PL202783B1 - Wyizolowany polinukleotyd, polipeptyd, wektor, bakterie Corynebacterium, starter, sonda oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów - Google Patents
Wyizolowany polinukleotyd, polipeptyd, wektor, bakterie Corynebacterium, starter, sonda oraz sposób wytwarzania L-aminokwasówInfo
- Publication number
- PL202783B1 PL202783B1 PL344386A PL34438600A PL202783B1 PL 202783 B1 PL202783 B1 PL 202783B1 PL 344386 A PL344386 A PL 344386A PL 34438600 A PL34438600 A PL 34438600A PL 202783 B1 PL202783 B1 PL 202783B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gene
- seq
- bacteria
- polynucleotide
- lysine
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 76
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 37
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 33
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 22
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 21
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 13
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- -1 succinyl diamine Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 3
- 101710155796 Malate:quinone oxidoreductase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 3
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150000582 dapE gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150094267 mqo gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DZZCICYRSZASNF-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DZZCICYRSZASNF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N Val-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N Glu-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXXCHJKHJYRMIY-FQPOAREZSA-N Thr-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LXXCHJKHJYRMIY-FQPOAREZSA-N 0.000 description 2
- DKKHULUSOSWGHS-UWJYBYFXSA-N Tyr-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N DKKHULUSOSWGHS-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150053253 pgi gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- OILNWMNBLIHXQK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OILNWMNBLIHXQK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N Ala-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N Ala-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N Ala-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- IHMCQESUJVZTKW-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 IHMCQESUJVZTKW-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FQNILRVJOJBFFC-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N FQNILRVJOJBFFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N Ala-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- RIPMDCIXRYWXSH-KNXALSJPSA-N Ala-Trp-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N3CCC[C@@H]3C(=O)O)N RIPMDCIXRYWXSH-KNXALSJPSA-N 0.000 description 1
- PGNNQOJOEGFAOR-KWQFWETISA-N Ala-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=C(O)C=C1 PGNNQOJOEGFAOR-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N Ala-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N Arg-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- QQEWINYJRFBLNN-DLOVCJGASA-N Asn-Ala-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QQEWINYJRFBLNN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- UDSVWSUXKYXSTR-QWRGUYRKSA-N Asn-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O UDSVWSUXKYXSTR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- NKLRWRRVYGQNIH-GHCJXIJMSA-N Asn-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NKLRWRRVYGQNIH-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- FMNBYVSGRCXWEK-FOHZUACHSA-N Asn-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O FMNBYVSGRCXWEK-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- CLUMZOKVGUWUFD-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CLUMZOKVGUWUFD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DKQCWCQRAMAFLN-UBHSHLNASA-N Asp-Trp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DKQCWCQRAMAFLN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- ZEXHDOQQYZKOIB-ACZMJKKPSA-N Cys-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZEXHDOQQYZKOIB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 1
- JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N Gly-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- KMSGYZQRXPUKGI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KMSGYZQRXPUKGI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IUZGUFAJDBHQQV-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IUZGUFAJDBHQQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- PYFIQROSWQERAS-LBPRGKRZSA-N Gly-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 PYFIQROSWQERAS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N His-Gly-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ILUVWFTXAUYOBW-CUJWVEQBSA-N His-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O ILUVWFTXAUYOBW-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N XIZQPFCRXLUNMK-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- RMOKGALPSPOYKE-KATARQTJSA-N Lys-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMOKGALPSPOYKE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N Met-Arg-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCNC(N)=N DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N Met-Gly-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- AFNJAQVMTIQTCB-DLOVCJGASA-N Phe-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 AFNJAQVMTIQTCB-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IWNOFCGBMSFTBC-CIUDSAMLSA-N Pro-Ala-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IWNOFCGBMSFTBC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N Pro-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N Ser-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N Ser-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- NJSPTZXVPZDRCU-UBHSHLNASA-N Ser-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N NJSPTZXVPZDRCU-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- OJFFAQFRCVPHNN-JYBASQMISA-N Ser-Thr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O OJFFAQFRCVPHNN-JYBASQMISA-N 0.000 description 1
- ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N Ser-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLSNVZAREYQMGR-HJGDQZAQSA-N Thr-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NLSNVZAREYQMGR-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N Thr-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- LCCSEJSPBWKBNT-OSUNSFLBSA-N Thr-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N LCCSEJSPBWKBNT-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N Thr-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N Thr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- FBQHKSPOIAFUEI-OWLDWWDNSA-N Thr-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FBQHKSPOIAFUEI-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 1
- PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N Thr-Tyr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N Thr-Val-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 1
- MJBBMTOGSOSAKJ-HJXMPXNTSA-N Trp-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MJBBMTOGSOSAKJ-HJXMPXNTSA-N 0.000 description 1
- FEZASNVQLJQBHW-CABZTGNLSA-N Trp-Gly-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEZASNVQLJQBHW-CABZTGNLSA-N 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N Tyr-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- MVYRJYISVJWKSX-KBPBESRZSA-N Tyr-His-Gly Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)NCC(=O)O)N)O MVYRJYISVJWKSX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- GZWPQZDVTBZVEP-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GZWPQZDVTBZVEP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005337 lysine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002897 organic nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 235000001892 vitamin D2 Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polinukleotyd, polipeptyd, wektor, bakterie Corynebacterium, starter, sonda oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów w szczególności L-lizyny.
Aminokwasy, zwłaszcza L-lizyna, znajdują zastosowanie w medycynie, w przemyśle farmaceutycznym oraz w żywieniu zwierząt.
Wiadomo, że można wytwarzać aminokwasy przez fermentacyjne hodowle szczepów bakterii z rodzaju Corynebacterium, zwłaszcza Corynebacterium glutamicum. Z powodu duż ego ich znaczenia, opracowuje się wciąż ulepszenia tych sposobów wytwarzania. Ulepszania mogą dotyczyć np. zużycia i zapotrzebowania na tlen, albo składu pożywek hodowlanych, jak np. stężenia cukru podczas fermentacji, albo obróbki produktu przez np. chromatografię jonowymienna albo wewnętrzne właściwości samych drobnoustrojów.
W celu polepszenia właściwości produkcyjnych tych drobnoustrojów, stosuje się sposoby mutagenezy, selekcji i wyboru mutantów. W ten sposób, otrzymuje się szczepy odporne na antymetabolity, jak np. analog lizyny S-(2-aminoetylo-cysteina albo auksotrofy w stosunku do regulacyjnych aminokwasów i wytwarzające L-lizynę.
Od kilku lat, stosuje się również metody rekombinacji DNA, w celu polepszenia szczepów Corynebacterium wytwarzających aminokwasy, w których amplifikuje się pojedyncze geny kodujące biosyntezę aminokwasów, oraz bada się ich działanie na wytwarzanie aminokwasów. Materiał przeglądowy dotyczący tego tematu można znaleźć w Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria: w Biology of Industrial Microorganisms, Demain i Solomon (wyd.) Benjamin Cummings, Londyn, UK, 1985:115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten i Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology, 15, 73-103 (1995)), Sahm i in., (Annuals of the New York Academy of Science 782:25-39 (1996).
Twórcy wynalazku postawili sobie za cel opracowanie nowych środków do fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów, w szczególności L-lizyny.
Aminokwasy, zwłaszcza L-lizyna, znajdują zastosowanie w medycynie, w przemyśle farmaceutycznym oraz szczególnie w żywieniu zwierząt. Stąd powszechne jest zainteresowanie nowymi ulepszonymi sposobami wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny.
W znaczeniu tu zastosowanym, aminokwasy oznaczają w szczególności L-lizynę albo lizynę, albo ich zasady i sole np. chlorowodorek lizyny albo siarczan lizyny.
Wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu kodującego:
a) polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 2,
b) polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 95% identyczna z sekwencją przedstawioną na Id. Sekw. nr 2.
W korzystnym polinukleotydzie sekwencja nukleotydowa jest wybrana z grupy obejmującej:
a) sekwencję nukleotydową przedstawioną na Id. Sekw. nr 1.,
b) sekwencję odpowiadającą sekwencji z a) z uwzględnieniem degeneracji kodu genetycznego, i
c) sekwencję nukleotydową odpowiadającą nukleotydom 413 do 1009 z sekwencji nukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1,
d) sekwencję nukleotydową komplementarną do sekwencji z a) i b).
Wynalazek dotyczy również polipeptydu o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na
Id. Sekw. nr 2. Korzystny polinukleotyd pochodzi z bakterii Corynebacterium.
Ponadto wynalazek dotyczy wektora zdolnego do replikacji w bakteriach Corynebacterium, który obejmuje sekwencję nukleotydowa według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzą również bakterie Corynebacterium o zwiększonym wyraż aniu polinukleotydu kodującego polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest na Id. Sekw. nr 2 do poziomu, w którym zwiększone jest wytwarzanie L-aminokwasów w tych bakteriach. Korzystnie w bakteriach Corynebacterium wewnątrzkomórkowa aktywność polipeptydu, o sekwencji przedstawionej na Id. Sekw. Nr 2 jest zwiększona przez wzrost ilości kopii polinukleotydu kodującego ten polipeptyd lub przez zastosowanie silnego promotora i, gdzie jest to właściwe, przez kombinację tych cech. Korzystnie bakterie są transformowane wektorem obejmującym polinukleotyd kodujący polipeptyd przedstawiony na Id. Sekw. nr 2.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania L-aminokwasów obejmującego etap, w którym bakterie wedł ug wynalazku poddawane są fermentacji w odpowiedniej poż ywce. Korzystny jest sposób, w którym bakterie poddaje się fermentacji w odpowiedniej pożywce przez co
PL 202 783 B1 poziom odpowiedniego L-aminokwasu/aminokwasów zwiększa się w pożywce lub w komórkach bakterii, a następnie izoluje się L-aminokwas/y.
Korzystnie stosuje się bakterie Corynebacterium wytwarzające L-lizynę.
Korzystnie L-lizynę wytwarza się przez fermentację bakterii, w których równocześnie zostały wzmocnione, w szczególności przez nadekspresję lub amplifikację jeden lub większa liczba genów wybranych z grupy składającej się z:
a) genu dapA dla syntazy dihydrodipikolinanowej,
b) genu lysC kodującego kinazę asparaginianową oporną na sprzężenie zwrotne,
c) genu dapD kodującego sukcynylazę tetradihydropikolinianową,
d) genu dapE kodującego desukcynylazę sukcynylodiaminopijabłaczanową,
e) genu gap dla dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej
f) genu pyc dla karboksylazy pirogronianowej
g) genu mqo dla oksydoreduktazy jabłczanowo:chinonowej;
h) genu lysE kodującego białko związane z eksportem lizyny.
W korzystnym sposobie L-lizynę wytwarza się przez fermentację bakterii, w których atenuowany jest gen pgi kodujący izomerazę glukozo-6-fosforanową.
Korzystnie w sposobie stosuje się mikroorganizmy z gatunku Corynebacterium glutamicum.
Wektor pCR2.1zwa1exp zdeponowany w E. coli pod numerem dostępu DSM 13115 jest również objęty zakresem wynalazku.
Ponadto wynalazek dotyczy startera obejmującego, co najmniej 30 kolejnych nukleotydów z sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
Korzystny starter obejmuje co najmniej 40 kolejnych nukleotydów z sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
Wynalazek dotyczy również sondy obejmującej, co najmniej 30 kolejnych nukleotydów z sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
Korzystna sonda obejmuje co najmniej 40 kolejnych nukleotydów z sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
Wynalazek umożliwia również uzyskanie polinukleotydów obejmujących sekwencję polinukleotydową, możliwą do uzyskania metodą hybrydyzacji przez badanie przesiewowe odpowiedniego banku genów, który zawiera gen pełnej długości o sekwencji polinukleotydowej odpowiadającej Id. Sekw. nr 1. Badanie przesiewowe prowadzi się przy użyciu sondy, której sekwencja odpowiada polinukleotydom o Id. Sekw. nr 1 albo fragmentowi tej sekwencji i obejmuje izolowanie określonej sekwencji DNA.
Sekwencje polinukleotydowe według wynalazku można stosować jako sondy hybrydyzacyjne dla RNA, cDNA i DNA, w celu izolowania cDNA pełnej długości, kodującego białko Zwa1, oraz takich cDNA albo genów, które wykazują duże powinowactwo sekwencji z genem zwa1.
Sekwencje polinukleotydowe według wynalazku mogą również służyć jako startery do wytwarzania DNA z genów, które kodują zwa1, przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).
Takie oligonukleotydy służące jako sondy albo startery obejmują około 30, korzystnie około 20, szczególnie korzystnie około 15 kolejnych zasad. Nadają się zwłaszcza oligonukleotydy o długości około 40 albo 50 par zasad.
„Wyizolowany” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza wydzielony ze środowiska zewnętrznego.
Termin „polinukleotyd” dotyczy przede wszystkim polirybonukleotydów i polidezoksyrybonukleotydów, przy czym może dotyczyć niemodyfikowanych albo modyfikowanych RNA albo DNA.
„Polipeptydy” w znaczeniu tu zastosowanym oznaczają peptydy albo białka, które zawierają dwa albo więcej aminokwasy, połączone ze sobą wiązaniem peptydowym.
Rozwiązania według wynalazku umożliwia fermentacyjne wytwarzanie aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny, przy zastosowaniu bakterii z rodzaju Corynebacterium, szczególnie tych, które już wytwarzają aminokwasy oraz takich, które posiadają nadmiernie wyrażone sekwencje nukleotydowe kodujące produkt genu zwa1, zwłaszcza tych, które wyrażają go na wyższym poziomie.
Określenie „wzmocnienie” oznacza zwiększenie wewnątrzkomórkowej aktywności jednego albo wielu enzymów (białek) drobnoustroju, które są kodowane przez odpowiednie DNA, przy czym stosuje się przykładowo zwiększenie liczby kopii genu, silny promotor albo gen kodujący odpowiedni enzym (białko), jak również można łączyć ze sobą powyższe możliwości.
Drobnoustroje, stanowiące przedmiot niniejszego wynalazku, potrafią wytwarzać L-aminokwasy, zwłaszcza L-lizynę z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, skrobi, celulozy albo
PL 202 783 B1 z gliceryny i etanolu. Dotyczy to w szczególnoś ci przedstawicieli bakterii Corynebacterium, zwł aszcza gatunku Corynebacterium. Z gatunku Corynebacterium w szczególności należy wymienić Corynebacterium glutamicum, znany z tego, że wytwarza L-aminokwasy.
Przydatne szczepy gatunku Corynebacterium, zwłaszcza rodzaju Corynebacterium glutamicum są przykładowo znanymi szczepami typu dzikiego:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecoloa ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 i
Brevibacterium divaricatum ATCC14020 oraz wytworzone z nich mutanty wytwarzające L-lizynę zwłaszcza szczepy, jak przykładowo
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 i
Corynebacterium glutamicum DSM5715
Twórcy wynalazku wyizolowali nowy gen zwa1, kodujący produkt genu Zwa1 z C. glutamicum.
W celu wyizolowania genu zwa1 albo innych genów z C. glutamicum można wytworzyć bank genów z interesującej bakterii. Wytwarzanie banków genów jest powszechnie znane z podręczników i niż ej opisanych publikacji. Przykł adowo, moż na wymienić podrę cznik Winnacker: Gene und Klone, Eine Eifuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Niemcy, 1990) albo podręcznik Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Znane banki genów obejmują np. E. coli K-12 szczep W3110, wytworzony przy użyciu wektorów λ przez Kohara i in., (Cell 50, 495-508 (1987)). Bathe i in., (Molecular General Genetics, 252:255265, 1996) opisują bank genów z C. glutamicum ATCC13032, który wytworzono przy użyciu wektorów kosmidowych SuperCos I (Wahl i in., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) w E. coli K-12 szczepu NM554 (Raleigh i in., 1988, Nucleic Acids Research, 16:15631575). Bormann i in. (Molecular Microbiology, 6(3) 317-326 (1992)) opisują bank genów z C. glutamicum ATCC13032 wytworzony przy zastosowaniu kosmidów pHC79 (Hohn i Collins, Gene 11, 291298 (1980)). Do wytwarzania banku genów z C. glutamicum w E. coli, można również zastosować plazmidy takie jak pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25:807-818 (1979)) czy pUC9 (Vieira i in., 1982,
Gene, 19:259-268). Jako gospodarz, szczególnie nadają się szczepy E. coli wykazujące defekt enzymów restrykcyjnych i rekombinacyjnych. Przykładowo, szczep DH5aMRC opisany przez Grant i in., (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Dłuższe fragmenty DNA klonowane przy użyciu kosmidów można klonować do wektorów przydatnych do sekwencjonowania i sekwencjonować sposobem opisanym przez np. Sanger i in., (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467(1977)).
W ten sposób, otrzymuje się nowe sekwencje DNA kodujące gen zwa1 z C. glutamicum, które jako Id. Sekw. nr 1 stanowią przedmiot według wynalazku. Dalej, na podstawie sekwencji DNA można poznać sekwencję aminokwasów odpowiednich białek. Na Id. Sekw. nr 2 pokazano odpowiednią sekwencję aminokwasową produktu genu zwa1.
Kodujące sekwencje DNA, pochodzące z Id. Sekw. nr 1 na skutek degeneracji kodu genetycznego, stanowią również część wynalazku. W podobny sposób, sekwencje DNA, które hybrydyzują z Id. Sekw. nr 1 albo częściami Id. Sekw. nr 1, stanowią również część wynalazku. W stanie techniki znane są konserwatywne zastąpienia w białkach aminokwasów, jak np. zamiana glicyny na alaninę albo kwasu asparginowego na kwas glutaminowy, jako tzw. „mutacje sensowne”, które nie powodują zasadniczych zmian aktywności białka, tzn. są neutralne czynnościowo. Dalej wiadomo, że zmiana końca N- i/lub C- białka, nie wpływa zasadniczo na czynność albo stabilność. Literatura dotycząca tego zagadnienia to Ben-Bassat i in., (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), O'Regan i in., (Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth i in., Prot. Sci. 3:240-247 (1994)), Hochuli i in., (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) i znane podręczniki genetyki i biologii molekularnej. Sekwencje aminokwasowe, które w ten sposób odpowiadają Id. Sekw. nr 2 stanowią część wynalazku.
PL 202 783 B1
Opisy sposobów identyfikacji sekwencji DNA przy użyciu hybrydyzacji można znaleźć przede wszystkim w podręczniku „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”, firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Niemcy, 1993 oraz Liebl i in., (International Journal of Systematic Bacteriology, (1991) 41:255-260). Sposoby amplifikacji sekwencji DNA przy pomocy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) można znaleźć m.in. w podręczniku Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) oraz w Newton i Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Niemcy, 1994).
Twórcy wynalazku stwierdzili, że bakterie Corynebacterium glutamicum w ulepszony sposób wytwarzają L-lizynę w wyniku nadekspresji genu zwa1.
W celu wywoł ania nadmiernej ekspresji moż na zwiększyć liczbę kopii genu albo zmutowa ć regiony promotorowe i regulatorowe albo miejsca przyłączania rybosomów, które znajdują się powyżej genów strukturalnych. W podobny sposób działają kasety ekspresji, które włącza się powyżej genów strukturalnych. Przez zastosowanie indukowalnych promotorów możliwe jest dodatkowo zwiększenie ekspresji w celu fermentacyjnego wytwarzania L-lizyny. Zwiększyć ekspresję można dodatkowo przez przedłużenie czasu trwania mRNA. Zapobiegając rozkładowi białek enzymatycznych można zwiększyć ich aktywność. Gen albo konstrukt genetyczny może być obecny zarówno na plazmidach o różnej liczbie kopii albo powielony i wintegrowany w chromosom. Alternatywnie, można osiągnąć zwiększenie ekspresji konkretnego genu przez zmianę składu pożywki i warunków hodowli.
W tym celu moż na znaleźć wskazówki w Martin i in. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)); Guerrero i in. (Gene 138, 35-41 (1994)); Tsuchiya i Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)); Eikmanns i in. (Gene 102, 93-98 (1991)); europejski opis patentowy EPS 0 472 869; patent USA 4, 601, 893; Schwartzer i Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid i in., (Applied and Environtal Microbiology 60, 126-132 (1994)); LaBarre i in. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)); zgłoszenie patentowe WO 96/15246; Malumbres i in. (Gene 134, 15-24 (1993)), japońska publikacja patentowa JP-A-10-229891; Jensen i Hammer (Biotechnology Bioengineering 58 191-195 (1998)); Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) oraz w znanych podręcznikach genetyki i biologii molekularnej.
Przykładowo, gen zwa1 można nadmiernie wyrażać, względnie osiągnąć amplifikację genu przez zintegrowanie z chromosomem, jak opisali Reinscheid i in. (Appl. Environ. Microbiol. 60, 126132 (1994)). Tą metodą do wektora plazmidowego klonuje się gen pełnej długości, który może replikować w gospodarzu (zwykle E. coli), ale nie w Corynebacterium glutamicum. Jako wektory można zastosować pSUP301 (Simon i in., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob albo pK19mob (Schafer i in., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994) J. Biol. Chem. 269:32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Invi-trogen, Groningen, Holandia; Bernard i in., J. Mol. Biol. 234:534-541 (1993)) albo pEM1 (Schrumpf i in., 1991, J. Bacteriol. 173:4510-4516). Wektor plazmidowy zawierający gen do amplifikacji, przenosi się przez koniugację albo transformację do pożądanego szczepu Corynebacterium glutamicum. Metodę koniugacji opisano, przykładowo w Schafer i in., Applied Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Sposoby Transformacji opisane są przez Thierbach i in. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican i Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) i Tauch i in., (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Po rekombinacji homologicznej, powstały szczep otrzymuje na drodze zjawiska „crossing over”, przynajmniej dwie kopie odpowiedniego genu. W ten sposób, przy użyciu plazmidu integracyjnego pCR2.1zwa1exp wytworzono szczep DSM5715::pCR2.1zwa1exp, niosący dwie kopie genu zwa1.
Oprócz tego, do wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny oprócz genu zwa1 można również nadmiernie wyrażać inne enzymy ze szlaku biosyntezy, jak enzymy szlaku glikolizy, szlaków anaplerotycznych, cyklu kwasu cytrynowego i wydalania aminokwasów.
W celu wytwarzania L-lizyny moż na równocześnie nadmiernie wyraż ać następujące enzymy:
• gen dapA dla syntazy dihydrodipikolinanowej (EP-B 0 197 335);
• gen lysC kodujący kinazę asparaginianową oporną na sprzężenie zwrotne;
• gen dapD kodujący sukcynylazę tetradihydropikolinianową (Wehrmann i in., Journal of Bacteriology, 180, 3159-3165 (1998)), • gen dapE kodujący desukcynylazę sukcynylodiaminopijabłczanową (Wehrmann i in., J. Bacteriol., 180, 3159-3165 (1998)), • gen gap dla dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174:6076-6086);
PL 202 783 B1 • gen pyc dla karboksylazy pirogronianowej (Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174:6076-6086);
• gen mqo dla oksydoreduktazy jabł czanowo:chinonowej (Molenaar i in., (1998) Eur. J. Biochem., 254, 395-403);
• gen lysE zwią zany z wydalaniem lizyny (DE-A-195 48 222).
Oprócz tego, celu wytwarzania aminokwasów, a zwłaszcza L-lizyny można równocześnie osłabić następujące enzymy:
• gen pck dla karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej (DE 199 50 409.1, DSM 13047) i/lub;
• gen pgi dla izomerazy glukozo-6-fosforanowej (US 09/396,478, DSM 12969).
Dalej, w celu wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny, korzystne jest, oprócz nadmiernej ekspresji genu zwa1, wyłączenie niepożądanych reakcji (Nakayama: „Breeding of Amino Acids Producing Micro-Organisms”, w: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (wyd.) Academic Press, Londyn UK, 1982).
Oprócz wzmocnienia genu zwa1 korzystne jest osłabienie genu zwa2 albo działania produktu genu zwa2. Odpowiedni gen i sposoby opisano w równoległym zgłoszeniu patentowym 199 59 327.2.
Wektor integracyjny pCR2.1zwa2, nadający się do mutagenezy insercyjnej zdeponowano w E. coli TOP10F' pod numerem DSM13113.
Plazmid pCR2.1zwa2int obejmuje plazmid pCR2.1-TOPO, opisany przez Mead i in. ((1991) Bio/Technology 9:657-663), w którym wbudowano wewnętrzny fragment genu zwa2, pokazany na Id. Sekw. nr 1 niemieckiego zgłoszenia patentowego 199 59 327.2. Plazmid ten prowadzi po transformacji i rekombinacji homologicznej z chromosomalnym genem zwa2 (insercja) do całkowitej utraty funkcji. W ten sposób wytwarza się przykładowo szczep DSM5715::pCR2.1zwa2int, w którym wyłączono produkt genu zwa2.
Drobnoustroje według wynalazku mogą być hodowane w sposób nieciągły albo ciągły, sposobem wsadowym albo innym, w celu wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny. Podsumowanie znanych sposobów hodowania opisano w podręczniku Chmiel (Bioprozestechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) albo w podręczniku Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Konkretna pożywka hodowlana musi być odpowiednia dla określonego szczepu według wynalazku. Opis pożywek hodowlanych dla różnych drobnoustrojów można znaleźć w podręczniku „Manual of Methods for General Bacteriology”, Am. Soc. Bacteriol., (Washington D.C., USA, 1981). Jako źródło węgla można zastosować różne źródła węglowodanów i cukrów nie ograniczone do glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, skrobi, celulozy, olejów i tłuszczów jak np. olej sojowy, słonecznikowy, arachidowy i kokosowy, kwasów tłuszczowych jak np. kwas palmitynowy, stearynowy i linolowy, albo alkoholi jak np. gliceryna i etanol oraz kwasy organiczne jak np. kwas octowy. Te związki można zastosować pojedynczo albo w mieszaninie. Jako źródła azotu można zastosować związki zawierające organiczny azot jak peptony, ekstrakty drożdży, ekstrakty mięsa, ekstrakty słodu, syrop z kukurydzy, mąka sojowa i mocznik albo związki nieorganiczne jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu i azotan amonu. Źródła azotu można zastosować pojedynczo oraz jako mieszaninę. Jako źródła fosforanów można zastosować kwas fosforowy, fosforan potasu albo fosforan dipotasu albo odpowiednie sole zawierające azot. Pożywka hodowlana powinna zawierać również sole metali, jak np. siarczan magnezu albo siarczan żelaza, które są konieczne dla wzrostu. Na koniec, oprócz powyższych związków należy zastosować niezbędne czynniki wzrostowe, jak aminokwasy i witaminy. Powyższe związki można dostarczać do hodowli w sposób ciągły albo w sposób wsadowy.
W celu kontrolowania pH, stosuje się zwią zki zasadowe takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak, względnie wodę amoniakalną albo związki kwasowe, jak kwas fosforowy albo siarkowy. W celu kontrolowania tworzenia się piany można zastosować substancję przeciwdziałające tworzeniu się piany, jak np. estery poliglikolowe kwasów tłuszczowych. W celu uzyskania stabilności plazmidu, można zastosować w pożywce substancje działające wybiórczo, jak np. antybiotyki. W celu prowadzenia procesu tlenowego można doprowadzać do hodowli tlen albo mieszaniny zawierające tlen, jak np. powietrze. Temperatura hodowli w normalnych warunkach mieści się w zakresie od 20°C do 45°C, zaś korzystnie od 25°C do 40°C. Hodowlę prowadzi się do uzyskania maksymalnego wytwarzania lizyny. Osiąga się to zwykle po 10 do 160 godzin hodowli.
Analizę L-lizyny przeprowadza się przez chromatografię anionowymienną z derywatyzacją ninhydryną według metody opisanej przez Spackman i in. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190).
PL 202 783 B1
Poniższe drobnoustroje zdeponowano w Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Brunszwik, Niemcy) w oparciu o Traktat Budapeszteński:
Escherichia coli szczep TOP10F'/pCR2.1zwa1exp jako depozyt DSM 13115.
Sposoby według wynalazku służą do fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny.
Oprócz wzmocnienia genu zwa1 korzystne jest osłabienie genu zwa2 albo działania produktu genu zwa2. Odpowiedni gen i sposoby opisano w równoległym zgłoszeniu patentowym 199 59 327.2. Wektor integracyjny pCR2.1zwa2, nadający się do mutagenezy insercyjnej zdeponowano w E. coli TOP10F' pod numerem DSM13113.
Przykłady
Poniższe przykłady obrazują rozwiązania według wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Wytwarzanie genomowego banku genów w kosmidach z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomalny DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 izolowano sposobem opisanym przez Tauch i in., (1995, Plazmid 33:168-179) i częściowo trawiono enzymem restrykcyjnym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, kod nr 27-0913-02). Fragmenty DNA defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy, kod nr 1758250). DNA wektorów kosmidowych SuperCos1 (Wahl i in., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2160-2164), wytworzony przez Stratagene (La Jolla, USA, kod nr 251301) cięto enzymem restrykcyjnym Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, kod nr 27-0948-02) i defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek. Na koniec, kosmidowy DNA cięto enzymem restrykcyjnym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, kod nr 27-0868-04). Traktowany w ten sposób kosmidowy DNA zmieszano z DNA z ATCC 13032 i traktowano ligazą DNA T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, kod nr 27-0870-04). Mieszaninę ligacyjną pakowano do fagów przy użyciu ekstraktu Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA kod nr 200217). W celu zakażania E. coli szczepu NM554 (Raleigh i in., 1988, Nucl. Acids Res., 16:1563-1575), komórki pobrano w 10 mM MgSO4, i zmieszano z porcją zawiesiny fagów. Zakażenie i miareczkowanie banku kosmidowego przeprowadzono sposobem według
Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989), przy czym komórki wysiano na agar LB (Lennox, 1955, Virology 1:190) z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny. Po inkubacji przez noc, w 37°C selekcjonowano pojedyncze rekombinowane kolonie.
P r z y k ł a d 2
Izolowanie i sekwencjonowanie genu zwa1
Kosmidowy DNA pojedynczych kolonii izolowano przy użyciu zestawu Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt nr 27106, Qiagen, Hilden, Niemcy) według instrukcji producenta i częściowo cięto enzymem restrykcyjnym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, kod nr 27-0913-02). Fragmenty DNA defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy, kod nr 1758250). Po rozdziale elektroforetycznym, izolowano fragmenty kosmidów w zakresie wielkości od 1500 do 2000 bp, przy użyciu zestawu QiaExII Gel Extraction Kit (produkt nr 20021, Qiagen, Hilden, Niemcy). DNA wektora do sekwencjonowania pZero-1 firmy Invitrogen (Groningen, Holandia, produkt nr K2500-01) cięto enzymem restrykcyjnym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, kod nr 27-0868-04). Ligację fragmentów kosmidów w wektorze do sekwencjonowania pZero1 przeprowadzono sposobem opisanym przez Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), w którym mieszaninę DNA inkubowano przez noc z ligazą DNA T4 (Pharmacia, Freiburg, Niemcy). Mieszaninę ligacyjną elektroporowano do bakterii E. coli DH5aMRC (Grant i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 4645-4649), metodą Tauch i in., (1995, Plazmid 33:168-179), po czym komórki wysiano na agar LB (Lennox, 1955, Virology 1:190) z dodatkiem 50 μg/ml zeocyny. Preparaty plazmidowe rekombinowanych klonów otrzymano przy użyciu Biorobot 9600 (produkt nr 900200, Qiagen, Hilden, Niemcy). Sekwencjonowanie przeprowadzono metodą przerywania łańcucha przy użyciu dideoksynukleotydów metodą Sanger i in., (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) z modyfikacjami Zimmermann i in., (1990, Nucl. Acids Res. 18:1067). Zastosowano zestaw wykorzystujący RR dRodaminę PE Applied Biosystems (nr produktu 403044, Weitrstadt, Niemcy). Elektroforetyczny rozdział i analizę reakcji sekwencjonowania przeprowadzono przy użyciu żelu „Rotiophorese NF Acrylamid/bisacrylamid” (29:1) (kod produktu A124.1, Roth, Karlsruhe, Niemcy) przy użyciu urządzenia do sekwencjonowania ABI Prism 377.
PL 202 783 B1
Otrzymane sekwencje opracowano przy użyciu pakietu oprogramowania Staden (1986, Nucl. Acids Res. 14:217-231) wersja 97-0. Pojedyncze sekwencje pochodzące z pZero-01 łączy się w postać pojedynczego kontigu. Oparte o analizę komputerową regiony kodujące opracowano programem XNIP. Dalszą analizę przeprowadzono „programem poszukującym BLAST” (Altshul i in., 1997, Nucl. Acids Res., 2 5:3389-3402) na nienadmiarowej bazie danych National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Otrzymaną sekwencję nukleotydową przestawiono na Id. Sekw. nr 1. Analiza sekwencji wykazała otwartą ramkę odczytu wielkości 597 par zasad, które można określić jako gen zwa1. Gen zwa1 koduje białko wielkości 199 aminokwasów, którego sekwencja została przedstawiona na Id. Sekw. nr 2.
P r z y k ł a d 3
Wytwarzanie wektorów do nadekspresji genu zwa1
Chromosomalny DNA izolowano ze szczepu ATCC13032 metodą Eikmanns i in., (Microbiology 140:1817-1828 (1994)). Na podstawie znanej z Przykładu 2 sekwencji genu zwa1 wybrano następujące startery do PCR:
zwa1-d1:
5' TCA CA CCG ATG ATT CAG GC 3' zwa1-d2:
5' AGA TTT AGC CGA AAG CG 3'
Startery zsyntetyzowano w firmie MWG Biotech (Ebersberg, Niemcy). Reakcję PCR przeprowadzono standardową metodą Innis i in., (PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990 Academic Press) przy użyciu polimerazy Pwo Boehringer Mannheim. Przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy wyizolowano fragment wielkości około 1,0 kb, zawierający gen zwa1.
Amplifikowany fragment DNA poddano ligacji do wektora pCR2.1-TOPO (Mead i in., (1991) Bio/Technology 9:657-663) przy użyciu zestawu do klonowania TOPO TA Invitrogen Corporation (Carlsbad, USA, nr kat. K4500-01). Na koniec, elektroporowano mieszaniną ligacyjną E. coli szczepu
DH5a (Hanahan, w: DNA cloning. A practical approach. Vol.I.IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). Selekcję komórek niosących plazmid przeprowadzono przez wysianie mieszaniny na agarze LB (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual wydanie drugie. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) zawierającym 25 mg/l kanamycyny. Plazmidowy DNA izolowano z transformantów przy użyciu zestawu QIAprep Spin Miniprep Kit firmy Qiagen. Plazmidy sprawdzono przez trawienie restrykcyjne EcoRI i elektroforezę na żelu agarozowym (0,8%). Plazmid określono jako pCR2.1zwa1exp.
P r z y k ł a d 4
Duplikacja genu zwa1 w wytwarzającym lizynę szczepie DSM5715
Wektor pCR2.1zwa1exp z Przykładu 3 wprowadzono przez elektroporację metodą Tauch i in., (FEMS Microbiol. Lett, 123:343-347 (1994)) do Corynebacterium glutamicum DSM 5715. Szczep DSM 5715 jest szczepem wytwarzającym lizynę, opornym na AEC (aminoetylocysteinę). Wektor pCR2.1zwa1exp nie może samodzielnie replikować w DSM 5715 i jest jedynie zatrzymywany w komórkach gdy zintegruje się z chromosomem. Selekcję klonów z wintegrowanym do chromosomu pCR2.1zwa1exp przeprowadzono przez wysianie mieszaniny elektroporacyjnej na agar LB (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual drugie wydanie Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)) z dodatkiem 15 mg/ml kanamycyny. W celu potwierdzenia integracji, przeprowadzono reakcję PCR standardową metodą Innis i in., (PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990 Academic Press) przy użyciu polimerazy Pwo Boehringer. Przez kombinację starterów zwa1-d1 i zwa1-d2 (Przykład 3) z uniwersalnym starterem M13 forward (5' GTTTTCCCAGTCACGAC 3') (Invitrogen Corp., nr kat N540-02) i uniwersalnym starterem M13 reverse (5' CAGGAAACAGCTATGAC 3') (Invitrogen Corporation, nr kat N530-02) wiążącymi się z wewnętrzną sekwencją wektora pCR2.1zwa1exp, można było wykazać, że plazmid pCR2.1zwa1exp został wprowadzony do chromosomu szczepu wytwarzającego lizynę DSM 5715. Szczep nazwano DSM5715: :pCR2.1zwa1exp.
P r z y k ł a d 5
Wytwarzanie lizyny
Szczep C. glutamicum otrzymany w Przykładzie 4, DSM5715::pCR2.1zwa1exp, zastosowano do wytwarzania lizyny w odpowiedniej pożywce odżywczej i określano zawartość lizyny w nadsączu hodowlanym.
PL 202 783 B1
W tym celu, szczep wysiany na p łytkę agarową uzupełnioną odpowiednim antybiotykiem (agar z wycią giem z mózgu i serca z kanamycyną 25 mg/l) i inkubowano przez 24 godziny w 33°C. Pobierając materiał z płytki założono hodowlę wstępną (10 ml pożywki w 100 ml kolbie Erlenmeyera). Jako pożywkę do hodowli wstępnej zastosowano pożywkę Cglll. Następnie dodano kanamycynę (25 mg/l). Hodowlę wstępną inkubowano wytrząsając z szybkością 240 obrotów na minutę w 33°C na wytrząsarce przez 48 godzin. Tą hodowlą wstępną zaszczepiono hodowlę główną, tak że jej OD (660 nm) wynosiła 0,1 OD. Do hodowli głównej zastosowano pożywkę MM.
Pożywka MM
CSL (Corn Steep Liquor - syrop kukurydziany) 5 g/l
MOPS 20 g/l glukoza (osobno autoklawowana) 50 g/l
Sole:
(NH4)2SO4 25 g/l
KH2PO4 0,1 g/l
MgSO4 x 7 H2O 1,0 g/l
CaCl2 x 2 H2O 10 mg/l
FeSO4 x 7 H2O 10 mg/l
MnSO4 x H2O 5,0 mg/l
Biotyna (sterylizowana przez filtrację) 0,3 mg/l
Tiamina x HCl (sterylizowana przez filtrację) 0,2 mg/l
Leucyna (sterylizowana przez filtrację) 0,1 g/l
CaCO3 25 g/l
CSL, MOPS i roztwór soli doprowadzono do pH 7 przy użyciu wody amoniakalnej i autoklawowano. Na koniec, dodano sterylizowany roztwór substratów i witamin, jak również autoklawowany CaCO3 w postaci suchej.
Hodowlę prowadzono w 10 ml objętości w 100 ml kolbie Erlenmeyera z progami. Dodano kanamycynę (25 mg/l). Hodowla przebiegała w 33°C i 80% wilgotności powietrza.
Po 48 godzinach określono OD przy długości fali 660 nm na urządzeniu Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Monachium). Wytworzoną lizynę określono przy użyciu analizatora aminokwasów Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) stosując chromatografię jonowymienną i derywatyzację z wykrywaniem metodą ninhydrynową.
W Tabeli 1 przedstawiono wyniki doś wiadczenia.
T a b e l a 1
| Szczep | OD (660) | Lizyna HCl g/l |
| DSM5715/pCR2.1 zwal exp | 12,1 | 11,93 |
| DSM5715 | 13,1 | 9,54 |
Opis Figur
Figura 1: Mapa plazmidu DSM5715/pCR2.1zwa1exp. Podane wielkości mają charakter przybliżony. Zastosowano następujące skróty i opisy:
| ColE1 ori | miejsce początku replikacji plazmidu ColE1 |
| lacZ | koniec 5' genu β-galaktozydazy |
| f1 ori | miejsce początku replikacji faga f1 |
| KmR | gen oporności na kanamycynę |
| ApR | gen oporności na amplicylinę |
| EcoRI | miejsce restrykcyjne EcoRI |
| Zwa1 | gen zwa1 |
PL 202 783 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Degussa-HUls AG <120> izolowany polinukleotyd, wektor zawierający go i komórka gospoda rza, oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów <130> 990172 BT <140>
<141>
<160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1260 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> -10_sygnał <222> (383)..(388) <220>
<221> ~35_sygnał <222> (360)..(365) <220>
<221> CDS <222> (413)..(1009) <400> 1
| ccgaaatatt | ccaaatatgt | aacataaatc | acacccgatg | attcaggcgg | gatgacctgc | 60 |
| gacttcaagg | tcgcaccaaa | gtcagattga | tatagatttc | gtaaataacg | tgacacaatc | 120 |
| gtgaccttcg | ggttaccgtg | tatcccaggc | accgcaacag | ttcatctgca | agtccggctc | 180 |
| 31 CC} CC 3 3.3 C | cc t: er h n fc. ctctcj —------j j ςι | gtcggaagtt | gaacaacctc | cttggtgcaa | cagaacttta | 240 |
| aaccacaaac | tcccgcattc | atgtgggcca | tattgcagac | agggacgggg | aaaccaccca | 300 |
| ccatcttttc | acaaaagaag | gcatggaggc | caactccttg | gggtgaagcc | agacatccac | 360 |
| tggeagagca | actcctccgc | tctaacccga | cagctaacct | cgacggcgac | aa atg aga Met Arg | 418 |
| gga Gly | aaa Lys | ctt Leu 5 | ttc Phe | atg Met | gga Gly | cgt Arg | cac His 10 | tcc Ser | act Thr | aag Lys | act Thr | agc Ser 15 | tcc Ser | ,gcg Ala | ttc Phe | 466 |
| acc | aag | ctc | gca | gct | tcc | acc | atc | gct | ttc | ggt | gct | gct | gca | acc | atc | 514 |
| Thr | Lys | Leu | Ala | Ala | Ser | Thr | Ile | Ala | Phe | Gly | Ala | Ala | Ala | Thr | Ile | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| atg | gct | cct | tct | gca | tct | gct | gca | cct | gat | tcc | gac | tgg | gat | cgc | etc | 562 |
| Met | Ala | Pro | Ser | Ala | Ser | Ala | Ala | Pro | ASp | Ser | Asp | Trp | Asp | Arg | Leu | |
| 35 | 40 | 45 | 50 |
PL 202 783 B1
| gca Ala | cag Gin | tgc Cys | gag Glu | tcc Ser 55 | ggt Gly | ggt Gly | aac Asn | tgg Trp | gca Al a 60 | atc Ile | aac Asn | acc Thr | ggt Gly | aac Asn 65 | ggc Gly | 610 |
| tac | cac | ggt | ggt | ctg | cag | ttc | tcc | gct | agc | acc | tgg | gct | gct | tac | ggc | 658 |
| Tyr | His | Gly | Gly | Leu | Gin | Phe | Ser | Ala | Ser | Thr | Trp | Ala | Ala | Tyr | Gly | |
| 70 | 75 | 80 | ||||||||||||||
| ggc | cag | gag | ttc | gct | acc | tac | gca | tac | cag | gca | acc | cgt | gag | cag | cag | 706 |
| Gly | Gin | Glu | Phe | Ala | Thr | Tyr | Ala | Tyr | Gin | Ala | Thr | Arg | Glu | Gin | Glrt | |
| Θ5 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| atc | gct. | gtt | gca | gag | cgc | acc | ttg | gct | ggt | cag | ggc | tgg | ggc | gca | tgg | 754 |
| Ile | Ala | Val | Ala | Glu | Arg | Thr | Leu | Ala | Gly | Gin | Giy | Trp | Gly | Ala | Trp | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| cct | gct | tgc | tcc | gct | tcc | ctt | gga | ctg | aac | tcc | gct | cca | acc | cag | cgt | 802 |
| Pro | Ala | Cys | Ser | Ala | Ser | Leu | Gly | Leu | Asn | Ser | Ala | Pro | Thr | Gin | Arg | |
| 115 | 120 | 125 | 130 | |||||||||||||
| gac | ctc | tcc | gct | acc | acc | tcc | acc | cca | gag | cca | gct | gca | gct | gca | cca | 850 |
| Asp | Leu | Ser | Ala | Thr | Thr | Ser | Thr | Pro | Glu | Pro | Ala | Ala | Ala | Ala | Pro | |
| 135 | 140 | 145 | ||||||||||||||
| gct | gtt | gct | gag | tac | aac | gct | cct | gca | gcc | aac | atc | gca | gtt | ggc | tcc | 898 |
| Ala | Val | Ala | Glu | Tyr | Asn | Ala | Pro | Ala | Ala | Asn | Ile | Ala | Val | Gly | Ser | |
| 150 | 155 | 160 | ||||||||||||||
| acc | gac | ttg | aac | acc | atc | aag | tcc | acc | tac | ggc | gct | gtc | acc | ggc | acc | 946 |
| Thr | Asp | Leu | Asn | Thr | Ile | Lys | Ser | Thr | Tyr | Gly | Ala | Val | Thr | Gly | Thr | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| ctc | gct | cag | tac | ggc | atc | acc | gtt | cca | gct | gag | gtt | gag | tct | tac | tac | 994 |
| Leu | Ala | Gin | Tyr | Gly | Ile | Thr | Val | Pro | Ala | Glu | val | Glu | Ser | Tyr | Tyr | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| aac | gct | ttc | gtc | ggc | taaatctagc tgcacttttt aaaagggagg gaaccttaaa | 10<Τ | ||||||||||
| Asn | Ala | Phe | Val | Gly |
195
<210> 2 <211> 199 <212> PR7 <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2
Met Arg Gly Lys Leu Phe Met Gly Arg His Ser Thr Lys Thr Ser Ser 15 10 15
Ala Phe Thr Lys Leu Ala Ala Ser Thr Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ala 20 25 30
PL 202 783 B1
Thr Ile Met Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ala Pro Asp Ser Asp Trp Asp 35 40 45
Arg Leu Ala Gin Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly 50 55 60
Asn Gly Tyr His Gly Gly Leu Gin Phe Ser Ala Ser Thr Trp Ala Ala
70 75 80
Tyr Gly Gly Gin Glu Phe Ala Thr Tyr Ala Tyr Gin Ala Thr Arg Glu
90 95
Gin Gin Ile Ala Val Ala Glu Arg Thr Leu Ala Gly Gin Gly Trp Gly 100 105 110
Ala Trp Pro Ala Cys Ser Ala Ser Leu Gly Leu Asn Ser Ala Pro Thr 115 120 125
Gin Arg Asp Leu Ser Ala Thr Thr Ser Thr Pro Glu Pro Ala Ala Ala 130 135 140
Ala Pro Ala Val Ala Glu Tyr Asn Ala Pro Ala Ala Asn Ile Ala Val
145 150 155 160
Gly Ser Thr Asp Leu Asn Thr Ile Lys Ser Thr Tyr Gly Ala Val Thr
165 170 175
Gly Thr Leu Ala Gin Tyr Gly Ile Thr Val Pro Ala Glu Val Glu Ser 180 185 190
Tyr Tyr Asn Ala Phe Val Gly 195
PL 202 783 B1
Claims (19)
1. Wyizolowany polinukleotyd kodujący:
a) polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 2,
b) polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 95% identyczna z sekwencją przedstawioną na Id. Sekw. nr 2.
2. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa jest wybrana z grupy obejmującej:
a) sekwencję nukleotydową przedstawioną na Id. Sekw. Nr 1,
b) sekwencję odpowiadającą sekwencji z a) z uwzględnieniem degeneracji kodu genetycznego, i
c) sekwencję nukleotydową odpowiadającą nukleotydom 413 do 1009 z sekwencji nukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
d) sekwencję nukleotydową komplementarną do sekwencji z a) b).
3. Polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 2.
4. Polinukleotyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że pochodzi z bakterii Corynebacterium.
5. Wektor zdolny do replikacji w bakteriach Corynebacterium, który obejmuje sekwencję nukleotydową określoną w zastrz. 1 albo 2, albo 4.
6. Bakterie Corynebacterium o zwiększonym wyrażeniu polinukleotydu kodującego polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest na Id. Sekw. nr 2 do poziomu, w którym zwiększone jest wytwarzanie L-aminokwasów w tych bakteriach.
7. Bakterie Corynebacterium według zastrz. 6, znamienne tym, że wewnątrzkomórkowa aktywność polipeptydu, o sekwencji przedstawionej na Id. Sekw. Nr 2 jest zwiększona przez wzrost ilości kopii polinukleotydu kodującego ten polipeptyd lub przez zastosowanie silnego promotora i, gdzie jest to właściwe, przez kombinację tych cech.
8. Bakterie Corynebacterium według zastrz. 6 albo 7, znamienne tym, że są transformowane wektorem obejmującym polinukleotyd kodujący polipeptyd przedstawiony na Id. Sekw. nr 2.
9. Sposób wytwarzania L-aminokwasów, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym bakterie określone w zastrz. 6 albo 7 albo 8 poddawane są fermentacji w odpowiedniej pożywce.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że
a) bakterie poddaje się fermentacji w odpowiedniej pożywce,
b) poziom odpowiedniego L-aminokwasu/aminokwasów zwiększa się w pożywce lub w komórkach bakterii, i
c) izoluje się L-aminokwas/y.
11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, albo 11, znamienny tym, że stosuje się bakterie Corynebacterium wytwarzające L-lizynę.
12. Sposób według zastrz. 9 albo 10, albo 11, znamienny tym, że L-lizynę wytwarza się przez fermentację bakterii, w których równocześnie zostały wzmocnione, w szczególności przez nadekspresję lub amplifikację jeden lub większa liczba genów wybranych z grupy składającej się z:
a) genu dapA dla syntazy dihydrodipikolinanowej,
b) genu lysC kodującego kinazę asparaginianową oporną na sprzężenie zwrotne,
c) genu dapD kodującego sukcynylazę tetradihydropikolinianową,
d) genu dapE kodującego desukcynylazę sukcynylodiaminopijabłaczanową,
e) genu gap dla dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej
f) genu pyc dla karboksylazy pirogronianowej,
g) genu mqo dla oksydoreduktazy jabłczanowo:chinonowej;
h) genu lysE kodującego białko związane z eksportem lizyny.
13. Sposób według zastrz. 9 albo 10, albo 11, znamienny tym, że L-lizynę wytwarza się przez fermentację bakterii, w których atenuowany jest gen pgi kodujący izomerazę glukozo-6-fosforanową.
14. Sposób według jednego z zastrz. od 9 do 13, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizmy z gatunku Corynebacterium glutamicum.
15. Wektor pCR2.1zwa1exp zdeponowany w E. coli pod numerem dostępu DSM 13115.
16. Starter obejmujący, co najmniej 30 kolejnych nukleotydów z sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
PL 202 783 B1
17. Starter według zastrz. 16, znamienny tym, że obejmuje co najmniej 40 kolejnych nukleotydów z sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
18. Sonda obejmująca, co najmniej 30 kolejnych nukleotydów z sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
19. Sonda według zastrz. 18, znamienna tym, że obejmuje co najmniej 40 kolejnych nukleotydów z sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19959328A DE19959328A1 (de) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | Neue für das zwa1-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL344386A1 PL344386A1 (en) | 2001-06-18 |
| PL202783B1 true PL202783B1 (pl) | 2009-07-31 |
Family
ID=7931969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL344386A PL202783B1 (pl) | 1999-12-09 | 2000-12-08 | Wyizolowany polinukleotyd, polipeptyd, wektor, bakterie Corynebacterium, starter, sonda oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6632644B2 (pl) |
| EP (1) | EP1111062B1 (pl) |
| JP (1) | JP2001197893A (pl) |
| KR (1) | KR20010062272A (pl) |
| CN (1) | CN1304998A (pl) |
| AT (1) | ATE293698T1 (pl) |
| AU (1) | AU7201800A (pl) |
| BR (1) | BR0005804A (pl) |
| DE (2) | DE19959328A1 (pl) |
| ES (1) | ES2241538T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0004880A2 (pl) |
| ID (1) | ID28607A (pl) |
| MX (1) | MXPA00010971A (pl) |
| PL (1) | PL202783B1 (pl) |
| RU (1) | RU2260048C2 (pl) |
| SK (1) | SK18342000A3 (pl) |
| ZA (1) | ZA200007269B (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060014259A9 (en) * | 1999-07-09 | 2006-01-19 | Kevin Burke | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
| US20050112733A1 (en) * | 2000-03-20 | 2005-05-26 | Degussa Ag | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
| DE10047142A1 (de) * | 2000-09-23 | 2002-04-11 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| CA2456416A1 (en) * | 2001-08-06 | 2003-02-20 | Degussa Ag | Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii |
| US7160711B2 (en) | 2001-08-06 | 2007-01-09 | Degussa Ag | Coryneform bacteria which produce chemical compounds I |
| WO2003029457A1 (fr) * | 2001-09-28 | 2003-04-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de production d'acide amine |
| DE10210527A1 (de) | 2002-03-09 | 2003-09-18 | Degussa | Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| DE102004011248A1 (de) * | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| KR100768748B1 (ko) * | 2004-12-30 | 2007-10-19 | 씨제이 주식회사 | 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법 |
| DE102005013676A1 (de) | 2005-03-24 | 2006-09-28 | Degussa Ag | Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien |
| US20070092951A1 (en) | 2005-03-24 | 2007-04-26 | Degussa Ag | Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria |
| DE102005023829A1 (de) | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Degussa Ag | Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| DE102007005072A1 (de) | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin |
| US20090246226A1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Zeon Corporation | Avian vaccines possessing a positive marker gene |
| KR101294935B1 (ko) | 2011-04-01 | 2013-08-08 | 씨제이제일제당 (주) | 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 |
| US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
| US11208649B2 (en) | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
| BR112018011503A2 (pt) | 2015-12-07 | 2018-12-04 | Zymergen Inc | promotores da corynebacterium glutamicum |
| US10544390B2 (en) | 2016-06-30 | 2020-01-28 | Zymergen Inc. | Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof |
| EP3478845A4 (en) | 2016-06-30 | 2019-07-31 | Zymergen, Inc. | METHOD OF GENERATING A GLUCOSE PERMEASE LIBRARY AND USES THEREOF |
| KR20200026881A (ko) | 2017-06-07 | 2020-03-11 | 지머젠 인코포레이티드 | 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 및 보조 유전자 발현을 조절하는 데 이의 용도 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643758A (en) * | 1987-03-10 | 1997-07-01 | New England Biolabs, Inc. | Production and purification of a protein fused to a binding protein |
| GB2223754B (en) * | 1988-09-12 | 1992-07-22 | Degussa | Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase |
| DE3943117A1 (de) * | 1989-12-27 | 1991-07-04 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| US6797509B1 (en) * | 1999-07-09 | 2004-09-28 | Degussa-Huls Ag | Nucleotide sequences which code for the tal gene |
-
1999
- 1999-12-09 DE DE19959328A patent/DE19959328A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-11-04 EP EP00124042A patent/EP1111062B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-04 DE DE50010097T patent/DE50010097D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-04 AT AT00124042T patent/ATE293698T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-11-04 ES ES00124042T patent/ES2241538T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-08 MX MXPA00010971A patent/MXPA00010971A/es unknown
- 2000-11-24 ID IDP20001018A patent/ID28607A/id unknown
- 2000-12-01 AU AU72018/00A patent/AU7201800A/en not_active Abandoned
- 2000-12-01 SK SK1834-2000A patent/SK18342000A3/sk unknown
- 2000-12-06 JP JP2000371852A patent/JP2001197893A/ja active Pending
- 2000-12-07 ZA ZA200007269A patent/ZA200007269B/xx unknown
- 2000-12-07 CN CN00134034A patent/CN1304998A/zh active Pending
- 2000-12-08 US US09/731,909 patent/US6632644B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-08 RU RU2000130809/13A patent/RU2260048C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-12-08 PL PL344386A patent/PL202783B1/pl unknown
- 2000-12-08 KR KR1020000074679A patent/KR20010062272A/ko not_active Withdrawn
- 2000-12-08 BR BR0005804-1A patent/BR0005804A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-12-08 HU HU0004880A patent/HUP0004880A2/hu unknown
-
2003
- 2003-08-14 US US10/640,263 patent/US7074607B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-05-22 US US11/419,529 patent/US7262036B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020127663A1 (en) | 2002-09-12 |
| KR20010062272A (ko) | 2001-07-07 |
| US20060205046A1 (en) | 2006-09-14 |
| US6632644B2 (en) | 2003-10-14 |
| DE50010097D1 (de) | 2005-05-25 |
| ZA200007269B (en) | 2001-06-07 |
| US7262036B2 (en) | 2007-08-28 |
| PL344386A1 (en) | 2001-06-18 |
| HUP0004880A2 (en) | 2002-10-28 |
| SK18342000A3 (sk) | 2001-12-03 |
| EP1111062B1 (de) | 2005-04-20 |
| ES2241538T3 (es) | 2005-11-01 |
| CN1304998A (zh) | 2001-07-25 |
| EP1111062A1 (de) | 2001-06-27 |
| DE19959328A1 (de) | 2001-06-13 |
| US7074607B2 (en) | 2006-07-11 |
| ID28607A (id) | 2001-06-14 |
| AU7201800A (en) | 2001-06-14 |
| HU0004880D0 (pl) | 2001-02-28 |
| RU2260048C2 (ru) | 2005-09-10 |
| MXPA00010971A (es) | 2002-05-23 |
| JP2001197893A (ja) | 2001-07-24 |
| ATE293698T1 (de) | 2005-05-15 |
| US20040063180A1 (en) | 2004-04-01 |
| BR0005804A (pt) | 2001-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2249293T3 (es) | Secuencias de nucleotidos para el gen tal. | |
| US6632644B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the zwa1 gene | |
| US20020106748A1 (en) | Novel nucleotide sequences encoding the zwa2 gene | |
| HUP0101166A2 (hu) | A dapC-gént kódoló nukleotid szekvenciák és eljárás L-lizin előállítására | |
| KR100828451B1 (ko) | ｌｙｓＲ3 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 | |
| KR100762112B1 (ko) | ｐｔｓＨ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| US6913910B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the glk-gene | |
| ES2233665T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen iysr3. | |
| US6818432B2 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| US20020094554A1 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| US6806068B1 (en) | Nucleotide sequences which encode the pfk gene | |
| US6830921B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the ACP gene | |
| MXPA00011412A (es) | Nuevas secuencias nucleotidas que condifican al gen pfka. | |
| US20020155555A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the pgsA2 gene | |
| KR20020097244A (ko) | ｐｇｓＡ2 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 |