PL204245B1

PL204245B1 - Preparat probiotyczny i zastosowanie preparatu probiotycznego

Info

Publication number: PL204245B1
Application number: PL363366A
Authority: PL
Inventors: Annika Mayra-Makinen; Tarja Suomalainen; Outi Vaarala
Original assignee: Valio Ltd
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2009-12-31
Also published as: ZA200305458B; EE05299B1; EE200300351A; BR0206689A; FI109602B; HUP0401017A2; JP3984546B2; WO2002060276A8; NZ527172A; HRP20030586B1; CA2434337A1; WO2002060276A1; CN100400645C; EP1359816A1; ES2243697T3; US20040062758A1; DE60204662D1; ATE297664T1; BRPI0206689B1; CN1487798A

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy preparatu probiotycznego i zastosowania preparatu probiotycznego. Preparat probiotyczny jest preparatem zawierającym bakterie kwasu mlekowego, bakterie wytwarzające kwas propionowy i/lub bifidobakterie, w różnych połączeniach. Probiotyki są korzystnie łączone z odpowiednimi prebiotykami dla wytworzenia synbiotyku. Preparat według wynalazku może być spożywany jako taki lub w połączeniu z odpowiednim pokarmem, takim jak produkt nabiałowy lub napój i jest użyteczny terapeutycznie dla pobudzenia układu immunologicznego i dla ogólnej poprawy zdrowia.

Stan techniki

Probiotyki są żywymi mikroorganizmami, które, gdy są podane człowiekowi lub zwierzęciu wywołują dobre samopoczucie gospodarza przez poprawę równowagi mikroorganizmów w jelicie (Fuller, R. Probiotics in man and animals, 1989, J. Appl. Microbiol. 66:365-378). Najlepiej udokumentowane probiotyki obejmują L. rhamnosus LGG, L. johnsonii LA1, L. casei Shirota i Bifidobacterium lactis Bbl2. Ponadto, szereg innych probiotyków został opisany w literaturze specjalistycznej (patrz przykładowo M.E. Sanders i J.H. in't Veld 1999. Antonie van Leeuwenhoek 76:293-315, Kluwer Academic Publishers). Wpływ probiotyków poprawiających zdrowie obejmuje równoważenie i utrzymywanie flory jelitowej, pobudzanie systemu odpornościowego i aktywności przeciwnowotworowej. Pożyteczne wpływy probiotyków w ludzkich jelitach opierają się na szeregu czynnikach wywoływanych przez żywe komórki bakterii, ich struktury komórkowe i produkty metabolizmu. Probiotyki są zazwyczaj podane w odżywkach lub jako kapsułki.

Bakteria może być uznana jako probiotyk jeśli zasadniczo spełnia następujące wymagania (Lee, Y-K i Salminen, S. 1995 The coming age of probiotics. Trend Food Sci Technol, 6:241-245): pozostaje żywotna w warunkach powszechnie panujących w układzie pokarmowym (niskie pH w żołądku, kwasy układu pokarmowego, itp.); przyczepia się do ścian jelit; metabolizuje w jelicie; daje się obrabiać technologicznie (wytrzymuje obróbkę); ujawnia zbadany klinicznie i opisany wpływ na zdrowie i jest bezpieczna do spożywania.

Prebiotyki są nie ulegającymi trawieniu składnikami pokarmu poprawiającymi ludziom zdrowie przez wybiórcze pobudzanie wzrostu i aktywności pewnych probiotycznych bakterii w jelicie grubym (Gibson, G.R. i Roberfroid, M.B. 1995. Dietary modulation of the human colonie microbiota - introducing a concept of prebiotics. J. Nutr. 125:1401-1412). Prebiotyk jest zazwyczaj nie ulegającym trawieniu węglowodanem (oligo- lub polisacharyd) lub cukrolem (alkohol cukrowy), który nie jest degradowany lub absorbowany w górnej części układu pokarmowego. Znane prebiotyki użyte w komercyjnych produktach obejmują inulinę (frukto-oligosacharyd lub FOS) i transgalakto-oligosacharydy (GOS lub TOS).

Synbiotyk jest określony jako kombinacja prebiotyku i probiotyku, prebiotyk wspomaga żywotność dodanego mikroorganizmu i jego przyleganie do jelita, przez co sprzyja poprawie zdrowia (Gibson and Roberfroid 1995, powyżej). Gdy nie strawione węglowodany przechodzące przez jelito cienkie są fermentowane w jelicie grubym, tworzone są na przykład krótko łańcuchowe kwasy tłuszczowe, inne kwasy organiczne, alkohole, wodór i dwutlenek węgla (Gibson and Roberfroid 1995, powyżej). Pierwszorzędowe kwasy tłuszczowe wytworzone podczas fermentacji to kwas octowy, kwas masłowy i kwas propionowy (Cummings, J.H. Short-chain fatty acids, w: Human Colonic Bacteria: Role in Nutrition, Physiology and Pathology, G.R. Gibson i G.T. Macfarlane (wyd.), str. 101-130, CRC Press, Boca Raton, 1995). Ogólnie zwiększenie liczby krótko-łańcuchowych kwasów tłuszczowych byłoby korzystne. Nie strawione węglowodany są głównym substratem dla mikroorganizmów jelita grubego, choć mogą one również obejmować związki fermentacji jelitowej, która jest niekorzystna. (Gibson i Roberfroid, 1995, powyżej).

Układ pokarmowy człowieka jest zasiedlony licznymi bakteriami żyjącymi w symbiozie z gospodarzem. Istnieją ogromne różnice w zawartości bakterii pomiędzy różnymi częściami przewodu pokarmowego, około 95% wszystkich bakterii jelitowych występuje w jelicie grubym będącym najważniejszą częścią jelit. Zbadano, że ponad 400 gatunków bakterii rozwija się w jelicie grubym. Ponadto, znane są mikroorganizmy, które przejściowo występują w jelitach (G.R. Gibson i M.B. Roberfroid (wyd.) Colonic Microbiota; Nutrition and Health. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 1999). Dominującymi gatunkami są: Bacteroides, Bifidobacterium, Coprococcus, Peptostreptococcus, Eubacterium and Ruminococcus. Szereg gatunków Lactobacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Veillonella, Propionibacterium i Enterobacteriaceae jest nieznacznie rzadszych. Niektóre z tych gatunków reprezentują użyteczne mikroorganizmy, podczas gdy inne mogą nawet być szkodliwe. Średnia zawartość mikroorganizmów w odchodach wynosi 10¹² cfu/g (na suchą masę). Bakterie degradują i fermentują te składPL 204 245 B1 niki pokarmu w jelicie grubym, które nie ulegają absorpcji w jelicie cienkim, w którym produkty końcowe fermentacji są zaabsorbowane dla wykorzystania przez organizm. Poza odżywianiem równowaga mikroorganizmów w jelicie grubym ma główne znaczenie dla stanu zdrowia człowieka (Tannock, G.W. 1998. Studies of the intestinal microflora: A prerequisite for the development of probiotics, Int. Dairy J. 8:527-533). Zmiany w składzie flory jelitowej lub nagła redukcja ich ilości (ze względu na ostrą biegunkę, leczenie antybiotykami, itp.) zwiększa zakażalność potencjalnie patogennymi szczepami, co może mieć poważne konsekwencje (powstanie alergii, chorób jelitowych, raka).

Enzymy β-glukuronidazowe wytworzone przez bakterie jelitowe są uważane za uczestniczące, przykładowo, w powstawaniu związków rakotwórczych. Steroidy i inne związki rakotwórcze, metabolizowane są w wątrobie i następnie są koniugowane z kwasem glukuronowym. Żółć dostarcza skoniugowanego związku glukuronowego do jelita cienkiego i z niego związek przechodzi dalej do jelita grubego gdzie enzymy glukuronidazowe mogą hydrolizować ten związek, co za tym idzie uwalniać toksyczne związki do jelita grubego (Rowland, I.R. 1995. Toxicology of the colon: role of the intestinal microflora, w: Human Colonic Bacteria, Role in nutrition, physiology, and pathology. Wydawcy: Gibson, G. R. i Macfarlane, G.T., str. 155-174, Boca Raton: CRC Press). Przypuszcza się, że gatunki Eubacterium, Bacteroides i Clostridium uwalniają większe ilości tych szkodliwych enzymów do jelit, niż przedstawiciele gatunków Bifidobacterium i Lactobacillus. Powinno to zatem być przyczyną dla której korzystnym będzie aby flora jelitowa składała się z bifidobakterii i bakterii kwasu mlekowego.

Ponadto, glikozydy pochodzące na przykład z warzyw i herbaty, przykładowo, nie są pobierane w jelicie cienkim i przechodzą do jelita grubego, gdzie mogą być hydrolizowane przez działanie β-glukozydazy tworząc toksyczne lub mutageniczne związki aglikanowe (Goldin, B.R. 1990. Intestinal Microflora: metabolism of drugs and carcinogens. Annals of Medicine 22:43-48).

Ponadto, flora jelitowa wytwarza enzym ureazę rozkładający mocznik do amoniaku. Duże ilości amoniaku mogą być toksyczne dla komórek nabłonkowych jelita (Mobley, H.L.T. i Hausinger, R.P. 1989. Microbial ureases: significance, regulation and molecular characterization. Microbiological Reviews 53:85-108).

Ludzka flora jelitowa tworzy się podczas wczesnych lat życia i potem już nie dochodzi do większych zmian w jej składzie. Mogą mieć jedynie drobne zmiany w obrębie gatunków (w bifidobakteriach, przykładowo).

Wraz z rosnącym zrozumieniem znaczenia flory jelitowej badania nad nią aktywnie ogniskują się na odkrywaniu czynników, które mogą być użyte dla wpływania na skład flory i jej działanie (żywotność) w taki sposób, że korzystne gatunki bakterii będą mogły być wzmacniane a szkodliwe ograniczane. Zakłada się, że działanie mikroorganizmów może być zaburzone przez prebiotyki wspierające korzystne bakterie. Intensywne badania przeprowadzono na galaktooligosacharydach (GOS), które są di-, tri- tetra-, penta- i heksasacharydami i które zawierają głównie jednostki galaktozy. Są one wytwarzane enzymatycznie z laktozy i zawartość produktu końcowego zależy od użytego enzymu (Matsumoto, K. i wsp., 1993. Galactooligosaccharides, w: Oligosaccharides. Production, properties and applications. Wyd. Nakakuki, T., Japanese Technology Reviews. tom. 3. nr 2., str. 90-116, Gordon i Breach Science Publishers, Szwajcaria, Australia). Wcześniej pokazano, że GOS wykazywały przykładowo właściwości bifidogeniczne, tj. takie, które wspomagają wzrost bifidobakterii (Ito, M. i wsp., 1990. Effect of administration of galactooligosaccharides on the human faecal microflora, stool weight, and abdominal sensation. Microb. Ecol Health Dis. 3:285-292).

Stan techniki

Zarówno produkty zawierające pojedynczy szczep probiotyczny i kombinacje wielkiej liczby różnych probiotyków były powszechnie opisane w literaturze naukowej. Synbiotyki były również opisane w literaturze naukowej.

Publikacja EP 904 784, N.V. Nutricia, przykładowo opisuje produkt probiotyczny zawierający Bifidobacterium, Enterococcus faecium i Lactobacillus. Ponadto, produkt ten może zawierać prebiotyki takie jak polisacharydy lub nie ulegającą degradacji skrobię i immunoglobuliny, witaminy, itp. Zgodnie z tą publikacją, produkt ten posiada działanie wspierające zdrowie w tym sensie, że przykładowo pobudza układ immunologiczny. Jednakże, efekt ten nie był pokazany w testach klinicznych ani nie badano żadnych innych aktywności biologicznych.

WO 00/33854, N.V. Nutricia opisuje produkt zawierający probiotyk i oligosacharydy. Probiotyki w szczególności odnoszą się do Lactobacillus i Bifidobacterium, choć Pediococcus, Propionibacterium, Leuconostoc i Saccharomyces sa również wspomniane. Uwzględnione prebiotyki obejmują transgalaktooligosacharydy (TOS) i fruktooligosacharydy (FOS). Zgodnie z publikacją, szczególnie korzystna

PL 204 245 B1 kombinacja obejmuje Lactobacillus rhamnosus i transgalaktooligosacharyd lub produkt hydrolizy galaktanu ziemniaka, kombinację tą i jej przygotowanie zilustrowano również w przykładach. Zgodnie z tą publikacją, produkt ma działanie poprawiające zdrowie i jest szczególnie użyteczny w leczeniu chorób jelitowych. Jednakże, jego aktywności nie zademonstrowano w jakikolwiek sposób.

W WO 97/34615, University of New South Wales, opisano probiotyczną kompozycję zawierającą dodatkowo jeden lub więcej probiotyków, odporną skrobię (nie degradowalną) i oligosacharyd, oraz synergiczny efekt uzyskany pomiędzy tymi trzema składnikami. Wspomnianymi probiotykami są Saccharomyces, Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus and Lactobacillus, i oligosacharydy obejmujące między innymi frukto- i galaktooligosacharydy. Przykłady pokazują synergiczny efekt bifidobakterii, skrobii kukurydzianej i fruktooligosacharydów w objętość bifidobacterii. Jednakowoż, żaden leczniczy efekt nie został opisany.

W US 5,895,648, Sitia-Yomo S.p.A., opisali probiotyczną kompozycję zawierają ca, w liofilizowanej postaci, żywe bakterie przynajmniej dwa gatunki bifidobakterii i przynajmniej dwa gatunki Lactobacillus lub Streptococcus połączone z jednym lub większą liczbą oligosacharydów. Kompozycja ta zawiera łącznie 4 do 20 części wagowych probiotyków i 5 do 22 części wagowych oligosacharydów, z których wspomniane są przykładowo galakto- i frukto-oligosacharydy, w szczególności inulina. Wspomniane probiotyki obejmują Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus i Streptococcus faecium. Zgodnie z publikacją mieszanina zawierająca probiotyki i prebiotyki może być dodana do deserów opartych na mleku, mleka lub soków dla zrównoważenia działania jelita. Jednakże, nie opisano żadnej aktywności biologicznej tej kombinacji.

Publikacja Milchwissenschaft (1988) tom 53, nr str. 603-605, opisuje mleko PAB zawierające trzy szczepy bakterii: Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii MTCC 1371, Lactobacillus acidophilus R. i Bifidobacterium bifidum NDRI. Prebiotyki nie zostały dodane do produktu. Zgodnie z tą publikacją mleko PAB jest użyteczne dla niemowląt i dzieci również tych, dotkniętych nietolerancją laktozy.

W WO 99/10476 opisano pobudzające działanie specyficznych szczepów bakteryjnych tj. Lactobacillus rhamnosus HN001 (NM97/09514) i HN067 (NM97/01925) i Lactobacillus acidophilus HN017 (NM97/09515) I Bifidobacterium lactis HN019 (NM97/09513), na system immunologiczny zmierzony jako zwiększona fagocytoza. Szczepy mogą być użyte pojedynczo lub dodane do produktów nabiałowych lub preparatów farmaceutycznych.

W US 5,902,578, Abbott Laboratories, odnosi się do sposobu zapobiegania i leczenia biegunki mieszaniną Lactobacillus reuterii, Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium infantis, mieszaninę, którą przygotowano jako proszek, płyn lub pigułki.

Biologiczne i lecznicze efekty probiotyków i synbiotyków powyższego rodzaju były również opisywane w stanie techniki. Jako przykład można wspomnieć Gallagher, D. i wsp., Journal of Nutrition (1996) tom 126, nr 5, str. 1362-1371, który opisuje wpływ bifidobakterii i Lactobacillus acidophilus na raka jelita grubego u szczurów i stwierdza, że najlepsze wyniki uzyskano stosując zarówno tą bakterię i jak i fruktooligosacharyd, i Kirjavainen, P. i wsp., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (listopad 1999) tom 6, nr 6, str. 799-802, który opisuje pozytywne skutki dwóch niezależnie zbadanych szczepów wytwarzających kwas mlekowy, Lactobacillus rhamnosus GG i Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii JS, na poziom limfocytów i co za tym idzie odpowiedzi immunologicznej myszy. Kombinacja tych dwóch bakterii nie została opisana lub zbadana.

Łączenie probiotyków z innymi substancjami posiadającymi wpływ terapeutyczny opisano również w stanie techniki. Przykładowo, WO 97/29762 i WO 97/29763, Procter & Gamble Company, opisali zastosowanie bakterii mlekowych i bifidobakterii w połączeniu z galakto- lub fruktooligosacharydami wraz z rośliną z rodzaju Ericaceae lub wyciągiem z niej dla leczenia infekcji dróg moczowych i chorób jelita, i WO 00/29007, Reddy, opisuje po łączenie probiotyków takich jak Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Propionibacterium, Brevibacterium, Penicillium i Saccharomyces produktami naturalnymi z opartymi na roślinie i substancjami lekopodobnymi.

Choć probiotyki i synbiotyki były intensywnie badane, dobre i wszechstronne produkty komercyjne nie są dostępne w żadnym znaczącym zakresie. W konsekwencji istnieje ciągła potrzeba oferowania konsumentom nowych produktów o jasno wykazanych działaniach probiotycznych i wytworzonych w postaci pozwalającej na ich zastosowanie przykładowo jako części lub uzupełnienia codziennej diety.

PL 204 245 B1

Krótki opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest preparat probiotyczny charakteryzujący się tym, że zawiera mikroorganizmy Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM7061), Propionibacterium freundenreichii ssp. Shermanii PJS (DSM7067) i bifidobakterie przy czym mikroorganizmy zawarte są w preparacie we wzajemnej proporcji każdego mikroorganizmu pomiędzy około 10:1 do 1:10.

W korzystnym wykonaniu preparatu wedł ug wynalazku jako bifidobakterie preparat zawiera Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692). Także korzystnie preparat według wynalazku zawiera ponadto tradycyjne stosowane w mleczarstwie mikroorganizmy starterowe.

W innej korzystnej realizacji wynalazku preparat zawiera również prebiotyk lub jest uż yty wraz z prebiotykiem, którym to prebiotykiem bardziej korzystnie, moż e być oligosacharyd. Jako oligosacharyd, w najkorzystniejszym wykonaniu wynalazku jest galakto-oligosacharyd (GOS).

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie preparatu zdefiniowanego powyżej do zapobiegania lub leczenia chorób jelitowych, alergii, tworzenia się substancji rakotwórczych/szkodliwych i raka, jako dodatek do produktu spoż ywczego, produktu farmaceutycznego, produktu wzmacniają cego zdrowie lub produktu naturalnego.

Korzystnie, w zastosowaniu preparat jest dodany do produktu mlecznego, napoju, soku, zupy lub pokarmu dla dzieci.

Zgodnie z wynalazkiem stosowane są głównie dwa szczepy bakterii mlekowych, tj. Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103) i Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061). Bakteria propionowa jest zazwyczaj Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067). Bifidobakteria może być jakąkolwiek bifidobakterią posiadająca działanie probiotyczne, typowo użyte są szczepy należące do gatunków Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium adolescentis.

Łączone są zazwyczaj co najmniej trzy z tych bakterii i kombinacja ta korzystnie obejmuje Lactobacillus rhamnosus LGG i/lub Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS.

Najbardziej korzystną kombinacją jest mieszanina czterech szczepów Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) i Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692). Jednakże jeśli jest to pożądane jakakolwiek bifidobakteria (taka jak Bbl2) może być uwzględniona w kombinacji. Korzystnie użytym prebiotykiem jest galaktooligosacharyd (GOS).

Inną korzystną kompozycją jest kombinacja bifidobakterii i bakterii propionowych, w której jakakolwiek bifidobakteria może być użyta wraz z Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067).

Nowa kombinacja może być użyta jako taka lub jako część innego produktu takiego jak farmaceutyk lub produkt pokarmowy. Kombinacja według wynalazku ma korzystny wpływ na równowagę w jelicie człowieka w ten sposób, ze zwiększa wytwarzanie entero-laktonu i zmniejsza niekorzystnie wysoką wartość pH. Kombinacja wpływa również na odpowiedź immunologiczną przez zwiększenie ilości limfocytów i przez γ-interferon (IFN) oraz przez ograniczenie powstawania substancji rakotwórczych. Kombinacja według wynalazku jest zatem, użyteczna dla zapobiegania i leczenia zaburzeń jelitowych, uczuleń i nowotworu i dla zapewniania ogólnego stanu zdrowia.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem kombinacja jest również stosowana jako substancja lecznicza w wytwarzaniu substancji leczniczych.

Szczegółowy opis wynalazku

Szczepy użyte w wynalazku, Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 i Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS) były opisane w stanie techniki. Bifidobacterium infantis Bbi99, który może być zawarty w kombinacji jest nowym szczepem i będzie bardziej szczegółowo opisany poniżej.

Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) jest opisany przykładowo w dokumencie patentowym US 5,032,399, Gorbach i Goldin. Szczep ten wyizolowano z ludzkich odchodów, jest on zdolny do dobrego wzrostu przy pH 3 oraz przeżywa nawet przy niższych wartościach pH jak również przy wysokiej zawartości kwasu żółciowego. Szczep wykazuje znakomite przywieranie zarówno do komórek śluzówki jak i do komórek nabłonkowych. Wydajność wytwarzania kwasu mlekowego z glukozy jest dobra: gdy rośnie na pożywce MRS, szczep wytwarza 1,5 - 2% kwasu mlekowego. Szczep nie fermentuje laktozy i co za tym idzie nie wytwarza kwasu mlekowego z laktozy. Szczep wykorzystuje następujące węglowodany: D-arabinoza, ryboza, galaktoza, D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza, ramnoza, dulcy6

PL 204 245 B1 tol, inozytol, mannitol, sorbitol, N-acetyloglukozamina, amigdalina, arbutyn, eskulina, salicynian, 5 celobioza, maltoza, sacharoza, trehaloza, raelezytoza, gentybioza, D-tagatoza, L-fukoza i glukonian. Szczepy rosną dobrze przy +15 - 45°C, optymalna temperatura mieści się w zakresie 30 - 37°C. Lactobacillus rhamnosus GG jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem dostępu ATCC 10 53103.

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 jest opisany bardziej szczegółowo w dokumencie patentowym FI 92498, Valio Oy. LC705 jest Gram dodatnią krótką pałeczką występującą w łańcuchach; jest homofermentującą słabo proteolityczną; rosnącą dobrze w +15 - 45°C; nie wytwarza amoniaku z argininy; jest katalazo ujemna; gdy rośnie na pożywce MRS (LAB M), szczep wytwarza 1,6% kwasu mlekowego mającego aktywność optyczną o konfiguracji L(+); szczep rozkłada cytrynian (0,169%) co za tym idzie wytwarza diacetyl i acetoinę; szczep fermentuje co najmniej następujące węglowodany (cukry, cukrole): ryboza, galaktoza, D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza, L-sorboza, ramnoza, mannitol, sorbitol, metylo-D-glukozyd, N-acetyloglukozamina, amigdalina, arbutyn, eskulina, salicynian, celobioza, maltoza, laktoza, sacharoza, trehaloza, melezytoza, gentobioza, D-turanoza i D-tagatoza. LC705 przywiera słabo do komórek śluzówki, lecz średnio dobrze do komórek nabłonka. Żywotność szczepu jest dobra przy niskich wartościach pH i wysokich zawartościach kwasu żółciowego. Szczep przeżywa dobrze przy zasoleniu 5% i całkiem dobrze przy zasoleniu 10%. Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 jest złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) pod numerem dostępu DSM 7061.

Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS) jest również opisana bardziej szczegółowo w dokumencie patentowym FI 92498, Valio Oy. PJS jest Gram dodatnią krótką pałeczką; fermentuje glukozę, fruktozę, galaktozę i laktozę; fermentuje dobrze mleczan i jego optimum wzrostu jest w temperaturze 32°C. Żywotność szczepu przy niskich wartościach pH i wysokich zawartościach kwasu żółciowego jest znakomita. Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS jest złożony w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM pod numerem dostępu DSM 7067.

Bifidobacterium infantis Bbi99 wyizolowano z odchodów zdrowego noworodka. B. infantis Bbi99 jest Gram dodatnią pleomorficzną pałeczką. Szczep jest katalazo ujemny, fruktozo-6-fosforano-fosfoketolazo dodatni (F6PPK) i zarówno α- i β-galaktozydazo- i α- i β-glukozydazo-dodatni. B. infantis Bbi fermentuje poniższe węglowodany: ryboza, galaktoza, D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza, metylo-D-mannoza, N-acetyloglukozamina, eskulina, salicyna, celobioza, maltoza, laktoza, melibioza i gentybioza. Optymalna temperatura wzrostu jest 30 - 40°C i pH 6,5 - 7,0. Szczep ten gdy rośnie na podłożach zawierających heksozę, wytwarza kwas L-mlekowy i kwas octowy (w proporcji 2:3). Zawartość G + C w DNA wynosi 55 - 67% mol. Bifidobacterium infantis Bbi99 złożono w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), zgodnie z Układem Budapesztańskim pod numerem dostępu DSM 13692 28 sierpnia 2000.

Preparat według wynalazku może obejmować również inne mikroorganizmy takie jak mikroorganizmy i probiotyki zawarte w starterach używanych w przemyśle mleczarskim. Istnieje wiele dobrze udokumentowanych szczepów starterowych, które są komercyjnie dostępne u producentów takich jak Hansen A/S, Dania, i Danisco/Wiesby GmbH, Niemcy.

Dla przygotowania preparatu według wynalazku, mikroorganizmy są hodowane stosując sposoby konwencjonalne znane w stanie techniki. Mogą być one hodowane jako czyste hodowle lub jako różnie mieszane hodowle. Hodowle mogą być użyte jako takie lub jeśli to pożądane mogą być obrobione przykładowo przez oczyszczanie, zatężanie, liofilizowanie lub wykańczanie ich dla wytworzenia różnych preparatów.

W celu wytworzenia pożądanego efektu probiotycznego stosuje się łącznie odpowiednie ilości probiotyków. Ilość każdego takiego probiotyku może, co za tym idzie, różnić się w szerokim zakresie, w zależności od, przykładowo, użytych szczepów i ich liczby, całkowitej liczby komórek probiotyków, całkowitej dawki dziennej i od innych właściwości i składników produktu. Dzienna dawka preparatu zazwyczaj obejmuje około 10⁶ - 10¹⁰ cfu probiotyków.

Jeden lub więcej probiotyków korzystnie dodaje się do kombinacji preparatu tworząc synbiotyk. Prebiotyk jest wybrany zgodnie z mikroorganizmami zawartymi w tej kombinacji rozpatrywanej tak, że będzie podtrzymywała wzrost mikroorganizmów. Odpowiednie prebiotyki mogą zawierać np. oligosacharydy, szczególnie galaktooligosacharyd (GOS), palatynozooligosacharyd, oligosacharyd sojowy, gentooligosacharyd, ksylooligomery, nie ulegającą degradacji skrobię, laktosacharozę, laktulozę, laktytol, maltytol, polidekstrozę lub im podobne. W celu wytworzenia efektu prebiotyku do synbiotyku dodaje się skuteczną ilość prebiotyku. To co jest ilością dostateczną jest określone przykładowo zgodPL 204 245 B1 nie z rozważanym szczepem, którego to dotyczy, ilość prebiotyków obejmuje i inne składniki i inne zastosowania produktu. Co za tym idzie, ilość również różni się w szerokim zakresie; może być od 0,5 do 5 g w dziennej dawce, przykładowo.

Prebiotyk nie musi koniecznie być uwzględniony w kombinacji. Zależnie od końcowego produktu i celu użycia, może być lepszym spożycie prebiotyku oddzielnie, choć w przybliżeniu w tym samym czasie co kombinacji probiotyku. W pewnych przypadkach wystarczającym może być spożycie jedynie kombinacji probiotyku, tak więc prebiotyk wcale nie będzie potrzebny. Przykładem tego jest przypadek gdy warunki jelitowe gospodarza są odpowiednie dla wzrostu probiotyków bez potrzeby dodania prebiotyków i gdy prebiotyk jest zawarty w normalnej diecie (jeśli jest spożyty przykładowo w owsiance lub chlebie ryżowym).

Niniejszy wynalazek pokazuje, że użyte mikroorganizmy spełniają kryteria postawione probiotykom: przeżywają dobrze w wymagających warunkach układu pokarmowego, przywierają dobrze do komórek jelita i namnażają się dobrze w jelitach. Pokazano również, że ujawniają one znakomite biologiczne efekty; przykładowo, zwiększają liczbę mikroorganizmów pożądanych z punktu widzenia zdrowia i ograniczają liczbę szkodliwych mikroorganizmów w jelicie, ograniczają aktywność szkodliwych enzymów i co za tym idzie tworzenie szkodliwych lub nawet rakotwórczych substancji i mają pobudzające działanie na odpowiedź immunologiczną.

Złożony preparat według wynalazku może być zastosowany jako taki lub w postaci kapsułek, pigułek lub tabletek, przykładowo wytworzonych w tradycyjnych procesach sporządzania farmaceutycznych produktów. Preparat według wynalazku może również być dodany do rozmaitych jadalnych produktów, takich jak pokarmy, napoje lub produkty konfekcjonowane, produkty zapewniające zdrowie, produkty naturalne, itp.. W kontekście niniejszego wynalazku preferowane są produkty zawierające preparat według wynalazku, takie jak produkty mleczne, szczególnie jogurty i inne produkty z mleka fermentowanego; sery i pasty, pokarm dla dzieci; soki i zupy oraz kapsułki. Produkt w postaci kapsułki zazwyczaj zawiera jedynie kombinację probiotyku, prebiotyk będzie spożyty niezależnie.

Produkty końcowe są przygotowane tradycyjnymi sposobami, a preparat dodaje się albo w trakcie z przygotowywania albo później, w czasie wykończania produktu końcowego.

P r z y k ł a d 1

Sporządzanie preparatu

Preparat przygotowano z mieszaniny bakterii, dodając, gdy jest to pożądane galakto-oligosacharydu (GOS) jako prebiotyku. Mieszanina bakteryjna została utworzona z hodowli bakterii (zatężonych lub zliofilizowanych) czterech szczepów, tj. Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) i Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692).

Zarówno LGG i bifidobakterie były hodowane indywidualnie.

LGG hodowano w pożywce zawierającej 5,0% przesączu serwatki (Valio Oy), 0,5% hydrolizatu kazeiny (Valio Oy), 0,5% drożdży technicznych, i 0,0015% MnSO4 x H2O. Składniki pożywki rozpuszczano w wodzie i pożywkę sterylizowano (przez 20 min w 120°C). Hodowlę prowadzono w temperaturze 37°C i przy pH 5,8 (ustawione NH4OH) przez około 18 godz., i mieszając przez prędkości 100 obr/min. Po hodowaniu komórki bakterii zatężono, płukano i liofilizowano stosując 10% (obj/obj) uzupełnienie czynnikiem zabezpieczającym, takim jak pożywka sacharozowa o stężeniu 46% lub podobna alternatywna, znana fachowcom. Końcowe stężenie bakterii w hodowli wynosiło więcej niż 1 x 10⁹ cfu/ml, w koncentracie więcej niż 1 x 10¹⁰ cfu/g i w zliofilizowanym proszku więcej niż 1 x 10¹¹ cfu/g.

Kompozycja pożywki hodowlanej dla bifidobakterii była jak następuje: przesącz serwatki 4% (Valio Ltd.), hydrolizat kazeiny 1,0% (Valio Ltd.), ekstrakt drożdży technicznych 1,0% (LAB M), cysteina-HCl 0,03% (Merck, Darmstadt, Niemcy). Inne składniki pożywki były najpierw rozpuszczane w wodzie, następnie dodawano cysteinę-HCl i pożywkę wysterylizowano (przez 20 min w 120°C). Hodowlę prowadzono przez około 18 - 20 godz., w temperaturze 37°C i przy pH 6,7 (ustawione NH4OH), mieszając przy prędkości 100 obr/min. Zawartość bakterii w hodowli wynosiła więcej niż 1 x 10⁹ cfu/ml. Po hodowli bakterie zatężono, przemywano i zliofilizowano stosując 10% (obj/obj) uzupełnienie czynnikiem zabezpieczającym, takim jak 46% pożywka sacharozowa lub podobne, alternatywne, znane fachowcom. Zawartość bakterii w koncentracie była większa niż 1 x 10¹⁰ cfu/g i w zliofilizowanym proszku więcej niż 1 x 10¹¹ cfu/g.

LC705 i PJS wyhodowano razem wyszczepiając komórki bakterii do pożywki opartej na serwatce w proporcji 1:2. Oparta na serwatce pożywka zawierała 3,5 - 5% przesączonej serwatki (Valio Oy), 1,0% hydrolizatu kazeiny i 1% ekstraktu z drożdży (Valio Oy). Szczepy hodowano przez trzy dni w 30°C,

PL 204 245 B1 pH pożywki utrzymywano na poziomie 4,5 przy pomocy automatycznego urządzenia do ustalania pH. Po hodowli, komórki bakterii zatężono, przemywano i liofilizowano stosując uzupełnienie 10% (obj/obj) czynnikiem zabezpieczającym, takim jak 46% pożywka sacharozowa lub inną podobną, znaną fachowcom. Zawartość każdej bakterii w koncentracie była >1 x 10¹⁰ cfu/g i w zliofilizowanym proszku >1 x 10 cfu/g.

Szczepy mogą również być hodowane niezależnie. W tym przypadku LC 705 hodowano jak opisano powyżej w przypadku łączonej hodowli, jedynie czas hodowli wynosił 1 dzień w 30°C. PJS hodowano w pożywce zawierającej 2% przesączu serwatki, 1,0% hydrolizatu kazeiny i 1% ekstraktu z drożdży. Szczep hodowano przez 3 dni w 30°C w pH 6,3 po czym obróbkę prowadzono jak wyżej.

Koncentraty lub proszki zmieszano w proporcji 1:1:1. Gdy LC705 i PJS hodowano niezależnie proporcje mieszania wynosiły 1:1:1:1. Otrzymana mieszanina koncentratów lub zamrożonych proszków jest użyta jako probiotyczna część w różnych zastosowaniach produktu będącego złożonym preparatem. Mieszanina ta jest dodawana do stosowanego produktu do otrzymania poniższych stężeń końcowych bakterii w produkcie:

LC705 >10⁶ cfu/g produktu

LC707 >10⁶ cfu/g produktu

PJS >10⁶ cfu/g produktu

Bifidomacterium >10⁶ cfu/g produktu

GOS (Valio Oy) dodano gdy było to pożądane, jako oddzielny produkt dla otrzymania stężenia GOS w produkcie wynoszącego około 0,5 - 5 g/dawkę.

P r z y k ł a d 2

Przywieranie szczepów i ich tolerancja w warunkach jelitowych

Przyleganie szczepów do śluzówki badano zgodnie z Ouweland i wsp. (Ouweland, A. C, Kirjavainen, P. V., Gronlund, M. - M., Isolauri, E., i Salminen, S. J. 1999. Adhesion of probiotic micro-organisms to intestinal mucus . Int. Dairy J. 9:623-630). LGG i będąca probiotykiem bakteria PJS przywierała znakomicie do śluzówki jelita, Bbi99 średnio i LC705 słabo. Przyleganie jest wymogiem wstępnym dla mikroorganizmu mającego korzystny wpływ na jelita. Z drugiej strony LC705 jest znany jako dobrze przylegający do komórek nabłonka, podobnie jak LGG (Lehto, E. i Salminen S. 1997. Adhesion of two lactobacillus strains, one lactococcus strain and one propionibacterium strain to cultured human intestinal CaCO-2 cell lines. Bioscience Microflora 16: 13-17). Właściwości te są korzystne gdy istnieje nierównowaga w jelicie i osłabiony został ochronny śluz.

T a b e l a 1

Właściwości adhezyjne (przyleganie) szczepów probiotycznych

Szczep	Przyleganie % (+odchylenie std.)
LGG	26,3±1,3
LC705	0,7±0,2
PJS	24,9±2,2
Bbi99	4,6±2,3

Testy in vitro pokazały szczepy znoszące fizjologiczne zawartości soli żółciowych i niskie pH żołądka.

Szczepy przetestowano przy różnych wartościach pH na 5 pożywkach MRS, których pH ustalono kwasem mlekowym do wartości pH 4, pH 3 i pH 2. Zbadane szczepy (świeże hodowle) wyszczepiono na 1% pożywkę pH i hodowano w 37°C przez 3 godz., po czym określono zawartość żywych komórek stosując agar dogodny dla danego szczepu (patrz tabela 5). Szczepy zachowały znakomicie swoją żywotność w 3 godzinnym procesie przy wartości pH 3. Bakteria propionowa zachowała żywotność nawet w pH 2. W teście tym bakterie nie były chronione przez składniki niesione przez pokarm (takie jak tłuszcz) i co za tym idzie można założyć, zostaną zachowane nawet lepiej wtedy gdy zostaną spożyte in vivo wraz z pokarmem.

PL 204 245 B1

T a b e l a 2

Zawartość komórek szczepów hodowanych w pożywkach MRS z ustalonym pH

	Wyjściowa zawartość cfu/ml	pH 4 cfu/ml	pH 3 cfu/ml	pH 2 cfu/ml
Bbi99	1 x 10⁷	2 x 10⁷	>10	>10
PJS	1 x 10⁸	9 x 10⁷	3 x 10⁷	1 x 10⁴
LGG	1 x 10⁷	2 x 10⁷	1 x 10⁷	>10²
LC705	6 x 10⁷	2 x 10⁸	4 x 10⁷	>10²

W odniesieniu do badania tolerancji soli ż ó ł ciowych testowano szczepy w poż ywkach MRS, które zawierały 0,3% i 0,5% 20 soli żółciowej Oxgal (Sigma), przez zaszczepienie 1% świeżej hodowli w pożywce MRS z solą żółciową. Szczepy hodowano w pożywkach przez 3 godz., w 37°C, po czym zawartość żywych komórek określono przy pomocy agaru właściwego dla szczepu (patrz tabela 5). Wszystkie szczepy znakomicie przeżyły traktowanie.

T a b e l a 3

Zawartość komórek hodowanych przy zawartości soli żółciowej wynoszącej 0,3% i 0,5%

	Wyjściowa zawartość (cfu/ml)	0,3% soli żółciowej	0,5% soli żółciowej
Bbi99	3 x 10⁷	1 x 10⁷	1 x 10⁷
PJS	6 x 10⁷	6 x 10⁷	5 x 10⁷
LGG	1 x 10⁷	2 x 10⁷	9 x 10⁶
LC705	1 x 10⁷	2 x 10⁷	1 x 10⁷

P r z y k ł a d 3

Selekcja prebiotyku użytecznego dla preparatu

Alternatywne prebiotyki były badane jako poszczególne szczepy przez hodowanie każdego szczepu w pożywce MRS wolnej od cukru, do której dodano 1% badanego prebiotyku. Każdy szczep hodowano przez 1 - 2 dni w optymalnej dla niego temperaturze. Wzrost bakterii obserwowano podczas testu, przez określenie zmętnienia hodowli, przy pomocy spektrofotometru.

Jak pokazano w tabeli 4 najlepszy promotor dla wzrostu dla wszystkich czterech szczepów był galaktooligosacharydem (GOS) uzupełnionym do 1%.

T a b e l a 4

Wpływ prebiotyków na wzrost bakterii

Prebiotyk	LGG	LC705	PJS	Bbi99
GOS	+ +	+ +	+ +	+
FOS	-	-	-	-
Xylooligomery	+	+ +	+	+
Polidekstroza	+ +	+ +	+	-
Arabinooligomery	-	-	-	-
Pektynooligomery	-	-	-	-
Ksylitol	-	-	-	-
Maltitol	-	+ +	-	-
Laktitol	-	+ +	-	-

PL 204 245 B1

P r z y k ł a d 4

Przygotowanie produktu końcowego

Funkcjonalny napój (po fińsku „tehojuoma”; Valio Oy) użyto jako podstawę dla przygotowania soku (dawka 65 ml/dzień), do którego dodano 0,1 g zliofilizowanej mieszaniny bakterii/dawka (= 65 ml) i 3,8 g 70% syropu GOS/dawka (= 65 ml). Odpowiedni sok bez dodatku syropu GOS lub mieszaniny bakterii użyto jako kontroli.

Zawartości bakterii w przygotowanym soku były jak następuje:

LGG >10⁷ cfu/ml

LC705 >10⁷ cfu/ml

PJS >10⁸ cfu/ml

Bbi99 >10⁷ cfu/ml

Produkty użyto w poniższych testach klinicznych, w których pro = sok+uzupełnienie probiotykiem i syn = sok+uzupełnienie probiotykiem+prebiotykiem

P r z y k ł a d 5

Efekty kliniczne preparatu według wynalazku

Napój opisany w przykładzie 4, zawierający wyżej opisaną kombinację probiotyku (pro) lub kombinację probiotyku i prebiotyku (syn) badano klinicznie na 20 osobnikach płci męskiej. Badane osoby otrzymywały codziennie napój zgodnie z planem badania i podczas badania nie pozwolono im na spożywanie żadnych innych produktów zawierających probiotyk. Schemat badania był taki, że test rozpoczynano okresem wstępnym, kontynuowanym przez okres otrzymywania probiotyków trwający dwa tygodnie i następnie okres synbiotyków, zakończony okresem nazywanym okresem wypłukania.

Schemat i harmonogram badania

Tydzień 8	N (tydzień 11)	N (tydzień 13)	N (tydzień 15)	N (tydzień 17)
I 3 tygodnie	*I 2 tygodnie	*I 2 tygodnie	*I 2 tygodnie	*I
Czas wstępny bez probiotyku	pro	syn	Normalna dieta bez probiotyku

Na koniec każdego okresu badane osoby oddawały próbki kału i krwi (=N).

Mikroorganizmy i enzymy analizowano z próbek kału a zawartości enterolaktonu i odpowiedź immunologiczną z krwi.

Mikroorganizmy

Zawartość mikroorganizmów

Całkowita zawartość bakterii mlekowych, LGG, LC705, całkowita zawartość bakterii propionowych PJS i całkowita zawartość bifidobakterii została oznaczona przy pomocy znanych w stanie techniki sposobów i parametry pokazano w tabeli 5.

T a b e l a 5

Sposoby oznaczania mikroorganizmów

Oznaczanie	Agar	Hodowla temperatura/czas
Bakterie mlekowe	MRS	37°C/3 dni	beztlenowa
LGG	MRS+0,005% wankomycyna (Sigma)	37°C/3 dni
LC705	MRS+0,005% wankomycyna	37°C/3 dni
Bakteria propionowa	Mod. YEL	30°C/7 dni	beztlenowa
PJS	Mod. YEL	30°C/7 dni	beztlenowa
Bifidobakteria	Agar rafinozowy (RB)	37°C/2 dni	beztlenowa

Wpływ na zawartość in vivo komórek bakterii jelitowych

Zawartość LGG, LC705 i PJS wzrastała znacząco w próbkach badanych osób w czasie okresu w którym używały one produkty zawierające probiotyk (tabela 6). Ponieważ zawartość bifidobakterii od

PL 204 245 B1 samego początku testu była bardzo wysoka, zmiany przypuszczalnie miały jedynie miejsce w ramach tych gatunków.

T a b e l a 6

Zawartość bakterii (log, cfu/g w próbkach kału; ±std.)

	Początkowa zawartość cfu/g	Po podaniu probiotyku cfu/g	Po podaniu synbiotyku cfu/g	Wypłukiwanie cfu/g
MHB (całkowita)	6,0 (±1,2)	6,2 (±1,2)	6,1 (±1,0)	4,5 (±1,6)
LGG	2,3(±1,0)	4,7 (±1,7)	5,3 (±1,2)	3,0 (±1,6)
LC705	2,0 (±0)	5,2 (±1,3)	5,4 (±1,0)	2,8 (±1,1)
Propionowa	2,7 (±1,4)	5,7 (±1,6)	5,6 (±1,4)	2,4(±1,7)
Bifidobakteria	8,2 (±1,5)	8,6 (±2,1)	8,8 (±2,2)	8,3 (±2,1)

Dodanie synbiotyku do produktu spożytego w teście pobierania poprawiała żywotność dodanych probiotyków w jelicie. Pokazano to na przykład przez zwiększenie zawartości LGG podczas okresu synbiotykowego.

Wpływ na wartość pH

Poziom pH u osób posiadających pH ponad 7 zmniejszał się w grupach, które otrzymywały mieszaninę probiotyku i synbiotyku, podczas gdy nie obserwowano obniżenia u osób o wyjściowej wartości pH niższej niż 7 (tabela 7).

T a b e l a 7

Zmiana PH po uzupełnieniu probiotykiem i synbiotykiem

	Kontrola	Sam probiotyk	Synbiotyk
pH>7	7,2	6,9	6,7
pH<7	6,6	6,7	6,6

Enzymy

Próbki kału opracowywano jak opisali Ling i wsp. (Ling, W-H., Korpela, R., Mykkanen, H., Salminen, S., and Hanninen, O. 1994 Lactobacillus GG supplementation decreases colonic hydrolytic and reductive activities in healthy female adults. Journal of Nutrition 124, 18-24).

β-glukuronidaza i β-glukozydaza oznaczono jak opisano przez Freeman (Freeman, H. J. 1986. Effects of differing purified cellulose pectin, and hemicellulose fibre on faecal enzymes in 1,2-dimethylhydrazine-induced rat colon carcinogenesis. Cancer Research 46: 5529-5532) i ureazę według zaleceń producenta (Boehringer Mannheim nr katalogowy 542946).

W czasie okresów badania nastąpiło zmniejszenie zawartości β-glukuronidazy, ureazy i β-glukozydazy w czasie pobierania probiotyku i synibiotyku (tabela 8). Po pobraniu, poziomy enzymów powróciły do normalnego. Synbiotyk posiadał silniejsze działanie obniżające poziomy enzymu niż mieszanina probiotyku.

T a b e l a 8

Zmiany w zawartości enzymu (nmol/min/g kału)

	Ureaza	Glukuronidaza	Glukozydaza
	% zmiany		% zmiany		% zmiany
Początkowy poziom	1080		292		746
Probiotyk	895	-17	214	-27	673	-9,8
Synbiotyk	592	-45	186	-36	448	-40
Odpłu kiwanie	980		227		640

Metabolizm glukozydazy i glukoronidazy wytwarza związki rakotwórcze. Znaczące obniżenie aktywności enzymu wytworzone przez kombinację probiotyku i synbiotyku według wynalazku, jasno pokazuje pozytywny efekt w odniesieniu do zmniejszenia tworzenia się substancji karcinogennych.

PL 204 245 B1

Zawartość enterolaktonu

Zawartość eneterolaktonu określono metodą Adlercreutz i wsp. (Adlercreutz, H., Fostis, T., Lampę, J., Wahała, K., Makela, T, Brunow, G. i Hase, T. 1993. 20 Quantitative determination at lignans and isoflavonoids in plasma of omnivorous and vegetarian women by isotope dilution gas-chromatography mass-spectrometry. Scan J. Clin Lab Invest 53: 5-18).

Poziomy enterolaktonu u badanych osób z początkowym poziomem enterolaktonu mniejszym niż 10 nmol/l zwiększyły się znacząco w wyniku pobrania synbiotyku (do poziomu 11,2).

Nie zaobserwowano zmian podczas badania w poziomie enterolaktonu u osób, u których poziom enterolaktonu w surowicy był normalny (10<x>30) już na początku testu. Wyniki przedstawiono w tabeli 9.

T a b e l a 9

Zawartość enterolaktonu podczas badania (zgrupowane na podstawie wyjściowego poziomu)

	10<x<30 nmol/l	<10 nmol/l
Poziom początkowy	24,4	3,2
Probiotyk	19,8	2,6
Synbiotyk	23,9	11,2

Wykazano, że zawartość enterolaktonu jednoznacznie koreluje z zagrożeniem powstania nowotworu: większa zawartość, mniejsze ryzyko. Wynik ten pokazuje również korzystny efekt kombinacji probiotyku i synbiotyku według wynalazku na zmniejszenie zagrożenia rakiem.

Badania immunologiczne

Wpływ na funkcje limfocytu

Funkcje limfocytu badano przed pobraniem produktu synbiotyku i w cztery tygodnie po rozpoczęciu pobierania.

Funkcje limfocytów badano jak następuje:

Limfocyty wyizolowano z krwi obwodowej przy pomocy gradientu Ficoll. Limfocyty pobudzono mitogenem PHA (Sigma) w pożywce hodowlanej RPMI (National Public Health Institute; department of nutrient broths), która zawierała 5% zinaktywowaną surowicę AB+ (Fiński Czerwony Krzyż) i L-glutaminę. Po 48 godzinach zebrano pożywkę hodowlaną dla oznaczenia cytokin z czterech odpowiednich studzienek hodowlanych zawierających komórki o gęstości 200 000 komórek na 200 μl pożywki hodowlanej w studzience, zarówno z lub bez mitogenu. Komórki zebrano po 16 godzinach od dodania tymidyny i mierzono wbudowywanie radioaktywnej tymidyny do DNA (cpn). Zawartość cytokin IL-4, IL-5, TGF-e1 i IFN-γ określono w komórkowych pożywkach hodowlanych przy pomocy metody ELISA.

Podczas badań, nie zaobserwowano zmian w zawartości IL-4, IL-5 i TGF-e1 wydzielonych przez limfocyty. Zawartość IFN-γ wydzielonych przez limfocyty pobudzane przez PHA znacząco zwiększyła się, (p=0,009, test Wilcoxon, patrz fig. 1). Zarówno spontaniczna jak i pobudzona za pomocą PHA proliferacja limfocytów zwiększyła się podczas badań (p=0,0002 w obu przypadkach, test Wilcoxon, fig. 1 i 2).

Zgodnie z wynikami badań zastosowanie produktu synbiotyku zwiększało proliferację limfocytów i wydzielanie cytokiny IFN-γ u badanych osób. IFN-γ należą do cytokin znanych jako Th1, które wzmacniają cytotoksyczną funkcję limfocytu i są antagonistami IL-4 i cytokin TGF-e1. Niskie poziomy wydzielania IFN-γ obserwowano u osób podatnych na uczulenia. Ponadto, dzieci z predyspozycjami do reakcji atopowej i uczuleniowej przypuszczalnie dotknięte są wolnym dojrzewaniem wydzielania IFN-γ. Znaczący efekt pobudzający preparatu według wynalazku na wydzielanie IFN-γ potwierdza, zatem, jego skuteczność w zapobieganiu i leczeniu uczuleń.

Claims

1. Preparat probiotyczny, znamienny tym, że zawiera mikroorganizmy Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM7061), Propionibacterium freundenreichii ssp. Shermanii PJS (DSM7067) i bifidobakterie przy czym mikroorganizmy zawarte są w preparacie we wzajemnej proporcji każdego mikroorganizmu pomiędzy około 10:1 do 1:10.

2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako bifidobakterie zawiera Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692).

PL 204 245 B1

3. Preparat według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że ponadto zawiera tradycyjne stosowane w mleczarstwie mikroorganizmy starterowe.

4. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera również prebiotyk lub jest użyty wraz z prebiotykiem.

5. Preparat według zastrz. 4, znamienny tym, że prebiotykiem jest oligosacharyd.

6. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że oligosacharydem jest galakto-oligosacharyd (GOS).

7. Zastosowanie preparatu zdefiniowanego w zastrz. 1 do zapobiegania lub leczenia chorób jelitowych, alergii, tworzenia się substancji rakotwórczych/szkodliwych i raka, jako dodatek do produktu spożywczego, produktu farmaceutycznego, produktu wzmacniającego zdrowie lub produktu naturalnego.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że preparat jest dodany do produktu mlecznego, napoju, soku, zupy lub pokarmu dla dzieci.