ES2272357T3 - Inmunoensayo para insecticidas neonicotinicos. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo útil en un inmunoensayo de una muestra para determinar la cantidad de un insecticida neonicotinoide, en donde dicho anticuerpo (I) es un anticuerpo policlonal producido por medio de la inmunización de un animal con un hapteno neonicotinoide conjugado con una proteína inmunogénica portadora y (II) específicamente enlazada al insecticida neonicotinoide, y en donde dicho anticuerpo es selectivo para un compuesto de la fórmula en donde A es 2-cloropirid-5-il ó 2-clorotiazol-5-il; R y R3 son independientemente hidrógeno o alquilo C1-C4; R1 y R2 son independientemente hidrógeno o alquilo C1-C4 o R1 y R2 son tomados ambos con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos para formar una imidazolidina o un anillo de oxadiazina; y X es N-NO2 o N-CN.
Description
Inmunoensayo para insecticidas
neonicotínicos.
Esta invención se relaciona con inmunoensayos
para pesticidas y con anticuerpos y reactivos para llevar a cabo
tales ensayos. La invención se relaciona además con métodos para
llevar a cabo tales ensayos y con kits que contienen reactivos
para practicar tales métodos. La invención tiene aplicación
particular en la detección y cuantificación de insecticidas
neonicotinoides en una muestra.
El uso de insecticidas sintéticos para controlar
plagas de insectos en cultivos es una práctica universal. Esta
práctica ha ganado un alto grado de éxito comercial debido a que ha
demostrado que tal control puede incrementar el rendimiento del
cultivo. Sin embargo, el uso efectivo de insecticidas requiere de un
buen manejo en vista de la resistencia de los insectos y en razón a
la exposición del medio ambiente y de los trabajadores. Una
solución que se ha dado a este problema ha sido el suministro de
nuevos insecticidas con mayor actividad, con el propósito de
reducir la necesidad de insecticidas antiguos tóxicos en forma aguda
y de reducir las tasas de carga para el medio
ambiente.
ambiente.
Una nueva clase de insecticidas que está ganando
reconocimiento significativo en el mercado son los llamados
insecticidas "neonicotinoides". Los compuestos de esta clase
incluyen, por ejemplo, los compuestos de imidacloprida,
acetamiprida y tiametoxam que se describen en las patentes
estadounidenses Nos. 4.742.060 y 5.304.566 y EP580553A2,
respectivamente.
El tratamiento directo de los materiales de
propagación de la planta (tales como semillas) con insecticidas son
aplicaciones objetivo dirigidas a la necesaria reducción de la
exposición del medio ambiente y de los trabajadores y a la
resistencia de la plaga vigorizada cuando se los aplica solos o
junto con aplicaciones foliares o en el surco del insecticida. Sin
embargo, debe tenerse cuidado para asegurarse de que el aparato
para el recubrimiento de la semilla esté adecuadamente calibrado con
el propósito de que el insecticida se aplique en forma uniforme al
material de la semilla para evitar problemas con el desempeño del
insecticida y fototoxicidad para la semilla, entre otros. Se pueden
utilizar mediciones analíticas para determinar si el equipo para
recubrimiento de la semilla ha sido calibrado en forma apropiada,
está operando en forma apropiada y si el tratamiento de muchas
semillas puede ser dado al público para embarque. Sin embargo, los
métodos tradicionales para detectar residuos de insecticida sobre
las semillas son extremadamente costosos y demorados, ya que ellos
requieren procedimientos analíticos altamente especializados y
costosos tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento o
cromatografía gas-líquido. Ambas técnicas
cromatográficas requieren instrumentación costosa que no es barata
de mantener y que debe ser operada por técnicos altamente
capacitados. Las instalaciones para el tratamiento de semillas y
los cultivadores usualmente no tienen tal equipo o personal
disponibles así que las muestras de semilla deben ser despachadas a
laboratorios analíticos en otros sitios. Cuando se analizan las
muestras con base en un ciclo rápido de rotación por parte de tales
laboratorios, la instalación de tratamiento puede recibir los datos
analíticos aproximadamente veinticuatro horas después del despacho.
Los análisis menos rápidos resultan en retrasos demasiado largos.
Estos retrasos resultan en muchas horas de ocio de tiempo de la
máquina en la instalación de recubrimiento. También se incurre en
retrasos en el despacho de la semilla recubierta.
Existe una urgente necesidad en el arte por
mejorar las técnicas de medición para hacerlas menos costosas, más
eficientes y más fácilmente manejables. Los métodos deseados también
deben ser útiles fuera del laboratorio, en condiciones de campo, ya
que ellos pueden proveer en forma rápida y confiable a un granjero o
al personal para tratamiento de la semilla con información sobre la
presencia y concentraciones de un insecticida dado sobre una
muestra de semilla. En este sentido, es importante que los métodos
diferencien al material pesticida activo de otros productos
permitiendo la determinación cuantitativa del ingrediente activo
deseado presente sobre la semilla. Sin embargo, aún subsisten
diferentes limitaciones serias en los métodos analíticos clásicos.
Algunas de estas limitaciones serían superadas por medio del uso de
tecnología de inmunoensayo.
Aun cuando fueron desarrollados originalmente
para uso médico y veterinario, los inmunoensayos han empezado a
encontrar más aplicaciones en el campo agrícola. Por ejemplo, los
inmunoensayos son adecuados para la detección y cuantificación de
enfermedades de los cultivos, aflatoxinas y ciertos antibióticos. Si
bien los inmunoensayos para detección de pesticida han sido
descritos en la literatura científica (ver más adelante), han estado
disponibles para uso comercial únicamente desde la década
pasada.
Los inmunoensayos cuentan con reactivos
altamente específicos para la detección de anticuerpos y aparatos
analíticos relativamente simples para detectar y/o cuantificar una
gran variedad de materiales objetivo. El anticuerpo, antes que el
instrumento o las condiciones de operación, provee la especificidad
analítica. Los inmunoensayos pueden por lo tanto ser llevados a
cabo sobre muestras relativamente crudas. Además, los métodos del
inmunoensayo han sido optimizados para ser utilizados en ambientes
remotos que no son de laboratorio, permitiendo su uso en el campo
así como en el laboratorio especializado.
Se conocen métodos inmunológicos para la
detección de ciertos herbicidas, incluyendo al ácido
2,4-diclorofenoxiacético (Fleeker, J., J.
Assoc. Off. Anal. Chem. 70:874-878
(1986)), al clorsulfurón (Kelley, M. y colaboradores, J.
Agric. Food Chem. 33:962-966
(1985)), las haloacetamidas (Winzenburger, P. A. y colaboradores
(Publicación de Patente Europea EP 340198,1989), y una variedad de
pesticidas, incluyendo diflubenzurón (Wie, S. I. y colaboradores,
J. Agric. Food Chem. 30:949-957
(1982)), el metalaxilo (Newsome, W. H., J. Agric.
Food Chem. 33:528-530 (1985)) y
paratión (Ercegovich, C. D. y colaboradores, J. Agric.
Food Chem. 29:559-563 (1981)). Se ha descrito
un también un método para la detección inmunológica de atrazina
(patente estadounidense No. 4.530.786). También se conocen ensayos
inmunológicos para cianazina, diclofop-metilo,
fentaclorfenol, 2,4,5-T y terbutrina. La patente
estadounidense No. 5.723.306 describe anticuerpos monoclonales
selectivos para piretrinas y piretroides.
Todos los métodos inmunológicos anteriores
utilizan antisueros policlonales que se obtuvieron a partir de
animales huéspedes (típicamente conejos) inmunizados con un antígeno
apropiado (inmunógeno). Más recientemente, los anticuerpos
monoclonales (mAbs) específicos para atrazina y sus derivados y los
productos de degradación, y el uso de tales mAbs en inmunoensayos
han sido divulgados (Schlaeppi y colaboradores, Publicación de la
Patente Europea EP 365818 (1990)).
Debido a su bajo peso molecular, los
insecticidas no son inmunógenos y no producen anticuerpos
específicos a partir de huéspedes animales. En consecuencia, el
desarrollo de un inmunoensayo de insecticida requiere de un número
de etapas, comenzando con el diseño de haptenos, derivados del
insecticida que mantienen la especificidad estructural de la
molécula de insecticida mientras permite la conjugación con una
proteína inmunogénica "portadora" de alto peso molecular.
Además, para los anticuerpos de selección durante el proceso de su
producción, se pueden preparar también haptenos adicionales cuyas
estructuras químicas son diferentes de las del hapteno utilizado
para inmunizar animales. Finalmente, una vez obtenida la preparación
de un anticuerpo (ya sea policlonal o monoclonal), se debe
desarrollar un inmunoensayo suficientemente sensible.
Se han descrito estrategias básicas utilizadas
en inmunoensayos modernos en numerosas referencias (ver, por
ejemplo, Voller, A. y colaboradores, eds., Immunoassays For
The 80's, University Park, 1981; Voller, A., "The
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic
Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates
Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Voller, A. y
colaboradores, J. Clin. Pathol.
31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth.
Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio. E. (ed.),
Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1980).
Esencial para cada propuesta es la generación de curvas de
calibración utilizando cantidades conocidas del analito deseado.
Un método de "anticuerpo marcado" de uso
común es conocido como el ensayo con sustancias inmunoabsorbentes
unidas a enzimas (ELISA). Aquí, un conjugado de proteína del
pesticida (llamado un "recubrimiento" o un "antígeno de
selección") se prepara utilizando una proteína que no está
estructuralmente relacionada con la proteína portadora utilizada en
el inmunógeno pesticida, contra el cual se generaron los anticuerpos
antipesticida. El conjugado del antígeno de recubrimiento se
inmoviliza sobre un soporte en fase sólida, tal como la superficie
de un pozo de microplaca, resultando en una cantidad fija de
pesticida en fase sólida por reacción. Se añade una cantidad
conocida de anticuerpo junto con la muestra de la prueba. El
pesticida inmovilizado compite con el pesticida libre en la muestra
desconocida por un número limitado de sitios de enlazamiento del
anticuerpo. La interacción entre el anticuerpo y el analito en la
fase líquida inhibe el enlazamiento del anticuerpo al pesticida en
fase sólida. El anticuerpo enlazado a la fase sólida se detecta por
medio de un segundo anticuerpo conjugado con una enzima, específico
para la región constante de la cadena pesada del anticuerpo
antipesticida. Muchos segundos anticuerpos enlazados a una enzima
se encuentran comercialmente disponibles para ese uso. Después de
retirar por medio de lavado el segundo anticuerpo no enlazado,
típicamente se detecta al segundo anticuerpo inmovilizado por medio
de la adición de un sustrato cromogénico para la enzima, que resulta
en un producto de reacción coloreado formado en proporción directa
con la cantidad de segundo anticuerpo enlazado. La cantidad de
producto de reacción es por lo tanto inversamente proporcional a la
cantidad de analito en la muestra desconocida.
Una modificación del método de "anticuerpo
marcado" elimina el uso de antígeno de recubrimiento. El
inmunoensayo enzimático (EIA) inmoviliza al anticuerpo
antipesticida sobre una fase sólida. Un hapteno pesticida se acopla
en forma covalente a una enzima, y el conjugado enzimático
resultante se incuba con muestras en micropozos o tubos de cultivo
recubiertos con anticuerpo antipesticida. El pesticida en la muestra
compite con el conjugado enzima-hapteno pesticida
para enlazar al anticuerpo inmovilizado. La fase sólida se lava para
remover los materiales no enlazados y se detecta al conjugado
enzimático enlazado al anticuerpo por medio de la adición de
sustrato cromogénico. Ver, por ejemplo, Bushway, R.J., L.P. Perkins,
S.A. Savage, S.L. Lekousi, and B.S. Ferguson. 1988. La
determinación de residuos de atrazina en agua y suelo por medio de
inmunoensayo enzimático. Bull. Environ. Contam. Toxicol.
40:647-654; Fleeker, J.R. and L.W. Cook. 1991.
Confiabilidad del inmunoensayo enzimática comercial en la detección
de atrazina en agua. P. 78-85 en M. Vanderlann, L.H.
Stanker, B.E. Watkins, y D.W. Roberts., eds. Immunoassays for Trace
Chemical Analysis. ACS Symposium Series 451. Washington, D.C.:
American Chemical
Society.
Society.
Existe la necesidad en el campo agrícola de un
método para analizar semillas tratadas con ingredientes activos
tales como insecticidas, que puede ser realizado en el campo o
dentro de una instalación para tratamiento de semillas.
La presente invención provee haptenos
neonicotinoides e inmunógenos para generar anticuerpos
antineonicotinoides así como anticuerpos, métodos, reactivos, y
kits para determinar la presencia de uno o más insecticidas
neonicotinoides definidos en una muestra por medio de inmunoensayo.
La presente invención tiene aplicación particular para la
determinación de la concentración de insecticidas neonicotinoides
aplicados a los materiales de propagación de la planta tal como las
semillas.
El método de inmunoensayo de la invención le
permite al personal en las instalaciones para tratamiento de
semillas donde se aplican a las semillas ciertos insecticidas
neonicotinoides, medir cuantitativamente la cantidad de ingrediente
activo aplicado. El método involucra una extracción rápida de los
ingredientes activos de la semilla y una rápida medición con base
en el inmunoensayo de la solución del extracto. Estas mediciones se
pueden utilizar para determinar si el equipo para recubrimiento de
la semilla ha sido calibrado adecuadamente, está operando
apropiadamente, y si los lotes de semilla tratados pueden ser
liberados para embarque. El ensayo está diseñado para ser simple de
operar requiriendo únicamente de equipo y reactivos ordinarios de
laboratorio. Por lo tanto, el personal que carezca de experiencia
en la realización de inmunoensayos será capaz de conducir
exitosamente la prueba después de unos pocos ensayos de
práctica.
Se ha encontrado que los conjugados
neonicotinoides antigénicos (inmunógenos) pueden elaborarse por
medio de conjugación de un hapteno pesticida neonicotinoide con una
molécula portadora tal como un derivado purificado de proteína
(PPD, Tuberculina) del virus de la Diptheria, albúmina de
suero bovino, albúmina de suero humano, ovoalbúmina o hemocianina
de lapa ojo de cerradura con un hapteno neonicotinoide. También
pueden elaborarse conjugados de materiales derivatizados tales como
albúmina derivatizada de suero bovino, albúmina cationizada de
suero bovino y similares. Ver, A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce y
J.G. Michael (1987) J. Immunol. 138:833-837.
Estos inmunógenos pueden ser inyectados entonces en animales
huéspedes que producirán anticuerpos para el hapteno neonicotinoide
que puede ser cosechado. Estos anticuerpos pueden ser utilizados
entonces en una variedad de procedimientos de inmunoensayos para
detectar a los correspondientes insecticidas neonicotinoides,
utilizando diferentes marcadores conocidos para marcar ya sea al
insecticida o al anticuerpo. En algunas modalidades de
inmunoensayos, se inmoviliza ya sea al derivado del insecticida
neonicotinoide o a un anticuerpo. Tanto los anticuerpos
policlonales como monoclonales pueden ser utilizados en la práctica
de la presente invención. Los anticuerpos pueden mostrar
enlazamiento selectivo con el(los) insecticida(s)
neonicotinoide(s) deseados aún en presencia de otros
ingredientes pesticidas activos que incluyen a otros insecticidas
neonicotinoides incorporados en una formulación de recubrimiento de
semillas.
Los métodos de detección que pueden ser
aplicados a la práctica de la presente invención para la medición
de insecticidas neonicotinoides en una muestra que incluye
biosensores y sistemas enzimáticos, fluorescentes,
quimioluminiscentes y radiométricos. Tales ensayos pueden utilizar
formatos heterogéneos u homogéneos y pueden utilizar placas
micropozo, tubos de cultivo, y cuentas de látex o partículas como
fases sólidas.
Los inmunoensayos de la presente invención se
utilizan para determinar la concentración de compuestos insecticidas
neonicotinoides definidos tales como imidacloprida, nitenpiram,
acetamiprida, tiametoxam, tiacloprida, clotiadina en una muestra
tal como un material de propagación de una planta.
La presente invención provee inmunoensayos para
analizar una muestra por la presencia de insecticidas
neonicotinoides definidos. En tales inmunoensayos, la reacción
neonicotinoide (antígeno)/anticuerpo puede ser detectada por medio
de una variedad de métodos, utilizando diferentes marcadores para
marcar ya sea al antígeno o al anticuerpo para permitir la
detección del producto de reacción. Además, la inmovilización ya sea
del antígeno o del anticuerpo facilitará la detección en muchos
casos.
Los ensayos antígeno/anticuerpo pueden ser
generalmente clasificados en dos categorías, heterogéneos y
homogéneos. Los ensayos heterogéneos requieren la separación del
componente enlazado marcado a partir del componente libre marcado
antes de la detección del producto de reacción. Los ensayos
homogéneos no requieren de tal etapa de separación. Los ensayos
pueden ser además (1) competitivos, por ejemplo, donde el antígeno
compite por el anticuerpo marcado con un antígeno en fase sólida o
donde al antígeno compite con el antígeno marcado por un anticuerpo
en fase sólida o (2) no competitivos en donde existe una relación
directa entre el marcador y el anticuerpo o el antígeno.
Los métodos de inmunoensayo que pueden ser
utilizados en la práctica de la presente invención para detectar
insecticidas neonicotinoides en una muestra incluyen inmunoensayos
con enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes y con biosensores,
así como un radioinmunoensayo. En los inmunoensayos unidos a enzimas
(ELISA), de acuerdo con la presente invención, los haptenos
correspondientes al(los) insecticida(s)
neonicotinoide(s) de interés pueden estar marcados
directamente con una enzima o indirectamente por medio del uso de
anticuerpos marcados con enzimas que bajo condiciones apropiadas
catalizan una reacción con un sustrato. La actividad de la enzima
se detecta típicamente por medio de la formación de un producto de
reacción coloreado, esto es, un punto final coloreado que puede ser
fácilmente detectado por el ojo o medido a través de un medio
espectroscópico o de reflectancia.
En las técnicas de inmunoensayo por
fluorescencia para ser utilizadas en la presente invención, los
haptenos correspondientes al(los) insecticida(s)
neonicotinoide(s) de interés pueden ser marcados directamente
con fluorocromos, o indirectamente con anticuerpos marcados con
fluorocromo. Los fluorocromos son tintes que absorben radiación
(por ejemplo, luz ultravioleta), son excitados por ella, y emiten
luz (por ejemplo, luz visible).
En una modalidad de la presente invención, el
método para determinar la concentración de un insecticida
neonicotinoide definido en una muestra que comprende las etapas
de:
- (a)
- proveer una fase sólida con un anticuerpo inmovilizado selectivo para dicho insecticida neonicotinoide;
- (b)
- poner en contacto a dicha muestra con el anticuerpo inmovilizado en presencia de una cantidad conocida de un conjugado enzima-hapteno del insecticida neonicotinoide;
- (c)
- lavar la fase sólida de la etapa (b) para remover cualquier conjugado enzima-hapteno no enlazado o muestra;
- (d)
- hacer reaccionar un sustrato cromogénico específico para dicho conjugado enzima-hapteno con la fase sólida lavada de la etapa (c) con el propósito de generar un cromógeno; y
- (e)
- medir la cantidad del cromógeno producido en la etapa (d) con el propósito de determinar la cantidad de conjugado enzima-hapteno enlazada al anticuerpo y por lo tanto la cantidad de insecticida neonicotinoide en dicha muestra.
En una modalidad, el inmunoensayo se suministra
en la forma de un kit que incluye tubos recubiertos con anticuerpo,
al conjugado enzima-hapteno neonicotinoide, sustrato
enzimático, y una solución para terminar la producción de la señal
colorimétrica.
En tanto que la invención a menudo se describe
con referencia al uso de anticuerpos monoclonales, aquellos
entrenados en el arte reconocerán que los anticuerpos monoclonales
podrían ser utilizados como una alternativa al uso de anticuerpos
policlonales. El término "anticuerpos" se lo utiliza aquí para
referirse genéricamente a anticuerpos policlonales o
monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales para los
insecticidas neonicotinoides para el uso en la práctica de la
presente invención se elaboran utilizando técnicas de inmunización
y de cultivo de hibridomas bien conocidas por aquellos entrenados
en el arte. Las líneas celulares apropiadas de hibridomas son
producidas preferiblemente por medio de la fusión de una célula que
produce anticuerpos y una célula de mieloma derivada de una especie
murina. Las células que producen anticuerpo son preferiblemente
células de bazo. Cualquier línea celular adecuada de mieloma puede
ser utilizada no obstante que es deseable utilizar una línea celular
bien caracterizada de la cual un cierto número son de uso común.
Igualmente, los anticuerpos policlonales para
los insecticidas neonicotinoides para el uso en la práctica de la
presente invención también se los elabora utilizando técnicas
conocidas por aquellos capacitados en el arte.
La presente invención también provee una
preparación de anticuerpo policlonal IgG que se enlaza al menos a
un insecticida neonicotinoide, en donde la preparación del
anticuerpo se produce por medio de un método que comprende las
etapas de: (a) administrar a un huésped una cantidad predeterminada
de una composición que contiene un insecticida neonicotinoide o un
equivalente inmunológico acoplado a una proteína portadora
biológicamente aceptable, (b) recolectar suero del huésped, y (c)
purificar el anticuerpo IgG del suero. Un equivalente inmunológico
de un antígeno tiene la habilidad, cuando se lo introduce en un
huésped, de causar la producción de anticuerpos para el
antígeno.
Como se observó anteriormente, el inmunoensayo
de la presente invención tiene aplicación particular en la detección
de la cantidad de un insecticida neonicotinoide que ha sido aplicado
a un material de propagación de planta. El término "material de
propagación de planta" se entiende que designa a todas las partes
generativas de la planta tal como semillas que pueden ser utilizadas
para la multiplicación del material más reciente y vegetativo de la
planta tal como esquejes y tubérculos (por ejemplo patatas). Pueden
mencionarse, por ejemplo, las semillas (en el sentido estricto),
raíces, frutos, tubérculos, bulbos, rizomas, y partes de plantas.
También pueden ser mencionadas las plantas germinadas y las plantas
jóvenes que van a ser transplantadas después de la germinación o
después de emerger del suelo. Estas plantas jóvenes pueden ser
protegidas antes del transplante por medio de un tratamiento por
inmersión total o parcial.
En una modalidad, el insecticida neonicotinoide
que puede ser detectado por medio de un ensayo de la presente
invención, se representa por medio de la fórmula
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en donde A es
2-cloropirid-5-il ó
2-clorotiazol-5-il;
R y R^{3} son independientemente hidrógeno o
alquilo C_{1}-C_{4};
R^{1} y R^{2} son independientemente
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} o R^{1} y
R^{2} son tomados ambos con los átomos de nitrógeno a los cuales
están unidos para formar una imidazolidina o un anillo de
oxadiazina; y
X es N-NO_{2} o
N-CN.
En otra modalidad, el insecticida neonicotinoide
detectable por medio del ensayo de la presente invención se
representa por medio de la fórmula
en donde A, R^{3} y X son como se
definió anteriormente para la fórmula
(I).
En una modalidad preferida, el inmunoensayo de
la presente invención emplea anticuerpos policlonales para un
insecticida neonicotinoide. Estos anticuerpos se pueden obtener a
partir del suero de un animal inmunizado. La inmunización se puede
lograr inyectando al inmunógeno (conjugado antigénico
hapteno-PPD) dentro de una especie que produce
anticuerpos, típicamente un mamífero y preferiblemente un conejo o
una oveja. Típicamente, la inyección inicial es seguida por una
serie de inyecciones posteriores de refuerzo para maximizar la
respuesta al anticuerpo. Óptimamente, el régimen de inyección se
suministra en múltiples dosis a conejos hembra blancos de Nueva
Zelanda. La cantidad inyectada de inmunógeno varía pero debe ser
adecuada para producir una cantidad detectable de anticuerpo. La
producción de anticuerpo se puede verificar por medio del análisis
del suero obtenido en ensayos de sangrado utilizando EIA, ELISA o
un Ensayo Indirecto del Inmunoensayo por Fluorescencia.
Los mismos marcadores utilizados en los ensayos
inmunométricos conocidos pueden ser utilizados para marcar al
hapteno utilizado en la presente invención. Entre estos se pueden
mencionar a las moléculas reporteras (RM) incluidas enzimas, tales
como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano, y la
\beta-galactosidasa. Además, se pueden utilizar
marcadores fluorescentes, luminiscentes o radioactivos tales como
fluoresceína, rodamina, luminol, acridio e isótopos radioactivos
^{125}I, etc., o partículas coloidales tales como oro y selenio,
etc. Finalmente, se pueden utilizar fluoróforos de quelato de
lantánido tales como europio y terbio, para generar señales
fluorescentes resueltas en el tiempo. Los marcadores enzimáticos más
comunes son la peroxidasa de rábano (HRP) y la fosfatasa
alcalina.
En una modalidad, se utiliza un
espectrofotómetro para detectar la cantidad de neonicotinoide en una
muestra. Sin embargo, los métodos de la presente invención pueden
ser adaptados por alguien entrenado en el arte para ser utilizados
en otros tipos de detectores cromogénicos. En forma similar, el
producto de reacción detectable no se limita a un cromóforo sino
que incluye a otros marcadores como se describió más arriba.
Se ha encontrado que los haptenos de las
siguientes fórmulas (IA), (IB) y (IIA) son útiles en la producción
de conjugados neonicotinoides antigénicos (inmunógenos) y de los
conjugados del ensayo:
en donde A es
2-cloropirid-5-il ó
2-clorotiazol-5-il;
R^{3} es hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{4};
R^{1} y R^{2} son independientemente
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} o R^{1} y
R^{2} son tomados ambos con los átomos de nitrógeno a los cuales
están unidos para formar una imidazolidina o un anillo de
oxadiazina;
n es un entero de 1 a 5 (preferiblemente un
entero de 3 a 5); y
X es N-NO_{2} o
N-CN.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde A, R^{1}, R^{2},
R^{3} y X son como se define para la fórmula (IA),
y
E es un enlace sencillo covalente o es una
fracción de enlazamiento de la fórmula -(CH_{2})_{m}- en
donde m es un entero de 1 a 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde A, R^{3}, X y n son como
se define para la fórmula
(IA).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde A, R^{3} y X son como se
define para la fórmula (IA) y E es como se define para la fórmula
(IB).
\newpage
Los haptenos de las fórmulas (IIIA) y (IIIB) se
pueden preparar en forma análoga a la siguiente metodología:
El hapteno deseado (IIA) o (IIIB) se prepara por
medio del uso de un derivado apropiado de
2-aminoetanotiol seleccionado a partir de un
compuesto de las fórmulas:
en donde R tiene el significado
dado anteriormente para la fórmula
(I).
Se ha encontrado que los siguientes haptenos son
particularmente útiles en la práctica de la presente invención:
en donde en cada caso n es un
entero entre 1 y 5; preferiblemente es un entero entre 3 y
5.
Los conjugados neonicotinoides antigénicos
(inmunógenos) y los conjugados del ensayo se pueden elaborar por
medio de conjugación de un hapteno pesticida neonicotinoide con una
molécula portadora o una molécula reportero, según el caso,
utilizando técnicas conocidas por aquellos entrenados en el arte. Se
han utilizado dos aproximaciones básicas. La primera utiliza
enlazadores que hacen parte del conjugado. Estos enlazadores son
homobifuncionales o heterobifuncionales, e incluyen a aquellos
capaces de formar, por ejemplo, enlaces disulfuro a través de
grupos tiol de fracciones de cisteína en la proteínas sustrato, o de
la formación de enlaces amida entre un grupo amino
N-terminal o las cadenas laterales de amino o
residuos de lisina y fracciones acilo activadas tales como
succinimidil ésteres. En general, esta aproximación involucra grupos
funcionales altamente reactivos sobre el enlazador y es
razonablemente accesible con respecto a los sustratos para
conjugación. Sin embargo a menudo es útil emplear grupos
funcionales que pueden ser menos reactivos, tales como aquellos
capaces de formación hidrazona.
Una segunda aproximación, particularmente útil
en la conjugación de dos fracciones de proteína, utiliza un agente
de deshidratación tal como una carbodiimida para llevar a cabo la
formación de, por ejemplo, nuevos enlaces peptídicos por medio de la
reacción de una fracción carboxilo sobre un miembro del conjugado
con un grupo amino libre sobre el otro. En este caso, el reactivo
no hace parte del conjugado.
Esta reacción no es particularmente accesible ya
que el grupo carboxilo no está activado; la carbodiimida provee el
intermediario activo y desplaza el equilibrio por medio de la
remoción de los elementos de agua para formar el enlace
peptídico.
Ambas aproximaciones para la conjugación se han
llevado a cabo generalmente en solventes acuosos debido a que el
material de la proteína que forma al conjugado se desnaturaliza
fácilmente. Las proteínas se diseñan para ser estables en un
ambiente acuoso y se sabe que se desnaturalizan aún en solventes,
tales como etanol, que se pensaría que es razonablemente análogo con
un medio acuoso. También, los componentes de la proteína conjugada
tienden a ser relativamente insolubles en solventes no acuosos.
Se ha encontrado que los conjugados de hapteno
de la siguiente fórmula son útiles en la práctica de la
invención:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde A, R^{1}, R^{2},
R^{3}, n y X tienen el significado dado en la fórmula (IA)
anterior y PR es un residuo de proteína de: (1) una molécula
portadora tal como un derivado purificado de proteína (PPD,
Tuberculina) del virus Diptheria, albúmina de suero bovino,
albúmina de suero humano, ovoalbúmina o hemocianina de lapa ojo de
cerradura en el caso de un inmunógeno o (2) una molécula reportera
(RM) tal como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano, y
\beta-galactosidasa.
Además, los conjugados de hapteno de la
siguiente fórmula son igualmente útiles:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde A, R^{1}, R^{2},
R^{3}, E y X tienen el significado dado en la fórmula (IB)
anterior.
Se ha encontrado que los siguientes conjugados
son particularmente útiles en la práctica de la presente
invención:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y
\vskip1.000000\baselineskip
en donde n en cada caso es un entero entre 1 y
5; preferiblemente n es un entero entre 3 y 5.
El anticuerpo policlonal no marcado utilizado en
el proceso de la presente invención para enlazar al neonicotinoide
antigénico o al conjugado hapteno-RM en la muestra
que está siendo probada, puede ser inmovilizado sobre cualquiera de
los soportes comúnmente utilizados en ensayos inmunométricos. Entre
aquellos que pueden ser utilizados están el papel filtro, cuentas
de látex o de poliestireno y polietileno, poliestireno,
polipropileno u otras placas micropozo adecuadas o tubos de ensayo.
Este soporte se puede elaborar con cualquier polímero de origen
natural o sintético, o con un material amorfo tal como vidrio.
Convenientemente, se utilizan membranas de nitrocelulosa o nylon
para las tirillas reactivas, y polivinilo, polipropileno,
poliestireno u otros plásticos para las cuentas o microplacas. Se
pueden utilizar también geles o partículas con base en agarosa,
acrilamida o látex. Adicionalmente, cualquiera de los dispositivos
inmunocromatográficos, tirillas de prueba y dispositivos de flujo
lateral conocidos en el arte, se pueden adaptar al proceso de la
presente invención. Entre los dispositivos adecuados de flujo
lateral, se pueden mencionar, por ejemplo, el tipo de dispositivo de
flujo lateral divulgado en la patente estadounidense No. 4.366.241.
Las técnicas para el enlazamiento de los anticuerpos a tales
materiales son bien conocidas por aquellos entrenados en el arte.
Una fuente adecuada para obtener anticuerpos enlazados a un soporte
es, por ejemplo, Beacon Analytical Systems, Inc. (Pórtland,
Maine).
Para preparar una muestra de semilla para uso en
el ensayo, se dispersan submuestras representativas de semilla a
partir de un lote tratado de neonicotinoide (por ejemplo, de cinco a
100 gramos de semilla de canola; de 10 a 200 gramos de sorgo,
trigo, algodón, maizales o semillas de maíz dulce) en un solvente
adecuado tal como acetona, acetonitrilo, etanol, isopropanol,
metanol, o mezclas de estos solventes con diferentes porcentajes de
agua. Las mezclas adecuadas agua-solvente incluyen,
por ejemplo, desde 1 a 50% de MeOH/H_{2}O y desde 1 a 20% de
acetonitrilo/H_{2}O. La semilla dispersada se mezcla por medio de
agitación con vórtice y luego se coloca en un baño para sonicación
aproximadamente durante veinte minutos seguido de más agitación con
vórtice. Se permite que se asienten los contenidos. Se remueve una
porción conocida del extracto líquido y se la añade a una cantidad
conocida de una solución de, por ejemplo, 1% acetonitrilo/agua. Se
diluye adicionalmente el extracto para llevar la concentración del
neonicotinoide extraído al rango de la curva de calibración. Se ha
encontrado que son útiles las diluciones entre mil y sesenta mil
veces. El inmunoensayo toma aproximadamente treinta y cinco minutos
para correr. La extracción y preparación del extracto para análisis
toman aproximadamente treinta minutos. Por lo tanto, se puede
extraer una muestra de semilla y analizarla aproximadamente en una
hora y cinco minutos. En una modalidad, se pueden analizar hasta dos
muestras de semilla a la vez (hasta con cinco submuestras por
muestra de semilla).
Las concentraciones de insecticidas
neonicotinoides aproximadamente entre diez mil partes por millón
hasta media parte por billón se pueden detectar en los
inmunoensayos de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, el
método es adecuado para cualquier cantidad de insecticida
neonicotinoide presente mientras que la cantidad de insecticida
neonicotinoide en una muestra o extracto de muestra caiga, o pueda
ser apropiadamente diluida para que caiga dentro del rango de la
curva de calibración.
La preparación del antígeno, la producción de
los anticuerpos policlonales y un inmunoensayo se ilustran con más
detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelve sulfato de
o-metilisourea (38,5 g) en una mezcla de ácido
nítrico (120 ml)/ácido sulfúrico (280 ml) a 0ºC y se agita durante 2
horas a 0ºC. Se vierte cuidadosamente la mezcla sobre hielo molido
con agitación y luego se remueve el hielo molido por filtración. Se
disuelven los cristales d tipo aguja en acetato de etilo y se torna
alcalina la solución por medio de la adición de carbonato de
potasio. Se seca la solución sobre sulfato de magnesio y se filtra.
Se concentra el filtrado para producir un polvo de color blanco (5
g).
1.2
Se prepara una solución a partir de 3 g de
clorhidrato de metil 4-aminobutirato (1.1a) y 15 ml
de agua. Se ajusta el pH en 11 por medio de la adición gota a gota
de NaOH 2 N mientras se enfría la solución en un baño de hielo. Se
equipa el frasco de reacción con un electrodo para pH y un
termómetro, y se agita rápidamente la solución básica clara
resultante mientras se añade
2-metil-1-nitroisourea
(2,38 g) en pequeñas porciones para mantener la temperatura de la
solución por debajo de 2ºC. Cuando se completa la adición, se agita
la reacción durante 1,5 h a 0ºC; obsérvese que el pH se haya
estabilizado en 9,6. Añadir THF (1 ml) y agitar por 2 h
adicionales. Diluir la reacción con agua y verterla sobre acetato de
etilo. Después de que se separa la capa orgánica, se seca la
fracción orgánica sobre sulfato de magnesio y se filtra la solución.
Se concentra el filtrado para producir un aceite claro. Se somete a
cromatografía flash el aceite crudo sobre gel de sílice eluyendo
con diclorometano/acetonitrilo 3:1 para producir 750 mg del producto
deseado como un sólido de color blanco.
\newpage
1.3
Se combina el producto de 1.2 (1,44 g) con
paraformaldehído (422 mg), ácido metano sulfónico (0,23 ml) y ácido
fórmico (10 ml) y se calienta a 55ºC durante 15 h. Se concentra la
reacción al vacío. Se suspende el aceite marrón resultante en
tolueno y se despoja en forma azeotrópica la solución hasta
sequedad. Se disuelve el aceite resultante en
THF/dioxano/acetonitrilo 1:1:1 y se lo trata con exceso de
diazometano. Se agita esta solución durante 30 minutos y se trata
la reacción con ácido acético. Se concentra la mezcla de reacción
hasta obtener un aceite. Se reconstituye el aceite en acetato de
etilo, se lava con solución de bicarbonato de sodio diluido, se
seca sobre sulfato de magnesio, y se concentra nuevamente hasta
obtener un aceite. Se purifica este aceite por medio de
cromatografía flash en diclorometano/acetonitrilo 3:1 para proveer
658 mg del éster butírico deseado de oxadiazinamina (1.3) como un
aceite claro.
1.4
Se disuelve el producto de 1.3 (1,1 g) d en
acetonitrilo (50 ml) y se añaden 3 g de carbonato de potasio. Se
añade el clorometil clorotiazol en una porción y se calienta la
mezcla de reacción a 55ºC durante 20 horas. Se enfría la mezcla de
reacción hasta temperatura ambiente y se la filtra para remover los
sólidos. Se concentra el filtrado marrón resultante hasta obtener
un aceite. Se purifica el aceite por medio de cromatografía flash en
diclorometano/acetonitrilo 3:1 para producir 894 mg del compuesto
deseado como un aceite amarillo/marrón.
1.5
Se disuelve el compuesto 1.4 (372 mg) en 8 ml de
HCl concentrado y 1 ml de agua y se agita durante 6 horas a
temperatura ambiente. Se diluye la mezcla de reacción con agua y se
basifica cuidadosamente por medio de la adición de NaOH 1 N hasta
obtener un pH de 4,5. Se extrae el acetato de etilo y se seca la
fracción orgánica sobre sulfato de magnesio. Se concentra la
fracción orgánica seca hasta obtener un aceite y se purifica por
medio de cromatografía flash en diclorometano/acetonitrilo 1:1 para
producir el producto deseado 1.5 (100 mg).
Ejemplos 2 -
5
La metodología de síntesis del Ejemplo 1 se la
utiliza para preparar los siguientes haptenos de tiametoxam
mostrados en la Tabla 1 por medio del reemplazo del intermediario
1.1a con un compuesto análogo apropiado de fórmula
NH_{2}(CH_{2})_{n}CO_{2}R (1.1b) en donde n es
un entero entre 1 y 5 y R es H o alquilo
C_{1}-C_{4}.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplos 6 -
9
La metodología de síntesis del Ejemplo 1 se la
utiliza para preparar los siguientes haptenos de tiametoxam
mostrados en la Tabla 2 por medio del reemplazo del intermediario
1.1a con un compuesto análogo apropiado de
fórmula
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde E es un enlace covalente
sencillo o una fracción de enlazamiento -(CH_{2})_{m}- en
donde m es un entero de 1 a 3: R es H o alquilo
C_{1}-C_{4}.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se combinaron el hapteno tiametoxam-ácido
butírico (100 mg, 0,275 mmol) y anisol (6,5 ml) en un balón de fondo
redondo de 10 ml equipado con una barra de agitación magnética y un
condensador de reflujo. El balón fue colocado en un baño de aceite
y calentado a 165ºC durante 2 h. Se removió el anisol a presión
reducida a 50ºC durante 5 h. El producto aceitoso resultante (90,2
mg) era 93% puro determinado por medio de análisis por HPLC.
- HPLC: Keystone Scientific Aquasil C-18 5u (25 x 0,46 cm); Acetonitrilo: Ácido Fosfórico 20 mM (40:60); 1,0 ml/min.; T=40C; UV @ 240 nm (BW = 100 nm); Tiempo de corrida: 13 min.; Tiempo de Retención: 4,6 min.
- TLC: (gel diol) Diclorometano/Acetonitrilo, 2:1 Rf = 0,25.
- RMN ^{1}H (CD_{3}CN, 300 MHz): \delta 7.43 (t, 1 H), 4.78 (s, 4H), 4.75 (s, 4H), 4.48 (d, 2H), 3.29 (t, 2H), 2.27 (t, 2H), 1.73 (q, 2H).
- Espectro de Masas EI/DEP: m/z 319 (M+).
- Análisis de Combustión: Teórico: C, 41.32; H, 4.41; N, 13.14;
- Encontrado: C, 40.13; H, 4.43; N, 12.99
Ejemplos 11 -
18
Se utiliza la metodología de síntesis del
Ejemplo 10 para preparar los siguientes haptenos de tiametoxam
des-nitroimino mostrados en la Tabla 3 por medio
del reemplazo del compuesto obtenido en el Ejemplo 1 con un
compuesto análogo apropiado de los ejemplos 2 - 9.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo 19 -
27
Se utiliza la metodología de síntesis del
Ejemplo 1 para preparar los siguientes haptenos de imidacloprid
mostrados en la Tabla 4 por medio del uso del derivado
nitroguanidilo obtenido en 1.2 o un análogo del mismo obtenido por
medio del reemplazo del intermediario 1.1a con un análogo apropiado
de fórmula 1.1b ó 1.1c como se muestra en los ejemplos
2-9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 28 -
36
Se utiliza la metodología de síntesis del
Ejemplo 10 para preparar los siguientes haptenos de imidacloprid
des-nitroimino mostrados en la Tabla 5 por medio del
reemplazo del compuesto obtenido en el ejemplo 1 con un compuesto
análogo apropiado de los ejemplos 19-27.
Ejemplos 37 -
45
Se utiliza la metodología de síntesis del
Ejemplo 1 para preparar los siguientes haptenos de clotiadina
mostrados en la Tabla 6 por medio del uso del derivado de
nitroguanidilo obtenido en 1.2 o un análogo del mismo obtenido por
medio del reemplazo del intermediario 1.1a con un análogo apropiado
de fórmula 1.1b ó 1.1c como se muestra en los ejemplos
2-9.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 46 -
54
Se utiliza la metodología de síntesis del
Ejemplo 10 para preparar los siguientes haptenos de clotiadina
des-nitroimino mostrados en la Tabla 7 por medio
del reemplazo del compuesto obtenido en el ejemplo 1 con un
compuesto análogo apropiado de los ejemplos
37-45.
\newpage
Ejemplos 55 -
63
Se utiliza la metodología de síntesis
especificada para los haptenos de las fórmulas (IIIA) y (IIIB) para
preparar los siguientes haptenos de clotiadina mostrados en la Tabla
8.
64.1
Se prepara una solución del derivado purificado
de proteína (Tuberculina, PPD) en PBS 0,01 M, pH 7,4, hasta una
concentración de 1 mg/ml. Se ajusta el pH de una alícuota de 0,5 ml
de esta solución en 4,5-5,0 con HCl 0,1 M.
64.2
Se disuelve el hapteno de tiametoxam del Ejemplo
1 (1 mg) en 250 \mul de ácido
2-(N-morfolino)-etanosulfónico 0,1
M, pH 4,5. Se combina el hapteno y las soluciones de PPD.
64.3
Se disuelve 1 mg de clorhidrato de
1-(dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDC) en 100 \mul de agua destilada desionizada. Se añade
inmediatamente la solución de EDC a la solución de
hapteno-PPD de 3.2. Se mezcla la solución de
hapteno-PPD-EDC por medio de
rotación durante 2 horas a temperatura ambiente. Se transfiere la
mezcla de reacción a una bolsa de diálisis con un corte de peso
molecular de 1000-2000 Dalton. Se hace una diálisis
extensiva contra 2 litros de PBS a 4ºC con tres cambios/día durante
cuarenta y ocho horas.
Se utiliza la metodología del Ejemplo 64 para
preparar un inmunógeno de imidacloprida usando el hapteno del
Ejemplo 21.
Se utiliza la metodología del Ejemplo 64 para
preparar un inmunógeno de clotiadina usando el hapteno del Ejemplo
39.
Se utiliza la metodología del Ejemplo 64 para
preparar un inmunógeno de clotiadina usando el hapteno del Ejemplo
57.
Para la inmunización inicial, se disuelve el
inmunógeno del Ejemplo 64 en Adyuvante Completo de Freund. Se
inoculan conejos blancos hembra de Nueva Zelanda. Se inyectan
aproximadamente 25 \mug de inmunógeno en cada sitio. Se inmunizan
ovejas en forma similar excepto porque se inyectan aproximadamente
38 \mug de inmunógeno en cada sitio.
En inmunizaciones posteriores, se disuelve el
inmunógeno en Adyuvante Incompleto de Freund. Los animales descansan
durante cuatro semanas entre las inmunizaciones y se les hace un
sangrado diez después de la inmunización.
Se administran inyecciones de refuerzo y se hace
un sangrado de los animales durante nueve meses, al final de los
cuales están anémicos.
Los anticuerpos policlonales se cosechan
utilizando técnicas conocidas por aquellos capacitados en el
arte.
69.1
El hapteno de tiametoxam del Ejemplo 1 (3,1 mg),
N-hidroxisuccinimida (NHS) (4,0 mg), y EDC (4,6 mg)
se combinan en un pequeño vial. Estos materiales se secan bajo una
corriente suave de nitrógeno durante 15 min a temperatura
ambiente.
69.2
Se añade dimetilformamida seca (2,0 mL) y se
sonica la mezcla durante 1 min. La solución resultante se incuba
durante la noche a temperatura ambiente.
69.3
Se disuelve peroxidasa de rábano (8,5 mg) en
amortiguador de carbonato (2,0 mL, 0,05 M, pH 9,6), en un vial
pequeño. Se coloca el vial en un baño de hielo.
69.4
Se añaden un total de 100 \mul de la solución
de hapteno-NHS-EDC de 6.2 lentamente
durante 1 hora y se incuba la mezcla con agitación durante 2
horas.
La mezcla de reacción se pasa sobre una columna
Sephadex G-25M equilibrada con PBS (0,01 M, pH 7,2).
Se recolecta el conjugado de la enzima en los primeros 3,0 mL de
eluato y se añade un volumen igual de glicerol; se almacena a
-20ºC.
Se diluye una porción del extracto de semilla en
MeOH/H_{2}O al 1% hasta llevar la concentración esperada de
tiametoxam dentro del rango de la curva de calibración, 0,5 a 120
partes por billón.
Se marcan y se colocan los tubos recubiertos con
anticuerpo en una gradilla para tubos de tal manera que el primero
y el último tubo son estándares y los demás estándares y muestras se
encuentran entremezclados. La gradilla agarra a cada tubo de tal
manera que ésta puede ser invertida sin la perdida de los tubos. Se
añade una alícuota de un estándar o muestra (0,5 mL) a todos los
tubos correspondientes. Se añade solución de conjugado enzimático
(0,5 mL) a todos los tubos. Se agita suavemente la gradilla para
mezclar los contenidos de todos los tubos. Se incuban los tubos
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se invierte la gradilla
para decantar los contenidos de todos los tubos. Se añade H_{2}O
destilada a todos los tubos hasta que se rebosen utilizando una
botella de lavado con tapa abatible y se decanta el lavado. Se lavan
los tubos tres veces más. Después del lavado final, se invierte la
gradilla y se tapan suavemente los tubos sobre una toalla de papel
limpia para remover el exceso de lavado. Se añade sustrato
enzimático (0,5 mL) a todos los tubos que se incuban durante 10
minutos a temperatura ambiente. Se agita la gradilla suavemente 2,5
minutos durante esta incubación. Se añade una solución ácida de
detención (HCl 1 M, 0,5 mL) a todos los tubos para terminar la
generación de la señal. Como se observa en la Tabla 10, la
absorbancia del producto de reacción se mide a 450 nm. Las
absorbancias de los estándares se utilizan para construir una curva
de calibración, una función de regresión en la forma de Y =
mLn(X) + B. La absorbancia de cada muestra se inserta dentro
de la función para determinar la concentración del pesticida
neonicotinoide en la muestra diluida. La concentración resultante se
multiplica por el factor de dilución para calcular la cantidad de
pesticida neonicotinoide en la muestra
original.
original.
\vskip1.000000\baselineskip
| ^{1}Concentración de Tiametoxam | Absorbancia a 450 nm | |
| (respuesta analítica) | ||
| 120 | 0,3145 | |
| 20 | 0,6636 | |
| 3 | 1,0283 | |
| 0,5 | 1,3618 | |
| ^{1}Unidades de Partes Por Billón. |
\vskip1.000000\baselineskip
La función que describe la respuesta de los
estándares de tiametoxam se genera por medio de análisis de
regresión. Este conjunto de datos produjo una curva estándar de Y =
-.191 Ln(X) + 1.23, r = .999 en la cual Y = la respuesta
analítica y X = la concentración de los estándares de
tiametoxam.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de semilla tratada se dividen en
submuestras para añadirles en forma aleatoria 50 g de algodón,
campo de mies, sorgo, maíz dulce, y trigo o 40 g de canola en jarras
de boca ancha de 8 oz. La canola se divide en submuestras cuatro
veces; se utilizan cinco submuestras de los otros tipos de semilla.
Se añade solvente (150 ml) y se sella tapa en forma ajustada. Se
extrae el algodón en acetonitrilo/agua al 5% mientras que otras
semillas utilizan un sistema solvente de metanol/agua al 20%. Se
agita vigorosamente la jarra en forma manual durante 30 segundos y
se la coloca en un baño de agua para sonicación a temperatura
ambiente durante 20 minutos. Las muestras se agitan una segunda vez
como se describió previamente. A los contenidos de cada jarra se les
permite que se asienten aproximadamente durante 5 minutos y se
remueve una alícuota (0,10 ml) para análisis. Se diluye la alícuota
en metanol/agua al 1% para llevar al residuo dentro del rango de la
curva estándar.
\newpage
Los tubos de cultivo de poliestireno recubiertos
con anticuerpo se marcan y se los coloca en la gradilla de tal
manera que el primero y el último de los tubos son estándares y se
mezclan los estándares restantes y las muestras. Se añaden las
soluciones de la muestra y del estándar (0,50 ml) a los tubos
correspondientes. Se añade un volumen similar de solución de
conjugado enzimático. Se agita suavemente la gradilla para mezclar
las soluciones y se ponen en incubación durante 20 minutos a
temperatura ambiente. Se remueven los contenidos de todos los tubos
invirtiendo la gradilla sobre un cuenco de acero inoxidable. Se lava
cada tubo hasta que rebose con agua destilada. La gradilla se
invierte sobre el vertedero para descargar el agua de lavado. El
lavado se repite cuatro veces. Luego se invierte la gradilla y se la
golpea suavemente sobre una toalla de papel para remover la mayor
parte del agua remanente. (El poco líquido que pueda quedar en los
tubos no afecta los resultados del ensayo). Se añade solución con
sustrato de enzima (0,5 ml) a los tubos, que se incuban durante
diez minutos a temperatura ambiente. Se agita suavemente la gradilla
a intervalos de 2,5 min para asegurarse que la enzima mantenga un
abundante suministro de sustrato. La generación de la señal
coloreada de azul se termina por medio de la adición de una
solución ácida de detención (0,50 ml). La absorbancia de la solución
en cada tubo se mide espectrofotométricamente a
450 nm.
450 nm.
La concentración de analito en las muestras se
determina a partir de una función de regresión en la forma de y = m
ln(x) + b.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la reactividad cruzada, o
especificidad del inmunoensayo para determinar si otras sustancias
de prueba encontradas en el recubrimiento de la semilla
interferiría con la medición del tiametoxam. Las sustancias de
prueba se disuelven en metanol/agua al 1% hasta concentraciones en
el rango de 1000 hasta 0,01 ng/ml. Las alícuotas de cada
concentración se analizan como se describió anteriormente. La
reactividad de cada sustancia de prueba en este rango se determina
como se describió previamente en Brady, J.F; Turner, J.; Skinner,
D.H. "Application of a triasulfuron enzyme immunoassay to the
analysis of incurred residues in soil and water samples." J.
Agric. Food Chem. 1995, 43:2542-2547.
\vskip1.000000\baselineskip
Entre las sustancias de prueba analizadas,
únicamente se encontró que el tiametoxam era significativamente
reactivo con el inmunoensayo (Tabla 9 más abajo). Por lo tanto, este
inmunoensayo es específico para tiametoxam.
Las submuestras de muchas de las semillas
tratadas fueron analizadas por medio de inmunoensayo y por medio de
HPLC. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 11.
La Tabla 11 describe la correlación de los resultados de la media
del inmunoensayo utilizando un anticuerpo policlonal y un análisis
de HPLC de cuarenta muestras de semilla para tiametoxam. La línea
de regresión más conveniente indica que se obtuvieron resultados
similares para cada método.
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\vskip1.000000\baselineskip
El alcance de la invención se determina por
medio de las reivindicaciones anexas.
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Claims (30)
1. Un anticuerpo útil en un inmunoensayo de una
muestra para determinar la cantidad de un insecticida
neonicotinoide, en donde dicho anticuerpo (I) es un anticuerpo
policlonal producido por medio de la inmunización de un animal con
un hapteno neonicotinoide conjugado con una proteína inmunogénica
portadora y (II) específicamente enlazada al insecticida
neonicotinoide, y en donde dicho anticuerpo es selectivo para un
compuesto de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- en donde A es 2-cloropirid-5-il ó 2-clorotiazol-5-il;
- R y R^{3} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{1} y R^{2} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} o R^{1} y R^{2} son tomados ambos con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos para formar una imidazolidina o un anillo de oxadiazina; y
- X es N-NO_{2} o N-CN.
2. El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación
1, en donde dicho anticuerpo es selectivo para un compuesto
seleccionado del grupo que consiste de imidacloprida, tiametoxam y
clotiadina.
3. Un compuesto de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- en donde A es 2-cloropirid-5-il ó 2-clorotiazol-5-il;
- R^{3} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{1} y R^{2} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} o R^{1} y R^{2} son tomados ambos con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos para formar una imidazolidina o un anillo de oxadiazina;
- n es un entero de 1 a 4; y
- X es N-NO_{2} o N-CN.
4. Un compuesto de acuerdo a la reivindicación
3 de fórmula
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5. Un compuesto de acuerdo a la reivindicación 4
de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un compuesto de acuerdo a la reivindicación 3
de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un compuesto de acuerdo a la reivindicación
6 de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
8. Una proteína conjugada de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
- en donde A es 2-cloropirid-5-il ó 2-clorotiazol-5-il;
- R^{3} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{1} y R^{2} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} o R^{1} y R^{2} son tomados ambos con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos para formar una imidazolidina o un anillo de oxadiazina;
- n es un entero de 1 a 4;
- X es N-NO_{2} o N-CN; y
- PR es un residuo de proteína de una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de un derivado purificado de proteína (PPD, Tuberculina) del virus Diptheria, albúmina de suero bovino, albúmina de suero bovino cationizado, albúmina de suero humano, ovoalbúmina y hemocianina de lapa ojo de cerradura; o un residuo de enzima seleccionado del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, y \beta-galactosidasa.
9. Un conjugado de proteína de acuerdo a la
reivindicación 8 de fórmula
10. Un conjugado de proteína de acuerdo a la
reivindicación 8 de fórmula
11. Un método para determinar la concentración
de un insecticida neonicotinoide en una muestra, que comprende las
etapas de:
- (a)
- proveer una fase sólida con un anticuerpo inmovilizado selectivo para dicho insecticida neonicotinoide, en donde dicho anticuerpo es selectivo para un compuesto de fórmula
- en donde A es 2-cloropirid-5-il ó 2-clorotiazol-5-il;
- R y R^{3} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{1} y R^{2} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} o R^{1} y R^{2} son tomados ambos con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos para formar una imidazolidina o un anillo de oxadiazina; y
- X es N-NO_{2} o N-CN;
- (b)
- poner en contacto a dicha muestra con el anticuerpo inmovilizado en presencia de una cantidad conocida de un conjugado enzima-hapteno del insecticida neonicotinoide;
- (c)
- lavar la fase sólida de la etapa (b) para remover cualquier conjugado enzima-hapteno no enlazado o muestra;
- (d)
- hacer reaccionar un sustrato cromogénico específico para dicho conjugado enzima-hapteno con la fase sólida lavada de la etapa (c) con el propósito de generar un cromógeno; y
- (e)
- medir la cantidad del cromógeno producido en la etapa (d) con el propósito de determinar la cantidad de conjugado enzima-hapteno enlazada al anticuerpo y por lo tanto la cantidad de insecticida neonicotinoide en dicha muestra.
12. Un método de acuerdo a la reivindicación 11
en donde dicha muestra se obtiene por medio de extracción de un
material de propagación de una planta en un solvente adecuado.
13. Un método de acuerdo a la reivindicación 12
en donde dicho material de propagación de una planta es una
semilla.
14. Un método de acuerdo a la reivindicación 13
en donde dicha semilla se selecciona del grupo que consiste de
canola, sorgo, trigo, algodón, campo de mies o maíz dulce.
15. Un método de acuerdo a la reivindicación 11
en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal producido por
medio de la inmunización de un animal con insecticida neonicotinoide
conjugado con una proteína inmunogénica portadora.
16. Un método de acuerdo a la reivindicación 15
en donde dicha proteína inmunogénica potadora es una molécula
portadora seleccionada del grupo que consiste de un derivado
purificado de proteína (PPD, Tuberculina) del virus
Diptheria, albúmina de suero bovino, albúmina de suero bovino
cationizado, albúmina de suero humano, ovoalbúmina y hemocianina de
lapa ojo de cerradura.
17. Un kit útil para un inmunoensayo de una
muestra para determinar la cantidad de un insecticida
neonicotinoide, en donde el kit contiene en combinación en uno o más
contenedores:
- (a)
- una fase sólida con un anticuerpo inmovilizado selectivo para dicho insecticida neonicotinoide en donde dicho anticuerpo es selectivo para un compuesto de fórmula
- en donde A es 2-cloropirid-5-il ó 2-clorotiazol-5-il;
- R y R^{3} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{1} y R^{2} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4} o R^{1} y R^{2} son tomados ambos con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos para formar una imidazolidina o un anillo de oxadiazina; y
- X es N-NO_{2} o N-CN;
- (b)
- un conjugado enzimático que contiene una enzima conjugada a un hapteno neonicotinoide.
18. El kit de la reivindicación 17 en donde el
anticuerpo es un anticuerpo policlonal producido por medio de
inmunización de un animal con un neonicotinoide conjugado con una
proteína inmunogénica portadora.
19. El kit de la reivindicación 17 en donde la
enzima es peroxidasa de rábano.
20. El kit de la reivindicación 17 en donde el
anticuerpo se enlaza específicamente a un insecticida neonicotinoide
seleccionado del grupo que consiste de imidacloprid, tiametoxam y
clotiadina.
21. Un anticuerpo útil en el inmunoensayo de una
muestra para determinar la cantidad de un insecticida
neonicotinoide, en donde dicho anticuerpo (I) es un anticuerpo
policlonal producido por medio de la inmunización de un animal con
un hapteno neonicotinoide conjugado con una proteína inmunogénica
portadora y (II) se enlaza específicamente al insecticida
neonicotinoide, y en donde dicho anticuerpo es selectivo para un
compuesto seleccionado entre nitenpiram, acetamiprida y
tiacloprida.
22. Un método para determinar la concentración
de un insecticida neonicotinoide en una muestra, que comprende las
etapas de:
- (a)
- proveer una fase sólida con un anticuerpo inmovilizado selectivo para el insecticida neonicotinoide, en donde dicho anticuerpo es selectivo para un compuesto seleccionado entre nitenpiram, acetamiprida y tiacloprida;
- (b)
- poner en contacto a dicha muestra con el anticuerpo inmovilizado en presencia de una cantidad conocida de un conjugado enzima-hapteno del insecticida neonicotinoide;
- (c)
- lavar la fase sólida de la etapa (b) para remover cualquier conjugado enzima-hapteno no enlazado o muestra;
- (d)
- hacer reaccionar un sustrato cromogénico específico para dicho conjugado enzima-hapteno con la fase sólida lavada de la etapa (c) con el propósito de generar un cromógeno; y
- (e)
- medir la cantidad del cromógeno producido en la etapa (d) con el propósito de determinar la cantidad de conjugado enzima-hapteno enlazada al anticuerpo y por lo tanto la cantidad de insecticida neonicotinoide en dicha muestra.
23. Un método de acuerdo a la reivindicación 22
en done dicha muestra se obtiene por medio de la extracción de un
material de propagación de la planta en un solvente adecuado.
24. Un método de acuerdo a la reivindicación 23
en done dicho material de propagación de la planta es una
semilla.
25. Un método de acuerdo a la reivindicación 24
en done dicha semilla se selecciona del grupo que consiste de
canola, sorgo, trigo, algodón, maizales o maíz dulce.
26. Un método de acuerdo a la reivindicación 22
en done dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal producido por
medio de la inmunización de un animal con un insecticida
neonicotinoide conjugado con una proteína inmunogénica
portadora.
27. Un método de acuerdo a la reivindicación 26
en done dicha proteína inmunogénica portadora es una molécula
portadora seleccionada del grupo que consiste de un derivado de
proteína purificada (PPD, Tuberculina), del virus de la
Diptheria, albúmina de suero bovino, albúmina cationizada de
suero bovino, albúmina de suero humano, ovoalbúmina y hemocianina
de lapa ojo de cerradura con un hapteno neonicotinoide.
28. Un kit útil para un inmunoensayo de una
muestra para determinar la cantidad de un insecticida
neonicotinoide, en donde el kit comprende en combinación en uno o
más contenedores:
- (a)
- una fase sólida con un anticuerpo inmovilizado selectivo para dicho insecticida neonicotinoide en donde dicho anticuerpo es selectivo para un compuesto seleccionado entre nitenpiram, acetamiprida y tiacloprida;
- (b)
- un conjugado enzimático que contiene una enzima conjugada a un hapteno neonicotinoide.
29. El kit de la reivindicación 28 en donde el
anticuerpo es un anticuerpo policlonal producido por medio de
inmunización de un animal con un neonicotinoide conjugado con una
proteína inmunogénica portadora.
30. El kit de la reivindicación 28 en donde la
enzima es peroxidasa de rábano.
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