JPH09224661A

JPH09224661A - グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH09224661A
Application number: JP8036345A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Hatakeyama; 和久畠山; Kouichirou Kuwabara; 孔一郎桑原; Miki Kobayashi; 幹小林; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1996-02-23
Publication date: 1997-09-02

Abstract

(57)【要約】【課題】コリネ型細菌由来のグルコ−ス−６−リン酸
デヒドロゲナ−ゼをコ−ドするＤＮＡを提供する。【解決手段】公知の配列を基に設計したプライマーＤ
ＮＡを用いて、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３のＤＮＡから上記酵素をコ−ドするＤＮＡの部分断
片を単離し、プラ−クハイブリダイゼ−ション、インバ
−スＰＣＲ反応等の手法を用いて、該酵素をコ−ドする
ＤＮＡを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするＤＮＡ
に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ［ＥＣ１．１．１．４９］は、ペントースリン酸回路
の酵素であり、グルコース−６−リン酸とＮＡＤＰ＋と
からホスホグルコノ−δ−ラクトンとＮＡＤＰＨとを生
成する不可逆反応の触媒である。グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡについては、
原核生物ではエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）由来の遺伝子［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，Ｖｏｌ．１７３，ｐ．９６８（１９９
１）］、エルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ
ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来の遺伝子［Ｇｅｎ
ｅ，Ｖｏｌ．１０１，ｐ．５１（１９９１）］、ロ
イコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓ
ｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来の遺伝子
［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６６，
ｐ．１３０２８（１９９１）］等が、単離され、その
塩基配列が決定されている。

【０００３】しかしながら、アミノ酸合成等、産業上広
く用いられているコリネ型細菌については、酵素タンパ
クおよびその塩基配列については報告されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】一般に、由来が異なる
と、酵素遺伝子は宿主において発現しないまたは発現し
にくいことから、コリネ型細菌内で発現可能なコリネ型
細菌由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼお
よびそれをコードするＤＮＡの単離が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組み換えの
手法を駆使することにより、コリネ型細菌からグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードす
るＤＮＡが単離可能であることを見い出し、本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明の要旨は、配列表の
配列番号１記載のアミノ酸配列で示されるグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするＤ
ＮＡに存する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼ及びそれをコードするＤＮＡ（以下、
ｚｗｆ遺伝子と略記する）は、コリネ型細菌の染色体Ｄ
ＮＡ、具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２
３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）株から以下に述べる
方法で単離、決定することができる。

【０００７】まず、上記コリネ型細菌を常法［例えば、
特開昭５１−１３０５９２号公報参照］に従い培養し、
培養物から菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出
する。染色体ＤＮＡは、例えば、特開平５−１５３７８
号公報の実施例１（Ａ）に記載の方法等により菌体から
容易に抽出することができる。エシエリヒア・コリ等の
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの一次構造の
相同性の高い部分から逆翻訳したオリゴデオキシリボヌ
クレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を行い、ｚｗｆ遺伝子の部分断片を得Ｒこと
ができる。

【０００８】該断片を鋳型として、染色体ＤＮＡ制限酵
素分解物に対してサザンハイブリダイゼーションを行
い、少なくともｚｗｆ断片の一部を含む、染色体ＤＮＡ
制限酵素断片の大きさを決定する。ＰＣＲで得られたｚ
ｗｆ遺伝子の部分断片を鋳型として、遺伝子ライブラリ
ーλＦＩＸＩＩからプラークハイブリダイゼーション
で、該断片を含むλファージを単離した。これをクロー
ニングする。

【０００９】この染色体ＤＮＡ断片を適当な制限酵素を
用いて切り出し、得られたＤＮＡ断片を適当なクローニ
ングベクター、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へサブ
クローニングし、エシエリヒア・コリＪＭ１０９株（宝
酒造製）を形質転換する。この形質転換株を適当な抗生
物質選択下で培養し、培養物から菌体を回収し、菌体か
ら常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを
抽出する。このプラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配
列を決定することにより、本発明のｚｗｆ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を取得することができる。

【００１０】このＤＮＡ断片の塩基配列は、ジデオキシ
ヌクレオチド酵素法［ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法；Ｓａｎｇｅｒ，Ｆｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３，
（１９７７）］により決定することができる。このよう
にして決定した上記大きさ約２ｋｂのＤＮＡ断片中の配
列を後記配列表の配列番号１に示す。この配列中に存在
するオープンリーディングフレームから、本発明のグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１記
載のアミノ酸配列中１から４８４で示されるアミノ酸配
列からなり、またそれをコードするＤＮＡは、例えば、
配列番号１記載の塩基配列中の６２９番目から２０８３
番目までの塩基配列で示されるものである。

【００１１】本発明におけるｚｗｆ遺伝子は、天然の細
菌、例えば、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡから分離され
たもののみならず、本明細書記載の塩基配列を元に通常
用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製シス
テム−１プラス（Ｓｙｓｔｅｍ−１Ｐｌｕｓ）を用い
て合成されたものであってもよい。また、前記の如くコ
リネ型細菌の染色体から取得される本発明のＤＮＡ断片
は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコード
する機能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の
一部の塩基が他の塩基と置換されていても、削除されて
いてもよく、新たに塩基が挿入されていてもよく、ある
いは塩基配列の一部が転位されているものであってもよ
く、さらにそれらの塩基配列にハイブリダイズする塩基
配列であってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本
発明のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片に包含されるものであ
る。

【００１２】

【実施例】以下、実施例によりさらに具体的に説明す
る。しかしながら、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
全ＤＮＡの抽出ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）を、半合成培地であるＡ培地［組
成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄
０．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ
₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザ
ミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン
２００μｇ、グルコース２０ｇを蒸留水に溶解して１
リットルとする］１リットル中で対数増殖期後期まで培
養した後に菌体を回収した。

【００１３】得られた菌体をリゾチームを１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する溶液［組成：１０ｍＭＮａＣｌ、
２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。該懸濁液にプロテ
ナーゼＫを１００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、これ
を３７℃で１時間インキュベートした。次に、ドデシル
硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加
し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌させた。得
られた溶菌液に等量のフェノール／クロロホルム溶液を
添加して室温で１０分間穏やかに振盪した後、その全量
を１０〜１２℃で２０分間、５，０００×ｇの遠心分離
に供し、その上清画分を分取した。該上清画分中に酢酸
ナトリウムをその濃度が０．３Ｍとなるように添加し、
次いで２倍量のエタノールを穏やかに添加した。水層と
エタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で搦め取
り、これを７０％エタノールで洗浄して風乾した。得ら
れたＤＮＡは、溶液［組成：１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍｌを
加えて４℃で一晩静置した後、実験に供した。

【００１４】（Ｂ）ｚｗｆ遺伝子の部分断片の採取エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１７
３，ｐ．９６８（１９９１）］、エルウィニア・クリ
サンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍ
ｉ）［Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０１，ｐ．５１（１９９
１）］、および、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２
６６，ｐ．１３０２８（１９９１）］のグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ遺伝子
の塩基配列をもとに推定したアミノ酸配列の相同性部分
の配列をもとに遺伝子クローニング用のＰＣＲプライマ
ーＤＮＡを設計した。

【００１５】ポリメラーゼ連鎖反応の一例を以下に示
す。反応液は以下の組成である。濃度は最終濃度を表
す。［２５ユニット／ｍｌＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５
０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２５ｍ
ＭｄＡＴＰ、０．２５ｍＭｄＣＴＰ、０．２５ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．２５ｍＭｄＴＴＰ、０．５μｇ／ｍ
ｌ染色体ＤＮＡ飽和水溶液、１μＭプライマー１：
AT(ATC)GA(TC)CA(TC)TA(TC)(TC)TIGGIAA(AG)GA（配列番
号１記載のアミノ酸配列１７４〜１８１を元にして設計
した配列：配列番号２）、１μＭプライマー２：GGIA
CICCI(TG)(GC)CCAIC（配列番号１記載のアミノ酸配列３
２４〜３２９を元にして設計した配列：配列番号３）、
として１００μｌの反応混合液を用いる。］ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件は例えば、９４℃で１
分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイクルとする２
５サイクルである。そして上記反応で得られたＤＮＡを
精製した。

【００１６】それぞれ最終濃度が、５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２
０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１ｕｎ
ｉｔ／１０μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｎｇ／１
０μｌｐＧＥＭ−Ｔベクター、１０ｎｇ／１０μｌ
ＰＣＲ産物となるように各成分を添加し、１６℃で
３時間反応させて、ＰＣＲ産物ＤＮＡを結合させた。

【００１７】ついで、常法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，５３，１５９（１９７０）参照］に従って、
得られた溶液を用いてエシエリヒア・コリＪＭ１０９を
形質転換した。得られた形質転換菌を選択培地［組成：
トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５
ｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン５０ｍｇ、イソプロ
ピオチオガラクトシド０．２３８ｇ、Ｘ−ｇａｌ
０．２ｇ、ジメチルホルムアミド２ｍｌを蒸留水に溶解
して１リットルとする］に塗抹し、３７℃で１６時間培
養した。

【００１８】こうして得られたコロニーを青／白カラー
スクリーニングした。選択培地上に生育した菌株を、ア
ンピシリンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含有するＬ培養
液［トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ
５ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする］に植菌
し、これを３７℃で７時間培養した。培養液を４℃で１
０分間、８,０００×ｇの遠心分離にかけて菌体を回収
した。回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法［Ｔ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ
ｉｎｇ，ｐ．９０−９１（１９８２）参照］によりプ
ラスミドを抽出した。

【００１９】次に、得られたプラスミドに挿入された染
色体由来の約４７０ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列をジデ
オキシヌクレオチド酵素法により決定した。具体的に
は、上記培養物より抽出したプラスミドＤＮＡをパーキ
ン・エルマー社製カタリスト８００モレキュラー・バイ
オロジー・ラボステーション（ＣＡＴＡＬＹＳＴ８０
０ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＢｉｏｌｏｇｙＬａｂｏｓ
ｔａｔｉｏｎ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてプ
ロトコールに従い反応させた後、パーキン・エルマー社
製３７３ＡＤＮＡシークエンサーによりプラスミドの
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。

【００２０】決定した塩基配列を翻訳して得られるタン
パク質と、既知のエシエリヒア・コリのグルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼとの相同性の比較により、そ
れがブレビバクテイウム・フラバムＭＪ−２３３のｚｗ
ｆ遺伝子の一部（配列表の配列番号１記載の塩基配列中
１１４８番目から１６１４番目）であることが判明し
た。

【００２１】（Ｃ）ｚｗｆ遺伝子の部分断片を含む染色
体ＤＮＡ制限酵素断片の大きさ決定染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩでそれぞれ分解した。これらをＯ
ｎｃｏｒ社製Ｐｒｏｂｅｔｅｃｈ２を用いてサザン
ハイブリダイゼーション用のナイロンメンブレンフィル
ターを作成した。

【００２２】上記、ＰＣＲで得られたｚｗｆ遺伝子の部
分断片を鋳型に、標識にはアマシャム社製［α−³²Ｐ］
ｄＣＴＰＡＡ０００５を用いて、宝酒造社製Ｒａｍｄ
ｏｍＰｒｉｍｅｒＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇＫｉ
ｔＶｅｒ．２の方法でプローブを標識した。フィルタ
ーを以下の組成の溶液［５×ＳＳＣ溶液、５×デンハル
ト溶液、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、０．１ｍｇ／ｍｌＳＩＧＭＡ社製ＳＡＬＭＯＮ
ＴＥＳＴＥＳＤＮＡＦｏｒＨｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ（１０ｍｇ／ｍｌ）］で６５℃で２時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。なお２０×ＳＳＣ溶液
は、以下の組成［３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸
ナトリウム］、１００×デンハルト溶液は以下の組成
［２％牛血清アルブミン、２％ポリビニルピロリド
ン、２％フィコール］である。

【００２３】上記で調製したプローブを加え、６５℃で
一晩、サザンハイブリダイゼーションを行った。フィル
ターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分
間緩やかに振盪させながら洗浄した。次にフィルターを
１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分間緩や
かに振盪させながら洗浄した。フィルターを風乾した
後、オートラジオグラフィーを行った。読みとりは、富
士写真フィルム社製バイオイメージングアナライザーＢ
ＡＳ−２０００を用いた。

【００２４】この結果、ｚｗｆ遺伝子の部分断片を含む
染色体ＤＮＡ制限酵素断片の大きさは、ＢａｍＨＩ断
片、ＥｃｏＲＩ断片、ＨｉｎｄＩＩＩ断片、ＳａｌＩ断
片が、それぞれ約２ｋｂ、３ｋｂ、８ｋｂ、１０ｋｂで
あった。（Ｄ）ｚｗｆ遺伝子の部分断片を含む染色体ＤＮＡＢ
ａｍＨＩ断片の単離０．２％マルトース、１０ｍＭＭｇＳＯ₄を添加し
たＬＢ培養液に、エシエリヒア・コリＰ２３２９を植菌
し、３７℃で培養した。そして遺伝子ライブラリーλＦ
ＩＸＩＩファージ溶液４００μｌにＰ２３２９培養液を
混合し、３７℃で１５分間培養した。次に４ｍｌのλト
ップアガー（５０℃保温）を加え、λプレートに均一に
なるように撒いて、３７℃で一晩培養した。

【００２５】ニトロセルロースフィルターをλプレート
上に空気が入らないように静かに置いて、予めフィルタ
ーに書いた目印の点をプレートに写した。フィルターを
剥がし、吸着面を上にして、以下の混合溶液に浸した濾
紙上に置き、順次５分間処理した（溶液１：［０．５Ｍ
ＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ］、溶液２：［１Ｍト
リス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．７５ＭＮａＣｌ］、
溶液３：２×ＳＳＣ）。フィルターを乾燥させた後、８
０℃で３０分間加熱してフィルターへＤＮＡを固定化し
た。

【００２６】フィルターを以下の混合溶液［５×ＳＳＰ
Ｅ、１×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、０．１
ｍｇ／ｍｌＳＩＧＭＡ社製ＳＡＬＭＯＮＴＥＳＴＥ
ＳＤＮＡＦｏｒＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１
０ｍｇ／ｍｌ）］にて４２℃、１時間プレハイブリダイ
ゼーションを行った。２０×ＳＳＰＥの組成は、３．６
ＭＮａＣｌ、０．２ＭＮａＨ₂ＰＯ₄、０．０２Ｍ
ＥＤＴＡである。上記（Ｃ）項で調製したプローブを加
え、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行った。

【００２７】フィルターを５×ＳＳＰＥ、１×デンハル
ト溶液、５０％ホルムアミド溶液で４２℃、１５分間
緩やかに振盪させながら洗浄した。次にフィルターを２
×ＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液で
４２℃、１５分間緩やかに振盪させながら洗浄した。フ
ィルターを風乾した後、オートラジオグラフィーを行っ
た。読みとりは、富士写真フィルム社製バイオイメージ
ングアナライザーＢＡＳ−２０００を用いた。

【００２８】目的プラークのソフトアガロースを砕い
て、２００μｌのＳＭ緩衝液に懸濁した。上記溶液１０
μｌを、３７℃で３〜４時間培養したエシエリヒア・コ
リＰ２３２９株３００μｌと混合し、トップアガロース
を加えてλプレートに撒いた。３７℃で一晩培養し、プ
ラークを形成させた。このλプレートに４ｍｌのＳＭ緩
衝液を加え、トップアガロースを掻き取って、４℃で１
時間穏やかに振盪した。トップアガロースを混入させな
いよう、上澄みを新しいチューブに移し、クロロホルム
を数滴加えた。そして５，０００ｒｐｍで５分間遠心
し、上澄みを得た。さらにＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ
（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１５分間保
温した。等量の２０％ポリエチレングリコール（平均
分子量６，０００）−２ＭＮａＣｌを加え、氷上で１
時間放置した後、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間
遠心後、上澄みを完全に除去した。２５０μｌのトリス
−ＥＤＴＡ緩衝液を加えて懸濁し、５μｌの１０％ド
デシル硫酸ナトリウムを加え、６８℃で５分間加熱後、
１０μｌの５ＭＮａＣｌを加え、等量のフェノール／
クロロホルムを加え、よく懸濁した。１２，０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心し、水層を新しいチューブに移した。
イソプロパノール沈殿後、７０％エタノール洗浄・乾
燥させ、５０μｌのトリス−塩酸緩衝液に懸濁した。

【００２９】以上の操作で得られたλＦＩＸＩＩＤＮ
ＡをＢａｍＨＩで切断した。切断物をアガロース電気泳
動して、ｚｗｆ遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡのＢａ
ｍＨＩ断片を分離・精製した。このＢａｍＨＩ断片約２
ｋｂをｐＵＣ１１８でサブクローニングした。サブクロ
ーニングしたＢａｍＨＩ断片約２ｋｂを含むｐＵＣ１１
８をＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩ断片を回収した。

【００３０】（Ｅ）ｚｗｆ遺伝子上流の塩基配列決定（Ｄ）項で得られた大きさ約２ｋｂのＤＮＡ断片溶液を
制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて３７℃で処理してＤＮＡ
断片を部分分解した。また、クローニングベクターｐＵ
Ｃ１１８を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。得られたベ
クターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、こ
の混合液にそれぞれ最終濃度が５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
ＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、および１ｕｎｉｔ
／１０μｌＴ４ＤＮＡリガーゼとなるように各成分を
添加し、ベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを
結合させた。

【００３１】上記と同様に大きさ約２ｋｂのＤＮＡ断片
溶液を制限酵素ＴａｑＩと反応させて部分分解ＤＮＡ断
片を調製した。クローニングベクターｐＵＣ１１８を制
限酵素ＡｃｃＩで切断した後、これを上記と同様にして
部分分解ＤＮＡと結合させた。得られたプラスミド混液
を用い、常法によりエシエリヒア・コリＪＭ１０９株を
形質転換し、前記の選択培地に塗抹した。

【００３２】上記選択培地に生育した菌株を常法に従い
液体培養し、得られた培養物よりプラスミドＤＮＡを抽
出した。抽出したプラスミドＤＮＡを用いて、ベクター
ｐＵＣ１１８に挿入された部分分解ＤＮＡ断片の塩基配
列を決定した。そして、これらの個々の配列の連結は、
パーキン・エルマー社製のシークエンス解析ソフトオ
ートアッセンブラー（Ａｕｔｏａｓｓｅｍｂｌｅｒ）
を用いて行った。

【００３３】この結果、配列表１記載の塩基配列中の１
番目から１９６５番目の塩基配列が判明した。それを翻
訳したタンパク質のアミノ酸一次構造と既知のエシエリ
ヒア・コリのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
のアミノ酸一次構造との相同性の比較により、配列表１
記載の塩基配列中の６２９番目から１９６５番目がブレ
ビバクテイウム・フラバムＭＪ−２３３のグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のオープンリーディ
ングフレームの上流であることが判明した。

【００３４】（Ｆ）ｚｗｆ遺伝子の全塩基配列決定オープンリーディングフレームの下流部分をクローニン
グするために、インバースポリメラーゼ連鎖反応［例え
ば、結城惇、実験医学、Ｖｏｌ．８、Ｎｏ．９（増
刊）、ｐ．４９（１９９０）参照］を行った。まず染色
体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで分解した。このＤＮＡ分解物を
アガロースゲル電気泳動した後、（Ｃ）で得られた結果
を参考にして３ｋｂ前後のＤＮＡ分解物を含むアガロー
スゲルを切り出した。

【００３５】このアガロースゲル中から、ＢＩＯ１０１
社製ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いてＤＮＡ分解物を
抽出した。そして以下の組成［５０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．９）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１ｕｎｉｔ／
１０μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ、１０μｇ／ｍｌ染
色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解物］となるように各成分を
添加し、１６℃で一晩反応させて、ＤＮＡ分解物を自己
結合させた。

【００３６】続いて、プライマー対［CTGAGCTGGAAGATTC
TGG（配列番号１記載の塩基配列の１９４３番目から１
９５９番目：配列番号４）、CGAAAGCTGCATCATCATC（配
列番号１記載の塩基配列の８７５番目から８９３番目の
相補鎖：配列番号５）］を用いて、上記の自己結合染色
体ＤＮＡＥｃｏＲＩ分解物を鋳型に、常法でポリメラ
ーゼ連鎖反応をした。

【００３７】得られたＤＮＡを前記の方法でｐＧＥＭ−
Ｔベクターに結合し、エシエリヒア・コリＪＭ１０９で
サブクローニングし、アルカリ−ＳＤＳ法で抽出した。
そして挿入断片の塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵
素法で決定した結果、配列表１記載の塩基配列中１９６
６番目から２２６０番目の塩基配列であることが明らか
になった。

【００３８】以上の結果、配列表１に示す大きさ約２，
２６０ｂｐのＤＮＡ塩基配列を決定した。決定した塩基
配列中にはオープンリーディングフレームの存在が認め
られた。それを翻訳したタンパク質のアミノ酸一次構造
と既知のエシエリヒア・コリのグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼのアミノ酸一次構造との相同性の比較
により、配列表の配列番号１記載の塩基配列中６２９番
目から２０８３番目ががブレビバクテイウム・フラバム
ＭＪ−２３３のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子であり、該酵素のアミノ酸配列は、配列番号１
記載のアミノ酸配列であることが判明した。

【００３９】

【発明の効果】本発明により提供されるグルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を用いて
コリネ型細菌を育種改良することにより、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ高産生能を有するコリネ型
細菌の取得が可能となる。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２２６０鎖の数：二本鎖配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 GATCCGATGA GGCTTTGGCT CTGCGTGGCA AGGCAGGCGT TGCCAACGCT CAGCGCGCTT 60 ACGCTGTGTA CAAGGAGCTT TTCGACGCCG CCGAGCTGCC TGTAAGGCGC CAACACTCAG 120 CGCCCACTGT GGGCATCCAC CGGCGTGAAG AACCCTGCGT ACGCTGCAAC TCTTTACGTT 180 TCCGAGCTGG CTGGTCCAAA CACCGTCAAC ACCATGCCAG AAGGCACCAT CGACGCTGTT 240 CTGGAACTGG GCAACCTGCA CGGTGACAAC CTGTCCAACT CCGCGGCAGA AGCTGACGCT 300 GTGTTCTCCC AGCTTGAGGC TCTGGGCGTT GACTTGGCAG ATGTCTTCCA GGTCCTGGAG 360 ACCGAGGCCG TGGACAAGTT CGTTGCTTCT TGGAGCGAAC TGCTTGAGTC CATGGAAGCT 420 CGCCTGAAGT AGAATCAGCA CGCTGCATCA GTAACGGCGA CATGAAATCG AATTAGTTCG 480 ATCTTATGTG GCCGTTACAC ATCTTTCATT AAAGAAAGGA TCGTGACGCT TACCATCGTG 540 AGCACAAAAC ACGACCCCCT CCAGCTGGAC AAACCCACTG CGCGACCCGC AGGATAAACG 600 ACTCCCCCGC ATCGCTGGCC CTTCCGGC 628 ATG GTG ATC TTC GGT GTC ACT GGC GAC TTG GCT CGA AAG AAG CTG CTC 676 Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu 1 5 10 15 CCC GCC ATT TAT GAT CTA GCA AAC CGC GGA TTG CTG CCC CCA GGA TTC 724 Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe 20 25 30 TCG TTG GTA GGT TAC GGC CGC CGC GAA TGG TCC AAA GAA GAC TTT GAA 772 Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu 35 40 45 AAA TAC GTA CGC GAT GCC GCA AGT GCT GGT GCT CGT ACG GAA TTC CGT 820 Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg 50 55 60 GAA AAT GTT TGG GAG CGC CTC GCC GAG GGT ATG GAA TTT GTT CGC GGC 868 Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly 65 70 75 80 AAC TTT GAT GAT GAT GCA GCT TTC GAC AAC CTC GCT GCA ACA CTC AAG 916 Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys 85 90 95 CGC ATC GAC AAA ACC CGc GGC ACC GCc GGC AAC TGG GCT TAC TAC CTG 964 Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu 100 105 110 TCC ATT CCA CCA GAT TCC TTC GCA GCG GTC TGC CAC CaG CTG GAG CGT 1012 Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg 115 120 125 TCC GGC ATG GCT GAA TCC ACC GAA GAA GCA TGG CGC CGC GTG ATC ATC 1060 Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile 130 135 140 GAG AAg CCT TTC GGC CAC AAC CTC GAA TCC GCA CAC GAG CTC AAC CAG 1108 Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln 145 150 155 160 CTG GTC AAC GCA GTC TTC CCA GAA TCT TCT GTG TTC CGC ATC GAC CAC 1156 Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His 165 170 175 TAT TTG GGC AAG GAA ACA GTT CAA AAC ATC CTG GCT CTG CGT TTT GCT 1204 Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala 180 185 190 AAC CAG CTG TTT GAG CCA CTG TGG AAC TcC AAC TAC GTT GAC CAC GTC 1252 Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val 195 200 205 CAG ATC ACC ATG GCT GAA GAT ATT GGC TTG GGT GGA CGT GCT GGT TAC 1300 Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr 210 215 220 TAC GAC GGC ATC GGC GCA GcC CGC GAC GTC ATC CAG AAC CAC CTG ATC 1348 Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile 225 230 235 240 CAG CTC TTG GCT CTG GTT GCC ATG GAA GAA CCA ATT TCT TTC GTG CCA 1396 Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro 245 250 255 GCG CAG CTG CAG GCA GAA AAG ATC AAG GTG CTC TCT GCG ACA AAG CCG 1444 Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro 260 265 270 TGC TAC CCA TTG GAT AAA ACC TCC GCT CGT GGT CAG TAC GCT GCC GGT 1492 Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly 275 280 285 TGG CAG GGC TCT GAG TTA GTC AAG GGA CTT CGC GAa GAA GAT GGC TTC 1540 Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe 290 295 300 AAC CCT GAG TCC ACC ACT GAG ACT TTT GCG GCT TGT ACC TTA GAG ATC 1588 Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile 305 310 315 320 ACG TCT CGT CGC TGG GCT GGT GTG CCG TTC TAC CTG CGC ACC GGT AAG 1636 Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys 325 330 335 CGT CTT GGT CGC CGT GTT ACT GAG ATT GCC GTG GTG TTT AAA GAC GCA 1684 Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala 340 345 350 CCA CAC CAG CCT TTC GAC GGC GAC ATG ACT GTA TCC CTT GGC CAA AAC 1732 Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn 355 360 365 GCC ATC GTG ATT CGC GTG CAG CCT GAT GAA GGT GTG CTC ATC CGC TTC 1780 Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe 370 375 380 GGT TCC AAG GTT CCA GGT TCT GCC ATG GAA GTC CGT GAC GTC AAC ATG 1828 Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met 385 390 395 400 GAC TTC TCC TAC TCA GAA TCC TTC ACT GAA GAA TCA CCT GAA GCA TAC 1876 Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr 405 410 415 GAG CGC CTT ATC TTg GAT GCG CTG TTG GAT GAA TCC AGC CTT TTC CCT 1924 Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro 420 425 430 ACC AAC GAG GAA GTG GAA CTG AGC TGG AAG ATT CTG GAT CCA ATT CTT 1972 Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu 435 440 445 GAA GCA TGG GAT GCC GAT GGA GAA CCA GAG GAT TAC CCA GCA GGT ACG 2020 Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr 450 455 460 TGG GGT CCA AAG AGC GCT GAT GAA ATG CTT TCC CGC AAC GGT CAC ACC 2068 Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr 465 470 475 480 TGG CGC AGG CCA TAATTTAGGG GCAAAAAATG ATCTTTGAAC TTCCGGATAC 2120 Trp Arg Arg Pro 484 CACCACCCAG CAAATTTCCA AGACCCTAAC TCGACTGCGT GAATCGGGCA CCCAGGTCAC 2180 CACCGGCCGA GTGCTCACCC TCATCGTGGT CACTGACTCC GAAAGCGATG TCGCTGCAGT 2240 TACCGAGTCC ACCAATGAAG 2260 配列番号：２配列の長さ：鎖の数：１本鎖配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATHGAYCAYT AYYTNGGNAA RGA 23 Nはイノシンを表す。配列番号：３配列の長さ：鎖の数：１本鎖配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GGNACNCCNK SCCANC 16 Nはイノシンを表す。配列番号：４配列の長さ：鎖の数：１本鎖配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CTGAGCTGGA AGATTCTGG 19 配列番号：５配列の長さ：鎖の数：１本鎖配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CGAAAGCTGC ATCATCATC 19

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
で示されるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２】請求項１記載のグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項３】配列表の配列番号１記載の塩基配列中６
２９から２０８３までの塩基配列で示されるグルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。