Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania materia lu na pola testowe, zw laszcza su- chych testów b ed acy podk ladem celulozowym pokrytym polimerow a membran a pó lprzepuszczaln a z niereaktywnego polimeru tworz acego pory nie zapadaj ace si e bez wype lnienia, pomimo kilkukrotne- go zamaczania i suszenia w wodzie i/lub innych rozpuszczalnikach. Znanych jest wiele rodzajów materia lów na pola testowe pozwalaj acych na separowanie na powierzchni testu upostaciowionych elementów zawartych w matrycy analitycznej Na przyk lad US patent 3092465 opisuje otrzymywanie testu do oznaczania glikozy w pe lnej krwi gdzie bibule filtracyj- n a nasyca si e roztworem odczynników zawieraj acych zelatyn e. Podobne rozwi azanie, zastosowano w opisie polskiego patentu PL 166404, gdzie na powierzchni e bibu ly filtracyjnej nanoszona jest war- stwa zawieraj aca komplet odczynników zawieszonych w zelatynie, tworz ac po wysuszeniu p eczniej a- c a, reaktywn a pó lprzepuszczaln a warstw e wska znikow a. Patent USA 4258001 opisuje rozwi azanie polegaj ace na pokrywaniu nosnika z politereftalanu glikolu etylenowego warstw a reakcyjn a sk ladaj ac a sie z odczynników reaguj acych z analitem zawieszonych w mieszaninie membranotwórczej opartej o wysoko cz asteczkowe polimery naturalne. Podobne rozwi azanie przedstawione jest w opisie paten- towym USA 4486537, gdzie pó lprzepuszczalna warstwa, sk ladaj aca si e z wielkocz asteczkowego po- limeru syntetycznego k ladziona jest na no snik z politereftalanu glikolu etylenowego tworz ac pó lprze- puszczalny film na nieprzepuszczalnej, ale dobrze transmituj acej swiat lo, odpornej chemicznie war- stwie no snika. Testy te s luza do analizy zawarto sci ró znych sk ladników w pe lnej krwi, np. glikozy, mocznika czy cholesterolu w pe lnej krwi. Jest równie z rozwi azanie ogólniejsze opracowane przez firm e Boehringer Mannheim, polegaj ace na separowaniu erytrocytów oraz innych upostaciowionych elementów pe lnej krwi za pomoc a w lókniny Przyk lad takiego rozwi azania przedstawiono w patencie niemieckim DE 3130749 dla testu do oznaczania cholesterolu. Zasada dzia lania tego testu polega na tym, ze separacja nast epuje zarówno na zasadzie filtracji sitowej jak i rozwijaniu chromatogramu. Krew wsi aka w pod lo ze z w lókniny szklanej, w której elementy o mniejszej masie cz asteczkowej s a separowane od upostaciowionych elementów krwi. Zasada ta zosta la wykorzystana równie z w innych rozwi azaniach opisanych np. w patentach niemieckich: DE Patent nr 4001155; DE Patent nr 4005- -4021. Zasada dzia lania tego typu rozwi aza n zosta la opisana równie z przez Vogla i wspó lpracowni- ków (Vogel P., Rittersdorf W., Thym D., Bartl K.: - Development of a potassium assay on the Reflo- tron. - Clin. Chem. 36(1990)107). Zasada ta pos lu zy la do opracowania kilkunastu testów do pe lnej krwi, b ed acych obecnie w sprzeda zy. Brak jest jednak do tej pory uniwersalnej metody pozwalajacej na otrzymywanie testów do oznacze n w najró zniejszych mediach, nie tylko w pe lnej krwi, ale równie z w sokach i przecierach owocowych i warzywnych, wodzie zanieczyszczonej mu lem i ró znymi zawiesi- nami, gnojowicy, zawiesinowych sciekach przemys lowych i wielu innych mediach gdzie zawarte w nich substancje przed rozpocz eciem procedur analitycznych wymagaj a wst epnie oddzielenia zanie- czyszcze n przez filtracj e lub odwirowanie. W opisie patentowym GB2217717 opisano sposób, w którym na suche nieporowate pod lo ze polimerowe nanosi si e roztwór membranotwórczy, sk ladaj acy si e z co najmniej 2 niekompatybilnych polimerów, które w roztworze tworz a dwie ró zne fazy. Do tego roztworu dodaje si e wype lniaczy i zelu- je w wodzie lub innym nierozpuszczalniku polimeru. W opisie patentowym EP0274911 - opisano metod e, w której membrana wykonana z polimerów syntetycznych takich jak poliamid, polidifluorowinyliden, nylon czy modyfikowany poliamid, nasycana jest roztworami odczynników i sama jako taka jest polem testowym, które dopiero (przyk lad 1) nano- szone jest na pod lo ze z octanu celulozy (pochodnej celulozy - folia nieporowata), z którym spajana jest za pomoc a kleju, przez docisk (dodatkowa, k lopotliwa czynno sc mog aca doprowadzi c do niepo zada- nych reakcji z zestawem odczynników w membranie), a ponadto klej jest dodatkowym obciazeniem. W opisach patentowych DE4438381 i US2002/0119577 opisano membran e wykonan a z niepo- rowatej mieszaniny nitrocelulozy i octanu celulozy naniesionej na pod lo ze z folii poliestrowej. W rezul- tacie membrany i pola testowe maj a grubo sc kilku milimetrów. Nieoczekiwanie okaza lo si e, ze sposobem wed lug wynalazku mo zliwe jest opracowanie mate- ria lu na pola testowe o nie zapadaj acych si e porach, w którym na porowatym no sniku z czystej celulo- zy znajduje si e bardzo cienka warstwa membrany pó lprzepuszczalnej spojonej bezpo srednio z tym pod lo zem, bez dodatkowej warstwy kleju, o odpowiedniej porowato sci i przepuszczalno sci, przezna- czonych do wykonania pól testowych, zw laszcza suchych testów.PL 203 559 B1 3 Sposób wed lug wynalazku wypelnia istniej ac a do tej pory luk e, pozwalaj ac na otrzymywanie podk ladu celulozowego pokrytego membran a pó lprzepuszczaln a, stanowi acego surowiec do otrzy- mywania materia lu pól testowych, z którego mo zna otrzyma c zarówno testy do oznacze n w zawiesi- nach wodnych, krwi jak i w sokach i przecierach ro slinnych. Sposób wed lug wynalazku polega na naniesieniu, znanymi sposobami, na podk lad celulozowy nasycony nierozpuszczalnikiem polimeru, korzystnie bibu le jako sci chromatograficznej, cienkiej war- stwy roztworu polimeru membranotwórczego skladaj acej si e z polimeru lub mieszaniny polimerów wybranych z grupy obejmuj acej polimery syntetyczne daj ace si e formowa c metod a inwersji faz, ko- rzystnie wybranych z grupy obejmuj acej poliamidy, polisulfony lub polieterosulfony, w rozpuszczalniku polimeru, o kontrolowanej grubo sci. Roztwór polimeru membranotwórczego lub polimerów membrano- twórczych, ewentualnie poza polimerem membranotwórczym mo ze zawiera c jeden lub kilka porofo- rów, korzystnie wybranych z grupy obejmuj acej niskocz asteczkowy alkohol poliwinylowy, poliglikole etylenowe i propylenowe oraz poliwinylopirolidony. Nast epnie membrana formowana jest metod a inwersji faz, przez suszenie naniesionej cienkiej warstwy membranotwórczej, lub korzystnie przez wytr acanie nierozpuszczalnikiem. Nierozpuszczalnik mo ze by c pojedynczym indywiduum chemicznym, lub roztworem wielu substancji. Po wyp lukaniu z powsta lej membrany poroforu, i wysuszeniu otrzymana bibu la pokryta membran a pó lprzepuszczaln a jest gotowym materia lem do otrzymywania pól testowych. W rozwi azaniu wed lug wynalazku, jednorodny roztwór sk ladaj acy si e z 1 polimeru, lub miesza- niny kompatybilnych polimerów, dzi eki czemu udaje si e uzyska c membran e pó lprzepuszczaln a o gru- bo sci od kilkunastu do kilkudziesi eciu mikrometrów, nanosi si e na pod lo ze celulozowe (porowate), nas aczone uprzednio nierozpuszczalnikiem polimeru (pod lo ze nie mo ze by c suche), bez dodatku nierozpuszczalnych wypelniaczy. Materia l na pola testowe otrzymany sposobem wed lug wynalazku charakteryzuje si e tym, ze posiada pory nie zapadaj ace si e podczas wielokrotnego suszenia, a stanowi go materia l z czystej celulozy, nasycony uprzednio nierozpuszczalnikiem lub mieszanin a nierozpuszczalników polimeru lub polimerów, z bardzo cienk a warstw a polimeru membranotwórczego wybranego z grupy obejmuj acej poliamidy, polisulfony i polieterosulfony, z ewentualnym dodatkiem poroforów wybranych z grupy obejmuj acej niskocz asteczkowe alkohole poliwinylowe, poliglikole etylenowe i propylenowe lub poliwi- nylopirolidony, stanowi acego jednocze snie po laczenie z pod lo zem z czystej celulozy. W naszej metodzie pole testowe stanowi jedynie warstw e czystej celulozy, uprzednio nasyconej nierozpuszczalnikiem, co powoduje, ze mieszanina membranotwórcza nie wnika w pod lo ze i zapew- nia, ze warstwa wi az aca membran e z celuloz a ma grubo sc rz edu kilku mikrometrów, a warstwa pó l- przepuszczalna, w zale zno sci od potrzeb, kilkuna scie do kilkudziesi eciu mikrometrów, a nie milime- trów jak w dotychczas znanych rozwi azaniach. Zastosowane przez nas rozwi azanie ma t a zalet e, ze membrana naniesiona na pod lo ze celulo- zowe nie wykazuje tendencji do zapadania si e porów podczas kilkukrotnego nawil zania wod a i susze- nia w przeciwie nstwie do membran wykonanych z octanu celulozy azotanu celulozy i ich mieszanek gdzie jednorazowe nas aczenie wod a i wysuszenie powoduje ca lkowite zapadni ecie si e porów. Jak wspomniano wy zej, u nas pod lo zem jest celuloza z naniesion a uprzednio warstw a pó lprze- puszczaln a. Warstwa ta ma grubo sc kilkunastu mikronów a nie kilku milimetrów i nie stanowi warstwy reakcyjnej jak w znanym rozwi azaniu. Warstw e reakcyjn a stanowi dopiero pod lo ze celulozowe i to dopiero po nasyceniu odpowiedni a mieszanin a reakcyjn a. Mieszaniny te mog a by c bardzo ró zne w zale zno sci od oznaczanego analitu. Powoduje to, ze pole testowe, po naniesieniu odczynników, ma grubosc rz edu kilku mikronów, bo w celuloz e nasycon a nierozpuszczalnikiem stosowanego polimeru, polimer ten wnika jedynie na tak a w la snie g leboko sc. Istot a naszego wynalazku jest taki sposób pokrycia pod lo za celulozowego membran a pó lprze- puszczaln a, aby membrana ta stanowi la jednocze snie trwa la spoin e z celuloz a, ale w ni a nie wsi aka la g lebiej ni z na grubo sc kilku mikrometrów, przy czym, sama membrana pó lprzepuszczalna ma gru- bosc, w zale zno sci od potrzeb, od kilkunastu do kilkudziesi eciu mikrometrów i podczas kilkukrotnego nasycania roztworami wodnymi i suszenia nie wykazuje zjawiska zapadania si e porów. Materia l i sposób wed lug wynalazku przedstawiono w poni zej zamieszczonych przyk ladach. P r z y k l a d I Na bibu le chromatograficzn a Whatman nr 3 nasycon a roztworem zawieraj acym: 3% wagowych eteru 5% wagowych wodyPL 203 559 B1 4 92% wagowych etanolu, nanosi si e równomiernie cienk a warstw e mieszaniny membranotwórczej o sk ladzie: 100 g dimetyloformamid 18 g polisulfonu Udel 1700 23 g poliwinylopirolidon K30 i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej ca losc zanurza si e do wody deminerali- zowanej na oko lo 2 godziny. Po tym czasie, p lucze si e jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i su- szy w temp. oko lo 60 °C. P r z y k l a d II Na bibu le chromatograficzn a Whatman nr 3 nasycon a roztworem zawieraj acym: 5% wagowych dimetyloformamidu 20% wagowych wody 75% wagowych etanolu, nanosi si e równomiernie cienk a warstw e mieszaniny membranotwórczej o sk ladzie: 100 g dimetyloformamid 16 g polisulfonu Udel 1700 12 g poliwinylopirolidon K30 12 g glikolu etylowego 20.000 D i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej ca losc zanurza si e do wody deminerali- zowanej zawieraj acej 0,02% wagowych CaCI 2 , na oko lo 2 godziny. Po tym czasie, p lucze si e jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i suszy w temp. oko lo 80 °C. P r z y k l a d III Na bibu le chromatograficzn a Whatman nr 3 nasycon a roztworem zawieraj acym: 3% wagowych eteru 5% wagowych wody 92% wagowych etanolu, nanosi si e równomiernie cienk a warstw e mieszaniny membranotwórczej o sk ladzie: 10 g dimetyloacetamidu 5 g metylopirolidonu 20 g polieterosulfonu Ultrason 2020 P 10 g poliwinylopirolidon K60 10 g poliwinylopirolidonu K90 i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej ca losc zanurza si e do wody deminerali- zowanej z dodatkiem 0,5% CaCI 2 i 0,5% MgCI 2 na okolo 2 godziny. Po tym czasie, p lucze si e jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i suszy w temp. oko lo 105 °C. P r z y k l a d IV Na bibu le chromatograficzn a Whatman nr 3 nasycon a roztworem zawieraj acym: 5% wagowych dimetyloacetamidu 10% wagowych metylopirolidonu 5% wagowych wody 80% wagowych etanolu, nanosi si e równomiernie cienk a warstw e mieszaniny membranotwórczej o sk ladzie: 50 g metylopirolidonu 50 g dimetyloformamidu 18 g polieterosulfon Ultrason 2020 P 23 g glikolu polietylenowego 20.000 D i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej ca losc zanurza si e do wody deminerali- zowanej z dodatkiem 0,5% CaCI 2 i 0,5% MgCI 2 na okolo 2 godziny. Po tym czasie, p lucze si e jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i suszy w temp. oko lo 105 °C. P r z y k l a d V Na bibu le chromatograficzn a Whatman nr 3 nasycon a roztworem zawieraj acym: 10% wagowych metylopirolidonu 10% wagowych wody 80% wagowych etanolu, nanosi si e równomiernie cienk a warstw e mieszaniny membranotwórczej o sk ladzie:PL 203 559 B1 5 50 g metylopirolidonu 50 g dimetyloformamidu 18 g polisulfon Ultrason 2020 P 23 g poliwinylopirolidon K30 10 g glikolu polipropylenowego 40.000 D i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej ca losc zanurza si e do wody deminerali- zowanej z dodatkiem 1,5% CaCI 2 na oko lo 2 godziny. Po tym czasie, p lucze si e jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i suszy w temp. oko lo 105 °C. P r z y k l a d VI Na bibu le chromatograficzn a Whatman nr 3 nasycon a roztworem zawieraj acym: 25% obj eto sciowych wody 75% wagowych etanolu, nanosi si e równomiernie cienk a warstw e mieszaniny membranotwórczej o sk ladzie: 50 g kwasu mrówkowego 50 g kwasu octowego 18 g poliamidu 6 M32000 10 g poliwinylopirolidon K30 10 g glikolu polipropylenowego 40.000 D 5 g alkoholu poliwinylowego 5000 D i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej ca losc zanurza si e do wody deminerali- zowanej z dodatkiem 1% MgCI 2 na oko lo 5 minut. Po tym czasie, p lucze si e jeszcze w k apielach z wody demineralizowanej, w jednej k apieli zawieraj acej 4% wodorow eglanu sodu i ponownie w k apieli z wody demineralizowanej i suszy w temp. oko lo 195-102 °C. PL PL