PL205558B1 - Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne - Google Patents

Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne

Info

Publication number
PL205558B1
PL205558B1 PL346704A PL34670499A PL205558B1 PL 205558 B1 PL205558 B1 PL 205558B1 PL 346704 A PL346704 A PL 346704A PL 34670499 A PL34670499 A PL 34670499A PL 205558 B1 PL205558 B1 PL 205558B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
sequence
nucleic acid
amylase
acid sequence
plant
Prior art date
Application number
PL346704A
Other languages
English (en)
Other versions
PL346704A1 (en
Inventor
Thomas Anthony Kavanagh
Nga Thi Lao
Original Assignee
Cambridge Advanced Tech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9817963.3A external-priority patent/GB9817963D0/en
Priority claimed from GBGB9817959.1A external-priority patent/GB9817959D0/en
Priority claimed from GBGB9913014.8A external-priority patent/GB9913014D0/en
Application filed by Cambridge Advanced Tech filed Critical Cambridge Advanced Tech
Publication of PL346704A1 publication Critical patent/PL346704A1/xx
Publication of PL205558B1 publication Critical patent/PL205558B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8221—Transit peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne.
Precyzyjny mechanizm syntezy i rozkładu skrobi w roślinach jest nieznany pomimo wyizolowania i scharakteryzowania licznych enzymów, które przypuszczalnie biorą udział w tych procesach.
Skrobia jest gromadzona w chloroplastach liści w czasie dnia i jest zużywana w celu zaspokojenia potrzeb rośliny na energię i biosyntezę w czasie nocy. Sposób, w jaki ta, tak zwana przejściowa, skrobia jest mobilizowana, nie jest w pełni zrozumiały, ale musi obejmować skoordynowane aktywności fosforolityczne i hydrolityczne, a w szczególności aktywność α-glukozydazy (E.C. 3.2.1.3) (Nielson and Sitt, 1997).
Skrobia jest gromadzona w organach spichrzowych, takich jak nasiona, owoce i bulwy. W tym przypadku skrobia jest przechowywana przez dłuższy czas, a mobilizacji skrobi towarzyszy degeneracja tkanek organu spichrzowego i wzrost aktywności amylolitycznej i fosforolitycznej. Jednakże istnieją dane sugerujące, że rozkład skrobi następuje również w amyloplastach organów spichrzowych (Sweetlove et al, 1996). To znowu wymaga skoordynowanej regulacji aktywności enzymów syntetyzujących i rozkładających.
Zarówno chloroplasty jak i amyloplasty pochodzą z proplastydów i mają zatem wiele wspólnych cech charakterystycznych poza tym, że stanowią miejsce syntezy skrobi w liściach i organach spichrzowych, odpowiednio; chloroplasty mogą przekształcić się w amyloplasty i inne typy plastydów (Thomson and Whatley, 1980).
Skrobia stanowi mieszaninę dwóch polisacharydów: amylozy, która jest liniowym łańcuchem reszt glikozylowych połączonych wiązaniami a-1,4-glikozydowymi; i amylopektyny, która jest utworzona z wielu liniowych łańcuchów a-1,4-poliglukanów, które są połączone ze sobą wiązaniami α-1,6-glikozydowymi.
Enzymami biorącymi udział w syntezie skrobi są pirofosforylaza ADPG (E.C. 2.7.7.21), syntaza skrobiowa (E.C.2.4.1.21) i enzym rozgałęziający (E.C. 2.4.1.18). Pirofosforylaza ADPG jest odpowiedzialna za dostarczanie substratu ADPG, cząsteczki służącej jako donor monomerów glukozy, które są łączone ze sobą przez wspólne działanie syntaz skrobiowych (wiązania α-1,4) i enzymów rozgałęziających (wiązania α-1,6).
Uważa się, że nierozpuszczalna, krystaliczna struktura ziaren skrobiowych tworzy się przez ciasne upakowanie długich, helikalnych, rozgałęzionych cząsteczek amylopektyny z liniowymi cząsteczkami amylozy wypełniającymi wolne przestrzenie.
Opisano cały szereg aktywności enzymatycznych rozkładających skrobię, obejmujących α-amylazę (E.C. 3.2.1.1), izoamylazę (E.C. 3.2.1.68), β-amylazę (E.C. 3.2.1.2), α-glukozydazę (E.C. 3.2.1.3), fosforylazę skrobiową (E.C. 2.4.1.1) oraz enzym dysproporcjonujący (E.C. 2.4.1.25). Wiele z tych aktywności enzymatycznych występuje w wielu postaciach w roślinach, niektóre z nich, jak się sądzi, biorą udział w syntezie skrobi. Wszystko to ma miejsce, do pewnego stopnia, w procesie mobilizacji skrobi, jednakże ich dokładna rola i możliwe oddziaływania pozostają jeszcze do ustalenia. Trudności w przypisaniu roli tym różnym enzymom najlepiej ilustrują dwie z tych aktywności enzymatycznych, które uważa się za mające największy udział w rozkładzie skrobi w roślinach: fosforylaza skrobiowa i amylaza.
Fosforylaza skrobiowa katalizuje odwracalne uwolnienie glukozo-1-fosforanu z a-1,4-glukanów. Dwie postaci fosforylazy skrobiowej zostały znalezione w tkankach roślinnych: Pho1 albo typu-L jest zlokalizowana wewnątrz plastydów i ma wysokie powinowactwo do maltodekstryn; Pho2 lub typu H jest cytozolowa i ma wysokie powinowactwo do dużych, wysoce rozgałęzionych poliglukanów, takich jak glikogen. Jakkolwiek plastydowy enzym Pho2 byłby prawdopodobnym kandydatem na uczestniczenie w mobilizacji skrobi, antysensowna inhibicja aktywności enzymatycznej w liściach nie ma żadnego wpływu ma akumulację skrobi w liściach transgenicznego ziemniaka (Sonnewald et al., 1995). W innych badaniach, antysensowna inhibicja cytoplazmatycznego Pho2 miała wpływ na kiełkowanie transgenicznych bulw ziemniaka, ale nie miała wpływu na akumulację i rozkład skrobi (Duwenig et al., 1997).
Występują dwie główne grupy amylaz, z których każda hydrolizuje wiązania a-1,4-glukozydowe w amylozie i amylopektynie: α-amylaza działa losowo na wiązania nie-końcowe, podczas gdy β-amylaza uwalnia jednostki maltozy rozpoczynając od nieredukującego końca łańcucha poliglukanowego. Uważa się, że subkomórkowa lokalizacja β-amylazy w przestrzeni apoplastydowej komórek
PL 205 558 B1 roślinnych odzwierciedla fakt, że enzym normalnie jest wydzielany. Jednakże u wielu roślin, takich jak ryż (Chen et al., 1994) i burak cukrowy (Li et al., 1992) enzym jest zlokalizowany również wewnątrz chloroplastów i amyloplastów, pomimo stwierdzenia, że sekwencje sygnałowe na końcu aminowym wielu α-amylaz są charakterystyczne raczej dla translokacji białka przez błonę ER niż błonę plastydową (Chen et al., 1994. W badaniach, gdzie promotor i sekwencja sygnałowa genu α-amylazy z ryżu zostały połączone z bakteryjnym genem GUS i wprowadzone do ryżu, tytoniu i ziemniaka przy zastosowaniu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium (Chen et al., 1994), wykazano, że wyrażana fuzja białkowa z GUS była najpierw transportowana do endoplazmatycznego retikulum, a następnie eksportowana do pożywki hodowlanej zawiesinowej hodowli transgenicznych komórek. W licznych badaniach pokazano, że α-amylaza będzie rozkładała natywne cząsteczki skrobi.
W przeciwieństwie do tego, badania in vitro wykazały, że β-amylaza nie będzie rozkładała natywnych ziaren skrobi bez wcześniejszego strawienia ziaren innymi enzymami. Mutanty ryżu (Daussant et al., 1981) i soi (Hildebrand and Hymowitz, 1981), którym brak aktywnej β-amylazy lub które zawierają jedynie ślady aktywności, odpowiednio, wyraźnie wykazują normalny wzrost i rozwój. Ponadto, transgeniczne rośliny Arabidopsis, w których poziom β-amylazy był znacznie obniżony, nie wykazują poważnych defektów wzrostowych (Mita et al., 1997). W usiłowaniach zdefiniowania dokładnej roli fizjologicznej β-amylaz w roślinach przeszkadzały nieprzekonywujące dane dotyczące subkomórkowej lokalizacji. Jakkolwiek jedno z badań (Kakefuda et al., 1986) donosiło o obecności dwóch β-amylaz w chloroplastach grochu, to wniosek z większości badań obejmujących gatunki, takie jak Vicia faba, jęczmień, pszenica, soja, słodki ziemniak i groch, był taki, że większość, jeżeli nie cała, aktywność β-amylazy jest pozachloroplastowa (Nakamura et al., 1991). Pogląd ten był poparty faktem, że wszystkie geny β-amylazy sklonowane do tej pory kodują białka, którym brak aminokońcowej chloroplastowej sekwencji peptydu sygnałowego.
U zbóż opisano trzy typy β-amylazy: postać specyficzną dla bielma, która akumuluje się czasie dojrzewania kłosów; formę, która jest syntetyzowana de novo w komórkach aleuronowych ryżu i kukurydzy w czasie kiełkowania (Wang et al., 1996, 1997); i β-amylazę, która występuje we wszystkich organach wegetatywnych. U Arabidopsis, wszechobecna postać odpowiada za około 80% całkowitej aktywności rozkładającej skrobię w liściach rozetowych. Podobnie jak wszystkie inne sklonowane dotychczas geny β-amylazy, gen wszechobecnej β-amylazy Arabidopsis nie koduje białka z subkomórkowym sygnałem kierującym, a zatem enzym jest prawdopodobnie zlokalizowany w cytozolu.
Odkrycia wielu badań, że aktywności rozkładające można usunąć bez szkodliwego wpływu na żywotność komórki, plus subkomórkowa lokalizacja enzymów rozkładających skrobię poza plastydem, są zaskakujące. Obserwowany brak aktywności β-amylazy zlokalizowanej w plastydach jest szczególnie nieoczekiwany w świetle faktu, że spodziewany produkt końcowy aktywności β-amylazy, a mianowicie maltoza, został zidentyfikowany jako produkt rozkładu skrobi w izolowanych chloroplastach (Peavey et al., 1977). Ostatnio pokazano, że zarówno glukoza, jak i maltoza są eksportowane z izolowanych amyloplastów w pączkach kalafiora w czasie procesu mobilizacji skrobi (Neuhaus et al., 1995).
Zdolność do manipulowania ilością skrobi w plastydach liści lub organów spichrzowych dawałaby duże korzyści dla wielu procesów przemysłowych, które wykorzystują skrobie roślinne. Przykładowo, podejmując próby zwiększenia zawartości skrobi w bulwach ziemniaka pokazano uprzednio, że kiedy glgC16 dla ADPG PPazy z E. coli ulega nadekspresji w transgenicznych bulwach ziemniaka, ma miejsce wzrost przepływu węgla do skrobi, ale następuje jedynie niewielki wzrost ostatecznej akumulacji skrobi (Sweetlove et al., 1997). Analiza aktywności enzymatycznych w liniach z nadekspresją pokazała, że poza zmianami dla ADPG PPazy, aktywność amylazy, a w szczególności β-amylazy, była również zmieniona. Te dane sugerują, że akumulacji skrobi w bulwach nadprodukujących białko glgC16 przeciwdziała rozkład nowo zsyntetyzowanej skrobi, tzn. ma miejsce obrót skrobią.
W innym przykładzie, dostępność skrobi w czasie procesu słodowania jest ściśle skorelowana z typem i ilością aktywności enzymów rozkładających w roślinach, a w szczególności w organach spichrzowych. Wzrost zdolności do rozkładu w roślinach uprawnych spowodowałby, ze słodowanie ziaren zbóż lub przekształcanie skrobi z bulw lub innych organów spichrzowych byłoby wydajne i produktywne.
Typ skrobi obecny w organach spichrzowych zależy od postaci i aktywności występujących tam pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej, enzymu rozgałęziającego i enzymów rozkładających. Oddziaływania pomiędzy różnymi enzymami będą miały również duże znaczenie.
Istnieje stosunkowo duże zainteresowanie w tworzeniu nowych skrobi w roślinach, ponieważ zmniejsza to koszty obróbki i modyfikacji skrobi przed ich użyciem w różnych przemysłach, takich jak spożywczy, papierniczy, farmaceutyczny, klejarski, olejarski i tekstylny. Następujące dalej przykłady
PL 205 558 B1 pokazują, w jaki sposób aktywność hydrolizy skrobi może być ważna przy zmienianiu struktury skrobi in vivo.
Pokazano, że w ziarnach kukurydzy, mutacja sugaryl powoduje nieobecność enzymu usuwającego rozgałęzienia, który hydrolizuje wiązania a-1,6-glikozylowe w skrobi (James et al., 1995). Mutacja powoduje zmniejszenie stężenia amylopektyny i akumulację wysoce rozgałęzionego glikopolisacharydu, fitoglikogenu.
Pokazano, że u grochu, krótkie cząsteczki oligosacharydowe, rozpoczynające się od maltozy i dodające kolejne reszty glukozy aż do uzyskania maltoheptozy, specyficznie stymulują aktywność związanej z ziarnami skrobi syntazy skrobiowej I (GBSSI) (Denyer et al., 1996), która jest ogólnie uważana za główny enzym odpowiedzialny za syntezę amylozy (np. van der Leij et al., 1991; Hylton et al., 1995: Ainsworth et al., 1993). Manipulacja aktywnością GBSSI przez kontrolowanie dostarczania malto-oligosacharydów jest przedmiotem wynalazku ujawnionego w WO 97/16554 i sugeruje, że wzrost stężenia malto-oligosacharydów, a zatem wzrost stosunku amylozy do amylopektyny w skrobi, można uzyskać przez wprowadzenie enzymów rozkładających, a mianowicie α-amylazy, β-amylazy, enzymu dysproporcjonującego, enzymu usuwającego rozgałęzienia i fosforylazy skrobiowej. W publikacji W097/16554 ujawniono również, że geny dla izoform plastydowych tych enzymów zostały sklonowane. Jednakże, jak omówiono powyżej, żaden z genów β-amylazy wyizolowanych do tej pory nie koduje enzymu β-amylazy z białkową sekwencją kierującą, a ponadto istnieją wątpliwości, czy te α-amylazy są wyjściowo kierowane do plastydów (Chen et al., 1994, Chan et al., 1994). Później, w WO/16554, wspomina się o wytworzeniu odpowiednich sekwencji cDNA β-amylazy metodą inżynierii genetycznej, tak aby dodać sekwencję kierującą do plastydów.
Poza zastosowaniem przemysłowym skrobi z organów spichrzowych, duża ilość skrobi w liściach ma istotne znaczenie dla uprawy roślin. Skrobia jest syntetyzowana w liściach na świetle w dzień z węgla wiązanego w trakcie fotosyntezy. Skrobia jest gromadzona w chloroplastach i ulega rozkładowi w nocy, stając się źródłem energii i związków pośrednich dla metabolizmu rośliny. Mechanizm kontrolujący zależność źródło-ujście jest obecnie nieznany, jednakże jest jasne, że manipulacja ilością i dostępnością skrobi w plastydach liści będzie miała zasadniczy wpływ na produktywność rośliny (biomasę i wydajność).
Ilość skrobi w liściach będzie również ważna dla tych roślin uprawnych, gdzie liście stanowią towar roślinny, na przykład tytoń. Wiadomo, że zawartość skrobi ma wpływ na zapach przy paleniu tytoniu. Dostarczenie sposobów manipulowania poziomem skrobi w liściach tytoniu mogłoby być przedmiotem zainteresowania przemysłu tytoniowego.
Opisano tu po raz pierwszy izolację cDNA kodującego nową β-amylazę, która jest kierowana do plastydów (i dlatego określana dalej jako kierowana do chloroplastów (ct) β-amylaza) za pośrednictwem nowej sekwencji kierującej. Izolacja tej całej sekwencji kodującej jest zaskakująca, ponieważ powszechnie sądzono, że β-amylaza bierze udział jedynie w hydrolizie skrobi po uwolnieniu z plastydu do cytoplazmy mniejszych fragmentów poliglukanowych bądź przez translokację bądź rozpad błony. Lokalizacja enzymu w plastydach otwiera nieprzewidywalną wcześniej możliwość, że ct β-amylaza bierze udział w rozkładzie przejściowej skrobi znajdującej się w chloroplastach i skrobi zapasowej znajdującej się w amyloplastach.
Podobieństwo cech chloroplastów i amyloplastów (Thomas i Whatley, 1980) jest ważne dla obecnego wynalazku, ponieważ wykazano, że peptydy przejściowe z polipeptydów kierujących do chloroplastów mogą importować polipeptydy heterologiczne do amyloplastów i odwrotnie. Przykładowo, peptyd kierujący syntazy skrobiowej związanej z ziarnami z kukurydzy po połączeniu z β-glukuronidazą (GUS) z E. coli będzie importował białko GUS nie tylko do amyloplastów, ale również do chloroplastów (Klosgen i Weil, 1991).
Ponadto, pokazano, że ekspresja genu ct-Bmy z Arabidopsis i ekspresja fuzji promotor ct-Bmy: GUS w transgenicznym tytoniu może być regulowana niezależnie zarówno przez światło, jak i sacharozę. Jest to nieoczekiwane w świetle ścisłego związku odpowiedzi na indukcję światłem i cukrem ATβ-Amy Arabidopsis (Mita et al., 1995).
Niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako Id. Sekw. Nr: 1 o nukleotydach 1-294 kodującej sekwencję zdolną do kierowania białka do plastydu roślinnego, lub sekwencje o 65% lub więcej identyczności z Id. Sekw. Nr: 1, które hybrydyzują z sekwencją z Id. Sekw. Nr: 1 w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują sekwencję mającą taką samą zdolność kierowania.
Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego koduje do 94 aminokwasów lub do 85 aminokwasów.
PL 205 558 B1
Ponadto wynalazek dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako Id. Sekw. Nr: 2 o nukleotydach 1-1662 i kodującej β-amylazę, lub sekwencje mające 65% lub więcej identyczności z Id. Sekw. Nr: 2 i które hybrydyzują z Id. Sekw. Nr: 2 w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują β-amylazę.
W zakres wynalazku wchodzi też sekwencja kwasu nukleinowego określona jako Id. Sekw. Nr: 3 o nukleotydach 1-1953 i kodująca β-amylazę kierowaną do chloroplastów, albo sekwencje mające co najmniej 65% albo więcej identyczności z ujawnioną sekwencją w Id. Sekw. Nr: 3, które hybrydyzują z sekwencją Id. Sekw. Nr: 3, w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują β-amylazę kierowaną do chloroplastu.
Wszystkie sekwencje według wynalazku mogą być sekwencją mRNA, cDNA lub sekwencją genomowego DNA.
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania rośliny transgenicznej, który obejmuje etapy stabilnego wprowadzania do genomu roślinnego genu chimerowego zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydów według wynalazku.
Korzystnie gen chimerowy ponadto zawiera sekwencję kodującą β-amylazę, korzystniej nieplastydową β-amylazą.
Korzystnie w sposobie według wynalazku sekwencją kodującą jest sekwencja według wynalazku kodująca β-amylazę.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje zwiększanie lub zmniejszanie aktywności β-amylazy w roślinie.
Korzystnie w sposobie według wynalazku sekwencją kodującą jest sekwencja według wynalazku kodująca β-amylazę kierowaną do chloroplastów.
Korzystnie sposób obejmuje zregenerowanie rośliny o zmienionym genomie.
Korzystnie gen chimerowy ponadto zawiera sekwencję kodującą enzym z grupy składającej się z syntazy sacharozowej, pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej, enzymu rozgałęziającego, α-amylazy, izoamylazy, nie-plastydowej β-amylazy, α-glukozydazy, fosforylazy skrobiowej i enzymu dysproporcjonującego.
Korzystnie chimerowy gen ponadto zawiera promotor, którym jest sekwencja kwasu nukleinowego zdolna do kierowania ekspresją produktu kodowanego przez sekwencję kodującą, która jest z nią funkcjonalnie połączona, przy czym ta sekwencja kwasu nukleinowego jest określona jako Id. Sekw. Nr: 8 lub mająca z nią co najmniej 65% identyczności i ma tę samą funkcję, i odpowiada na bodziec, a poziom ekspresji takiego produktu zmienia się w odpowiedzi na bodziec stosowany wobec tej sekwencji kwasu nukleinowego.
Bodźcem takim może być światło lub jego brak i/lub zróżnicowane poziomy cukru. Alternatywnie, bodźcem jest bodziec, który jest kontrolowany w rozwoju.
Indukowany promotor lub sekwencja kwasu nukleinowego zdolna do kierowania ekspresją takiego produktu w roślinach może działać w warunkach, kiedy nie ma światła, ale obecny jest cukier albo mnie ma cukru, ale obecne jest światło. Tkanką rośliny, gdzie nie ma światła, ale obecny jest cukier może być, odpowiednio, organ podziemny albo organ odbieralnikowy. Organami podziemnymi mogą być, na przykład bulwy, kłącza albo korzenie, podczas gdy innymi organami odbieralnikowymi mogą być młode liście i nasiona.
Tkanką rośliny, gdzie nie ma cukru, ale obecne jest światło mogą być starsze liście (gdzie żaden cukier nie jest transportowany), części kwiatu albo kiełkujące nasiona.
Korzystnie gen chimerowy zawiera ponadto sekwencję kodującą białko lub enzym, które są jednym lub więcej elementami w szlaku z następującej grupy: synteza lipidów, fotosynteza, metabolizm aminokwasów, wiązanie azotu, wiązanie węgla lub synteza polimerów węglowodanowych; albo mają zdolność nadawania cech roślinom.
Korzystniej sposób obejmuje kierowanie białka lub enzymu do plastydu roślinnego.
Korzystnie nadawana cecha jest wybrana z następującej grupy: oporności na herbicydy i oporności na szkodniki.
Korzystnie w sposobie według wynalazku roślina już wykazuje zwiększenie lub zmniejszenie aktywności enzymatycznej w szlaku biosyntezy skrobi jako wynik transformacji genetycznej i obejmuje zmianę dalszego enzymu w celu podwyższenia lub obniżenia poziomu enzymu, a tym samym zwiększenia lub zmniejszenia ilości skrobi wytworzonej przez retransformowaną roślinę, przy czym kolejnym enzymem jest kierowana do plastydu β-amylaza, która zawiera sekwencję Id. Sekw. Nr: 1.
PL 205 558 B1
Korzystniej β-amylaza kierowana do plastydu obejmuje Id. Sekw. Nr: 1, a pierwszą stransformowaną rośliną jest transgeniczny ziemniak transformowany genem pirofosforylazy adenozynodifosforano-glukozowej (ADPG-PPazy).
Korzystnie w sposobie gen chimerowy ponadto zawiera promotor wybrany z grupy składającej się z promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (pełnego albo skróconego), promotora rubisco, promotora plastocyjaniny z grochu, promotora syntazy nopalinowej, promotora białka wiążącego chlorofil a/b, promotora gluteniny o wysokim ciężarze cząsteczkowym, promotora α,β-gliadyny, promotora hordeiny oraz promotora patatyny.
Korzystnie sekwencja kodująca enzym w genie chimerowym dostarcza możliwości regulowania w górę albo w dół aktywności tego enzymu.
W zakres wynalazku wchodzi też gen chimerowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję według wynalazku zdolną do kierowania białka do plastydu roślinnego.
Ponadto wynalazek dotyczy genu chimerowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydu według wynalazku i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą enzym ze szlaku rozkładu skrobi, kodowany przez sekwencję według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi również gen chimerowy, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego zdolną do kierowania ekspresją dalszej sekwencji kodującej, którą jest sekwencja według wynalazku.
Wynalazek dotyczy też komórek roślinnych zawierających sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku.
Ponadto w zakres wynalazku wchodzą nasiona transgenicznej rośliny zawierające jedną albo więcej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku.
Wynalazek dotyczy też roślin transgenicznych zawierających komórki roślinne według wynalazku.
Korzystnie rośliny te są roślinami, z których jedna lub więcej jest wybrana z grupy składającej się z ziemniaków, pszenicy, kukurydzy, jęczmienia, pomidorów, ryżu, grochu, soi, orzeszków ziemnych, kasawy, słodkiego ziemniaka, bananów i tytoniu.
Komórki roślinne zawierające gen chimerowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydów i sekwencję kodującą sekwencję enzymu ze szlaku biosyntezy albo rozkładu skrobi, albo chimerowy gen zawierający sekwencję kwasu nukleinowego zdolną do kierowania ekspresją następującej po nim sekwencji kodującej, albo chimerowy gen zawierający opisaną powyżej sekwencję kwasu nukleinowego, która może odpowiadać na bodziec oraz sekwencję kodującą, gdzie poziom ekspresji takiego produktu podlega zmianom w odpowiedzi na bodziec stosowany wobec takiej sekwencji kwasu nukleinowego, stanowią również aspekty tego wynalazku.
W pierwszym wykonaniu wynalazku powyższe sposoby mogą być stosowane do zmieniania metabolizmu liści, tak, że skrobia jest w nich gromadzona lub z nich mobilizowana, przy czym proces ten zmienia stosunek źródło-ujście w roślinie jako całości. Można to osiągnąć przez dostarczenie sekwencji kierującej i kwasu nukleinowego kodującego sekwencję enzymu ze szlaku biosyntezy albo rozkładu skrobi pod kontrolą odpowiedniego promotora. Wybór odpowiedniego promotora będzie prowadził do powstania roślin o zwiększonych albo zmniejszonych poziomach skrobi, co mogłoby być przydatne, na przykład, w przemyśle tytoniowym; albo, alternatywnie prowadziłoby do zmian w zawartości skrobi w innych tkankach roślinnych, takich jak bulwy, owoce i korzenie po modyfikacji wzajemnego stosunku źródło-ujście w roślinach.
W tym wykonaniu wynalazku odpowiedni promotor kieruje ekspresją sekwencji kierującej do plastydu i sekwencji kodującej enzym ze szlaku biosyntezy albo rozkładu skrobi w całej roślinie, tak zwaną ekspresją konstytutywną, albo specyficznie w liściach. Te zmiany mają zasadniczy wpływ, tak że zawartość i/lub wydajność wytwarzania skrobi w organach roślinnych będzie znacząco zmieniona.
Korzystnym promotorem zdolnym do kierowania ekspresją we wszystkich tkankach roślinnych jest promotor pobrany z genu 35S wirusa mozaiki kalafiora. Do ekspresji w liściach korzystne promotory można uzyskać z genu dla małej podjednostki karboksylazy rybulozobifosforanowej albo genu plastocyjaniny z grochu. Specjalista w tej dziedzinie będzie świadomy możliwości zastosowania innych odpowiednich promotorów, zarówno do ekspresji konstytutywnej, jak i ekspresji specyficznej dla liści, takich jak promotor syntazy nopalinowej i promotor białka wiążącego chlorofil a/b, odpowiednio.
Sekwencja kodująca lub jej części dla enzymu ze szlaku biosyntezy albo rozkładu skrobi może być usytuowana w normalnym kierunku zgodnym z ramką odczytu, tj. sensownym, albo w orientacji przeciwnej do ramki odczytu, tj. antysensownym. Regulacja aktywności enzymu w roślinach w górę albo w dół przy zastosowaniu technologii sensownej, antysensownej lub kosupresji (ta ostatnia jak
PL 205 558 B1 opisano przez DNAP w ich patentach europejskich nr 0465572 i 0647715) mogą być zastosowane do uzyskania zmian w skrobi w roślinach.
W drugim wykonaniu wynalazku, sposób według wynalazku można również zastosować do zmiany metabolizmu skrobi w organach spichrzowych, tak, że zawartość skrobi jest zwiększana i/lub skrobia jest dostarczana w odpowiedniej postaci, takiej jaka jest wymagana dla celów konkretnych procesów przemysłowych. Takie procesy obejmują wytwarzanie papieru, wytwarzanie farmaceutyków, artykułów tekstylnych, barwników i artykułów budowlanych; dostarczanie artykułów spożywczych: pieczywa, nabiału i przekąsek, wytwarzanie produktów spożywczych puszkowanych, suszonych albo do szybkiego sporządzania; słodowanie ziarna i wytwarzanie syropów i alkoholu.
W pierwszym i drugim wykonaniu sposobu, enzym wybrany do zastosowania w chimerowym genie według tych sposobów może być jednym ze szlaku rozkładu skrobi, tj. enzymem rozkładającym skrobię. Korzystne jest, jeżeli chimerowy gen zawiera β-amylazę kierowaną do chloroplastów (znaną tu jako ct β-amylaza), a korzystniejsze jest jeżeli zawiera ct β-amylazę pochodzącą z Arabidopsis thaliana (określaną dalej jako At ct β-amylaza), patrz, Id. Sekw. Nr: 3. Można również zastosować sekwencje homologiczne do At ct β-amylazy, które mogą pochodzić z innych źródeł roślinnych, takich jak ziemniak, tytoń, pszenica, kukurydza i jęczmień. Standardowe metody klonowania przez techniki hybrydyzacji albo reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) można zastosować do izolowania sekwencji z takich organizmów: na przykład techniki klonowania molekularnego, takie jak opisane przez Sambrook et al. (1989) i techniki PCR opisane przez Innes et al. (1990). Inne enzymy rozkładające skrobię, których albo którego sekwencja kodująca byłaby przydatna do zastosowania wraz z sekwencją kierującą do plastydów obejmują β-amylazę, enzym dysproporcjonujący, enzym rozgałęziający, fosforylazę skrobiową, α-glukozydazę i nie-plastydową β-amylazę.
W drugim wykonaniu sposobu według wynalazku można będzie wybrać korzystne promotory, które kierowałyby ekspresję do organów spichrzowych roślin, na przykład, z genów z następującej listy: genu dla gluteiny o wysokiej masie cząsteczkowej z bielma pszenicy; genu dla α,β-gliadyny z bielma pszenicy; genu hordeiny z bielma jęczmienia; albo genu patatyny z bulw ziemniaka. Inne przydatne promotory są znane specjalistom w tej dziedzinie.
W każdym z wykonań wynalazku, zmiana metabolizmu tkanki albo zmiana typu lub właściwości skrobi może być dokonywana tak, aby mogła odpowiadać na bodziec tj. możliwa do indukowania, przez zastosowanie opisanego tu indukowalnego promotora (Id. Sekw. Nr: 8). Przykładowo, aspekt indukowalności światłem indukowalnego promotora może być zastosowany do manipulowania wschodzeniem nasion przez zaindukowanie genu, takiego jak barnaza (przykłady czego przedstawiono w patencie WO 98/10081), do wywierania wpływu na rozwój pyłku albo do wywierania wpływu na geny nieodpowiadające na światło w poza tym zależnych od światła procesach, takich jak dojrzewanie owoców lub kiełkowanie nasion. Promotor indukowalny światłem można również zastosować do włączania genów, które wpływają na wytwarzanie metabolitów wtórnych w liściach, na przykład, wytwarzanie alkaloidów. Indukowalne światłem promotory można również zastosować do manipulowania enzymami biosyntezy skrobi w liściach albo innej tkance fotosyntetyzującej, albo na przykład, do włączania genów po przeniesieniu bulw, na przykład po przechowywaniu w ciemności.
Aspekt indukowalności cukrem indukowalnego promotora mógłby być zastosowany do regulowania genów np. w rozwijającej się bulwie i innych niefotosyntetyzujących tkankach, takich jak geny oporności na szkodniki i/lub geny, które mogą wpływać na jakość roślin uprawnych po ich zebraniu. W przypadku ziemniaków oporność na rdzę, zgorzel (ang. blackleg) i butwienie dawałyby szczególne korzyści i mogłyby być z największą korzyścią klonowane w zrekombinowanych genach z promotorami indukowanymi cukrem. Alternatywnie, aspekt indukowalności cukrem indukowalnego promotora mógłby być użyty do kierowania ekspresją genów dla markerów selekcyjnych w procesie hodowli tkankowej.
Specjalista w tej dziedzinie łatwo zidentyfikuje element indukowanej odpowiedzi na cukier w Id. Sekw. Nr: 8 i/albo element indukowalnej odpowiedzi na światło przez zastosowanie dobrze znanych technik, takich jak analiza delecyjna. Pwee i Gray (1993) opisują taką analizę delecyjna dla genu plastocyjaniny przy zastosowaniu genu markerowego w celu określenia jego funkcjonalnych rejonów.
Sposoby tu opisane albo, na przykład, w podręczniku laboratoryjnym Sambrooka i wsp. (1989) oraz Gelvina i Stantona (1995) dla klonowania sekwencji genów i wstawiania ich do odpowiednich nośników (wektorów lub plazmidów itd.) są technikami dobrze znanymi specjalistom, dla wprowadzenia takich pomysłów w życie. Gen chimerowy lub geny, jak opisano powyżej, można wprowadzać osobno, albo może im towarzyszyć jeden lub więcej innych genów chimerowych, takich jak jeden lub
PL 205 558 B1 więcej innych opisanych tu genów. W przypadku opisanych powyżej wykonań wykorzystujących pierwszy gen chimerowy kodujący enzym ze szlaku rozkładu skrobi, drugi gen chimerowy może, przykładowo, zawierać sekwencję kwasu nukleinowego kodującą enzym ze szlaku biosyntezy skrobi również pod kontrolą odpowiedniego promotora i odpowiedniego terminatora. Promotor i/lub terminator drugiego genu chimerowego może być taki sam albo inny niż promotor i/lub terminator pierwszego genu chimerowego. Odpowiednimi sekwencjami kodującymi enzym ze szlaku biosyntezy skrobi są sekwencje kwasu nukleinowego dla syntazy sacharozowej, pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej i mogą również obejmować enzym rozgałęziający, α-amylazę, nieplastydową β-amylazę, α-glukozydazę, fosforylazę skrobiową i enzym dysproporcjonujący.
Sposoby wprowadzania jednego lub więcej genów chimerowych do roślin zostały opisane i obejmują konstruowanie binarnego wektora z genami chimerowymi połączonymi razem w jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego; kotransformację przy zastosowaniu dwóch lub więcej różnych komórek Agrobacterium, na przykład, z różnymi wektorami binarnymi zawierającymi różne geny chimerowe; albo transformację rośliny, która już ma gen chimerowy innym, odmiennym genem chimerowym, tj. retransformację. W tym ostatnim przypadku, sposób selekcji transgenicznych roślin po wprowadzeniu drugiego genu chimerowego musi być różny od sposobu selekcji zastosowanej do wprowadzenia pierwszego genu chimerowego. Odpowiednie markery selekcyjne będą obejmowały te na oporność na higromycynę, kanamycynę, sulfonamid i Bastę. Można również zastosować metody biologiczne, takie jak krzyżowanie dwóch roślin, gdzie każda roślina zawiera jeden gen chimerowy.
W celu dokonania zmiany zawartości skrobi w już stransformowanych roślinach, które wykazują znaczący wzrost w aktywności pierwszego enzymu i w konsekwencji zmianę w syntezie skrobi można zastosować dwa chimerowe konstrukty genowe.
A zatem niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobu dokonywania zmian w transgenicznej roślinie, która już wykazuje zwiększenie albo zmniejszenie aktywności enzymatycznej, jako rezultat transformacji genetycznej, kolejnego enzymu w celu zwiększenia lub zmniejszenia poziomu ekspresji tego innego enzymu i w ten sposób zwiększać albo zmniejszać ilość skrobi wytwarzanej przez retransformowaną roślinę.
Korzystne, jeżeli pierwszą stransformowaną rośliną jest roślina mająca zwiększoną aktywność enzymatyczną w szlaku biosyntezy skrobi. Przykład próby zwiększenia zawartości skrobi w roślinie jest transgeniczny ziemniak stransformowany genem ADPG-PPazy, na przykład glgC16 (patrz, na przykład, WO 91/19806). Podwyższenie zawartości skrobi w takich roślinach jest stosunkowo niewielkie. Pierwszą stransformowaną rośliną jest korzystnie roślina retransformowaną genem chimerowym dla enzymu rozkładającego skrobię, zawierającym odpowiednio, na przykład, At ct β-amylazę. Białko glgC16 jest wyrażane w bulwach po w pierwszej transformacji i prowadzi do wzrostu aktywności ADPG-PPazy i zwiększenia przepływu węgla do skrobi. Korzystne, ekspresja genu chimerowego At ct β-amylazy albo jego części w bulwach po retransformacji prowadziła do obniżenia poziomu ekspresji aktywności At ct β-amylazy, tj. kosupresji lub technologii antysensownej, uzyskując zatem wzrost akumulacji skrobi.
Korzystne, ekspresja drugiego enzymu jest kierowana do bulw. Odpowiednim promotorem do kierowania ekspresją genu chimerowego At ct β-amylazy w bulwach jest promotor genu dla patatyny.
Pierwsza transformowana roślina ziemniaka wyrażająca glgC16 jest oporna na kanamycynę, a zatem binarny konstrukt wektorowy dla genu chimerowego At ct β-amylazy niesie inny gen oporności, na przykład, odpowiednio, gen oporności na sulfonamid. Zwiększone wytwarzanie skrobi w bulwie ziemniaka byłoby korzystne, na przykład, dla wytwórców chrupków, ponieważ 1% wzrostu suchej masy ziemniaka będzie dawał w rezultacie 4% wzrostu dla produktu.
Wytwórcy chrupków ziemniaczanych mogą posłużyć również do zilustrowania innej korzyści wynalazku. Gdy bulwy ziemniaczane przechowuje się w temperaturze poniżej 8°C, akumulują się cukry redukujące, glukoza i fruktoza na skutek rozkładu zgromadzonej skrobi. Gdy ziemniaki praży się w celu uzyskania chrupków, cukry redukujące reagują z aminokwasami w reakcji Miliarda wytwarzając brązowe zabarwienie i psując smak produktu. Wprowadzenie do ziemniaków genu chimerowego, który zatrzymywałby rozkład skrobi, a zatem akumulację cukrów redukujących, byłoby korzystne dla wytwórców przekąsek. Korzystne byłoby, gdyby gen chimerowy zawierał sekwencję kodującą albo część sekwencji dla ct β-amylazy w konstrukcie do kosupresji albo antysensownym, kierowanym przez odpowiedni promotor i terminator. Odpowiedni promotor mógłby być wzięty z genów dla patatyny z bulw ziemniaka. Korzystne byłoby, gdyby dowolny inny spośród wspomnianych wyżej enzymów rozkładających skrobię mógł być również zastosowany zamiast ct β-amylazy.
PL 205 558 B1
Indukowalny promotor z Id. Sekw. Nr: 8 mógłby być również zastosowany w konstrukcie, jeżeli wymagana byłaby skoordynowana ekspresja w rozwijających się liściach i rozwijających się bulwach, ponieważ promotor patatyny jest również indukowalny sacharozą (Rochsa-Sosa et al. (1989). Podobnie, sekwencja dla polipeptydu kierującego do chloroplastu z Id. Sekw. Nr: 1 mogłaby być zastosowana z dowolnym innym genem, któremu brak swojej własnej sekwencji kierującej i który powinien być kierowany do plastydów.
Powyższe przykłady służą do zilustrowania możliwych korzyści zastosowania niniejszego wynalazku. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje się, że kombinacja genów i roślin, do których wynalazek może być stosowany jest znaczna.
Korzystnie, kombinacja genów będzie obejmowała ct β-amylazę z jednym lub więcej genów dla: syntazy sacharozowej, pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej, enzymu rozgałęziającego, α-amylazy, nie-plastydowej β-amylazy, α-glukozydazy, fosforylazy skrobiowej i enzymu dysproporcjonującego, sekwencje których są znane specjalistom. Alternatywnie, sekwencję kierującą z ct β-amylazy może być stosowana z jednym lub większą liczbą powyższych genów.
Korzystnie, lista roślin, które można transformować obejmuje, ziemniaki, pszenicę, kukurydzę, jęczmień, pomidory, ryż, groch, soję, orzeszki ziemne, kasawę, słodki ziemniak, banany i tytoń.
Wynalazek będzie teraz opisany, drogą przykładów z odniesieniem do wykonania dla izolowania cDNA z ct β-amylazy z Arabidopsis thaliana i dla wprowadzania cDNA do roślin tytoniu i ziemniaka. Podane są również przykłady promotora odpowiadającego na bodziec i jego aktywność w roślinach transgenicznych.
Aby wynalazek można było łatwo wprowadzić w życie, będzie poczynione odniesienie, drogą przykładów, do następujących schematycznych rysunków na których;
Na Fig. 1 pokazano wyniki testowania importu wyznakowanych radioaktywnie produktów translacji przez SDS-PAGE, a następnie fluorografię. Legenda: markery masy cząsteczkowej (ścieżka M); produkty translacji (ścieżka Tr); izolowane powtórnie i traktowane termolizyną chloroplasty po inkubacji dla zajścia importu (ścieżka C); frakcja stromy (ścieżka S); przemyte tylakoidy (ścieżka T); tylakoidy traktowane termolizyną (ścieżka tT); frakcja błony wewnętrznej (ścieżka I); frakcja błony zewnętrznej (ścieżka O). Prekursor próbny (P), pośrednia (I) i dojrzała (M) forma β-amylazy, odpowiednio. Kilodaltony (K).
Na Fig. 2 pokazano wpływ światła i cukrów oraz wpływ światła i cukrów na wyrażanie transkryptu ct β-amylazy z siewek Arabidopsis thaliana. Na Fig. 2a pokazano analizę Northern całkowitego RNA z 5-tygodniowych roślin Arabidopsis hodowanych w glebie i eksponowanych przez 2 dni na światło ciągłe (L), 2 dni ciągłej ciemności (D), 2, a następnie 3 dni światła ciągłego (LL) albo 2 dni ciemności, a następnie 3 dni światła ciągłego (DL). Na Fig. 2b pokazano analizę Northern całkowitego RNA z 5-tygodniowych roślin Arabidopsis hodowanych in vitro, które były przenoszone do wody i eksponowane przez 3 dni na światło ciągłe (WL); albo do 5% sacharozy i trzymane przez 3 dni w ciemności (SD) albo eksponowane 3 dni na światło ciągłe (SL) albo do 5% glukozy i trzymane przez 3 dni w ciemności (GD) albo eksponowane 3 dni na światło ciągłe (GL). Filtry Northern hybrydyzowano z wyznakowaną radioaktywnie wstawką cDNA ct-Bmy i poddano autoradiografii (część górna). Odpowiadające temu barwione bromkiem żele agarozowe z formaldehydem są pokazane w części dolnej;
Na Fig. 3 pokazano schematycznie T-DNA chimerowych genów promotor ct β-amylazy-GUS skonstruowanych w Przykładzie 3, poniżej, w których NosP reprezentuje promotor syntetazy nopalinowej, NosT reprezentuje terminator syntazy nopalinowej; Br to odwrócone powtórzenie prawej sekwencji granicznej, a BL to odwrócone powtórzenie lewej sekwencji granicznej T-DNA z pBI101; NPTII reprezentuje sekwencję kodującą fosfotransferazy II neomycynowej; GUS reprezentuje sekwencję kodującą β-glukuronidazy. Fragmenty promotorowe ct β-amylazy są reprezentowane przez zakreskowane prostokąty; powielone w reakcji PCR fragmenty łączące XhoI-BamHI są reprezentowane przez czarne prostokąty;
Na Fig. 4 pokazano wpływ światła i sacharozy na aktywność GUS wyrażaną z genu chimerowego promotor ct BmyGUS w siewkach tytoniu;
Na Fig. 5 pokazano mapę plazmidową donorowego wektora pDV35S (SK)V;
Na Fig. 6 pokazano mapę plazmidową donorowego wektora pDV02000;
Na Fig. 7 pokazano mapę plazmidową binarnego plazmidu pBNP10431, gdzie 35S reprezentuje promotor 35S CaMV, ct bamy reprezentuje cDNA β-amylazy pełnej długości; 35St reprezentuje terminator 35S CaMV, Br reprezentuje odwrócone powtórzenie prawej sekwencji granicznej z binarnego wektora pBinPlus, colE1ori reprezentuje początek bakteryjnej replikacji colE1, RKori reprezentuje
PL 205 558 B1 początek replikacji oriV plazmidu RK2, nptIII reprezentuje gen fosfotransferazy neomycynowej dla bakteryjnej oporności na kanamycynę, LB reprezentuje odwrócone powtórzenie lewej sekwencji granicznej binarnego wektora, a kan reprezentuje zrekombinowany roślinny gen fosfotransferazy neomycynowej wymagany dla oporności rośliny na kanamycynę;
Na Fig. 8 pokazano mapę plazmidową binarnego plazmidu pBNP10432, gdzie oznaczenia są jak na Fig. 7.
Na Fig. 9 pokazano mapę plazmidową binarnego plazmidu pBNP02431, gdzie oznaczenia są jak na Fig. 7 z tą różnicą, że patp reprezentuje promotor genu patatyny klasy I z wektora pDV02000 na Fig. 6, a nost reprezentuje terminator syntazy nopalinowej, oraz
Na Fig. 10 pokazano mapę plazmidową binarnego plazmidu pBNP02432, gdzie oznaczenia są jak na Fig. 9.
Na li ś cie sekwencji:
Id. Sekw. Nr: 1 jest kwasem nukleinowym zdolnym do kierowania sekwencji kodującej do plastydu roślinnego, a w szczególności chloroplastu;
Id. Sekw. Nr: 2 jest kwasem nukleinowym, który koduje β-amylazę;
Id. Sekw. Nr: 3 jest pełną sekwencją (ct) β-amylazy kierowanej do chloroplastów.
Id. Sekw. Nr: 4 i 5 są starterami używanymi w procesie amplifikacji w Przykładzie 3;
Id. Sekw. Nr: 6 i 7 są starterami używanymi w procesie amplifikacji w Przykładzie 3;
Id. Sekw. Nr: 8 jest kwasem nukleinowym, który może odpowiadać na bodziec, szczególnie światło i/lub cukier.
P r z y k ł a d 1
Izolacja i charakteryzacja kierowanej do chloroplastów β-amylazy z Arabidopsis thaliana
Sekwencjnowanie wstawki DNA w pBmy81
Analiza w bazie danych BLASTN sekwencji nukleotydowej 37 kb fragmentu DNA z chromosomu IV Arabidopsis w kosmidzie G16599 (Beven et al., 1998) wykazała obecność genu o znaczącej homologii z pozachloroplastową β-amylazą z Arabidopsis, jęczmienia, kukurydzy, soi i ryżu. W analizie tej zidentyfikowano również kilka 3'-końcowych sekwencji EST, z których jedna, EST 81E10T7 (Newman et al., 1995), określana tu dalej jako pBmy81, była identyczna na odcinku około 3000 nukleotydów. Klon EST 81E10T7 był dostarczony przez Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) DNA Stock Center (Ohio University, USA). Zestaw subklonów z zagnieżdżonymi delecjami Bal31 na odcinku wstawki DNA w pBmy81 zastosowano jako matryce DNA w reakcjach dwuniciowego sekwencjowania z zastosowaniem cykli PCR przy użyciu wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym uniwersalnych starterów. Reakcje sekwencjonowania analizowano w automatycznym sekwenatorze Applied Biosystem Model 373A. Sekwencja nukleotydowa wstawki cDNA pBmy81 jest pokazana w Id. Sekw. Nr: 3. Konstrukt pBmy81 został zdeponowany przez Advanced Technologies (Cambridge) Limited, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 4WA zgodnie z porozumieniem budapeszteńskim w International Recognition of the Deposit of Micro-Organisms dla potrzeb procedur patentowych w National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen, Szkocja, 4 sierpnia 1998 pod numerem dostępu NCIMB 40964.
Identyfikacja przypuszczalnych sygnałów kierujących do chloroplastów
Wstawka cDNA pBmy81 zawiera 36 nie ulegających translacji nukleotydów na końcu 3' i otwartą ramkę odczytu (ORF), która koduje białko złożone z 548 aminokwasów oraz nie ulegający translacji rejon 3' (UTR) o długości 232 bp. Białko kodowane przez wstawkę cDNA pBmy81 ma przewidywany ciężar cząsteczkowy 61 kDa i wykazuje duże podobieństwo aminokwasowe z roślinnymi pozachloroplastowymi β-amylazami z kukurydzy, ryżu, jęczmienia, soi i słodkiego ziemniaka. Jednakże białko kodowane przez pBmy81 różni się od wszystkich innych opisanych dotychczas β-amylaz tym, że zawiera unikatowy N-końcowy dodatek, mający właściwości sygnału kierującego do chloroplastów, tj. wysoką zawartość seryny (16%), treoniny (10%) i naładowanych dodatnio reszt aminokwasowych (15%) (Baier and Dietz, 1997). Trzy domeny, które są cechami charakterystycznymi dla sygnałów kierujących do chloroplastów (Schatz and Dobberstein, 1966) zostały zidentyfikowane w sekwencji sygnałowej: nienaładowana domena amino-końcowa, centralna domena bogata w aminokwasy z grupą hydroksylową i domena karboksy-końcowa mogąca tworzyć amfifilowy łańcuch β.
Wstawka DNA w pBmy81 koduje kierowaną do chloroplastów β-amylazę
Nienaruszone chloroplasty izolowano z 50-60 g pędów grochu (Pisum sativum L. var Feltham First) przy zastosowaniu gradientu schodkowego Percoll. Materiał roślinny hodowano i chloroplasty izolowano zgodnie z metodą Mould and Gray (1997a).
PL 205 558 B1
Plazmid pBmy81 linearyzowano poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym Notl i poddawano transkrypcji in vitro przy zastosowaniu polimerazy RNA T7. Wyznakowane radioaktywnie białko prekursorowe syntetyzowano w systemie translacji z kiełków pszenicy, włączając 35S-metioninę i 35S-cysteinę, z transkryptów cDNA pBmy81 zasadniczo tak, jak opisano przez Mould i Gray (1997a).
Import wyznakowanych radioaktywnie produktów translacji in vitro przeprowadzono tak, jak opisano przez Mould i Gray (1997b). Po przeprowadzeniu inkubacji dla zajścia importu, nienaruszone chloroplasty traktowano termolizyną (stężenie końcowe 0,2 mg/ml w buforze do importu) przez 30 min. w lodzie, a następnie reakcję z proteazą zatrzymywano przez dodanie EDTA do 50 mM w buforze do importu. Chloroplasty ponownie izolowano przez poduszkę 40% Percoll w buforze do importu, a następnie przemywano buforem do importu (Mould and Gray (1997a). Próbki (1/10) chloroplastów traktowanych termolizyną pobierano do analizy, a pozostałość frakcjonowano zasadniczo tak, jak opisano przez Schnell i Blobel (1993). Próbki chloroplastów traktowanych termolizyną, frakcje strony, tylakoidów i tylakoidy traktowane termolizyną analizowano ilościowo poprzez SDS-PAGE, a następnie barwienie błękitem Coomassie i skanowanie denstytometryczne wybarwionych prążków białkowych (podjednostki karboksylazy rybulozobifosforanowej i białek kompleksu świetlnego zastosowano jako standardy). Równoważne ilości tych frakcji (wynoszące około 2% chloroplastów odzyskanych z gradientu Percoll, a 505 uzyskanych frakcji wewnętrznej i zewnętrznej błony analizowano poprzez elektroforezę w 10% żelu poliakryloamidowym w obecności SDS, a następnie fluorografię. Wyniki (Fig. 1) pokazują, że główny produkt translacji (ścieżka Tr) ma około 58 kDa. Kiedy izolowane, nienaruszone chloroplasty grochu inkubowano z wyznakowanym radioaktywnie białkiem w obecności ATP, powstawały polipeptydy o wielkości 50 kDa i 48 kDa (ścieżka C). Odporność tych polipeptydów na rozkład przez egzogenne dodawaną termolizynę wskazuje, że są one produktami importu wyznakowanych radioaktywnie białek. Frakcjonowanie nienaruszonych traktowanych termolizyną chloroplastów na strome, przemywane tylakoidy i tylakoidy traktowane termolizyną oraz błonę wewnętrzną i zewnętrzną wykazało, że dwa wyznakowane radioaktywnie polipeptydy są zlokalizowane we frakcji stromy.
P r z y k ł a d 2
Indukcja sacharozą i światłem genu ct β-amylazy z Arabidopsis thaliana
W celu pokazania indukcji ct β-amylazy na świetle, rośliny Arabidopsis thaliana ekotyp Landsberg hodowano w szklarni w warunkach 18 godzin światła, 6 godzin ciemności w 18°C. Po 5 tygodniach, dwie skrzynki siewek przenoszono do kompletnej ciemności, a dwie skrzynki siewek hodowano przy ciągłym świetle. Po dwóch dniach, jedną skrzynkę z siewkami trzymanymi w ciemności i jedną skrzynkę siewek hodowanych na świetle użyto do izolacji całkowitego RNA, a drugą skrzynkę w obu przypadkach eksponowano przez dalsze 3 dni na ciągłe światło.
Dla kombinowanego traktowania sacharoza-światło-ciemność, nasiona ekotypu Landsberg sterylizowano powierzchniowo, umieszczano na pożywce agarowej MS zawierającej 1% sacharozę i hodowano w pokoju hodowlanym w warunkach 18 godzin światła, 6 godzin ciemności. Pięciotygodniowe siewki przenoszono na sterylną wodę destylowaną albo 5% roztwór sacharozy lub glukozy w wodzie. Siewki utrzymywano bądź przy ciągłym świetle, bądź w ciemności przez trzy dni. Całkowity RNA otrzymano z siewek dla każdego testu i poddano analizie Northern tak, jak opisano przez Eggermont et al. (1996). Filtry Northern hybrydyzowano z oczyszczonym z żelu wstawką cDNA pBmy81 jako sondą wyznakowaną radioaktywnie 32P-cdCTP metodą losowych starterów tak, jak opisano przez Feinberg i Vogelstein (1983).
Wyniki pokazane na Fig. 2A wskazują, że transkrypt genu ct β-amylazy jest indukowalny światłem.
Wyniki pokazane na Fig. 2B wskazują, że transkrypt genu ct β-amylazy jest indukowalny w ciemności 5% sacharozą i w mniejszym stopniu 5% glukozą. Ta indukcja jest dalej wzmacniana na świetle w obecności cukrów. Wyniki te pokazują, że wpływ światła i cukrów jest od siebie wzajemnie niezależny.
P r z y k ł a d 3
Konstrukcja fuzji promotor ct β-amylazy-GUS
Fragmenty promotorowe izolowano z genu β-amylazy znajdującego się na kosmidzie G16599 (Beven et al., 1998) przez trawienie enzymami restrykcyjnymi. Dogodnymi miejscami restrykcyjnymi w promotorze były Hind III w pozycji nukleotydowej -1662 bp (zaczynając od pozycji 19179 na nici minus w sekwencji Id. Sekw. Nr: 8), Sal I w pozycji -1127 bp i Pst I w pozycji -371 bp oraz miejsce Xho I zlokalizowane w pozycji +21 poniżej inicjacyjnej metioniny ct β-amylazy i zostały one użyte do wyizolowania trzech sekwencji promotora o różnej długości plus peptydu tranzytowego (A w kodonie inicjacyjnym ATG dla metioniny jest numerowana jako +1).
PL 205 558 B1
Fragment o długości 294 bp (Id. Sekw. Nr: 1) genu ct β-amylazy zlokalizowany w kosmidzie G16599 (Beven et al., 1998) powielono przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych:
Id. Sekw. Nr: 4
PI: (5' - AAT TCCTCGAGT TCT CTT ATC - 3') i
Id. Sekw. Nr: 5
P2: (5' - cgg gAT CCC TGA CAT TGT TAC - 3').
W starterze PI, podkreślone zasady oznaczają miejsce XhoI leżące w pozycji +21 bp; w starterze P2 zasady pisane małymi literami odnoszą się do nukleotydów dodawanych w celu utworzenia miejsca BamHI.
Chimerowe geny: promotor ct β-amylazy-GUS utworzono poprzez potrójną ligację fragmentów promotorowych; fragmentu łącznikowego PCR strawionego XhoI i BamHI, wektora GUS pBI101 (Jefferson et al., 1987) strawionego Hindlll-BamHI, Sall-BamHI lub Pstl-BamHI (Fig. 3). Konstrukty nazwano HjiGUS, SβGUS i PβGUS, odpowiednio.
Chimerowe konstrukty genowe przenoszono do Agrobacterium tumefacens LB4404 poprzez krzyżowanie trój rodzicielskie (Beven, 1984) i wprowadzano do Nicotiana tabacum var Samsun przy zastosowaniu metody transformacji dysków liściowych (Horsch et al., 1985).
P r z y k ł a d 3A
Indukcja sacharozą i światłem genu: promotor ct β-amylazy z Arabidopsis thaliana-GUS w siewkach tytoniu
W roślinach zawierających konstrukty HjiGUS i PβGUS miał miejsce wysoki poziom ekspresji aktywności GUS i linie potomne F1 siewek zastosowano do badania indukowalnej światłem i sacharozą ekspresji genów chimerowych. Nasiona F1 tytoniu sterylizowano powierzchniowo, umieszczano na pożywce agarowej MS zawierającej 1% sacharozę i hodowano w pokoju hodowlanym w warunkach 18 godzin światła, 6 godzin ciemności. Dwu- trzytygodniowe siewki przenoszono na sterylną wodę destylowaną albo 5% roztwór sacharozy lub glukozy w wodzie. Siewki utrzymywano bądź przy ciągłym świetle, bądź w ciemności przez trzy dni. Ekstrakty całkowitego białka z puli do 10 do 14 siewek analizowano pod kątem aktywności GUS przy zastosowaniu fluorogennego substratu 4-metylolumbeliferyloglukuronidu (4-MUG) tak, jak opisano przez Jefferson i wsp. (1987). W przypadku obydwu konstruktów, poziom aktywności GUS w siewkach eksponowanych na ciągłe światło w nieobecności sacharozy był podobny do poziomów aktywności GUS w siewkach eksponowanych na sacharozę w nieobecności ciągłego światła (Fig. 4). Jednakże ekspozycja siewek zarówno na ciągłe światło, jak i sacharozę podnosiła poziomy aktywności GUS około dwa do trzech razy. Wyniki te pozostają zasadniczo w zgodzie z wynikami dla samego genu β-amylazy, co pokazuje, że indukowalność światłem i indukowalność sacharozą są procesami niezależnymi.
Barwienie histochemiczne dla GUS pokazało, że aktywność była wykrywana w liścieniach dwutygodniowych siewek, a niewielka albo brak aktywności było w pierwszych prawdziwych liściach albo w łodygach i korzeniach. W czterotygodniowych siewkach dodatkową aktywność pokazano w pierwszych prawdziwych liściach, a także w łodygach. Barwienie GUS było w szczególności związane z bogatymi w chloroplasty komórkami miękiszowymi (chlorenchyma) zlokalizowanymi pomiędzy wiązkami ksylemu oraz pomiędzy wiązkami ksylemu i łyka, które tworzą wewnętrzne łyko w łodydze.
P r z y k ł a d 4
Ukierunkowaną mutagenezę zastosowano do przekształcenia miejsca KpnI położonego w pozycji 2302 bp plazmidu pBmy81 w miejsce BamHI. Startery oligonukleotydowe
Id. Sekw. Nr: 6
P3: (5' - GCT GGT ACG CCT GCA GGA TCC GGT CCG GAA TTC CC 3') i
Id. Sekw. Nr: 7
P4: (5' - GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT GCA GGC GTA CCA GC 3') zaprojektowano i zastosowano z zestawem Quick Change site-directed mutagenesis kit (Promega). Protokół był taki, jak zalecał producent.
Sekwencję kodującą β-amylazy pełnej długości wycięto ze zmutowanego plazmidu poprzez cięcie BamHI, a następnie oczyszczono przy użyciu GeneCleann (BIO101). Fragment BamHI poddano ligacji w miejscu BamHI z wektorami donorowymi pDV35S(SK)V (patrz Fig. 5) i pDV02000 (patrz Fig. 6).
pDV35S(SK)V składa się z pBluscript (Stratagene) niosącego 35S CaMV promotor-35S terminator, podobne konstrukty są znane w tej dziedzinie (np. Odell i wsp., 1985). pDV02000 składa się z pBluscript z 1,4 kb fragmentem z promotorem patatyny-terminatorem syntazy nopalinowej. Biegły w tej dziedzinie będzie mógł zrobić podobne konstrukty ze znanych sekwencji (np. Liu i wsp., 1990).
PL 205 558 B1
Izolowano plazmidy z sekwencją kodującą zarówno w orientacji sensownej, jak i antysensownej w stosunku do promotora, a chimerowe geny ct β-amylazy subklonowano z wektorów donorowych do binarnego wektora pBinPlus (van Engelen i wsp., 1995). Mapy plazmidów są pokazane na Fig. 7-10.
P r z y k ł a d 5
Transformacja i retransformacja roślin
Ziemniaki transformowano przy zastosowaniu metody jednoczesnej hodowli dysków liściowych, zasadniczo tak, jak opisano przez Hotsch (1985). Binarne wektory jak opisano powyżej przenoszono do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 stosując metodę elektroporacji i hodowle takich Agrobacteria używano do transformacji tak, że zregenerowane rośliny przenosiły chimerowe geny jak opisano w Przykładzie 4.
Binarny plazmid z genem promotor β-amylazy terminatorem sytntazy nopalinowej można zastosować do transformacji ziemniaka już przenoszącego chimerowy gen dla ADPG-Ppazy glgC16 z E. coli metodami jednoczesnej hodowli dysków liściowych.
P r z y k ł a d 6
Konstrukcja plazmidów z sekwencją kodującą peptyd kierujący ct β-amylazy z At
Sekwencja kodująca sekwencję kierującą do plastydów ct β-amylazy z At jest zawarta we fragmencie o długości 294 bp równoważnym Id. Sekw. Nr: 1. Amplifikację w reakcji PCR lub trawienie enzymami restrykcyjnymi można zastosować do izolacji fragmentów DNA z plazmidów opisanych w Przykładzie 3, tj. fragmentów, które będą składały się z promotora 35S CaMV plus sekwencji kodującej sekwencję kierującą do plastydów lub promotora patatyny plus sekwencji kodującej sekwencję kierującą do plastydów. Chimerowe geny można skonstruować przez ligację sekwencji kodujących dla białek lub enzymów jako fuzje translacyjne z sekwencją kodującą peptyd tranzytowy. Powstające w procesie translacji białka będą transportowane do plastydów w celu dostarczenia nowych aktywności albo wpływania na szlaki metaboliczne.
Literatura
Ainsworth, C, Clark, J. and Balsdon, J. (1993). Plant. Mol. Biol., 22, 67-82.
Baier, M. and Dietz, K.J., (1997) Plant J. 12, 179-190
Bevan, M.W. (1984) Nucl. Acids. Res., 12 , 8711-8721
Bevan, M.W. et al. (1998). Nature, 391, 485-488.
Chan, MT., Chao, YC. and Yu, SM. (1994). J. Biol. Chem., 269, 17635-17641.
Chen, MH., Liu, LF., Chen, YR. , Wu, HK. and Yu, SM. (1994).
Plant J., 6, 625-636.
Daussant, J., Zbaszyniak, B., Sadowski, J. and Wiatroszak, I. (1981). Planta, 151, 176-179.
Denyer, K., Clarke, B., Hylton, C, Tatge, H. and Smith, A.M. (1996). Plant J., 10, 1135-1143.
Duwenig, E., Steup, M., Willmitzer, L. and Kossmann, J. (1997).
Plant J., 12, 323-333.
Eggermont, K., Goderis, I. J. and Broekaert, W. F. (1996).
Plant Mol. Biol. Rep. 14, 273-279.
Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983). Anal. Biochem. 132, 6-13.
Gelvin, S. B. -and Schilperoort, R. A. (1995). Plant Molecular
Biology Manual. 2nd edition. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.
Hildebrand, D.F. and Hymowitz, T. (1981). Physiol. Plant., 53, 429-434.
Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffman, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Swaley, R.T. (1985) Science, 227. 1229-1231.
Hylton, C.M., Denyer, K., Keeling, P.L., Chang, MT. and Smith, A.M. (1995). Planta, 198, 230-237. Innes, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (1990). PCR Protocols. Publisher: Academic Press.
James, M.G., Robertson, D.S. and Myers, A.M. (1995). Plant Cell, 7, 417-429.
Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. and Bevan, M.W. (1987) EMBO, J. 6. 3901-3907.
Kakefuda, G., Duke, S.H. and Hostak, M.H. (1986). Planta, 168, 175-182.
Klosgen, R.B. and Weil, J.H. (1991) Mol. Gen. Genet., 225, 297-304
Li, B., Servaites, J.C. and Geiger, D.R. (1992). Plant Physiol., 98, 1277-1284.
Liu, X.J., Prat, S., Willmitzer, L. and Frommer, W.B. (1990) Mol. Gen. Genet., 223, 401-406.
Mita, S., Suzuki-Fujii, K. and Nakamura, K. (1995) Plant Physiol. 107,895-904.
Mita, S., Murano, N., Akaike, M. and Nakamura, K. (1997). Plant J., 11, 841-851.
PL 205 558 B1
Mould, R.M. and Gray, J.C. (1997a). In Cell Biology: A Laboratory Handbook, second edition, Volume 2. (Cells, J.E. ed). New York: Academic Press, pp. 81-86.
Mould, R.M. and Gray, J.C. (1997b). In Celi Biology: A Laboratory Handbook, second edition, Volume 2. (Cells, J.E. ed). New York: Academic Press, pp. 286-292.
Nakamura, K., Ohto, M., Yoshida, N. and Nakamura, K. (1991). Plant Physiol., 96, 902-909.
Neuhaus, H.E., Henrichs, G. and Schiebe, R. (1995). Planta, 194, 454-460.
Newman, T. et al. (1994). Plant Physiol., 106, 1241-1255.
Nielson, T.H., Deiting, U. and Stitt, M. (1997). Plant Physiol., 113, 503-510.
Odell, J.T. Nagy, F. and Chua, N.H. (1985) Nature, 313, 810-812.
Peavey, D.G., Steup, M. and Gibbs, M. (1977). Plant Physiol., 60, 305-308.
Pwee, K-H. and Gray, J.C. (1993) Plant J. 3, 437-449.
Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J. and Willmitzer, L. (1989)
EMBO, 8, 23-29.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. Publisher: Cold Spring Harbour.
Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996). Science, 271, 1519-1526. Schnell, D.J. and Blobel, G. (1993). J. Cell. Biol., 120, 103-115.
Sonnewald, U., Basner, A., Greve, B. and Steup, M. (1995). Plant. Mol. Biol., 27, 567-576 Sweetlove, L.J., Burrell, M.M. and ap Rees, T. (1996). Blochem. J., 320-493-498.
Thomson, W.W. and Whatley, J.M. (1980) Ann. Rev. Plant Physiol. 31, 375-394.
van Engelen, F. A., Molthoff, J. W., Conner, A. J., Nap, J-P., Pereira, A. and Stiekema, W. J. (1995).
Transgenic Res. 4, 288-290.
van der Leij, F.R., Visser, R.G.F., Ponstein, A.S., Jacobsen, E. and Feenstra, W.J. (1991). Mol. Gen.
Genet., 228, 240-248.
Wang, SM., Lun, WL. and Chen, J. (1996). Plant Mol. Biol., 31, 975-982.
Wang, SM., Lue, WL., Huang, HW. and Chen, J. (1997). Plant Physiol., 113, 403-409.
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) ADRESAT: Advanced Technologies (Cambridge) Ltd.
(B) ULICA: Globe House, 1 Water Street (C) MIASTO: Londyn (D) KRAJ: Anglia (F) KOD POCZTOWY: WC2R 3LA (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgentczne (iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER (A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: Viglen P5/75 (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Windows 3.1
PL 205 558 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 294 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (B) SZCZEP: Ekotyp Colombia (C) RODZAJ TKANKI: liść (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(A) BIBLIOTEKA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom IV (ix) CECHA (A) NAZWA: peptyd tranzytowy (B) POŁOŻENIE: 37-291 bp (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1 :
TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG
MELTLNSS8
AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAGAAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC
S SL I KR KD AKSS RNQ E S SSN28
121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT
NMTFAKMKPPTYQFQAKNSV48
181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAGAAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA
KEMKFTHE KTFTPEG ETLEK68
241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTT
WEKLHVLSYPHSKNDASV 85
PL 205 558 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1642 pary zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (B) SZCZEP: Ekotyp Colornbia (C) RODZAJ TKANKI: liść (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(A) BIBLIOTEKA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom IV (ix) CECHA (A) NAZWA: peptyd tranzytowy (B) POŁOŻENIE: 1-1393 bp (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2 :
GTTCCGGTGTTCGTCATCITACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAA
VPVFVMLPLDTVTMSGH LNK20
CCACGAGCCATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATG
PRAMNASLMAL K G A G V E GVM40
121 gtggatgcttggtggggattggtggagaaagatggacctatgaattataactgggaaggc
VDAWWGLVE KDGPMNYNWEG60
181 TATGCCGAGCTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCA
YAEL I QMVQKHGLKLQVVMS80
241 TTCCATCAATGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTG fhqcggnvgdscsiplppwvioo
01 CTTGAAGAG atcagcaagaaccctgatcttgtctacacagacaaatctgggagaaggaac
LEE ISKNPDLVYTDKSGRRN 120
361 cctgaatatatctccttgggatgtgattctgtgcctgtcctaagaggaagaacacctatc
PEYISLGCDSVPVLRGRTPI14 0
421 caggtctactcagatttcatgaggagcttccgtgaacgatttgaaggctacataggagga
QVYSDFMRSFRERFEGY IGG 160
PL 205 558 B1
481 gttattgcggaaattcaagtaggaatgggaccttgtggagaattgagatacccatcatac
VIAEIQVGMGPCGELRYPSY 180
541 CCTGAAAGCAACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAG
P .ESNGTWRFPG I G E F Q C Y D K 200
601 TATATGAAATCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACA
YMKSSLQAYAESIGKTNWGT 220
661 AGCGGACCTCATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGG
SGPHDAGEY KNLPEDT E F F E 240
721 AGAGACGGAACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAG
RDGTWNSEYGKFFMEWYSGK 260
781 CTGCTAGAACATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGA
LLEHGDQLLSSAKGIFQGSG 280
841 GCAAAGCTATCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCA
A K L S G K V A G I H W Η Υ Ν T R S H A 300
901 gctgagctaaccgctggatattacaacacaagaaaccatgacgggtatctgccaatagct
AELTAGYYNTRNHDGYLPIA320
961 AAGATGTTCAACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGG
KMFNKHGVVLNFTCMEMKDG3 60
1021 GAGCAACCTGAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCG
EQPEHANCSPEGLVKQVQNA 380
1081 ACAAGGCAGGCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGCGCTAGAACGATATGACTCGAGC
TRQAGTELAGENALERYDSS 400
1141 GCATTCGGACAAGTGGTAGCAACAAATAGGTCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTT
AFGQVVATNRSDSGNGLTAF 420
1201 ACTTACCTAAGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAG
T Y L R Μ Ν K R L F E G Q N W Q Q L V E 440
1261 TTTGTTAAGAACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGG AGACTCTCAAAAGAAGACACAACT
FVKNMKEGGHGRRLS KEDTT 460
1321 GGAAGTGACCTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATCGCTGAGAATGTGGAGGAGGCT
GSDLYVGFVKGKXAENVEEA 480
81 GCTTTAGTGTAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTG
A L V - 4g3
1441 TCTGATAAATAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTGCACAA
1501 TTCTGGGTCAGAGTCAGAGCAAAGAGAAGCAAAATCAAGATGATGTACACTTAGATGTAT
1561 CCTATGAGTTTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTT
1621 CTCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC
PL 205 558 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1953 pary zasad (B) TYP: nukleotyd <C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (B) SZCZEP: Ekotyp Colombia <C) RODZAJ TKANKI: liść (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(A) BIBLIOTEKA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 31E10T7 (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom IV (ix) CECHA (A) NAZWA: CDS (B) POŁOŻENIE: 37-1683 bp (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3
TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG
MELTLNSS6
AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAGAAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC
SSLIKRKDAKSSRNQESSSN28
121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT
NMTFAKM KPPTYQFQAKNSV48
181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAGAAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA
KEMKFT H EKTFTPEGETLEK68
241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTTCCGGTG
WEKLHVLSYPHSKNDA£VPV88
01 TTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAACCACGAGCC
F V M L P L D Τ V Τ M S G H L Ν K P R A 108
61 ATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATGGTGGATGCT
MNASLMALKGAGVEGVMVDA 128
421 TGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGCTATGCCGAG
WWGLVEKDGPMNYNWEGYAE 148
PL 205 558 B1
481 CTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCATTCCATCAA b I Q Μ V Q K H G b K L Q V V M S F H Q 168
541 TGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTGCTTGAAGAG
CGGNVGDSCSI PLPPWVLEE188
601 ATCAGCAAGAACCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATCTGGGAGAAGGAACCCTGAATAT
I S K Ν P D L V Y T D K S G R R Ν Ρ E ¥ 208
661 ATCTCCTTGGGATGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATCCAGGTCTAC
I S L G C D S V Ρ V b R G R Τ Ρ I Q V Y 228
721 TCAGATTTCATGAGGAGCTTCCGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGAGTTATTGCG
SDFMRSFRERFEGYIGGVIA248
781 GAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATACCCTGAAAGC
E I Q V G M G P C G E L R Y P S Y Ρ E S 268
841 AACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAGTATATGAAA
N G T W R F P G I G E F Q C Y D K Y Μ K 2B8
901 TCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACAAGCGGACCT
S S L Q A Y A E S I G K Τ N W G T S G P 308
961 CATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGGAGAGACGGA
HDAGEYKNLPEDTEFFRRDG 328
1021 ACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAGCTGCTAGAA
TWNSEYGKFFMEWYSGKLLE 348
1081 CATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGAGCAAAGCTA
H G D Q L L S SAKG I F Q G S G A K L 368
1141 TCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCAGCTGAGCTA
S G K V A G I H W Η Y Ν T R S H A A E L 388
1201 ACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCAATAGCTAAGATGTTC
T A G Y Y Ν T RNHDGYLPIAKMF408
1261 AACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGGGAGCAACCT
Ν K H G V V L K F T C K E Μ K D G E Q P 428
1321 GAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCGACAAGGCAG
EHANCS P EGLVKQVQNATRQ 448
1381 GCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGCGCTAGAACGATATGACTCGAGCGCATTCGGA
A G Τ E L A G E N A L E R Y D S S A F G 468
1441 CAAGTGGTAGCAACAAATAGGtCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTTACTTACCTA
Q V V A Τ N R S D S G N G L T A F Τ Y b 488
1501 AGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAGTTTGTTAAG
RMNKRLFEGQNWQQLVEFVK 508
1561 AACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGACTCTCAAAAGAAGACACAACTGGAAGTGAC
NMKEGGHGRRLS KEDTTGSD 528
PL 205 558 B1
1621 CTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAG ATCGCTGAG AATGTGGAGG AGGCTGCTTTAGTG
LYVGFVKGKIAENVEEAALV 548
1681 TAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTGTCTGATAAA
1741 TAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTGCACAATTCTGGGTC
1801 agagtcagagcaaagagaagcaaaatcaagatgatgtacacttagatgtatcctatgagt
1861 TTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTTCTCCAAAAA
1921 AAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotyd
CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
CD) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4
AATTCCTCGA GTTCTCTTAT C 21
PL 205 558 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5
GGGATCCCT GACATTGTTA C 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 6:
( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6
GCTGGTACC CTGCAGGATC CGGTCCGGAA TTCCC 35
INFORMATION FOR SEO.ID.NO.7 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7 :
GGGAATTCCG GACCGGATCC TGCAGGCGTA CCAGC 3 5
PL 205 558 B1
SEQUENCE INFORMATION FOR SEQ. ID. NO. 8 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1652 pary zasad
(B) TYP: nukleotyd
CC) NICIOWOŚĆ: podwójna
CD) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (B) SZCZEP: Ekotyp Colombia (C) RODZAJ TKANKI: liść (vii) ŻRÓDLÓ BEZPOŚREDNIE:
(A) BIBLIOTEKA: EU Arabidopsis Genome Project (B) KLON: Kosmid G16599 <viii> POŁOŻENIE W GENOMIE:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom 4 (ix) CECHA (A) NAZWA: promotor (B) POŁOŻENIE: 17534-19185 bp G115599 nić komplementarna (xi> OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8 :
(ii) SEQUENCE DESCRIPHON: SEQ.ID.NO:8
1 AAGCTTGTGT CTATTTCAAA TTCTTGACCG TAGATGTCAC AACATGCATA
51 TATCATTGAA AACAGAGCAA CACAGGAAAC CAAGCATATG TATCTAGATA
101 TACTTAGCAA GACATAACTA TAGTCTTTGA ATCAACATAG GGATTAATGA
151 TAGAGAATGA GGAAGCTCAA GATTTTATAC TCAGTTTCTT ACAAAACAAA
201 TTTCTCTCTA ACTGCAAAAA CACCAATTAG GATTTGAAGA GCGTACCTGT
251 TTGAGTCAAT GTCCAATGTC GTCCCCCCGC CTTCTACATT TCTTAGCCTG
301 CTGAATAAAA GCACAAGCCA AAATGAGAAG GTGCCAAAGG CGATAAGGAT
351 CAATTTCTAC CATTCAAAAA ACTAATGGTG AGAATTAGAA ACGAGAGAAA
401 ACTACTTGTT GAGGAAATAG CCAAAAGCGC AATCTTCGTC ACCTGAATAA
451 AGACCAAACC GTCACTTTCA atgagtcagc AAGAAAAAGA GAGAGAGAGA
SOI GAGAGAGATT CTCTATAACA TTTGAGTCGA CATGGATTCT AATGCATCAA
PL 205 558 B1
551 AAGTCATCTC CAATAAACAA ACACTTGAAA CTCACATGGC TAATAGAACA
601 AGATCAAAGC CTTAAGTATT AAGCATTACA GACACTACTG GCTAACTTTT
651 GACACATGTT CTTAAGTAAC ATAGTATCAA TATCCGTGAA TCACATCGAA
701 CACACACAAC AAGGGCTTAA TGCATCAAAG TCCTGTTATT TCCATATAAC
751 AACATATTTC ATTTACAAAC AGAATGCAGC ATTCAGGCAG TCCAAATGGA
801 AAGGTTGACA AAAAAATATA ATCTTGTAAC TCTACATATA TGGCAGAATG
851 TAATAACCAG GCAAGAAAAA AACAGAATAA ACAGATCAAT GAGTATGATA
901 TAAAAAAAAG TCACAAAGAA TGTGCCACAG TGAACAAGAG GGCCATGAGA
951 AGAAATTTTC AAAGAAAATA TTAGCATTGT TAGAATTTTT TGGGTCAATG
1001 GATCTGTCAG CTGCTTAGTT GGAAAACACA AATCTTACAG GAAGGAAAGT
1051 CCAAGAAAAA GAAAATAAGC AAAGTTAATA GCCACCACAA GAAATTTCAT
1101 ACAGAAATAA TTAAATCGTT GCACTTATCT TCTTATTCAA ACTAAAATCA
1151 AGAGAACTTA ATAATTTTCA GCCACACGAA CCATGTGTTC AAAGCCAAAG
1201 GTGAGAAGCC AAAATTATCA GCTTATCTCC ATTAACAAGG GAAAAGCAAG
1251 ACTAGATTTA AGAGTTCTCT GTAACTAAAA ACTGCAGGAG TGAGTAAGTA
1301 AATAATTCAC CAACAGGAAA ACAAAACTCA ATTATCTATA GCTGAATACA
1351 CATGTAAATG AGAATTTATT AACTAAAACA TCTTCCTTTG TAACTGATGT
1401 GACATTTACA ATTTTTCATT TTGAGGTGTA AGAACCGTGT GACAAGTGAA
1451 AAGGTTAAAA TAAGCAACCT TTGTGATATT TTCTCTCCAC TTTTTGAAAT
1501 TGGGTCTCCA AACCACAGCC AATCAATATT CTTTATAAAT ACAAACACAC
1551 AAACAGCATC TTTCTCTCAA ACACAAACAT ATCTTCTATC AAACACCAAC
1601 AGCTCTATTC TCTACCTCAT TTCTCATCAT AACAAAGAGA GAGAAAAAAA
1651 CT

Claims (30)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sekwencja kwasu nukleinowego określona jako Id. Sekw. Nr: 1 o nukleotydach 1-294 kodująca sekwencję zdolną do kierowania białka do plastydu roślinnego, lub sekwencje o 65% lub więcej identyczności z Id. Sekw. Nr: 1, które hybrydyzują z sekwencją z Id. Sekw. Nr: 1 w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują sekwencję mającą taką samą zdolność kierowania.
  2. 2. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje do 94 aminokwasów.
    PL 205 558 B1
  3. 3. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje do 85 aminokwasów.
  4. 4. Sekwencja kwasu nukleinowego określona jako Id. Sekw. Nr: 2 o nukleotydach 1-1662 i kodująca β-amylazę, lub sekwencje mające 65% lub więcej identyczności z Id. Sekw. Nr: 2 i które hybrydyzują z Id. Sekw. Nr: 2 w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują β-amylazę.
  5. 5. Sekwencja kwasu nukleinowego określona jako Id. Sekw. Nr: 3 o nukleotydach 1-1953 i kodująca β-amylazę kierowaną do chloroplastów, albo sekwencje mające co najmniej 65% albo więcej identyczności z ujawnioną sekwencją w Id. Sekw. Nr: 3, które hybrydyzują z sekwencją Id. Sekw. Nr: 3, w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują β-amylazę kierowaną do chloroplastu.
  6. 6. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1-5, znamienna tym, że jest sekwencją mRNA, cDNA lub sekwencją genomowego DNA.
  7. 7. Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy stabilnego wprowadzania do genomu roślinnego genu chimerowego zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydów określoną w zastrz. 1.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że gen chimerowy ponadto zawiera sekwencję kodującą β-amylazę.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że enzym jest nieplastydową β-amylazą.
  10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja kodująca jest sekwencją kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 4.
  11. 11. Sposób według zastrz. 8-10, znamienny tym, że obejmuje zwiększanie lub zmniejszanie aktywności β-amylazy w roślinie.
  12. 12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 5.
  13. 13. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje zregenerowanie rośliny o zmienionym genomie.
  14. 14. Sposób według zastrz. 7-13, znamienny tym, że gen chimerowy ponadto zawiera sekwencję kodującą enzym wybrany z grupy składającej się z syntazy sacharozowej, pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej, enzymu rozgałęziającego, α-amylazy, izoamylazy, nie-plastydowej β-amylazy, α-glukozydazy, fosforylazy skrobiowej i enzymu dysproporcjonującego.
  15. 15. Sposób według zastrz. 7-14, znamienny tym, że chimerowy gen ponadto zawiera promotor, którym jest sekwencja kwasu nukleinowego zdolna do kierowania ekspresją produktu kodowanego przez sekwencję kodującą, która jest z nią funkcjonalnie połączona, przy czym ta sekwencja kwasu nukleinowego jest określona jako Id. Sekw. Nr: 8 lub mająca z nią co najmniej 65% identyczności i ma tę samą funkcję, i odpowiada na bodziec, a poziom ekspresji takiego produktu zmienia się w odpowiedzi na bodziec stosowany wobec tej sekwencji kwasu nukleinowego.
  16. 16. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że gen chimerowy zawiera ponadto sekwencję kodującą białko lub enzym, które są jednym lub więcej elementami w szlaku z następującej grupy: synteza lipidów, fotosynteza, metabolizm aminokwasów, wiązanie azotu, wiązanie węgla lub synteza polimerów węglowodanowych; albo mają zdolność nadawania cech roślinom.
  17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że gen chimerowy obejmuje sekwencję kierującą białka lub enzymu do plastydu roślinnego.
  18. 18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że nadawana cecha jest wybrana z następującej grupy: oporności na herbicydy i oporności na szkodniki.
  19. 19. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się roślinę, która już wykazuje zwiększenie lub zmniejszenie aktywności enzymatycznej w szlaku biosyntezy skrobi jako wynik transformacji genetycznej, a sposób i obejmuje zmianę dalszego enzymu w celu podwyższenia lub obniżenia poziomu enzymu, a tym samym zwiększenia lub zmniejszenia ilości skrobi wytworzonej przez retransformowaną roślinę, przy czym kolejnym enzymem jest kierowana do plastydu β-amylaza, która zawiera sekwencję Id. Sekw. Nr: 1.
  20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że β-amylaza kierowana do plastydu obejmuje Id. Sekw. Nr: 2.
  21. 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że pierwszą stransformowaną rośliną jest transgeniczny ziemniak transformowany genem pirofosforylazy adenozynodifosforano-glukozowej (ADPG-PPazy).
  22. 22. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że chimerowy gen ponadto zawiera promotor wybrany z grupy składającej się z promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (pełnego albo skróconego),
    PL 205 558 B1 promotora rubisco, promotora plastocyjaniny z grochu, promotora syntazy nopalinowej, promotora białka wiążącego chlorofil a/b, promotora gluteniny o wysokim ciężarze cząsteczkowym, promotora α, β-gliadyny, promotora hordeiny oraz promotora patatyny.
  23. 23. Sposób według zastrz. 8-13, znamienny tym, że sekwencja kodująca enzym w genie chimerowym dostarcza możliwości regulowania w górę albo w dół aktywności tego enzymu.
  24. 24. Gen chimerowy, znamienny tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1.
  25. 25. Chimerowy gen, znamienny tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydu określoną w zastrz. 1 i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą enzym ze szlaku rozkładu skrobi, kodowany przez sekwencję określoną w zastrz. 4.
  26. 26. Gen chimerowy, znamienny tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego zdolną do kierowania ekspresją dalszej sekwencji kodującej, którą jest sekwencja określona w zastrz. 5.
  27. 27. Komórki roślinne, znamienne tym, że zawierają sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1, 4, albo 5.
  28. 28. Nasiona transgenicznej rośliny, znamienne tym, że zawierają jedną albo więcej sekwencji kwasu nukleinowego określonych w zastrz. 1, 4 albo 5.
  29. 29. Rośliny transgeniczne, znamienne tym, że zawierają komórki roślinne określone w zastrz. 27.
  30. 30. Rośliny według zastrz. 29, znamienne tym, że są roślinami wybranymi z grupy składającej się z ziemniaków, pszenicy, kukurydzy, jęczmienia, pomidorów, ryżu, grochu, soi, orzeszków ziemnych, kasawy, słodkiego ziemniaka, bananów i tytoniu.
PL346704A 1998-08-19 1999-08-13 Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne PL205558B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9817963.3A GB9817963D0 (en) 1998-08-19 1998-08-19 A plastid-targeting nucleic acid sequence and uses therefor
GBGB9817959.1A GB9817959D0 (en) 1998-08-19 1998-08-19 A novel plastid-targeting nucleic acid sequence and a novel B-amylase sequence and uses therefor
GBGB9913014.8A GB9913014D0 (en) 1999-06-05 1999-06-05 A plastid-targeting nucleic acid sequence,a stimulus-responsive promoter,and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL346704A1 PL346704A1 (en) 2002-02-25
PL205558B1 true PL205558B1 (pl) 2010-05-31

Family

ID=27269441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL346704A PL205558B1 (pl) 1998-08-19 1999-08-13 Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6489540B1 (pl)
EP (1) EP1105468B1 (pl)
JP (2) JP2002523040A (pl)
CN (2) CN1528904B (pl)
AT (1) ATE527346T1 (pl)
AU (1) AU773492B2 (pl)
BR (1) BR9914299A (pl)
CA (1) CA2336249C (pl)
CZ (1) CZ303574B6 (pl)
ES (1) ES2375034T3 (pl)
HU (1) HU228696B1 (pl)
MX (1) MXPA01001815A (pl)
NZ (1) NZ509642A (pl)
PL (1) PL205558B1 (pl)
SK (1) SK288125B6 (pl)
TR (1) TR200100625T2 (pl)
WO (1) WO2000011144A2 (pl)
ZA (1) ZA200100736B (pl)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3546337B2 (ja) * 1993-12-21 2004-07-28 ゼロックス コーポレイション 計算システム用ユーザ・インタフェース装置及びグラフィック・キーボード使用方法
PL205558B1 (pl) * 1998-08-19 2010-05-31 Cambridge Advanced Tech Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne
US7091398B2 (en) 2001-02-22 2006-08-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Isolated sucrose sythase polynucleotides and uses thereof
US20060236426A1 (en) * 2001-04-25 2006-10-19 Jens Kossmann Nucleic acid molecules encoding starch degrading enzymes
EP1432798B1 (en) * 2001-08-27 2010-11-17 Syngenta Participations AG Self-processing plants and plant parts
US20060233930A1 (en) * 2002-11-08 2006-10-19 Bayer Cropscience Gmbh Process for reducing the acrylamide content of heat-treated foods
JP2007151435A (ja) * 2005-12-02 2007-06-21 Niigata Univ デンプン集積能力の高い形質転換植物およびその製造方法
BRPI0820565A2 (pt) * 2007-11-05 2014-10-14 Syngenta Participations Ag Métodos para aumentar o teor de amido em plantas
EP2401385A4 (en) * 2009-02-25 2012-10-10 Syngenta Participations Ag METHOD FOR INCREASING THE STRENGTH CONTENT IN PLANT PISTONS
US10443068B2 (en) 2010-06-25 2019-10-15 Agrivida, Inc. Plants with engineered endogenous genes
US9434954B2 (en) 2010-06-25 2016-09-06 Agrivida, Inc. Plants with altered levels of vegetative starch
US9598700B2 (en) 2010-06-25 2017-03-21 Agrivida, Inc. Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
WO2015021600A1 (en) * 2013-08-13 2015-02-19 Danisco Us Inc. Beta-amylase and methods of use
CN104232681B (zh) * 2014-09-28 2017-02-15 浙江大学 一种植物表达载体及在制备磷酸化改性水稻淀粉中的应用
CN117481005B (zh) * 2023-09-21 2024-08-02 中国烟草总公司广东省公司 一种坡地烟与山旱稻双优融合的种植方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5391725A (en) * 1989-12-08 1995-02-21 New York University Medical Center Organ-specific plant promoter sequences
US5451513A (en) * 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5349123A (en) * 1990-12-21 1994-09-20 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
EP0536293B1 (en) 1990-06-18 2002-01-30 Monsanto Technology LLC Increased starch content in plants
US5750876A (en) * 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
GB9522589D0 (en) * 1995-11-03 1996-01-03 Innes John Centre Modified plants and plant products
PL328819A1 (en) 1996-09-03 1999-02-15 Plant Genetic Systems Nv Improved barstar gene
PL205558B1 (pl) 1998-08-19 2010-05-31 Cambridge Advanced Tech Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne

Also Published As

Publication number Publication date
TR200100625T2 (tr) 2001-06-21
MXPA01001815A (es) 2002-06-21
NZ509642A (en) 2003-08-29
PL346704A1 (en) 2002-02-25
HUP0200732A3 (en) 2004-10-28
JP2010131029A (ja) 2010-06-17
WO2000011144A2 (en) 2000-03-02
CA2336249C (en) 2011-03-08
CN1234868C (zh) 2006-01-04
BR9914299A (pt) 2001-11-27
AU5432699A (en) 2000-03-14
CA2336249A1 (en) 2000-03-02
WO2000011144A3 (en) 2000-09-08
SK288125B6 (sk) 2013-10-02
CZ303574B6 (cs) 2012-12-19
EP1105468A2 (en) 2001-06-13
US20030074690A1 (en) 2003-04-17
HU228696B1 (en) 2013-05-28
SK2042001A3 (en) 2002-01-07
US6489540B1 (en) 2002-12-03
CN1528904A (zh) 2004-09-15
CN1528904B (zh) 2010-05-26
ATE527346T1 (de) 2011-10-15
HUP0200732A2 (hu) 2002-07-29
JP4673431B2 (ja) 2011-04-20
CN1323349A (zh) 2001-11-21
ES2375034T3 (es) 2012-02-24
EP1105468B1 (en) 2011-10-05
CZ2001460A3 (cs) 2001-11-14
AU773492B2 (en) 2004-05-27
JP2002523040A (ja) 2002-07-30
ZA200100736B (en) 2002-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4673431B2 (ja) 新規のプラスチドターゲティング核酸配列、新規のβ−アミラーゼ配列、刺激反応性プロモーター、およびその使用
AU656920B2 (en) Transgenic plants having a modified carbohydrate content
RU2129609C1 (ru) СПОСОБ КАТАЛИЗА РЕАКЦИИ ФЕРМЕНТАЦИИ СУБСТРАТА, СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ ПОТРЕБЛЕНИЯ ПИЩЕВОГО РАЦИОНА ЖИВОТНЫМ, ПЛАЗМИДА pMOG413, ПЛАЗМИДА pMOG429 И ПЛАЗМИДА pMOG227
US5436394A (en) Plasmid for the preparation of transgenic plants with a change in habit and yield
JPH09510342A (ja) 植物プラスチドにおけるトランスジェニック構造体の制御された発現
JPH10510162A (ja) バイオマス生産が改良されたトランスジェニック植物
US6284956B1 (en) Plant selectable marker and plant transformation method
JPH05507626A (ja) トランスジェニック植物におけるシクロデキストリンの生産
AU2001276398B2 (en) Transgenic plants which produce isomalt
US20030028925A1 (en) Plant selectable marker and plant transformation method
EP1458878B1 (en) Method of increasing the transgene-coded biomolecule content in organisms
US7728192B2 (en) Process for converting storage reserves of dicotyledonous seeds into compositions comprising one or more gene products
Koivu Novel sprouting technology for recombinant protein production

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140813