R⁶ oznacza niższy alkil (1-4C). Szczególnie korzystna jest pochodna o wzorze:

w którym n oznacza 2 i R⁵ oznacza winyl.

PL 202 340 B1

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnej benzoporfiryny o wzorze:

i jego soli, w którym:

R^{1 * * *} oznacza alkil (1-6C); n oznacza liczbę cał kowitą 1-6; i w którym R⁵ oznacza winyl, polegający na tym, że obejmuje poddanie mono-, di- lub tri-zestryfikowanej formy wymienionego powyżej związku produktowego lub jego soli, reakcji z zasadą i rozpuszczalnikiem w czasie wystarczająco długim na przeprowadzenie dezestryfikacji (hydrolizy) i otrzymanie końcowego związku.

Korzystnie, wymienioną reakcję przeprowadza się w atmosferze obojętnej zapobiegającej utlenianiu; i/lub w którym wymienioną zasadą jest wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek litu, wodorotlenek wapnia, wodorotlenek baru, wodorotlenek chromu, lub wodorotlenek tetraalkiloamoniowy; i/lub w którym rozpuszczalnikiem jest DMSO, niskocząsteczkowy alkohol, DMF, THF lub woda lub ich mieszaniny; i/lub w którym wymienion ą oboję tną atmosferę stanowi gaz azot, hel lub argon; i/lub

PL 202 340 B1 w którym wymienioną reakcję przeprowadza się w temperaturze okoł o 0-60°C; i/lub w którym wymienioną reakcję przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez około 2-48 godzin.

Korzystnie, sposób ten obejmuje dalej rozpuszczenie każdego związku produktowego, jego soli w wodzie i dodanie dostatecznej iloś ci kwasu celem wytrącenia wymienionego związku końcowego.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca pochodną według wynalazku w mieszaninie z dopuszczalnym farmaceutycznie rozczynnikiem.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnej według wynalazku jako czynnika fotoaktywnego do wytwarzania kompozycji przeznaczonej do przeprowadzania terapii fotodynamicznej PDT.

Należy zauważyć, że związki 1 i 2 różnią się jedynie umiejscowieniem podstawnika Dielsa-Aldera w pierścieniu A w porównaniu do pierścienia B. Oba te produkty powstają albowiem protoporfiryna IX, materiał wyjściowy przy otrzymywaniu związków 1 i 2, nie jest symetrycznie podstawiona w tych pierścieniach. Z drugiej strony, związek o wzorze 3 pochodzi z podobnego przyłączenia Dielsa-Aldera do protoporfiryny III; a związek o wzorze 4 z przyłączenia Dielsa-Aldera do protoporfiryny XIII. Ponieważ te protoporfiryny są symetryczne powstaje w każdym przypadku tylko jeden produkt.

Krótki opis rysunków

Rysunek 1 przedstawia znane poprzednio w dziedzinie związki BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA i BPD-DB.

Rysunki 2A i 2B pokazują fotouczulanie (fotosensybilizację) komórek L1210 in vitro przez B3 w funkcji stężenia.

Rysunek 3 przedstawia wychwytywanie B3 w czasie przez komórki L1210.

Rysunek 4 przedstawia kinetykę uwalniania B3 z komórek L1210 po 1 godzinnej inkubacji.

Rysunek 5 przedstawia rozmieszczenie (biodystrybucję) B3 w tkankach myszy.

Sposoby realizacji wynalazku

Związki o wzorach 1-4 według wynalazku są analogiczne do związków przedstawionych w patencie US Patent Nr 5,171,749 i poprzedzających go patentach US Patent Nr 5,283,255; 5,399,583; 4,883,790; 4,920,143 i 5,095,030. Związki według wynalazku różnią się od związków przytoczonych w tych patentach przekształ ceniem w pochodne trzech grup karboksylowych co pokazano na tych wzorach jako „COY i „COX. Wytwarzanie takich związków było niemożliwe z uwagi na trudności napotkane przy hydrolizie grupy karboalkoksylowej w pozycji zajmowanej przez „COY. Niniejszy wynalazek stwarza możliwość dostępu do tej grupy karboalkoksylowej i pozwala na przeprowadzenie syntezy różnych związków fotoaktywnych dotychczas niedostępnych.

Dla ułatwienia dyskusji podstawnik „COY będzie określany jako „karboksyl winylowy nie zważając na znaczenie Y w dyskutowanym związku. Grupy oznaczone „COX będą określane jako „karboksyl propionowy ponownie niezależnie od konkretnego znaczenia X lub n w dowolnym określonym związku.

Autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że w odpowiednio dobranych warunkach hydrolizy karboksylowa grupa winylowa staje się dostępna. Aczkolwiek karboksylowe grupy propionowe łatwo poddają się reakcjom deestryfikacji (hydrolizy), ponownej estryfikacji lub dalszym przemianom w pochodne to winylowa grupa karboksylową w formie estru alkilowego jest bardziej odporna na hydrolizę i, istotnie, aby hydroliza tej grupy zakończyła się powodzeniem należy ją przeprowadzić w warunkach zapobiegających utlenianiu lub rozpadowi cząsteczki.

Możliwość hydrolizy winylowej grupy karboksylowej, jej dostępność, pociąga za sobą ważne konsekwencje. Po pierwsze, tak otrzymany trikwas jest sam w sobie ważnym nowym związkiem fotoaktywnym. Po drugie, ponieważ propionowe grupy karboksylowe są najbardziej reaktywne można je łatwo ponownie estryfikować celem zabezpieczania i wówczas aktywować karboksyl winylowy celem dalszego podstawiania. Tak więc można otrzymać serie związków, w których propionowe grupy karboksylowe występują albo w formie wolnych kwasów i soli lub prostych estrów lub amidów lub acylohydrazydów, i w których karboksyl winylowy jest wolnym kwasem lub solą lub jest przeprowadzony w pochodną taką jak złożony ester lub amid lub acylohydrazyd.

Związki według wynalazku występują w formie izomerów optycznych. Niezależnie od tego czy został przeprowadzony rozdział na indywidualne izomery optyczne czy też nie związki uzyskane poprzez wytworzenie pochodnych na winylowej grupie karboksylowej są przydatne jako czynniki fotoaktywne. Dysponowanie dodatkowymi związkami do istniejącego repertuaru związków fotoaktywnych umożliwia ich dopasowanie do konkretnych wskazań medycznych i indywidualnych pacjentów.

PL 202 340 B1

Możliwość manipulowania winylową grupą karboksylową (dostępność do niej) pozwala również na wytwarzanie czynników fotoaktywnych, w których wszystkie trzy grupy karboksylowe (karboksyl winylowy i karboksyle propionowe) przekształcone są w identyczne pochodne co daje jeszcze inne związki wzbogacając repertuar związków fotoaktywnych. Na koniec, oczywiste jest, że różnorodność kombinacji podstawników na trzech omawianych grupach karboksylowych daje całą grupę - przedział związków, przy czym przedział ten jest jeszcze rozszerzony przez rozmaitość możliwych do otrzymania R⁵ w rezultacie przeprowadzenia w pochodne podstawnika winylowego.

Tak więc, nawet bez dopracowywania warunków tak aby tylko jedna z karboksylowych grup propionowych poddana była reakcji i abstrahując od różnych podstawień na R⁵, możliwe są kombinacje pokazane w Tabeli 1.

T a b e l a 1 winylowa grupa propionowa grupa karboksylowa karboksylowa

Y= X=

X-1 -OH -OH

X-2 -OH -OR4 w której OH oznacza wolny kwas lub sól, w zależ noś ci od pH.

Aby otrzymać związki Grupy X-1, produkt Dielsa-Aldera, lub każdą bardziej zestryfikowaną w winylowych i propionowych grupach karboksylowych formę, poddaje się hydrolizie w opisanych tutaj warunkach do uzyskania formy trikwasu. Aby otrzymać związki Grupy X-2, propionowe grupy karboksylowe ponownie estryfikuje się lub przeprowadza w amidy stosując standardowe metody albowiem grupy te są znacznie bardziej reaktywne niż winylowa grupa karboksylowa.

Stosując te metody otrzymano szczególnie korzystny związek oznaczony w dalszej części opisu jako „B3 jak to przedstawiono w Przykładzie 3, poniżej.

Poniżej przedstawiono Schemat Reakcji ilustrujący wytwarzanie tych związków.

Na Schemacie Reakcji pokazano przekształcenie przejściowego trikwasu, otrzymanego sposobem według wynalazku, w związki Grupy X-2 poprzez prostą estryfikację w standardowych warunkach propionowych grup karboksylowych. Takimi standardowymi warunkami jest działanie na przejściowy trikwas odpowiednim alkoholem w obecności takiego kwasu jak kwas siarkowy, chlorowodorowy, trifluorometanosulfonowy lub innego odpowiedniego kwasu.

PL 202 340 B1

Zilustrowane tutaj przekształcenie pokazuje podstawnik Dielsa-Aldera w pierścieniu B pochodzący z protoporfiryny IX, tj. ze związku o wzorze 2, i podstawnik winylowy na R⁵; niemniej jednak Schemat Reakcji 1 dotyczy generalnie związków według wynalazku i po prostu podano go jako ilustrację.

Szczególnie korzystnymi produktami powstającymi według tego schematu reakcji są podane powyżej związki o wzorach 13-14. Związki te można użyć do przygotowania kompozycji terapeutycznych do zastosowania w terapii PDT.

Podstawniki w związkach BPD według wynalazku opisane są poprzez charakterystykę R¹-R⁵. Terminologię definiuje się dalej w sposób następujący:

Zastosowany tutaj termin „alkil odnosi się do nasyconego prostego lub rozgałęzionego łańcucha węglowodorowego, który, gdy posiada dostateczną liczbę atomów węgla, może być cykliczny lub zawierać część cykliczną. Typowymi przykładami są metyl, etyl, t-butyl, cykloheksyl, i tym podobne.

Termin „rodnik węglowodorowy oznacza jednowartościowy podstawnik zawierający jedynie węgiel i wodór stanowiące łańcuch prosty lub rozgałęziony, nasycony lub nienasycony, aromatyczny lub niearomatyczny lub mieszany, i który może być cykliczny lub niecykliczny. Tak więc, do rodników węglowodorowych 1-10C należą cyklopentyloetyl, 2-pentenyl, 3-butynyl, 2,4-dimetyloheksyl, i tym podobne.

Należy zauważyć, że związki według wynalazku mogą zawierać jedno lub więcej centrum chiralne i wskutek tego występować w formach enancjomerycznych lub diastereoizomerycznych. Wzory 1-4, reprezentujące związki według wynalazku, oznaczają więc optycznie czyste enancjomery lub diestereoizomery lub mogą być mieszaninami racemicznymi lub mieszaninami diestereoizomerów.

Jak opisano dalej w wymienionych powyżej patentach dotyczących BPD związki według wynalazku można, w miarę potrzeby, sprzęgać z czynnikiem nakierowującym (targeting agent), który będzie doprowadzał cząsteczkę do specyficznej tkanki lub organu. Takimi czynnikami nakierowującymi są przeciwciała, receptory, połączenia receptor-ligand i tym podobne. Przyłączenie czynnika nakierowującego do związku przeprowadza się standardowymi technikami. Zastosowany tutaj termin „formy sprzężone odnosi się do związków o wzorach 1-4 połączonych, korzystnie, poprzez łącznik (linker) z takimi specyficznie „nakierowującymi czynnikami.

W technikach terapii fotodynamicznej znanych ogólnie w dziedzinie można stosować róż ne formy związków według wynalazku. Jak podano powyżej terapię fotodynamiczną prowadzi się wg. najprzeróżniejszych protokołów i dla różnych wskazań medycznych. Ponadto, w pewnych przypadkach związki tego typu przejawiają aktywność farmakologiczną przy braku światła. W zastosowaniach stosuje się standardowe kompozycje farmaceutyczne w tym, jeśli trzeba, kompozycje liposomalne.

₅

Szczególnie przydatnymi w tych zastosowaniach są związki o wzorach 13-14, w których R⁵ oznacza winyl, zwłaszcza gdzie R¹ i R⁶ oznaczają metyl we wzorze 14, lub odpowiednio podstawioną w pierścieniu A forma wzór (13), ponownie szczególnie korzystna gdy R1 i R6 oznaczają metyl, i w szczególnoś ci zwią zek B3 z poniż szego Przykł adu 3.

Wytwarzanie trikwasu

Zasadniczą sprawą w syntezie związków według wynalazku jest wytworzenie trikwasów związków o wzorach 1-4, tj. w których X i Y oznaczają OH. W tym wytwarzaniu jako materiał wyjściowy stosuje się dowolną formę związków o wzorach 1-4, która jest bardziej zestryfikowana zarówno w winylowej jak i w propionowej grupie karboksylowej niż sam trikwas. Typowo, karboksylowa grupa winylowa znajduje się w formie estru, typowo estru alkilowego, a propionowe grupy karboksylowe również mogą być zestryfikowane. Alternatywnie, jako wyjściowe materiały można stosować estry z podstawionym rodnikiem węglowodorowym jak również odpowiednie amidy.

Ponieważ reakcje propionowych grup karboksylowych przebiegają znacznie łatwiej niż winylowej grupy karboksylowej, typowymi substancjami wyjściowymi są związki o wzorach 1-4, w których winylowa grupa karboksylowa występuje w formie estru lub amidu podczas gdy propionowe grupy karboksylowe mogą być już całkowicie lub częściowo zhydrolizowane. Tak więc, do typowych związków wyjściowych należą związki o wzorach ogólnych 1-4, w których wszystkie winylowe i propionowe grupy karboksylowe występują w formie zestryfikowanej lub w formie amidu, lub odpowiednie związki, w których propionowe grupy karboksylowe są cał kowicie lub częściowo zhydrolizowane. Jako substancje wyjściowe można również zastosować mieszane amidy i estry.

Te wyjściowe substancje rozpuszcza się w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak dimetyloformamid (DMF), dimetylosulfotlenek (DMSO) lub tetrahydrofuran (THF) lub ich mieszaniny, i zadaje się odpowiednią zasadą, taką jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek litu, wodoPL 202 340 B1 rotlenek wapnia, wodorotlenek baru, wodorotlenek chromu lub wodorotlenek tetraalkiloammoniowy lub każdą inną odpowiednio silną zasadą. Można również użyć stałe, związane z żywicą, reagenty alkaliczne. W mieszaninie reakcyjnej może być również woda i niskocząsteczkowe alkohole. Typowe stężenia zasady wynoszą od 0,1 do 1M. Korzystne jest prowadzenie reakcji w obojętnej nieutleniającej atmosferze, jak w atmosferze azotu, helu lub argonu. Temperatura mieszaniny reakcyjnej jest utrzymywana w zakresie 0-60°C, lecz typowo reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej. Czas reakcji powinien być dostatecznie długi aby przeprowadzić hydrolizę winylowych grup karboksylowych, typowo 2-48 godziny. Zależy to od temperatury, w której prowadzi się reakcję, lecz typowo, jeśli reakcja przebiega w temperaturze pokojowej, jest ona zakończona w czasie około 18 godzin. Postęp hydrolizy śledzi się chromatograficznie np. metodą TLC lub HPLC, co pozwala dobrać odpowiedni czas reakcji.

Produkt reakcji - trikwas często wytrąca się w warunkach reakcji lecz można go ponownie rozpuścić dodając wodę. Korzystnie, produkt wytrąca się następnie obniżając pH do około 3-4 stosując typowy kwas, zazwyczaj kwas siarkowy, azotowy, solny lub CF3SO3H. Wytrącony trikwas można krystalizować z odpowiednich rozpuszczalników. Szczególnie korzystnym rozpuszczalnikiem jest wilgotny metanol.

Po uzyskaniu oczyszczonego krystalizowanego produktu, trikwas poddaje się w standardowych warunkach reakcji przemianom wyszczególnionym na powyższym schemacie celem wytworzenia wielu rozmaitych czynników fotoaktywnych o wzorach1-4. Przekształceń grupy oznaczonej przez R⁵ można dokonywać w każdym ze związków przejściowych, lub na związkach wyjściowych i na produktach.

Następujące przykłady ilustrują lecz nie ograniczają zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie trikwasu o Wzorze 6

1,0 g (1,37 mM) tetraesteru otrzymanego z B-pierścieniowego adduktu Dielsa-Aldera do protoporfiryny IX - tj. związku o wzorze 2, w którym R¹ oznacza Me, Y i X oznaczają -OMe, n oznacza 2, i R⁵ oznacza winyl, dodano do zawiesiny LiOH (1,0 g, 41 mM) w 50 ml tetrahydrofuranu, 10 ml metanolu i 5,0 ml wody uprzednio odgazowanej przez mieszanie pod azotem przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną mieszano powoli przez 18 godzin przepuszczając wolny strumień azotu. Przebieg reakcji śledzono metodą TLC na żelu krzemionkowym stosując mieszaninę dichlorometan/metanol jako układ rozwijający. Mieszaninę reakcyjną przerabiano dodając najpierw 100 ml wody i następnie obniżając pH do 3-4 dodając 5% HCl. Osad odsączono i przemyto wodą poprzednio zbuforowaną kwasem octowym do pH 3,5. Stały trikwas o wzorze 6 krystalizowano z wilgotnego metanolu z wytworzeniem 770 mg (82% wydajności) produktu. Trikwas rozkłada się podczas stapiania. Budowę związku potwierdzono poprzez analizę na C/H i N oraz widma NMR. Widmo NMR wskazuje na nieobecność sygnału estru metylowego z łańcucha bocznego kwasu propionowego jak również od sygnału w niższym polu przyporządkowanego estrowi na grupie winylowej. Aby potwierdzić strukturę związku trikwas o wzorze 6 zadano diazometanem aby zregenerować wyjś ciowy materiał .

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie triestru z glikolem etylenowym mg (72 μΜ) trikwasu otrzymanego w Przykładzie 1 rozpuszczono w suchym dimetyloformamidzie (DMF) (2 ml) i aktywowano go reagentem tetrafluoroboranem benzotriazol-1-ilo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowym (BTTU) (Aldrich) (100 mg, 310 μM) w obecności trietyloaminy (50 μθ. BTTU oznacza czynnik aktywujący grupę karboksylową o wzorze

Mieszaninę reakcyjną mieszano przez sześć godzin i następnie dodano 250 μl glikolu etylenowego oraz później 20 ul DBU. Po 30 minutach mieszaninę reakcyjną dodano z kolei do mieszanego roztworu 20 ml dichlorometanu i 10 ml wody. Warstwę organiczną oddzielono i przemyto jeszcze trzy razy każdorazowo 5 ml wody. Rozpuszczalnik usunięto otrzymując ciemno zielony olej. Produkt,

PL 202 340 B1 mg triestru z glikolem etylenowym (38%), wydzielono na drodze preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej eluując go 5% metanolem w dichlorometanie.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie B3

Do roztworu 200 mg (0,289 mmoli) trikwasu wytworzonego w Przykładzie 1 w 10,0 ml metanolu dodano ~100 mikrolitra (1 mmol) kwasu siarkowego. Reakcję przerwano po 2 godzinach dodając 10 ml 5% roztworu octanu amonowego i 20 ml dichlorometanu. Warstwę organiczną przemyto dwukrotnie wodą. Do roztworu produktu dodano 10 ml acetonitrylu. Rozpuszczalnik usunięto na wyparce obrotowej z wytworzeniem ciemnego zielonego proszku. Produkt, B3 krystalizowano z mieszaniny metanol/chloroform otrzymując, po wysuszeniu w temperaturze 60°C pod zmniejszonym ciśnieniem przez 4 godziny, 140 mg (67%) ciemnego zielonego ciała stałego. Produkt ulega rozpadowi podczas stapiania. Budowę związku potwierdzono poprzez analizę na C/H i N, analizę widma masowego oraz rezonansu protonowego NMR i odpowiada ona związkowi o wzorze 14, w którym R⁵ oznacza winyl i R¹ i R⁶ oznaczają metyl.

P r z y k ł a d 4

Fotosensybilizacja komórek in vitro

Mysie komórki białaczki (L1210) inkubowano w odpowiednim buforze w obecności i bez surowicy z różnymi ilościami leku B3 przez 1 godzinę. Po usunięciu leku komórki wystawiono na działanie szerokiego spektrum światła przy 9 J/cm². Zdolność do życia (żywotność) komórek wyznaczano po 20 godzinach poprzez pomiar kolorymetryczny MTT. Wyniki przedstawiono na Rysunkach 2A i 2B jako % komórek zabitych względem komórek wystawionych jedynie na działania światła. Wartość LD50 (dawka powodująca 50% zabicie komórek) wynosiła 7 ng/ml w nieobecności, i 35 ng/ml w obecności 10% surowicy. Tak więc, B3 jest bardzo silnym fotouczulaczem komórek i zachowuje te właściwości w obecności surowicy.

P r z y k ł a d 5

Farmakokinetyka komórkowa

Wychwytywanie B3 przez komórki in vitro: komórki L1210 (5x10⁶/probówkę) inkubowano w obecności 10% surowicy z B3 w stężeniu 3 μg/ml w okresach czasu do 100 minut. Po różnych czasach trwania inkubacji wyjmowano po dwie probówki (duplikaty) i komórki, po przemyciu, poddawano lizie a ilość B3 w ekstrakcie określano fluorescencyjnie w obecności 1% Tritonu X-100.

Uwalnianie/zachowanie B3 przez komórki in vitro: komórki L1210 inkubowano przez 1 godzinę z B3 w stężeniu 3 μg/ml w obecności 10% surowicy, następnie przemyto i umieszczono na pożywce pozbawionej leku zawierającej 10% surowicy. Po różnych czasach w podwójnych próbkach (duplikatach) określano zawartość B3 w komórkach tak jak opisano powyżej.

Podane na Rysunkach 3 i 4 wyniki wskazują, że B3 podlega bardzo szybkiej farmakokinetyce in vitro. Związek dociera szybko do komórek osiągając maksymalne stężenia w ciągu 20 min. Po usunięciu B3 z pożywki hodowlanej uwalnianie jest szybkie i prawie całkowicie zakończone po 30 min. W oparciu o doświadczenia z innymi lekami należy oczekiwać, że B3 wykazuje bardzo szybką farmakokinetykę in vivo, tak więc unika się wydłużonego fotouczulenia skóry.

P r z y k ł a d 6

Dystrybucja tkankowa i klirens (usuwanie) In Vivo

Myszom (zdrowym, normalnym i z nowotworem M1) wstrzykiwano dożylnie B3, w roztworze wodnym zawierającym DMSO, w ilości 4 mg/kg. W różnych czasach po podaniu B3 zwierzęta zabijano i wyznaczano zawartość B3 w różnych ekstraktach metodą fluorescencyjną tak jak opisano powyżej.

Wyniki przedstawiono na Rysunku 5. Lek usuwa się z testowanych tkanek po około 5 minutach. Tak więc, B3 wykazuje szybką farmakokinetykę in vivo potwierdzając oczekiwania, że przy stosowaniu terapeutycznym nie wystąpi przedłużona nadwrażliwość skóry.

P r z y k ł a d 7

Selektywność In Vivo

Dane o biodystrybucji B3 (stosunki nowotwór:tkanka) uzyskane dla myszy z nowotworem M1 (rhabdomyosarcoma) również uzyskano po różnych czasach. W ciągu pierwszej godziny po dożylnym podaniu 4 mg/kg B3, stosunki nowotwór:tkanka dla mięśni i skóry wynosiły odpowiednio 1,5-2,0 i 3,1-3,9. Dla węzłów chłonnych stosunki wynosiły 0,7. Wyniki wskazują na preferencyjne gromadzenie się B3 w nowotworze i innych ulegających szybkiej proliferacji tkankach (węzły chłonne) w przeciwieństwie do normalnych, nie dzielących się tkanek.

PL 202 340 B1

Ponieważ to preferencyjne nagromadzanie się obserwowano szybko po podaniu B3 oznacza to iż fotouczulacz może być aktywowany przez światło zaraz po iniekcji co jest korzystne w zastosowaniu klinicznym.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Pochodna benzoporfiryny o wzorze:

   i jego sole, w którym:

   R¹ oznacza alkil (1-6C);

   Y oznacza -OH;

   n oznacza liczbę cał kowitą 1-6

   PL 202 340 B1 każdy X oznacza niezależnie -OH lub -OR⁴, w którym R⁴ oznacza niepodstawiony rodnik węglowodorowy 1-10C i

   R⁵ oznacza winyl.
2. 2. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że Y i oba X oznaczają -OH i n oznacza 2.
3. 3. Pochodna według zastrz. 2, znamienna tym że, jest to „trikwas o wzorze:

   PL 202 340 B1
4. 6. Sposób wytwarzania pochodnej benzoporfiryny o wzorze:

   PL 202 340 B1 i jego soli, w którym:

   R¹ oznacza alkil (1-6C); n oznacza liczbę całkowitą 1-6; i w którym R⁵ oznacza winyl, znamienny tym, że obejmuje poddanie mono-, di- lub tri-zestryfikowanej formy wymienionego powyżej związku produktowego lub jego soli, reakcji z zasadą i rozpuszczalnikiem w czasie wystarczająco długim na przeprowadzenie dezestryfikacji (hydrolizy) i otrzymanie końcowego związku.
5. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że wymienioną reakcję przeprowadza się w atmosferze obojętnej zapobiegającej utlenianiu; i/lub w którym wymienioną zasadą jest wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek litu, wodorotlenek wapnia, wodorotlenek baru, wodorotlenek chromu, lub wodorotlenek tetraalkiloamoniowy; i/lub w którym rozpuszczalnikiem jest DMSO, niskocząsteczkowy alkohol, DMF, THF lub woda lub ich mieszaniny; i/lub w którym wymienioną obojętną atmosferę stanowi gaz azot, hel lub argon; i/lub w którym wymienioną reakcję przeprowadza się w temperaturze około 0-60°C; i/lub w którym wymienioną reakcję przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez około 2-48 godzin.
6. 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że obejmuje dalej rozpuszczenie każdego związku produktowego, jego soli w wodzie i dodanie dostatecznej ilości kwasu celem wytrącenia wymienionego związku końcowego.
7. 9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera pochodną określoną w zastrz. 1-5 w mieszaninie z dopuszczalnym farmaceutycznie rozczynnikiem.
8. 10. Zastosowanie pochodnej określonej w zastrz. 1-5 jako czynnika fotoaktywnego do wytwarzania kompozycji przeznaczonej do przeprowadzania terapii fotodynamicznej PDT.