PL205061B1 - Przeciwciało użyteczne do oznaczenia immunologicznego próbki w celu określenia zawartości insektycydu neonikotynoidowego, insektycyd neonikotynoidowy, koniugat proteinowy oraz sposób określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce i zestaw mający zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbce - Google Patents
Przeciwciało użyteczne do oznaczenia immunologicznego próbki w celu określenia zawartości insektycydu neonikotynoidowego, insektycyd neonikotynoidowy, koniugat proteinowy oraz sposób określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce i zestaw mający zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbceInfo
- Publication number
- PL205061B1 PL205061B1 PL355630A PL35563000A PL205061B1 PL 205061 B1 PL205061 B1 PL 205061B1 PL 355630 A PL355630 A PL 355630A PL 35563000 A PL35563000 A PL 35563000A PL 205061 B1 PL205061 B1 PL 205061B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- neonicotinoid
- sample
- hapten
- enzyme
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
- C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
- C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/61—Halogen atoms or nitro radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
- C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
- C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy przeciwciała użytecznego do oznaczenia immunologicznego próbki w celu określenia zawartości insektycydu neonikotynoidowego, insektycydu neonikotynoidowego, koniugatu proteinowego oraz sposobu określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce i zestawu mającego zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbce.
Stosowanie syntetycznych insektycydów do zwalczania szkodników owadzich w uprawach stanowi praktykę ogólnoświatową. To praktyczne zastosowanie zyskało wysoki stopień popularności komercyjnej, ponieważ okazało się, że ten sposób zwalczania może zwiększyć plony. Jednakże skuteczne stosowanie insektycydów wymaga wydatnego nadzoru pod względem oporności insektycydów oraz narażenia środowiska i pracowników. Jednym z rozwiązań tego problemu było dostarczenie nowych, bardziej aktywnych insektycydów w celu ograniczenia zapotrzebowania na starsze, silnie toksyczne insektycydy oraz zmniejszenia ich ilości wprowadzanej do środowiska.
Jedną z nowych klas insektycydów, które uzyskują znaczące uznanie na rynkach są tak zwane insektycydy „neonikotynoidowe. Związki z tej klasy obejmują na przykład takie związki jak imidaklopryd, acetamipryd i tiametoksam, które są ujawnione odpowiednio w opisach patentowych U.S. 4742060 i 5304566 oraz EP 580553A2.
Bezpośrednie zaprawianie roślinnego materiału rozrodczego (takiego jak nasiona) insektycydami stanowi adresowane aplikowanie, które jest nakierowane na wymagania zmniejszenia narażenia środowiska i pracowników oraz narastania oporności szkodników, jeśli jest stosowane indywidualnie lub w połączeniu z aplikowaniem dolistnym lub w bruzdę siewną. Jednakże należy dołożyć starań, aby zapewnić właściwą kalibrację aparatury do zaprawiania nasion, aby insektycyd został równomiernie naniesiony na materiał siewny, aby uniknąć problemów związanych między innymi ze skutecznością insektycydu i fitotoksycznością nasion. Pomiary analityczne mogą być zastosowane w celu określenia, czy oprzyrządowanie do zaprawiania nasion zostało właściwie skalibrowane, czy funkcjonuje właściwie i czy traktowane partie mogą być przekazane do wysyłki. Jednakże tradycyjne sposoby wykrywania resztek insektycydów na nasionach są wyjątkowo czasochłonne i kosztowne, ponieważ wymagają wysoce specjalistycznych i kosztownych procedur analitycznych, takich jak chromatografia gaz-ciecz lub wysokosprawna chromatografia cieczowa. Techniki chromatograficzne wymagają kosztownej aparatury, która jest kosztowna w utrzymaniu, i która musi być obsługiwana przez wyszkolony personel techniczny. Stanowiska zaprawiania nasion oraz hodowcy zwykle nie posiadają takiego sprzętu lub personelu wśród swych pracowników, a więc próbki nasion muszą być wysyłane do odległych laboratoriów analitycznych. Jeśli próbki są poddane analizie w tych laboratoriach w ramach szybkiego cyklu transportowego, to stanowisko zaprawiania może otrzymać dane analityczne po około dwudziestu czterech godzinach od wysłania. Analizy w ramach wolniejszej procedury prowadzą do dłuższych opóźnień. Takie opóźnienia mogą powodować wiele godzin przestoju urządzeń na stanowisku zaprawiania. Opóźnienia w wysyłce zaprawianych nasion też są nieuniknione.
Istnieje pilna potrzeba w dziedzinie udoskonalenia istniejących technik pomiarowych, aby uczynić je mniej kosztownymi, bardziej wydajnymi i łatwiejszymi do posługiwania się. Potrzebne metody powinny być także użyteczne poza laboratorium w warunkach polowych tak, aby mogły szybko i dokładnie dostarczyć hodowcy lub personelowi stanowiska zaprawiania informacje o zawartości i stężeniach danego insektycydu w próbce nasion. W tym względzie jest istotne, aby metody różnicowały aktywny materiał pestycydowy od innych produktów, pozwalając na ilościowe oznaczanie żądanego składnika występującego na nasionach. Jednakże wciąż pozostają liczne ograniczenia klasycznych metod analitycznych. Niektóre z tych ograniczeń mogą być przezwyciężone z zastosowaniem technologii oznaczeń immunologicznych.
Oznaczenia immunologiczne i wykrywanie pestycydów
Pomimo że, opracowane przede wszystkim do użytku medycznego i weterynaryjnego, oznaczenia immunologiczne zaczęły znajdować zastosowanie w agrotechnice. Na przykład oznaczenia immunologiczne są dostępne do wykrywania i oznaczania ilościowego chorób roślin uprawnych, aflatoksyn i określonych antybiotyków. Chociaż oznaczenia immunologiczne do wykrywania pestycydów zostały ujawnione w literaturze naukowej (patrz poniżej), to stały się dostępne na zasadach komercyjnych dopiero w ostatniej dekadzie.
Oznaczenia immunologiczne opierają się na wysoce specyficznych reagentach - przeciwciałach oraz stosunkowo prostym urządzeniu analitycznym do wykrywania i/lub oznaczania ilościowego szePL 205 061 B1 rokiego zakresu docelowych materiałów. Specyficzność analityczną zapewnia przeciwciało, a nie aparatura lub warunki funkcjonowania. Oznaczenia immunologiczne zatem mogą być przeprowadzane na stosunkowo surowych próbkach. Ponadto, oznaczenia immunologiczne zastały zoptymalizowane do stosowania w odległych, nielaboratoryjnych warunkach, co pozwala na ich stosowanie w polu, jak i w wyspecjalizowanym laboratorium.
Metody immunologiczne są znane do wykrywania określonych herbicydów, w tym kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (Fleeker, J., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 70: 874-878 (1986)), chlorsulfuronu (Kelley, M. et al., J. Agric. Food Chem., 33: 962-965 (1985)), haloacetamidów (Winzenburger, P. A., et al. (publikacja europejskiego opisu patentowego EP 340198, 1989) oraz rozmaitych pestycydów, w tym diflubenzuronu (Wie, S. I., et al., J. Agric. Food Chem., 30: 949-957 (1982)), metalaksylu (Newsome, W. H., J. Agric. Food Chem., 33: 528-530 (1985)) i parationu (Ercegovich, C. D., et al., J. Agric. Food Chem., 29:559-563 (1981)). Opracowano również metodę immunologicznego wykrywania atrazyny (opis patentowy USA nr 4.530.786). Znane są również oznaczenia immunologiczne dla cyjanazyny, diklofopu-metylu, pentachlorofenolu, 2,4,5-T i terbutrynu.
Wszystkie powyższe sposoby immunologiczne wykorzystują poliklonalne surowice odpornościowe, które pozyskano od zwierząt - gospodarzy (zwykle królików) immunizowanych odpowiednim antygenem (immunogenem). Ostatnio ujawniono przeciwciała monoklonalne (mAbs) specyficzne względem atrazyny i jej pochodnych oraz produktów rozpadu, oraz zastosowanie takich mAbs w oznaczeniach immunologicznych (Schlaeppi, et al., publikacja europejskiego opisu patentowego EP 365818 (1990)).
Ze względu na niski ciężar cząsteczkowy insektycydy nie są immunogenne i nie aktywują uwalniania specyficznych przeciwciał u zwierząt - gospodarzy. Stąd też opracowanie oznaczenia immunologicznego insektycydu wymaga wielu etapów, rozpoczynających się od zaprojektowania haptenów, pochodnych insektycydu, które zachowując specyfikę strukturalną cząsteczki insektycydu, umożliwiają zarazem sprzężenie z immunogenną proteiną („nośnikiem) o wysokim ciężarze cząsteczkowym. Ponadto, w celu przeprowadzenia skriningu przeciwciał w trakcie procesu ich wytwarzania, może być konieczne otrzymanie dodatkowych haptenów, których budowa chemiczna jest różna od haptenu stosowanego do immunizowania zwierząt. Na zakończenie, po otrzymaniu preparatu przeciwciał (poliklonalnych lub monoklonalnych), trzeba jeszcze opracować wystarczająco czułe oznaczenie immunologiczne.
Podstawowe strategie stosowane w nowoczesnych oznaczeniach immunologicznych ujawniono w licznych pracach odnoś nych (patrz na przykł ad Voller, A., et al., ed., Immunoassays For The 80's, University Park, 1981; Voller, A., „The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Diagnostic Horizons 2: 1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Voller, A., et al., J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol., 73: 482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1980). Podstawowe dla każdego podejścia jest wykreowanie krzywych kalibracji z użyciem znanych ilości żądanej substancji analizowanej.
Metoda „znaczonego przeciwciała w ogólnym użytku jest cytowana jako enzymatyczny test immunoadsorpcyjny (ELISA). Tutaj otrzymuje się koniugat proteinowy pestycydu (zwany „powłoczką lub „antygenem skriningowym) z użyciem proteiny, która jest strukturalnie niepodobne do proteiny nośnej stosowanej w immunogenie pestycydowym, względem której generowane są przeciw-pestycydowe przeciwciała. Koniugat powleczony antygenem jest immobilizowany na nośniku stałym, takim jak powierzchnia studzienki mikropłytki, co prowadzi do utrwalonej ilości pestycydowej fazy stałej na reakcję. Dodawana jest znana ilość przeciwciała równolegle z testowaną próbką. Immobilizowany pestycyd konkuruje z wolnym pestycydem w nieznanej próbce względem limitowanej liczby centrów wiążących przeciwciała. Oddziaływanie pomiędzy przeciwciałem i substancją analizowaną w fazie ciekł ej inhibituje wią zanie przeciwciał a do pestycydowej fazy stał ej. Przeciwciał o zwią zane z fazą stałą jest wykrywane przez sprzężone z enzymem drugie przeciwciało specyficzne dla stałego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała przeciw-pestycydowego. Wiele enzymów związanych z drugim przeciwciałem jest dostępnych komercyjnie do takiego zastosowania. Po odmyciu niezwiązanego drugiego przeciwciała, immobilizowane drugie przeciwciało jest zwykle wykrywane przez dodanie chromogenicznego substratu dla enzymu, co prowadzi do barwnego produktu reakcji, tworzącego się w ilości proporcjonalnej do ilości związanego drugiego przeciwciała. Ilość produktu reakcji jest zatem odwrotnie proporcjonalna do ilości substancji analizowanej w nieznanej próbce.
Modyfikacja metody „znaczonego przeciwciała eliminuje użycie powlekanego antygenu. Enzymatyczny test immunologiczny (EIA) immobilizuje przeciwpestycydowe przeciwciało na fazie stałej. Pestycydowy hapten sprzęga się kowalencyjnie z enzymem, a uzyskany koniugat enzymowy jest in4
PL 205 061 B1 kubowany z próbkami w mikrostudzienkach lub probówkach hodowlanych powlekanych przeciwciałem przeciw-pestycydowym. Pestycyd w próbkach konkuruje z koniugatem pestycydowym hapten-enzym, wiążąc się do immobilizowanego przeciwciała. Fazę stałą przemywa się w celu usunięcia niezwiązanych materiałów, a związany z przeciwciałem koniugat enzymowy jest wykrywany przez dodanie substratu chromogenicznego. Patrz np., Bushway, R.J., L.P. Perkins, S.A. Savage, S.L. Lekousi i B.S. Ferguson, 1988, Determination of atrazine residues in water and soil by enzyme immunoassay. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 40: 647-654; Fleeker, J.R. i L.W. Cook, 1991, Reliability of commercial enzyme immunoassay in detection of atrazine in water, str. 78-85 w M. Vanderlann, L.H. Stanker, B.E. Watkins, i D.W. Roberts., ed., Immunoassays for Trace Chemical Analysis, ACS Symposium Series 45,. Waszyngton, D.C.: American Chemical Society.
Istnieje zapotrzebowanie w agrotechnice na sposób analizowania nasion zaprawianych składnikami czynnymi, takimi jak insektycydy, który mógłby być realizowany w polu lub w obrębie stanowiska zaprawiania nasion.
Istotą wynalazku jest przeciwciało użyteczne do oznaczenia immunologicznego próbki w celu oznaczenia zawartości insektycydu neonikotynoidowego, którym to przeciwciałem jest (I) przeciwciało poliklonalne wytworzone poprzez immunizowanie zwierzęcia z użyciem haptenu neonikotynoidowego sprzężonego z immunogeniczną proteiną nośną i które (II) specyficznie wiąże się z insektycydem neonikotynoidowym, przy czym przeciwciało to jest selektywne względem związku o wzorze
R2 R1 i i
w którym
A oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;
R i R3 niezależ nie oznaczają wodór lub C1-C4alkil;
2 1 2
R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy, oraz
X oznacza N-NO2 lub N-CN.
Korzystnie przeciwciało według wynalazku jest selektywne względem związku wybranego z grupy obejmują cej imidaklopryd, tiametoksam i klotiadynę.
Istotą wynalazku jest też insektycyd neonikotynoidowy o wzorze IA
w którym
A oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;
3
R3 oznacza wodór lub C1-C4alkil;
2 1 2
R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil, lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy;
n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 4; oraz X oznacza N-NO2 lub N-CN.
W szczególnoś ci insektycydami neonikotynoidowymi wedł ug wynalazku są zwią zki o wzorze
PL 205 061 B1
Zgodny z wynalazkiem jest również koniugat proteinowy o wzorze
w którym
A oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;
R3 oznacza wodór lub C1-C4alkil;
R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil, lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy;
n oznacza liczbę cał kowitą od 1 do 4; oraz
X oznacza N-NO2 lub N-CN.
PR oznacza resztę proteinową cząsteczki nośnika wybranej z grupy obejmującej pochodną oczyszczonej proteiny (PPD, tuberkulina) z wirusa Diphtheria, albuminę surowicy bydlęcej, kationizowaną albuminę surowicy bydlęcej, albuminę surowicy ludzkiej, albuminę jaja kurzego lub hemocyjaninę keyhole limpet lub resztę enzymu wybranego z grupy obejmującej fosfatazę alkaliczną, peroksydazę chrzanową i β-galaktozydazę.
PL 205 061 B1
W szczególności zgodny z wynalazkiem jest koniugat proteinowy o wzorze
oraz koniugat proteinowy o wzorze
Zgodny z wynalazkiem jest też sposób określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce, charakteryzują cy się tym, ż e (a) dostarcza się fazę stałą z immobilizowanym przeciwciałem selektywnym dla insektycydu neonikotynoidowego o wzorze
R2 R1 i i
w którym
A oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;
R i R3 niezależ nie oznaczają wodór lub C1-C4alkil;
R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy oraz
X oznacza N-NO2 lub N-CN (b) doprowadza się do zetknięcia wymienionej próbki z immobilizowanym przeciwciałem w obecności znanej iloś ci koniugatu hapten insektycydu neonikotynoidowego - enzym;
(c) przemywa się fazę stałą z etapu (b) i usuwa się niezwiązany koniugat hapten-enzym lub próbkę, (d) poddaje się reakcji substrat chromogeniczny specyficzny dla wymienionego koniugatu hapten-enzym z przemytą fazą stałą z etapu (c) w celu generowania chromogenu oraz (e) dokonuje się pomiaru ilości chromogenu wytworzonego w etapie (d) w celu określenia ilości koniugatu przeciwciało-związany hapten-enzym, a zatem i ilości insektycydu neonikotynoidowego w wymienionej próbce.
Korzystnie w sposobie według wynalazku próbkę otrzymuje się przez ekstrakcję roślinnego materiału rozrodczego odpowiednim rozpuszczalnikiem, przy czym korzystnym roślinnym materiałem rozrodczym są nasiona, w szczególności nasiona wybrane z grupy obejmującej kanadyjską odmianę rzepaku (canola), sorgo, pszenicę, bawełnę, kukurydzę paszową lub kukurydzę cukrową.
W sposobie wedł ug wynalazku korzystnie przeciwciał em jest przeciwciał o poliklonalne wytworzone przez immunizowanie zwierzęcia insektycydem neonikotynoidowym sprzężonym z immunogeniczną proteiną nośną, przy czym immunogeniczną proteiną nośną jest zwłaszcza cząsteczka nośnika wybrana z grupy obejmującej pochodną oczyszczonej proteiny (PPD, tuberkulina) z wirusa Diphtheria, albuminę surowicy bydlęcej, kationizowaną albuminę surowicy bydlęcej, albuminę surowicy ludzkiej, albuminę jaja kurzego lub hemocyjaninę keyhole limpet.
PL 205 061 B1
Zgodny z wynalazkiem jest zestaw mający zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbce, charakteryzujący się tym, że obejmuje on kombinację w jednym lub większej liczbie pojemników:
(a) fazy stałej z immobilizowanym przeciwciałem selektywnym względem insektycydu neonikotynoidowego, przy czym przeciwciało to jest selektywne względem związku o wzorze
R2 R1 i i
w którym
A oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;
R i R3 niezależ nie oznaczają wodór lub C1-C4alkil;
R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy, oraz
X oznacza N-NO2 lub N-CN i (b) koniugatu enzymowego zawierającego enzym sprzężony z haptenem neonikotynoidowym.
Korzystnie w zestawie według wynalazku przeciwciałem jest przeciwciało poliklonalne wytworzone drogą immunizowania zwierzęcia neonikotynoidem sprzężonym z immunogeniczną proteiną nośną, enzymem jest peroksydazą chrzanową a przeciwciało specyficznie wiąże się z insektycydem neonikotynoidowym wybranym z grupy obejmującej imidaklopryd, tiametoksam i klotiadynę.
Zgodne z wynalazkiem jest przeciwciało użyteczne do oznaczenia immunologicznego próbki w celu oznaczenia zawartoś ci insektycydu neonikotynoidowego, którym to przeciwciał em jest (I) przeciwciało poliklonalne, wytwarzane przez immunizowanie zwierzęcia haptenem insektycydu neonikotynoidowego sprzężonym z immunogenną proteiną nośną i (II) które specyficznie wiążące insektycyd neonikotynoidowy, przy czym przeciwciało to jest selektywne względem związku wybranego z grupy obejmującej nitenpiram, acetamipryd i tiaklopryd.
Zgodny z wynalazkiem jest również sposób określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce, charakteryzujący się tym, że (a) dostarcza się fazę stałą z immobilizowanym przeciwciałem selektywnym dla insektycydu neonikotynoidowego, przy czym przeciwciało to jest selektywne względem związku wybranego z grupy obejmującej nitenpiram, acetamipryd i tiaklopryd.
(b) doprowadza się do zetknięcia wymienionej próbki z immobilizowanym przeciwciałem w obecności znanej iloś ci koniugatu haptenu insektycydu neonikotynoidowego - enzymu;
(c) przemywa się fazę stałą z etapu (b) i usuwa się niezwiązany koniugat hapten-enzym lub próbkę;
(d) poddaje się reakcji substrat chromogeniczny, specyficzny dla wymienionego koniugatu hapten-enzym z przemytą fazą stałą z etapu (c) w celu generowania chromogenu; oraz (e) dokonuje się pomiaru ilości chromogenu wytworzonego w etapie (d) w celu określenia ilości koniugatu przeciwciało-związany hapten-enzym, a zatem i ilości insektycydu neonikotynoidowego w wymienionej próbce.
Korzystnie również w tym sposobie według wynalazku próbkę otrzymuje się przez ekstrakcję roślinnego materiału rozrodczego odpowiednim rozpuszczalnikiem, przy czym roślinnym materiałem rozrodczym są nasiona, zwłaszcza nasiona wybrane z grupy obejmującej kanadyjską odmianę rzepaku (canola), sorgo, pszenicę, bawełnę, kukurydzę paszową lub kukurydzę cukrową.
Korzystnie przeciwciałem jest przeciwciało poliklonalne wytworzone przez immunizowanie zwierzęcia insektycydem neonikotynoidowym sprzężonym z immunogeniczną proteiną nośną, przy czym jako immunogeniczną proteinę nośną stosuje się cząsteczkę nośnika wybraną z grupy obejmującej pochodną oczyszczonej proteiny (PPD, tuberkulina) z wirusa Diphtheria, albuminę surowicy bydlęcej, kationizowaną albuminę surowicy bydlęcej, albuminę surowicy ludzkiej, albuminę jaja kurzego lub hemocyjaninę keyhole limpet.
Według wynalazku zestaw mający zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbce obejmuje kombinację w jednym lub większej liczbie pojemników:
PL 205 061 B1 (a) fazy stałej z immobilizowanym przeciwciałem selektywnym względem insektycydu neonikotynoidowego wybranego z grupy obejmującej nitenpiram, acetamipryd i tiaklopryd i (b) koniugatu enzymowego zawierającego enzym sprzężony z haptenem neonikotynoidowym.
W zestawie według wynalazku korzystnie przeciwciał em jest przeciwciał o poliklonalne wytworzone drogą immunizowania zwierzęcia neonikotynoidem sprzężonym z immunogeniczną proteiną nośną, a enzymem korzystnie jest peroksydaza chrzanowa.
Wynalazek dostarcza neonikotynoidowe hapteny oraz immunogeny dla generowania przeciw-neonikotynoidowych przeciwciał, jak również przeciwciała, metody, reagenty i zestawy do wykrywania obecności jednego lub większej liczby insektycydów neonikotynoidowych w próbce za pomocą testu immunologicznego. Wynalazek ma zwłaszcza zastosowanie do oznaczania stężenia insektycydów neonikotynoidowych aplikowanych na roślinny materiał rozrodczy, taki jak nasiona.
Sposób oznaczania immunologicznego według wynalazku umożliwia personelowi stanowiska zaprawiania nasion, na którym insektycydy neonikotynoidowe są aplikowane na nasiona, ilościowe oznaczenie ilości zaaplikowanego składnika czynnego. Sposób obejmuje szybką ekstrakcję składników czynnych z nasion oraz pomiar oparty na szybkim oznaczeniu immunologicznym w roztworze poekstrakcyjnym. Pomiary te mogą być wykorzystane do określenia, czy oprzyrządowanie do zaprawiania nasion zostało właściwie skalibrowane, czy funkcjonuje poprawnie i czy zaprawione partie nasion mogą być przekazane do wysyłki. Oznaczenie jest zaprojektowane tak, aby przeprowadzać proste operacje, które wymagają tylko zwykłego sprzętu laboratoryjnego i reagentów. A zatem personel bez praktyki w przeprowadzaniu oznaczeń immunologicznych będzie w stanie skutecznie przeprowadzać testy po kilku próbach praktycznych.
Stwierdzono, że antygeniczne koniugaty neonikotynoidowe (immunogeny) można wytworzyć drogą sprzęgania neonikotynoidowego pestycydowego haptenu z cząsteczką nośnika, taką jak: pochodna oczyszczonej proteiny (PPD, tuberkulina) z wirusa Diphtheria, albumina surowicy bydlęcej, albumina surowicy ludzkiej, albumina jaja kurzego lub hemocyjanina keyhole limpet z neonikotynoidowym haptenem. Koniugaty pochodnych materiałów, takie jak: pochodne albuminy surowicy bydlęcej, kationizowanej albuminy surowicy bydlęcej i tym podobnych, również mogą być wytworzone. Patrz A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce i J.G. Michael (1987), J. Immunol., 138: 833-837. Następnie, te immunogeny mogą być wstrzykiwane zwierzętom gospodarzom, które wytwarzają przeciwciała przeciwko haptenowi neonikotynoidowemu, które to przeciwciała mogą być pobierane. Przeciwciała te mogą być następnie wykorzystywane w rozmaitych procedurach oznaczeń immunologicznych celem wykrywania odpowiednich insektycydów neonikotynoidowych, z użyciem różnych znanych markerów celem znakowania albo insektycydu albo przeciwciała. W niektórych praktycznych realizacjach oznaczeń immunologicznych, immobilizuje się albo pochodną insektycydu neonikotynoidowego albo przeciwciało. Można stosować zarówno przeciwciała poliklonalne jak i monoklinalne w praktyce wedł ug niniejszego wynalazku. Moż na wykazać , ż e przeciwciał a selektywnie wiążą się z żądanymi insektycydami neonikotynoidowymi nawet w obecnoś ci innych składników pestycydowo czynnych, a w tym i innych insektycydów neonikotynoidowych dodanych do preparatu do zaprawiania nasion.
Metody detekcji, które mogą być użyte w praktyce według niniejszego wynalazku do oznaczania insektycydów neonikotynoidowych w próbkach, obejmują biosensory oraz układy enzymatyczne, fluorescencyjne, chemiluminescencyjne i radiometryczne. W oznaczeniach tych mogą być wykorzystywane formaty heterogenne lub homogenne i mogą być używane płytki mikrostudzienkowe, probówki hodowlane oraz perełki lub ziarna lateksowe jako fazy stałe.
Oznaczenia immunologiczne według wynalazku są stosowane w celu oznaczenia stężenia insektycydowych związków neonikotynoidowych, takich jak imidaklopryd, nitenpiram, acetamipryd, tiametoksam, tiaklopryd i klotiadyn w próbce, takiej jak roślinny materiał rozrodczy.
Niniejszy wynalazek dostarcza oznaczenia immunologiczne do badania próbek pod kątem obecności insektycydów neonikotynoidowych.
W takich oznaczeniach immunologicznych reakcja neonikotynoidowego (antygenu)/przeciwciał a może być wykrywana różnorodnymi metodami, z użyciem rozmaitych markerów do znakowania albo antygenu albo przeciwciała, aby umożliwić wykrywanie produktu reakcji. Ponadto, immobilizowanie albo antygenu albo przeciwciała przyspiesza w wielu przypadkach wykrycie.
Oznaczenia antygen/przeciwciało mogą ogólnie być zaklasyfikowane do dwóch kategorii, heterogennych i homogennych. Oznaczenia heterogenne wymagają oddzielenia związanego znakowanego składnika od wolnego znakowanego składnika przed wykrywaniem produktu reakcji. Oznaczenia
PL 205 061 B1 homogenne nie wymagają takiego etapu oddzielania. Dalej, oznaczenia mogą być (1) konkurencyjne, na przykład, w którym antygen konkuruje w reakcji ze znakowanym przeciwciałem z antygenem na fazie stałej lub w którym antygen konkuruje ze znakowanym antygenem w reakcji z przeciwciałem na fazie stałej lub (2) niekonkurencyjne, w których występuje bezpośrednia zależność pomiędzy znakowaniem i przeciwciałem lub antygenem.
Metody oznaczeń immunologicznych, które mogą być stosowane w praktyce według niniejszego wynalazku do wykrywania insektycydów neonikotynoidowych w próbkach, obejmują oznaczenia enzymatyczne, fluorescencyjne, chemiluminescencyjne i biosensorowe, jak również radioimmunologiczne. W enzymatycznych testach immunoabsorpcyjnych (ELISA), stosownie do niniejszego wynalazku, hapteny odpowiadające danym insektycydom neonikotynoidowym, mogą być znakowane bezpośrednio enzymatycznie lub pośrednio przez użycie znakowanych enzymatycznie przeciwciał, które w odpowiednich warunkach katalizują reakcję z substratem. Aktywność enzymatyczna jest zwykle wykrywana wskutek tworzenia barwnego produktu reakcji, tj. barwnego punktu końcowego, który może być rozpoznawany gołym okiem lub drogą pomiaru spektroskopowego lub współczynnika odbicia.
W technikach fluorescencyjnych oznaczeń immunologicznych stosowanych w niniejszym wynalazku, hapteny odpowiadające danym insektycydom neonikotynoidowym mogą być znakowane bezpośrednio fluorochromami lub pośrednio przeciwciałami znakowanymi fluorochromami. Fluorochromy są to barwniki, które absorbują promieniowanie (np. światło ultrafioletowe), ulegają wzbudzeniu i emitują światło (np. światło widzialne).
W praktycznej realizacji wynalazku test immunologiczny jest dostarczany w postaci zestawu zawierającego probówki poleczone przeciwciałem, koniugat hapten neonikotynoidowy-enzym, substrat enzymatyczny i roztwór do zakończenia generowania sygnału kolorymetrycznego.
Aczkolwiek wynalazek często jest przedstawiany w odniesieniu do użycia przeciwciał poliklonalnych, specjaliści w dziedzinie łatwo zorientują się, że przeciwciała monoklonalne mogą być użyte jako alternatywa dla zastosowania przeciwciał poliklonalnych. Termin „przeciwciała niniejszym używany źródłowo odnosi się do przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych.
Przeciwciała monoklonalne względem insektycydów neonikotynoidowych do stosowania w praktyce według niniejszego wynalazku, są wytwarzane drogą immunizacji i technik hodowli hybrydomy, ogólnie znanych w dziedzinie. Odpowiednie linie komórkowe hybrydomy są korzystnie wytwarzane przez fuzję komórki wytwarzającej przeciwciało i komórki szpiczaka pochodzącego od gatunku myszy. Komórkami wytwarzającymi przeciwciała są korzystnie komórki śledziony. Może być stosowana jakakolwiek odpowiednia linia komórkowa szpiczaka, jednakże korzystnie należy zastosować dobrze scharakteryzowaną linię komórkową, spośród wielu ogólnie stosowanych.
Podobnie, przeciwciała poliklonalne względem insektycydów neonikotynoidowych do stosowania w praktyce według niniejszego wynalazku są również wytwarzane z wykorzystaniem technik znanych specjalistom w dziedzinie.
Preparat poliklonalnego przeciwciała IgG, który wiąże co najmniej jeden insektycyd neonikotynoidowy, który to preparat przeciwciała jest wytwarzany sposobem obejmującym etapy:
(a) podawania gospodarzowi zadanej ilości kompozycji zawierającej insektycyd neonikotynoidowy lub jego równoważnik immunologiczny sprzężony z biologicznie dopuszczalnym nośnikiem proteinowym, (b) pobranie surowic od gospodarza oraz (c) oczyszczanie przeciwciała IgG zawartego w surowicach.
Równoważnik immunologiczny przeciwciała ma zdolność, jeśli jest wprowadzony do organizmu gospodarza, wywoływania wytwarzania przeciwciała względem antygenu.
Jak zaznaczono powyżej, oznaczenie immunologiczne według niniejszego wynalazku ma zastosowanie zwłaszcza do wykrywania tej ilości insektycydu neonikotynoidowego, która została zaaplikowana na roślinny materiał rozrodczy. Termin „roślinny materiał rozrodczy należy rozumieć jako oznaczający wszystkie wytworzone części rośliny, takie jak nasiona, które mogą być wykorzystane do pomnożenia tych ostatnich oraz wegetatywny materiał roślinny, taki jak rozsady i bulwy (na przykład ziemniaczane). Można tu wymienić np. nasiona (sensu stricto), korzenie, owoce, bulwy, kolby, kłącza oraz części roślin. Kiełkujące rośliny i młode rośliny, które przeszczepiano po wykiełkowaniu lub po wyłonieniu z gleby, mogą również być wzmiankowane. Te młode rośliny mogą być chronione przed przeszczepieniem drogą pełnego lub częściowego zanurzania.
W jednej praktycznej realizacji, insektycyd neonikotynoidowy, który może być wykrywany w oznaczeniu wedł ug niniejszego wynalazku, jest przedstawiony wzorem
PL 205 061 B1
R2 R1 i i
w którym
A oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;
R i R3 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil;
R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil, lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolidynowy lub oksadiazynowy; oraz X oznacza N-NO2 lub N-CN.
W innej praktycznej realizacji, insektycyd neonikotynoidowy, który moż e być wykrywany w oznaczeniu wedł ug niniejszego wynalazku, jest przedstawiony wzorem
w którym A, R3 i X są zdefiniowane jak powyżej dla wzoru (I).
W korzystnej praktycznej realizacji, w oznaczeniu immunologicznym wedł ug niniejszego wynalazku wykorzystuje się przeciwciała poliklonalne dla insektycydu neonikotynoidowego. Te przeciwciała można otrzymać z surowic immunizowanych zwierząt. Immunizacji można dokonywać poprzez wstrzyknięcie immunogenu (koniugat hapten-antygeniczny PPD) gatunkowi wytwarzającemu przeciwciało, zwykle ssakowi, korzystnie królikowi lub owcy. Zwykle po pierwotnej iniekcji następuje seria kolejnych iniekcji wspomagających w celu zmaksymalizowania reakcji przeciwciał. Optymalnie harmonogram iniekcji obejmuje wielokrotne dawki podawane samicom białych królików nowozelandzkich. Ilość wstrzykniętego immunogenu jest zróżnicowana, ale musi być odpowiednia do wytworzenia wykrywalnej ilości przeciwciał. Wytwarzanie przeciwciał może być weryfikowane poprzez analizowanie surowic uzyskanych w próbach krwawienia z użyciem EIA, ELISA lub pośredniego fluorescencyjnego oznaczenia immunologicznego.
Te same znaczniki używane w znanych oznaczeniach immunometrycznych mogą być użyte do znakowania haptenu stosowanego w niniejszym wynalazku. Wśród tych można wymienić cząsteczki reporterowe (RM), w tym enzymy, takie jak fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa oraz β-galaktozydaza. Ponadto, mogą być użyte znaczniki fluorescencyjne, luminescencyjne lub radioaktywne, takie jak fluoresceina, rodamina, luminol, akrydyna i izotopy radioaktywne 125l, itd., lub koloidalne cząstki np. złota lub selenu itd. Wreszcie fluorofory chelatowe lantanowców, takie jak europu i terbu, mogą być użyte do generowania szybkich sygnałów fluorescencyjnych. Najbardziej typowymi markerami enzymatycznymi są peroksydaza chrzanowa (HRP) i fosfataza alkaliczna.
W jednej praktycznej realizacji stosuje się spektrofotometr do wykrywania zawartości neonikotynoidu w próbce. Jednakże, sposoby według niniejszego wynalazku mogą być zaadaptowane przez specjalistę w dziedzinie tak, aby wykorzystywać inne rodzaje detektorów chromogenicznych. Podobnie, wykrywalny produkt reakcji nie jest ograniczony do chromoforów, ale obejmuje inne znaczniki ujawnione powyżej.
Stwierdzono, że hapteny o poniższych wzorach (IA), (IB) i (IIA) są użyteczne do wytwarzania antygenicznych koniugatów neonikotynoidowych (immunogenów) i oznaczanych koniugatów:
Hapten (IA)
R2 R1
w którym
A oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il; R3 oznacza wodór lub C1-C4alkil;
PL 205 061 B1
R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil, lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolidynowy lub oksadiazynowy;
n oznacza liczbę cał kowitą od 1 do 5 (korzystnie liczbę cał kowitą od 3 do 5); oraz X oznacza N-NO2 lub N-CN.
E oznacza pojedyncze wiązanie kowalencyjne lub jest fragmentem spinają cym o wzorze -(CH2)m-, w którym m oznacza liczbę cał kowitą od 1 do 3.
P r z y k ł a d 1: Hapten (IIIA)
3 w którym A, R3, X i n są zdefiniowane jak dla wzoru (IA). Hapten (IIIB)
Hapteny o wzorach (IIIA) i (IIIB) można otrzymać przez analogię do poniższej metodologii:
PL 205 061 B1
Żądany hapten (IIIA) lub (IIIB) otrzymuje się z użyciem odpowiedniej pochodnej 2-aminoetanotiolu wybranej spośród związków o wzorach
w których R ma znaczenie podane powyżej dla wzoru (I).
Poniższe hapteny okazały się szczególnie użyteczne w praktycznym zastosowaniu niniejszego wynalazku:
PL 205 061 B1
Cl
Ν, +Ό OH
Ν
I _
Ο w których n w każdym przypadku oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5; korzystnie n oznacza liczbę całkowitą od 3 do 5.
Antygeniczne koniugaty neonikotynoidowe (immunogeny) i oznaczane koniugaty mogą być wytworzone przez sprzęganie neonikotynoidowego haptenu pestycydowego z cząsteczką nośnika lub cząsteczką reporterową, w zależności od sytuacji, z użyciem technik znanych specjalistom w dziedzinie. Przyjęte są dwa zasadnicze podejścia. W pierwszym wykorzystuje się linkery, które stają się częścią koniugatu. Linkery te są homobifunkcyjne lub heterobifunkcyjne i obejmują te zdolne do tworzenia na przykład wiązań disiarczkowych za pośrednictwem grup tiolowych fragmentów cysteinowych w substratach proteinowych lub tworzenia wiązań amidowych pomiędzy N-terminalnymi grupami aminowymi lub grupami aminowymi łańcuchów bocznych lub resztami lizynowymi oraz aktywowanymi fragmentami acylowymi, takimi jak estry sukcynoimidylowe. Ogólnie, podejście to angażuje wysoce reaktywne grupy funkcyjne linkera i jest zasadnie ułatwione w odniesieniu do substratów sprzęgania. Jednakże, często jest użyteczne wykorzystywanie grup funkcyjnych, które mogą być mniej reaktywne, takich jak te zdolne do tworzenia hydrazonów.
Drugie podejście, szczególnie użyteczne przy sprzęganiu dwóch fragmentów proteinowych, wykorzystuje reagent odwadniający, taki jak karbodiimid, dla uzyskania tworzenia na przykład nowych wiązań peptydowych w reakcji fragmentu karboksylowego jednego substratu sprzęgania z wolną grupą aminową drugiego. W tym przypadku, reagent nie staje się częścią koniugatu.
Reakcja nie jest szczególnie ułatwiona, ponieważ grupa karboksylowa nie jest aktywowana; karbodiimid dostarcza aktywny związek pośredni i przesuwa równowagę odciągając formalnie cząsteczkę wody z utworzeniem wiązania peptydowego.
Oba podejścia do sprzęgania na ogół realizuje się w rozpuszczalnikach wodnych, ponieważ materiał proteinowy tworzący koniugat łatwo ulega denaturacji. Proteiny są trwałe w środowisku wodnym, natomiast wiadomo, że ulegają denaturacji nawet w takich rozpuszczalnikach jak etanol, który mógłby być uważany za w zasadzie zbliżony do środowiska wodnego. A także, komponenty koniugatu proteinowego zazwyczaj są raczej źle rozpuszczalne w rozpuszczalnikach niewodnych.
W praktyce według niniejszego wynalazku okazały się użyteczne koniugaty haptenów o poniższym wzorze:
w którym A, R1 R2, R3, n i X mają znaczenia podane dla powyższego wzoru (IA) i PR oznacza resztę proteinową: (1) cząsteczki nośnej, takiej jak pochodna oczyszczonej proteiny (PPD, tuberkulina) z wirusa Diptheria, albuminy surowicy bydlęcej, albuminy surowicy ludzkiej, albuminy jaja kurzego lub hemocyjaniny keyhole limpet w przypadku immunogenu lub (2) cząsteczki reporterowej (RM), takiej jak fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa i β-galaktozydaza.
Ponadto, podobnie użyteczne są koniugaty haptenów o wzorze:
PL 205 061 B1 w którym A, R1, R2, R3, E i X mają znaczenia podane dla powyż szego wzoru (IB).
Poniższe koniugaty okazały się szczególnie użyteczne w praktyce według niniejszego wynalazku:
w których w każ dym przypadku n oznacza liczbę cał kowitą od 1 do 5; korzystnie n oznacza liczbę całkowitą od 3 do 5.
Nieznakowane przeciwciało poliklonalne, używane w sposobie według niniejszego wynalazku do wiązania antygenicznego neonikotynoidu lub koniugatu hapten-RM w testowanej próbce, może być immobilizowane na jakimkolwiek z nośników zwykle stosowanych w oznaczeniach immunometrycznych. Spośród nich może być stosowana bibuła filtracyjna, perełki lateksowe, lub polistyrenowe oraz polietylenowe, polistyrenowe, polipropylenowe lub inne odpowiednie płytki mikrostudzienkowe lub probówki. Nośnik ten może być wykonany z jakiegokolwiek polimeru pochodzenia naturalnego lub syntetycznego, lub materiału bezpostaciowego, takiego jak szkło. Dogodnie, błony nitrocelulozowe lub nylowe są stosowane do pasków reaktywnych, oraz tworzywa poliwinylowe, polipropylenowe, polistyrenowe i inne masy plastyczne do perełek lub mikropłytek. Mogą być również stosowane żele i cząstki agarozowe, akrylamidowe lub lateksowe. W dodatku, dowolne spośród urządzeń immunochromatograficznych, pasków testowych i urządzeń z przepływem bocznym znanych w dziedzinie może być zaadaptowane do sposobu według niniejszego wynalazku. Spośród odpowiednich urządzeń z przepływem bocznym moż e być wymienione na przykład urządzenie typu ujawnionego w opisie patentowym USA 4.366.241. Techniki osadzania przeciwciał na takich materiałach są ogólnie znane specjalistom w dziedzinie. Odpowiednim źródłem pozyskania przeciwciał osadzonych na nośniku jest na przykład Beacon Analytical Systems, Inc. (Portland, Maine).
W celu przygotowania próbki nasion do oznaczenia, reprezentatywne podpróbki nasion z partii zaprawianej neonikotynoidem (na przykład od pięciu do stu gramów nasion odmiany rzepaku (canola); od dziesięciu do dwustu gramów nasion sorga, pszenicy, bawełny, kukurydzy paszowej lub kukurydzy słodkiej) dysperguje się w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak aceton, acetonitryl, etanol, izoproPL 205 061 B1 panol, metanol lub mieszaniny tych rozpuszczalników z różną zawartością procentową wody. Odpowiednie mieszaniny zawierają na przykład od 1 do 50% MeOH/H2O i od 1 do 20% acetonitrylu/H2O. Zdyspergowane nasiona miesza się zawirowywując ręcznie, a następnie umieszcza w łaźni ultradźwiękowej na około dwadzieścia minut, po czym dalej miesza ręcznie. Zawartość pozostawia się do osadzenia. Odmierzoną porcję cieczy ekstraktu oddziela się i dodaje do znanej ilości roztworu, na przykład 1% acetonitrylu w wodzie. Ekstrakt dalej rozcieńcza się, aby doprowadzić stężenie wyekstrahowanego neonikotynoidu do zakresu krzywej kalibracji. Użyteczne okazały się rozcieńczenia od 1:1000 do 1:60000. Przeprowadzenie oznaczenia immunologicznego zajmuje około trzydzieści pięć minut. Ekstrakcja i przygotowanie ekstraktu do analizy zajmuje w przybliżeniu trzydzieści minut. A zatem próbka nasion może być wyekstrahowana i zanalizowana w około godzinę i pięć minut. W jednej z praktycznych realizacji do dwóch próbek nasion (przy do pięciu podpróbkach na próbkę nasion) można analizować jednocześnie.
Za pomocą oznaczeń immunologicznych według niniejszego wynalazku można wykryć stężenia insektycydów neonikotynoidowych od około dziesięciu tysięcy części na milion do połowy części na miliard. Jednakże, sposób może być zastosowany w przypadku obecności dowolnej ilości insektycydu neonikotynoidowego, o ile ilość insektycydu neonikotynoidowego w próbce lub ekstrakcie próbki mieści się lub może być odpowiednio rozcieńczona tak, aby mieścić się w zakresie krzywej kalibracji.
Otrzymywanie antygenu, wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych i oznaczenia immunologiczne są bardziej szczegółowo zilustrowane w poniższych przykładach, które jednak nie ograniczają zakresu wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1 - Procedura syntetyczna prowadząca do haptenu tiametoksamowego
PL 205 061 B1
1.1.2-Metylo-1-nitroizomocznik
Rozpuszcza się siarczan O-metyloizomocznika (38,5 g) w mieszaninie kwasu azotowego (120 ml) kwasu siarkowego (280 ml) w 0°C i miesza przez 2 godziny w 0°C. Ostroż nie wylewa się mieszaninę na pokruszony lód, mieszając, a następnie oddziela pokruszony lód drogą sączenia. Rozpuszcza się igłopodobne kryształy w octanie etylu i alkalizuje roztwór dodając węglan potasu. Roztwór suszy się siarczanem magnezu i sączy. Przesącz zatęża się otrzymując biały proszek (5 g).
1.2
Przygotowuje się roztwór z 3 g chlorowodorku 4-aminomaślanu metylu (1.1a) i 15 ml wody. pH koryguje się do 11 dodając kroplami 2N NaOH, chłodząc roztwór w łaźni z lodem. Kolbę reakcyjną zaopatruje się w elektrodę pH-metrową i termometr, uzyskany klarowny, zasadowy roztwór miesza energicznie i dodaje małymi porcjami 2-metylo-1-nitroizomocznik (2,38 g) tak, aby utrzymać temperaturę roztworu poniżej 2°C. Po zakończeniu dodawania, reakcje miesza się przez 1,5 godziny w 0°C; należy zwrócić uwagę na stabilizację pH przy 9,6. Dodaje się THF (1 ml) i miesza przez kolejne godziny. Reakcję rozcieńcza się wodą i wylewa do octanu etylu. Po oddzieleniu fazy organicznej, frakcje organiczną suszy się siarczanem magnezu i sączy roztwór. Przesącz zatęża się dostarczając klarowny olej. Chromatografia typu flash surowego oleju na żelu krzemionkowym z Lucją 3:1 dichlorometanem/acetonitrylem dostarcza 750 mg oczekiwanego produktu w postaci białego ciała stałego.
1.3.
Produkt z 1.2 (1,44 g) łączy się z paraformaldehydem (422 mg), kwasem metanosulfonowym (0,023 ml) i kwasem mrówkowym (10 ml) i ogrzewa w 55°C przez 15 godzin. Reakcję zatęża się pod próżnią. Uzyskany brązowy olej zawiesza się w toluenie i azeotropowo odpędza się roztwór do sucha. Uzyskany roztwór rozpuszcza się w 1:1:1 THF/dioksanie/acetonitrylu i zadaje nadmiarem diazometanu. Roztwór ten miesza się przez 30 minut i zadaje reakcje kwasem octowym. Mieszaninę reakcyjną zatęża się do oleju. Olej rozprowadza się w octanie etylu, przemywa rozcieńczonym roztworem kwaśnego węglanu sodu, suszy siarczanem magnezu i ponownie zatęża do oleju. Olej oczyszcza się za pomocą chromatografii typu flash w 3:1 dichlorometanie/acetonitrylu dostarczając 658 mg oczekiwanego estru oksadiazynoaminomasłowego (1.3) w postaci klarownego oleju.
1.4.
Produkt z 1.3 (1,1 g) rozpuszcza się w acetonitrylu (50 ml) i dodaje 3 g węglanu potasu. Dodaje się chlorometylochlorotiazol w jednej porcji i ogrzewa mieszaninę reakcyjną w 55°C przez 20 godzin. Mieszaninę reakcyjną chłodzi się do temperatury pokojowej i sączy oddzielając ciała stałe. Uzyskany brązowy przesącz zatęża się do oleju. Olej ten oczyszcza się za pomocą chromatografii typu flash w 3:1 dichlorometanie/acetonitrylu dostarczają c 894 mg oczekiwanego zwią zku w postaci ż ó ł tobrązowego oleju.
1.5.
Związek 1.4 (372 mg) rozpuszcza się w 8 ml stężonego HCI i 1 ml wody, i miesza się przez 6 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się wodą i ostrożnie alkalizuje dodając 1N NaOH do uzyskania pH 4,5. Ekstrahuje się octanem etylu i suszy frakcję organiczną siarczanem magnezu. Zatęża się wysuszoną frakcję organiczną do oleju i oczyszcza za pomocą chromatografii typu flash w 1:1 dichlorometanie/acetonitrylu uzyskując oczekiwany produkt 1.5 (100 mg).
P r z y k ł a d y 2-5. Hapteny tiametoksamowe
Metodologia syntezy z przykładu 1 została wykorzystana do otrzymania następujących haptenów tiametoksamowych przedstawionych w tablicy 1, po zastąpieniu półproduktu 1.1a odpowiednim analogiem o wzorze NH2(CH2)nCO2R (1.1b), w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5 i R oznacza H lub C1-C4alkil.
PL 205 061 B1
T a b l i c a 1
| Przykład | n |
| 2 | 1 |
| 3 | 2 |
| 4 | 4 |
| 5 | 5 |
P r z y k ł a d y 6-9. Hapteny tiametoksamowe
Metodologia syntezy z przykładu 1 została wykorzystana do otrzymania następujących haptenów tiametoksamowych przedstawionych w tablicy 2, po zastąpieniu półproduktu 1.1a odpowiednim
analogiem o wzorze (1.1c), w którym E oznacza kowalencyjne wiązanie pojedyncze lub fragment spinający -(CH2)m, w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3; R oznacza H lub C1-C4alkil.
T a b l i c a 2
PL 205 061 B1
P r z y k ł a d 10. Procedura syntezy haptenu des-(nitroimino)-tiametoksamowego
Hapten - kwas tiametoksamomasłowy (100 mg, 0,275 mmol) i anizol (6,5 ml) miesza się w 10 ml kolbie okrągłodennej wyposażonej w mieszadełko magnetyczne i chłodnicę zwrotną. Kolbę umieszcza się w łaźni olejowej i ogrzewa w 165°C przez 2 godziny. Anizol usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem w 50°C przez 5 godzin. Uzyskany oleisty produkt (90,2 mg) wykazał czystość 93% według analizy HPLC.
Charakterystyka, dane spektralne:
HPLC: Keystone Scientific Aquasil C-18 5μ (25 x 0,46 cm); acetonitryl : 20 mM kwas fosforowy (40:60); 1,0 ml/min.; T=40°C; UV przy 240 nm (BW = 100 nm); czas analizy: 13 min.; czas retencji: 4,6 min. TLC: (żel diolowy) dichlorometan/acetonitryl, 2:1 Rf = 0,25.
1H NMR (CD3CN, 300MHz): δ 7,43 (t, 1H), 4,78 (s, 4H), 4,75 (s, 4H), 4,48 (d, 2H), 3,29 (t, 2H), 2,27 (t, 2H), 1,73 (q, 2H).
Widmo masowe EI/DEP: m/z 319 (M+).
Analiza elementarna, obliczono: C, 41,32; H, 4,41; N, 13,14;
znaleziono: C, 40,13; H, 4,43; N, 12,99.
P r z y k ł a d y 11-18. Hapteny des-(nitroimino)-tiametoksamowe
Metodologia syntezy z przykładu 10 została wykorzystana do otrzymania następujących haptenów des-(nitroimino)-tiametoksamowych przedstawionych w tablicy 3, po zastąpieniu związku otrzymanego w przykładzie 1 odpowiednim analogiem, związkiem z przykładów 2-9.
T a b l i c a 3
Cl ί°Ί Νγ>
ο
| Przykład | R5 |
| 11 | -CH2CO2H |
| 12 | -ch2ch2co2h |
| 13 | -ch2ch2ch2ch2co2h |
| 14 | -ch2ch2ch2ch2ch2co2h |
| 15 | \ CO,H V |
PL 205 061 B1
P r z y k ł a d y 19-27. Hapteny imidakloprydowe
Metodologia syntezy z przykładu 1 została wykorzystana do otrzymania następujących haptenów imidakloprydowych przedstawionych w tablicy 4, z użyciem pochodnej nitroguanidylowej otrzymanej w 1.2 lub jej analogu otrzymanego po zastąpieniu półproduktu 1.1a odpowiednim analogiem o wzorze 1.1b lub 1.1c, wedł ug opisu z przykł adów 2-9.
T a b l i c a 4
I
Ο
| Przykład | R6 |
| 19 | -CH2CO2H |
| 20 | -ch2ch2co2h |
| 21 | -ch2ch2ch2co2h |
| 22 | -ch2ch2ch2ch2co2h |
| 23 | -ch2ch2ch2ch2ch2co2h |
| 24 | \ co2h V |
| 25 | |
| 26 | Vco2h |
| 27 | a/ O™ |
PL 205 061 B1
P r z y k ł a d y 28-36. Hapteny des-(nitroimino)-imidakloprydowe
Metodologia syntezy z przykładu 10 została wykorzystana do otrzymania następujących haptenów des-(nitroimino)-imidakloprydowych przedstawionych w tablicy 5, po zastąpieniu związku otrzymanego w przykł adzie 1 odpowiednim analogiem, zwią zkiem z przykł adów 19-27.
T a b l i c a 5
Cl ν
| Przykład | R7 |
| 28 | -CH2CO2H |
| 29 | -ch2ch2co2h |
| 30 | -ch2ch2ch2co2h |
| 31 | -ch2ch2ch2ch2co2h |
| 32 | -ch2ch2ch2ch2ch2co2h |
| X co2h | |
| 33 | V |
| 34 | u X-CO,H |
| 35 | V |
| 36 | \,CO,H |
| W |
P r z y k ł a d y 37-45. Hapteny klotiadynowe
Metodologia syntezy z przykładu 1 została wykorzystana do otrzymania następujących haptenów klotiadynowych przedstawionych w tablicy 6, z użyciem pochodnej nitroguanidylowej otrzymanej w 1.2 lub jej analogu otrzymanego po zastą pieniu półproduktu 1.1a odpowiednim analogiem o wzorze 1.1 b lub 1.1c, według opisu z przykładów 2-9.
PL 205 061 B1
T a b l i c a 6
Cl ΝχΛ/ΝΗ ΝΗ 8
Ii r
Ν' +<O N I
O
| Przykład | R8 |
| 37 | -CH2CO2H |
| 38 | -ch2ch2co2h |
| 39 | -ch2ch2ch2co2h |
| 40 | -ch2ch2ch2ch2co2h |
| 41 | -ch2ch2ch2ch2ch2co2h |
| 42 | \ co,h V |
| 43 | |
| 44 | ^<^co2h |
| 45 |
P r z y k ł a d y 46-54. Hapteny des-(nitroimino)-klotiadynowe
Metodologia syntezy z przykładu 10 została wykorzystana do otrzymania następujących haptenów des-(nitroimino)-klotiadynowych przedstawionych w tablicy 7, po zastąpieniu związku otrzymanego w przykładzie 1 odpowiednim analogiem, związkiem z przykładów 37-45.
PL 205 061 B1
P r z y k ł a d y 55-63. Hapteny tiakloprydowe
Metodologia syntezy podana dla haptenów o wzorach (IIIA) i (IIIB) została wykorzystana do otrzymania następujących haptenów klotiadynowych przedstawionych w tablicy 8.
T a b l i c a 8
PL 205 061 B1
P r z y k ł a d 64. Otrzymywanie immunogenu tiametoksamowego
64.1
Przygotowuje się roztwór oczyszczonej pochodnej proteinowej (PPD, tuberkulina) w 0,01 PBS, pH 7,4 do stężenia 1 mg/ml. pH próbki 0,5 ml tego roztworu koryguje się do 4,5-5,0 za pomocą 0,1M HCI.
64.2
Rozpuszcza się hapten tiametoksamowy z przykładu 1 (1 mg) w 250 μl 0,1 M kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego, pH 4,5. Łączy się roztwory haptenu i PPD.
64.3
Rozpuszcza się 1 mg chlorowodorku 1-(dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (EDC) w 100 μl destylowanej, dejonizowanej wody. Natychmiast dodaje się roztwór EDC do roztworu hapten-PPD z 3.2. Miesza się roztwór hapten-PPD-EDC rotacyjnie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną przenosi się do worka do dializy o progu przepuszczalności dla ciężaru cząsteczkowego 1000-2000 daltonów. Dializuje się wyczerpująco względem 2 litrów PBS w 4°C z trzema zmianami/dziennie przez czterdzieści osiem godzin.
P r z y k ł a d 65. Otrzymywanie immunogenu imidakloprydowego
Stosuje się metodologię z przykładu 64 dla otrzymania immunogenu imidakloprydowego z użyciem haptenu z przykładu 21.
P r z y k ł a d 66. Otrzymywanie immunogenu klotiadynowego
Stosuje się metodologię z przykładu 64 dla otrzymania immunogenu klotiadynowego z użyciem haptenu z przykładu 39.
PL 205 061 B1
P r z y k ł a d 67. Otrzymywanie immunogenu tiakloprydowego
Stosuje się metodologię z przykładu 64 dla otrzymania immunogenu klotiadynowego z użyciem haptenu z przykładu 57.
P r z y k ł a d 68. Harmonogram immunizacji oraz pobierania przeciwciał.
Do początkowej immunizacji rozpuszcza się immunogen z przykładu 64 w kompletnym adiuwancie Freund'a. Szczepi się samice białych królików nowozelandzkich. Wstrzykuje się każdorazowo w przybliżeniu 25 μΙ immunogenu. Owce immunizuje się podobnie, z tym wyjątkiem, że każdorazowo wstrzykuje się w przybliżeniu 38 μl immunogenu.
W kolejnych immunizacjach immunogen rozpuszcza się w niepełnym adiuwancie Freund'a.
Zwierzęta pozostawia się w spokoju przez cztery tygodnie pomiędzy immunizacjami i pobiera krew w dziesięć dni po immunizacji.
Zastrzyki wspomagające podaje się zwierzętom i pobiera krew przez dziewięć miesięcy, po czym zwierzęta wykrwawia się.
Przeciwciała poliklonalne pozyskuje się technikami znanymi specjalistom w dziedzinie.
P r z y k ł a d 69. Otrzymywanie koniugatów hapten-enzym
69.1
Hapten tiametoksamowy z przykładu 1 (3,1 mg), N-hydroksysukcynimid (NHS) (4,0 mg) i EDC (4,6 mg) wprowadzono do małej fiolki. Materiały te suszono w łagodnym strumieniu azotu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
69.2
Suchy dimetyloformamid (2,0 ml) dodano i mieszaninę poddawano działaniu ultradźwięków przez 1 minutę. Uzyskany roztwór inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej.
69.3
Peroksydazę chrzanową (8,5 mg) rozpuszczono w buforze węglanowym (2,0 ml, 0,05M pH 9,6) w małej fiolce. Fiolkę umieszczono w łaźni z lodem.
69.4
W sumie 100 μl roztworu hapten-NHS-EDC z 6,2 dodawano powoli przez 1 godzinę i mieszaninę inkubowano mieszając przez 2 godziny.
Mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez kolumnę z Sephadex G-25M równoważoną PBS (0,01 M, pH 7,2). Koniugat enzymowy zebrano w pierwszych 3,0 ml eluatu i dodano równoważną objętość glicerolu; całość przechowuje się w -20°C.
P r z y k ł a d 70. Oznaczenie nasion odmiany rzepaku (canola) zaprawianych tiametoksamem.
Porcje ekstraktu nasion rozcieńcza się 1% MeOH/H2O aż spodziewane stężenie tiametoksamu zostanie doprowadzone do zakresu krzywej kalibracji, 0,5 do 120 części na miliard. Probówki powlekane przeciwciałem znakuje się i umieszcza na statywie tak, że pierwsza i ostatnia probówka stanowią wzorce, a pozostałe wzorce i próbki są wymieszane ze sobą. Uchwyty statywu mocują każdą probówkę tak, że statyw może być przewracany bez wypadania probówek. Porcję wzorca lub próbki (0,5 ml) dodaje się do wszystkich odpowiednich probówek. Statyw jest delikatnie wstrząsany tak, aby wymieszać zawartość wszystkich probówek. Probówki inkubuje się przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Statyw przewraca się, aby zdekantować zawartość wszystkich probówek. Do wszystkich probówek dodaje się destylowaną wodę do przelewania się, z użyciem tryskawki z przestawną głowicą, i ciecz z przemycia dekantuje się. Probówki przemywa się jeszcze trzy razy. Po ostatnim przemyciu statyw odwraca się i probówki delikatnie płucze się nad ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar cieczy płuczącej. Do wszystkich probówek dodaje się substrat enzymatyczny (0,5 ml), a następnie probówki inkubuje się przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Statyw wytrząsa się delikatnie co 2,5 minuty w trakcie inkubowania. Do wszystkich probówek dodaje się kwaśny roztwór zatrzymujący (1M, HCI, 0,5 ml) w celu zakończenia generowania sygnału. Jak przedstawiono w tablicy 10, absorbancję produktu reakcji mierzy się przy 450 nm. Absorbancje wzorców wykorzystuje się do stworzenia krzywej kalibracji, funkcji regresji o postaci Y + m Ln(X) + B. Absorbancję każdej próbki wprowadza się do funkcji w celu określenia stężenia pestycydu neonikotynoidowego w rozcieńczonej próbce. Uzyskane stężenie mnoży się przez współczynnik rozcieńczania celem obliczenia ilości pestycydu neonikotynoidowego w pierwotnej próbce.
PL 205 061 B1
T a b l i c a 10
| Typowa krzywa wzorcowa dla immunologicznego oznaczania tiametoksamu | |
| 1Stężenie tiametoksamu | Absorbancja przy 450 nm (reakcja analityczna) |
| 120 | 0,3145 |
| 20 | 0,6636 |
| 3 | 1,0283 |
| 0,5 | 1,3618 |
1Jednostki: części na miliard
Funkcja określająca reakcję wzorców tiametoksamowych jest generowana drogą analizy regresyjnej. Taki zbiór danych dostarcza krzywą wzorcową Y = -0,191 Ln(X) + 1,23, r = -0,999, w której Y = reakcję analityczną a X = stężenie wzorców tiametoksamowych.
P r z y k ł a d 71. Test reakcji krzyżowej nasion zaprawianych tiametoksamem.
71.1
Ekstrakcja nasion
Próbki zaprawianych nasion dzieli się na podpróbki przez randomiczne dodawanie 50 g bawełny, kukurydzy paszowej, sorga, kukurydzy jadalnej i pszenicy lub 40 g odmiany rzepaku (canola) do 8-uncjowych naczyń z szerokim otworem. Odmianę rzepaku (canola) podpróbkowuje się czterokrotnie; w przypadku innych nasion stosuje się pięć podpróbek. Dodaje się rozpuszczalnik (150 ml) i szczelnie mocuje przykrywkę. Bawełnę ekstrahuje się 5% acetonitrylem w wodzie, natomiast inne nasiona wymagają układu rozpuszczalnikowego 20% metanol w wodzie. Naczynie energicznie wytrząsa się ręcznie przez 30 sekund, a następnie umieszcza w ultradźwiękowej łaźni wodnej w temperaturze pokojowej na 20 minut. Próbki wytrząsa się powtórnie, tak jak podano uprzednio, zawartość każdego naczynia pozostawia się do osiadania na około 5 minut i porcję (0,10 ml) pobiera się do analizy. Porcje rozcieńcza się w 1% metanolu w wodzie, aby doprowadzić resztkowe zawartości do zakresu krzywej wzorcowej.
71.2. Oznaczenie immunologiczne
Powlekane przeciwciałami polistyrenowe probówki hodowlane znakuje się i umieszcza na statywie tak, że pierwsza i ostania probówka są wzorcami, a pozostałe wzorce i próbki są wymieszane. Próbkę i roztwory wzorcowe (0,50 ml) dodaje się do odpowiednich probówek. Dodaje się podobną objętość koniugatu enzymowego. Statyw delikatnie wstrząsa się, aby wymieszać roztwory i pozostawia się do inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zawartość wszystkich probówek usuwa się poprzez odwrócenie statywu nad płytą ze stali nierdzewnej. Każdą probówkę przemywa się do przelewania wodą destylowaną. Statyw przewraca się nad zlewem w celu usunięcia wody z przemycia. Przemywanie powtarza się cztery razy. Następnie statyw odwraca się i opróż nia delikatnie nad ręcznikiem papierowym w celu usunię cia wię kszoś ci pozostał ej cieczy z przemycia (pewna ilość cieczy pozostał a w probówkach nie wpł ywa na wyniki oznaczeń ). Do probówek dodaje się roztwór substratu enzymowego (0,50 ml), które następnie inkubuje się przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Statyw delikatnie strząsa się w odstępach 2,5 minutowych, aby zapewnić, że enzym ma wystarczający dostęp enzymu do substratu. Generowanie sygnału o barwie błękitnej kończy się po dodaniu kwasowego roztworu zatrzymującego (0,50 ml). Absorbancję roztworu z każdej probówki mierzy się spektrofotometrycznie przy 450 nm. Stężenie substancji analizowanej w próbkach określa się z funkcji regresyjnej o postaci y = m In (x) + b.
71.3. Określenie reaktywności krzyżowej.
Reaktywność krzyżową, lub specyficzność oznaczenia immunologicznego ocenia się w celu określenia, czy inne substancje testowane znajdujące się w zaprawianych nasionach wpływają na oznaczenie tiametoksamu. Substancje testowane rozpuszcza się w 1% metanolu w wodzie, do stężeń w zakresie od 1000 do 0,01 ng/ml. Porcje dla każdego stężenia analizuje się tak jak ujawniono powyżej. Reaktywność każdej substancji testowanej w tym zakresie określa się jak ujawniono uprzednio w Brady, J.F; Turner, J.; Skinner, D.H. „Application of a triasulfuron enzyme immunoassay to the analysis of incurred residues in soil and water samples, J. Agric. Food Chem., 1995, 43: 2542-2547.
PL 205 061 B1
71.4. Wyniki.
Spośród analizowanych substancji testowanych tylko tiametoksam okazał się znacząco reaktywny w oznaczeniu immunologicznym (poniższa tablica 9). A zatem niniejsze oznaczenie immunologiczne jest specyficzne względem tiametoksamu.
Podpróbki zaprawionych partii nasion analizowano za pomocą oznaczenia immunologicznego i HPLC. Wyniki tych analiz przedstawiono w tablicy 11. Tablica 11 przedstawia korelację średnich wyników oznaczenia immunologicznego z użyciem przeciwciał poliklonalnych oraz analiz HPLC dla czterdziestu próbek nasion pod kątem zawartości tiametoksamu. Najlepiej dopasowana linia regresji wskazuje, że uzyskuje się podobne wyniki za pomocą każdej z tych metod.
T a b l i c a 9
Reaktywność krzyżowa w oznaczeniu immunologicznym tiametoksamu
| Substancja oznaczana | 1 Reaktywność w % względem tiametoksamu |
| Tiametoksam | 100 |
| Klotiadyna | <1,0 |
| Imidaklopryd | 2NR |
| Chlorpiryfos | NR |
| Difenokonazol | NR |
| Fludioksonil | NR |
| Pentachloronitrobenzen | NR |
| Metalaksyl | NR |
| Mefenoksam (R-Metalaksyl) | NR |
| Fluksofenim | NR |
| Karboksyna | NR |
| Kaptan | NR |
| Systan (Myklobutanil) | NR |
| TCMTB | NR |
| Pirymifos-metyl | NR |
| Tiofanat-metyl | NR |
1 Reaktywność substancji badanych względem tiametoksamu w %.
2 NR, niereaktywny.
Specjaliści w dziedzinie zauważą, że niniejszy wynalazek może mieć wiele odmian i modyfikacji, które nie oddalają się od idei lub zakresu wyżej ujawnionego wynalazku.
T a b l i c a 11
Porównanie wyników analitycznych uzyskanych z oznaczeń immunologicznych i z HPLC
| Wykryta zawartość tiametoksamu, części na milion | ||||||||
| Nasiona | Próbka | Oznaczenie immunologiczne 1 Analizy powtórzeniowe | 1Średnia | HPLC | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| Rzepak | 294642 | 3517 | 2586 | 3403 | 4139 | 4327 | 3594 | 3724 |
| (odmiana kana- | 294681 | 4191 | 3416 | 3643 | 3591 | 4718 | 3912 | 3915 |
| dyjska, canola) | 294682 | 3034 | 3299 | 2687 | 3534 | 4254 | 3362 | 3769 |
| 294683 | 3264 | 3104 | 3614 | 3860 | 3445 | 3457 | 3875 | |
| 294684 | 2761 | 3367 | 3617 | 3685 | 3409 | 3368 | 3920 | |
| Sorgo | 294643 | 1659 | 1865 | 1662 | 1661 | 1929 | 1755 | 1732 |
| 294643 | 1613 | 1654 | 1678 | 1771 | 1998 | 1743 | 1732 | |
| 294685 | 1348 | 1855 | 1601 | 1984 | 1979 | 1753 | 1853 | |
| 294686 | 1717 | 2054 | 1966 | 1981 | 1980 | 1940 | 1870 | |
| 294687 | 1943 | 1880 | 2244 | 1767 | 2165 | 2000 | 1861 | |
| 294688 | 1972 | 1821 | 1746 | 1864 | 1626 | 1806 | 1923 |
PL 205 061 B1 cd. tablicy 11
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| Pszenica | 294644 | 651 | 664 | 611 | 573 | 612 | 622 | 624 |
| 294689 | 628 | 688 | 684 | 569 | 741 | 662 | 712 | |
| 294689 | 690 | 732 | 655 | 753 | 710 | 708 | 712 | |
| 294690 | 930 | 817 | 690 | 794 | 898 | 826 | 745 | |
| 294691 | 757 | 565 | 625 | 700 | 806 | 691 | 731 | |
| 294692 | 1057 | 994 | 893 | 740 | 845 | 906 | 731 | |
| 294692 | 915 | 861 | 604 | 658 | 599 | 727 | 731 |
1Analizy powtórzeniowe (w sumie pięć analiz) dla każdej próbki przeprowadzono za pomocą oznaczenia immunologicznego. Średnią wartość dla wszystkich analiz immunologicznych danej próbki porównano z wynikiem z HPLC dla tej próbki za pomocą analizy regresyjnej. Uzyskano funkcję regresji Y = 1,00 X +10,9, r = 0,976, N = 40, gdzie Y = ppm tiametoksamu wykrytego w oznaczeniu immunologicznym, a X = ppm tiametoksamu wykrytego przez HPLC.
T a b l i c a 11
Porównanie wyników analitycznych uzyskanych z oznaczeń immunologicznych i z HPLC (c.d.)
| Wykryta zawartość tiametoksamu, części na milion | ||||||||
| Nasiona | Próbka | Oznaczenie immunologiczne 1 Analizy powtórzeniowe | 1Średnia | HPLC | ||||
| Bawełna | 294645 | 2149 | 2091 | 2309 | 2320 | 2505 | 2275 | 2694 |
| 294677 | 2774 | 2477 | 2602 | 3369 | 3329 | 2910 | 2829 | |
| 294678 | 2220 | 3587 | 2945 | 2870 | 2853 | 2895 | 2907 | |
| 294679 | 2427 | 3275 | 2471 | 2795 | 2538 | 2701 | 2757 | |
| 294680 | 1967 | 2006 | 2255 | 2056 | 2119 | 2080 | 2933 | |
| 294680 | 2963 | 2750 | 2510 | 2934 | 2481 | 2728 | 2933 | |
| 294645 | 2115 | 2576 | 2865 | 3146 | 2649 | 2670 | 2694 | |
| Kukurydza | 298296 | 469 | 428 | 364 | 375 | 455 | 418 | 390 |
| cukrowa | 298297 | 750 | 390 | 480 | 514 | 499 | 527 | 397 |
| 298298 | 554 | - - | 476 | 426 | 481 | 484 | 368 | |
| 298299 | 456 | 440 | 377 | 412 | 387 | 414 | 372 | |
| 298300 | 448 | 343 | 375 | 388 | 410 | 393 | 385 | |
| 298301 | 3931 | 3625 | 4350 | 4083 | 4485 | 4095 | 3640 | |
| 298302 | 4854 | 5058 | 4558 | 4286 | 5237 | 4798 | 4189 | |
| 298303 | 3431 | 3587 | 3176 | 3835 | 4296 | 3665 | 3657 | |
| 298304 | 5379 | 5428 | 4246 | 4084 | 3697 | 4567 | 3792 | |
| 298305 | 3107 | 4301 | 2881 | 4397 | 4692 | 3876 | 3859 |
1Analizy powtórzeniowe (w sumie pięć analiz) dla każdej próbki przeprowadzono za pomocą oznaczenia immunologicznego. Średnią wartość dla wszystkich analiz immunologicznych danej próbki porównano z wynikiem z HPLC dla tej próbki za pomocą analizy regresyjnej.
T a b l i c a 11
Porównanie wyników analitycznych uzyskanych z oznaczeń immunologicznych i z HPLC (c.d.)
| Wykryta zawartość tiametoksamu, części na milion | ||||||||
| Nasiona | Próbka | Oznaczenie immunologiczne 1 Analizy powtórzeniowe | 1Średnia | HPLC | ||||
| Kukurydza | 298307 | 469 | 464 | 567 | 451 | 422 | 475 | 424 |
| paszowa | 298308 | 409 | 384 | 409 | 422 | 386 | 402 | 389 |
| 298309 | 379 | 408 | 368 | 378 | 333 | 373 | 400 | |
| 298310 | 428 | 395 | 493 | 417 | 552 | 367 | 373 | |
| 298311 | 320 | 407 | 307 | 402 | 398 | 457 | 383 | |
| 298312 | 3050 | 3656 | 2645 | 3622 | 3827 | 3360 | 3038 | |
| 298313 | 4322 | 3694 | 2955 | 3397 | 3185 | 3511 | 3529 | |
| 298314 | 3602 | 3347 | 3804 | 3055 | 3972 | 3556 | 3681 | |
| 298315 | 3563 | 3301 | 3271 | 3445 | 4037 | 3523 | 3712 | |
| 298316 | 4326 | 4903 | 5118 | 4590 | 4873 | 4762 | 3661 |
PL 205 061 B1 1Analizy powtórzeniowe (w sumie pięć analiz) dla każdej próbki przeprowadzono za pomocą oznaczenia immunologicznego. Średnią wartość dla wszystkich analiz immunologicznych danej próbki porównano z wynikiem z HPLC dla tej próbki za pomocą analizy regresyjnej.
Claims (28)
- Zastrzeżenia patentowe1. Przeciwciało użyteczne do oznaczenia immunologicznego próbki w celu oznaczenia zawartości insektycydu neonikotynoidowego, którym to przeciwciałem jest (I) przeciwciało poliklonalne wytworzone poprzez immunizowanie zwierzęcia z użyciem haptenu neonikotynoidowego sprzężonego z immunogeniczną proteiną nośną i które (II) specyficznie wiąże się z insektycydem neonikotynoidowym, przy czym przeciwciało to jest selektywne względem związku o wzorzeR2 R1 i i w którymA oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;R i R3 niezależ nie oznaczają wodór lub C1-C4alkil;R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy, oraz X oznacza N-NO2 lub N-CN.
- 2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że wymienione przeciwciało jest selektywne względem związku wybranego z grupy obejmującej imidaklopryd, tiametoksam i klotiadynę.
- 3. Insektycyd neonikotynoidowy o wzorze IA w którymA oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;3R3 oznacza wodór lub C1-C4alkil;1 2 1 2R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil, lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy;n oznacza liczbę cał kowitą od 1 do 4; oraz X oznacza N-NO2 lub N-CN.
- 4. Związek według zastrz. 3 o wzorzePL 205 061 B1
- 5. Związek według zastrz. 4 o wzorze
- 8. Koniugat proteinowy o wzorze w którymA oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;R3 oznacza wodór lub C1-C4alkil;R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil, lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy;n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 4; orazX oznacza N-NO2 lub N-CN.PR oznacza resztę proteinową cząsteczki nośnika wybranej z grupy obejmującej pochodną oczyszczonej proteiny (PPD, tuberkulina) z wirusa Diphtheria, albuminę surowicy bydlęcej, kationizowaną albuminę surowicy bydlęcej, albuminę surowicy ludzkiej, albuminę jaja kurzego lub hemocyjaninę keyhole limpet lub resztę enzymu wybranego z grupy obejmującej fosfatazę alkaliczną, peroksydazę chrzanową i β-galaktozydazę.
- 9. Koniugat proteinowy według zastrz. 8 o wzorzePL 205 061 B1
- 10. Koniugat proteinowy według zastrz. 8 o wzorze
- 11. Sposób określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce, znamienny tym, że (a) dostarcza się fazę stałą z immobilizowanym przeciwciałem selektywnym dla insektycydu neonikotynoidowego o wzorzeR2 R1 i i w którymA oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;R i R3 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil;R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy orazX oznacza N-NO2 lub N-CN (b) doprowadza się do zetknięcia wymienionej próbki z immobilizowanym przeciwciałem w obecności znanej ilości koniugatu hapten insektycydu neonikotynoidowego - enzym;(c) przemywa się fazę stałą z etapu (b) i usuwa się niezwiązany koniugat hapten-enzym lub próbkę, (d) poddaje się reakcji substrat chromogeniczny specyficzny dla wymienionego koniugatu hapten - enzym z przemytą fazą stałą z etapu (c) w celu generowania chromogenu oraz (e) dokonuje się pomiaru ilości chromogenu wytworzonego w etapie (d) w celu określenia ilości koniugatu przeciwciało-związany hapten-enzym, a zatem i ilości insektycydu neonikotynoidowego w wymienionej próbce.
- 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że próbkę otrzymuje się przez ekstrakcję roślinnego materiału rozrodczego odpowiednim rozpuszczalnikiem.
- 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że roślinnym materiałem rozrodczym są nasiona.
- 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że nasiona są wybrane z grupy obejmującej kanadyjską odmianę rzepaku (canola), sorgo, pszenicę, bawełnę, kukurydzę paszową lub kukurydzę cukrową.
- 15. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że przeciwciałem jest przeciwciało poliklonalne wytworzone przez immunizowanie zwierzęcia insektycydem neonikotynoidowym sprzężonym z immunogeniczną proteiną nośną.
- 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że immunogeniczną proteiną nośną jest cząsteczka nośnika wybrana z grupy obejmującej pochodną oczyszczonej proteiny (PPD, tuberkulina) z wirusa Diphtheria, albuminę surowicy bydlęcej, kationizowaną albuminę surowicy bydlęcej, albuminę surowicy ludzkiej, albuminę jaja kurzego lub hemocyjaninę keyhole limpet.
- 17. Zestaw mający zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbce, znamienny tym, że obejmuje on kombinację w jednym lub większej liczbie pojemników:(a) fazy stałej z immobilizowanym przeciwciałem selektywnym względem insektycydu neonikotynoidowego, przy czym przeciwciało to jest selektywne względem związku o wzorzePL 205 061 B1R2 R1 i i w którymA oznacza 2-chloropiryd-5-yl lub 2-chlorotiazol-5-il;R i R3 niezależ nie oznaczają wodór lub C1-C4alkil;1 2 1 2R1 i R2 niezależnie oznaczają wodór lub C1-C4alkil lub R1 i R2 wzięte łącznie z atomami azotu, do których są dołączone, tworzą pierścień imidazolinowy lub oksadiazynowy, orazX oznacza N-NO2 lub N-CN i (b) koniugatu enzymowego zawierającego enzym sprzężony z haptenem neonikotynoidowym.
- 18. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że przeciwciałem jest przeciwciało poliklonalne wytworzone drogą immunizowania zwierzęcia neonikotynoidem sprzężonym z immunogeniczną proteiną nośną.
- 19. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że enzymem jest peroksydaza chrzanowa.
- 20. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że przeciwciało specyficznie wiąże się z insektycydem neonikotynoidowym wybranym z grupy obejmującej imidaklopryd, tiametoksam i klotiadynę.
- 21. Przeciwciało użyteczne do oznaczenia immunologicznego próbki w celu oznaczenia zawartości insektycydu neonikotynoidowego, którym to przeciwciałem jest (I) przeciwciało poliklonalne, wytwarzane przez immunizowanie zwierzęcia z haptenem insektycydu neonikotynoidowego sprzężonym z immunogenną proteiną nośną i (II) które specyficznie wiążące insektycyd neonikotynoidowy, przy czym przeciwciało to jest selektywne względem związku wybranego z grupy obejmującej nitenpiram, acetamipryd i tiaklopryd.
- 22. Sposób określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce, znamienny tym, że (a) dostarcza się fazę stałą z immobilizowanym przeciwciałem selektywnym dla insektycydu neonikotynoidowego, przy czym przeciwciało to jest selektywne względem związku wybranego z grupy obejmującej nitenpiram, acetamipryd i tiaklopryd.(b) doprowadza się do zetknięcia wymienionej próbki z immobilizowanym przeciwciałem w obecności znanej iloś ci koniugatu haptenu insektycydu neonikotynoidowego - enzymu;(c) przemywa się fazę stałą z etapu (b) i usuwa się niezwiązany koniugat hapten-enzym lub próbkę;(d) poddaje się reakcji substrat chromogeniczny, specyficzny dla wymienionego koniugatu hapten - enzym z przemytą fazą stałą z etapu (c) w celu generowania chromogenu; oraz (e) dokonuje się pomiaru ilości chromogenu wytworzonego w etapie (d) w celu określenia ilości koniugatu przeciwciało-związany hapten - enzym, a zatem i ilości insektycydu neonikotynoidowego w wymienionej próbce.
- 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że próbkę otrzymuje się przez ekstrakcję roślinnego materiału rozrodczego odpowiednim rozpuszczalnikiem.
- 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że roślinnym materiałem rozrodczym są nasiona.
- 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że wymienione nasiona są wybrane z grupy obejmującej kanadyjską odmianę rzepaku (canola), sorgo, pszenicę, bawełnę, kukurydzę paszową lub kukurydzę cukrową.
- 26. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że przeciwciałem jest przeciwciało poliklonalne wytworzone przez immunizowanie zwierzęcia insektycydem neonikotynoidowym sprzężonym z immunogeniczną proteiną nośną.
- 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że jako immunogeniczną proteinę nośną stosuje się cząsteczkę nośnika wybraną z grupy obejmującej pochodną oczyszczonej proteiny (PPD, tuberkulina) z wirusa Diphtheria, albuminę surowicy bydlęcej, kationizowaną albuminę surowicy bydlęcej, albuminę surowicy ludzkiej, albuminę jaja kurzego lub hemocyjaninę keyhole limpet.
- 28. Zestaw mający zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbce, który to zestaw obejmuje kombinację w jednym lub większej liczbie pojemników:PL 205 061 B1 (a) fazy stałej z immobilizowanym przeciwciałem selektywnym względem insektycydu neonikotynoidowego wybranego z grupy obejmującej nitenpiram, acetamipryd i tiaklopryd i (b) koniugatu enzymowego zawierającego enzym sprzężony z haptenem neonikotynoidowym.
- 29. Zestaw według zastrz. 28, znamienny tym, że przeciwciałem jest przeciwciało poliklonalne wytworzone drogą immunizowania zwierzęcia neonikotynoidem sprzężonym z immunogeniczną proteiną nośną.
- 30. Zestaw według zastrz. 28, znamienny tym, że enzymem jest peroksydaza chrzanowa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45678299A | 1999-12-08 | 1999-12-08 | |
| PCT/EP2000/012310 WO2001042787A2 (en) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Immunoassay for neonicotinyl insecticides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL355630A1 PL355630A1 (pl) | 2004-05-04 |
| PL205061B1 true PL205061B1 (pl) | 2010-03-31 |
Family
ID=23814141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL355630A PL205061B1 (pl) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Przeciwciało użyteczne do oznaczenia immunologicznego próbki w celu określenia zawartości insektycydu neonikotynoidowego, insektycyd neonikotynoidowy, koniugat proteinowy oraz sposób określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce i zestaw mający zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbce |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7148029B2 (pl) |
| EP (1) | EP1235805B1 (pl) |
| JP (1) | JP4980536B2 (pl) |
| KR (1) | KR100752536B1 (pl) |
| CN (1) | CN100379725C (pl) |
| AR (2) | AR026735A1 (pl) |
| AT (1) | ATE343564T1 (pl) |
| AU (1) | AU778677B2 (pl) |
| BR (1) | BR0016265B1 (pl) |
| CA (1) | CA2393084C (pl) |
| CZ (1) | CZ303174B6 (pl) |
| DE (1) | DE60031570T2 (pl) |
| DK (1) | DK1235805T3 (pl) |
| EA (1) | EA005380B1 (pl) |
| ES (1) | ES2272357T3 (pl) |
| HU (1) | HU229490B1 (pl) |
| IL (2) | IL150009A0 (pl) |
| MA (1) | MA25635A1 (pl) |
| MX (1) | MXPA02005514A (pl) |
| NO (1) | NO331464B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ519152A (pl) |
| PL (1) | PL205061B1 (pl) |
| PT (1) | PT1235805E (pl) |
| UA (1) | UA76708C2 (pl) |
| WO (1) | WO2001042787A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA200204582B (pl) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7763433B2 (en) | 2004-07-01 | 2010-07-27 | Forsite Diagnostics Limited | Analyte detection system |
| JP4841856B2 (ja) * | 2005-03-31 | 2011-12-21 | 株式会社堀場製作所 | クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 |
| JP2006282547A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Horiba Ltd | ニテンピラムのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ、およびその測定手段、測定用キットまたは測定方法 |
| US8188223B2 (en) * | 2005-05-18 | 2012-05-29 | Ablynx N.V. | Serum albumin binding proteins |
| KR100696615B1 (ko) | 2005-10-06 | 2007-03-19 | 충북대학교 산학협력단 | 이미다크로플리드 분석 방법 및 이의 분석 시스템 |
| EP1965209A4 (en) | 2005-12-16 | 2009-06-17 | Bayer Cropscience Ag | KIT FOR DETERMINING THE ACTIVE INGREDIENT OF AN ANTI-TERMITE AGENT USING AN IMMUNODOSING METHOD |
| JP2007187650A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Horiba Ltd | 免疫測定法を用いたフィプロニルの測定キット |
| JP4516609B2 (ja) * | 2006-02-10 | 2010-08-04 | 三井化学アグロ株式会社 | Ｏ−メチル−ｎ−ニトロイソ尿素の製造方法 |
| CN100402522C (zh) * | 2006-02-13 | 2008-07-16 | 中国农业大学 | 一种净化常山酮的方法及其专用免疫亲和色谱柱 |
| KR100879222B1 (ko) | 2006-05-09 | 2009-01-15 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 제초제 메타미포프 잔류물 검출용 효소면역학적 분석법 |
| KR100876435B1 (ko) | 2007-05-22 | 2008-12-31 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 살충제 비스트리플루론 잔류물의 효소면역학적 분석에이용되는 합텐-단백질 복합체 및 항체 |
| KR100879223B1 (ko) | 2007-05-22 | 2009-01-15 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 살충제 비스트리플루론 잔류물 검출용 효소면역학적 분석법 |
| US9207240B2 (en) * | 2007-11-14 | 2015-12-08 | Arbor Vita Corporation | Method of efficient extraction of protein from cells |
| CN101880325A (zh) * | 2010-06-22 | 2010-11-10 | 南京农业大学 | 一种应用于吡虫啉农药残留检测的单克隆抗体 |
| EP2705366B1 (en) | 2011-05-04 | 2017-07-12 | Pop Test LLC | Diagnostic device |
| CN102636643A (zh) * | 2012-04-06 | 2012-08-15 | 上海交通大学 | 用于检测噻虫啉的免疫传感器及其制备方法 |
| CA2882596C (en) | 2012-08-21 | 2019-05-14 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Antibodies to olanzapine and use thereof |
| JP6131414B2 (ja) | 2012-08-21 | 2017-05-24 | ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． | アリピプラゾールのハプテン及びイムノアッセイにおけるそれらの使用 |
| CA2882562C (en) | 2012-08-21 | 2019-08-27 | Eric Hryhorenko | Antibodies to aripiprazole and use thereof |
| JP6389176B2 (ja) | 2012-08-21 | 2018-09-12 | ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． | アリピプラゾールハプテンに対する抗体及びその使用 |
| WO2014031656A1 (en) | 2012-08-21 | 2014-02-27 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc | Antibodies to olanzapine haptens and use thereof |
| CN104854110B (zh) * | 2012-08-21 | 2016-12-28 | 詹森药业有限公司 | 奥氮平半抗原 |
| CN102942519B (zh) * | 2012-10-31 | 2014-08-13 | 天津科技大学 | 烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用 |
| CN104974256B (zh) * | 2015-04-10 | 2018-06-05 | 南京农业大学 | 一种抗噻虫啉单克隆抗体及其用途 |
| CN105037344A (zh) * | 2015-06-16 | 2015-11-11 | 环境保护部南京环境科学研究所 | 一种噻虫啉半抗原的合成方法 |
| CN105087498B (zh) * | 2015-09-07 | 2018-01-09 | 江南大学 | 一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
| CN105572376B (zh) * | 2016-03-07 | 2017-07-11 | 中国烟草总公司贵州省公司 | 一种检测农作物中甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法 |
| KR102225307B1 (ko) | 2017-10-19 | 2021-03-11 | 경북대학교 산학협력단 | 왁스 에스테르를 유효성분으로 포함하는 엔도설판 잔류 여부 판단용 또는 엔도설판 독성 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 |
| CN109813894A (zh) * | 2017-11-18 | 2019-05-28 | 镇江亿特生物科技发展有限公司 | 一种检测大米中乙虫腈的化学发光免疫检测试剂盒 |
| CN108998422A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-14 | 江南大学 | 一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
| CN109111394B (zh) * | 2018-09-21 | 2021-09-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种啶虫脒半抗原与抗原的制备方法及应用 |
| CN109061158B (zh) * | 2018-09-21 | 2021-09-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测啶虫脒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
| CN109917126A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-21 | 成都市房屋安全事务中心((成都市白蚁防治研究中心)) | 一种检测吡虫啉的试纸条、吡虫啉半抗原的制备方法及检测吡虫啉残留的方法 |
| CN111646959B (zh) * | 2020-05-14 | 2022-07-15 | 广州海关技术中心 | 一种呋虫胺半抗原、胶体金标记呋虫胺单克隆抗体以及呋虫胺胶体金检测装置 |
| CN112111011B (zh) * | 2020-07-28 | 2022-04-19 | 浙江大学 | 一种特异性抗噻虫嗪抗体的可变区序列及其重组全长抗体 |
| CN113009057B (zh) * | 2020-10-22 | 2023-11-07 | 重庆医科大学 | 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测尿液中新烟碱类杀虫剂及代谢产物的方法 |
| CN112595850A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-04-02 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种噻虫胺人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用 |
| CN113281501B (zh) * | 2021-05-12 | 2023-07-07 | 北京勤邦科技股份有限公司 | 一种五氯硝基苯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用 |
| CN113979994A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-01-28 | 信达安检测技术(天津)有限公司 | 一种吡虫啉半抗原、完全抗原及其合成与应用 |
| CN114397441B (zh) * | 2022-01-25 | 2025-01-28 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种啶虫脒化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN114636768B (zh) * | 2022-03-23 | 2023-11-07 | 广西-东盟食品检验检测中心 | 一种茉莉花中噻虫嗪残留的检测方法 |
| CN116223643A (zh) * | 2022-10-12 | 2023-06-06 | 广西医科大学 | 一种检测血清中新烟碱类杀虫剂及代谢物浓度的方法 |
| CN116046705B (zh) * | 2023-01-05 | 2025-06-13 | 之江实验室 | 一种分离检测噻虫嗪和啶虫脒的方法 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5334528A (en) * | 1989-10-30 | 1994-08-02 | The Regents Of The University Of California | Monoclonal antibodies to cyclodiene insecticides and method for detecting the same |
| JPH0580553A (ja) | 1991-09-24 | 1993-04-02 | Mita Ind Co Ltd | 電子写真感光体 |
| TW240163B (en) * | 1992-07-22 | 1995-02-11 | Syngenta Participations Ag | Oxadiazine derivatives |
| GB9304191D0 (en) * | 1993-03-02 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Process for the preparation of aqueous nicotinaldehyde |
| DE4329952C1 (de) * | 1993-09-04 | 1994-08-04 | Draegerwerk Ag | Monoklonale Antikörper zum Nachweis von Pyrethroiden sowie Verfahren zu deren Herstellung |
| US5553209A (en) | 1994-01-28 | 1996-09-03 | Hughes Aircraft Company | Method for automatically displaying map symbols |
| US5849758A (en) * | 1995-05-30 | 1998-12-15 | American Cyanamid Company | Herbicidal 2, 6-disubstituted pyridines and 2, 4-disubstituted pyrimidines |
| DE69616364T2 (de) * | 1995-08-02 | 2002-07-11 | Smithkline Beecham Corp., Philadelphia | Endothelinrezeptorantagonisten |
| US5972842A (en) * | 1996-12-12 | 1999-10-26 | American Cyanamid Company | Herbicidal cyanopyridines |
| AR008539A1 (es) * | 1996-12-19 | 2000-01-19 | Syngenta Participations Ag | PROCESO PARA LA PREPARACIoN DE DERIVADOS DE TIAZOL, INTERMEDIARIOS DEL MISMO Y PROCEDIMENTO PARA LA PREPARACIoN DE INTERMEDIARIOS |
| JP2993902B2 (ja) * | 1997-02-26 | 1999-12-27 | 株式会社環境免疫技術研究所 | トリフルミゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| JP3188641B2 (ja) * | 1997-03-18 | 2001-07-16 | 株式会社環境免疫技術研究所 | ミクロブタニルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| JP3188642B2 (ja) * | 1997-03-19 | 2001-07-16 | 株式会社環境免疫技術研究所 | イマザリルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| CN1680274A (zh) * | 1997-10-27 | 2005-10-12 | Isk美国有限公司 | 取代的苯化合物、它们的制备方法和含它们的除草剂和脱叶剂组合物 |
| US6121202A (en) * | 1997-11-07 | 2000-09-19 | American Cyanamid Company | Thienyloxypyridines and-pyrimidines useful as herbicidal agents |
| DE19831246A1 (de) * | 1998-07-11 | 2000-01-13 | Clariant Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arylpyridinen |
| JP3884586B2 (ja) | 1998-12-24 | 2007-02-21 | 株式会社堀場製作所 | イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
| US6960595B2 (en) * | 2001-03-23 | 2005-11-01 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | 5-6 to 5-7 Heterobicycles as factor Xa inhibitors |
-
2000
- 2000-06-12 UA UA2002075564A patent/UA76708C2/uk unknown
- 2000-12-06 EP EP00989956A patent/EP1235805B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 NZ NZ519152A patent/NZ519152A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 AT AT00989956T patent/ATE343564T1/de active
- 2000-12-06 MX MXPA02005514A patent/MXPA02005514A/es active IP Right Grant
- 2000-12-06 DE DE60031570T patent/DE60031570T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CZ CZ20021969A patent/CZ303174B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 PT PT00989956T patent/PT1235805E/pt unknown
- 2000-12-06 IL IL15000900A patent/IL150009A0/xx active IP Right Grant
- 2000-12-06 PL PL355630A patent/PL205061B1/pl unknown
- 2000-12-06 US US10/149,512 patent/US7148029B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 AU AU26721/01A patent/AU778677B2/en not_active Ceased
- 2000-12-06 AR ARP000106458A patent/AR026735A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-12-06 WO PCT/EP2000/012310 patent/WO2001042787A2/en not_active Ceased
- 2000-12-06 HU HU0203499A patent/HU229490B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 ES ES00989956T patent/ES2272357T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 BR BRPI0016265-5A patent/BR0016265B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 CN CNB008177716A patent/CN100379725C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-06 EA EA200200620A patent/EA005380B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 JP JP2001544026A patent/JP4980536B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-06 CA CA2393084A patent/CA2393084C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 KR KR1020027007294A patent/KR100752536B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-06 DK DK00989956T patent/DK1235805T3/da active
-
2002
- 2002-06-03 IL IL150009A patent/IL150009A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-06 NO NO20022684A patent/NO331464B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-06-07 MA MA26676A patent/MA25635A1/fr unknown
- 2002-06-07 ZA ZA200204582A patent/ZA200204582B/xx unknown
-
2008
- 2008-01-11 AR ARP080100138A patent/AR064873A2/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL205061B1 (pl) | Przeciwciało użyteczne do oznaczenia immunologicznego próbki w celu określenia zawartości insektycydu neonikotynoidowego, insektycyd neonikotynoidowy, koniugat proteinowy oraz sposób określania stężenia insektycydu neonikotynoidowego w próbce i zestaw mający zastosowanie do oznaczania immunologicznego zawartości insektycydu neonikotynoidowego w próbce | |
| US5501987A (en) | Dual analyte immunoassay for methamphetamine and amphetamine | |
| US5654178A (en) | Immunoassay for tetrachloroisophthalonitrile (chlorothalonil), its derivatives and breakdown products | |
| CN101100486A (zh) | 氟虫腈人工抗原、抗体及其用途 | |
| JP2025032213A (ja) | 対称性ジメチル化アルギニン分析物に対する抗体及びその用途 | |
| CN116082185B (zh) | 虫酰肼类半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备与应用 | |
| CN110551220A (zh) | 一种滴滴涕单克隆抗体的制备及其应用 | |
| CN113307776B (zh) | 一种双特异性识别阿苯达唑和多菌灵的抗体制备和应用 | |
| CN109061157A (zh) | 一种检测氟节胺的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 | |
| CN109265395B (zh) | 一种二氯喹啉酸半抗原与抗原的制备方法及应用 | |
| CN111896738A (zh) | 一种检测蛇形菌素的试纸条及其应用 | |
| CN109856091B (zh) | 一种检测久效磷的时间分辨荧光试纸条及其应用 | |
| CN118638058B (zh) | 一种甲苯咪唑半抗原、人工抗原和甲苯咪唑单克隆抗体及其制备与应用 | |
| CN119060191B (zh) | 一种分泌双酰肼类化合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN120060157A (zh) | 一株分泌特乐酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN121949165A (zh) | 一种敌磺钠半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 | |
| CN116535515A (zh) | 一种抗吡蚜酮的单克隆抗体及其应用 | |
| CN111505293A (zh) | 一种检测杂色曲霉素的试纸条及其应用 |