PL205611B1 - Wyizolowany gen zwf z Corynebacterium glutamicum, rekombinowana bakteria coryneform wytwarzająca L-lizynę lub L-treoninę oraz sposób wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny przez fermentację bakterii - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany gen zwf z Corynebacterium glutamicum, rekombinowana bakteria coryneform wytwarzająca L-lizynę lub L-treoninę oraz sposób wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny przez fermentację bakterii.

L-aminokwasy są wykorzystywane w żywieniu zwierząt, w medycynie i przemyśle farmaceutycznym.

Wiadomo, że aminokwasy można wytwarzać przez fermentację szczepów bakterii Corynebacterium (bakterie z grupy coryneform), zwłaszcza szczepy C. glutamicum. Z powodu dużego znaczenia, opracowuje się wciąż ulepszenia tych sposobów wytwarzania. Ulepszenia sposobów mogą dotyczyć takich parametrów fermentacji jak np. mieszanie i dostarczenie tlenu, albo składu pożywek hodowlanych, jak np. stężenia cukru podczas fermentacji, albo obróbki formy produktu przez np. chromatografię jonowymienną albo wewnętrzne właściwości samych drobnoustrójów.

W celu polepszenia wł a ś ciwoś ci produkcyjnych tych drobnoustrojów stosuje się metody mutagenezy, selekcji i wyboru mutantów. W ten sposób otrzymuje się szczepy odporne na antymetabolity, jak np. analog treoniny kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy (AHV), albo auksotrofy w stosunku do metabolitów o znaczeniu regulatorowym i wytwarzające L-aminokwasy jak np. treoninę.

Od kilku lat stosuje się również metody rekombinacji DNA, w celu polepszenia szczepów Corynebacterium glutamicum wytwarzających L-aminokwasy.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych, ulepszonych sposobów fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów przez bakterie coryneform (Corynebacterium).

L-aminokwasy znajdują zastosowanie w medycynie, przemyśle farmaceutycznym, spożywczym, a w szczególności w żywieniu zwierząt. Stąd powszechne jest zainteresowanie nowymi ulepszonymi sposobami wytwarzania aminokwasów.

Wynalazek dotyczy wyizolowanego genu z Corynebacterium glutamicum (genu zwf) uzyskanego przez zastosowanie PCR z C. glutamicum ATCC13032 z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych:

zwf-forward (Id. Sekw. Nr: 10): 5'-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3' zwf-reverse (Id. Sekw. Nr: 11): 5'-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3' kodującego polipeptyd o aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu, przy czym polipeptyd na N-końcu zawiera sekwencję aminokwasową (Id. Sekw. Nr: 9): Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp.

Ponadto wynalazek dotyczy rekombinowanej bakterii coryneform wytwarzającej L-lizynę lub L-treoninę, która jest transformowana genem według wynalazku, kodującym polipeptyd o aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu i zawierający na N-końcu sekwencję aminokwasową (Id. Sekw. Nr: 9): Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp.

Korzystnie gen jest wzmacniany przez zwiększenie liczby jego kopii. Korzystnie gen jest podłączony do promotora.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny przez fermentację bakterii z grupy coryneform, który obejmuje następujące etapy:

a) fermentację bakterii wytwarzających L-aminokwas, w których gen zwf kodujący dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu według wynalazku jest wzmocniony,

b) zatężanie L-aminokwasu w pożywce lub w komórkach bakterii, oraz

c) izolowanie wytworzonego L-aminokwasu.

W korzystnym sposobie stosuje się bakterie coryneform, które wytwarzają L-treoninę lub L-lizynę, korzystniej stosuje się bakterię z rodzaju Crynebacterium, która wytwarza L-lizynę.

Korzystnie w sposobie fermentacyjnego wytwarzania L-lizyny w bakteriach coryneform jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu dapA kodującego syntazę dihydrodipikolinanową,

b) genu lysC kodującego kinazę asparginianową odporną na sprzężenie zwrotne,

c) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,

d) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,

e) genu tkt kodującego transketolazę,

f) genu gnd kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,

g) genu lysE związanego z wydalaniem lizyny,

h) genu zwanego zwa1 zdeponowanego pod numerem DSM 13115,

PL 205 611 B1

i) genu eno kodującego enolazę, ulega lub ulegają równocześnie wzmocnieniu.

W równie korzystnym sposobie fermentacyjnego wytwarzania L-lizyny w bakteriach coryneform jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu dapA kodującego syntazę dihydrodipikolinanową,

b) genu lysC kodującego kinazę asparginianową odporną na sprzężenie zwrotne,

c) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,

d) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,

e) genu tkt kodującego transketolazę,

f) genu gnd kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,

g) genu lysE związanego z wydalaniem lizyny,

h) genu nazwanego zwa1 zdeponowanego pod numerem DSM 13115,

i) genu eno kodującego enolazę, ulega lub ulegają równocześnie nadekspresji.

Ponadto korzystny jest sposób fermentacyjnego wytwarzania L-treoniny, w którym w bakteriach coryneform jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu hom kodującego dehydrogenazę homoserynową albo allelu hom^dr kodującego dehydrogenazę homoserynową „oporną na sprzężenie zwrotne”,

b) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,

c) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,

d) genu mqo kodującego oksydoreduktazę jabłczanowo:chinonową,

e) genu tkt kodującego transketolazę,

f) genu gnd kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,

g) genu thrE związanego z wydalaniem treoniny,

h) genu zwanego zwa1 zdeponowanego pod numerem DSM 13115,

i) genu eno kodującego enolazę, ulega lub ulegają równocześnie wzmocnieniu.

Również korzystny jest sposób fermentacyjnego wytwarzania L-treoniny, w którym w bakteriach coryneform jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu hom kodującego dehydrogenazę homoserynową albo allelu hom^dr kodującego dehydrogenazę homoserynową „oporną na sprzężenie zwrotne”,

b) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,

c) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,

d) genu mqo kodującego oksydoreduktazę maleinianowo:chinonową,

e) genu tkt kodującego transketolazę,

f) genu gnd kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,

g) genu thrE związanego z wydalaniem treoniny,

h) genu zwanego zwa1 zdeponowanego pod numerem DSM 13115,

i) genu eno kodującego enolazę, ulega lub ulegają równocześnie nadekspresji.

Korzystny też jest sposób, w którym w celu wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny fermentowane są bakterie, w których jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu pck kodującego karboksykinazę fosfoenolopirogronianową,

b) genu pgi kodującego izomerazę glukozo-6-fosforanową,

c) genu poxB kodującego oksydazę pirogronianową, lub

d) genu zwanego zwa2 zdeponowanego pod numerem DSM 13113, jest lub są jednocześnie osłabione.

W korzystnym sposobie dla osiągnięcia wzmocnienia, zwiększona jest liczba kopii genu zwf według wynalazku przez transfomację wektorami plazmidowymi niosącymi ten gen.

W równie korzystnym wykonaniu sposobu w celu osią gnię cia wzmocnienia dodatkowych genów lub sekwencji nukleotydowych, zwiększona jest liczba ich kopii przez transformacje bakterii wektorami plazmidowymi, które niosą te geny lub sekwencje nukleotydowe.

Ponadto w sposobie korzystnie amplifikuje się allele genu zwf według wynalazku, które są wynikiem degeneracji kodu genetycznego.

Równie korzystnie w sposobie amplifikuje się allele genu zwf według wynalazku, które są wynikiem neutralnej mutacji sensownej.

PL 205 611 B1

Stosowane szczepy mogą korzystnie wytwarzać L-aminokwasy jeszcze przed wzmocnieniem genu zwf.

Określenie „wzmocnienie” w znaczeniu tu stosowanym oznacza zwiększenie aktywności wewnątrzkomórkowej jednego, albo wielu enzymów (białek) w drobnoustroju, które są kodowane przez odpowiedni DNA, przy czym zwiększeniu ulega przykładowo liczba kopii genu, względnie stosuje się wzmocniony promotor albo gen, który koduje enzym o zwiększonej aktywności, również można łączyć ze sobą powyższe możliwości.

Drobnoustroje stanowiące przedmiot wynalazku potrafią wytwarzać L-aminokwasy z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, skrobi, celulozy albo z glicerolu i etanolu. Dotyczy to przedstawicieli bakterii coryneform, zwłaszcza rodzaju Corynebacterium. Z rodzaju Corynebacterium w szczególnoś ci wymienić należ y gatunek Corynebacterium glutamicum znany z tego, ż e wytwarza L-aminokwasy.

Przydatne szczepy rodzaju Corynebacterium, zwłaszcza szczepy Corynebacterium glutamicum są przykładowo znanymi szczepami typu dzikiego

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

Brevibacterium flavum ATCC 14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 oraz wytworzone z nich mutanty wytwarzające L-aminokwasy, jak np. szczepy wytwarzające L-treoninę

Corynebacterium glutamicum ATCC 21649

Brevibacterium flavum BB69

Brevibacterium flavum DSM 5399

Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269

Brevibacterium lactofermentum TBB-10 i, przykładowo, szczepy takie jak wytwarzające L-izoleucynę

Corynebacterium glutamicum ATCC 14309

Corynebacterium glutamicum ATCC 14310

Corynebacterium glutamicum ATCC 14311

Corynebacterium glutamicum ATCC 15168

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 i, przykładowo, szczepy takie jak wytwarzające L-tryptofan Corynebacterium glutamicum ATCC 21850

Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901) i, przykładowo szczepy takie jak wytwarzające L-lizynę Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

Brevibacterium flavum FERM-P 1708

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Corynebacterium glutamicum DM 58-1

Corynebacterium glutamicum DSM 12866.

Stwierdzono, że bakterie coryneform wytwarzają L-aminokwasy zwłaszcza L-lizynę, L-treoninę i L-tryptofan ulepszonym sposobem po nadmiernym wyrażeniu genu zwf, kodującego białko Zwf.

Można również zastosować allele genu zwf, powstałe w wyniku degeneracji kodu genetycznego, lub sensownych mutacji o neutralnej funkcji.

JP-A-09224661 ujawnia sekwencję nukleotytową dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu nazwaną zwf z Brevibacterium flavum MJ-223 (FERM BP-1497). W opisie JP-A-09224661 przedstawiono sekwencję aminokwasową N-końca Zwf jako polipeptyd Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu (Id. Sekw. Nr: 7).

Jednakże potwierdzenie tego nie było możliwe. Zamiast podanej ustalono sekwencję aminokwasową N-końca jako Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp (Id. Sekw.

PL 205 611 B1

Nr: 8). Reszta waliny na N-końcu ze względu na postranslacyjną modyfikację będzie odcinana, co prowadzi do sekwencji aminokwasowej N-końca jako Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp (Id. Sekw. Nr: 9).

W celu wywołania efektu wzmocnienia (np. nadmiernej ekspresji/nadekspresji) zwiększa się liczbę kopii odpowiednich genów, albo mutuje regiony promotorowe i regulatorowe, albo miejsca przyłączania rybosomów, które znajdują się powyżej genów strukturalnych. W podobny sposób działają kasety ekspresji, które włącza się powyżej genów strukturalnych. Zastosowanie indukowalnych promotorów pozwala na dodatkowe zwiększenie wyrażania w trakcie fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów. Przez przedłużenie czasu trwania m-RNA można dodatkowo polepszyć ekspresję. Ponadto przez zapobieganie rozkładowi białek enzymatycznych można zwiększyć ich aktywność. Geny albo konstrukty genowe są obecne na plazmidach w różnej ilości kopii, albo zintegrowane w chromosomie i powielone. Alternatywnie, mo ż na uzyskać zwię kszenie ekspresji okreś lonych genów przez zmianę składu pożywki i warunków hodowli.

W tym celu można znaleźć wskazówki, między innymi w publikacjach Martin i in. (Bio/Technology 5, 137-146, (1987)); w Guerrero i in. (Gene 138, 35-41 (1944)); w Tsuchija i Morinaga (Bio/Technology 6,

428-430 (1988)); w Eikmanns i in. (Gene 102, 93-98 (1991)); w europejskim opisie patentowym EP

472 869; w patencie USA 4,601,893; w Schwarzer i Pϋhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991); w Reinscheid i in. (Applied Environental Microbiology 60, 126-132 (1994)); w LaBarre i in. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)); zgłoszenie patentowe WO 96/15246; Malumbres i in. (Gene 134, 15-24 (1993)); w japońskiej publikacji patentowej JP-A-10-229891; w Jensen i Hammer (Biotechnology Bioengineering 58, 191-195 (1998)); oraz w znanych podręcznikach genetyki i biologii molekularnej.

Przykładowo, białko Zwf zostało nadmiernie wyrażone przy użyciu plazmidu. W tym celu zastosowano E. coli - C. glutamicum wektor wahadłowy pEC-T18mob2 pokazany na Fig. 1. Plazmid pEC-T18mob2zwf, pokazany na Fig. 2 wytworzono po włączeniu genu zwf w miejsce cięcia KpnI/Sall wektora pEC-T18mob2.

Inne wektory plazmidowe, mogące replikować w C. glutamicum, jak np pEKEx1 (Eikmanns i in., Gene 102: 93-98 (1991)) lub pZ8-1 (EP-B-0 375 889), mogą być użyte w podobny sposób.

Oprócz amplifikacji genu zwf, do wytwarzania L-aminokwasów może być korzystne nadmierne wyrażanie jednego lub więcej enzymów szlaku biosyntezy, jak enzymy glikolizy, anaplerotyczne, szlaku pentozofosforanowego lub wydalania aminokwasów.

Tak więc przykładowo, w celu wytwarzania zwłaszcza L-treoniny można równocześnie amplifikować, a w szczególności nadmiernie wyrażać następujące enzymy:

- gen hom dla dehydrogenazy homoserynowej (Peoples i in., Molec. Microbiol. 2, 63-72 (1988)) albo allel hom^dr, kodujący dehydrogenazę homoserynową „oporną na sprzężenie zwrotne” (Archer i in., Gene 107, 53-59 (1991)),

- gen gap dla dehydrogenazy gliceroloaldehydo-3-fosforanowej (Eikmanns i in. (1992) Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)),

- gen pyc dla karboksylazy pirogronianowej (Peters-Wendisch i in., Microbiology 144: 915-927 (1998)),

- gen mqo dla oksydoreduktazy jabłczanowo:chinonowej (Molenaar i in., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),

- gen tkt dla transketolazy (nr dostępu AB023377 w EMBL, Heidelberg, Niemcy)

- gen gnd dla dehydrogenazy 6-fosfoglukonianu (JP-A-9-224662),

- gen thrE wydalania treoniny (DE 199 41 478.5; DSM 12840),

- gen zwa1 (DE 199 59 328.0; DSM 13115),

- gen eno dla enolazy (DE: 19947791.4)

Przykładowo, w celu wytwarzania L-lizyny można amplifikować, w szczególności równocześnie nadmiernie wyrażać następujące:

- gen dapA dla syntazy dihydrodipikolinanowej (EP-B0 197 335),

- gen lysC dla kinazy asparginianowej odpornej na sprzężenie zwrotne (Kalinowski i in. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324),

- gen gap dla dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (Eikmanns (1992) J. Bacteriol. 174: 6076-6086);

- gen pyc dla karboksylazy pirogronianowej (DE-A-198 31 609);

- gen tkt dla transketolazy (nr dostępu AB023377 w EMBL, Heidelberg, Niemcy);

- oprócz tego gen gnd dla dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (JP-A-9-224662),

PL 205 611 B1

- gen lysE dla wydalania lizyny (DE-A-195 48 222),

- gen zwa1 (DE 199 59 328.0; DSM 13115),

- gen eno dla enolazy (DE 199 47791.4).

Dalej, oprócz amplifikacji genu zwf, do wytwarzania L-aminokwasów można korzystnie równocześnie osłabić jeden lub więcej genów wybranych z grupy złożonej z:

- gen pck dla karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej (DE 199 50 409.1; DSM 13047),

- gen pgi dla izomerazy glukozo-6-fosforanowej (US 09/396,478, DSM 12969),

- gen poxB dla oksydazy pirogronianowej (DE 199 51 975.7; DSM 13114),

- gen zwa2 (DE: 199 59 327.2; DSM 13113).

W celu wytwarzania L-aminokwasów korzystne jest, oprócz nadmiernej ekspresji białka Zwf, wyłączenie niepożądanych reakcji (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”, w: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londyn UK, 1982).

Drobnoustroje wytworzone zgodnie z rozwiązaniami według wynalazku mogą być hodowane w sposób nieciągły albo ciągły, sposobem wsadowym albo innym, w celu wytwarzania L-aminokwasów. Podsumowanie znanych sposobów hodowania przedstawiono w podręczniku Chmiel (Bioprozestechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), albo Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen) (Vieweg Verlag, Braunscheig/Wiesbaden, 1994)).

Pożywka dla konkretnego szczepu musi spełniać pewne, określone wymagania zależne od określonego mikroorganizmu. Opis pożywek hodowlanych dla różnych drobnoustrojów można znaleźć w podręczniku „Manual of Methods for General Bacteriology”, American Society for Bacteriology, (Washington D.C. USA, 1981). Jako źródło węgla można zastosować różne węglowodany i cukry, takie jak np. glukoza, sacharoza, laktoza, fruktoza, maltoza, melasa, skrobia i celuloza, oleje i tłuszcze jak np. olej sojowy, słonecznikowy, arachidowy i kokosowy, kwasy tłuszczowe jak np. jak np. kwas palmitynowy, kwas stearynowy i kwas linolowy, albo alkohole jak np. glicerol i etanol, oraz kwasy organiczne jak np. kwas octowy. Jako źródła azotu można zastosować związki zawierające organiczny azot jak peptony, ekstrakty drożdży, ekstrakty mięsa, ekstrakty słodu, syrop z kukurydzy, mąka sojowa i mocznik, albo związki nieorganiczne jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, w ęglan i azotan amonu. Źródła azotu można stosować pojedynczo oraz jako mieszaninę. Jako źródła fosforanów można stosować kwas fosforowy, fosforan potasu albo fosforan dipotasu, albo odpowiednie sole zawierające azot. Pożywka hodowlana powinna zawierać również sole metali, jak np. siarczan magnezu albo siarczan żelaza, które są konieczne dla wzrostu. Na koniec, oprócz powyższych związków należy stosować niezbędne czynniki wzrostowe, jak aminokwasy i witaminy. Ponadto do pożywki można dodawać odpowiednie prekursory. Powyższe związki można dostarczać do hodowli w sposób ciągły, albo w sposób wsadowy.

W celu kontrolowania pH, stosuje się zwią zki zasadowe takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak, względnie wodę amoniakalną, albo związki kwasowe, jak kwas fosforowy czy siarkowy. W celu kontrolowania tworzenia się piany można stosować substancje przeciwpienne jak np. estry poliglikolowe kwasów tłuszczowych. W celu uzyskania stabilności plazmidu, można zastosować w pożywce substancje działające wybiórczo jak np. antybiotyki. W celu prowadzenia procesu tlenowego można doprowadzać do hodowli tlen, albo mieszaniny zawierające tlen jak np. powietrze. Temperatura hodowli w normalnych warunkach mieści się w zakresie od 20°C do 45°C, korzystnie od 25°C do 40°C. Hodowlę prowadzi się do uzyskania maksymalnego wytwarzania L-aminokwasu. Osiąga się to zwykle po 10 do 160 godzin hodowli.

Analizę L-aminokwasów przeprowadza się przez chromatografię anionowymienną z derywatyzacją ninhydryną według metody opisanej przez Spackman i in. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190, albo przez analizę HPLC w fazie odwróconej opisaną przez Lindroth i in. (Analitycal Chemistry ((1979) 51: 1167-1174).

Poniższy drobnoustrój zdeponowano w Deutsche Sammlung fur Mikrooorganismen und Zellkulturen (DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Brunszwik, Niemcy) zgodnie z Traktatem Budapeszte ń skim:

Escherichia coli K-12 DH5/pEC-T18mob2 jako DSM 13244.

Dołączono następujące Figury:

Figura 1: Mapa plazmidu pEC-T18mob2

Figura 2: Mapa plazmidu pEC-T18mob2zwf

Figura 3: Mapa plazmidu pAMC1

PL 205 611 B1

Figura 4: Mapa plazmidu pMC1

Figura 5: Mapa plazmidowa pCR2.1poxBint

Podaną liczbę par zasad stanowią powtarzalne wartości przybliżone.

W odniesieniu do Figury 1 i 2

Zastosowano skróty o następującym znaczeniu:

Tet gen oporności na tetracyklinę oriV kodowany przez plazmid początek replikacji E. coli

RP4mob region mob odpowiedzialny za mobilność plazmidu rep kodowany przez plazmid początek replikacji plazmidu pGA1z C. glutamicum per gen kontrolujący liczbę kopii pGA1 lacZ-alfa fragment genu lacZa (koniec N) genu β-galaktozydazy lacZalfa' koniec 5' fragmentu genu lacZa 'lacZalfa koniec 3' fragmentu genu lacZa

W odniesieniu do Figury 3 i 4

Zastosowano skróty o następującym znaczeniu:

Neo r gen oporności na neomycynę/kanamycynę

ColE1 ori początek replikacji plazmidu ColE1

CMV promotor wirusa cytomegalii

LacP promotor laktozy

Pgi gen izomerazy fosfoglukozy

LacZ część genu β-galaktozydazy

SV40 3' splice 3' miejsce składania transkryptu małpiego wirusa 40

SV40 polyA miejsce poliadenylacji transkryptu małpiego wirusa 40 f1(-)ori początek replikacji faga filamentowego f1

SV40 ori miejsce początku replikacji małpiego wirusa 40 kan r gen oporności na kanamycynę pgi insert wewnętrzny fragment genu pgi ori początek replikacji plazmidu pBGS8

W odniesieniu do Figury 5

Zastosowano skróty o następującym znaczeniu:

ColE1 ori początek replikacji plazmidu ColE1

LacZ pozostałość fragmentu genu lacZa po klonowaniu f1 ori początek replikacji faga f1

KmR oporność na kanamycynę

ApR oporność na ampicylinę

PoxBint wewnętrzny fragment genu poxB

Znaczenie skrótów oznaczających nazwy różnych enzymów restrykcyjnych (np. BamHI, EcoRI itp.) jest znane ze stanu techniki i jest podsumowane, na przykład w publikacji Kessler i Holtke (Gene 47, 1-153 (1986)), albo Roberts i in. (Nucleic Acids Research 27, 312-313 (1999)).

P r z y k ł a d y

Poniższe przykłady ilustrują rozwiązania według wynalazku. O ile nie podano inaczej stosowano techniki biologii molekularnej, np. izolowanie plazmidowego DNA, trawienie restrykcyjne, ligacje, standardowe transformowanie E. coli itp. jak opisane w publikacji Sambrook i in., (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Sprin Harbour Laboratories, USA).

P r z y k ł a d 1: Ekspresja białka Zwf

1.1 Wytwarzanie plazmidu pEC-T18mob2

Wektor wahadłowy E. coli- C. glutamicum pEC-T18mob2 wytworzono w sposób znany ze stanu techniki.

Wektor zawiera region replikacji rep plazmidu pGA1 zawierający efektor transkrypcji per (US-A-5,175,108; Nesvera i in., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)) gen zapewniający oporność na tetracyklinę tetA(Z) z plazmidu pAG1 (US-A-5,158,891; numer dostępu w bibliotece National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) oznaczony nr AF121000) region replikacji oriV plazmidu pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), fragment genu lacZa zawierający promotor lac i miejsce wielokrotnego klonowania (mcs) (Norrander i in., Gene 26, 101-106 (1983)) i region mob plazmidu RP4 (Simon i in., (1983) Bio/Technology 1: 784-791).

PL 205 611 B1

Powstały wektor transformowano do E. coli szczepu DH5a (Brown (ed.) Molecular Biology Labfax, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK, 1991). Selekcję komórek niosących plazmid przeprowadzono przez wysianie mieszaniny transformacyjnej na agarze LB (Sambrook i in., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) z dodatkiem 5 mg/l tetracykliny. Plazmidowy DNA izolowano z transformantów zestawem QIAprep Spin Miniprep Kit z Qiagen i sprawdzano przez trawienie restrykcyjne EcoRI i Hindlll i elektroforezę na żelu agarozowym (0,8%).

Plazmid nazwano pEC-T18mob2 i przedstawiono na Fig. 1. Został on zdeponowany w szczepie E. coli K-12 DH5apEC-T18mob2 w DSMZ (Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen, Brunszwik, Niemcy) jako DSM 13244.

1.2 Wytwarzanie plazmidu pEC-T18mob2zwf

Gen z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 najpierw amplifikowano przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) stosując następujące startery oligonukleotydowe:

zwf-forward (Id. Sekw. Nr: 10): 5-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3' zwf-reverse (Id. Sekw. Nr: 11): 5'-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3'

Reakcję PCR przeprowadzono w 30 cyklach w obecności 200 μΜ trifosforanów dezoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 μΜ każdego z odpowiednich oligonukleotydów, 100 ng chormosomalnego DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, 1/10 objętości 10-krotnie stężonego buforu reakcyjnego oraz 2,6 jednostek mieszaniny termostabilnej polimerazy DNA Taq-/Pwo- (Expand High Fidelity PCR System, Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) w urządzeniu Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) w następujących warunkach: 94°C przez 30 sekund, 64°C przez 1 minutę i 68°C przez 3 minuty.

Amplifikowany fragment długości około 1,8 kb poddano ligacji przy pomocy zestawu SureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja) w miejsce cięcia Smal wektora pUC18 według instrukcji producenta. Szczep E. coli DH5aMCR (Grant i in., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformowano całą porcją reakcji ligacji. Transformanty zidentyfikowano dzięki ich oporności na karbenicylinę na płytkach z agarem LB, zawierających 50 μg/ml karbenicyliny. Plazmidy wyizolowano z 7 transformantów i sprawdzono obecność fragmentu PCR wielkości 1,8 kb jako wstawki przy pomocy analizy restrykcyjnej. Wytworzony rekombinowany plazmid zwano dalej pUC18zwf.

W celu skonstruowania pEC-T18mob2zwf, plazmid pUC18zwf trawiono KpnI i SalI, produkt wyizolowano przy pomocy zestawu NucleoSpin Extraction Kit z Macherey-Nagel (Diiren, Niemcy) według instrukcji producenta, a następnie poddano ligacji do wektora pEC-T18mob2, który również cięto KpnI i Sall i defosforylowano. E. coli szczepu DH5amcr (Grant i in., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformowano całą porcją reakcji ligacji. Transformanty zidentyfikowano przy użyciu ich oporności na tetracyklinę na płytkach z agarem LB, zawierających 5 μg/ml tetracykliny. Plazmidy wyizolowano z 12 transformantów i sprawdzono obecność fragmentu PCR wielkości 1,8 kb jako wstawki przy pomocy analizy restrykcyjnej. Jeden z wyizolowanych w ten sposób rekombinowanych plazmidów nazwano pEC-T18mob2zwf (Figura 2).

P r z y k ł a d 2: Wytwarzanie producentów aminokwasów przy użyciu amplifikacji genu zwf

Szczep Corynebacterium glutamicum DSM5715 wytwarzający L-lizynę jest opisany w EP-B-0435132, a szczep Brevibacterium flavum DSM 5399 wytwarzający L-treoninę jest opisany w EP-B-0385940. Oba szczepy zdeponowano w DSMZ (Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen, Brunszwik, Niemcy) zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim.

2.1 Wytworzenie szczepu DSM5715/pEC-T18mob2zwf i szczepu DSM5399/pEC-T18mob2zwf

Szczepy DSM5715 i DSM5399 transformowano plazmidem pEC-T18mob2zwf stosując elekroporację opisaną przez Liebl i in., (FEMS Microbiology Letters 53: 299-303 (1989)). Selekcję transformantów przeprowadzono na agarze LBHIS zawierającym 18,5 g/l bulionu z mózgu i serca, 0,5 M sorbitolu, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l ekstraktu drożdżowego Bacto, 5 g/l NaCl 18 g/l agaru Bacto, z dodatkiem 5 mg/l tetracykliny. Inkubację prowadzono przez 2 dni w 33°C.

Plazmidowe DNA izolowano z transformantu w sposób konwencjonalny (Peters-Wendish i in., 1998, Microbiology, 144, 915-927), trawiono endonukleazą restrykcyjną Xbal i KpnI, a plazmid sprawdzano przez elektroforezę na żelu agarozowym. Otrzymane szczepy nazwano DSM5715/pEC-T18mob2zwf i DSM5399/pEC-T18mob2zwf.

PL 205 611 B1

2.2 Wytwarzanie L-treoniny

Szczep C. glutamicum DSM5399/pEC-T18mob2zwf otrzymany w przykładzie 2.1 hodowano na pożywce odżywczej odpowiedniej do wytwarzania treoniny i określano zawartość treoniny w supernatancie.

W tym celu, szczep wysiano na pł ytkę agarow ą z odpowiednim antybiotykiem (agar z wycią giem z mózgu i serca z tetracykliną (5 mg/l)) przez 24 godziny w 33°C. Z płytki wykonano hodowlę wstępną (10 ml pożywki w 100 ml kolbie stożkowej). Jako pożywkę kompletną do hodowli wstępnej zastosowano pożywkę Cglll.

Pożywka Cglll

NaCl 2,5 g/l

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto-Yeast ekstrakt 10 g/l

Glukoza (autoklawowana osobno) 2% (wag./obj.) pH ustalono na 7,4

Następnie dodano tetracyklinę (5 mg/l). Hodowlę wstępną inkubowano wytrząsając z szybkością 240 obrotów na minutę w 33°C na wytrząsarce przez 16 godzin. Tą hodowlą wstępną zaszczepiono główną hodowlę tak, że jej OD (660 nm) wynosiła 0,1 OD. Do hodowli głównej zastosowano pożywkę MM.

Pożywka MM
CSL (Corn Steep Liquor - syrop kukurydziany)	5 g/l
MOPS (kwas morfolinopropanosulfonowy)	20 g/l
glukoza (osobno autoklawowana)	50 g/l
(NH4)2SO4	25 g/l
KH2PO4	0,1 g/l
MgSO4 x 7H2O	1,0 g/l
CaCl2 x 2H2O	10,0 mg/l
FeSO4 x 7H2O	10,0 mg/l
MnSO4 x H2O	5,0 mg/l
Biotyna (sterylizowana przez filtrację)	0,3 mg/l
Tiamina x HCl (sterylizowana przez filtrację)	0,2 mg/l
L-leucyna (sterylizowana przez filtrację)	0,1 g/l
CaCO3	25 g/l
CSL, MOPS i roztwór soli doprowadzono do pH 7 przy użyciu wody amoniakalnej i autoklawo-

wano. Na koniec, dodano sterylizowany roztwór substratów i witamin, jak również autoklawowany w postaci suchej CaCO3.

Hodowlę prowadzono w 10 ml objętości w 100 ml kolbie stożkowej z progami. Dodano tetracyklinę (5 mg/l). Hodowla przebiegała w 33°C i 80% wilgotności powietrza.

Po 72 godzinach określono OD przy długości fali 660 nm na urządzeniu Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Monachium). Ilość wytworzonej treoniny określono przy użyciu analizatora aminokwasów Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) przez chromatografię jonowymienną i derywatyzację z wykrywaniem metodą ninhydrynową. W Tabeli 1 pokazano wyniki doświadczenia.

T a b e l a 1

Szczep	OD	L-treonina g/l
DSM5399	12,3	0,74
DSM5399/pEC-T18mob2zwf	10,2	1,0

2.3 wytwarzanie L-lizyny

Szczep C. glutamicum DSM5715/pEC-T18mob2zwf otrzymany w Przykładzie 2.1 hodowano w pożywce odżywczej przydatnej do wytwarzania lizyny i określano zawartość lizyny w supernatancie hodowli.

W tym celu, szczep inkubowano najpierw na płytce agarowej z odpowiednim antybiotykiem (agar z wyciągiem z mózgu i serca z tetracykliną (5 mg/l)) przez 24 godziny w 33°C. Wychodząc z tej hodowli na płytce agarowej, zaszczepiano hodowlę wstępną (10 ml pożywki w 100 ml stożkowej kolbie). Pełną pożywkę Cglll zastosowano jako pożywkę do hodowli wstępnej.

PL 205 611 B1

Pożywka CgIII

NaCl 2,5 g/l

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto-Yeast ekstrakt 10 g/l

Glukoza (autoklawowana osobno) 2% (wag./obj.) pH doprowadzono do pH 7,4

Do tej pożywki dodawano tetracyklinę (5 mg/l). Hodowlę wstępną inkubowano przez 24 godziny w 33°C przy 240 rpm w wytrząsarce. Hodowlą tą zaszczepiano hodowlę główną, tak aby wyjściowe

OD (660 nm) hodowli głównej wynosiło 0,1. Do hodowli głównej stosowano pożywkę MM.

Pożywka MM

CSL (Corn Steep Liquor - syrop kukurydziany) 5 g/l

MOPS (kwas morfolinopropanosulfonowy) 20 g/l

Glukoza (autoklawowana osobno) 58 g/l (NH4)2SO4 25 g/l

KH2PO4 0,1 g/l

MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l

CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l

FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l

MnSO4 * H2O 5,0 mg/l

Biotyna (sterylizowana przez filtrację) 0,3 mg/l

Tiamina * HCl (sterylizowana przez filtrację) 0,2 mg/l

L-Leucyna (sterylizowana przez filtrację) 0,1 g/l

CaCO3 25 g/l

CSL, MOPS i roztwór soli doprowadzano do pH 7 roztworem wody amoniakalnej i autoklawowano. Następnie dodawano sterylny substrat i roztwory witamin jak również CaCO3 autoklawowany w suchej postaci.

Hodowlę prowadzono w objętości 10 ml w 100 ml kolbie stożkowej z przegrodami. Dodawano tetracyklinę (5 mg/l). Hodowlę prowadzono w 33°C i 80% wilgotności atmosfery.

Po 72 godzinach, określano OD przy długości fali 660 nm stosując Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). Powstające stężenie lizyny analizowano przy użyciu analizatora aminokwasów z Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) przez chromatografię jonowymienną i uzyskanie pochodnej po kolumnie z wykrywaniem ninhydryną. Wyniki doświadczenia są pokazane w Tabeli 2.

T a b e l a 2

Szczep	OD	L-lizyna HCI g/l
DSM5715	10,8	16,0
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	7,2	17,1

P r z y k ł a d 3: Konstruowanie banku genów w szczepie AS019 Corynebacterium glutamicum

Bibliotekę DNA Corynebacterium glutamicum szczepu AS019 (Yoshihama I in., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)) skonstruowano stosując system λZap Express™ (Short i in., (1988) Nucleic Acids Research 16: 7583-7600) jak to opisano przez O'Donohue, M. (The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum, teza doktorska, National University of Ireland, Galway, (1997)). Zestaw λZap Express™ zakupiono z Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037.) i zastosowano według instrukcji producenta. DNA AS019 trawiono enzymem restrykcyjnym Sau3A i poddano ligacji do trawionych BamHI i defosforylowanych ramion λZap Express™.

P r z y k ł a d 4: Klonowanie i sekwencjonowanie genu pgi

1. Klonowanie

Szczep Escherichia coli DF1311 przenoszący mutacje w genach pgi i pgl, jak to opisano przez Kupor i Fraenkel (Journal of Bacteriology 100: 1296-1301 (1969)), transformowano około 500 ng plazmidowej biblioteki AS019 λZap Express™, opisanej w przykładzie 3. Selekcję transformantów przeprowadzono na minimalnej pożywce M9 (Sambrook i in., (1989). Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbour Laboratries, 5 USA)), z dodatkiem kanamycyny w ilości 50 mg/l i inkubowano w 37°C przez 48 godzin. Plazmidowy DNA wyizolowano z transformantu według instrukcji

PL 205 611 B1

Birnboim i Doly, 1979, (Rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid Research, 7: 1513-1523.) i oznaczono jako pAMC1 (Figura 3).

2. Sekwencjonowanie

Analiza sekwencyjna wstawionego insertu pAMC1 została przeprowadzona według metody Sanger i in. (Proceedings of National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467 (1977)) stosując fluoroscencyjnie wyznakowane znaczniki. Sekwencjonowanie prowadzono stosując analizator genetyczny ABI prism 310 z Perkin Elmer Applied Biosystems, (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut, USA), i ABI prism Big Dye™ zestaw Terminator Cycle Sequencing Reaction również z firmy Perkin Elmer.

Analizę sekwencji wewnętrznej prowadzono stosując startery uniwersalny naprzód i wstecz M13 uzyskane z Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, AL1, 3AW, UK):

Starter uniwersalny naprzód: GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C

Starter M13 wstecz: GGA AAC AGC TAT GAC CAT G

Startery wewnętrzne zostały następnie zaprojektowane na podstawie uzyskanych sekwencji, co pozwoliło uzyskać sekwencję całego genu pgi. Zastosowano startery wewnętrzne o następującej sekwencji:

Starter wewnętrzny 1: GGA AAC AGG GGA GCC GTC

Starter wewnętrzny 2: TGC TGA GAT ACC AGC GGT

Uzyskaną sekwencję analizowano stosując program DNA Strider (Marck (1988), Nucleic Acids Research 16: 1829-1836), wersja 1.0 na komputerze Apple Macintosh. Program ten umożliwia analizę wykorzystania miejsc restrykcyjnych, analizę ramki odczytu i określenie wykorzystania kodonów. Porównanie otrzymanej sekwencji DNA z sekwencjami EMBL i Genbank przeprowadzono stosując program BLAST (Altschul i in., (1997) Nucleic Acid Research, 25: 3389-3402)). Sekwencje DNA i białek przyrównano stosując programy Clustal V i Clustal W (Higgins I Sharp, 1988, Gene 73: 237-244).

Otrzymaną sekwencję pokazano jako Id. Sekw. Nr: 1. Analiza otrzymanej sekwencji nukleotydowej wykazała otwartą ramkę odczytu wielkości 1650 par zasad, którą oznaczono jako gen pgi. Koduje ona białko wielkości 550 aminokwasów, pokazane na Id. Sekw. Nr: 2.

P r z y k ł a d 5: Wytwarzanie wektora integracyjnego do mutagenezy integracyjnej genu pgi

Wewnętrzny segment genu pgi amplifikowano metodą PCR używając jako matrycy genomowego DNA wyizolowanego z Corynebacterium glutamicum AS019 (Heery i Dunican, (1993) Applied and Environmental Microbiology 59: 791-799). Użyto starterów dla pgi:

fwd. Starter: ATG GAR WCC AAY GGH AA rev. Starter: YTC CAC GCC CCA YTG RTC gdzie R=A+G; Y=C+T; W=A+T; H=A+T+C.

Parametry procesu PCR były następujące:

cykli

94°C przez 1 min.

47°C przez 1 min.

72°C przez 30 sek.

1,5 mM MgCl2 około 150-200 ng matrycowego DNA.

Otrzymany produkt PCR klonowano do dostępnego w handlu wektora pGEM-T zakupionego z Promega Corp., (Promega UK, Southampton) używając szczepu E. coli JM109, (Yanisch-Perron i in., 1985, Gene, 33: 103-119) jako gospodarza. Sekwencję produktu PCR pokazano jako Id. Sekw. Nr: 3. Wklonowaną wstawkę wycięto jako fragment EcoRI i wligowano do plazmidu pBGS8 (Spratt i in., Gene 41: 337-342 (1986)) uprzednio trawionego EcoRI. Używane enzymy restrykcyjne pochodziły z Boehringer Mannheim UK Ltd., (Bell Lane, Lewes East Sussex BN7 1LG, UK.) i stosowane były zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie transformowano E. Coli JM109 mieszaniną ligacyjną i selekcjonowano elektrotransformanty na agarze Luria uzupełnionym IPTG (izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozyd), X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-D-galaktopiranozyd) i kanamycyną w stężeniu 1 mM, 0,02% i 50 mg/l, odpowiednio. Płytki agarowe inkubowano przez 12 godzin w 37°C. Plazmidowy DNA wyizolowany z jednego transformanta scharakteryzowano przez analizę enzymami EcoRI, BamHI, Sall i oznaczono jako pMC1 (Figura 4).

Plazmid pMC1 zdeponowano w szczepie Escherichia coli DH5a/pMCl w DSMZ, (Braunschweig, Niemcy) jako DSM 12969 zgodnie z Traktatem Budapesztańskim.

PL 205 611 B1

P r z y k ł a d 6: Mutageneza integracyjna genu pgi w szczepie DSM 5715 wytwarzającym lizynę

Wektor pMC1 opisany w Przykładzie 5 wstawiono metodą elektroporacji według Tauch i wsp. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) do Corynebacterium glutamicum DSM 5715. Szczep DSM 5715 jest producentem lizyny opornym na AEC. Wektor pMC1 nie może replikować się niezależnie w DSM 5715 i jest utrzymywany w komórkach jedynie po włączeniu do chromosomu DSM 5715. Selekcję klonów z pMC1 włączonym do chromosomu przeprowadzono poprzez wysianie mieszaniny po elektroporacji na agar LB (Sambrook i wsp., Molecular cloning: a laboratory manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), uzupełniony 15 mg/l kanamycyny. W celu wykrycia integracji fragment wewnętrzny fragment pgi (przykład 5) znakowano przy użyciu zastawu hybrydyzacyjnego Dig z Boehringer stosując metodę „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” z Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993). Chromosomowy DNA transformanta izolowano stosując metodę według Eikmanns i in. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) i w każdym przypadku trawiono enzymami restrykcyjnymi SalI, SacI i Hindlll. Powstałe fragmenty rozdzielano przez elektroforezę w żelu agarozowym i hybrydyzowano w 68°C przy użyciu zastawu hybrydyzacyjnego Dig z Boehringer. Stwierdzono, że plazmid pMC1 wstawiono do chromosomu DSM5715 w obrębie chromosomowego genu pgi. Szczep nazwano DSM5715::pMC1.

P r z y k ł a d 7: Wpływ nadekspresji genu zwf z jednoczesną eliminacją genu pgi na wytwarzanie lizyny

7.1 Wytwarzanie szczepu DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf

Wektor pEC-T18mob2zwf wspomniany w przykładzie 1.2 elektroporowano metodą według Tauch i wsp. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) do Corynebacterium glutamicum DSM 5715:pMC1. Selekcję komórek niosących plazmidy prowadzono przez wysianie elektroporowanych komórek na agar LB (Sambrook i in., Molecular cloning: a laboratory manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), uzupełniony 15 mg/l kanamycyny i 5 mg/l tetracykliny. Plazmidowy DNA izolowano z transformantów stosując metody konwencjonalne (PetersWendisch i in., 1998, Mikrobiology 144, 915-927) i sprawdzano tnąc enzymami restrykcyjnymi KpnI i Sall z następującą po tym elektroforezą w żelu agarozowym. Uzyskany szczep nazwano DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf.

7.2 Wytwarzanie lizyny

Szczep C. glutamicum DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf wytworzony w przykładzie 7.1 hodowano na pożywce odpowiedniej do wytwarzania lizyny i określano zawartość lizyny w supernatancie.

W tym celu szczep wysiano na płytkę agarową z odpowiednim antybiotykiem (agar z wyciągiem z mózgu i serca z tetracykliną (5 mg/l) i kanamycyną (25 mg/l) przez 24 godziny w 33°C. Hodowlę szczepów porównawczych uzupełniono według ich oporności na antybiotyki. Z płytki wykonano hodowlę wstępną (10 ml pożywki w 100 ml kolbie stożkowej). Jako pożywkę do hodowli wstępnej zastosowano pożywkę Cglll.

Pożywka Cglll

NaCl 2,5 g/l

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto - Yeast Ekstrakt 10 g/l

Glukoza (autoklawowana osobno) 2% (wag./obj.) pH ustalono na 7,4

Następnie dodano tetracyklinę (5 mg/l) i kanamycynę (5 mg/l). Hodowlę wstępną inkubowano wytrząsając z szybkością 240 obrotów na minutę w 33°C na wytrząsarce przez 16 godzin. Tą hodowlą wstępną zaszczepiono główną hodowlę, tak że jej OD (660 nm) wynosiło 0,1. Do hodowli głównej zastosowano pożywkę MM.

Pożywka MM

CSL (Corn Steep Liquor - syrop kukurydziany) 5 g/l

MOPS (kwas morfolinopropanosulfonowy) 20 g/l

Glukoza (autoklawowana osobno) 50 g/l (NH4)2SO4 25 g/l

KH2PO4 0,1 g/l

MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l

CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l

FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l

MnSO4 * H2O 5,0 mg/l

PL 205 611 B1

Biotyna (sterylizowana przez filtrację) 0,3 mg/l

Tiamina * HCl (sterylizowana przez filtrację) 0,2 mg/l

L-Leucyna (sterylizowana przez filtrację) 0,1 g/l

CaCO3 25 g/l

CSL, MOPS i roztwór soli doprowadzano do pH 7 roztworem wody amoniakalnej i autoklawowano. Następnie dodawano sterylny substrat i roztwory witamin jak również CaCO3 autoklawowany w suchej postaci.

Hodowlę prowadzono w 10 ml objętości w 100 ml kolbie stożkowej z progami. Dodano tetracyklinę (5 mg/l) i kanamycynę (25 mg/l). Hodowla przebiegała w 33°C i 80% wilgotności powietrza.

Po 72 godzinach określono OD przy długości fali 660 nm na urządzeniu Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Monachium). Ilość wytworzonej lizyny określono przy użyciu analizatora aminokwasów Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) przez chromatografię jonowymienną i derywatyzację z wykrywaniem metodą ninhydrynową. W tabeli 3 pokazano wyniki doświadczenia.

T a b e l a 3

Szczep	OD	L-lizyna HCI g/l
DSM5715	7,3	14,3
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	7,1	14,6
DSM5715::pMC1/pEC-Tmob2zwf	10,4	15,2

P r z y k ł a d 8: Wytwarzanie genomowego banku genów z Corynebacterium glutamicum

ATCC 13032 w kosmidach

Chromosomalny DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 izolowano sposobem opisanym przez Tauch i in., (1995, Plazmid 33: 168-179) i częściowo trawiono enzymem restrykcyjnym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu Sau3AI kod nr 27-0913-02). Fragmenty DNA defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy, opis produktu SAP kod nr 1758250). DNA wektorów kosmidowych SuperCos1 (Wahl i in., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2160-2164), wytworzony przez Stratagene (La Jolla, USA, opis produktu SuperCos1 Cosmid Vector Kit, kod nr 251301) cięto enzymem restrykcyjnym Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu Xbal, kod nr 27-0948-02) i defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek. Na koniec, kosmidowy DNA cięto enzymem restrykcyjnym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu BamHI, kod nr 27-0868-04). Traktowany w ten sposób DNA kosmidowy zmieszano z DNA ATCC 13032 i traktowano ligazą DNA T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu T4-DNA-Ligase, kod nr 27-0870-04). Mieszaninę ligacyjną pakowano do fagów przy użyciu ekstraktu Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, opis produktu Gigapack II XL Packing Extract, kod nr 200217). W celu zakażania E. coli szczepu NM554 (Raleigh i in., 1988, Nucl. Acids Res., 16: 1563-1575), komórki pobrano w 10 mM MgSO4, i zmieszano z porcją zawiesiny fagów. Zakażenie i miareczkowanie banku kosmidowego przeprowadzono sposobem według Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), przy czym komórki wysiano na agar LB (Lennox, 1955, Virology 1:190) z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny. Po inkubacji przez noc, w 37°C selekcjonowano pojedyncze rekombinowane kolonie.

P r z y k ł a d 9: Izolowanie i sekwencjonowanie genu poxB

Kosmidowy DNA pojedynczych kolonii (przykład 7) izolowano przy użyciu zestawu Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt nr 27106, Qiagen, Hilden, Niemcy) według instrukcji producenta i cięto częściowo enzymem restrykcyjnym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu Sau3AI, kod nr 27-0913-02). Fragmenty DNA defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy, opis produktu SAP, kod nr 1758250). Po rozdziale elektroforetycznym, izolowano fragmenty kosmidów w zakresie wielkości od 1500 do 2000 bp przy użyciu zestawu QiaExII Gel Extraction Kit (produkt nr 20021, Qiagen, Hilden, Niemcy). DNA wektora sekwencjonującego pZero-1 firmy Invitrogen (Groningen, Holandia, produkt opisany jako Zero Backround Cloning Kit nr K2500-01) cięto enzymem restrykcyjnym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu BamHI, kod nr 27-0868-04). Ligację fragmentów kosmidów w wektorze do sekwencjonowania pZero-1 przeprowadzono sposobem opisanym przez Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), w którym mieszaninę DNA inkubowano przez noc z ligazą DNA T4 (Pharmacia, Freiburg, Niemcy). Mieszaninę ligacyjną elektroporowano do

PL 205 611 B1 bakterii E. coli DH5aMRC (Grant i in., 1990, Proceedings of the National. Academy of Sciences USA 87 4645-4649), metodą Tauch i in., (1994 FEMS Microbiol. Letters, 123: 343-7), po czym komórki wysiano na agar LB (Lennox, 1955, Virology 1:190) z dodatkiem 50 μg/ml zeocyny. Preparaty plazmidowe rekombinowanych klonów otrzymano przy użyciu Biorobot 9600 (produkt nr 900200, Qiagen, Hilden, Niemcy). Sekwencjonowanie przeprowadzono metodą przerywania łańcucha przy użyciu dideoksynukleotydów metodą Sanger i in., (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) z modyfikacjami Zimmermann i in., (1990, Nucl. Acids Res. 18:1067). Zastosowano zestaw „RR dRodamin Terminator Cycle Seguencing Kit” z PE Applied Biosystems (nr produktu 403044, Weitrstadt, Niemcy). Elektroforetyczny rozdział i analizę reakcji sekwencjonowania przeprowadzono przy użyciu żelu „Rotiophorese NF Acrylamid/bisacrylamid” (29:1) (kod produktu A124.1, Roth, Karlsruhe, Niemcy) przy użyciu urządzenia do sekwencjonowania ABI Prism 377 z PE Applied Biosystem (Weiterstadt, Niemcy).

Otrzymane sekwencje opracowano przy użyciu pakietu oprogramowania Staden (1986, Nucl. Acids Res. 14:217-231) wersja 97-0. Pojedyncze sekwencje pochodzące pZero-01 łączy się do postaci ciągłego kontigu. Komputerowa analiza regionów kodujących została przeprowadzona programem XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231). Dalsze analizy przeprowadzono programem poszukującym BLAST (Altshul i in., 1997, Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402) na nie redundancyjnej bazie danych National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).

Otrzymaną sekwencję nukleotydową przestawiono na Id. Sekw. nr 4. Analiza sekwencji wykazała otwartą ramkę odczytu wielkości 1737 par zasad, które można określić jako gen poxB. Gen poxB koduje białko wielkości 579 aminokwasów, którego sekwencję nukleotydową pokazano jako Id. Sekw. nr 5.

P r z y k ł a d 10: Wytwarzanie wektora integracyjnego do mutagenezy integracyjnej genu poxB

Chromosomalny DNA izolowano ze szczepu ATCC 13032 metodą Eikmanns i in., (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)). Na podstawie znanej z Przykładu 8 sekwencji genu poxB z C. glutamicum wybrano następujące oligonukleotydy do PCR:

poxBint1: 5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3' poxBint2: 5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'

Startery syntetyzowano w firmie MWG Biotech (Ebersberg, Niemcy) i przeprowadzono standardową reakcję PCR metodą Innis i in., (PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990 Academic Press) przy użyciu polimerazy Pwo z Boehringer. Przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy wyizolowano fragment wielkości około 0,9 kb, zawierający wewnętrzny fragment genu poxB, przedstawiony jako Id. Sekw. nr 6.

Amplifikowany fragment DNA poddano ligacji do wektora zestawem TOPO TA Cloning Kit firmy Invitrogen Corporation (Carlsbad, USA, nr kat. K4500-01) do wektora pCR2.1-TOPO (Mead i in., (1991) Bio/Technology, 9: 657-663)). Następnie elektroporowano mieszaniną ligacyjną E. coli szczep DH5a (Hanahan, w: DNA cloning: A practical approach, tom I, IRL-Press, Oxford, Washington, USA, 1985). Selekcję komórek niosących plazmid przeprowadzono przez wysianie mieszaniny na agarze LB (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989)) zawierającym 25 mg/l kanamycyny. Plazmidowy DNA izolowano z transformantów przy użyciu zestawu QIAprep Spin Miniprep Kit firmy Qiagen i sprawdzono przez trawienie restrykcyjne EcoRI i elektroforezę na żelu agarozowym (0,8%). Plazmid określono jako pCR2.1poxBint i pokazano na Fig. 5.

Plazmid pCR2.1poxBint zdeponowano jako szczep Escherichia coli DH5a/pCR2.1poxBint w DSMZ (Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen, Brunszwik, Niemcy) jako DSM 13114 zgodnie z Traktatem Budapesztańskim.

P r z y k ł a d 11: Mutageneza integracyjna genu poxB w szczepie wytwarzającym lizynę DSM

5715

Wektor określony w Przykładzie 10 jako pCR2.1poxBint wprowadzono przez elektroporację do Corynebacterium glutamicum DSM 5715 metodą Tauch i in., (FEMS Microbiol. Lett. 123: 343-347 (1994)). Szczep DSM 5715 jest producentem lizyny opornym na AEC. Wektor pCR2.1poxBint nie może samodzielnie replikować w DSM 5715 i jest jedynie zatrzymywany w komórkach gdy wintegruje do chromosomu DSM 5715. Selekcję klonów z wintegrowanym do chromosomu pCR2.1poxBint przeprowadzono przez wysianie mieszaniny elektroporacyjnej na agar LB (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.) z dodatkiem 15 mg/ml kanamycyny. W celu potwierdzenia integracji, fragment poxBint wyznakowano zestawem do hybrydyzacji Dig z Boehringer i hybrydyzowano metodą opisaną w „DIG System Users Guide for Filter Hybrydisation” Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Niemcy, 1993) przy użyciu tego zestawu. Chromosomalny DNA

PL 205 611 B1 potencjalnych integrantów izolowano metodą Eikmanns i in. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) i cięto enzymami restrykcyjnymi Sall, SacI i Hindlll. Powstałe fragmenty rozdzielono przez elektroforezę na żelu agarozowym i hybrydyzowano przy użyciu zestawu DIG Boehringer w 68°C. Plazmid pCR2.1poxBint z Przykładu 9 wprowadzono do chromosomu DSM 5715 w regionie genu poxB. Szczep określono jako DSM5715::pCR2.1poxBint.

P r z y k ł a d 12: Wpływ nadekspresji genu zwf z jednoczesna eliminacją genu poxB na wytwarzanie lizyny

12.1 Wytwarzanie szczepu DSM5715::pCR2.1poxBint/pECT18mob2zwf.

Szczep DSM5715::pCR2.1poxBint transformowano plazmidem pEC-T18mob2zwf przy zastosowaniu metody elektroporacji opisanej w Liebl i in., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)). Selekcję transformantów prowadzono na agarze LBHIS zawierającym 18,5 g/l bulionu z wyciągiem z mózgu i serca, 0,5 M sorbitolu, 5 g/l Bacto-tryptonu, 2,5 g/l ekstraktu Bacto-yeast, 5 g/l NaCl i 18 g/l Bacto-agaru, który był uzupełniony 5 mg/l tetracykliny i 25 mg/l kanamycyny. Inkubację prowadzono przez 2 dni w 33°C.

Plazmidowy DNA izolowano w każdym przypadku z transformanta przy użyciu konwencjonalnych metod (Peters-Wendisch i wsp., 1998, Microbiology 144, 915-927), trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Xbal i KpnI, plazmid sprawdzano przez elektroforezę w żelu agarozowym. Otrzymany w ten sposób szczep nazwano DSM5715:pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf.

12.2 Wytwarzanie L-lizyny

Szczep C. glutamicum DSM5715::pCR2.1poxBint/pECT18mobzwf otrzymany w Przykładzie 12.1 hodowano w pożywce odżywczej odpowiedniej do wytwarzania lizyny i określano zawartość lizyny w supernatancie hodowli.

W tym celu, szczep inkubowano najpierw na płytce agarowej z odpowiednim antybiotykiem (agar mózgowo-sercowy z tetracykliną (5 mg/l) i kanamycyną (25 mg/l)) przez 24 godziny w 33°C. Porównywane szczepy były uzupełniane zgodnie z ich opornością na antybiotyki. Wychodząc z tej hodowli na płytce agarowej, zaszczepiano hodowlę wstępną (10 ml pożywki w 100 ml stożkowej kolbie). Pełną pożywkę Cglll zastosowano jako pożywkę do hodowli wstępnej.

Pożywka CgIII

NaCl 2,5 g/l

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto-Yeast ekstrakt 10 g/l

Glukoza (autoklawowana osobno) 2% (wag./obj.) pH doprowadzono do 7,4

Do tej pożywki dodawano tetracyklinę (5 mg/l) i kanamycynę (25 mg/l)). Hodowlę wstępną inkubowano przez 16 godzin w 33°C przy 240 rpm na wytrząsarce. Hodowlą tą zaszczepiano hodowlę główną tak, aby wyjściowe OD (660 nm) hodowli głównej wynosiło 0,1. Do hodowli głównej stosowano pożywkę MM.

Pożywka MM

CSL (Corn Steep Liquor - syrop kukurydziany) 5 g/l

MOPS (kwas morfolinopropanosulfonowy) 20 g/l

Glukoza (autoklawowana osobno) 58 g/l (NH4)2SO4 25 g/l

KH2PO4 0,1 g/l

MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l

CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l

FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l

MnSO4 * H2O 5,0 mg/l

Biotyna (sterylizowana przez filtrację) 0,3 mg/l

Tiamina * HCl (sterylizowana przez filtrację) 0,2 mg/l

L-Leucyna (sterylizowana przez filtrację) 0,1 g/l

CaCO3 25 g/l

CSL, MOPS i roztwór soli doprowadzano do pH 7 roztworem wody amoniakalnej i autoklawowano. Następnie dodawano sterylne substraty i roztwory witamin jak również CaCO3 autoklawowany w postaci suchej. Hodowlę prowadzono w objętości 10 ml w 100 ml kolbie stożkowej z przegrodami. Dodawano tetracyklinę (5 mg/l) i kanamycynę (25 mg/l). Hodowlę prowadzono w 33°C i 80% wilgotności atmosfery.

PL 205 611 B1

Po 72 godzinach, określano OD przy długości fali 660 nm przy użyciu Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). Ilość wytworzonej lizyny analizowano przy użyciu analizatora aminokwasów z Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) przez chromatografię jonowymienną i uzyskanie pochodnej po kolumnie z wykrywaniem ninhydryną. Wyniki doświadczenia są przedstawione w Tabeli 4.

T a b e l a 4

Szczep	OD	L-lizyna HCI g/l
DSM5715	10,8	16,0
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	8,3	17,1
DSM5715::pCR2.1poxBint	7,1	16,7
DSM5715:: pCR2.1 poxBint/pEC-T 18mob2zwf	7,8	17,7

PL 205 611 B1

WYKAZ SEKWENCJI <110> DegussaAG <120> Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów przez wzmocnienie genu zwf <130> 990239BT <140> PCT/EPOO/06303 <141> 2000-03-20 <160> 11 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 2811 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221 > CDS <222> (373)..(2022) <223> pgi <400> 1 aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat 60 taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc 120 aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa 180 gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg 240 acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac 300 cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa 360 gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac 411 Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp 1 5 10 att tcg acc acc cag gtt tgg caa gac ctg acc gat cat tac tca aac 459 Ile Ser Thr Thr Gin Val Trp Gin Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn

20 25 ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc 507 Phe Gin Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala 30 35 40 45 ‘ gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac ctg tcg aag 555 Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys

55 60

PL 205 611 B1 aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca ctg acc gaa 603 Asn Leu Leu Asp Asp Afa Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Lau Thr Glu

70 75 gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc ggt gaa cac 651 Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His

85 90 ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc gcg ctg cgc ctt 699 Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu

100 105 cct gcc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt gct gct gat 747 Pro Ala Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gin Asp Val Ala Ala Asp 110 115 120 125 gtc cac gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act gcg ctg cgc 795 Val His Glu Val Leu Giy Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg

130 135 140 tca ggc aac tgg ttg gga cac acc ggc cac acg atc aag aag atc gtc 843 Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val

145 150 155 aac att ggt atc ggt ggc tct gac ctc gga cca gcc atg gct acg aag 891 Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys

160 165 170 gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt atc tca gca gaa ttc gtc tcc 939 Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser

175 180 185 aac gtc gac cca gca gac ctc gtt tct gtg ttg gaa gac ctc gat gca 987 Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala 190 195 200 205 gaa tcc aca ttg ttc gtg atc gct tcg aaa act ttc acc acc cag gag 1035 Glu Ser Thr Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gin Glu

210 215 220 acg ctg tcc aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta gag aag ctc 1083 Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu

225 230 235 ggt gaa gag gct gtc gcg aag cac ttc gtc gca gtg tcc acc aat gct 1131 Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala

240 245 250 gaa aag gtc gca gag ttc ggt atc gac acg gac aac atg ttc ggc ttc 1179 Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe

255 260 265 tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tcc gtg gac tcc gca gtt ggt ctt 1227 Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu 270 275 280 285

PL 205 611 B1 tcc ctc atg gca gtg atc ggc cct cgc gac ttc atg cgt ttc ctc ggt 1275 Ser Leu Met Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly

290 295 300 gga ttc cac gcg atg gat gaa cac ttc cgc acc acc aag ttc gaa gag 1323 Gly Phe His Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu

305 310 315 aac gtt cca atc ttg atg gct ctg ctc ggt gtc tgg tac tcc gat ttc 1371 Asn Val Pro Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe

320 325 330 tat ggt gca gaa acc cac gct gtc eta cct tat tcc gag gat ctc age 1419 Tyr Gly Ala Glu Thr His Ala Vai Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser

335 340 345 cgt ttt gct gct tac ctc cag cag ctg acc atg gag acc aat ggc aag 1467 Arg Phe Ala Ala Tyr Leu Gin Gin Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys 350 355 360 365 tea gtc cac cgc gac ggc tcc cct gtt tcc act ggc act ggc gaa att 1515 Ser Val His Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile

370 375 380 tac tgg ggt gag cct ggc aca aat ggc cag cac gct ttc ttc cag ctg 1563 Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gin His Ala Phe Phe Gin Leu

385 390 395 atc cac cag ggc act cgc ctt gtt cca gct gat ttc att ggt ttc gct 1611 Ile His Gin Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala

400 405 410 cgt cca aag cag gat ctt cct gee ggt gag cgc acc atg cat gac ctt 1659 Arg Pro Lys Gin Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu

415 420 425 ttg atg age aac ttc ttc gca cag acc aag gtt ttg gct ttc ggt aag 1707 Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gin Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys 430 435 440 445 aac gct gaa gag atc gct gcg gaa ggt gtc gca cct gag ctg gtc aac 1755 Asn Ala Glu Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn

450 455 460 cac aag gtc gtg cca ggt aat cgc cca acc acc acc att ttg gcg gag 1803 His Lys Val Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu

465 470 475 gaa ctt acc cct tet att ctc ggt gcg ttg atc gct ttg tac gaa cac 1851 Glu Leu Thr Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His

480 485 490 acc gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gac atc aac tcc ttc gac caa 1899 Thr Val Met Va! Gin G!y Vai Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gin

495 500 505

PL 205 611 B1 tgg ggi gtt 9^aa ctg 99° ^{aaa ca}s ^cag gca ^aat g^ac etc gct ccg 9^{ct 1947} Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gin Gin Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala 510 515 520 525 gtc tct ggt gaa gag gat gtt gac tcg gga gat tct tcc act gat tca 1995 Val Ser Gly Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser

530 535 540 ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt 2042 Leu Ile Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg

545 550 caggggcgtg aagaatcctc gcctcatagc actggccgct atcatcctga cctcgttcaa 2102 tctgcgaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg atgatttagg 2162 ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt tcgcggttgc 2222 tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tgatgtttgc 2282 catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgctgttgat 2342 ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc ttccgattgc 2402 tgttagggag tattttccgc gtcacgtcgg tggaatgtcg acaacttatc tggtgtcgtt 2462 ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgccgtgccg atttctcagt gggctacaca 2522 tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggttggttgc 2582 ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cggcgccgtc 2642 gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg gggctcgggt tgatgtttgg 2702 gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg taggtgatcc 2762 aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc 2811 <210> 2 <211> 550 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2

Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp Ile Ser Thr 15 10 15

Thr Gin Val Trp Gin Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gin Ala 20 25 30

Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr

PL 205 611 B1

40 45

Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys Asn Leu Leu 50 55 60

Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly 65 70 75 80

Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn 85 90 95

Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu 100 105 110

Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gin Asp Val Ala Ala Asp Val His Glu 115 120 125

Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn 130 135 140

Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val Asn Ile Gly 145 150 155 160

Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg 165 170 175

Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp 180 185 190

Pro Ala Asp Leu Vai Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Ser Thr 195 200 205

Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gin Glu Thr Leu Ser 210 215 220

Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu 225 230 235 240

Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val 245 250 255

PL 205 611 B1

Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp 260 265 270

Val Gly Gly Arg Tyr Ser Va! Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met 275 280 285

Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His 290 295 300

Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu Asn Val Pro 305 310 315 320

Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala 325 330 335

Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala 340 345 350

Ala Tyr Leu Gin Gin Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His 355 360 365

Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile Tyr Trp Gly 370 375 380

Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gin His Ala Phe Phe Gin Leu Ile His Gin 385 390 395 400

Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala Arg Pro Lys 405 410 415

Gin Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser 420 425 430

Asn Phe Phe Ala Gin Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu 435 440 445

Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val 450 455 460

Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu Glu Leu Thr 465 470 475 480

PL 205 611 B1

Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Giu His Thr Val Met 485 490 495

Vai Gin Gly Val Ile Trp Asp ile Asn Ser Phe Asp Gin Trp Gly Val 500 505 510

Glu Leu Gly Lys Gin Gin Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly 515 520 525

Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu Ile Lys 530 535 540

Trp Tyr Arg Ala Asn Arg 545 550 <210> 3 <211> 462 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc 60 gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac 120 cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt 180 cctgccggtg agcgcaccat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag 240 gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg 300 gtcaaccaca aggtcgtgcc aggiaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaactt 360 accccticta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acaccgtgat ggttcagggc 420 gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa 462 <210> 4 <211> 2160 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221 > CDS <222> (327)..(2063) <223> poxB <400> 4

PL 205 611 B1 ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60 cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt 120 ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt 180 gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg 240 aagogtggca acaactggaa tttaagagca caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac 300 aatagccata acgttgagga gttcag atg gca cac agc tac gca gaa caa tta 353 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gin Leu 1 5 att gac act ttg gaa get caa ggt gtg aag ega att tat ggt ttg gtg 401 Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gin Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Vai 10 15 20 25 ggt gac agc ctt aat ccg atc gtg gat get gtc ege caa tea gat att 449 Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile Val Asp Ala Val Arg Gin Ser Asp Ile

35 40 gag tgg gtg cac gtt ega aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gee ggt 497 Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly

50 55 gcg gaa teg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt get get tet tgt 545 Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys

65 70 ggt cct gga aac aca cac ctg att cag ggt ctt tat gat teg cat ega 593 Gly Pro Gly Asn Thr His Leu Ile Gin Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg

80 85 aat ggt gcg aag gtg ttg gee atc get agc cat att ccg agt gee cag 641 Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala Ile Ala Ser His ile Pro Ser Ala Gin 90 95 1 00 105 att ggt teg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag 689 He Gly Ser Thr Phe Phe Gin Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys

110 115 120 gaa tgc tet ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa 737 Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gin Gly Glu

125 130 135 ege att ttg cat cac gcg att cag tcc acc atg gcg ggt aaa ggt gtg 785 Arg Ile Leu His His Ala Ile Gin Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val

140 145 150 teg gtg gta gtg att cct ggt gat atc get aag gaa gac gca ggt gac 833 Ser Val Val Val Ile Pro Gly Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp

155 160 165 ggt act tat tcc aat tcc act att tet tet ggc act cct gtg gtg ttc 881

PL 205 611 B1

Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe 170 175 180 185 cog gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct 929 Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala

190 195 200 aag tct gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg 977 Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala

205 210 215 cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg 1025 Gin Va! Leu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala

220 225 230 ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc 1073 Leu Gly Gly Lys Gin Tyr Ile Gin His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly

235 240 245 atg tct ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tcc aat gag 1121 Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Giy Ala Cys Vai Asp Ala Ser Asn Glu 250 255 260 265 gcg gat ctg ctg att eta ttg ggt acg gat ttc cct tat tct gat ttc 1169 Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe

270 275 280 ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att 1217 Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gin Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile

285 290 295 .

ggt ega cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca 1265 Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala

300 305 310 aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc 1313 Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser

315 ' 320 325 ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg age tcg gtg 1361

Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val 330 335 340 345 gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct 1409 Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro

350 355 360 gaa tac gtt gcc tct att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg 1457 Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val

365 370 375 ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc 1505 Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile

380 385 390

PL 205 611 B1 gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc 1553 Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly

395 400 405 acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat 1601

Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gin Ser Vai Asp 410 415 420 425 ega aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg 1649 Arg Asn Arg Gin Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met

430 435 440 ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag 1697 Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gin Leu Pro Leu Lys

445 450 455 gct gtg gtg ttt aac aac agt tet ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg 1745 Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met

460 465 470 ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat 1793

Leu Val Glu Gly Gin Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn

475 480 485 ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa teg gta cgc atc acc 1841 Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr 490 495 500 505 gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag eta gct gag gca ttg gca tat cct 1889 Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gin Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro

510 515 520 gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg teg atc 1937 Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile

525 530 535 cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc age aag gcg gee 1985 Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gin Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala

540 545 550 acc ega acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gee 2033 Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Va! Gly Ala Met ile Asp Leu Ala

555 560 565 cgt teg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct 2083 Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro 570 575 gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143 gcccatgaga ttgccct 2160 <210> 5 <211> 579

PL 205 611 B1 <212> PRT <213> Corynebacterium głutamicum <400> 5

Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gin Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gin 1 5 10 15

Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile 20 25 30

Val Asp Ala Val Arg Gin Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn 35 40 45

Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly 50 55 60

Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu 65 70 75 80

Ile Gin Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala 85 90 95

Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gin Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gin 100 105 110

Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu 115 120 125

Met Val Asn Gly Gly Glu Gin Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile 130 135 140

G,n Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Va! Ser Val Val Val Ile Pro Gly 145 150 155 160

Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr 165 170 175

Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala 180 185 190 ·

Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys 195 200 205

PL 205 611 B1

Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gin Val Leu Glu Leu Ala Glu 210 215 220

Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gin Tyr Ile 225 230 235 240

Gin His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr 245 250 255

Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu 260 265 270

Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala 275 280 285

Gin Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys 290 295 300

Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Aia Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro 305 310 315 320

His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys 325 330 335

Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn 340 345 350

Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu 355 360 365

Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met 370 375 380

Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg 385 390 395 400

Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro 405 410 415

His Ala Ile Gly Ala Gin Ser Val Asp Arg Asn Arg Gin Vai Ile Ala 420 425 430

PL 205 611 B1

Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr 435 440 445

Val Lys Leu His Gin Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser 450 455 460

Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gin Pro Glu 465 470 475 480

Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala 485 490 495

Ata Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu 500 505 510

Gin Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile 515 520 525

Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu 530 535 540

Gin Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly 545 550 555 560

Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile 565 570 575

Pro Thr Pro <210> 6 <211> 875 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc 60 accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac 120 gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg 180 gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg 240

PL 205 611 B1 ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt 300 aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt 360 gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg 420 gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac 480 gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg 540 gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca 600 gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta 660 gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct 720 attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat 780 gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc 840 cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc 875 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Brevibacterium flavum MJ-223 <400> 7

Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu 15 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8

Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 9

Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 15 10 15

PL 205 611 B1 <210> 10 <211> 20 <212> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter zwf-forward <400> 10 tcgacgcggt tctggagcag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> zwf-reverse <400> 11 ctaaattatg gcctgcgcca g 21

Claims (16)

1. Wyizolowany gen z Corynebacterium glutamicum (gen zwf) uzyskany przez stosowanie PCR z C. glutamicum ATCC13032 z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych zwf-forward (Id. Sekw. Nr: 10):

5'-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3' zwf-reverse (Id. Sekw. Nr: 11):

5'-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3' kodujący polipeptyd o aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu, przy czym polipeptyd na N--końcu zawiera sekwencję aminokwasową (Id. Sekw. Nr: 9): Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp.

2. Rekombinowana bakteria coryneform wytwarzająca L-lizynę lub L-treoninę, znamienna tym, że jest transformowana genem określonym w zastrz. 1, kodującym polipeptyd o aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu i zawierający na N-końcu sekwencję aminokwasową (Id. Sekw. Nr: 9): Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp.

3. Bakteria coryneform według zastrz. 2, znamienna tym, że jest wzmacniany przez zwiększenie liczby jego kopii.

4. Bakteria coryneform według zastrz. 2, znamienna tym, że gen jest podłączony do promotora.

5. Sposób wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny przez fermentację bakterii z grupy coryneform, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) fermentację bakterii wytwarzających L-aminokwas, w których gen zwf kodujący dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu określony w zastrz. 1 jest wzmocniony,

b) zatężanie L-aminokwasu w pożywce lub w komórkach bakterii oraz

c) izolowanie wytworzonego L-aminokwasu.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się bakterie coryneform, które wytwarzają L-treoninę lub L-lizynę.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się bakterię z rodzaju Crynebacterium, która wytwarza L-lizynę.

PL 205 611 B1

8. Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-lizyny według zastrz. 5, znamienny tym, że w bakteriach coryneform jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu dapA kodującego syntazę dihydrodipikolinanową,

b) genu lysC koduj ącego kinazę asparginianową odporną na sprzężenie zwrotne,

c) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,

d) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową ,

e) genu tkt kodującego transketolazę,

f) genu gnd kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,

g) genu lysE zwią zanego z wydalaniem lizyny,

h) genu zwanego zwa1 zdeponowanego pod numerem DSM 13115,

i) genu eno kodują cego enolazę , ulega lub ulegają równocześ nie wzmocnieniu.

9. Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-lizyny wedł ug zastrz. 5, znamienny tym, ż e w bakteriach coryneform jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu dapA kodującego syntazę dihydrodipikolinanową,

b) genu lysC koduj ącego kinazę asparginianową odporną na sprzężenie zwrotne,

c) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,

d) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową ,

e) genu tkt kodującego transketolazę,

f) genu gnd kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,

g) genu lysE zwią zanego z wydalaniem lizyny,

h) genu nazwanego zwa1 zdeponowanego pod numerem DSM 13115,

i) genu eno kodują cego enolazę , ulega lub ulegają równocześnie nadekspresji.

10. Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-treoniny według zastrz. 5, znamienny tym, że w bakteriach coryneform jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu hom kodującego dehydrogenazę homoserynową albo allel hom^dr kodujący dehydrogenazę homoserynową „oporną na sprzężenie zwrotne”,

b) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,

c) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,

d) genu mqo kodującego oksydoreduktazę jabłczanowo:chinonową,

e) genu tkt kodującego transketolazę,

f) genu gnd kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,

g) genu thrE związanego z wydalaniem treoniny,

h) genu zwanego zwa1 zdeponowanego pod numerem DSM 13115,

i) genu eno kodującego enolazę, ulega lub ulegają równocześnie wzmocnieniu.

11. Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-treoniny według zastrz. 5, znamienny tym, że w bakteriach coryneform jeden lub wię cej genów wybranych z grupy skł adają cej się z:

a) genu hom kodującego dehydrogenazę homoserynową albo allel hom^dr kodujący dehydrogenazę homoserynową „oporną na sprzężenie zwrotne”,

b) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,

c) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,

d) genu mqo kodującego oksydoreduktazę jabłaczanowo:chinonową,

e) genu tkt kodującego transketolazę,

f) genu gnd kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,

g) genu thrE związanego z wydalaniem treoniny,

h) genu zwanego zwa1 zdeponowanego pod numerem DSM 13115,

i) genu eno kodującego enolazę, ulega lub ulegają równocześnie nadekspresji.

12. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w celu wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny fermentowane są bakterie, których jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:

a) genu pck kodującego karboksykinazę fosfoenolopirogronianową,

b) genu pgi kodującego izomerazę glukozo-6-fosforanową,

c) genu poxB kodującego oksydazę pirogronianową, lub

PL 205 611 B1

d) genu zwanego zwa2 zdeponowanego pod numerem DSM 13113,jest lub są jednocześnie osłabione.

13. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w celu osiągnięcia wzmocnienia, zwiększona jest liczba kopii genu zwf określonego w zastrz. 1 przez transfomację wektorami plazmidowymi niosącymi ten gen.

14. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w celu osiągnięcia wzmocnienia dodatkowych genów lub sekwencji nukleotydowych, zwiększona jest liczba ich kopii przez transformacje bakterii wektorami plazmidowymi, które niosą te geny lub sekwencje nukleotydowe.

15. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że amplifikuje się allele genu zwf określonego w zastrz. 1, które są wynikiem degeneracji kodu genetycznego.

16. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że amplifikuje się allele genu zwf określonego w zastrz. 1, które są wynikiem neutralnej mutacji sensownej.