PL202844B1

PL202844B1 - Immunogeniczny polipeptyd, polinukleotyd, polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, wektor ekspresji, kompozycja szczepionki, polipeptyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis, polinukleotyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis i sposób wytwarzania polipeptydu

Info

Publication number: PL202844B1
Application number: PL344142A
Authority: PL
Inventors: Yasir A. Skeiky; Mark Alderson; Antonio Campos-Neto
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 1998-04-07
Filing date: 1999-04-07
Publication date: 2009-07-31
Also published as: CN1629185A; NO20005050D0; BR9909472A; KR20060064698A; HUP0101521A2; CZ302870B6; US20060171965A1; HU228354B1; TR200002938T2; AU753995B2; US7186412B1; JP4227302B2; NZ507378A; EP1068329A2; JP4326008B2; WO1999051748A2; NO20120621L; CN1304451A; CA2326598C; CA2326598A1

Description

1. Dziedzina wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest immunogeniczny polipeptyd, polinukleotyd, polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, wektor ekspresji, kompozycja szczepionki, polipeptyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis, polinukleotyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis i sposób wytwarzania polipeptydu.

2. Stan techniki

Gruźlica jest przewlekłą chorobą zapalną, wywoływaną zakażeniem M. tuberculosis. Stanowi ona jedną z najważniejszych chorób w krajach rozwijających się, jak również stanowi coraz większy problem w rozwiniętych regionach świata; rocznie stwierdza się około 8 milionów nowych przypadków i 3 miliony zgonów z powodu gruźlicy. Jakkolwiek zakażenie może przez dłu ższy czas pozostawać nierozpoznane, choroba zwykle daje objawy ostrego zapalenia płuc, z gorączką i kaszlem bez odkrztuszania. W przypadku braku leczenia dochodzi zwykle do poważnych powikłań i zgonu.

Jakkolwiek gruźlicę można na ogół zwalczać długotrwałą antybiotykoterapią, leczenie takie jest niewystarczające do zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby. Zakażeni mogą przez pewien czas nie mieć objawów, a zakażać następne osoby. Ponadto, mimo że stosowanie się do zaleceń lekarskich ma kluczowe znaczenie, trudno jest nadzorować zachowanie pacjentów. Niektórzy chorzy nie kończą całego cyklu leczenia, co może prowadzić do nieskuteczności leczenia i rozwoju lekooporności.

Dla kontrolowania rozprzestrzeniania się gruźlicy istotne znaczenie mają skuteczne szczepienia i trafne wczesne rozpoznanie choroby. Obecnie najskuteczniejszą metodą wywoł ywania ochronnej odporności jest szczepienie żywymi drobnoustrojami. Najczęstszym stosowanym w tym celu Mycobacterium jest Bacillus Calmette-Guerin (BCG), awirulentny szczep M. bovis. Jednakże bezpieczeństwo i skuteczność BCG budzą wątpliwości i w niektórych krajach, na przykład w Stanach Zjednoczonych, nie szczepi się ogółu społeczeństwa tym szczepem.

Gruźlicę rozpoznaje się zwykle na podstawie testu skórnego, polegającego na śródskórnym podaniu tuberkuliny PPD (oczyszczonej pochodnej białkowej). Swoiste dla antygenu reakcje limfocytów T powodują mierzalne stwardnienie w miejscu wstrzyknięcia po 48-72 godzinach od wstrzyknięcia, co wskazuje na ekspozycję na antygeny Mycobacterium. W przypadku tego testu problemem jest jednak czułość i swoistość, ponadto nie można odróżnić osób szczepionych BCG od osób zakażonych.

Chociaż jak wykazano, głównymi efektorami odporności na M. tuberculosis są makrofagi, to głównymi induktorami tej odporności są limfocyty T. Dowodem kluczowej roli limfocytów T w ochronie przed zakażeniem M. tuberculosis jest częste występowanie M. tuberculosis u chorych z zespołem nabytego braku odporności (AIDS), związane ze zmniejszeniem liczby limfocytów CD4⁺ spowodowanym zakażeniem ludzkim wirusem nabytego braku odporności (HIV). Wykazano, że reagujące na Mycobacterium limfocyty T CD4+ są silnymi induktorami interferonu gamma (IFN-γ), który z kolei, jak wykazano, wyzwala działanie makrofagów przeciwko Mycobacterium u myszy. Mimo że rola IFN-γ u ludzi jest mniej oczywista, badania wykazały, że 1,25-dihydroksywitamina D3, sama lub w połączeniu z IFN-γ lub czynnikiem martwicy nowotworu-alfa, aktywuje ludzkie makrofagi do hamowania zakażenia M. tuberculosis. Ponadto wiadomo, że IFN-γ pobudza ludzkie makrofagi do wytwarzania 1,25-dihydroksywitaminy D3. Podobnie wykazano, że interleukina-12 (IL-12) odgrywa rolę w pobudzaniu oporności na zakażenie M. tuberculosis. Przegląd immunologii zakażenia M. tuberculosis można znaleźć w Chan i Kaufmann, 1994, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, red. Bloom, ASM Press, Waszyngton, D.C.

W związku z tym istnieje potrzeba opracowania ulepszonych szczepionek i ulepszonych sposobów rozpoznawania, zapobiegania i leczenia gruźlicy.

Przedmiotem wynalazku jest immunogeniczny polipeptyd, zawierający sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr 2, ewentualnie zawierającą jedną konserwatywną substytucję aminokwasem.

Korzystnie taki immunogeniczny polipeptyd, według wynalazku stanowi sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr 2, ewentualnie zawierającą jedną konserwatywną substytucję aminokwasem.

Także korzystnie, immunogeniczny polipeptyd, może zawierać sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 2, która ewentualnie zawiera jedną konserwatywną substytucję aminokwasem. Może także koPL 202 844 B1 rzystnie zawierać sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 792 w SEQ ID nr 2, lub sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 2. Bardziej korzystnie stanowi sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 2.

Przedmiotem wynalazku jest także polinukleotyd, który koduje polipeptyd zdefiniowany powyżej we wszystkich jego tutaj ujawnionych aspektach.

Przedmiotem wynalazku jest też polinukleotyd, zawierający pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w średnich warunkach hybrydyzacji z drugą sekwencją polinukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr: 2, przy czym wspomniany polinukleotyd zawiera pierwsza sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest funkcjonalnie równoważny sekwencji reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr: 2, w próbach wytwarzania proliferacji komórki T lub interferonu gamma.

Korzystnie polinukleotyd, zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w bardzo ostrych warunkach hybrydyzacji z drugą sekwencją polinukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr: 2, przy czym wspomniany polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest funkcjonalnie równoważny sekwencji reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr: 2, w te ś cie wytwarzania proliferacji komórki T lub interferonu gamma.

Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku zdefiniowany powyżej. Korzystnie polipeptyd ten może być wytwarzany metodami rekombinacji DNA, ewentualnie, również korzystnie metodami syntezy chemicznej. Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku korzystnie indukuje odpowiedź komórki T.

Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku korzystnie może być połączony poprzez fuzję z drugim heterologicznym polipeptydem.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera polipeptyd zdefiniowany powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca polinukleotyd powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresji, charakteryzujący się tym, że zawiera polinukleotyd zdefiniowany powyżej. Korzystnie wektor ekspresji może być wektorem wirusowym.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja szczepionki, która zawiera polipeptydy zdefiniowane powyżej i adiuwant.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja szczepionki, która zawiera polinukleotydy zdefiniowany powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także każdy polipeptyd zdefiniowany powyżej do stosowania do leczenia lub zapobiegania infekcjom M. Tuberculosis.

Wynalazek ujawnia także polinukleotyd zdefiniowany powyżej do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom M. Tuberculosis.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania polipeptydów zdefiniowanych powyżej, polegający na tym, że prowadzi się ekspresję rekombinacyjną polinukleotydu jak zdefiniowano powyżej.

Niniejszy wynalazek opiera się w części na odkryciu autorów, że polinukleotydy, które zawierają od dwóch do pięciu sekwencji kodujących M. tuberculosis, wytwarzają rekombinacyjne białka fuzyjne, które zachowują immunogenność i antygenowość ich poszczególnych składowych. Opisane tutaj białka fuzyjne według niniejszego wynalazku indukują reakcje limfocytów zarówno T, jak i B, co można zmierzyć poprzez proliferację limfocytów T, wytwarzanie cytokin i wytwarzanie przeciwciał. Ponadto jako immunogen stosowano in vivo białko fuzyjne z adiuwantami w celu wywołania zarówno komórkowej, jak i humoralnej odporności na M. tuberculosis. Ponadto wytwarzano konstrukt białka fuzyjnego do stosowania w wytwarzaniu szczepionki z adiuwantem do uzyskania długotrwałej ochrony zwierząt przed rozwojem gruźlicy. Białko fuzyjne było immunogenem skuteczniejszym, niż mieszanina poszczególnych jego składników białkowych.

Immunogeniczny polipeptyd M. tuberculosis według niniejszego wynalazku można wytwarzać w postaci kompozycji farmaceutycznych do podawania pacjentowi w celu zapobiegania i/lub leczenia zakażenia M. tuberculosis. Immunogenność białka fuzyjnego można zwiększyć dodając adiuwant.

Według innego aspektu wynalazku stosuje się polinukleotydy według wynalazku do wytwarzania rekombinacyjnych antygenów polipeptydu fuzyjnego in vitro.

Polinukleotydy można podawać pacjentowi bezpośrednio jako szczepionki DNA w celu wywołania ekspresji antygenu w organizmie pacjenta, i w wyniku tego, wywołania reakcji immunologicznej przeciwko M. tuberculosis.

PL 202 844 B1

Możliwe jest również zastosowanie polipeptydów według wynalazku do sporządzenia testów in vitro do wykrywania przeciwciał humoralnych lub odporności komórkowej przeciwko M. tuberculosis w celu rozpoznawania zakażenia lub obserwacji postępu choroby. Ponadto polipeptydy immunogeniczne według wynalazku można stosować jako środek diagnostyczny in vitro w postaci śródskórnego testu skórnego. Oprócz tego, polipeptydy te można stosować jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał przeciwko M. tuberculosis w organizmie zwierzęcia (innego niż człowiek). Przeciwciała można stosować do wykrywania docelowych antygenów in vivo i in vitro.

4. Krótki opis rysunków

Fig. 1A i 1B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 1) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 2) białka trifuzyjnego Ra12-TbH9-Ra35 (oznaczonego jako Mtb32A)

Fig. 2: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 3) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 4) białka trifuzyjnego Erd14-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb3 9A)

Fig. 3A-3D: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 5) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 6) białka trifuzyjnego TbRa3-38kD-Tb38-1

Fig. 4A-4D: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 7) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 8) białka bifuzyjnego TbH9-Tb38-1

Fig. 5A-5J: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 9) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 10) białka tetrafuzyjnego TbRa3-38kD-Tb38-lDPEP (oznaczonego jako TbF-2)

Fig. 6A i 6B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 11) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 12) białka pentafuzyjnego Erd14-DPV-MTI-MSL-MTCC2 (oznaczonego jako Mtb88f)

Fig. 7A i 7B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 13) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 14) białka tetrafuzyjnego Erd14-DPV-MTI-MSL (oznaczonego jako Mtb46f)

Fig. 8A i 8B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 15) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 16) białka tetrafuzyjnego DPV-MTI-MSL-MTCC2 (oznaczonego jako Mtb71f)

Fig. 9A i 9B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 17) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 18) białka trifuzyjnego DPV-MTI-MSL (oznaczonego jako Mtb31f)

Fig. 10A i 10B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 19) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 20) białka trifuzyjnego TbH9-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb61f)

Fig. 11A i 11B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 21) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 22) białka trifuzyjnego Erd14-DPV-MTI (oznaczonego jako Mtb36f)

Fig. 12A i 12B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 23) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 24) białka bifuzyjnego TbH9-Ra35 (oznaczonego jako Mtb59f)

Fig. 13A i 13B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr 25) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID Nr 26) białka bifuzyjnego Ra12-DPPD (oznaczonego jako Mtb24)

Fig. 14A-14F: Reakcje proliferacyjne limfocytów T sześciu osobników PPD+ po stymulacji dwoma białkami fuzyjnymi i ich oddzielnymi składnikami

Fig. 15A-15F: wytwarzanie IFN-γ w organizmach sześciu osobników PPD+ po stymulacji dwoma białkami fuzyjnymi i ich oddzielnymi składnikami

Fig. 16A-16F: proliferacja limfocytów T myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem

Fig. 17: wytwarzanie IFN-γ myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem

Fig. 18: wytwarzanie IL-4 myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem

Fig. 19A-19F: stężenie przeciwciał w surowicy myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym lub jego oddzielnymi składnikami i adiuwantem

Fig. 20A-20C: przeżycie świnek morskich po ekspozycji na M. tuberculosis w aerozolu. Przed ekspozycją na bakterie u świnek morskich zastosowano jako immunogen białka fuzyjne Mtb32A i Mtb39A, w kompozycji z adiuwantem SBAS1c (20A), SBAS2 (20B) lub SBAS7 (20C). Kontrolą dodatnią jest BCG.

Fig. 21A i 21B: stymulacja proliferacji i wytwarzania IFN-γ w TbH9-swoistych limfocytach T przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1.

Fig. 22A i 22B: stymulacja proliferacji i wytwarzania IFN-γ w Tb38-1-swoistych limfocytach T przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1.

Fig. 23A i 23B: stymulacja proliferacji i wytwarzania IFN-γ w limfocytach T, dla których uprzednio wykazano reakcję zarówno na antygen TbH-9, jak i Tb38-1, przez białko fuzyjne TbH9-Tb38-1.

PL 202 844 B1

5. Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku są immunogenne polipeptydy, które stanowią antygeny użyteczne w leczeniu i zapobieganiu gruźlicy, polinukleotydy kodujące takie antygeny i sposoby ich zastosowania. Antygeny według niniejszego wynalazku są polipeptydami fuzyjnymi antygenów M. tuberculosis i jego odmian. Bardziej szczegółowo, antygeny te zawierają co najmniej dwa polipeptydy M. tuberculosis, które uległy fuzji do większej cząsteczki polipeptydu fuzyjnego. Antygeny według niniejszego wynalazku mogą ponadto zawierać inne składniki, przeznaczone do zwiększenia immunogenności antygenów lub do ulepszenia tych antygenów w innych aspektach, na przykład izolacja antygenów poprzez dodanie przedłużenia z reszt histydynowych na jednym z końców antygenu.

5.1. Antygeny swoiste dla M. tuberculosis

Antygeny według niniejszego wynalazku przedstawiono na Fig. 1A-13B, włączając homologi i odmiany tych antygenów. Antygeny te można modyfikować poprzez na przykład dodanie łącznikowych sekwencji peptydowych, jak to opisano poniżej. Te peptydy łącznikowe można włączać między jeden lub więcej polipeptydów, tworzących każde z białek fuzyjnych przedstawionych na Fig. 1A-13B. Innymi antygenami według niniejszego wynalazku są antygeny opisane na Fig. 1A-13B, połączone ze znanym antygenem M. tuberculosis, takim jak uprzednio opisywany antygen 38 kD (SEQ ID Nr 27) (Andersen i Hansen, 1989, Infect. Immun. 57:2481-2488; Genbank nr nabycia M30046).

5.2. Testy immunogenności

Antygeny według niniejszego wynalazku i ich immunogenne części, mają zdolność do wywoływania reakcji immunogennej. Bardziej szczegółowo, antygeny mają zdolność do wywoływania proliferacji i/lub wytwarzania cytokin (to znaczy wytwarzania interferonu γ i/lub interleukiny 12) w limfocytach T, komórkach NK, limfocytach B i/lub makrofagach, pochodzących od osobnika odpornego na M. tuberculosis. Dobór typu komórki do zastosowania w ocenie reakcji immunogennej będzie zależał od badanej reakcji. Na przykład wytwarzanie interleukiny 12 najłatwiej ocenia się z zastosowaniem preparatów zawierających limfocyty B i/lub makrofagi. Osobnik odporny na M. tuberculosis jest to taki osobnik, którego uważa się za opornego na rozwój gruźlicy poprzez to, że doszło u niego do skutecznej reakcji limfocytów T przeciwko M. tuberculosis (to znaczy, jest on w zasadzie wolny od objawów choroby). Osobniki takie można zidentyfikować w oparciu o silnie dodatni (to znaczy, stwardnienie o ś rednicy powyż ej 10 mm) wynik testu skórnego na białka gruźlicy (PPD) i brak jakichkolwiek przedmiotowych i podmiotowych objawów gruźlicy. Limfocyty T, komórki NK, limfocyty B i makrofagi pochodzące od osobnika odpornego na M. tuberculosis można wytwarzać sposobami znanymi specjalistom. Na przykład można stosować preparat PBMC (to znaczy, jednojądrzastych komórek krwi obwodowej) bez dalszego rozdzielania komórek składowych. PBMC można na ogół wytworzyć na przykład stosując odwirowanie gęstości poprzez „FICOLL” (Winthrop Laboratories, NY). Limfocyty T do testów według niniejszego wynalazku można również oczyszczać bezpośrednio z PBMC. Zamiast tego można stosować wzbogaconą linię komórkową limfocytów T przeciwko białkom Mycobacterium, lub klony limfocytów T reaktywne na poszczególne białka Mycobacterium. Takie klony limfocytów T można wytwarzać na przykład poprzez hodowlę PBMC od osobników odpornych na M. tuberculosis z białkami Mycobacterium przez czas 2-4 tygodni. Umożliwia to ekspansję jedynie limfocytów T swoistych przeciwko białkom Mycobacterium, co powoduje powstanie linii złożonej wyłącznie z takich komórek. Komórki te można następnie klonować i badać z poszczególnymi białkami, stosując sposoby znane specjalistom w celu dokładniejszego zdefiniowania swoistości poszczególnych limfocytów T. Ogólnie, antygeny, które wypadają dodatnio w testach na proliferację i/lub wytwarzanie cytokin (to znaczy wytwarzanie interferonu γ i/lub interleukiny 12), wykonanych z zastosowaniem limfocytów T, komórek NK, limfocytów B i/lub makrofagów pochodzących od osobników odpornych na M. tuberculosis, uważa się za immunogenne. Testy takie można przeprowadzić na przykład stosując przykładowe opisane poniżej procedury. Immunogenne części takich antygenów można zidentyfikować stosując podobne testy, i mogą one być obecne w polipeptydach opisanych poniżej.

Zdolność polipeptydu (na przykład immunogennego antygenu, lub jego części lub innej odmiany) do wywoływania proliferacji komórek, ocenia się poprzez zetknięcie komórek (na przykład komórek T i/lub komórek NK) z polipeptydem i pomiar proliferacji komórek. Na ogół ilość polipeptydu, wystarczająca do oceny około 10⁵ komórek, wynosi od około 10 ng/ml do około 100 μg/ml, a korzystnie wynosi około 10 μg/ml. Inkubację polipeptydu z komórkami prowadzi się typowo w temperaturze 37°C przez około sześć dni. Po inkubacji z polipeptydem komórki bada się pod kątem reakcji proliferacyjnej, którą można oceniać sposobami znanymi specjalistom, na przykład poprzez eksponowanie komórek na impuls wyznakowanej radioaktywnie tymidyny i pomiar włączania znacznika do DNA komórek.

PL 202 844 B1

Ogólnie, polipeptyd powodujący co najmniej trzykrotne zwiększenie proliferacji powyżej poziomu tła (to znaczy proliferacji obserwowanej dla komórek hodowanych bez polipeptydu) uważa się za zdolny do indukcji proliferacji. Zdolność polipeptydu do stymulowania wytwarzania interferonu γ i/lub interleukiny 12 można oceniać poprzez zetknięcie komórek z polipeptydem i pomiar poziomu interferonu γ lub interleukiny 12 wytwarzanej przez komórki. Ogólnie, ilość polipeptydu, wystarczająca do oceny około

10⁵ komórek, wynosi od około 10 ng/ml do około 100 μg/ml, a korzystnie, wynosi około 10 μg/ml. Polipeptyd może być, lecz niekoniecznie, unieruchomiony na podłożu stałym, takim jak kulka lub ulegająca rozpadowi biologicznemu mikrosfera, takich jak opisane w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4897268 i 5075109. Inkubację polipeptydu z komórkami typowo prowadzi się w temperaturze 37°C przez około sześć dni. Po inkubacji z polipeptydem komórki bada się pod kątem interferonu γ i/lub interleukiny 12 (lub jednej lub więcej z jej podjednostek), które można oceniać sposobami znanymi specjalistom, takimi jak enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA), lub, w przypadku podjednostki P70 IL-12, test biologiczny, taki jak test z pomiarem proliferacji limfocytów T. Ogólnie polipeptyd powodujący wytwarzanie co najmniej 50 pg interferonu γ na ml nadsączu hodowli (zawierającego 10⁴-10⁵komórek na ml) uważa się za zdolny do stymulowania wytwarzania interferonu γ. Polipeptyd, który pobudza wytwarzanie co najmniej 10 pg/ml podjednostki P70 IL-12 i/lub co najmniej 100 pg/ml podjednostki P40 IL-12, na 10⁵ makrofagów lub limfocytów B (lub na 3x10⁵ PBMC) uważa się za zdolny do pobudzania wytwarzania IL-12.

Ogólnie, antygenami immunogennymi są te antygeny, które pobudzają proliferację i/lub wytwarzanie cytokin (to znaczy, interferonu γ i/lub interleukiny 12) w limfocytach T, komórkach NK, limfocytach B i/lub makrofagach, pochodzących od co najmniej około 25% osobników odpornych na M. tuberculosis. Wśród tych antygenów immunogennych, można wyróżnić polipeptydy o korzystnych właściwościach terapeutycznych w oparciu o wielkość reakcji w powyższych testach i w oparciu o odsetek osobników, dla których obserwuje się reakcję. Ponadto, antygeny o korzystnych właściwościach terapeutycznych nie będą pobudzały proliferacji ani wytwarzania cytokin in vitro w komórkach pochodzących od więcej niż 25% osobników nieodpornych na M. tuberculosis, co eliminuje reakcje nie spowodowane swoiście komórkami reagującymi na M. tuberculosis. Antygeny pobudzające reakcję w dużym odsetku preparatów limfocytów T, komórek NK, limfocytów B i/lub makrofagów od osobników odpornych na M. tuberculosis (z małą częstością reakcji w preparatach komórek od innych osobników) mają korzystne właściwości terapeutyczne.

Antygeny o korzystnych właściwościach terapeutycznych można również zidentyfikować na podstawie ich zdolności do zmniejszania nasilenia zakażenia M. tuberculosis u zwierząt doświadczalnych przy podawaniu w postaci szczepionki. Korzystne preparaty szczepionki do zastosowania u zwierząt doświadczalnych opisano szczegółowo poniżej. Skuteczność można określić w oparciu o zdolność antygenu do zapewniania co najmniej około 50% zmniejszenia liczby bakterii i co najmniej około 40% zmniejszenia śmiertelności po zakażeniu doświadczalnym. Do korzystnych zwierząt doświadczalnych należą myszy, świnki morskie i Naczelne.

5.3. Izolowanie sekwencji kodujących

Przedmiotem niniejszego wynalazku są również cząsteczki kwasów nukleinowych, kodujące polipeptydy fuzyjne M. tuberculosis. W szczegółowych wykonaniach podanych jako przykładowe w poniższym przykładzie 6, zbudowano trzynaście fuzyjnych sekwencji kodujących M. tuberculosis. Według niniejszego wynalazku każdą sekwencję nukleotydową, kodującą sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego można stosować do wytwarzania rekombinacyjnych cząsteczek, kierujących ekspresją sekwencji kodującej.

W celu klonowania pełnej długości sekwencji kodujących lub odmian homologicznych dla wytworzenia polinukleotydów fuzyjnych, można stosować wyznakowane sondy DNA, wytworzone z dowolnej części sekwencji nukleotydowych lub ich komplementów według niniejszego wynalazku, do przeszukiwania biblioteki genomowej lub cDNA, utworzonej z różnych szczepów M. tuberculosis, w celu zidentyfikowania sekwencji kodującej każdego składnika. Izolowanie sekwencji kodujących można przeprowadzić poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR), stosując dwie pule zdegenerowanych primerów oligonukleotydowych, wytworzone na podstawie sekwencji kodujących według niniejszego wynalazku.

Wynalazek ujawnia również izolowane lub oczyszczone polinukleotydy, komplementarne do sekwencji nukleotydowych SEQ ID Nr 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 i 25, oraz polinukleotydy wybiórczo hybrydyzujące do takich sekwencji komplementarnych. W korzystnym wykonaniu zapewnia się też polinukleotyd hybrydyzujący do sekwencji o SEQ ID Nr 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23

PL 202 844 B1 i 25 lub jej sekwencji komplementarnej w łagodnych warunkach hybrydyzacji i kodujący białko, zachowujące immunogenność białek fuzyjnych o SEQ ID Nr 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 i 26. Jako przykład, można podać następujące łagodne warunki hybrydyzacji (zob. także Shilo i Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792): filtry zawierające DNA poddaje się obróbce wstępnej przez 6 godzin w temperaturze 40°C w roztworze zawierającym 35% formamidu, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA i 500 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Hybrydyzację prowadzi się z zastosowaniem tego samego roztworu z następującymi modyfikacjami: stosuje się 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 pg/ml DNA spermy łososiowej, 10% (masa/obj.) siarczanu dekstranu i 5-20 X 10⁶ cpm sondy wyznakowanej ³²P. Filtry inkubuje się w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez 18-20 h w temperaturze 40°C, i następnie płucze przez 1,5 godziny w temperaturze 55°C w roztworze zawierającym 2xSSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA i 0,1% SDS. Roztwór płuczący zastępuje się świeżym roztworem i inkubuje przez dodatkowe półtorej godziny w temperaturze 60°C. Filtry osusza się bibułą i eksponuje na autoradiografię. Jeżeli jest to konieczne, filtry płucze się po raz trzeci w temperaturze 65-68°C i ponownie eksponuje na film. Inne warunki łagodnej hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki (na przykład takie, jak stosowane do hybrydyzacji międzygatunkowej).

Ujawnia się też polinukleotyd, hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEQ ID Nr 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 i 25 lub jej sekwencji komplementarnych w surowych warunkach hybrydyzacji i kodujący białko, zachowujące immunogenność białek fuzyjnych o SEQ ID Nr 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 i 26. Jako przykład, można podać następujące surowe warunki hybrydyzacji: wstępną hybrydyzację filtrów, zawierających DNA, prowadzi się od 8 godzin do czasu przez noc w temperaturze 65°C w buforze złożonym z 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 500 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Filtry hybrydyzuje się przez 48 godzin w temperaturze 65°C w mieszaninie hybrydyzacji wstępnej, zawierającej 100 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososiowej i 5-20 X 10⁶ cpm sondy wyznakowanej ³²P. Płukania filtrów dokonuje się w temperaturze 37°C przez 1 h w roztworze zawierającym 2 X SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll i 0,01% BSA. Następnie prowadzi się płukanie w 0,1 X SSC w temperaturze 50°C przez 45 minut przed autoradiografią. Inne surowe warunki hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki.

W innym korzystnym wykonaniu zapewnia się polinukleotyd hybrydyzujący do sekwencji kodującej SEQ ID Nr 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 lub 25 lub do jej sekwencji komplementarnej w średnich warunkach hybrydyzacji i kodujący białko zachowujące immunogenność białka fuzyjnego o SEQ ID Nr 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 i 26. Przykładowe średnie warunki hybrydyzacji są następujące: filtry zawierające DNA poddaje się obróbce wstępnej przez 6 h w temperaturze 55°C w roztworze zawierającym 6 X SSC, 5X roztwór Denhardta, 0,5% SDS i 100 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososiowej. Hybrydyzację prowadzi się w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez 18-20 h w temperaturze 55°C i następnie płucze dwukrotnie przez 30 minut w temperaturze 60°C w roztworze zawierającym 1 X SSC i 0,1% SDS. Filtry osusza się bibułą i eksponuje na autoradiografię. Inne średnie warunki hybrydyzacji, które można zastosować, są znane ze stanu techniki. Płukanie filtrów prowadzi się w temperaturze 37°C przez 1 h w roztworze zawierającym 2 X SSC, 0,1% SDS.

5.4. Polipeptydy kodowane przez sekwencje kodujące

Według niniejszego wynalazku można stosować polinukleotyd według niniejszego wynalazku, kodujący białko fuzyjne, jego fragmenty lub funkcjonalne odpowiedniki, do wytwarzania cząsteczek rekombinacyjnych kwasów nukleinowych, kierujących ekspresją białka fuzyjnego, jego fragmentów lub funkcjonalnych odpowiedników w odpowiednich komórkach-gospodarzach. Produkty polipeptydu fuzyjnego kodowane przez takie polinukleotydy można modyfikować poprzez molekularną manipulację sekwencji kodującej.

Z uwagi na nieodłączną degenerację kodu genetycznego w praktyce niniejszego wynalazku można stosować inne sekwencje DNA, kodujące w zasadzie tę samą lub funkcjonalnie równoważną sekwencję aminokwasową, do ekspresji polipeptydów fuzyjnych. Do takich sekwencji DNA należą sekwencje zdolne do hybrydyzacji do sekwencji kodujących lub ich komplementów, opisanych w niniejszym wynalazku, w łagodnych, średnich lub surowych warunkach hybrydyzacji opisanych w powyższym podrozdziale 5.3.

Do modyfikacji sekwencji nukleotydowych, które można stosować według niniejszego wynalazku, należą delecje, addycje lub substytucje różnych reszt nukleotydowych, powodujące powstanie sekwencji kodujących ten sam lub funkcjonalnie równoważny produkt genowy. Sam produkt genowy

PL 202 844 B1 może zawierać delecje, addycje lub substytucje reszt aminokwasowych, powodujące nieme zmiany, dając w ten sposób funkcjonalnie równoważny epitop antygenowy. Takich konserwatywnych substytucji aminokwasów można dokonywać w oparciu o podobieństwo polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilności i/lub amfipatycznej natury danych reszt. Na przykład do aminokwasów o ładunku ujemnym należą kwas asparaginowy i glutaminowy; do aminokwasów o ładunku dodatnim należą lizyna, histydyna i arginina; do aminokwasów o nienaładowanych polarnych grupach początkowych o podobnej hydrofilności należą glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina i tyrozyna, a do aminokwasów o niepolarnych grupach początkowych należą alanina, walina, izoleucyna, leucyna, fenyloalanina, prolina, metionina i tryptofan.

Sekwencje nukleotydowe według niniejszego wynalazku można wytwarzać w celu zmiany sekwencji kodującej białka fuzyjnego w wielu celach, włączając w to, jednak bez ograniczenia, zmiany powodujące modyfikację obróbki i ekspresji produktu genowego. Na przykład można wprowadzać mutacje sposobami znanymi ze stanu techniki, takimi jak mutageneza ukierunkowana na miejsce, w celu wprowadzenia nowych miejsc restrykcyjnych, w celu zmiany wzorca glikozylacji, fosforylacji itd.

W innym wykonaniu niniejszego wynalazku można syntetyzować sekwencję kodującą białka fuzyjnego, w całości lub w części, znanymi sposobami chemicznymi. Zob. na przykład Caruthers i wsp., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea i Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10) 2331; Matteucci i Caruthers, 1980, Tetrahedron Letter 21:719 i Chow i Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9 (12): 2807-2817. Zamiast tego, sam polipeptyd można wytwarzać stosując sposoby chemiczne w celu wytworzenia w całości lub w części sekwencji aminokwasowej. Na przykład peptydy można syntetyzować technikami fazy stałej, odcinać z żywicy i oczyszczać poprzez preparacyjną wysokowydajną chromatografię cieczową. (Zob. Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., str. 50-60). Skład syntetycznych polipeptydów można potwierdzać poprzez analizę aminokwasów lub sekwencjonowanie (na przykład sposób degradacji Edmana, zob. Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., str. 34-49).

Ponadto sekwencję kodującą białka fuzyjnego można poddawać mutacji in vitro lub in vivo w celu stworzenia i/lub usunięcia sekwencji translacyjnych, inicjacyjnych i/lub terminacyjnych, lub w celu stworzenia odmian w regionach kodujących i/lub stworzenia nowych restrykcyjnych miejsc endonukleazowych lub zniszczenia miejsc uprzednio istniejących w celu ułatwienia dalszych modyfikacji in vitro. Można stosować dowolną technikę mutagenezy znaną ze stanu techniki, włączając w to, jednak bez ograniczenia, mutagenezę chemiczną, ukierunkowaną na miejsce mutagenezę in vitro (Hutchinson, C. i wsp., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), zastosowanie łączników TAB^® (Pharmacia) i tym podobne. Ważne jest, aby manipulacje nie zniszczyły immunogenności polipeptydów fuzyjnych.

Ponadto, jako substytucje lub addycje do sekwencji można wprowadzać nieklasyczne aminokwasy lub chemiczne analogi aminokwasów. Do aminokwasów nieklasycznych należą, jednak bez ograniczenia, D-izomery pospolitych aminokwasów, kwas α-aminobutyrowy, 4-aminobutyrowy, Aby, 2-aminobutyrowy, γ-Abu, ε-Ahx, 6-aminoheksanoesowy, Aib, 2-aminobutyrowy, 2-aminopropionowy, ornityna, norleucyna, norwalina, hydroksyprolina, sarkozyna, cytrulina, kwas cysteinowy, t-butyloglicyna, t-butyloalanina, fenyloglicyna, cykloheksyloalanina, β-alanina, kwasy fluoroaminowe, tworzone aminokwasy, takie jak β-metyloaminokwasy, Ca-metyloaminokwasy, Na-metyloaminokwasy i ogólnie analogi aminokwasów. Ponadto aminokwas może być D (prawoskrętny) lub L (lewoskrętny).

W swoistym wykonaniu sekwencje kodujące każdego antygenu w białku fuzyjnym są połączone na swych końcach aminowych lub karboksylowych poprzez wiązanie peptydowe w dowolnej kolejności. Zamiast tego można stosować peptydową sekwencję łącznikową do oddzielania poszczególnych polipeptydów, tworzących polipeptyd fuzyjny, o odległość wystarczającą do zapewnienia, że każdy polipeptyd składa się w strukturę drugo- i trzeciorzędową, co maksymalizuje jego skuteczność antygenową w zapobieganiu i leczeniu gruźlicy. Taką peptydową sekwencję łącznikową włącza się do białka fuzyjnego z zastosowaniem standardowych sposobów znanych ze stanu techniki. Można dobierać korzystne peptydowe sekwencje łącznikowe w oparciu o następujące czynniki (1) ich zdolność do przyjęcia giętkiej rozciągniętej konformacji (2) ich niezdolność do przyjęcia struktury drugorzędowej, która mogłaby wchodzić w interakcje z epitopami funkcyjnymi na polipeptydzie pierwszym i drugim i (3) brak hydrofobowych lub naładowanych reszt, które mogłyby reagować z funkcyjnymi epitopami polipeptydu. Korzystne peptydowe sekwencje łącznikowe zawierają reszty Gly, Asn i Ser. W sekwencji łącznikowej można również stosować inne niemal obojętne aminokwasy, takie jak Thr i Ala. Do sekwencji aminokwasowych, które można korzystnie stosować jako łączniki, należą sekwencje opisane

PL 202 844 B1 przez Maratea i wsp., Gene 40:39-46, 1985; Murphy i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; patencie Stanów Zjednoczonych nr 4935233 i patencie Stanów Zjednoczonych nr 4751180. Sekwencja łącznikowa może mieć długość od 1 do około 50 aminokwasów. Sekwencje peptydowe nie są konieczne, gdy polipeptydy pierwszy i drugi mają okolice nieniezbędnych N-końcowych aminokwasów, które można stosować do oddzielenia domen funkcyjnych i zapobiegania interferencji sterycznej. Na przykład antygeny w białku fuzyjnym mogą być połączone poprzez giętki polilinker, taki jak GlyCys-Gly lub Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, powtórzony 1-3 razy (Bird i wsp., 1988, Science 242:423-426; Chaudhary i wsp., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066-1070).

W jednym z wykonań takie bia ł ko wytwarza się poprzez rekombinacyjną ekspresję kwasu nukleinowego, kodującego białko. Taki produkt fuzyjny można wytwarzać poprzez ligację ze sobą odpowiednich sekwencji kwasów nukleinowych, kodujących pożądane sekwencje aminokwasowe sposobami znanymi ze stanu techniki, w odpowiedniej ramce kodującej, i ekspresję produktu sposobami znanymi ze stanu techniki. Zamiast tego produkt taki można wytwarzać technikami syntezy białek, na przykład poprzez zastosowanie syntetyzatora peptydów. Do polinukleotydu fuzyjnego można również dodawać sekwencje kodujące dla innych cząsteczek, takich jak cytokina lub adiuwant.

5.5. Wytwarzanie białek fuzyjnych

W celu wytworzenia biał ka fuzyjnego M. tuberculosis wedł ug niniejszego wynalazku sekwencję nukleotydową, kodującą białko, lub jej równoważnik funkcjonalny, wprowadza się do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, to znaczy do wektora zawierającego elementy niezbędne do transkrypcji i translacji wprowadzonej sekwencji kodującej. Komórki-gospodarzy lub linie komórkowe, transfekowane lub transformowane rekombinacyjnymi wektorami ekspresji, można stosować w wielu celach. Należy do nich, jednak bez ograniczenia, produkcja białka fuzyjnego na dużą skalę.

Do wytwarzania wektorów ekspresji, zawierających fuzyjną sekwencję kodującą i odpowiednie sygnały kontroli transkrypcji/translacji, można stosować sposoby znane specjalistom. Do sposobów tych należą sposoby rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i rekombinacja/genetyczna rekombinacja in vivo. (Zob. na przykład sposoby opisane przez Sambrooka i wsp., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., i Ausubel i wsp., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). Można również wytwarzać chemicznie RNA zdolne do kodowania polipeptydu (red. Gait, 1984, Oligonucleoide Synthesis, IRL Press, Oxford).

5.5.1. Systemy ekspresji

W celu ekspresji sekwencji kodują cej biał ko fuzyjne moż na stosować róż ne systemy gospodarzwektor ekspresji. Należą do nich, jednak bez ograniczenia, drobnoustroje, takie jak bakterie (na przykład E. coli, B. subtilis) transformowane rekombinacyjnym DNA bakteriofaga, wektory ekspresji DNA plazmidowego lub DNA kosmidowego, zawierające sekwencję kodującą, drożdże (na przykład Saccharomyces, Pichia), transformowane rekombinacyjnymi drożdżowymi wektorami ekspresji, zawierającymi sekwencję kodującą, systemy komórek owadów, zakażone rekombinacyjnymi wirusowymi wektorami ekspresji (na przykład bakulowirus), zawierające sekwencję kodującą, systemy komórek roślinnych, zakażone rekombinacyjnymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (na przykład wirus mozaiki kalafiora - CaMV; wirus mozaiki tytoniowej - TMV) lub transformowane rekombinacyjnymi plazmidowymi wektorami ekspresji (na przykład plazmid Ti), zawierającymi sekwencję kodującą, lub systemy komórek ssaków (na przykład COS, CHO, BHK, komórki 293, 3T3). Elementy ekspresji tych systemów mają różną moc i właściwości.

W zależności od stosowanego układu gospodarz/wektor, w wektorze ekspresji można stosować dowolny z wielu korzystnych elementów transkrypcji i translacji, włączając w to promotory konstytutywne i indukowalne. Na przykład przy klonowaniu w systemach bakteryjnych można stosować promotory indukowalne, takie jak pL bakteriofaga λ, plac, ptrp, ptac (promotor hybrydowy ptrp-lac; promotor cytomegalowirusowy) i tym podobne; przy klonowaniu w roślinnych systemach komórkowych można stosować promotory pochodzące z genomu komórek roślinnych (na przykład promotory wstrząsu cieplnego, promotor małej podjednostki RUBISCO, promotor białka wiążącego chlorofil α/β) lub z wirusów roślinnych (na przykład promotor 35S RNA CaMV; promotor białkowy powłoki TMV); przy klonowaniu w systemach komórek ssaków - promotory pochodzące z genomu komórek ssaków (na przykład promotor metalotioneinowy) lub z wirusów ssaków (na przykład późny promotor adenowirusowy, promotor wirusa krowianki 7.5K); przy wytwarzaniu linii komórkowych, zawierających liczne kopie antygenowej sekwencji kodującej można stosować wektory oparte na SV-4 0, BPV i EBV z odpowiednim dobieralnym znacznikiem.

PL 202 844 B1

Do ekspresji antygenów M. tuberculosis korzystne są systemy bakteryjne. Do zastosowania in vivo można wytwarzać bakterię, taką jak Bacillus Calmette-Guerin, w celu ekspresji polipeptydu fuzyjnego według niniejszego wynalazku na powierzchni komórki. Można korzystnie dobierać inne bakteryjne systemy ekspresji w zależności od zamierzonego zastosowania produktów po ekspresji. Na przykład, gdy ma być wytworzona duża ilość białka fuzyjnego do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych, korzystne mogą być wektory kierujące ekspresją wysokiego poziomu produktów białka fuzyjnego, które łatwo jest oczyszczać. Do wektorów takich należą, bez ograniczenia, wektor ekspresyjny E. coli pUR278 (Inouye i Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke i Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509) i tym podobne. Można również stosować wektory pGEX w celu ekspresji obcych polipeptydów jako białek fuzyjnych z glutationo-S-transferazą (GST). Ogólnie takie białka fuzyjne są rozpuszczalne i można je łatwo oczyszczać z uległych lizie komórek poprzez adsorpcję na kulki glutationowo-agarozowe i następnie elucję w obecności wolnego glutationu. Wektory pGEX wytwarza się tak, aby zawierały miejsca cięcia trombiny lub proteazy czynnika Xa, tak aby korzystny klonowany polipeptyd fuzyjny mógł być uwalniany z cząstki GST.

5.5.2. Oczyszczanie białek

Po uzyskaniu ekspresji białka rekombinacyjnego można je zidentyfikować poprzez testy oparte na fizycznych lub funkcjonalnych właściwościach produktu, włączając w to radioaktywne znakowanie produktu i następnie analizę poprzez elektroforezę żelową, test radioimmunologiczny, ELISA, testy biologiczne itd.

Po zidentyfikowaniu kodowanego białka można je izolować i oczyszczać standardowymi sposobami, włączając w to chromatografię (na przykład chromatografię cieczową wysokosprawną, jonowymienną, powinowactwa i kolumny różnicującej wielkość), odwirowanie, różnicową rozpuszczalność lub dowolny inny standardowy sposób oczyszczania białek. Rzeczywiste warunki będą zależeć w części od czynników takich, jak ładunek netto, hydrofobowość, hydrofilność itd., i będą oczywiste dla specjalisty. Właściwości funkcjonalne można oceniać stosując dowolny korzystny test, taki jak wiązanie przeciwciał, indukcja proliferacji limfocytów T, pobudzenie wytwarzania cytokin, takich jak IL2, IL-4 i IFN-γ. Dla praktyki niniejszego wynalazku korzystne jest, aby każde białko fuzyjne było w co najmniej 80% oczyszczone od innych białek. Korzystniejsze jest, aby było oczyszczone w co najmniej 90%. Do podawania in vivo, korzystne jest, aby białka były oczyszczone w ponad 95%.

5.6. Zastosowanie sekwencji kodującej białko fuzyjne

Sekwencję kodującą białko fuzyjne według niniejszego wynalazku można stosować do kodowania produktu białkowego do zastosowania jako immunogen do indukowania i/lub wzmagania reakcji immunologicznej na M. tuberculosis. Ponadto taką sekwencję kodującą można poddać ligacji z sekwencją kodującą innej cząsteczki, takiej jak cytokina lub adiuwant. Takie polinukleotydy można stosować in vivo jako szczepionki DNA (patenty Stanów Zjednoczonych nr 5589466, 5679647, 5703055). W tym wykonaniu wynalazku polinukleotyd wykazuje ekspresję kodowanego przez siebie białka w organizmie biorcy w celu bezpośredniego pobudzenia reakcji immunologicznej. Polinukleotyd można wstrzykiwać nie uodpornionemu pacjentowi w celu zapoczątkowania reakcji immunologicznej na produkt kodowany przez ten polinukleotyd, lub podawać zakażonemu lub uodpornionemu pacjentowi w celu zwiększenia wtórnych reakcji immunologicznych.

W korzystnym wykonaniu, kompozycja terapeutyczna zawiera sekwencję kodującą białko fuzyjne lub jej fragmenty, które są częścią wektora ekspresyjnego. W szczególności polinukleotyd taki zawiera promotor połączony w sposób umożliwiający działanie z regionem kodującym, przy czym promotor ten jest indukowalny lub konstytutywny, i ewentualnie swoisty tkankowo. W innym wykonaniu polinukleotyd zawiera sekwencję kodującą otoczoną regionami sprzyjającymi rekombinacji homologicznej w pożądanym miejscu genomu, zapewniając w ten sposób wewnątrzchromosomalną ekspresję sekwencji kodującej (Koller i Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8932-8935; Zijlstra i wsp. 1989, Nature 342: 435-438).

Podawanie kwasu nukleinowego pacjentowi może być bezpośrednie - w tym przypadku pacjenta eksponuje się bezpośrednio na kwas nukleinowy lub wektor zawierający kwas nukleinowy, lub pośrednie - w tym przypadku komórki transformuje się najpierw kwasem nukleinowym in vitro i następnie wszczepia pacjentowi. Te dwa sposoby znane są, odpowiednio, jako transfer genów in vivo i ex vivo.

W swoistym wykonaniu kwas nukleinowy podaje się bezpośrednio in vivo, gdzie ulega ekspresji w celu wytworzenia kodowanego produktu-białka fuzyjnego. Można tego dokonać jednym z licznych sposobów znanych ze stanu techniki, na przykład poprzez wytworzenie go jako części odpowiedniego wektora ekspresyjnego kwasu nukleinowego i podanie go, tak aby stał się wewnątrzkomórkowy, na

PL 202 844 B1 przykład poprzez zakażenie z zastosowaniem defektywnego lub atenuowanego wektora retrowirusowego lub innego wektora wirusowego (zob. patent Stanów Zjednoczonych nr 4980286) lub poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie nagiego DNA, lub poprzez zastosowanie bombardowania mikrocząstkami (na przykład działo genowe; Bioloistic, Dupont) lub powlekanie lipidami lub receptorami powierzchni komórkowej lub czynnikami transfekującymi, zamknięcie w liposomach, mikrocząstkach lub mikrokapsułkach (patent Stanów Zjednoczonych nr 5407609, 5853763, 5814344 i 5820883) lub przez podawanie go w połączeniu z peptydem, o którym wiadomo, że wchodzi do jądra, poprzez podanie go w połączeniu z ligandem podlegającym endocytozie, której mediatorem jest receptor (zob. na przykład Wu i Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), który można stosować do typów komórek docelowych wykazujących swoistą ekspresję receptorów itp. W innym wykonaniu można wytwarzać kompleks kwasu nukleinowego i ligandu, w którym ligand zawiera fuzogenny peptyd wirusowy do rozsadzania endosomów, co umożliwia uniknięcie lizosomalnego rozpadu kwasu nukleinowego. W jeszcze innym wykonaniu kwas nukleinowy można ukierunkowywać in vivo na swoisty komórkowo wychwyt zwrotny i ekspresję, poprzez ukierunkowywanie swoistego receptora (zob. na przykład publikacje PCT WO 92/06180 z 16 kwietnia 1992; WO 92/22635 z 23 grudnia 1992; WO 92/20316 z 26 listopada 1992; WO 93/14188 z 22 lipca 1993 i WO 93/20221 z 14 października 1993) . Zamiast tego kwas nukleinowy można wprowadzać wewnątrzkomórkowo i włączać do DNA komórki gospodarza w celu ekspresji przez rekombinację homologiczną (Koller i Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra i wsp., Nature 342: 435-438).

W swoistym wykonaniu można stosować wektor wirusowy, taki jak wektor retrowirusowy (zob. Miller i wsp., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). Wektory retrowirusowe zmodyfikowano w celu delecji sekwencji retrowirusowych, które nie są konieczne do pakowania genomu wirusowego i włączania do DNA komórki-gospodarza. Fuzyjną sekwencję kodującą klonuje się do wektora, co ułatwia podawanie kwasu nukleinowego biorcy. Więcej szczegółów na temat wektorów retrowirusowych można znaleźć w Boesen i wsp., 1994, Biotherapy 6: 291-302, gdzie opisano zastosowanie wektora retrowirusowego do podawania genu mdrl do hematopoetycznych komórek macierzystych w celu nadania komórkom macierzystym większej oporności na chemioterapię. Innymi pozycjami piśmiennictwa ilustrującymi zastosowanie wektorów retrowirusowych do terapii genowej są: Clowers i wsp., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Kiem i wsp., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons i Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141 i Grossman i Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3: 110-114.

Innymi wektorami wirusowymi, które można stosować w terapii genowej, są adenowirusy. Adenowirusy są szczególnie atrakcyjnymi nośnikami do podawania genów na nabłonek dróg oddechowych. Adenowirusy w naturalnych warunkach zakażają nabłonek dróg oddechowych, gdzie wywołują chorobę o lekkim przebiegu. Innymi miejscami docelowymi opartych na adenowirusach systemów podawania są wątroba, ośrodkowy układ nerwowy, komórki śródbłonka i mięśnie. Adenowirusy mają tę zaletę, że są zdolne do zakażania komórek nie dzielących się. Proponowano także zastosowanie do transferu genów in vivo wirusa związanego z adenowirusem (AAV) (Walsh i wsp., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 2 04: 289-300).

Inna technika obejmuje przeniesienie struktury do komórek w hodowli tkankowej takimi sposobami, jak elektroporacja, lipofekcja, transfekcja, której mediatorem jest fosforan wapnia lub zakażenie wirusowe. Zwykle sposób transferu obejmuje transfer dobieralnego znacznika do komórek. Komórki umieszcza się następnie w warunkach selekcji w celu wyizolowania tych komórek, w których doszło do wychwytu i ekspresji transferowanego genu. Komórki te podaje się następnie pacjentowi.

W tym wykonaniu kwas nukleinowy wprowadza się do komórki przed podaniem in vivo powstałej komórki rekombinacyjnej. Takiego wprowadzenia można dokonać dowolnym sposobem znanym ze stanu techniki, włączając w to, bez ograniczenia, transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, zakażenie wektorem wirusowym lub bakteriofagowym, zawierającym sekwencje kwasu nukleinowego, fuzje komórkowe, chromosomalny transfer genu, mikrokomórkowy transfer genu, fuzję sferoplastu itp. Ze stanu techniki znane są liczne sposoby wprowadzania obcych genów do komórek (zob. na przykład Loeffler i Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen i wsp., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92) i można je stosować według niniejszego wynalazku.

Polinukleotydy według niniejszego wynalazku można również stosować w rozpoznawaniu gruźlicy do wykrywania u pacjenta sekwencji polinukleotydowych swoistych dla M. tuberculosis. Takiego wykrywania można dokonywać na przykład poprzez izolowanie polinukleotydów z próbki biologicznej uzyskanej od pacjenta podejrzanego o zakażenie bakterią. Po izolowaniu polinukleotydów z próbki biologicznej umożliwia się hybrydyzację wyznakowanego polinukleotydu według niniejszego wynalaz12

PL 202 844 B1 ku, komplementarnego do jednego lub więcej polinukleotydów, do polinukleotydów w próbce biologicznej, stosując techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych znane specjalistom. Hybrydyzację taką można prowadzić na przykład w roztworze lub z zastosowaniem partnera hybrydyzacyjnego na stałym podłożu.

5.7. Terapeutyczne i profilaktyczne zastosowanie białka fuzyjnego

Oczyszczone lub częściowo oczyszczone białka fuzyjne lub ich fragmenty można wytwarzać jako szczepionki lub kompozycję terapeutyczną. Takie kompozycje mogą zawierać adiuwanty w celu wzmożenia reakcji immunologicznych. Ponadto białka takie można dalej zawieszać w emulsji olejowej w celu spowodowania wolniejszego uwalniania białek in vivo po wstrzyknięciu. Optymalny stosunek każdego składnika w preparacie można określać technikami znanymi specjalistom.

W szczepionkach według niniejszego wynalazku do nasilania reakcji immunologicznej można stosować dowolny z wielu adiuwantów. Większość adiuwantów zawiera substancję, która ma zabezpieczać antygen przed szybkim katabolizmem, taką jak wodorotlenek glinu lub olej mineralny, i substancję nieswoiście stymulującą reakcje immunologiczne, taką jak lipid A, Bordetella pertussis lub Mycobacterium tuberculosis. Odpowiednie adiuwanty są dostępne w handlu i należą do nich na przykład niepełny adiuwant Freunda i pełny adiuwant Freunda (Difco Laboratories) i adiuwant 65 Mercka (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Do innych korzystnych adiuwantów należą ałun, mikrosfery ulegające rozpadowi biologicznemu, monofosforylolipid A, quil A, SBAS1c, SBAS2 (Ling i wsp., 1997, Vaccine 15: 1562-1567), SBAS7 i Al(OH)3.

W szczepionkach według niniejszego wynalazku korzystne jest, aby adiuwant indukował reakcję immunologiczną zawierającą aspekty Th1. Do korzystnych adiuwantów należą na przykład połączenie monofosforylolipidu A, korzystnie, 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MLP) wraz z solą glinu. System wzmożony obejmuje połączenie monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, zwłaszcza połączenie 3D-MLP i saponiny QS21, jak to opisano w WO 94/00153, lub mniej reaktogenną kompozycję, w której QS21 jest szybko oziębiana z cholesterolem, jak to opisano w WO 96/33739. Uprzednie doświadczenia dowiodły ewidentnego synergistycznego działania połączenia 3D-MLP i QS21 w indukowaniu zarówno reakcji immunologicznej humoralnej, jak i komórkowej typu Th1. Szczególnie silny adiuwant, obejmujący QS21, 3D-MLP i tokoferol w emulsji typu olej w wodzie, opisano w WO 95/17210, i jest to korzystny preparat.

Preparaty zawierające antygen według niniejszego wynalazku można podawać pacjentowi per se lub w postaci kompozycji farmaceutycznej lub terapeutycznej. Preparaty farmaceutyczne, zawierające białka, można wytwarzać za pomocą konwencjonalnego mieszania, rozpuszczania, granulowania, wytwarzania drażetek, mielenia mokrego i frakcjonowania sedymentacyjnego, emulgowania, zamykania w kapsułki, procesów wychwytywania lub liofilizacji. Kompozycje farmaceutyczne można wytwarzać w sposób konwencjonalny z zastosowaniem jednego lub więcej fizjologicznie dopuszczalnych nośników, rozcieńczalników, zaróbek lub substancji pomocniczych, ułatwiających obróbkę polipeptydów do preparatów, które można stosować farmaceutycznie. Odpowiednie wytwarzanie zależy od wybranej drogi podawania.

Do podawania miejscowego, białka można wytwarzać w postaci roztworów, żelów, maści, kremów, zawiesin itd., znanych ze stanu techniki.

Do preparatów o działaniu ogólnoustrojowym należą preparaty przeznaczone do podawania w postaci wstrzyknięć, na przykład podskórnych, dożylnych, domięśniowych, dokanałowych lub dootrzewnowych, jak również preparaty przeznaczone do podawania przezskórnego, przezśluzówkowego, doustnego lub do płuc.

Do wstrzyknięć białka można wytwarzać w postaci roztworów wodnych, korzystnie w buforach zgodnych fizjologicznie, takich jak roztwór Hanksa, roztwór Ringera lub sól fizjologiczna. Roztwór może zawierać środki ułatwiające wytwarzanie, takie jak środki zawieszające, stabilizujące i/lub dyspergujące. Zamiast tego białka można wytwarzać w postaci proszku do rozpuszczania w odpowiednim nośniku, na przykład jałowej, apirogennej wodzie, przed zastosowaniem.

Do podawania przezśluzówkowego w preparacie stosuje się środki penetrujące odpowiednie do danej bariery. Takie środki penetrujące są ogólnie znane.

Do podawania doustnego kompozycję można łatwo wytwarzać poprzez łączenie białek z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami znanymi ze stanu techniki. Nośniki te umożliwiają wytworzenie z białek preparatów w postaci tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, cieczy, żelów, syropów, zawiesin i tym podobnych, do podawania doustnego leczonemu pacjentowi. Do korzystnych zaróbek do doustnych preparatów stałych, takich jak proszki, kapsułki i tabletki, należą wypełniacze, takie jak

PL 202 844 B1 cukry, na przykład laktoza, sacharoza, mannit i sorbit; pochodne celulozy, takie jak skrobia kukurydziana, skrobia pszenna, skrobia ryżowa, skrobia ziemniaczana, żelatyna, tragakanta, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy i/lub poliwinylopirolidon (PVP);

środki granulujące i środki wiążące. Jeżeli jest to korzystne, można dodawać środki rozsadzające, takie jak usieciowany poliwinylopirolidon, agar lub kwas alginowy lub jego sól, taką jak alginian sodowy.

Jeżeli jest to korzystne, stałe postacie dawkowe mogą być powlekane cukrem lub powłoką dojelitową z zastosowaniem standardowych technik.

Do płynnych preparatów doustnych, takich jak na przykład zawiesiny, eliksiry i roztwory, do odpowiednich nośników, zaróbek lub rozcieńczalników należą woda, glikole, oleje, alkohole itp. Oprócz tego można dodawać środki smakowe, konserwujące, barwniki i tym podobne.

Do podawania podpoliczkowego białka można wytwarzać w postaci tabletek, tabletek do ssania itp., w sposób konwencjonalny.

Do podawania przez inhalację białka do zastosowania według niniejszego wynalazku, korzystnie, podaje się w postaci aerozolu z opakowania pod ciśnieniem lub nebulizatora, z zastosowaniem odpowiedniego propelentu, na przykład dichlorofluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetrafluoroetanu, dwutlenku węgla lub innego korzystnego gazu. W przypadku aerozolu pod ciśnieniem jednostkę dawkową można określić poprzez zaopatrzenie go w zawór do podawania odmierzonej dawki. Można wytwarzać kapsułki i naboje, na przykład żelatynowe, do stosowania w inhalatorze, zawierające proszek-mieszaninę białek i odpowiedniego podłoża proszku, takiego jak laktoza lub skrobia.

Białka można również wytwarzać w postaci kompozycji do podawania doodbytniczego lub dopochowowego, jako czopki lub wlewki, zawierające na przykład konwencjonalne podłoża czopków, takie jak masło kakaowe lub inne glicerydy.

Oprócz preparatów opisanych powyżej białka można również wytwarzać w postaci preparatów o przedł u ż onym uwalnianiu. Takie dł ugodział ają ce preparaty moż na podawać przez wszczepienie (na przykład podskórne lub domięśniowe) lub wstrzyknięcie domięśniowe. I tak na przykład białka można wytwarzać w postaci preparatu z odpowiednimi substancjami polimerowymi lub hydrofobowymi (na przykład w postaci emulsji w dopuszczalnym oleju) lub żywicami jonowymiennymi, lub jako pochodne słabo rozpuszczalne, na przykład w postaci słabo rozpuszczalnej soli.

Zamiast tego można stosować inne farmaceutyczne systemy podawania. Przykładami dobrze znanych nośników do podawania leków są liposomy i emulsje, które można stosować do podawania antygenu. Można również stosować pewne rozpuszczalniki organiczne, takie jak dimetylosulfotlenek, jakkolwiek zazwyczaj kosztem większej toksyczności. Białka fuzyjne można również zamykać w mikrosferach (patenty Stanów Zjednoczonych nr 5407609, 5853763, 5814344 i 5820883). Dodatkowo można podawać białka stosując system o przedłużonym uwalnianiu, taki jak półprzepuszczalne macierze stałych polimerów, zawierające lek lub szczepionkę. Znane są różne substancje do wytwarzania preparatów o przedłużonym uwalnianiu. Kapsułki o przedłużonym uwalnianiu mogą, w zależności od swej natury chemicznej, uwalniać białka przez czas od kilku tygodni do ponad 100 dni. W zależności od natury chemicznej i stabilności biologicznej odczynnika, można stosować inne sposoby stabilizacji białka.

Określenie ilości białka fuzyjnego skutecznej do wywoływania reakcji immunologicznej u pacjenta pozostaje w kompetencjach specjalisty, zwłaszcza w świetle niniejszego szczegółowego opisu.

Skuteczną dawkę można określić wstępnie na podstawie testów in vitro. Na przykład można wytwarzać dawkę w modelach zwierzęcych w celu osiągnięcia indukcji reakcji immunologicznej z zastosowaniem sposobów znanych ze stanu techniki. Specjalista łatwo zoptymalizuje zastosowanie u ludzi w zależ ności od danych z badań na zwierzętach. Dawki i odstęp między nimi można ustalać indywidualnie. Na przykład przy stosowaniu jako szczepionki polipeptydy i polinukleotydy według niniejszego wynalazku można podawać w około 1-3 dawkach przez czas od 1 do 36 tygodni. Korzystnie, podaje się 3 dawki w odstępach około 3-4 miesięcy, po czym okresowo podaje się dawkę przypominającą. Dla niektórych pacjentów odpowiednie mogą być inne schematy podawania. Korzystna dawka jest to taka ilość polipeptydu lub DNA, która, po podaniu w wyżej opisany sposób, jest zdolna do wywołania reakcji immunologicznej u uodpornionego pacjenta, wystarczającej do zabezpieczenia pacjenta przed zakażeniem M. tuberculosis przez co najmniej 1-2 lata. Ogólnie, ilość polipeptydu obecnego w dawce (lub wytworzonego in situ przez DNA zawarte w dawce) wynosi od około 1 pg do około 100 mg na kg masy ciała gospodarza, typowo od około 10 pg do około 1 mg, i korzystnie od około 100 pg do około

PL 202 844 B1 pg. Korzystny zakres dawek będzie zależał od masy i wzrostu pacjenta, typowo będzie jednak wynosił od 0,1 ml do około 5 ml.

5.8. Zastosowanie diagnostyczne białka fuzyjnego

Polipeptydy fuzyjne według niniejszego wynalazku są korzystne w rozpoznawaniu zakażenia gruźlicą in vitro i in vivo. Zdolność polipeptydu według niniejszego wynalazku do indukowania proliferacji lub wytwarzania cytokin można badać sposobami opisanymi w powyższym rozdziale 5.2.

Według innego aspektu przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby zastosowania jednego lub więcej polipeptydów fuzyjnych do rozpoznawania gruźlicy przy zastosowaniu testu skórnego in vivo. W rozumieniu niniejszego opisu, „test skórny” jest to dowolny test przeprowadzany bezpośrednio na pacjencie, w którym mierzy się reakcję nadwrażliwości typu późnego (DTH) (taką jak obrzęk, zaczerwienienie lub zapalenie skóry) po śródskórnym wstrzyknięciu jednego lub więcej polipeptydów, jak to opisano powyżej. Takie wstrzyknięcie można wykonać stosując dowolny odpowiedni przyrząd, wystarczający do zetknięcia polipeptydu z komórkami skóry pacjenta, taki jak na przykład strzykawka tuberkulinowa lub strzykawka 1 ml. Korzystnie, reakcję mierzy się co najmniej 48 godzin po wstrzyknięciu, korzystniej w czasie od około 48 do około 72 godzin po wstrzyknięciu.

Reakcja DTH jest reakcją immunologiczną typu komórkowego, większą u pacjentów, eksponowanych uprzednio na antygen testowy (to znaczy, na immunogenną część zastosowanego polipeptydu lub jego odmiany). Reakcję można mierzyć wzrokowo, stosując linijkę. Ogólnie, reakcję o średnicy ponad około 0,5 cm, korzystnie, ponad około 1,0 cm, uważa się za dodatnią, wskazującą na zakażenie gruźlicą, które może manifestować się, lub nie, jako czynna choroba.

Polipeptydy fuzyjne według niniejszego wynalazku, korzystnie, wytwarza się do zastosowania jako test skórny, w postaci kompozycji farmaceutycznych, zawierających polipeptyd i fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Kompozycje takie typowo zawierają jeden lub więcej powyższych polipeptydów w ilości od około 1 pg do około 100 pg, korzystnie od około 10 pg do około 50 pg w objętości 0,1 ml. Korzystnie, nośnik stosowany w takich kompozycjach farmaceutycznych stanowi roztwór soli fizjologicznej z odpowiednimi środkami konserwującymi, takimi jak fenol i/lub Tween 80™.

W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby zastosowania polipeptydów do rozpoznawania gruźlicy. W tym aspekcie zapewnia się sposoby wykrywania zakażenia M. tuberculosis w próbce biologicznej z zastosowaniem polipeptydów fuzyjnych, samych lub w połączeniu. W rozumieniu niniejszego opisu „próbka biologiczna” jest dowolną zawierającą przeciwciało próbką pobraną od pacjenta. Korzystnie, próbkę stanowi krew pełna, plwocina, surowica, osocze, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy lub mocz. Korzystniej próbkę stanowi próbka krwi, surowicy lub osocza, pobrana od pacjenta lub z pojemnika z krwią. Polipeptyd(y) stosuje się w teście, jak to opisano poniżej, w celu stwierdzenia obecności lub nieobecności przeciwciał przeciwko polipeptydowi (polipeptydom) w próbce względem z góry określonej wartości odcięcia. Obecność takich przeciwciał wskazuje na uprzednie uczulenie antygenami Mycobacterium, co może wskazywać na gruźlicę.

W wykonaniach, w których stosuje się więcej niż jeden polipeptyd fuzyjny, stosowane polipeptydy są korzystnie komplementarne (to znaczy jeden składowy polipeptyd będzie miał tendencję do wykrywania zakażenia w próbkach, w których zakażenie nie zostałoby wykryte przez drugi składowy polipeptyd). Polipeptydy komplementarne można zwykle zidentyfikować poprzez zastosowanie każdego polipeptydu oddzielnie w celu oceny próbek surowicy, uzyskanych z serii pacjentów, o których wiadomo, że są zakażeni M. tuberculosis. Po określeniu, dla których próbek wynik testu jest dodatni (jak to opisano poniżej) dla każdego polipeptydu, można wytwarzać preparaty łączące dwa lub więcej polipeptydów fuzyjnych, zdolne do wykrywania zakażenia w większości, lub we wszystkich badanych próbkach. Takie polipeptydy są komplementarne. Około 25-30% surowic od osób zakażonych gruźlicą daje wynik ujemny dla przeciwciał przeciwko poszczególnym białkom. Polipeptydy komplementarne można zatem stosować w połączeniu w celu poprawy czułości testu diagnostycznego.

Istnieje wiele testów znanych specjalistom stosowania jednego lub więcej polipeptydów do wykrywania przeciwciał w próbce. Zob. na przykład Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; publikację tę włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. W korzystnym wykonaniu test obejmuje zastosowanie polipeptydu unieruchomionego na stałym podłożu w celu związania i usunięcia przeciwciała z próbki. Związane przeciwciało można następnie wykrywać stosując odczynnik detekcyjny, zawierający grupę reporterową. Do korzystnych odczynników detekcyjnych należą przeciwciała wiążące się z kompleksem przeciwciało/polipeptyd i z wolnymi polipeptydami, wyznakowanymi grupą reporterową (na przykład w teście semikompetycyjnym). Zamiast tego można stosować test kompetycyjny, w którym przeciwciało wiążące się z polipeptydem znakuje

PL 202 844 B1 się grupą reporterową i umożliwia się związanie go z unieruchomionym antygenem po inkubacji antygenu z próbką. Zakres hamowania wiązania wyznakowanego przeciwciała z polipeptydem przez składowe próbki wskazuje na reaktywność próbki z unieruchomionym polipeptydem.

Podłoże stałe może być dowolną substancją stałą, znaną specjalistom, do której można przytwierdzać antygen. Podłoże stałe może na przykład stanowić zagłębienie testowe w płytce do mikromiareczkowania lub błona nitrocelulozowa lub inna korzystna błona. Zamiast tego podłoże może stanowić kulka lub krążek, włókno szklane, lateks lub materiał plastyczny, taki jak polistyren lub polichlorek winylu. Podłoże może również stanowić cząstka magnetyczna lub sensor włókna optycznego, tak jak to opisano na przykład w patencie Stanów Zjednoczonych 5359681.

Polipeptydy mogą być związane ze stałym podłożem przy zastosowaniu różnych sposobów znanych specjalistom. W kontekście niniejszego wynalazku, termin „związany” oznacza zarówno wiązanie niekowalencyjne, takie jak adsorpcja, jak i wiązanie kowalencyjne (które może być bezpośrednim wiązaniem między antygenem a grupami funkcyjnymi na podłożu lub może być połączeniem za pośrednictwem środka usieciowującego). Korzystne jest wiązanie poprzez adsorpcję do zagłębienia w płytce do mikromiareczkowania lub do błony. W takich przypadkach adsorpcję można osiągnąć poprzez zetknięcie polipeptydu, w korzystnym buforze, z podłożem stałym przez korzystny czas. Czas kontaktu jest różny w zależności od temperatury, jednak typowo wynosi od około 1 godziny do około dnia. Ogólnie, zetknięcie zagłębienia plastykowej płytki do mikromiareczkowania (na przykład polistyrenowej lub z polichlorku winylu) z polipeptydem w ilości od około 10 ng do około 1 μg, korzystnie, około 100 ng, wystarcza do związania odpowiedniej ilości antygenu.

Kowalencyjne wiązanie polipeptydu ze stałym podłożem można ogólnie osiągać poprzez najpierw poddanie reakcji podłoża z odczynnikiem dwufunkcyjnym, który będzie reagował zarówno z podłożem, jak i z grupą funkcyjną, taką jak grupa hydroksylowa lub aminowa, na polipeptydzie. Na przykład polipeptyd można wiązać z podłożami o odpowiedniej powłoce polimerowej z zastosowaniem benzochinonu lub poprzez kondensację grupy aldehydowej na podłożu z grupą aminową i aktywnym wodorem na polipeptydzie (zob. na przykład Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, str. A12-A13).

W niektórych wykonaniach, testem jest enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA). Test ten można przeprowadzić najpierw stykając antygen polipeptydu fuzyjnego, unieruchomiony na podłożu stałym, zwykle na zagłębieniu płytki do mikromiareczkowania, z próbką, tak że przeciwciała przeciwko polipeptydowi w próbce pozostawia się do związania z unieruchomionym polipeptydem. Niezwiązaną próbkę usuwa się następnie z unieruchomionego polipeptydu i dodaje się odczynnik reakcyjny zdolny do wiązania unieruchomionego kompleksu przeciwciało-polipeptyd. Następnie określa się ilość odczynnika detekcyjnego, który pozostaje niezwiązany z podłożem stałym, z zastosowaniem sposobu odpowiedniego dla danego odczynnika detekcyjnego.

Bardziej szczegółowo, po unieruchomieniu polipeptydu na podłożu, jak to opisano powyżej, pozostałe miejsca wiązania białka na podłożu typowo blokuje się. Można stosować dowolny odpowiedni środek blokujący, znany specjalistom, taki jak bydlęca albumina surowicy lub Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Unieruchomiony polipeptyd inkubuje się następnie z próbką i przeciwciało pozostawia się do związania z antygenem. Próbkę można rozcieńczać odpowiednim rozcieńczalnikiem, takim jak sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem (PBS) przed inkubacją. Ogólnie, odpowiedni czas kontaktu jest to taki czas, który wystarcza do wykrycia obecności przeciwciała w próbce zakażonej M. tuberculosis. Korzystnie, czas kontaktu jest wystarczający do osiągnięcia poziomu wiązania wynoszącego co najmniej 95% poziomu osiąganego w stanie równowagi między przeciwciałem związanym i niezwiązanym. Specjalista zauważy, że czas niezbędny do osiągnięcia stanu równowagi można łatwo określić poprzez poziom wiązania, zachodzącego w danym czasie. W temperaturze pokojowej zwykle wystarcza około 30-minutowy czas inkubacji.

Niezwiązaną część próbki można następnie usuwać poprzez płukanie podłoża stałego odpowiednim buforem, na przykład PBS zawierającym 0,1% Tween 20™. Następnie do podłoża stałego można dodawać odczynnik detekcyjny. Odpowiednim odczynnikiem detekcyjnym jest dowolny związek, wiążący się z unieruchomionym kompleksem przeciwciało-polipeptyd, który można następnie wykrywać różnymi sposobami znanymi specjalistom. Korzystnie, odczynnik detekcyjny zawiera środek wiążący (na przykład białko A, białko G, lektynę lub wolny antygen) sprzężony z grupą reporterową. Do korzystnych grup reporterowych należą enzymy (na przykład peroksydaza chrzanowa), substraty, kofaktory, inhibitory, barwniki, radionuklidy, grupy luminescencyjne, grupy fluorescencyjne, biotyna i cząstki koloidalne, takie jak koloidalne złoto i selen. Sprzęganie środka wiążącego z grupą reporte16

PL 202 844 B1 rową można osiągać standardowymi sposobami znanymi specjalistom. Najczęstsze środki wiążące można również nabyć w stanie sprzężonym z rozmaitymi grupami reporterowymi z wielu źródeł handlowych (na przykład Zymed Laboratories, San Francisco, CA, i Pierce, Rockford, IL).

Odczynnik detekcyjny inkubuje się następnie z unieruchomionym kompleksem przeciwciałopolipeptyd przez czas wystarczający do wykrycia związanego przeciwciała. Odpowiedni czas można zwykle określić na podstawie zaleceń producenta lub poprzez badanie poziomu wiązania, zachodzącego w danym czasie. Następnie usuwa się niezwiązany odczynnik detekcyjny i wykrywa się związany odczynnik detekcyjny z zastosowaniem grupy reporterowej. Sposób stosowany do wykrywania grupy reporterowej zależy od natury grupy reporterowej. Dla grup radioaktywnych odpowiednie są na ogół zliczanie scyntylacji lub metody autoradiograficzne. Do wykrywania barwników, grup luminescencyjnych i grup fluorescencyjnych można stosować metody spektroskopowe. Biotynę można wykrywać stosując awidynę, sprzężoną z inną grupą reporterową (zwykle grupą radioaktywną lub fluorescencyjną lub z enzymem). Enzymatyczne grupy reporterowe można zwykle wykrywać poprzez dodawanie substratu (zwykle przez określony czas) i następnie analizę spektroskopową lub inną produktów reakcji.

W celu określenia obecności lub nieobecności przeciwciał przeciwko M. tuberculosis w próbce, sygnał wykryty z grupy reporterowej, która pozostaje związana z podłożem stałym, porównuje się zwykle z sygnałem odpowiadającym z góry określonej wartości odcięcia. W jednym korzystnym wykonaniu wartość odcięcia jest to średni sygnał uzyskany po inkubacji unieruchomionego antygenu z próbkami od pacjentów niezakażonych. Ogólnie, za wynik dodatni w kierunku gruźlicy uważa się taki wynik, gdy sygnał wytwarzany przez próbkę jest ponad trzy odchylenia standardowe ponad określoną wartość odcięcia. W innym korzystnym wykonaniu, wartość odcięcia określa się z zastosowaniem krzywej operacyjnej odbiorcy, stosując sposób Sackett i wsp., 1985, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., str. 106-107. Pokrótce, w tym wykonaniu wartość odcięcia można określać z wykresu par częstości wyników prawdziwie dodatnich (to znaczy, czułości) i fałszywie dodatnich (100%-swoistość), odpowiadających każdej możliwej wartości odcięcia dla wyniku testu diagnostycznego. Wartość odcięcia na wykresie, która jest najbliższa lewemu górnemu rogowi (to znaczy wartość, obejmująca największe pole) jest najdokładniejszą wartością odcięcia, i próbkę wytwarzającą sygnał wyższy od wartości odcięcia określonej tą metodą można uważać za dodatnią. Zamiast tego wartość odcięcia można przesunąć w lewo wzdłuż wykresu, w celu zminimalizowania odsetka wyników fałszywie dodatnich, lub w prawo, w celu zminimalizowania odsetka wyników fałszywie ujemnych. Ogólnie próbkę wytwarzająca sygnał wyższy od wartości odcięcia, oznaczonej tą metodą, uznaje się za dodatnią w kierunku gruźlicy.

W pokrewnym wykonaniu przeprowadza się test w teście szybkiego przepływu lub test paskowy, w którym antygen jest unieruchomiony na błonie, takiej jak nitroceluloza. W teście przepływowym przeciwciała w próbce wiążą się z unieruchomionym polipeptydem w miarę przechodzenia próbki przez błonę. Następnie odczynnik detekcyjny (na przykład białko A - złoto koloidalne) wiąże się z kompleksem przeciwciało-polipeptyd, w miarę jak roztwór zawierający odczynnik detekcyjny przepływa przez błonę. Następnie można przeprowadzić wykrywanie związanego odczynnika detekcyjnego w sposób opisany powyżej. W teście paskowym jeden koniec błony, z którą związany jest polipeptyd, zanurza się w roztworze zawierającym próbkę. Próbka migruje wzdłuż błony przez region zawierający odczynnik detekcyjny i do obszaru unieruchomionego polipeptydu. Stężenie odczynnika detekcyjnego na polipeptydzie wskazuje na obecność w próbce przeciwciał skierowanych przeciwko M. tuberculosis. Typowo, stężenie odczynnika detekcyjnego w tym miejscu wytwarza wzorzec, taki jak linia, który można odczytywać wzrokowo. Nieobecność takiego wzorca wskazuje na ujemny wynik testu. Ogólnie ilość polipeptydu unieruchomionego na błonie dobiera się do wytwarzania wzorca odróżnialnego wzrokowo, gdy próbka biologiczna zawiera przeciwciała na poziomie wystarczającym do wywołania sygnału dodatniego w ELISA, jak to omówiono powyżej. Korzystnie, ilość polipeptydu unieruchomionego na błonie wynosi od 5 ng do około 1 μg, i więcej, korzystnie od około 50 ng do około 500 ng. Testy takie można typowo przeprowadzać z bardzo małą ilością (na przykład jedna kropla) surowicy lub krwi pacjenta.

Po opisaniu wynalazku następują przykłady, które mają na celu jedynie ilustrację, nie zaś ograniczenie wynalazku.

6. Przykład: Białka fuzyjne antygenów M. tuberculosis zachowują immunogenność poszczególnych składników

6.1. Materiał i metody

6.1.1. Wytwarzanie białek fuzyjnych

PL 202 844 B1

Sekwencje kodujące antygenów M. tuberculosis zmodyfikowano przez PCR w celu ułatwienia ich fuzji i późniejszej ekspresji białka fuzyjnego. Dokonano powielenia DNA, stosując 10 μl buforu 10X Pfu, 2 il 10 mM dNTP, po 2 μl każdego z primerów PCR w stężeniu 10 μM, 81,5 μl wody, 1,5 μl polimerazy DNA Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) i 1 μl DNA w stężeniu 70 ng/il (dla antygenu TbRa3) lub 50 ng/il (dla antygenów 38 kD i Tb38-1). Dla antygenu TbRa3 denaturację w temperaturze 94°C prowadzono przez 2 minuty i następnie przez 40 cykli 96°C przez 15 sek. i 72°C przez 1 minutę, i wreszcie w 72°C przez 4 minuty. Dla antygenu 38 kD denaturację w 96°C prowadzono przez 2 minuty, następnie prowadzono 40 cykli 96°C przez 30 sek., 68°C przez 15 sek. i 72°C przez 3 minuty, i na koniec 72°C przez 4 min. Dla antygenu Tb38-1, po denaturacji w temperaturze 94°C przez 2 minuty prowadzono 10 cykli po 96°C przez 15 sekund, 68°C przez 15 sekund i 72°C przez 1,5 min., 30 cykli 96°C przez 15 sek., 64°C przez 15 sek. i 72°C przez 1,5, i na koniec 72°C przez 4 minuty.

Po trawieniu endonukleazą restrykcyjną w celu uzyskania pożądanych końców lepkich lub tępych dokonano ligacji polinukleotydu swoistego dla każdego polipeptydu fuzyjnego do plazmidu ekspresyjnego. Każdy powstały plazmid zawierał sekwencję kodującą poszczególnych antygenów każdego polipeptydu fuzyjnego. Stosowanymi wektorami ekspresyjnymi były pET-12b i pT7L2IL1.

Dla kodowania jednego białka fuzyjnego (SEQ ID Nr 1 i 2) (Fig. 1A i 2B) ligacji poddano trzy sekwencje kodujące dla antygenów Ra12, TbH9 i Ra35. Inne trzy sekwencje kodujące dla antygenów Erd14, DPV i MTI poddano ligacji, aby kodowały drugie białko fuzyjne (SEQ ID Nr 3 i 4) (Fig. 2). Trzy sekwencje kodujące dla antygenów Tbra3, 38 kD i Tb38-1 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 5 i 6) (Fig. 3A-3D). Dwie sekwencje kodujące dla antygenów TbH9 i Tb38-1 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 7 i 8) (Fig. 4A-4D). Cztery sekwencje kodujące dla antygenów TbRa3, 38 kD, Tb38-1 i DPEP poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 9 i 10) (Fig. 5A-5J). Pięć sekwencji kodujących dla antygenów Erd14, DPV, MTI, MSL i MTCC2 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 11 i 12) (Fig. 6A i 6B). Cztery sekwencje kodujące dla antygenów Erd14, DPV, MTI i MSL poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 13 i 14) (Fig. 7A i 7B). Cztery sekwencje kodujące dla antygenów DPV, MTI, MSL i MTCC2 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 15 i 16) (Fig. 8A i 8B). Trzy sekwencje kodujące dla antygenów DPV, MTI i MSL poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 17 i 18) (Fig. 9A i 9B). Trzy sekwencje kodujące dla antygenów TbH9, DPV i MTI poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 19 i 20) (Fig. 10A i 10B). Trzy sekwencje kodujące dla antygenów Erd14, DPV i MTI poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 21 i 22) (Fig. 11A i 11B). Dwie sekwencje kodujące dla antygenów TbH9 i Ra35 poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 23 i 24) (Fig. 12A i 12B). Dwie sekwencje kodujące dla antygenów Ra12 i DPPO poddano ligacji, aby kodowały jedno białko fuzyjne (SEQ ID Nr 25 i 26) (Fig. 13A i 13B).

Białka rekombinacyjne ulegały ekspresji w E. coli z sześcioma resztami histydynowymi na części aminokońcowej z zastosowaniem wektora plazmidowego pET (pET-17b) i systemu ekspresyjnego polimerazy RNA T7 (Novagen, Madison, WI). Do ekspresji wysokiego poziomu stosowano szczep E. coli BL21 (DE3) pLysE (Novagen). Rekombinacyjne (His-Tag) białka fuzyjne oczyszczono z rozpuszczalnego nadsączu lub nierozpuszczalnego ciała wtrętowego 500 ml indukowanych IPTG hodowli poprzez chromatografię powinowactwa z zastosowaniem jednego etapu macierzy QIAexpress Ni-NTA Agarose (QIAGEN, Chatsworth, CA) w obecności 8M mocznika. Pokrótce, 20 ml utrzymywanej przez noc hodowli nasyconej BL21, zawierającej strukturę pET, dodano do 500 ml pożywki 2xYT, zawierającej 50 il/ml ampicyliny i 34 ig/ml chloramfenikolu, hodowanej w temperaturze 37°C ze wstrząsaniem. Hodowle bakteryjne indukowano 2 mM IPTG przy OD 560 wynoszącej 0,3 i hodowano przez jeszcze 3 h (OD - 1,3-1,9). Komórki zebrano z 500 ml hodowli poprzez odwirowanie i ponownie zawieszono w 20 ml buforu wiążącego (0,1 M fosforanu sodowego, pH 8,0; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) zawierającym mM PMSF i 20 ig/ml leupeptyny plus jedna tabletka całkowitego inhibitora proteazy (Boehringer Mannheim) na 25 ml. E. coli poddano lizie poprzez liofilizację i następnie krótką sonikację, następnie wirowano przy 12 k obr./min. przez 30 minut celem uzyskania granulacji ciał wtrętowych.

Ciała wtrętowe wypłukano trzykrotnie w 1% CHAPS w 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Etap ten znacznie zmniejszał zanieczyszczenie LPS. Ciało wtrętowe na koniec rozpuszczono w 20 ml buforu wiążącego, zawierającego 8 M mocznika lub 8 M mocznika dodano bezpośrednio do rozpuszczalnego nadsączu. Rekombinacyjne białka fuzyjne z resztami His-Tag zbiorczo związano z żywicą agarozową Ni-NTA (5 ml żywicy na 500 ml indukcji) poprzez kołysanie w temperaturze pokojowej przez 1 h i kompleks przepuszczono przez kolumnę. Przepływ prowadzono dwukrotnie na tej samej kolumnie

PL 202 844 B1 i kolumnę płukano trzykrotnie 30 ml każdego z buforów płuczących (0,1 M fosforanu sodowego i 10 mM Tris-HCl, pH 6,3), zawierających również 8 M mocznika. Związane białko eluowano 30 ml 150 mM imidazolu w buforze płuczącym i zebrano frakcje 5 ml. Zebrano w pulę frakcje zawierające każde rekombinacyjne białko fuzyjne, dializowano przeciwko 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) związanego ponownie z macierzą Ni-NTA, eluowano i dializowano w 10 mM Tris-HCl (pH 7,8). Wydajność białka rekombinacyjnego waha się od 25 do 150 mg na litr indukowanej hodowli bakteryjnej z czystością ponad 98%. Przeprowadzono test rekombinacyjnych białek pod kątem zanieczyszczenia endotoksynami z zastosowaniem testu Limulus (BioWhittaker) i wykazano, że zawierały ich <10 E.U.Img.

6.1.2. Test proliferacji limfocytów T

Oczyszczone polipeptydy fuzyjne badano pod kątem zdolności do indukowania proliferacji limfocytów T w preparatach komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). PBMC od dawców, o których wiadomo było, że uzyskali wynik dodatni w teście skórnym PPD i dla których limfocytów T wykazano proliferację w reakcji na PPD i nieoczyszczone białka rozpuszczalne M. tuberculosis hodowano w RPMI 1640, uzupełnionym 10% surowicą ludzką od wielu dawców i 50 gl/ml gentamycyny. Oczyszczone polipeptydy dodano w dwóch egzemplarzach w stężeniu od 0,5 do 10 μg/ml. Po sześciu dniach hodowli w 96-zagłębieniowych płytkach o okrągłym dnie w objętości 200 gl, z każdego zagłębienia usunięto 50 gl pożywki dla oznaczenia poziomu IFN-γ, jak to opisano poniżej w rozdziale 6.1.3. Płytki poddano następnie impulsacji 1 gCi/zagłębienie trytowanej tymidyny przez kolejne 18 godzin, zebrano i oznaczono wychwyt trytu stosując gazowy licznik scyntylacyjny. Frakcje powodujące proliferacje w obu kopiach ponad trzykrotnie przekraczającą proliferację obserwowaną w komórkach hodowanych w samej pożywce uznawano za dodatnie.

6.1.3. Test interferonu γ

Usunięto w warunkach jałowych śledziony myszy i wytworzono zawiesiny pojedynczych komórek w pełnej RPMI po lizie krwinek czerwonych. Posiano po 100 gl (2x10^-5 komórek) na zagłębienie w 96-zagłębieniowej płaskodennej płytce do mikromiareczkowania. Hodowle pobudzano wskazanymi białkami rekombinacyjnymi przez 24 h i nadsącz testowano pod kątem IFN-γ.

Poziom IFNy w nadsączu analizowano poprzez sandwichową ELISA, stosując pary przeciwciał sposoby dostępne w PharMingen. Wytworzono krzywe standardowe, stosując rekombinacyjne cytokiny mysie. Płytki ELISA (Corning) powlekano 50 ul/zagłębienie (1 gg/ml, w 0,1 M dwuwęglanowego buforu powlekającego, pH 9,6) wychwytującego cytokiny mAb (szczurzego IFN-γ skierowanego przeciwko antygenom mysim (PharMingen, nr kat. 18181D) i inkubowano przez 4 h w temperaturze pokojowej. Wytrząśnięto zawartość płytki i zablokowano PBS-0,05% Tween, 1,0% BSA (200 gl/zagłębienie) przez noc w temperaturze 4°C i przepłukano do 6X w PBS-0,1% Tween. Następnie przez h w temperaturze pokojowej dodawano normy (mysie IFN-γ) i próbki nadsączu, rozcieńczonego w PBS-0,05% Tween, 0,1% BSA. Płytki przepłukano w powyższy sposób i następnie inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej ze 100 gl/zagłębienie drugiego Ab (biotynowane szczurze przeciwciało skierowane przeciwko mysiemu IFN-γ (nr kat. 18112D, PharMingen) w ilości 0,5 gg/ml, rozcieńczone w PBS-0,05% Tween, 0,1% BSA. Po przepłukaniu płytki inkubowano ze 100 gl/zagłębienie streptawidyny-HRP (Zymed) w rozcieńczeniu 1:2500 w PBS-0,05% Tween, 0,1% BSA w temperaturze pokojowej przez 1 h. Płytki przepłukano po raz ostatni i wywołano 100 gl/zagłębienie substratu TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna, Kirkegaard i Perry, Gaithersburg, MD) i reakcję zahamowywano po wywołaniu koloru stosując H2SO4, 50 gl/zagłębienie. Oznaczano absorbancję (OD) w 450 nm, stosując 570 nm jako referencyjną długość fali i określano stężenie cytokin z zastosowaniem krzywej standardowej.

6.2. Wyniki

6.2.1. Reakcje immunologiczne wywołane białkami trifuzyjnymi

Trzy sekwencje kodujące M. tuberculosis wprowadzono do wektora ekspresyjnego celem wytworzenia białka fuzyjnego. Antygeny, oznaczone jako Ra12, TbH9 i Ra35 wytworzono jako jedno rekombinacyjne białko fuzyjne (Fig. 1A i 1B). Antygeny Erd14, DPV i MTI wytworzono jako drugie białko fuzyjne (Fig. 2). Oba białka fuzyjne poddano oczyszczeniu powinowactwa do zastosowania w testach in vitro i in vivo.

Oba białka fuzyjne badano pod kątem ich zdolności do pobudzania reakcji limfocytów T u sześciu osób PPD⁺. Przy pomiarze proliferacji limfocytów T oba białka fuzyjne wykazywały podobny wzorzec reaktywności, jak ich poszczególne składowe (Fig. 14A-14F). Podobny wynik uzyskano przy pomiarze wytwarzania IFN-γ (Fig. 15A-15F). Na przykład pacjent D160 zareagował na antygeny TbH9 i MTI oddzielnie. Pacjent D160 zareagował również na białka fuzyjne, zawierające te antygeny

PL 202 844 B1 (Fig. 14B i 15B). Przeciwnie, u D160 nie obserwowano reakcji limfocytów T na inne antygeny oddzielnie. Inny pacjent, D201, który nie zareagował na antygeny Erd14, DPV ani MTI oddzielnie, nie reagował również na białko fuzyjne zawierające te antygeny. Należy zauważyć, że gdy reakcje limfocytów T na poszczególne składowe obu białek fuzyjnych nie były szczególnie silne, białka fuzyjne stymulowały reakcje równe lub wyższe, niż reakcje pobudzane przez poszczególne antygeny w większości przypadków.

Białko trifuzyjne Ral2-TbH9-Ra35 badano również jako immunogen in vivo. W tych doświadczeniach białko fuzyjne wstrzykiwano w poduszki łap myszy celem uodpornienia. Każda grupa po trzy myszy otrzymywała białko w innym preparacie adiuwantu: SBASlc, SBAS2 (Ling i wsp., 1997, Vaccine 15:1562-1567), SBAS7 i Al(OH)3. Po dwóch podskórnych uodpornieniach w odstępie trzech tygodni zwierzęta tydzień potem uśmiercono i zebrano ich drenujące węzły chłonne do zastosowania jako komórki reagujące w testach proliferacji limfocytów T i wytwarzania cytokin.

Niezależnie od tego, który adiuwant stosowano do immunizacji, indukowano silną proliferację limfocytów T przeciwko TbH9 przy stosowaniu go jako pojedynczy antygen (Fig. 16A). Słabsze reakcje indukowano przeciwko Ra35 i Ra12 (Fig. 16B i 16C). Przy stosowaniu białka fuzyjnego Ra12TbH9-Ra35 jako immunogenu obserwowano reakcję podobną do reakcji przeciwko pojedynczym składowym.

Przy pomiarze wytwarzania cytokin, adiuwanty SBASIc i SBAS2 dawały podobne reakcje IFNy (Fig. 17) i IL-4 (Fig. 18). Jednakże połączenie SBAS7 i wodorotlenku glinu dało najsilniejszą reakcję IFN-γ i najniższy poziom wytwarzania IL-4 dla wszystkich trzech antygenów. W odniesieniu do humoralnej reakcji przeciwciał in vivo, Fig. 19A-19F ukazują, że białko fuzyjne wywoływało reakcje swoiste dla antygenu, zarówno IgG1, jak i IgG2, przy stosowaniu z dowolnym z trzech adiuwantów.

Oprócz tego myszy C57B1/6 immunizowano połączeniem dwóch struktur ekspresyjnych, z których każda zawierała sekwencję kodującą Ra12-TbH9-Ra35 (Mtb32A) lub Erd14-DPV-MTI (Mtb39A) jako szczepionkami DNA. Uodpornione zwierzęta wykazywały znaczną ochronę przeciwko gruźlicy po późniejszej ekspozycji aerozolowej na żywe bakterie. W oparciu o te wyniki wytworzono fuzyjną strukturę sekwencji kodujących Mtb32A i Mtb39A, a produkt przez nie kodowany testowano w modelu długotrwałej ochrony na świnkach morskich. W tych badaniach świnki morskie uodparniano pojedynczym rekombinacyjnym białkiem fuzyjnym lub mieszaniną białek Mtb32A i Mtb39A w preparatach zawierających adiuwant. Fig. 20A-20C ukazują, że świnki morskie uodpornione białkiem fuzyjnym w SBAS1c lub SBAS2 były lepiej chronione przed rozwojem gruźlicy po późniejszej ekspozycji w porównaniu ze zwierzętami uodpornionymi dwoma antygenami w mieszaninie z tym samym preparatem adiuwantów. Białka fuzyjne w preparacie SBAS2 zapewniały zwierzętom najlepszą ochronę. Tak więc białka fuzyjne różnych antygenów M. tuberculosis można stosować jako immunogeny w preparatach szczepionek skuteczniejsze, niż mieszanina poszczególnych składników.

6.2.2. Reakcje immunologiczne wywołane białkami bifuzyjnymi

Sposobami rekombinacyjnymi wytworzono bifuzyjne białko fuzyjne, zawierające antygeny TbH9 i Tb38-1 bez sekwencji zawiasowej. Badano zdolność białka fuzyjnego TbH9-Tb38-1 do indukowania proliferacji limfocytów T i wytwarzania IFN-γ. Stosowano PBMC od trzech dawców: u jednego dawcy wykazano uprzednio reakcję na TbH9, lecz nie na Tb38-1 (dawca 131); u innego wykazano reakcję na Tb38-1, lecz nie na TbH9 (dawca 184) i u jeszcze innego wykazano reakcję na oba antygeny (dawca 201). Wyniki tych badań wykazują funkcjonalną aktywność obu antygenów w białku fuzyjnym (Fig. 21A i 21B, 22A i 22B, i 23A i 23B).

6.2.3. Białko tetrafuzyjne reagowało z surowicami pacjentów z gruźlicą

Wytworzono sposobami rekombinacyjnymi białko fuzyjne, zawierające antygen TbRa3, 38KD, Tb38-1 i DPEP. Badano reaktywność tego białka tetrafuzyjnego, oznaczonego jako TbF-2 z surowicami chorych zakażonych M. tuberculosis, metodą ELISA. Wyniki tych badań (Tabela 1) dowodzą, że w białku fuzyjnym działają niezależnie wszystkie cztery antygeny.

Specjalista zauważy, że kolejność poszczególnych antygenów w każdym białku fuzyjnym można zmieniać i że można oczekiwać porównywalnej aktywności, pod warunkiem, że każdy z epitopów pozostaje funkcjonalnie dostępny. Ponadto można stosować okrojone postacie białek zawierających aktywne epitopy do tworzenia białek fuzyjnych.

PL 202 844 B1

T a b e l a 1

Reaktywność białka fuzyjnego TbF-2 z surowicą pacjentów z gruźlicą (TB) i surowicą prawidłową (PR)

Nr surowicy	Stan	TbF OD450	Stan	TbF-2 OD450	Stan	Reaktywność w ELISA
						38 kD	TbRa3	Tb38-1	DPEP
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
B931-40	TB	0.57	+	0.321	+	-	+	-	+
B931-41	TB	0.601	+	0.396	+	+	+	+	-
B931-109	TB	0.494	+	0.404	+	+	+	±±	-
B931-132	TB	1.502	+	1.292	+	+	+	+	±±
5004	TB	1.806	+	1.666	+	±±	±±	+	-
15004	TB	2.862	+	2.468	+	+	+	+	-
39004	TB	2.443	+	1.722	+	+	+	+	-
68004	TB	2.871	+	2.575	+	+	+	+	-
99004	TB	0.691	+	0.971	+	-	±±	+	-
107004	TB	0.875	+	0.732	+	-	±±	+	-
92004	TB	1.632	+	1.394	+	+	±±	±±	-
97004	TB	1.491	+	1.979	+	+	±±	-	+
118004	TB	3.182	+	3.045	+	+	±±	-	-
173004	TB	3.644	+	3.578	+	+	+	+	-
175004	TB	3.332	+	2.916	+	+	+	-	-
274004	TB	3.696	+	3.716	+	-	+	-	+
276004	TB	3.243	+	2.56	+	-	-	+	-
282004	TB	1.249	+	1.234	+	+	-	-	-
289004	TB	1.373	+	1.17	+	-	+	-	-
308004	TB	3.708	+	3.355	+	-	-	+	-
314004	TB	1.663	+	1.399	+	-	-	+	-
317004	TB	1.163	+	0.92	+	+	-	-	-
312004	TB	1.709	+	1.453	+	-	+	-	-
380004	TB	0.238	-	0.461	+	-	±±	-	+
451004	TB	0.18	-	0.2	-	-	-	-	±±
478004	TB	0.188	-	0.469	+	-	-	-	±±
410004	TB	0.384	+	2.392	+	±±	-	-	+
411004	TB	0.306	+	0.874	+	-	+	-	+
421004	TB	0.357	+	1.456	+	-	+	-	+
528004	TB	0.047	-	0.196	-	-	-	-	+

PL 202 844 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
A6-87	PR	0.094	-	0.063	-	-	-	-	-
A6-88	PR	0.214	-	0.19	-	-	-	-	-
A6-89	PR	0.248	-	0.125	-	-	-	-	-
A6-90	PR	0.179	-	0.206	-	-	-	-	-
A6-91	PR	0.135	-	0.151	-	-	-	-	-
A6-92	PR	0.064	-	0.097	-	-	-	-	-
A6-93	PR	0.072	-	0.098	-	-	-	-	-
A6-94	PR	0.072	-	0.064	-	-	-	-	-
A6-95	PR	0.125	-	0.159	-	-	-	-	-
A6-96	PR	0.121	-	0.12	-	-	-	-	-

Odcięcie		0.284		0.266

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Immunogeniczny polipeptyd, zawierający sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr 2, ewentualnie zawierającą jedną konserwatywną substytucję aminokwasem.
2. Immunogeniczny polipeptyd, według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr 2, ewentualnie zawierającą jedną konserwatywną substytucję aminokwasem.
3. Immunogeniczny polipeptyd, według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 2 ewentualnie zawierającą jedną konserwatywną substytucję aminokwasem.
4. Immunogeniczny polipeptyd, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 792 w SEQ ID nr 2.
5. Immunogeniczny polipeptyd, według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 2.
6. Immunogeniczny polipeptyd, według zastrz. 5, znamienny tym, że stanowi sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 2.
7. Polinukleotyd, znamienny tym, że koduje polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1 do 6.
8. Polinukleotyd, zawierający pierwszą sekwencję nuklotydową, która hybrydyzuje w średnich warunkach hybrydyzacji z drugą sekwencją polinukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr: 2, przy czym wspomniany polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest funkcjonalnie równoważny sekwencji reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr: 2, w próbach wytwarzania proliferacji komórki T lub interferonu gamma.
9. Polinukleotyd, według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera pierwszą sekwencję nuklotydową, która hybrydyzuje w bardzo ostrych warunkach hybrydyzacji z drugą sekwencją polinukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr: 2, przy czym wspomniany polinukleotyd zawiera pierwszą sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest funkcjonalnie równoważny sekwencji reszt aminokwasowych 8 do 729 w SEQ ID nr: 2, w teście wytwarzania proliferacji komórki T lub interferonu gamma.
10. Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd zdefiniowany w zastrz. 8 do 9.
11. Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według zastrz. 7 do 9, znamienny tym, że jest wytwarzany metodami rekombinacji DNA.
12. Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według zastrz. 7 do 9, znamienny tym, że jest wytwarzany metodami syntezy chemicznej.

PL 202 844 B1
13. Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według zastrz. 7 do 9, znamienny tym, że polipeptyd ten indukuje odpowiedź komórki T.
14. Polipeptyd kodowany przez polinukleotyd zdefiniowany w zastrz. 7 do 9, znamienny tym, że jest połączony poprzez fuzję z drugim heterologicznym polipeptydem.
15. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1 do 6 lub 10 do 14.
16. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca polinukleotyd zdefiniowany w zastrz. 7 do 9.
17. Wektor ekspresji, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd zdefiniowany w zastrz. 7 do 9.
18. Wektor ekspresji według zastrz. 17, znamienny tym, że jest wektorem wirusowym.
19. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1 do 6 lub 10 do 14 i adiuwant.
20. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera polinukleotyd zdefiniowany w zastrz. 7 do 9.
21. Polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1 do 6 lub 10 do 14 do stosowania do leczenia lub zapobiegania infekcjom M. Tuberculosis.
22. Polinukleotyd zdefiniowany w zastrz. 7 do 9 do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom M. Tuberculosis.
23. Sposób wytwarzania polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 do 6, lub 10, do 14, znamienny tym, że prowadzi się ekspresję rekombinacyjną polinukleotydu jak zdefiniowano w zastrz. 7 do 9.