PL203114B1 - Zastosowania przeciwciała przeciw VLA-4 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała przeciw integrynie alfa-4/beta7 lub jego fragmentu wiążącego antygen lub przeciwciała przeciw VCAM-1 lub jego fragmentu wiążącego antygen, zastosowania rozpuszczalnych polipeptydów VLA-4 lub VCAM-1, które antagonizują interakcję VLA-4/VCAM-1 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zastosowania: przeciwciała przeciw VLA-4 lub jego fragmentu wiążącego antygen; przeciwciała przeciw integrynie alfa-4/beta7 lub jego fragmentu wiążącego antygen lub przeciwciała przeciw VCAM-1 lub jego fragmentu wiążącego antygen, zastosowania rozpuszczalnych polipeptydów VLA-4 lub VCAM-1, które antagonizują interakcję VLA-4/VCAM-1, do wytwarzania leku.

Lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku przeznaczony jest do leczenia szpiczaka mnogiego, oraz uwalniania czynników resorbujących kości przez komórki szpiczaka, powodującego ciężką utratę kości, która jest głównym objawem ubocznym szpiczaka u ludzi. Szpiczak mnogi jest drugim najbardziej powszechnym nowotworem hematologicznym z 15000 nowych przypadków diagnozowanych co roku i 30000 - 40000 pacjentów ze szpiczakiem w USA rocznie (Mundy i Bertolini, 1986). Osiemdziesią t procent pacjentów cierpi na wyniszczają cy rozpad osteolityczny koś ci, spowodowany wzrostem tworzenia i aktywności osteoklastów (OCL) (Mundy i Bertolini, 1986). Rozpad kości może spowodować rozdzierające bóle kości, patologiczne złamania, kompresję rdzenia kręgowego i zagrażającą życiu hiperkalcemię. Ponieważ szpiczaka nie można wyleczyć konwencjonalną chemioterapią albo przeszczepem komórek macierzystych (Attal i in., 1996) oraz z powodu ciężkiego stanu chorobowego i potencjalnej śmiertelności związanej ze szpiczakiem, istotne życiowo są strategie leczenia kontrolujące sam wzrost szpiczaka oraz szczególnie rozpad osteolityczny kości, który może wystąpić u tych pacjentów.

Jednakże, patologiczny mechanizm odpowiedzialny za zwiększoną aktywność osteoklastów u pacjentów ze szpiczakiem pozostaje nieznany (Mundy, 1998). Zmiany kostne wystę pują w kilku postaciach. Czasami u pacjentów rozwijają się nieznaczne zmiany osteolityczne, które są związane z pojedynczymi plazmocytomami. Niektórzy pacjenci wykazują rozsianą osteopenię , która naś laduje wygląd osteoporozy i jest spowodowana komórkami szpiczaka rozsianymi w kośćcu osiowym. U większości pacjentów występują nieznaczne, liczne zmiany lityczne, występujące w sąsiedztwie ognisk komórek szpiczaka. Hiperkalcemia występuje w następstwie rozpadu kości u około 1/3 pacjentów z chorobą zaawansowaną . Rzadko pacjenci ze szpiczakiem nie mają zmian litycznych albo utraty kości, a zamiast tego wykazują wzrost tworzenia nowej kości wokół komórek szpiczaka. Ta rzadka sytuacja znana jest jako osteosklerotyczna postać szpiczaka.

Osteolityczne zmiany kostne są najczęstszymi objawami szkieletowymi u pacjentów ze szpiczakiem (Mundy, 1998). Jakkolwiek dokładne mechanizmy molekularne pozostają niejasne, ponad 15-letnie obserwacje wykazały, że: 1) mechanizm, według którego następuje zniszczenie kości w szpiczaku zachodzi przez osteoklasty, normalne komórki resorbujące kość; 2) osteoklasty gromadzą się na powierzchniach resorbujących kości w szpiczaku w sąsiedztwie zbiorowisk komórek szpiczaka i wydaje się , ż e mechanizm, który pobudza osteoklasty w szpiczaku, jest miejscowy; 3) od wielu lat wiadomo, że hodowle komórek ludzkiego szpiczaka in vitro wytwarzają kilka czynników aktywujących osteoklasty, w tym limfotoksynę-alfa (LT-α), interleukinę 1 (IL-1), białko pokrewne z hormonem przytarczyc (PTHrP) i interleukinę 6 (IL-6); 4) hiperkalcemia występuje u około 1/3 pacjentów ze szpiczakiem czasami w trakcie choroby; hiperkalcemia jest zawsze związana ze znacznym wzrostem resorpcji kości i często z zaburzeniami filtracji kłębuszkowej; 5) wzrost resorpcji kości przez osteoklasty w szpiczaku jest zwykle związany ze znacznym zaburzeniem funkcji osteoblastów. Aktywność fosfatazy alkalicznej w surowicy jest obniżona albo jest na normalnym poziomie, w przeciwieństwie do pacjentów z innymi rodzajami osteolitycznej choroby kości, zaś scyntygraficzne badanie kości nie wykazuje dowodów zwiększonego wychwytu, wskazując na zaburzenia odpowiedzi osteoblastów na wzrost resorpcji kości.

Jakkolwiek różne mediatory wymienione powyżej są włączone w stymulację aktywności osteoklastów u pacjentów ze szpiczakiem mnogim, doniesienia o czynnikach wytwarzanych przez komórki szpiczaka nie są zgodne ze sobą, zaś niektóre badania są nieprzekonywujące z powodu obecności w populacji komórek szpiczaka mnogiego innych zanieczyszczających rodzajów komórek, w tym komórek zrębu i makrofagów. IL-6 jest głównym czynnikiem wzrostowym szpiczaka, który zwiększa wzrost kilku linii komórkowych szpiczaka oraz świeżo izolowanych od pacjentów komórek szpiczaka (Bataille i in., 1989). Wytwarzanie IL-6 można wykryć przez PCR w około 40% świeżo wyizolowanych komórek szpiczaka, ale tylko 1 na 150 badanych pacjentów wykazuje wykrywalne wytwarzanie IL-6 w badaniu immunocytochemicznym albo ELISA (Epstein, 1992). Receptory IL-6 wykrywano tylko w 6 na 13 próbek od pacjentów ze szpiczakiem mnogim (Bataille i in., 1992). Ponadto, dojrzałe komórki szpiczaka, jak opisywano, wykazują minimalną reakcję proliferacyjną na IL-6. Interleukina 11 (IL-11)

PL 203 114 B1 wykazuje wobec plazmocytomy działanie przypominające aktywność IL-6, ale do tej pory nie wykazano, że komórki szpiczaka wytwarzają IL-11. Bataille i współpracownicy (1995) wykazali, że perfuzja 5 pacjentów ze szpiczakiem opornym na leczenie przy użyciu przeciwciała przeciwko IL-6 zmniejsza ilość komórek szpiczaka u jedynie 2 z tych pacjentów. IL-1 jest niezwykle silnym czynnikiem resorpcyjnym kości, który wywołuje hiperkalcemię na modelach zwierzęcych pod nieobecność defektu nerek (Boyce i in., 1989). W przeciwieństwie do tego, hiperkalcemia rzadko występuje u pacjentów ze szpiczakiem bez defektu nerek. Co najistotniejsze, w wysoko oczyszczonych komórkach szpiczaka, nie można wykryć wytwarzania IL-1, a jedynie rzadko wytwarzanie TNF-α, co sugeruje, że inne zanieczyszczające rodzaje komórek, takie jak makrofagi, mogą być źródłem IL-1 i TNF-α (Epstein, 1992). Podobnie, LT-α jest wytwarzana przez większość linii ludzkich komórek szpiczaka (Bataille i in., 1995), ale nie wydaje się być wytwarzana przez komórki szpiczaka in vivo (Alsina i in., 1996). Oprócz IL-1, TNF-α, oddala LT-α i IL-6, komórki szpiczaka wytwarzają odciętą postać M-CSF, który jest biologicznie czynny, ale M-CSF sam nie powoduje hiperkalcemii, ani nie indukuje tworzenia osteoklastów w hodowlach ludzkiego szpiku (MacDonald i in., 1986).

Zatem, rola żadnego z tych czynników w osteolitycznej chorobie kości u pacjentów ze szpiczakiem nie została wyraźnie wykazana in vivo, tak więc znane cytokiny nie są w pełni odpowiedzialne za resorpcję kości obserwowaną u tych pacjentów.

Rola interakcji cząsteczek adhezyjnych w chorobie kości związanej ze szpiczakiem

Anderson i współpracownicy byli pierwszym zespołem, który wykazał znaczenie interakcji adhezyjnych między komórkami szpiczaka a komórkami w mikrośrodowisku szpiku we wzroście komórek szpiku i rozwoju osteolitycznej choroby kości. Komórki szpiczaka mnogiego wyrażają na powierzchni komórkowe cząsteczki adhezyjne CD29 (VLA-4), LFA-1 i CD44 (Chauhan i in., 1995). Zespół ten sugerował, że komórki szpiczaka gromadzą się w szpiku przez swoiste interakcje adhezyjne między białkami macierzy zewnątrzkomórkowej i komórkami zrębu szpiku. Dalej wykazali, że adhezja komórek szpiczaka mnogiego do komórek zrębu wyzwala wydzielanie IL-6 zarówno przez prawidłowe jak i pochodzące ze szpiczaka mnogiego komórki zrębu, oraz zwiększony wzrost komórek nowotworu pod wpływem IL-6. Jednakże, przeciwciała przeciwko CD29, LFA-1 albo CD44 nie zmniejszyły wytwarzania IL-6 przez komórki zrębu szpiku w odpowiedzi na komórki szpiczaka, co sugeruje, że inna interakcja receptor-ligand wyzwalały wydzielanie IL-6 przez komórki zrębowe szpiku kostnego wiążące się z komórkami szpiczaka. Sama identyfikacja możliwego szlaku adhezji nie oznacza koniecznie, że jest to ważny szlak. W tym przypadku żaden ze związanych szlaków nie odgrywa roli w wytwarzaniu IL-6.

Vanderkerken i in., (1997) badali również profil fenotypowy adhezji mysich komórek 5T2 i komórek szpiczaka 5T33 w modelu mysiego szpiczaka. Badacze ci wykazali, że te linie komórkowe wyrażają VLA-4, VLA-5, LFA-1 i CD44, i sugerowali, że te interakcje adhezyjne mogą być ważne dla komórek szpiczaka do wiązania się z komórkami zrębowymi szpiku.

Jednakże, mimo znacznych postępów laboratoryjnych, fundamentalne mechanizmy leżące u podstaw zwiększonego rozpadu kości przez osteoklasty w szpiczaku in vivo pozostaje słabo zrozumiały. Odzwierciedla to niezdolność do prostego zinterpretowania danych dotyczących interakcji adhezyjnych otrzymanych in vitro w odniesieniu do interakcji in vivo. Przykładowo, wiele badań in vitro wiąże zarówno integrynę VLA-4 jak i integrynę LFA-1 z adhezją komórek macierzystych krwiotworzenia do komórek zrębowych szpiku (opisane przez Papayannopoulou i Nakamoto, 1993). Te dane in vitro pozwalają przewidzieć, że każdy z tych szlaków, jeżeli zostanie zablokowany in vivo, spowoduje peryferalizacje komórek macierzystych krwiotworzenia ze szpiku do krwi obwodowej. Mimo to, w badaniach na naczelnych, mimo iż przeciwciało monoklonalne przeciwko VLA-4 powodowało peryferalizację komórek macierzystych, przeciwciało monoklonalne przeciwko łańcuchowi beta 2 integryny LFA-1 nie miało wpływu, pomimo rosnących poziomów neutrofilów, wykazując w ten sposób skuteczność przeciwciał monoklonalnych (Papayannopoulou i Nakamoto, 1993). Dane te wykazują, że na podstawie wyników in vitro nie można było faktycznie dokładnie przewidzieć znaczenia in vivo.

Należy zauważyć, że rola integryny VLA-4 była badana na przerzutach wielu nowotworów, w tym białaczek, takich jak chłoniaki, z rozbieżnymi wynikami. Zatem, transfekcja ludzkiego łańcucha alfa4 do komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) spowodowała ekspresję VLA-4, i sprawiła, że komórki te były zdolne do migracji do szpiku kostnego in vivo, które to zjawisko było hamowane przez przeciwciała monoklonalne przeciwko VLA-4 (Matsuura i in., 1996). Przeciwnie, transfekcja komórek chłoniaka integryną VLA-4 silnie hamuje przerzuty do wątroby, płuc i nerek, natomiast nie ma wpływu na kierowanie i proliferację w szpiku (Gosslar i in., 1996). Oprócz tego, ekspresja VLA-4 na silnie prze4

PL 203 114 B1 rzutujących komórkach mysiego czerniaka silnie hamuje tworzenie przerzutów do płuc in vivo (Qian i in., 1994) i nie predysponuje czerniaka do przerzutów do szpiku.

Podsumowując, nie jest jasne na podstawie badań in vitro, jak niezawodnie można przewidzieć in vivo szlaki adhezji. Ponadto, nawet gdy przeprowadzono badania in vivo, uzyskane dane nie są zgodne. Jedną z głównych przyczyn powodujących rozbieżności w dziedzinie szpiczaka mnogiego jest to, że obecnie dostępne zwierzęce modele nie są dobrymi prognostykami ludzkiej choroby. W przypadku szpiczaka mnogiego, ludzkie i mysie linie komórkowe szpiczaka, które moż na hodować in vitro są rzadko związane z rozpadem kości in vivo (Mundy, 1998).

Byłoby bardzo pożądane opracowanie związków albo antagonistów, którzy hamują wytwarzanie tych czynników resorbujących kości, zatrzymując w ten sposób postępujący rozpad kości i polepszając jakość życia pacjentów ze szpiczakiem.

Zastosowaliśmy niedawno opracowany mysi model szpiczaka mnogiego, w którym u myszy rozwija się ciężka osteoliza z wszystkimi cechami choroby ludzkiej (Garrett, 1997). Stosując tę linię komórkową i model zwierzęcy ustalono, że zahamowanie szlaku integryny alfa4/liganda integryny alfa4 in vivo prowadzi do zmniejszonej zdolności komórek szpiczaka mnogiego do proliferacji i/lub przeżywania. Wykazano, że interakcje międzykomórkowe między komórkami szpiczaka i komórkami zrębowymi szpiku przez interakcje VLA-4/VCAM-1, jest wymagane do wzrostu wytwarzania aktywności, która pobudza osteoklastyczną resorpcję kości w mikrośrodowisku kości in vitro.

Naszym zdaniem ta interakcja jest kluczowa dla kierowania komórek szpiczaka do przedziału szpikowego, dla ich dalszego przeżywania i wzrostu i ostatecznie do postępu osteolizy wywołanej szpiczakiem. Zbadano to na modelu zwierzęcym i stwierdzono, że in vivo, antagonista integryny VLA-4, zawierającej podjednostkę alfa4, silnie hamuje wytwarzanie przeciwciała podtypu IgG2b. Jest to ten sam izotyp jak wytwarzany przez linię komórkową 5TGM1, i stanowi dokładny środek zastępczy dla wielu komórek szpiczaka w przedziale szpikowym w dowolnym czasie. Zatem, zablokowanie szlaku VLA-4 silnie hamuje wytwarzanie IgG2b, zaś w konsekwencji, poziom obciążenia szpiczakiem.

Wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen wybranego spośród:

(a) przeciwciała przeciw VLA-4 lub jego fragmentu wiążącego antygen;

(b) przeciwciała przeciw integrynie alfa-4/beta7 lub jego fragmentu wiążącego antygen (c) przeciwciała przeciw VCAM-1 lub jego fragmentu wiążącego antygen do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia szpiczaka mnogiego, przy czym przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen są wybrane z grupy składającej się z przeciwciała ludzkiego, przeciwciała chimerowego, przeciwciała humanizowanego i ich fragmentów wiążących antygen.

W zakres wynalazku wchodzi równie ż zastosowanie przeciwciał a lub jego fragmentu wiążącego antygen wybranego spośród:

(a) przeciwciała przeciw VLA-4 lub jego fragmentu wiążącego antygen;

(b) przeciwciała przeciw integrynie alfa-4/beta7 lub jego fragmentu wiążącego antygen (c) przeciwciała przeciw VCAM-1 lub jego fragmentu wiążącego antygen do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania resorpcji kości towarzyszącej nowotworom szpiku kostnego, przy czym przeciwciało lub jego fragment wiążący są wybrane z grupy składającej się z przeciwciała ludzkiego, przeciwciała chimerowego, przeciwciała humanizowanego i ich fragmentów wiążących antygen.

Korzystnie w powyższych zastosowaniach przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen są wybrane spośród przeciwciała HP1/2 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała HP2/1 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała HP2/4 lub jego fragmentu wiążącego, przeciwciała L25 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała P4C2 lub jego fragmentu wiążącego antygen i przeciwciała P4G9 lub jego fragmentu wiążącego antygen.

Korzystnie przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest humanizowanym przeciwciałem przeciw VLA-4 lub jego fragmentem wiążącym antygen obejmującym humanizowany łańcuch lekki i humanizowany ł a ń cuch ciężki, a każ dy ł a ń cuch lekki i ł a ń cuch ciężki obejmuje regiony determinuj ące dopasowanie (CDR1, CDR2 i CDR3) z mysiego przeciwciała 21.6 przeciw VLA-4.

Korzystnie a. humanizowany łańcuch lekki obejmuje zrębowy region zmienny z sekwencji zrębowego regionu zmiennego ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, gdzie co najmniej jedna pozycja aminokwasowa regionu zrębowego jest zajęta przez aminokwas obecny w równoważnej pozycji zrębowego regionu zmiennego łańcucha lekkiego mysiej immunoglobuliny 21.6; i

PL 203 114 B1

b. humanizowany łańcuch ciężki obejmuje zrębowy region zmienny z sekwencji zrębowego regionu zmiennego ludzkiego łańcucha ciężkiego, gdzie co najmniej jedna pozycja aminokwasowa regionu zrębowego jest zajęta przez aminokwas obecny w równoważnej pozycji zrębowego regionu zmiennego łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny 21.6.

Korzystnie kompozycja zawierająca przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen wytwarzana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest w formie odpowiedniej do podawania pozajelitowego.

Korzystnie przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen mogą być stosowane w kombinacji z jednym lub więcej kortykosteroidem, ś rodkiem przeciwzapalnym, antymetabolitem i immunomodulatorem.

Korzystnie przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen jest przeciwciałem monoklonalnym lub jego fragmentem wiążącym antygen.

Korzystnie przeciwciało przeciw VLA-4 lub jego fragment wiążący antygen wiąże łańcuch alfa VLA-4.

Korzystnie przeciwciało przeciw VLA-4 lub jego fragment wiążący antygen jest przeciwciałem przeciw VLA-4 lub jego fragmentem wiążącym swoistym wobec epitopu B.

Wynalazek dotyczy również zastosowania rozpuszczalnych polipeptydów VLA-4 lub VCAM-1, które antagonizują interakcję VLA-4/VCAM-1, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia szpiczaka mnogiego oraz zastosowania rozpuszczalnych polipeptydów VLA-4 lub VCAM-1, które antagonizują interakcję VLA-4/VCAM-1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania resorpcji kości towarzyszącej nowotworom szpiku kostnego.

Korzystnie w powyższych zastosowaniach kompozycja zawierająca polipeptyd jest sformułowana do podawania pozajelitowego, korzystnie też polipeptyd jest odpowiedni do stosowania w kombinacji z jednym lub więcej kortykosteroidem, środkiem przeciwzapalnym, immunosupresantem, antymetabolitem i immunomodulatorem.

Kompozycja do leczenia szpiczaka mnogiego lub kompozycja do hamowania resorpcji kości wytwarzana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawiera przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen wybrane spośród przeciwciała przeciw VLA-4 lub jego fragmentu wiążącego antygen albo przeciwciała przeciw integrynie alfa-4/beta7 lub jego fragmentu wiążącego antygen, które mogą być czynnikami wiążącymi integrynę alfa4, bądź przeciwciała przeciw VCAM-1 lub jego fragmentu wiążącego antygen , które może być czynnikiem wiążącym ligand integryny alfa4. Kompozycja zawierająca przeciwciało wybrane powyższych przeciwciał antagonizuje interakcje między integryną z podjednostką alfa4 (np. VLA4) i ligandem tej integryny (np. VCAM-1). Korzystnymi przeciwciałami przeciwko VLA-4 albo przeciwko alfa4 beta7 są przeciwciało ludzkie, chimerowe, humanizowane i ich fragmenty; przeciwciałem przeciwko VCAM-1 może być przeciwciało ludzkie, chimerowe, humanizowane i ich fragmenty.

Kompozycja może być podawana w dawkach zapewniających od 0,1 do 20 mg/kg ciężaru ciała. W szczególności, korzystne związki mogą antagonizować oddziaływanie: a) równocześnie VLA-4 i alfa4beta7 z ich odpowiednimi ligandami alfa4; albo b) tylko VLA-4 z ligandem alfa4; albo c) tylko alfa4beta7 z ligandem alfa4.

Kompozycję zawierającą przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen wybrane spośród przeciwciała przeciw VLA-4 lub jego fragmentu wiążącego antygen albo przeciwciała przeciw integrynie alfa-4/beta7 lub jego fragmentu wiążącego antygen, które mogą być czynnikami wiążącymi integrynę alfa4, bądź przeciwciała przeciw VCAM-1 lub jego fragmentu wiążącego antygen, które może być czynnikiem wiążącym ligand integryny alfa4a można stosować do leczenia osobnika z zaburzeniem charakteryzującym się obecnością osteoklastogenezy. Kompozycja zawierająca przeciwciało wybrane powyższych przeciwciał antagonizuje interakcje między integryną z podjednostką alfa4 (np. VLA4) i ligandem tej integryny (np. VCAM-1).

Korzystnymi czynnikami są przeciwciała przeciwko VLA-4 albo przeciwko alfa4beta7 (przeciwciało ludzkie, chimerowe, humanizowane i ich fragmenty); przeciwciało przeciwko VCAM-1 (ludzkie, chimerowe, humanizowane i ich fragmenty). Kompozycja może być podawana w dawkach zapewniających od 0,1 do 20 mg/kg ciężaru ciała. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie odnośniki włączone są tu w całości.

Krótki opis Figur

Figura 1.

Wpływ przeciwciał neutralizujących na tworzenie TRAP-dodatnich wielojądrzastych komórek przypominających OC we wspólnych hodowlach komórek 5TGM1 i komórek szpiku.

PL 203 114 B1

Mieszaninę komórek 5TGM1 (1 x 10³) i komórek szpiku (1 x 10⁶) w zawiesinie, wysiano na płytki 48-studzienkowe, i hodowano w obecności albo pod nieobecność 10 μg/ml przeciwciał przeciwko VCAM-1 (VCAM-1 Ab), przeciwciała przeciwko alfa4betal (α4β11 Ab), przeciwciała przeciwko ICAM-1 (ICAM-1 Ab) i szczurzych IgG jako kontroli. Po 6 dniach hodowli, hodowle utrwalono i określono liczbę TRAP-dodatnich, wielojądrzastych komórek przypominających OC (TRAP(+) MNC). Zarówno VCAM-1 Ab, jak i alfa4betal Ab hamowały tworzenie (TRAP(+) MNC), podczas gdy ICAM-1 Ab nie wykazywały wpływu. Dane wyrażono jako średnią ± SE (n = 3). * = różnica istotna statystycznie w stosunku do kontroli IgG.

Figura 2

Wpływ kondycjonowanych pożywek 5TGM1 i ST2 na resorpcję kości w hodowlach narządowych szczurzych płodowych kości długich.

Kondycjonowaną (48 godzin) pożywkę uzyskaną z samych ST2, samych 5TGM1 i wspólnej hodowli ST2 i 5TGM1 badano na aktywność resorbowania kości w hodowlach narządowych szczurzych, płodowych kości długich, znakowanych ⁴⁵Ca. Znakowane, szczurze płodowe kości długie hodowano w obecności pożywki kondycjonowanej (40% obj.) albo pożywki kontrolnej przez 120 godzin. Dane wyrażono jako procent wzrostu uwalniania wapnia w porównaniu z pożywką kontrolną. Uwalnianie z pożywki kondycjonowanej komórek zrębowych ST2 pokazano jako niewypełnione słupki. Uwalnianie z 5TGM1 pokazano jako zakreskowane słupki. Uwalnianie z kondycjonowanej pożywki zebranej ze wspólnej hodowli 5TGM1 i ST2 pokazano jako wypełnione słupki. Dane wyrażono jako średnią ± SE (n = 4). * = istotnie różne od samych ST2. *** = istotnie różne od samych 5TGMl.

Figura 3

Wpływ rekombinowanej, rozpuszczalnej VCAM-1 (sVCAM-1) na wytwarzanie aktywności osteoklastogennej przez komórki 5TGM1.

Kondycjonowaną pożywkę zebrano z hodowli komórek 5TGM1 hodowanych w obecności albo pod nieobecność sVCAM-1 (1 x 10^-8 do 1 x 10^-7 M) przez 24 godziny. Aktywność osteoklastogenną tych kondycjonowanych pożywek badano w hodowlach szpiku mysiego. Komórki szpiku (1 x 10⁶/studzienkę) wysiano do płytek 48-studzienkowych i hodowano w obecności kondycjonowanej pożywki (słupki zakreskowane) albo pożywki kontrolnej (IMDM) zawierającej to samo stężenie sVCAM-1 (słupki niewypełnione).

Po 6 dniach, hodowle utrwalono i oznaczono liczbę TRAP-dodatnich, wielojądrzastych komórek przypominających OC (TRAP+MNC). Kondycjonowana pożywka z komórek 5TGM1 traktowana 1 x 10⁷ M sVCAM-1 zwiększała tworzenie TRAP(+)MNC w porównaniu z kontrolą. Dane wyrażono jako średnią ± SE (n = 3). * = istotnie różne od kontroli.

Figura 4

Wpływ przeciwciała monoklonalnego PS2 przeciwko VLA-4 na wzrost IgG2b w surowicy myszy niosących 5TGM1.

Myszom wstrzyknięto po 1 x 10⁵ komórek 5TGM1, po czym pozostawiono do skolonizowania szpiku. Myszy podzielono na dwie grupy po trzy, jedną służącą jako grupa kontrolna, zaś drugą leczono w dniu 8, 11, 14, 17 i 20 przez podanie 80 μg przeciwciała monoklonalnego PS/2 ( około 4 mg/kg). Poziomy IgG2b, izotypu przeciwciała wytwarzanego przez komórki szpiczaka 5TGM1, mierzono co tydzień od 1 do 6 tygodnia. Leczenie przeciwciałami monoklonalnymi silnie hamowało wytwarzanie IgG2b, wskazując na hamowanie przeżywania i wzrostu komórek szpiczaka in vivo.

Figura 5

Wpływ przeciwciał monoklonalnych M/K-2.7 przeciwko VCAM-1 na wzrost IgG2b w surowicy myszy niosących 5TGM1.

Myszom wstrzyknięto komórki 5TGM1 jak to opisano na fig. 4, po czym pozostawiono do skolonizowania szpiku. Myszy podzielono na grupy po cztery lub pięć myszy, jedną służącą jako grupa kontrolna (niewypełnione kwadraty), zaś grupę drugą/trzecią leczono profilaktycznie przez podanie 80 μg przeciwciała monoklonalnego (niewypełnione romby) i 160 μg przeciwciała monoklonalnego (niewypełnione kółka) (około 4 do 8 mg/kg), czwartą grupę traktowano terapeutycznie przez podanie 160 μg przeciwciała monoklonalnego (trójkąty). Mierzono poziom IgG2b, izotypu przeciwciała wytwarzanego przez komórki szpiczaka 5TGM1. Leczenie przeciwciałami monoklonalnymi silnie hamowało wytwarzanie IgG2b, wskazując na hamowanie przeżywania i wzrostu komórek szpiczaka in vivo.

Figura 6

Wpływ przeciwciała przeciwko integrynie alfa4 na przeżycie myszy niosących szpiczaka mnogiego.

PL 203 114 B1

Określenie „szpiczak mnogi w znaczeniu tu zastosowanym oznacza stan medyczny osobnika z chorobą nowotworową komórek plazmatycznych, z klonem nowotworowym reprezentują cym komórki na różnych etapach rozwoju linii komórek plazmatycznych od różnych pacjentów (Mundy, 1988).

Integryna alfa 4 beta1 jest receptorem powierzchniowym komórki dla VCAM-1, fibronektyny i prawdopodobnie innych cz ąsteczek, które wiążą się z nią albo w inny sposób oddział ują . Takie czą steczki, które wiążą się albo w inny sposób oddziałują z integryna zawierającą podjednostkę alfa 4 są pojedynczo i wspólnie określane jako „ligand(y) alfa4. Określenie „integryna a4b1 („VLA-4 albo „a4b1 albo „integryna a4b1, są tu stosowane zamiennie) w znaczeniu tu stosowanym oznacza polipeptydy, które są zdolne do wiązania się z VCAM-1 i przedstawicielami białek macierzy zewnątrzkomórkowej, w szczególności z fibronektyną albo ich homologi albo fragmenty, jakkolwiek należy zauważyć, że istnieją inne ligandy dla VLA-4 i które można je analizować stosując konwencjonalne metody.

Wiadomo, że podjednostka alfa4 wiąże się, z innymi podjednostkami beta oprócz beta 1, tak więc można zdefiniować określenie „integryna alfa4 jako integryny, w których podjednostka alfa4 wiąże się z jedną albo innymi podjednostkami beta. Dalszym przykładem integryny „alfa4 jest alfa4beta7 (R. Lobb i M. Hemler, 1994). W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „integryna(y) alfa4 oznacza VLA-4, jak również integryny, które zawierają beta1, beta7 albo inną podjednostkę beta.

„Antagonistą integryny w zastosowaniach według wynalazku jest przeciwciało, które hamuje integrynę(y) alfa4 przed wiązaniem się z ligandem integryny alfa4. Antagonistą są również rozpuszczalne polipeptydy, które obejmują rozpuszczalną postać białka ligandu VCAM-1. Przykładowo, kompozycję wytwarzaną zgodnie z zastosowaniami według wynalazku zawierającą rozpuszczalną postać ligandu integryny alfa4 albo jego fragment można podawać w celu wiązania integryny i korzystnie ligand współzawodniczy o miejsce wiązania integryny na komórkach, prowadząc w ten sposób do skutków przypominających podanie antagonistów, takich jak przeciwciała przeciwko integrynie alfa4 (np. przeciwciała przeciwko alfa4 beta7 i/lub VLA-4). Dla celów wynalazku, określenie „antagonista interakcji liganda integryny alfa4/integryny alfa4 dotyczy czynnika, np. polipeptydu, który może hamować albo blokować ligand alfa4 (np. VCAM-1) i/lub funkcję wiązania za pośrednictwem integryny alfa4 (np. alfa4beta7 albo VLA-4) albo może w inny sposób modulować funkcje liganda alfa4 i/lub integryny alfa4, np. przez zahamowanie albo zablokowanie przekazywania sygnału integryny alfa 4 za pośrednictwem liganda alfa4 albo przekazywania sygnału liganda alfa4 za pośrednictwem liganda alfa4 i który jest skuteczny w leczeniu szpiczaka, korzystnie w ten sam sposób jak przeciwciała przeciwko integrynie alfa4.

Konkretnie, antagonistą interakcji VCAM-1/VLA-4 jest czynnik, który wykazuje jedną albo wiele z następujących właściwoś ci: 1) pokrywa albo wiąże się z VLA-4 na powierzchni komórek niosących VLA-4 (np. komórek szpiczaka) ze swoistością wystarczającą do zahamowania interakcji liganda VLA-4/VLA-4, np. interakcji VCAM-1/VLA-4 między komórkami zrębowymi szpiku i komórkami szpiczaka; 2) pokrywa albo wiąże się z VLA-4 na powierzchni komórek niosących VLA-4 (np. komórek szpiczaka) ze swoistością wystarczającą do modyfikowania, a korzystnie do zahamowania sygnału przekazywania za pośrednictwem VLA-4, np. sygnalizacji za pośrednictwem VLA-4/VCAM-1; 3) pokrywa albo wiąże się z ligandem VLA-4 (np. VCAM-1) na komórkach zrębowych szpiku ze swoistością wystarczającą do zahamowania interakcji VLA-4/VCAM-1; 4) pokrywa albo wiąże się z ligandem VLA-4 (np. VCAM-1) na komórkach zrębowych szpiku ze swoistością wystarczającą, do modyfikowania, zaś korzystnie do hamowania przekazywania sygnału VLA-4 za pośrednictwem liganda VLA-4, np. sygnalizacji VLA-4 za pośrednictwem VCM-1. W korzystnym wykonaniu, antagonista wykazuje jedną albo obie właściwości 1) i 2). W innym korzystnym wykonaniu, antagonista ma jedną albo obie właściwości 3) i 4). Ponadto, pacjentowi można podawać więcej niż jednego antagonistę, np. czynnik, który wiąże się z VLA-4 można połączyć z czynnikiem, który wiąże VCAM-1.

Przykładowo, przydatne są przeciwciała (omówione poniżej), jak również rozpuszczalne postaci naturalnych białek wiążących VLA-4 i VCAM-1. Rozpuszczalne postaci naturalnych białek wiążących VLA-4 obejmują rozpuszczalne peptydy VCAM-1, a rozpuszczalne postaci naturalnych białek wiążących VCAM-1 obejmują rozpuszczalne peptydy VLA-4, białka fuzyjne VLA-4. W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „rozpuszczalny peptyd VLA-4 albo „rozpuszczalny peptyd VCAM-1 oznacza polipeptyd VLA-4 albo VCAM-1 niezdolny do zakotwiczania się w błonie komórkowej. Takie rozpuszczalne polipeptydy obejmują polipeptydy VLA-4 i VCAM pozbawione wystarczającej części ich domeny transbłonowej do zakotwiczania polipeptydu, albo są zmodyfikowane w taki sposób, że domena transbłonowa jest nieczynna. Te czynniki wiążące mogą działać przez współzawodnictwo z białkami wiążącymi VLA-4 na powierzchni komórki albo w inny sposób zmieniać działanie VLA-4. Przykładowo,

PL 203 114 B1 rozpuszczalną postać VCAM-1 (patrz np. Osborn i in., 1989 Cell, 59: 1203-1211)) albo jej fragment można podawać w celu związania VLA-4 i korzystnie współzawodniczenia o miejsca wiązania VLA-4 na komórkach szpiczaka, doprowadzając w ten sposób do efektów podobnych do podawania antagonistów takich jak przeciwciała przeciwko VLA-4.

W innym przykł adzie, VCAM-1 albo jej fragment, który jest zdolny do wią zania się z VLA-4 na powierzchni komórek szpiczaka niosących VLA-4, np. fragment zawierający dwie domeny końca N z VCAM-1, moż na poddać fuzji z drugim peptydem, np. peptydem, który zwię ksza rozpuszczalność albo okres półtrwania in vivo ugrupowania VCAM-1. Drugi peptyd może być fragmentem peptydu rozpuszczalnego, korzystnie ludzkiego peptydu, bardziej korzystnie białka osocza, albo członkiem nadrodziny immunoglobulin. W szczególnie korzystnym wykonaniu, drugim peptydem jest IgG albo jego część albo fragment, np. region stały łańcucha ciężkiego ludzkiej IgGl i obejmuje przynajmniej domenę zawiasową, CH1 i CH3.

W innych korzystnych wykonaniach czynnik, który stosuje się w zastosowaniu wedł ug wynalazku do wiązania, w tym do zablokowania albo pokrycia integryny alfa4 i/lub liganda integryny alfa4 na powierzchni komórki, jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko VLA-4 i/lub przeciwko alfa4beta7. Korzystne przeciwciała do wytwarzania kompozycji do leczenia, w szczególności do leczenia ludzi, obejmują ludzkie przeciwciała, humanizowane przeciwciała, przeciwciała chimerowe, Fab, Fab', F(ab')2 i fragment F(v) oraz monomery i dimery łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała albo ich mieszaniny. Przeciwciała monoklonalne przeciwko VLA-4 są korzystnym czynnikiem wiążącym w zastosowaniu według wynalazku.

W znaczeniu tu stosowanym, okreś lenie „przeciwciało humanizowane oznacza przeciwciało, wytworzone technologią rekombinowanego DNA, w którym niektóre albo wszystkie aminokwasy łańcucha lekkiego albo ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny, które nie są konieczne do wiązania antygenu, zostały zastąpione odpowiednimi aminokwasami łańcucha lekkiego albo ciężkiego immunoglobuliny ssaka, który nie jest człowiekiem.

W znaczeniu tu stosowanym, okreś lenie „przeciwciało chimerowe oznacza przeciwciało, wytworzone technologią rekombinowanego DNA, w którym wszystkie lub część aminokwasów regionu zawiasowego i regionu stałego łańcucha lekkiego immunoglobuliny, łańcucha ciężkiego albo obu, została zastąpiona odpowiednimi regionami z innego łańcucha lekkiego albo ciężkiego immunoglobuliny. W innym aspekcie, zastosowany może być wariant cząsteczki chimerowej, który obejmuje: 1) ugrupowanie kierujące do VLA-4, np. ugrupowanie VCAM-1, zdolne do wiązania antygenu (tj. VLA-4) na powierzchni komórek szpiczaka niosących VLA-4; 2) ewentualnie, drugi peptyd, np. peptyd, który zwiększa rozpuszczalność albo okres półtrwania in vivo ugrupowania kierującego do VLA-4, np. członek nadrodziny immunoglobulin albo jego fragment albo część, np. część albo fragment IgG, np. region stały łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG1, np. regiony zawiasowe CH2 i CH3; oraz ugrupowanie toksyny. Ugrupowanie kierujące VLA-4 może być naturalnie występującym ligandem VLA-4 albo jego fragmentem, np. peptydem VCAM-1 albo podobnie konserwatywnie podstawioną sekwencją aminokwasowa. Korzystnym ugrupowaniem kierującym jest rozpuszczalny fragment VCAM-1, np. domeny końca N 1 i 2 cząsteczki VCAM-1. Cząsteczkę chimerową można zastosować do leczenia osobnika, np. człowieka zagrożonego chorobą, np. szpiczakiem mnogim, charakteryzującym się obecnością komórek szpiczaka niosących VLA-4 i korzystnie aktywną VLA-4.

Technologia wytwarzania przeciwciał monoklonalnych jest dobrze znana. Pokrótce, komórki linii nieśmiertelnej (zwykle komórki szpiczaka) poddaje się fuzji z limfocytami (zwykle sklenocytami) ssaka immunizowanego kompletną komórką wyrażającą dany antygen, np. VLA-4, po czym supernatanty z hodowli powstałych komórek hybrydoma bada się przesiewowo w kierunku przeciwciał przeciwko antygenowi. Patrz, Kohler i in., 1975, Nature, 265: 295 - 297.

Immunizację można przeprowadzić stosując procedury standardowe. Dawka jednostkowa i schemat immunizacji zależ y od immunizowanego gatunku, jego stanu odpornoś ci, ciężaru ciał a itp. Zwykle, immunizowane ssaki skrwawią się, po czym surowicę każdej próbki krwi bada się na konkretne przeciwciała stosując odpowiedni test przesiewowy. Przykładowo, przeciwciała przeciwko VLA-4 można zidentyfikować przez immunoprecypitację lizatów komórkowych znakowanych ¹²⁵I z komórek wyrażających VLA-4 (patrz, Sanchez-Madrid i in., 1986, Eur. J. Immunol.,16: 1343 - 1349 i; Hemler i in., 1987). Przeciwciał a przeciwko VLA-4 moż na również identyfikować przez cytometrię przepł ywową, np. przez pomiar fluorescencji komórek Ramos inkubowanych z przeciwciałem uważanym za rozpoznające VLA-4 (patrz, Elices i in., 1990 Cell, 60:577 - 584)). Limfocyty zastosowane do wytwarzania komórek hybrydoma zwykle izoluje się od immunizowanych ssaków, których surowice okazały

PL 203 114 B1 się dodatnie w stosunku do obecności przeciwciał przeciwko VLA-4 przy zastosowaniu testów przesiewowych.

Zwykle, nieśmiertelna linia komórkowa (np. linia komórek szpiczaka) pochodzi od tego samego gatunku ssaka co limfocyty. Korzystnymi nieśmiertelnymi liniami komórkowymi są mysie linie komórkowe szpiczaka, które są wrażliwe na pożywkę hodowlaną zawierającą hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę („pożywka HAT). Zwykle, mysie komórki linii szpiczaka wrażliwego na HAT poddaje się fuzji z mysimi splenocytami stosując poliglikol etylenowy o średnim ciężarze cząsteczkowym 1500 (PEG1500). Komórki hybrydoma powstałe z fuzji są następnie selekcjonowane z użyciem pożywki HAT, która zabija komórki szpiczaka, które nie uległy fuzji albo uległy fuzji nieproduktywnej (splenocyty, które nie uległy fuzji giną w kilka dni później ponieważ nie są transformowane). Hybrydoma wytwarzającą żądane przeciwciało wykrywa się badaniem przesiewowym supernatantów hodowlanych hybrydoma. Przykładowo, hybrydoma przygotowane w celu wytwarzania przeciwciał przeciwko VLA-4 można badać przesiewowo przez badanie supernatantów hodowlanych w kierunku wydzielonych przeciwciał mających zdolność do wiązania rekombinowanej linii komórkowej wyrażającej podjednostkę alfa4 (patrz, Elices i in., wyżej).

W celu wytworzenia przeciwciał przeciwko VLA-4, które są kompletnymi immunoglobulinami, komórki hybrydoma, które są dodatnie w teście przesiewowym, hodowano w pożywce w warunkach i przez czas wystarczający do umożliwienia komórkom hybrydoma wydzielenia przeciwciał monoklonalnych do pożywki hodowlanej. Techniki hodowli tkankowej i przydatne pożywki hodowlane dla komórek hybrydoma są dobrze znane. Supernatant z kondycjonowanej hodowli hybrydoma można zbierać, a przeciwciała przeciwko VLA-4 ewentualnie dalej oczyszczać dobrze znanymi sposobami.

Alternatywnie, żądane przeciwciało można wytworzyć przez wstrzyknięcie komórek hybrydoma do jamy otrzewnej nieimmunizowanych myszy. Komórki hybrydoma proliferują w jamie otrzewnej, wydzielając przeciwciało, które gromadzi się w wysięku otrzewnowym. Przeciwciało można zbierać przez pobieranie strzykawką płynu wysiękowego z jamy otrzewnej.

Uprzednio opisano kilka mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko VLA-4, patrz, np. Sanchez-Madrid i in., 1986 powyżej; Hemler i in., 1987 powyżej; Pulido i in., 1991, J. Biol. Chem., 266(16), 10241 - 10245). Te przeciwciała monoklonalne przeciwko VLA-4, takie jak HP1/2 i inne przeciwciała przeciwko VLA-4 (np. HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9) zdolne do rozpoznawania łańcucha P VLA-4 będą przydatne w zastosowaniach według wynalazku. Korzystne są przeciwciała przeciwko VLA-4, które rozpoznają epitopy łańcucha alfa4 VLA-4 włączone w wiązanie VCAM-1 i ligandów fibronektyny (tj. przeciwciała, które mogą wiązać się z VLA-4 w miejscu włączonym w rozpoznawanie liganda i blokują wiązanie z VCAM-1 i fibronektyną). Takie przeciwciała określono jako przeciwciała swoiste wobec epitopu B (B1 albo B2) (Pulido i in., 1991 powyżej) i są również przeciwciałami przeciwko VLA4 stosowanymi według wynalazku.

Innym korzystnym czynnikiem wiążącym, który może blokować albo pokrywać antygeny VLA w zastosowaniach według wynalazku jest w pełni ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko VLA-4. Takie przeciwciała mogą być wytwarzane przy użyciu ludzkich splenocytów napiętnowanych in vitro, jak to opisano w Boerner i in., 1991, J. Immunol., 147, 86 - 95. Alternatywnie, mogą być wytwarzane przez klonowanie repertuaru jak opisano przez Persson i in., 199, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 88: 2432 - 2436 lub przez Huang i Stollar, 1991 J. Immunolo. Methods 141, 227-236 i patent USA 5,798,230 (sierp. 25, 1998, „Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use), opisujące wytwarzanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych z ludzkich limfocytów B. Według tego sposobu, limfocyty B wytwarzające ludzkie przeciwciała monoklonalne unieśmiertelnia się przez zakażenie wirusem Epsteina-Barr albo jego pochodną, która wyraża jądrowy antygen 2 wirusa (EBNA2). Następnie, działanie EBNA2, które jest konieczne do unieśmiertelnienia, wyłącza się co powoduje wzrost wytwarzania przeciwciała.

W jeszcze innym sposobie wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał, opisanych w patencie USA nr 5,789,650 (Sierp. 4, 1998, „Transgenic non-human Animals for producing heterologus antibodies) stosuje się transgeniczne zwierzęta, które nie są ludźmi zdolne do wytwarzania przeciwciał heterologicznych i transgeniczne zwierzęta nie będące ludźmi o inaktywowanych endogennych genach immunoglobulin. Endogenne geny immunoglobulin są tłumione przez polinukleotydy antysensowne i/lub surowicę odpornościową skierowaną przeciwko endogennym immunoglobulinom. Przeciwciała heterologiczne są kodowane przez geny immunoglobulin normalnie spotykane w genomie tego gatunku zwierzęcia niebędącego człowiekiem. Jeden albo wiele sekwencji zawierających transgeny nie rearanżowanych heterologicznych łańcuchów ciężkich ludzkich immunoglobulin wprowadza się do

PL 203 114 B1 organizmu zwierzęcia, które nie jest człowiekiem tworząc zwierzę transgeniczne zdolne do czynnościowej rearanżacji transgenicznych sekwencji immunoglobulin i wytwarzania repertuaru przeciwciał różnych izotypów kodowanych przez geny ludzkich immunoglobulin. Takie heterologiczne ludzkie przeciwciała są wytwarzane przez limfocyty B, które są następnie unieśmiertelniane, np. przez poddanie fuzji z linią komórkową unieśmiertelnioną, taką jak szpiczak albo przez manipulowanie takimi limfocytami B innymi technikami w celu uzyskania linii komórkowej zdolnej do wytwarzania heterologicznych przeciwciał monoklonalnych, w pełni ludzkiego a przeciwciała.

Wielkie biblioteki ekspozycji na fagu nieimmunizowanych sekwencji ludzkich można również zastosować do izolowania przeciwciał o wysokim powinowactwie, które mogą być opracowywane jako ludzkie leki stosując standardową technikę fagową (Vaughan i in., 1996). Jeszcze inny korzystny czynnik wiążący, który może blokować albo pokrywać antygeny VLA-4 w kompozycjach stosowanych w zastosowaniach według wynalazku, jest humanizowanym rekombinowanym przeciwciałem o swoistości przeciwko VLA-4. W oparciu o wczesne sposoby wytwarzania przeciwciał chimerowych opisano nowe podejście w EP 0239400 (Winter i in.), w którym przeciwciała są zmienione przez zastąpienie ich regionów zapewniających komplementarność (CDR) jednego gatunku na regiony innego gatunku. Sposób ten można zastosować przykładowo, w celu zastąpienia CDR z regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego Ig alternatywnymi CDR z domen regionów zmiennych przeciwciała mysiego. Te zmienione regiony zmienne Ig można następnie łączyć z regionami stałymi ludzkich Ig tworząc przeciwciała, które są całkowicie ludzkie pod względem składu, z wyjątkiem wstawionych mysich CDR. Przewiduje się, że takie przeciwciała z wstawionymi CDR byłyby prawdopodobnie mniej immunogenne dla ludzi w porównaniu z przeciwciałami chimerowymi, ponieważ zawierają znacząco mniej składowych niepochodzących od człowieka. Sposób humanizacji przeciwciał monoklonalnych metodą „przeszczepiania CDR określa się jako „przekształtowanie (Riechmann i in., 1988 Nature332, 323 - 327; Verhoeyen i in., 1988, Science 239, 1534 - 1536)).

Zwykle, regiony zapewniające komplementarność (CDR) przeciwciała mysiego są przeszczepiane do odpowiednich regionów przeciwciała ludzkiego, ponieważ CDR (trzy w łańcuchu ciężkim i trzy w łańcuchu lekkim), które są regionami odpowiadającymi za wiązanie z antygenem. Przeszczepienie CDR uzyskuje się przez przekonstruowanie genetyczne, w którym sekwencje DNA CDR określa się przez klonowanie segmentów genu regionu zmiennego (V) mysiego łańcucha ciężkiego i lekkiego, a następnie przenosi do odpowiednich ludzkich regionów V przez ukierunkowaną mutagenezę. Na końcu procesu, dodaje się segmenty genu ludzkiego regionu stałego żądanego izotypu (zwykle gamma I dla CH i kappa dla CL) i geny humanizowanego łańcucha lekkiego i ciężkiego są równocześnie wyrażane w komórkach ssaczych wytwarzając rozpuszczalne przeciwciało humanizowane.

Przeniesienie tych CDR do przeciwciała ludzkiego nadaje przeciwciału właściwości wiązania antygenu oryginalnego przeciwciała mysiego. Sześć CDR mysiego przeciwciała umieszcza się strukturalnie w zrębowym regionie V. Przyczyną pomyślnego przeszczepiania CDR jest mała różnica w regionie zrębowym pomiędzy przeciwciałami ludzkimi i mysimi i bardzo podobna struktura trójwymiarowa, z podobnymi punktami przyłączania CDR, w taki sposób, że można wymieniać CDR. Takie humanizowane homologi przeciwciała można wytwarzać jak to zilustrowano w Jones i in., 1986, Nature 321, 522 - 525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323 - 327; Queen i in., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; i Orlandi i in., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 3833.

Mimo to, uważa się, że pewne aminokwasy regionu zrębowego oddziałują z CDR i wpływają na całkowite powinowactwo wiązania antygenu. Bezpośrednie przeniesienie CDR z przeciwciała mysiego z wytworzeniem rekombinowanego przeciwciała humanizowanego bez żadnych modyfikacji ludzkiego regionu zrębowego V często powodują częściową albo całkowitą utratę powinowactwa wiązania. W wielu przypadkach, wydaje się to być kluczowe dla uzyskania aktywności wiązania.

W Queen i in., 1989 (powyżej) oraz WO 90/07861 (Protein Design Labs) opisano wytwarzanie hmanizowanych przeciwciał, które zawierają modyfikowane reszty w regionie zrębowym przeciwciała akceptorowego przez połączenie CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego (anty-Tac) z ludzkimi regionami zrębowymi i regionami stałymi przeciwciała. Przedstawiono jedno z rozwiązań problemu utraty powinowactwa wiązania, które często jest spowodowane bezpośrednim przeniesieniem CDR bez modyfikacji reszt ludzkiego regionu zrębowego V; ich rozwiązanie obejmuje dwa kluczowe etapy. Po pierwsze, ludzkie regiony zrębowe V wybiera się stosując analizę komputerową w celu znalezienia optymalnej homologii sekwencji z regionem V oryginalnego przeciwciała mysiego, w tym przypadku przeciwciała przeciwko Tac. W drugim etapie, struktury trzeciorzędowe mysiego regionu V modeluje się komputerowo w celu wizualizacji reszt regionów zrębowych, które prawdopodobnie oddziałują

PL 203 114 B1 z mysimi CDR, zaś mysie reszty aminokwasowe nakładają się na homologiczny region ludzki. Patrz również Protein Design Labs patent USA nr 5,693,762).

Można stosować odmienne podejście (Tempest i in., 1991, Biotechnology 9, 266 - 271 i wykorzystywać jako wzorzec, region zrębowy V pochodzący od NEWM i REI odpowiednio łańcuchów ciężkiego i lekkiego do przeszczepiania CDR bez wprowadzania grupy haptoforowej reszt mysich. Zaletą stosowania podejścia Tempest i in. do konstruowania przeciwciał humanizowanych opartych na NEWM i REI jest fakt, że trój-wymiarowa struktura regionów zmiennych NEWM i REI jest znana z krystalografii promieniami X, a zatem swoiste oddziaływania między CDR-ami a resztami zrębu regionu V mogą być modelowane.

Bez względu na podjęte podejście, przykłady początkowych humanizowanych przeciwciał wytwarzanych do tej pory pokazały, że nie jest to prosty sposób. Jednak, nawet potwierdzając, że takie zmiany zrębowe mogą być konieczne, nie można przewidzieć, na podstawie dostępnego stanu techniki, która, jeżeli jakaś, z reszt zrębowych będzie musiała być zmieniona w celu otrzymania funkcjonalnych humanizowanych rekombinowanych przeciwciał o żądanej swoistości. Wyniki do tej pory wskazują, że zmiany konieczne do zachowania swoistości i/lub powinowactwa są w większości wyjątkowe dla danego przeciwciała i nie mogą być przewidziane w oparciu o humanizowanie odmiennego przeciwciała.

Korzystne przeciwciała przydatne w zastosowaniach według niniejszego wynalazku obejmują chimerowe przeciwciała i humanizowane rekombinowane przeciwciała (tj. kompletne immunoglobuliny i ich części) o swoistości epitopu B, który wytworzono i opisano w równolegle rozpatrywanych zgłoszeniach USA nr 08/004,798 z 12 stycznia 1993, publikacja PCT US94/00266 zgłoszona 7 stycznia 1994. Materiałem wyjściowym do wytworzenia chimerowych (mysie V- ludzkie C) i humanizowanych homologów przeciwciał przeciwko VLA-4 mogą być mysie przeciwciała przeciwko VLA-4 dostępne w handlu, jak uprzednio opisano (np. HP2/1, Ammae International, Inc., Westbrook, Maine) albo monoklonalne przeciwciało przeciwko VLA-4 wytworzone zgodnie ze wskazówkami.

Na przykład, regiony zmienne łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała HP1/2 przeciwko VLA-4 sklonowano, zsekwencjonowano i wyrażono w kombinacji ze stałymi regionami łańcuchów ciężkiego i lekkiego ludzkiej immunoglobuliny. Takie przeciwciało HP1/2 ma podobną swoistości i moc do przeciwciała mysiego HP1/2 i może być przydatne do wytworzenia kompozycji zgodnie z wynalazkiem.

Inne korzystne humanizowane przeciwciała przeciwko VLA-4 są opisane przez Athena Neurosciences, Inc w PCT/US95/01219 (27 lipca 1955). Te humanizowane przeciwciała przeciwko VLA-4 obejmują humanizowany łańcuch lekki i humanizowany łańcuch ciężki. Humanizowany łańcuch lekki obejmuje trzy regiony zapewniające dopasowanie (CDR1, CDR2 i CDR3) o sekwencjach aminokwasowych z odpowiednich regionów zapewniających komplementarność łańcucha lekkiego mysiej immunoglobuliny 21 - 6 i zmiennego regionu zrębowego z sekwencji zmiennego regionu zrębowego ludzkiego lekkiego łańcucha kappa za wyjątkiem, że co najmniej jedna pozycja aminokwasowa jest zajęta przez ten sam aminokwas obecny w równoważnej pozycji zmiennego regionu zrębowego łańcucha lekkiego mysiej immunoglobuliny 21 - 6. Humanizowany łańcuch ciężki zawiera trzy regiony zapewniające komplementarność (CDR1, CDR2 i CDR3) o sekwencjach aminokwasowych z odpowiednich regionów zapewniających komplementarność łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny 21 - 6 i zmiennego regionu zrębowego z sekwencji zmiennego regionu zrębowego ludzkiego łańcucha ciężkiego za wyjątkiem, że co najmniej jednaj pozycja aminokwasowa jest zajęta przez ten sam aminokwas obecny w równoważnej pozycji zmiennego regionu zrębowego łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny 21 - 6.

Zastosowania terapeutyczne. Lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawierający czynniki wiążące VLA-4, szczególnie przeciwciała przeciwko VLA-4, jest korzystnie podawany pozajelitowo. Stosowane tu określenie pozajelitowo obejmuje iniekcje podskórne, dożylne, domięśniowe, dostawowe, domaziowe, domostkowe, dootoczkowe, dowątrobowe, do wnętrza zmian chorobowych i doczaszkowe oraz techniki wlewu.

Czynniki wiążące VLA-4 są korzystnie podawane jako sterylne kompozycje farmaceutyczne zawierające dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, który może być dowolnym, z licznych dobrze znanych nośników, takich jak woda, solanka, sól fizjologiczna z buforem fosforanowym, dekstroza, glicerol, etanol i temu podobne, lub ich kombinacje. Związki te można stosować w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli pochodzących od nieorganicznych lub organicznych kwasów i zasad. Wśród tych soli z kwasami są następujące: octan, adypinian, alginian, asparaginian, benzoesan, benzenosulfonian, wodorosiarczan, maślan, cytrynian, kamforan, kamforosulfonian, cyklopentanopropionian,

PL 203 114 B1 diglukonian, dodecylosiarczan, etanolosulfonian, fumaran, glukoheptanian, glicerofosforan, hemisiarczan, heptanian, heksanian, chlorowodorek, bromowodorek, jodowodorek, 2-hydroksyetanosulfonian, mleczan, maleinian, metanosulfonian, 2-naftalenosulfonian, nikotynian, szczawian, pamonian, pektynian, nadsiarczan, 3-fenylopropionian, pikrynian, piwalan, propionian, bursztynian, winian, tiocyjanian, tosylan i undekanian. Sole z zasadami obejmują sole amonowe, sole metali alkalicznych, takie jak sole sodu i potasu, sole metali ziem alkalicznych, takie jak sole wapnia i magnezu, sole zasad organicznych, takie jak sole dicykloheksyloaminy, N-metylo-D-glukaminy, tris(hydroksymetylo)metyloaminy i sole z aminokwasami, takimi jak arginina, lizyna i tak dalej. Zasadowe grupy zawierają ce azot mogą być czwartorzędowane takimi czynnikami jak halogenki niższego alkilu, takie jak chlorek, bromek i jodek dimetylu, dietylu, dipropylu i di-butylu, siarczany dialkilu takie jak siarczan dimetylu, dietylu, dibutylu i diamylu, halogenki długołańcuchowe takie jak chlorki, bromki i jodki decylu, laurylu, myristylu, i stearylu, halogenki aralkilu, takie jak bromki benzylu i fenetylu i inne. W ten sposób otrzymuje się produkty rozpuszczalne w wodzie lub w oleju lub dyspergujące.

Stosowane tu określenie „nośnik obejmuje dopuszczalne adiuwanty i podłoża. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, które mogą być stosowane w kompozycjach farmaceutycznych wytworzonych zgodnie z zastosowaniami według wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, wymieniacze jonowe, wodorotlenek glinu, stearynian glinu, lecytynę, białka surowicze, takie jak albumina surowicy ludzkiej, substancje buforujące, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbowy, sorbinian potasu, mieszaninę częściowych glicerydów nasyconych roślinnych kwasów tłuszczowych, wody, soli lub elektrolitów, takich jak siarczan protaminy, wodorofosforan disodu, wodorofosforan potasu, chlorek sodu, sole cynku, krzemionka koloidalna, trikrzemian magnezu, substancje oparte na celulozie, glikol polietylenowy, sól sodowa karboksymetylocelulozy, poliakrylany, woski polimery blokowe polietylen-polioksypropylen i lanolina.

Kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniami według wynalazku mogą być w postaci sterylnych preparatów do iniekcji, na przykład, sterylnej możliwej do wstrzyknięcia zawiesiny wodnej lub oleistej. Zawiesina może być formułowana zgodnie z technikami znanymi w dziedzinie wykorzystującymi odpowiednie czynniki dyspergujące lub nawilżające i czynniki zawieszające. Sterylny możliwy do wstrzyknięcia preparat może być również sterylnym możliwym do iniekcji roztworem lub zawiesiną w nietoksycznym dopuszczalnym pozajelitowo rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, na przykład, roztwór w 1,3-butanodiolu.

Wśród dopuszczalnych podłoży i rozpuszczalników, które można zastosować są: woda, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Ponadto, sterylne ciekłe tłuszcze są konwencjonalnie stosowane jako rozpuszczalniki lub podłoże zawieszające. W tym celu mogą być stosowane dowolne łagodne ciekłe oleje, w tym syntetyczne mono- lub diglicerydy. Kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy i jego pochodne glicerydowe są przydatne do wytwarzania leków możliwych do wstrzyknięcia jak również naturalne dopuszczalne farmaceutycznie oleje, takie jak olej z oliwek lub olej rycynowy, zwłaszcza w ich wersjach polioksyetylowanych. Te roztwory olejowe lub zawiesiny mogą również zawierać długołańcuchowy, alkoholowy rozcieńczalnik lub środek rozpraszający, taki jak Ph. Helv lub podobny alkohol. Kompozycje farmaceutyczne wytwarzane zgodnie z zastosowaniami według wynalazku, zawierające antagonistów interakcji VLA-4/VACAM-1, mogą być podawane pozajelitowo lub doustnie. Jeżeli podawane są doustnie, mogą być podawane w akceptowanych postaciach dawkowania do podawania doustnego, w tym, ale nie wyłącznie, kapsułkach, tabletkach, wodnych zawiesinach lub roztworach. W przypadku tabletek do doustnego stosowania, nośniki które są powszechnie stosowane, obejmują laktozę i skrobię kukurydzianą. Typowo dodaje się również środki smarujące, takie jak stearynian magnezu. Do podawania doustnego w postaci kapsułki przydatne rozcieńczalniki obejmują laktozę i suszoną skrobię kukurydzianą. Gdy do stosowania doustnego wymagane są zawiesiny wodne, składnik aktywny jest połączony ze środkami emulgującymi i zawieszającymi. Jeśli trzeba, mogą być dodane pewne środki słodzące, aromatyzujące lub barwiące. Mogą być również stosowane miejscowe plastry transdermalne. Kompozycje farmaceutyczne wytwarzane zgodnie z zastosowaniami według wynalazku mogą być również podawane w aerozolu donosowym lub inhalacji przy użyciu nebulizera, inhalatora proszkowego lub inhalatora z odmierzonymi dawkami. Takie kompozycje są wytwarzane zgodnie z technikami dobrze znanymi w dziedzinie formulacji farmaceutycznych i mogą być wytwarzane jako roztwory w solance, stosujące alkohol benzylowy lub inne odpowiednie środki konserwujące, promotory absorpcji do zwiększania biodostępności, fluoropochodne węglowodorów i/lub inne konwencjonalne czynniki solubilizujące lub dyspergujące.

PL 203 114 B1

Zgodnie z innym wykonaniem kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniami według niniejszego wynalazku zawierające przeciwciało, które mogą również zawierać dodatkowy czynnik wybrany z grupy składającej się z kortykosteroidów, środków przeciw zapalnych, immunosupresantów, antymetabolitów i immunomodulatorów. Konkretne związki w obrębie każdej z tych klas mogą być wybrane spośród związków wymienionych w odpowiednich grupach w „Comprehensive medical Chemistry, Pergamon Press, Oxford, Anglia, str. 970 - 986 (1990). Również włączone są do tych grup związki takie jak teofilina, sulfasalazyna, i aminosalicylany (przeciwzapalne), cyklosporyna, FK-506 i rapamycyna (immunosupresanty); cyklofosfamid i metotreksat (antymetabolity); steroidy (wziewne, doustne lub miejscowe) i interferony (immunomodulatory).

Ilość aktywnego składnika, który może być połączony z materiałami nośnikowymi do wytwarzania pojedynczej dawki, będzie zmieniała się w zależności od leczonego gospodarza, a w szczególności od sposobu podawania. Jednakże należy rozumieć, że konkretna dawka i reżim leczenia dla konkretnego pacjenta będzie zależał od różnorodnych czynników, w tym aktywności zastosowanego konkretnego związku, wieku pacjenta, ciężaru ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu podawania, szybkości wydalania, kombinacji leków i oceny przez lekarza prowadzącego i zaawansowania konkretnej choroby podlegającej leczeniu. Ilość składnika aktywnego może również zależeć od czynnika terapeutycznego lub profilaktycznego, jeżeli jest jakiś, z którym składnik jest współpodawany.

Dawka i wielkość dawki związku skutecznego w zapobieganiu, tłumieniu lub hamowaniu adhezji komórkowej będzie zależała od rozmaitych czynników, takich jak natura inhibitora, pole powierzchni pacjenta, cel leczenia, natura leczonej patologii, swoistość stosowanej kompozycji farmaceutycznej i ocena lekarza prowadzą cego. Przydatne są poziomy dawki składnika aktywnego mię dzy okoł o 0,001 a około 100 mg/kg ciężaru ciała na dzień, korzystnie między około 0,1 a około 50 mg/kg wagi ciała na dzień. Najbardziej korzystnie, czynnik wiążący VLA-4, jeśli będzie podawane przeciwciało lub pochodna przeciwciała, będzie podawany w dawce w zakresie między około 0,1 mg/kg ciężaru ciała/dzień a około 20 mg/kg ciężaru ciała/dzień, korzystnie w zakresie między około 0,1 mg/kg ciężaru ciała/dzień a 10 mg/kg ciężaru ciała/dzień i z przerwami co 1 - 14 dni. Dla czynnika nie będącego przeciwciałem, zakres dawkowania powinien korzystnie być między ilościami równoważnika molowego a ilościami przeciwciała. Korzystnie, kompozycja przeciwciała jest podawana w ilości skutecznej do dostarczenia poziomu przeciwciała w osoczu co najmniej 1 mg/ml. Optymalizację dawkowania można określić przez podanie czynników wiążących, a następnie ocenę powlekania czynnikiem komórek VLA-4 dodatnich wobec czasu po podaniu danej dawki in vivo.

Komórki szpiczaka zawarte w próbce osobniczej krwi obwodowej (lub komórkach szpiku) powinny być badane na obecność czynnika in vitro (lub ex vivo) przy użyciu reagenta do wykrywania podawanego czynnika. Na przykład, może to być znakowane fluorochromem przeciwciało swoiste dla podawanego czynnika, który jest następnie mierzony standardową analizą FACS (sorter komórek aktywowanych fluorescencyjnie). Alternatywnie obecność podawanego czynnika można wykryć in vitro (lub ex vivo) dzięki niezdolności lub obniżonej zdolności komórek osobnika do wiązania tego samego czynnika, który sam został oznaczony (np. fluorochromem). Korzystne dawkowanie powinno wytwarzać możliwą do wykrycia powłokę olbrzymiej większości komórek VLA-4 dodatnich. Korzystnie powłoka w przypadku homologu przeciwciała jest utrzymywane przez okres 1 - 14 dni.

Modele zwierzęce

Dokładnie opisano model zwierzęcy (Garrett 1997). Pokrótce, Radl i in. (1988) opisali mysi model szpiczaka, który pojawia się spontanicznie u myszy C57BL/KaL w Rij w podeszłym wieku. Ten stan występuje w przybliżeniu u 1 na 200 zwierząt w związku z ich starzeniem i prowadzi do gammopatii monoklonalnej z niektórymi cechami choroby ludzkiej (Radl 1988). W celu rozwinięcia lepszego i bardziej zdolnego do reprodukcji modelu zwierzęcego ustalono i subklonowano linię komórkową z mysiego szpiczaka zwaną 5TGM1 i stwierdzono, ż e wywoł uje u myszy zmiany charakterystyczne dla ludzkiego szpiczaka, takie jak ciężka osteoliza i zaangażowanie narządów, które nie są kośćmi, w tym wątroby i nerki (Garrett 1997). U myszy inokulowanych hodowanymi komórkami rozwinęła się choroba w wysoce możliwy do przewidzenia i odtworzenia sposób, który obejmuje tworzenie się gammopati monoklonalnej i radiologicznych zmian kostnych. Ponadto, niektóre z myszy stają się hyperkalcemiczne, a zmiany kostne charakteryzują się zwiększoną aktywnością osteoplastyczną. Zatem, w oparciu o badania histologiczne zaatakowanych narzą dów u myszy niosą cych STGM1 i zwię kszone poziomy IgG2b w surowicy, 5TGM1 określa się jako szpiczaka mysiego, który dokładnie oddaje cechy choroby ludzkiej.

PL 203 114 B1

Następujące przykłady są przeznaczone do dalszego zilustrowania pewnych korzystnych wykonań wynalazku i nie są przeznaczone do ograniczania go. W następujących przykładach konieczne enzymy restrykcyjne, plazmidy i inne reagenty i materiały mogą być uzyskane ze źródeł handlowych, a klonowanie, ligacji inną metodologię rekombinacji DNA moż na przeprowadzić procedurami dobrze znanymi w dziedzinie.

Przykłady

Przykład 1: Materiały i metody

Komórki szpiczaka 5TGM1

Komórki szpiczaka 5TGM1 pochodziły początkowo ze szpiczaka, który spontanicznie pojawił się u dojrzał ej myszy C57B1/KaLwRij (Garrett, 1997; Vanderkerken, 1997). Komórki hodowano w poż ywce Dulbecco w modyfikacji Iscove'a (IMDM, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS, Summit, Fort Collins, CO) i 1% roztworu penicyliny-streptomycyny (GIBCO, Grand Island, NY)w 37°C i 5% CO2. Do doświadczeń in vitro opisanych poniżej, zastosowano komórki 5TGM1 pomiędzy 25 i 30 pasażem. Przeciwciała, rozpuszczalne VCAM-1.

Przeciwciała neutralizujące przeciwko mysiemu VCAM-1 (M/K-2.7), integrynie VLA-4 (PS/2) i czą steczce adhezji mię dzykomórkowej 1 (ICAM-1, YNl/1.7) był y darem od Dr Kensuke Miyake (Saga Medical University, Saga, Japonia). Rekombinowane rozpuszczalne VCAM-1 (Lobb i in., 1991), zawierające 7 domen zewnątrzkomórkowych ludzkiej VCAM-1 było darem od Dr Roy Lobb, Biogen, Inc., Cambridge, MA.

Reakcja odwrotnej transkrypcji z następującą po niej reakcją łańcuchową polimerazy (RT-PCR).

Stosując RT-PCR potwierdziliśmy ekspresję odpowiednio VCAM-1 i integryny alfa4 w komórkach zrębu szpiku kostnego i 5TGM1. Całkowity RNA wyizolowano z 5TGMI, pierwotnej hodowli komórek zrębu szpiku kostnego i linii komórkowej zrębu szpiku ST2 (RIKEN Cell Bank, Tsukuba, Japonia) jednoetapową metodą izolacji RNA z użyciem reagenta TRIazol (GIBCO). 3 μg RNA inkubowano z 50 ng losowych heksamerów w 70°C przez 10 minut i schłodzono na lodzie, a następnie przekształcono w pierwszą nić cDNA stosując odwrotną transkryptazę (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) zgodnie z instrukcją producenta. Zastosowano następujące startery do PCR: mysi VCAM-1 starter 5', 5'-OH-GCTGCGCGTCACCATTGTTCTC-3'-OH [Id. Sekw. nr 1]; VCAM-1, starter 3', 5'-OH-ACCACCCTCTTGAAGCCTTGTG-3'-OH [Id. Sekw. nr 2]; mysia integryna alfa4, starter 5', 5'-OH-CCCCTCAACACGAACAGATAGG-3'-OH [Id. Sekw. nr 3]; mysia integryna alfa4, starter 3', 5'-OH-GCCTTGTCCTTAGCAACACTGC-3'-OH [Id. Sekw. nr 4].

PCR prowadzono przez 30 cykli składających się z 1 minuty w 94°C; 1 minuty w 55°C i 2 minut w 72°C. Mieszanina reakcyjna do PCR (w sumie 50 μθ zawierała 10 μl pierwszej nici cDNA, 50 mM KCl 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 mM MgCl2, mieszaninę dezoksy-NTP (0,2 mM każdy), parę starterów (0,15 μM każdy) i 2 U polimerazy DNA Taq (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Produkty PCR rozdzielono na 2,5% żelu agarozowym, zawierającym bromek etydyny i wizualizowano w świetle UV. Wielkość fragmentów potwierdzono przez odniesienie do znaczników ciężaru cząsteczkowego.

Przyłączanie komórek 5TGMI do komórek zrębu szpiku

W teście heterotypowej adhezji międzykomórkowej, komórki ST2 (5 x 10⁴/studzienkę) wysiano w 48-studzienkowej płytce (Costar, Cambridge, MA) i hodowano przez 48 godzin w pożywce alfaMEM z dodatkiem 10% FBS aż do wzrostu zlewnego. Komórki 5TGM1 (5 x 10⁶) znakowano przez inkubowanie z 10 μ Ci [metylo3H]tymidyną (New England Nuclear) przez 24 godziny w 37°C w pożywce hodowlanej. Po wytworzeniu się jednowarstwy ST2, inkubowano ją z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA, Sigma, St. Louis, MO) w bezsurowiczej pożywce alfaMEM przez 1 godzinę i wysiano na jednowarstwę komórek 5TGM1 znakowanych trytem. Układ inkubowano pod nieobecność i w obecności przeciwciał przeciwko VCAM-1 albo integrynie alfa4betal w 37°C przez 1 godzinę. Nieprzylegające komórki usunięto przez 2-krotne płukanie z zastosowaniem 5% kwasu trichlorooctowego i 2-krotne płukanie z zastosowaniem PBS, a komórki przylegające rozpuszczono w 300 μl 0,25 mM NaOH, zneutralizowano tą samą objętością 0,25 mM HCl i określono radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym.

Test tworzenia osteoklastów we wspólnej hodowli komórek 5TGM1 i komórek zrębu szpiku.

Komórki mysiego szpiku otrzymano od 5-tygodniowych samców myszy C57BL jak opisano uprzednio (Yoneda, 1993). Kości udowe i piszczelowe wycięto aseptycznie i odcięto oba końce. Komórki szpiku wypłukano, zebrano i inkubowano z pożywką alfaMEM z dodatkiem 10% FBS (Hyclone, Logan, UT) i 1% roztworu streptomycyny-penicyliny w 100 mm szlakach hodowlanych (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) w 37°C przez 2 godziny. Zebrano nieprzylegające komórki zawierające prekursory osteoklastów i komórki zrębu. Komórki szpiku (1 x 10⁶) i komórki 5TGM1 (1 x 10³) w 300 μl

PL 203 114 B1 pożywki wysiano do płytek 48-studzienkowych (dzień 0). W 2 dniu, 300 μΐ świeżej pożywki dodano łagodnie do każdej studzienki i w 4 dniu 300 μl zużytej pożywki pobrano i zastąpiono tą samą objętością świeżej pożywki. W 6 dniu, hodowle utrwalono i wybarwiono na fosfatazę kwaśną winianooporną (TRAP) stosując dostępny w handlu zestaw (Sigma). Wielojądrzaste komórki TRAP-pozytywne z więcej niż 3 jądrami określono jako komórki przypominające osteoklasty (przypominające OC) i liczono pod mikroskopem. W celu potwierdzenia że komórki przypominające OC mają zdolności do resorpcji kości, komórki 5TGM1 i komórki zrębu szpiku hodowano wspólnie na skrawkach 5 x 5 mm zębiny wieloryba w tych samych warunkach i badano przez mikroskopię skaningową tworzenie się zagłębień resorpcyjnych, jak opisane (Yoneda, 1992).

W niektórych doświadczeniach, wspólną hodowlę komórek szpiczaka 5TGMI i komórek szpiku przeprowadzano stosując wkładki transwell (Becton Dickinson Labware) w celu zapobieżenia bezpośredniemu kontaktowi między dwoma typami komórek (2 x 10⁶, płytki 24-studzienkowe, Costar). Komórki szpiku wysiano do dolnych komór, a następnie komórki szpiczaka 5TGMI (2 x 10³) wysiano do dolnej (bezpośredni kontakt) albo górnej (brak kontaktu) komory.

Hodowle narządowe szczurzych, płodowych kości długich) znakowanych ⁴⁵Ca

Pożywki kondycjonowane z hodowli 5TGMI badano na aktywność resorpcyjną kości w hodowlach narządowych szczurzych, płodowych kości długich, znakowanych ⁴⁵Ca, jak to opisano wcześniej (Mbalaviele, 1995). Ciężarnym samicom szczura podano po 250 μ Ci ⁴⁵Ca (New England Nuclear) w dniu 18 ciąży. Kości promieniowe i łokciowe uzyskano od 19 dniowych płodów szczurzych przez wypreparowanie pod mikroskopem i hodowano przez 24 godziny w pożywce BGJ (Sigma) z dodatkiem 0,1% BSA na granicy faz powietrza i pożywki na siatkach ze stali nierdzewnej. Następnie kości hodowano w obecności pożywki kondycjonowanej (50% wag.) albo pożywki kontrolnej przez 120 godzin. Pożywkę zmieniano raz w 48 godzinie. Na zakończenie hodowli, kości inkubowano w lodowatym 5% kwasie trichloro-octowym przez 2 godziny i określano radioaktywność ⁴⁵Ca w kościach i pożywkach w liczniku scyntylacyjnym. Resorpcję kości oceniano jako procent ⁴⁵Ca uwolnionego do pożywki z kości, obliczone wg. wzoru (zliczenia ⁴⁵Ca w pożywce)/(zliczenia ⁴⁵Ca w pożywce i kości) x 100.

Wspólna hodowla komórek szpiczaka 5TGMI z komórkami mysiej linii komórek zrębu szpiku ST2.

Komórki ST2 (0,5 x 10⁶) i 5TGM1 (4 x 10⁶) wysiano razem do 60 mm szalek hodowlanych (Becton Dickinson) w IMDM z dodatkiem 10% FBS i hodowano przez noc, płukano pożywką bezsurowiczą IMDM dwukrotnie i inkubowano w 5 ml bezsurowiczej IMDM. Po 48 godzinach pożywkę kondycjonowaną pobierano i przechowywano w -70°C do dalszego użycia.

Efekt przeciwciała monoklonalnego PS2 przeciwko VLA-4 na zwiększenie poziomu surowiczych IgG2b u myszy niosących 5TGM1.

Myszom wstrzykiwano 1 x 10⁵ komórek 5TGM1, po czym pozostawiano do kolonizacji szpiku. Myszy podzielono na dwie grupy po 3, jedną służącą jako grupa kontrolna, zaś drugą leczono co dwa tygodnie zaczynając od 8 dnia przez podanie 80 pg przeciwciała monoklonalnego PS/2 (około 4 mg/kg). Poziom lgG2b, izotypu przeciwciała wytwarzanego przez komórki szpiczaka 5TGM1 mierzono co tydzień od 1 do 6 tygodnia.

Wynik

Ekspresja VCAM-1, VLA-4 i wpływ przeciwciał przeciwko VCAM-1 i VLA-4 na przyłączanie się komórek 5TGM1 do pojedynczych warstw ST2.

Wykorzystując RT-PCR potwierdzono ekspresję VCAM-1 i integryny VLA-4 odpowiednio w komórkach zrębowych szpiku kostnego i komórkach szpiczaka. Tak jak tego oczekiwano zarówno linia komórek zrębowych ST2 i pierwotne komórki zrębowe szpiku kostnego wyrażają VCAM-1, podczas gdy 5TGM1 nie wyrażają. Przeciwnie, komórki szpiczaka 5TGM1 wyrażają integrinę VLA-4, podczas gdy komórki rdzeniowe nie wyrażają (dane nie pokazane). Dodatkowo zarówno przeciwciało przeciwko VCAM-1 (10 pg/ml) jak i przeciwciało przeciwko VLA-4 (10 pg/ml) częściowo (50 - 80%) hamują przyleganie komórek 5TGM1 do pojedynczych warstw ST2, wykazując, że integryny VCAM-1 i VLA-4 wyrażane na tych komórkach są czynne biologicznie i, że te przeciwciała mają aktywność neutralizującą (dane nie pokazane).

Tworzenie komórek OC-podobnych w jednoczesnej hodowli komórek szpiczaka 5TGM1 z komórkami mysiego szpiku kostnego 6 dnia jednoczesnej hodowli komórek 5TGM1 z komórkami mysiego szpiku kostnego utworzyło się wiele komórek wielojądrzastych, TRAP-dodatnich, podobnych do osteoklastów (OC-podobnych). Te komórki OC-podobne wykazywały tworzenie zagłębień resorpcyjnych w skrawkach zębiny, demonstrując, że są zdolne do resorpcji kości i mają fenotyp osteoklastu. W doświadczeniach wykorzystywano wkładki „Transwell, tworzenie komórek OC-podobnych obser16

PL 203 114 B1 wowano podczas hodowli komórek 5TGM1 w bezpośrednim kontakcie z komórkami szpiku kostnego. Przeciwnie, jedynie niewielka liczba komórek OC-podobnych powstawała gdy komórki 5TGM1 oddzielano od komórek szpiku kostnego błoną „Transwell. Tak więc, komórki 5TGM1 wywołują tworzenie osteoklastów w mieszanych hodowlach szpiku kostnego i wywołanie tego tworzenia wymaga bezpośredniego kontaktu komórka-komórka.

Wpływ przeciwciał przeciwko VCAM-1 i intergrynie VLA-4 na tworzenie komórek OC-podobnych w jednoczesnej hodowli 5TGM1 i komórek szpiku.

Zarówno przeciwciało przeciwko VCAM-1 (VCAM-1 Ab, 10 μg/ml) jak przeciwciało przeciwko integrynie VLA-4 (alfa4betal Ab, 10 μg/ml) dramatycznie hamuje tworzenie komórek OC-podobnych. Przeciwnie mAB przeciwko ICAM-1, inna cząsteczka adhezyjna włączona w interakcje zrębowo/szpiczakowe nie wpływa na tworzenie komórek OC-podobnych (Figura 1).

Aby ocenić czy to hamowanie przez mAB VCAM-1 i VLA-4 było swoiste dla wywoływanego przez 5TGM1 tworzenia komórek OC-podobnych i nie zależało od cytotoksyczności, skutki działania tych przeciwciał badano podczas tworzenia komórek OC-podobnych wywoływanego przez 1,25(OH)2D3, szeroko stosowanego czynnika stymulującego osteoklastogenezę w hodowlach mysich komórek szpiku kostnego (Takahashi 1988). Ani mAB VCAM-1, ani mAb VLA-4 nie hamują tworzenia komórek OC-podobnych wywoływanego przez witaminę D3, co jako takie nie ma wpływu na ekspresję VCAM-1 w komórkach zrębowych (dane nie pokazane).

Wpływ kondycjonowanej pożywki zbieranej z jednoczesnej hodowli 5TGM1 i ST2 na resorpcję kości.

Kondycjonowaną pożywka z jednoczesnej hodowli komórek 5TGM1 i ST2 na wykazuje znaczący wzrost resorpcji kości w teście płodowych, szczurzych kości długich (Figura 2), podczas gdy kondycjonowaną pożywka 5TGM1 powoduje jedynie niewielki wzrost, w porównaniu z pożywką kontrolną. Kondycjonowaną pożywka z komórek ST2 nie wykazuje wzrostu resorpcji koście zatem bezpośredni kontakt komórka-komórka zarówno przez VCAM-1, jak i VLA-4 wywołuje wytwarzanie komórek podobnych do osteoklastów i wytwarzanie in vitro czynników resorbujących kości.

Wpływ rekombinowanego rozpuszczalnego VCAM-1 (sVCAM-1) na wytwarzanie przez komórki 5TGM1 aktywności resorpcyjnej i osteoklastogennej.

Kondycjonowana pożywka 5TGM1 traktowana rekombinowaną rozpuszczalną postacią VCAM-1 (sVCAM-1) zwiększa w sposób zależny od dawki resorpcję kości płodowych szczurzych kości długich, podczas gdy kondycjonowaną pożywka otrzymywana z nietraktowanych 5TGM1 zwiększa resorpcję kości jedynie w niewielkim stopniu. Sama rozpuszczalna VCAM-1 nie wpływa na resorpcję kości (dane nie pokazane). W układzie hodowlanym mysiego szpiku kondycjonowaną pożywka zbierana z komórek 5TGM1 traktowanych sVACAM-1 wykazuje zwiększoną aktywność tworzenia komórek OC-podobnych, podczas gdy kondycjonowaną pożywka z nietraktowanych 5TGMI wykazuje jedynie niewielką aktywność tworzenia komórek OC-podobnych (Figura 3).

Ekspresja mRNA ligandu Rank w komórkach zrębowych szpiku (ST2) hodowanych w obecności i przy braku mysich komórek szpiczaka.

Ponieważ ligand Rank okazał się być ważnym pośrednikiem tworzenia OCL i może być wspólnym końcowych szlakiem osteoklastogenicznych wpływów cytokin na tworzenie OCL, zbadano ekspresję ligandu Rank w indywidualnych, jak i jednoczesnych hodowlach komórek 5TGM1 i ST2. Stwierdzono, że jednoczesna hodowla komórek 5TGM1 i ST2 wzbudza ligand mRNA Rank w komórkach ST2. Ponadto, ponieważ komórki 5TGM1 nie wyrażają ligandu Rank były traktowane sVCAM-1 (dane nie pokazane). W końcu, kondycjonowaną pożywka z komórek 5TGM1 traktowana sVCAM-1 indukowała mRNA ligandu Rank w komórkach ST2, co sugeruje, że szlak VCAM-1/VLA-4 produkuje cytokiny w komórkach szpiczaka, które zwiększają ekspresję ligandu Rank w komórkach zrębowych szpiku (dane nie pokazane).

Podsumowując, wykazano, że same komórki 5TGM1 wytwarzają niewielką aktywność pobudzającą tworzenie komórek OC-podobnych i resorpcję kości. Jednakże, podczas hodowania komórek szpiczaka 5TGM1 jednocześnie z komórkami szpiku zawierającymi prekursory hemopoetycznych osteoklastów i komórek zrębowych silnie przylegają do komórek szpiku i zwiększają tworzenie komórek OC-podobnych. Nie tworzą się komórki OC-podobne w jednoczesnych hodowlach, w których komórki 5TGM1 są chronione przed kontaktem z komórkami zrębowymi. Następnie, w hodowlach narządowych szczurzych, płodowych kości długich kondycjonowaną pożywka zbierana z jednoczesnych hodowli komórek szpiczaka 5TGM1 i komórek rdzeniowych szpiku kostnego ST2 zwiększają aktywność resorpcji kości w porównaniu z kondycjonowaną pożywką zarówno samego ST2, jak i 5TGM1.

PL 203 114 B1

Dane te są spójne z obserwacją, że do wytwarzania pobudzenia do produkcji osteoklastów i aktywności resorpcyjnej kości jest wymagany bezpośredni kontakt komórka-komórka komórek 5TGM1 i komórek zrębowych szpiku kostnego. Następnie określono jakie cząsteczki adhezji komórkowej były włączone w bezpośrednie oddziaływania komórka-komórka między komórkami 5TGM1 i komórkami zrębowymi szpiku, które są niezbędne do wywołania aktywności osteoklastogennej.

Wyniki nasze wskazują, że VCAM-1 i integryna VLA-4 odgrywają rolę w tych oddziaływaniach komórka-komórka, ponieważ przeciwciała neutralizujące te dwie cząsteczki adhezyjne znacząco zmniejszają tworzenie komórek OC-podobnych w hodowlach jednoczesnych. Oddziaływanie VCAM-1/integryna VLA-4 jest odpowiedzialne za komunikację komórka-komórka między komórkami zrębowymi szpiku i komórkami szpiczaka 5TGM1 prowadzącymi do zwiększonego wytwarzania aktywności osteoklastogennej i resorpcyjnej kości. Na koniec, aktywność resorpcyjną kości w części zależy od wzbudzenia ligandu Rank.

Przykład 2: Doświadczenia in vivo

Badania in vitro sugerują, że oddziaływania między VLA-4 na komórki szpiczaka a VCAM-1 na komórki zrębowe szpiku odgrywają podstawową rolę we wzbudzaniu aktywności resorpcyjnej szpiczaka. Celem było sprawdzenie tej hipotezy in vivo na modelu zwierzęcym, który dokładnie odpowiada chorobie u człowieka.

A. W tym doświadczeniu myszom wstrzykiwano 1 x 10⁵ komórek szpiczaka 5TGMI, co pozwalało na zasiedlenie szpiku. Myszy podzielono na dwie grupy po trzy zwierzęta, jedna grupa służyła jako grupa kontrolna, drugą leczono mAB PS/2dwa razy w tygodniu rozpoczynając 8 dnia. Poziomy IgG2b, izotypu przeciwciała produkowanego przez komórki szpiczaka 5TGM1 mierzono co tydzień, od 1 do 6 tygodnia. Leczenie mAb w dawce 80 μg na iniekcję (-4 mg/kg) podawane dwa razy w tygodniu znacząco zahamowało wytwarzanie IgG2b, wskazywało to na istotne zahamowanie przeżycia komórek szpiczaka i wzrostu in vivo (Figura 4). Następnie, leczone myszy wykazały znaczące zmniejszenie występowania paraplegii (wszystkie 3 nieleczone zwierzęta wykazywały paraplegię w 42 dniu, podczas gdy z grupy leczonych zwierząt tylko jedno). Dwa z leczonych zwierząt bez paraplegii wykazywało również zmniejszenie ciężarów śledziony i wątroby, co również korelowało z obciążeniem nowotworem. W końcu, leczone zwierzęta wykazywały histopatologicznie zmniejszenie powierzchni guza (z 6,71(±)1,74 do 0,05(±)0,08 milimetrów kwadratowych) w piszczeli i kości udowej. Nie było wpływu leczenia na poziomy wapnia w surowicy (dane nie pokazane).

B. W równoległym doświadczeniu, leczenie w dawkach 40 pg PS/2 podawanych dwa razy w tygodniu nie miało wpływu na poziomy IgG2b (dane nie pokazane). Dane te pokazują, że mAb PS/2 przeciwko VLA-4 silnie zaburzają wzrost usadowionych komórek szpiczaka w sposób zależny od dawki.

C. W innym doświadczeniu in vivo, 18 myszom SCID wstrzyknięto komórki szpiczaka 5TGM1 w dniu 0. Cztery myszy leczono PBS; 4 myszy leczono stosując schemat profilaktyczny mAb M/K-2.7 reaktywny przeciwko mysim VCAM-1 w dawce 80 pg (-4 mg/kg) co trzy dni, rozpoczynając w dniu -1 (tj. w dniu -1, 2, 5, 8 i 11). W równoległym doświadczeniu wykorzystującym ten sam protokół, pięć myszy leczono 160 pg mAb M/K-2.7. Dodatkowo, pięć myszy leczono 160 pg mAb M/K-2.7 rozpoczynając protokół leczniczy od dnia 8 (tj. dni 8, 11, 14, 17 i 20). Surowicę pobierano od wszystkich myszy w dniach 21, 28 i 35, zwierzęta naświetlano promieniami rentgena i w 35 dniu zabijano w celu wykonania badania histopatologicznego. Wszystkie trzy leczone grupy wykazywały zmniejszenie poziomów IgG2b w surowicy, wskazujące na zmniejszenie obciążeniem komórek szpiczaka (Figura 5). Znaczący wpływ obserwowano również w odniesieniu do wagi śledziony w protokole niskich dawek profilaktycznych w odniesieniu do kontroli (0,23(±)0,14 g dla kontroli w przeciwieństwie do grupy leczonej 0,08(±)0,04). W grupie wysokich dawek profilaktycznych 4 z 5 zwierząt wykazało oczywiste zmniejszenie ciężaru śledziony, lecz całkowita wartość nie była znacząca z powodu jednego zwierzęcia z dużą wagą śledziony (dane nie pokazywane).

D. Można zbadać, czy początkowa wysoka dawka antagonisty integryny alfa4, po której następują dawki podtrzymujące, poprawi skuteczność. Komórki szpiczaka są już umiejscowione w kompartmencie szpikowym, i konieczne jest zahamowanie ich ściśle związanych, zależnych od VLA-4 oddziaływań z VCAM-1. Ponadto, wydaje się oczywiste, że im większa jest liczba usadowionych komórek szpiczaka, tym większa jest wstępna dawka wymagana do wypłukania komórek do krążenia obwodowego.

Przeprowadzono większe badanie z przeciwciałem PS/2 przeciwko VLA-4. Dwudziestu ośmiu myszom SCID wstrzyknięto komórki szpiczaka 5TGM1 w dniu 0. Dziewięć myszy nie otrzymało lecze18

PL 203 114 B1 nia; 9 myszy otrzymało izotypowo zgodne z kontrolą mAb IgG; 10 myszy leczono mAB PS/2 przeciwko integrynie alfa 4. Stosowano różne schematy leczenia, w których myszom podawano wysokie dawki mAb (200 μg) w dniach 4, 5 16, a następnie dawkę podtrzymującą 80 μg (-4 mg/kg) co trzy dni rozpoczynając od dnia 8.

Występowało statystycznie istotne zmniejszenie IgG2b w surowicy, gdy grupę leczoną porównywano albo z grupą nieleczoną albo kontrolną leczoną IgG w tygodniach 3 i 4 (dane nie pokazywane). Ważne jest, że grupa leczona porównywana zarówno z grupą nieleczoną, jak i z grupą leczoną IgG wykazuje wyraźny wpływ na przeżycie (Figura 6).

Przykład 3: Inne doświadczenia in vivo

W oparciu o informacje podane tu po raz pierwszy specjaliści w dziedzinie mogą łatwo potwierdzić i poszerzyć znaczenie integryn alfa 4 i ich ligandów w wielorakich szpiczakach wykorzystując opisany mysi model.

Następujące typy doświadczeń są na poziomie umiejętności specjalisty w dziedzinie opartych na ujawnieniu niniejszego wynalazku, lecz służą raczej dla zobrazowania, a nie ograniczenia rodzajów pracy.

1) Odpowiedź na dawkę mAb PS/2 w celu określenia optymalnej dawki podtrzymującej, podawanej dwa razy w tygodniu. 80 μg wykazuje dobrą skuteczność, lecz dawka 40 μg nie daje żadnego efektu. Badano wyższe dawki, aż do 20 mg/kg dwa lub trzy razy dziennie w celu ustalenia optymalnego dawkowania.

2) Pacjenci, u których występuje choroba na różnych stadiach zaawansowania, związanych z obciążeniem nowotworowym. Badano skuteczność mAb PS/2 podawanego w różnym czasie od rozpoznania choroby tj. porównywano rozpoczęcie leczenie w 8 dniu (patrz na przykład Figura 4), do rozpoczęcia dwa, trzy, cztery i pięć tygodni po zaszczepieniu w celu zaobserwowania jak późno można podać mAB aby złagodzić objawy.

3) Badano działania mAb MK-2 na mysie VCAM-1, po których następowały te same parametry co podane powyżej (dawkowanie, czas podawania) dla mAB przeciwko VLA-4.

Przewidywano, że podobne poziomy dawkowania będą konieczne do uzyskania skuteczności.

4) Badano dalsze markery postępu szpiczaka, w tym obciążenie nowotworem zarówno w szpiku, jak i w miejscach pozaszpikowych, oceniano zmiany kostne analizą radiolograficzną szkieletu stosując histomorfometrię; mierzono współczynniki resorpcji kości przez określanie wiązań krzyżowych kolegenu w surowicy; mierzono wytwarzanie białka monoklonalnego w surowicy; występowanie hiperkalcemii i śmiertelność.

5) Szpiczak mnogi jest obecnie leczony nieskutecznie standardowymi schematami chemioterapeutycznymi. Badano addycyjne lub synergistyczne skutki optymalnego dawkowania mAb w połączeniu z, lub raczej przed, lub po dawkowaniu odpowiedniego schematu chemioterapeutycznego.

6) Badano zdolność inhibitora małych cząstek integryny alfa4, który jest wybiórczy w stosunku do jednej konkretnej integryny lub jest jednocześnie wybiórczy w stosunku do wielu integryn alfa4 lub zdolność kombinacji takich inhibitorów do naśladowania wpływu mAb i blokowania postępu szpiczaka wykorzystując protokoły i schematy opisane powyżej. Inhibitory małych cząstek były podawane pozajelitowo, lub doustnie, w dawkach z zakresu 0,1 do 30 mg/kg, raz lub dwa razy dziennie, lub dwa lub trzy razy w tygodniu.

Claims (24)

1. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen wybranego spośród:

(a) przeciwciała przeciw VLA-4 lub jego fragmentu wiążącego antygen;

(b) przeciwciała przeciw integrynie alfa-4/beta7 lub jego fragmentu wiążącego antygen (c) przeciwciała przeciw VCAM-1 lub jego fragmentu wiążącego antygen do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia szpiczaka mnogiego, przy czym przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen są wybrane z grupy składającej się z przeciwciała ludzkiego, przeciwciała chimerowego, przeciwciała humanizowanego i ich fragmentów wiążących antygen.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen są wybrane spośród przeciwciała HP1/2 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała HP2/1 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała HP2/4 lub jego fragmentu wiążącego,

PL 203 114 B1 przeciwciała L25 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała P4C2 lub jego fragmentu wiążącego antygen i przeciwciała P4G9 lub jego fragmentu wiążącego antygen.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest humanizowanym przeciwciałem przeciw VLA-4 lub jego fragmentem wiążącym antygen obejmującym humanizowany łańcuch lekki i humanizowany łańcuch ciężki, a każdy łańcuch lekki i łańcuch ciężki obejmuje regiony determinujące dopasowanie (CDR1, CDR2 i CDR3) z mysiego przeciwciała 21.6 przeciw VLA-4.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że:

a. humanizowany łańcuch lekki obejmuje zrębowy region zmienny z sekwencji zrębowego regionu zmiennego ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, gdzie co najmniej jedna pozycja aminokwasowa regionu zrębowego jest zajęta przez aminokwas obecny w równoważnej pozycji zrębowego regionu zmiennego łańcucha lekkiego mysiej immunoglobuliny 21.6; i

b. humanizowany łańcuch ciężki obejmuje zrębowy region zmienny z sekwencji zrębowego regionu zmiennego ludzkiego łańcucha ciężkiego, gdzie co najmniej jedna pozycja aminokwasowa regionu zrębowego jest zajęta przez aminokwas obecny w równoważnej pozycji zrębowego regionu zmiennego łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny 21.6.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja zawierająca przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest w formie odpowiedniej do podawania pozajelitowego.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen mogą być stosowane w kombinacji z jednym lub więcej kortykosteroidem, środkiem przeciwzapalnym, antymetabolitem i immunomodulatorem.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen jest przeciwciałem monoklonalnym lub jego fragmentem wiążącym antygen.

8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało przeciw VLA-4 lub jego fragment wiążący antygen wiąże łańcuch alfa VLA-4.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało przeciw VLA-4 lub jego fragment wiążący antygen jest przeciwciałem przeciw VLA-4 lub jego fragmentem wiążącym swoistym wobec epitopu B.

10. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen wybranego spośród:

(a) przeciwciała przeciw VLA-4 lub jego fragmentu wiążącego antygen;

(b) przeciwciała przeciw integrynie alfa-4/beta7 lub jego fragmentu wiążącego antygen (c) przeciwciała przeciw VCAM-1 lub jego fragmentu wiążącego antygen do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania resorpcji kości towarzyszącej nowotworom szpiku kostnego, przy czym przeciwciało lub jego fragment wiążący są wybrane z grupy składającej się z przeciwciała ludzkiego, przeciwciała chimerowego, przeciwciała humanizowanego i ich fragmentów wiążących antygen.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen są wybrane spośród przeciwciała HP1/2 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała HP2/1 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała HP2/4 lub jego fragmentu wiążącego, przeciwciała L25 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przeciwciała P4C2 lub jego fragmentu wiążącego antygen i przeciwciała P4G9 lub jego fragmentu wiążącego antygen.

12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest humanizowanym przeciwciałem przeciw VLA-4 lub jego fragmentem wiążącym antygen obejmującym humanizowany łańcuch lekki i humanizowany łańcuch ciężki, a każdy łańcuch lekki i łańcuch ciężki obejmuje regiony determinujące dopasowanie (CDR1, CDR2 i CDR3) z mysiego przeciwciała 21.6 przeciw VLA-4.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że:

a. humanizowany łańcuch lekki obejmuje zrębowy region zmienny z sekwencji zrębowego regionu zmiennego ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, gdzie co najmniej jedna pozycja aminokwasowa regionu zrębowego jest zajęta przez aminokwas obecny w równoważnej pozycji zrębowego regionu zmiennego łańcucha lekkiego mysiej immunoglobuliny 21.6; i

b. humanizowany łańcuch ciężki obejmuje zrębowy region zmienny z sekwencji zrębowego regionu zmiennego ludzkiego łańcucha ciężkiego, gdzie co najmniej jedna pozycja aminokwasowa regionu zrębowego jest zajęta przez aminokwas obecny w równoważnej pozycji zrębowego regionu zmiennego łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny 21.6.

PL 203 114 B1

14. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że kompozycja zawierająca przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest w formie odpowiedniej do podawania pozajelitowego.

15. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen mogą być stosowane w kombinacji z jednym lub więcej kortykosteroidem, środkiem przeciwzapalnym, antymetabolitem i immunomodulatorem.

16. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen jest przeciwciałem monoklonalnym lub jego fragmentem wiążącym antygen.

17. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeciwciało przeciw VLA-4 lub jego fragment wiążący antygen wiąże łańcuch alfa VLA-4.

18. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeciwciało przeciw VLA-4 lub jego fragment wiążący antygen jest przeciwciałem przeciw VLA-4 lub jego fragmentem wiążącym swoistym wobec epitopu B.

19. Zastosowanie rozpuszczalnych polipeptydów VLA-4 lub VCAM-1, które antagonizują interakcję VLA-4/VCAM-1, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia szpiczaka mnogiego.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że kompozycja zawierająca polipeptyd jest sformułowana do podawania pozajelitowego.

21. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że polipeptyd jest odpowiedni do stosowania w kombinacji z jednym lub więcej kortykosteroidem, środkiem przeciwzapalnym, immunosupresantem, antymetabolitem i immunomodulatorem.

22. Zastosowanie rozpuszczalnych polipeptydów VLA-4 lub VCAM-1, które antagonizują interakcję VLA-4/VCAM-1, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania resorpcji kości towarzyszącej nowotworom szpiku kostnego.

23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że kompozycja zawierająca polipeptyd jest sformułowana do podawania pozajelitowego.

24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że polipeptyd jest odpowiedni do stosowania w kombinacji z jednym lub więcej kortykosteroidem, środkiem przeciwzapalnym, immunosupresantem, antymetabolitem i immunomodulatorem.