PL205861B1

PL205861B1 - Sposób uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów zubożonej w nie-sprzężone związki lipofilowe

Info

Publication number: PL205861B1
Application number: PL374684A
Authority: PL
Inventors: Ivan Bán; Klaus-Guenther Gerling; Hans-Joerg Mueller; Stefan Wachsmann
Original assignee: Solvay Pharm Gmbh
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2003-10-08
Publication date: 2010-06-30
Also published as: CN1691951A; TWI284131B; ZA200502494B; EP1553959B1; TW200409779A; WO2004035067A1; AU2003301237B2; JP4778233B2; PL374684A1; PT1553959E; DK1553959T3; HK1083450A1; ATE427752T1; CN100542542C; NO20052286L; NO332770B1; NO20052286D0; AR041121A1; IL167924A; CA2498095A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów, która jest zubożona w nie-sprzężone związki lipofilowe z grupy obejmującej nie-sprzężone flawonoidy, nie-sprzężone izoflawonoidy, nie-sprzężone norizoprenoidy, nie-sprzężone steroidy, zwłaszcza steroidy androstanowe i pregnanowe, oraz porównywalne związki nie-sprzężone.

Estrogeny stosuje się w medycynie do terapii hormonozastępczej. W szczególności mieszaniny estrogenów stosuje się do leczenia i zapobiegania w przypadku zaburzeń okresu przekwitania występujących u kobiet po naturalnej lub sztucznej menopauzie. W tym przypadku naturalne mieszaniny sprzężonych estrogenów występujące w moczu ciężarnych klaczy, określane poniżej jako naturalne mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów, okazały się szczególnie czynne i dobrze tolerowane.

Rozpuszczona zawartość substancji stałych w moczu ciężarnych klaczy (= pregnant mares urine, poniżej w skrócie „PMU) może się naturalnie zmieniać w szerokim zakresie i na ogół wynosi 40-90 g suchej substancji na litr. Obok mocznika i innych substancji zwykle występujących w moczu w skł adzie substancji stał ych PMU wystę pują skł adniki fenolowe w iloś ci okoł o 2-5% wagowych w przeliczeniu na suchą substancj ę . Wś ród tych skł adników fenolowych znajdują się krezole i znany jako HPMF dihydro-3,4-bis-[(3-hydroksyfenylo)-metylo]-2(3H)-furanon. Związki te mogą występować w postaci wolnej lub sprzężonej. W PMU zawarta jest naturalna mieszanina estrogenów, która w dużym stopniu występuje w postaci sprzężonej, np. jako sól sodowa półestru kwasu siarkowego (poniżej w skrócie „sól siarczanowa). Zawartość sprzężonych estrogenów (obliczona jako sól siarczanowa estrogenów) może wynosić 0,1-1% wagowych w przeliczeniu na suchą substancję. Dodatkowo w składzie substancji stałych PMU mogą występować dalsze związki lipofilowe, których ilości mogą się zmieniać w szerokim zakresie i nie są do przewidzenia. Te związki lipofilowe pochodzą głównie z roś lin pobranych jako poż ywienie przez ciężarne klacze i obejmują przede wszystkim róż ne pochodne flawonoidów, izoflawonoidów, norizoprenoidów i związki porównywalne, takie jak na przykład formononetyna, genisteina, daidzeina, biochanina A, ekwol i kumestrol. Te związki lipofilowe pierwotnie pochodzenia roślinnego mogą występować w moczu w postaci sprzężonej albo wolnej (nie sprzężonej). Do tych występujących poza tym w składzie substancji stałych PMU lipofilowych składników zalicza się też nie-sprzężone pochodne steroidowe, tu zwłaszcza steroidy androstanowe i pregnanowe, ale wymienia się także nie-sprzężone pochodne estrogenów.

Ekstrakty zawierające naturalne mieszaniny sprzężonych estrogenów uzyskuje się zazwyczaj metodami ekstrakcji w fazie stałej albo sposobami opartymi na różnych etapach ekstrakcji ciecz-ciecz za pomocą rozpuszczalników organicznych niemieszających się z wodą albo mieszających się tylko w niewielkim stopniu. Na ogół przyjmuje się, ż e uzyskana naturalna mieszanina sprzężonych estrogenów, aby mogła być stosowana jako substancja czynna do celów farmaceutycznych, musi spełniać określone farmaceutyczne wymagania, na przykład musi odpowiadać wymogom USP (United States Pharmacopeia) albo farmakopei europejskiej (Eureopean Pharmacopeia). I tak pod kątem zawartości sprzężonych estrogenów w przeliczeniu na suchą substancję muszą być utrzymane określone wartości graniczne.

W opisach patentowych USA nr 2551205 i nr 2429398 opisano sposób wytwarzania rozpuszczalnego w wodzie preparatu estrogenowego z PMU, w którym najpierw przez adsorpcję na węglu aktywnym albo na innych odpowiednich substancjach adsorpcyjnych, następnie eluowanie rozpuszczalnikiem organicznym mieszającym się z wodą, takim jak np. pirydyna, i wreszcie usuwanie rozpuszczalnika otrzymuje się wodny koncentrat, który zawiera większą część rozpuszczalnych w wodzie składników estrogenowych pierwotnie wprowadzonego PMU. Podczas gdy w opisie patentowym USA nr 2429398 koncentrat oczyszcza się dalej drogą ekstrakcji za pomocą benzenu i/lub eteru, to w opisie patentowym USA nr 2551205 wskazuje się, że koncentrat zakwasza się do wartości pH 2-6, korzystnie 4-5, po czym szybko ekstrahuje się prawie nie mieszającym się z wodą rozpuszczalnikiem organicznym z grupy obejmującej alifatyczne, aromatyczne albo alicykliczne węglowodory (np. heksan, benzen, toluen, cykloheksan) albo chlorowane węglowodory (np. chloroform, dichlorek etylenu, trichloroetylen, czterochlorek węgla, chlorobenzen), w celu oddzielenia niepożądanych substancji, takich jak tłuszcze, oleje, wolne składniki fenolowe i nie-sprzężone steroidy, przez przeprowadzenie do fazy organicznej. Na koniec fazę wodną utrwala się drogą zobojętniania. Opis patentowy USA nr 2551205 zaleca, aby uzyskany ekstrakt oczyszczać dalej za pomocą dalszych etapów ekstrakcji i wytrącania. Łącznie po przeprowadzeniu sposobu opisanego w opisie

PL 205 861 B1 patentowym USA nr 2551205 uzyskuje się tylko wydajność wynoszącą około 80% składników estrogenowych wprowadzonego koncentratu.

W opisie patentowym USA nr 2565115 opisuje się ekstrakcję sprzężonych estrogenów z PMU za pomocą acetonu. O czystości uzyskanej frakcji estrogenowej nie ma żadnej wzmianki.

W opisie patentowym USA nr 2696265 opisano sposób, w którym najpierw estrogeny ekstrahuje się alifatycznym alkoholem albo ketonem, takim jak heksanol, cykloheksanol albo cykloheksanon. Estrogeny przechodzą do fazy organicznej i następnie oczyszcza się je dalej, między innymi w fazie wodnej zawierającej estrogeny nastawia się wartość pH 4 za pomocą kwasu solnego i ekstrahuje się dichlorkiem etylenu.

W opisie patentowym USA nr 2834712 omawia się sposób wytwarzania mieszanin estrogenów o znaczą cej czystoś ci i nieznacznej toksycznoś ci, który polega na wielu poszczególnych etapach ekstrakcji z zastosowaniem różnych rozpuszczalników i przy stosowaniu różnych wartości pH. Stosuje się przy tym duże objętości rozpuszczalników, takich jak heksan i benzen. I tak np. w jednym etapie już wstępnie oczyszczony koncentrat rozpuszcza się w wodzie, za pomocą kwasu solnego nastawia się wartość pH około 5,0 i ekstrahuje się benzenem i następnie eterem w celu oddzielenia składników fenolowych.

W mię dzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 01/27134 opisano porównywalnie prosty sposób ekstrahowania sprzężonych estrogenów z PMU. Po dodaniu soli, takiej jak np. chlorek sodu, PMU ekstrahuje się co najmniej taką samą objętością rozpuszczalnika organicznego, takiego jak np. octan etylu, przy czym sprzężone estrogeny przechodzą do fazy organicznej. Fazę organiczną oddziela się i suszy w celu uzyskania ekstraktu. W zgłoszeniu WO 01/27134 nie ma żadnej wzmianki o czystości uzyskanego ekstraktu sprzężonych estrogenów.

Przy opisanych wyżej i znanych ze stanu techniki sposobach ekstrakcji ciecz-ciecz występuje jednak wiele problemów, takich jak silne tworzenie się piany, powstawanie osadów, tworzenie się emulsji i złe rozdzielanie faz. Na ogół potrzeba wiele etapów ekstrakcji, co prowadzi do strat i tylko częściowego odzyskiwania zawartości estrogenów. Ponadto te sposoby ekstrakcji wymagają dużych objętości rozpuszczalników po części szkodzących zdrowiu. Ponadto w wyżej podanych opisach patentowych nie ma wzmianki o zawartości w otrzymanych produktach nie-sprzężonych składników lipofilowych, takich jak na przykład nie-sprzężone pochodne flawonoidów, izoflawonoidów, norizoprenoidów i porównywalnych związków nie-sprzężonych, albo też nie-sprzężonych steroidów, zwłaszcza steroidów androstanowych i pregnanowych, ani o oddzielaniu takich składników. Te sposoby znane ze stanu techniki nie dostarczają żadnych zadowalających wyników odnośnie wydajności albo czystości otrzymywanych ekstraktów, mierzonych wobec uzyskanej łącznej zawartości hormonów w przeliczeniu na suchą substancję, albo obejmują wiele różnych etapów postępowania i wymagają stosowania dużych objętości organicznych i po części nawet niepożądanych pod względem toksykologicznym rozpuszczalników.

Ponadto ze stanu techniki znane są różne sposoby ekstrakcji w fazie stałej w celu uzyskania naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów zubożonej w dużym stopniu w fenolowe składniki moczu. I tak w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 98/08526 opisano sposób, w którym w ekstrakcji w fazie stałej na semipolarnej, zwłaszcza na niejonowej semipolarnej polimerycznej żywicy adsorpcyjnej można otrzymywać zubożoną w fenolowe składniki moczu, w dużym stopniu wolną od krezolu i HPMF mieszaninę zawierającą praktycznie całkowicie naturalny skład estrogenów PMU. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 98/08525 opisany jest podobny sposób, w którym w ekstrakcji w fazie stałej jako środek adsorpcyjny stosuje się żel krzemionkowy. Również chińskie zgłoszenie patentowe CN 13 08083 omawia porównywalny sposób, w którym stosuje się polarne żywice adsorpcyjne zawierające grupy cyjanowe. Otrzymane ekstrakty nadają się jako materiał wyjściowy do wytwarzania środków farmaceutycznych, które zawierają jako składnik czynny naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów z PMU.

Wymagania stawiane wyrobom farmaceutycznym, na przykład wartości graniczne odnośnie zawartości sprzężonych estrogenów w przeliczeniu na suchą substancję, są zazwyczaj spełniane przez mieszaniny sprzężonych estrogenów uzyskiwane z PMU według sposobu z WO 98/08526 albo sposobu z WO 98/08525. Okazało się jednak, że obok żądanej zawartości sprzężonych estrogenów w uzyskiwanej suchej substancji mogą występować też nie-sprzężone związki lipofilowe. Do nie-sprzężonych związków lipofilowych zalicza się na przykład różne nie-sprzężone pochodne flawonoidów, izoflawonoidów, norizoprenoidów i porównywalne związki nie-sprzężone, takie jak na przykład formononetyna, genisteina, daidzeina, biochanina A, ekwol i kumestrol, lecz także nie-sprzężone steroidy,

PL 205 861 B1 zwłaszcza steroidy androstanowe i pregnanowe, oraz nie-sprzężone estrogeny, przy czym wyliczenia tego nie należy oceniać jako wyczerpujące. Obecność nie-sprzężonych związków lipofilowych w uzyskanej z PMU mieszaninie sprzężonych estrogenów nie daje się standaryzować, natomiast zarówno zawartość jak i skład wolnych i sprzężonych związków lipofilowych zmienia się na przykład w zależności od pożywienia pobranego przez ciężarne klacze.

Co prawda skład naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów nie zmienia się przez dodatkową obecność nie-sprzężonych związków lipofilowych, ale skład sprzężonych końskich estrogenów w odniesieniu do suchej substancji może być zmniejszony. Przez celowe oddzielanie niesprzężonych składników lipofilowych można by uzyskiwać wyższe stężenie substancji czynnych, to jest sprzężonych końskich estrogenów, w otrzymywanym ekstrakcie. Również ze względu na pewność środka leczniczego może się okazać celowe oddzielanie nie-sprzężonych związków lipofilowych, aby zapewnić równomierny skład poszczególnych szarży ekstraktu, ponieważ w ten sposób można eliminować nie-sprzężone składniki lipofilowe, których zawartość i skład w PMU może się zmieniać w zależności od zmieniającego się z porą roku rodzaju pożywienia pobranego przez ciężarne klacze, i w ten sposób wszystkie otrzymywane ekstrakty mogłyby wykazywać porównywalny skład sprzężonych końskich estrogenów w przeliczeniu na suchą substancję. Ponadto oddzielanie nie-sprzężonych związków lipofilowych może być korzystne w celu uzyskania równomiernego fizjologicznego zakresu działania. Może być na przykład korzystne oddzielanie z naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów ewentualnie obecnych, nie-sprzężonych związków lipofilowych, które ewentualnie same wykazują niepożądane działanie fizjologiczne.

Zadaniem wynalazku jest więc znalezienie technicznie i ekonomicznie optymalnego sposobu uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów, przy czym mieszanina ta jest w duż ym stopniu zuboż ona w nie-sprzężone zwią zki lipofilowe, zwłaszcza nie-sprzężone pochodne flawonoidów, izoflawonoidów i norizoprenoidów. W szczególności zadaniem wynalazku jest znalezienie takiego sposobu, w którym stosuje się tylko niewielkie ilości rozpuszczalników nieszkodliwych dla zdrowia. Ponadto należy opracować sposób, który obejmowałby tylko niewiele etapów postępowania, a przy tym dostarczał ekstrakt sprzężonych końskich estrogenów, wykazujący porównywalnie wysoką zawartość sprzężonych estrogenów w przeliczeniu na suchą substancję. Poza tym za pomocą sposobu według wynalazku powinno być możliwe w prosty sposób takie traktowanie zubożonej już w fenolowe składniki moczu mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, która może zawierać zmienne i ewentualnie podwyższone ilości nie-sprzężonych związków lipofilowych, aby uzyskiwana sposobem według wynalazku naturalna mieszanina sprzężonych końskich estrogenów wykazywała dobre zawartości substancji czynnych i spełniała żądane wymagania farmaceutyczne, zwłaszcza utrzymywanie żądanych wartości granicznych zawartości sprzężonych estrogenów w przeliczeniu na suchą substancję.

Znaleziono sposób, za pomocą którego w niespodziewanie prosty sposób można uzyskiwać mieszaninę sprzężonych końskich estrogenów, również z PMU wykazujących zmienne i ewentualnie podwyższone ilości nie-sprzężonych związków lipofilowych, przy czym uzyskana mieszanina sprzężonych końskich estrogenów jest w dużym stopniu zubożona w nie-sprzężone związki lipofilowe, zwłaszcza nie-sprzężone pochodne flawonoidów, izoflawonoidów i norizoprenoidów. W szczególności sposób według wynalazku można stosować w przypadku zubożonej już w fenolowe składniki moczu mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy tak, aby tym sposobem uzyskiwać mieszaninę sprzężonych końskich estrogenów wykazującą wysoką jakość produktu i pewnie spełniającą żądanie wymagań farmaceutycznych, zwłaszcza w odniesieniu do utrzymywania wartości granicznych zawartości sprzężonych estrogenów w przeliczeniu na suchą substancję.

Zgodnie z wynalazkiem sposób uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów charakteryzuje się tym, że uzyskana mieszanina jest zubożona w nie-sprzężone związki lipofilowe z grupy obejmującej nie-sprzężone flawonoidy, nie-sprzężone izoflawonoidy, nie-sprzężone norizoprenoidy, nie-sprzężone steroidy, zwłaszcza steroidy androstanowe i pregnanowe, oraz porównywalne nie-sprzężone związki i sposób ten wyróżnia się tym, że

a) wodną fazę wyjściową wybraną z grupy obejmującej (i) wodny roztwór już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, (ii) wodny koncentrat już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, (iii) koncentrat ciekłego moczu uzyskany przez zatężenie i

PL 205 861 B1 (iv) koncentrat moczu uwolniony od substancji stałych i substancji śluzowych w procesach oddzielania wybranych z grupy obejmującej dekantację, rozdzielanie, filtrację lub w procesie stanowiącym kombinację wymienionych sposobów albo uzyskany drogą filtracji membranowej wstępnie zatężony retentat moczu poddaje się ekstrakcji ciecz-ciecz za pomocą dostatecznej ilości środka ekstrakcyjnego i na koniec oddziela się fazę wodną, przy czym środkiem ekstrakcyjnym jest nadający się do ekstrakcji nie-sprzężonych związków lipofilowych z wyżej podanej grupy, niemieszający się z wodą albo mieszający się w bardzo niewielkim stopniu z wodą rozpuszczalnik organiczny wybrany z grupy obejmującej proste, rozgałęzione albo cykliczne C4-C10-alkohole, C2-C10-zestryfikowane kwasy, C3-C10-aldehydy, C4-C10-ketony, C2-C10-etery, C3-C6-nitryle i C1-C3-chlorowcoalkany oraz mieszaniny wyżej wymienionych rozpuszczalników, i

b) uzyskaną fazę wodną ewentualnie poddaje się powtórnie etapowi (a) i

c) uzyskaną fazę wodną zawierającą naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów ewentualnie zatęża się.

W etapie (a) jako wodną fazę wyjściową stosuje się korzystnie wodny roztwór (i) zubożonej już w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, albo wodny koncentrat (ii) zubożonej już w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy.

Zubożanie w fenolowe składniki moczu prowadzi się korzystnie drogą ekstrakcji w fazie stałej na niejonowych semipolarnych żywicach adsorpcyjnych albo na hydrofobowanym żelu krzemionkowym.

Jako środek ekstrakcyjny stosuje się korzystnie środek wybrany z grupy obejmującej estry C1-C4-alkilowe kwasu octowego, heksanol, eter dietylowy, chlorek metylenu, eter metylo-t-butylowy oraz mieszaniny wymienionych rozpuszczalników, zwłaszcza estry C1-C4-alkilowe kwasu octowego, korzystnie octan etylu.

W etapie (a) w wodnej fazie wyjściowej nastawia się wartość pH w zakresie 4-12, korzystnie w zakresie 4,0 do 7,0, zwłaszcza w zakresie 4,0 do 6,0, a szczególnie w zakresie 4,7 do 5,3.

W etapie (a) korzystnie stosunek objętościowy wodnej fazy wyjściowej do środka ekstrakcyjnego wynosi 5:1 do 1:3, korzystnie 2:1 do 1:2 a w etapie (b) stosunek objętościowy fazy wodnej otrzymanej w etapie (a) do środka ekstrakcyjnego wynosi 20:1 do 1:1, korzystnie 10:1 do 2:1.

W sposobie wedł ug wynalazku stosuje się jako fazę wyjś ciową wyż ej omówiony wodny roztwór lub wodny koncentrat już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy.

Ten wodny roztwór albo ten wodny koncentrat można otrzymywać sposobem opisanym już na przykład w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO 98/08526 i WO 98/08525 albo w chińskim zgłoszeniu patentowym CN 1308083 i na podstawie tych opublikowanych zgłoszeń patentowych jest on dostępny dla fachowców. Treść tych opisów WO 98/08526, WO 98/08525 i CN 1308083 stanowi ujawnienie również dla przedmiotu niniejszego zgłoszenia. Wodnym roztworem albo wodnym koncentratem już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy może być również produkt procesu ekstrakcji ciecz-ciecz, tak jak na przykład opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 01/27134. Otrzymane sposobami opisanymi w powyższych zgłoszeniach patentowych wodne roztwory lub koncentraty można przed zastosowaniem w sposobie według wynalazku w znany sposób, na przykład drogą destylacji, znowu zatężać, aby otrzymać koncentrat uwolniony w dużym stopniu od rozpuszczalnika organicznego.

Ponadto w sposobie według wynalazku jako wodną fazę wyjściową można stosować koncentrat (iii) uzyskany z PMU przez zatężanie albo koncentrat (iv) uzyskany z PMU, który drogą sączenia albo sposobami porównywalnymi został już wstępnie oczyszczony. Zgromadzony mocz (PMU) uwalnia się najpierw w znany sposób od substancji śluzowych i stałych. Substancje stałe i śluzowe pozostawia się do osadzenia i następnie oddziela się je za pomocą znanych metod rozdzielania, na przykład przez dekantowanie, rozdzielanie i/lub sączenie. I tak PMU można na przykład prowadzić poprzez znane urządzenie rozdzielające, np. separator, urządzenie filtracyjne albo sedymentator. Jako urządzenie rozdzielające można stosować np. złoże piasku albo dostępne w handlu separatory, np. separatory dyszowe albo komorowe. W miarę potrzeby można też stosować urządzenia mikrofiltracyjne albo ultrafiltracyjne, przy stosowaniu których można osiągnąć równocześnie uwolnienie w dużym stopniu od zarazków i wirusów w poddawanym sączeniu PMU.

Do moczu względnie koncentratu moczu można ewentualnie dodawać środki konserwujące, środki zarodnikobójcze, środki bakteriobójcze i/lub środki przeciwczerwiowe.

PL 205 861 B1

Jako wstępnie oczyszczony koncentrat moczu (iv) można też stosować wstępnie stężony retentat PMU, który można uzyskać z PMU drogą znanej filtracji membranowej. Zawartość substancji czynnej w retentacie i jego skład może ulegać zmianie w zależności od wprowadzanego PMU i błony stosowanej do filtracji membranowej, na przykład wielkości jej porów, oraz od warunków filtracji. Na przykład przy zastosowaniu błony nanofiltracyjnej można w retentacie PMU uzyskać zatężenie zawartości estrogenów prawie bez strat przy równoczesnym usunięciu do 50% wagowych niżej cząsteczkowych składników PMU. W sposobie według wynalazku można stosować retentaty PMU, które zostały wstępnie zatężone do stosunku około 1:10, na przykład około 1:7, i których objętość można więc zatężać do około 1/10, na przykład około 1/7 pierwotnej objętości PMU.

Jeżeli koncentratem stosowanym jako wodna faza wyjściowa jest zatężony koncentrat PMU albo koncentrat już wstępnie oczyszczony na przykład drogą filtracji membranowej, wówczas uzyskana mieszanina sprzężonych końskich estrogenów, która została sposobem według wynalazku zubożona w nie-sprzężone związki lipofilowe, może wykazywać już wystarczającą czystość, może jednak też ewentualnie zawierać znaczące ilości fenolowych składników moczu, które muszą być oddzielone w dalszych etapach sposobu. I tak otrzymaną fazę wodną można na przykład poddawać sposobom opisanym w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO 98/08526 i WO 98/08525 albo w chińskim zgłoszeniu patentowym CN 1308083, które to sposoby są dostępne fachowcom z tych opublikowanych zgłoszeń patentowych, przy czym otrzymuje się produkt, który także pod względem zawartości fenolowych składników moczu odpowiada żądanym farmaceutycznym wymaganiom dla sprzężonych estrogenów.

W ramach wynalazku jest szczególnie korzystne stosowanie wodnego roztworu już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, albo wodnego koncentratu już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy jako wodnej fazy wyjściowej.

Zgodnie z wynalazkiem w etapie (a) wyżej opisaną wodną fazę wyjściową poddaje się ekstrakcji ciecz-ciecz za pomocą dostatecznej ilości środka ekstrakcyjnego, który stanowi rozpuszczalnik organiczny niemieszający się z wodą albo mieszający się w bardzo małym stopniu i odpowiedni do ekstrakcji nie-sprzężonych związków lipofilowych, zwłaszcza nie-sprzężonych flawonoidów, nie-sprzężonych izoflawonoidów, nie-sprzężonych norizoprenoidów i nie-sprzężonych steroidów. Ponadto ten rozpuszczalnik organiczny powinien nie mieszać się z wodną fazą wyjściową, albo mieszać się tylko w nieznacznym stopniu, przy czym mieszanie w nieznacznym stopniu oznacza, ż e w fazie wodnej występuje najwyżej 6% objętościowych rozpuszczonego rozpuszczalnika organicznego. W tym etapie ekstrakcji ciecz-ciecz można zasadniczo stosować każdy rozpuszczalnik organiczny niemieszający się z wodą, o ile ekstrahuje z fazy wodnej nie-sprzężone zwią zki lipofilowe. Do ekstrakcji nie-sprzężonych związków lipofilowych, zwłaszcza nie-sprzężonych flawonoidów, nie-sprzężonych izoflawonoidów, niesprzężonych norizoprenoidów i nie-sprzężonych steroidów, nadają się rozpuszczalniki organiczne o 1-10 atomach C, które mogą być proste, rozgałęzione lub cykliczne: C4-C10-alkohole, korzystnie butanol, heksanol, cykloheksanol i pentanol, C2-C10 zestryfikowane kwasy, korzystnie octan etylu (= ester etylowy kwasu octowego), octan metylu, octan propylu, octan izopropylu, octan butylu, octan amylu, malonian etylometylowy, fosfonian dimetylu, C3-C10-aldehydy i C4-C10-ketony, korzystnie butanon, pentanon, heksano-2,4-dion, heksanodial, cykloheksanokarbaldehyd, metylofenyloketon i podobne, C2-C10-etery, korzystnie eter dietylowy, eter metylo-t-butylowy, C3-C6-nitryle i C1-C3-chlorowcoalkany, korzystnie chlorek metylenu oraz mieszaniny wyżej wymienionych rozpuszczalników. W szczególności jako środki ekstrakcyjne zgodnie z wynalazkiem można stosować estry C1-C4-alkilowe kwasu octowego, heksanol, eter dietylowy, chlorek metylenu, eter metylo-t-butylowy oraz mieszaniny wymienionych rozpuszczalników. Spośród nich jako środek ekstrakcyjny szczególnie korzystnie stosuje się estry C1-C4-alkilowe kwasu octowego, a zwłaszcza ester etylowy kwasu octowego (= octan etylu).

W prowadzonej zgodnie z wynalazkiem w etapie (a) ekstrakcji ciecz-ciecz za pomocą dostatecznej ilości środka ekstrakcyjnego stosunek objętościowy wodnej fazy wyjściowej do środka ekstrakcyjnego należy rozumieć jako nieograniczający w ramach wynalazku. Na ogół stosuje się objętość rozpuszczalnika organicznego odpowiadający objętości wodnej fazy wyjściowej, przy czym stosunek fazy wodnej do fazy organicznej może mieścić się w zakresie 10:1 do 1:10. Korzystnie stosunek objętościowy wodnej fazy wyjściowej do organicznego środka ekstrakcyjnego wynosi 5:1 do 1:3, szczególnie korzystny stosunek objętościowy mieści się w zakresie 2:1 do 1:2.

Sposób prowadzenia takiego procesu ekstrakcji jest znany fachowcom ze stanu techniki. Zazwyczaj prowadzi się ekstrakcję ciecz-ciecz w urządzeniu umożliwiającym mieszanie w sposób ciągły

PL 205 861 B1 fazy wodnej i fazy organicznej niemieszającej się z wodą. Do prowadzenia takiego procesu ekstrakcji przykładowo wymienia się tak zwane urządzenie Mixer-Settler, w którym obydwie fazy ulegają wymieszaniu drogą mieszania.

Zasadniczo opisana zgodna z wynalazkiem ekstrakcja ciecz-ciecz może być prowadzona przy każdej wartości pH wodnej fazy wyjściowej, korzystnie jednak w etapie (a) najpierw nastawia się wartość pH wodnej fazy wyjściowej na 4-12. Przy nastawianiu wartości pH roztwór miesza się korzystnie w dostatecznie dużym, obojętnym pojemniku, jak na przykład w pojemniku ze stali szlachetnej zaopatrzonym w mieszadło lub porównywalne urządzenie, aby w ten sposób uzyskać szybkie i równomierne nastawienie wartości pH. Do nastawiania wartości pH można stosować znane zasady albo kwasy.

I tak na przykł ad do obniż ania wartości pH moż na stosować jeden ze znanych kwasów nieorganicznych albo organicznych, korzystnie kwas rozcieńczony. Szczególnie korzystne do obniżania albo do nastawiania wartości pH mniejszej od 7 okazało się na przykład stosowanie rozcieńczonego kwasu siarkowego, korzystnie 1N kwasu siarkowego, rozcieńczonego kwasu octowego, rozcieńczonego kwasu fosforowego albo rozcieńczonego kwasu solnego, zwłaszcza 1N kwasu solnego.

Opisana zgodna z wynalazkiem ekstrakcja ciecz-ciecz nie wymaga nastawiania specyficznej temperatury, lecz można ją prowadzić w szerokim zakresie temperatury, a mianowicie od 5°C do temperatury wrzenia organicznego rozpuszczalnika względnie maksymalnie 95°C. Korzystnie zgodnie z wynalazkiem ekstrakcję ciecz-ciecz prowadzi się w temperaturze pokojowej, ponieważ w ten sposób dodatkowy pobór energii jest najmniejszy. Jako temperaturę pokojową bierze się zazwyczaj pod uwagę temperaturę otoczenia, na przykład temperaturę 10-30°C.

Czas trwania takiej ekstrakcji ciecz-ciecz w ramach wynalazku nie jest ograniczony i może zawierać się w granicach od 5 minut do wielu godzin; czas trwania zależy od ilości wprowadzanej wodnej fazy wyjściowej. Zazwyczaj fazę wodną z etapu (a) i organiczny środek ekstrakcyjny miesza się ze sobą w ciągu 5-60 minut, korzystnie 10-20 minut, aby uzyskać możliwie całkowite przejście niesprzężonych składników lipofilowych z fazy wodnej do fazy organicznej.

Na zakończenie etapu ekstrakcji drogą mieszania mieszaninę faz pozostawia się, aby uzyskać rozdzielenie faz. Rozdzielanie faz w zależności od stosowanych objętości może trwać 10 minut do wielu godzin, korzystnie fazy pozostawia się na okres 30-120 minut. Po rozdzieleniu się fazy wodnej i fazy organicznej fazę wodną oddziela się i kieruje do dalszego stosowania, podczas gdy fazę organiczną odrzuca się.

Wyżej opisany etap (a) można ewentualnie powtarzać; wówczas zgodnie z wynalazkiem dołącza się ewentualny etap (b), w którym otrzymaną w etapie (a) fazę wodną poddaje się ponownej ekstrakcji ciecz-ciecz za pomocą dostatecznej ilości środka ekstrakcyjnego, który stanowi rozpuszczalnik organiczny niemieszający się z wodą albo mieszający się w bardzo małym stopniu, odpowiedni do ekstrakcji nie-sprzężonych związków lipofilowych, zwłaszcza nie-sprzężonych flawonoidów, niesprzężonych izoflawonoidów, nie-sprzężonych norizoprenoidów i nie-sprzężonych steroidów.

Dla wyboru środka ekstrakcyjnego i sposobu prowadzenia ekstrakcji, to jest stosowania aparatury, czasu trwania i temperatury procesu ekstrakcji, przykładowo wymienia się możliwości opisane wyżej dla etapu (a).

Zgodnie z wynalazkiem w etapach (a) i (b) w obydwu etapach można stosować zarówno różne środki ekstrakcyjne jak i takie same środki ekstrakcyjne. Korzystnie w obydwu etapach ekstrakcji stosuje się taki sam środek ekstrakcyjny. W szczególności w obydwu etapach ekstrakcji jako środek ekstrakcyjny powinno się stosować ester C1-C4-alkilowy kwasu octowego, zwłaszcza ester etylowy kwasu octowego.

W prowadzonej zgodnie z wynalazkiem w etapie (b) ekstrakcji ciecz-ciecz za pomocą dostatecznej ilości środka ekstrakcyjnego stosunek objętościowy już raz ekstrahowanej, zawierającej sprzężone końskie estrogeny, fazy wodnej z etapu (a) do środka ekstrakcyjnego rozumie się jako nie ograniczający. Na ogół stosuje się objętość rozpuszczalnika organicznego, która wyraźnie jest mniejsza od objętości fazy wodnej otrzymanej w etapie (a), przy czym jednak stosunek fazy wodnej do organicznej może wynosić 40:1 do 1:2. Korzystnie stosunek objętości fazy wodnej otrzymanej w etapie (b) do organicznego środka ekstrakcyjnego wynosi 20:1 do 1:1, zwłaszcza 10:1 do 2:1.

Na zakończenie etapu ekstrakcji drogą mieszania w etapie (b) mieszaninę faz pozostawia się, aby uzyskać rozdzielenie faz. Rozdzielanie faz może trwać 10 minut do wielu godzin, korzystnie fazy pozostawia się na okres 20-90 minut. Po rozdzieleniu się fazy wodnej i fazy organicznej fazę wodną oddziela się i kieruje do dalszego stosowania, podczas gdy fazę organiczną odrzuca się.

PL 205 861 B1

Po oddzieleniu fazy organicznej od fazy wodnej w etapie (c) uzyskuje się fazę wodną zawierającą naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów. Ta faza wodna zawiera występującą w PMU naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów obok tylko nieznacznej ilości obecnych pierwotnie w PMU albo w koncentratach PMU nie-sprzężonych składników lipofilowych. Tę fazę wodną można ewentualnie w znany sposób dalej zatężać, aby uzyskać odpowiedni do dalszej obróbki koncentrat w duż ym stopniu uwolniony od rozpuszczalnika organicznego. I tak na przyk ład z uzyskanej fazy wodnej można oddestylowywać jeszcze obecne pozostałości rozpuszczalnika organicznego. Drogą destylacji można też nastawiać zawartość suchej substancji wodnej fazy ekstraktu na konkretną wartość, korzystnie na zawartość suchej substancji w zakresie 5-15%, zwłaszcza na zawartość suchej substancji 9%. Na koniec dla stabilizacji uzyskanej naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów można nastawiać jeszcze wartość pH wodnego roztworu ekstraktu na wartość w zakresie alkalicznym, korzystnie w zakresie 8-13, zwłaszcza na wartość 9-12. Do nastawiania wartości pH nadają się zasady zwykle stosowane do nastawiania wartości pH, na przykład 1N NaOH albo Na2CO3.

Uzyskana zgodnie z wynalazkiem w etapie (c) i ewentualnie poddana jeszcze dalszej obróbce albo zatężona faza wodna może służyć jako materiał wyjściowy do wytwarzania środków leczniczych zawierających naturalną mieszaninę sprzężonych końskich estrogenów. Za pomocą odpowiedniego procesu suszenia, takiego jak suszenie rozpyłowe, można ewentualnie otrzymywać mieszaninę substancji stałych wolną od eluentów. Jeżeli naturalna mieszanina sprzężonych estrogenów ma być stosowana do wytwarzania stałych środków leczniczych, to może się okazać korzystne dodawanie do fazy wodnej zawierającej sprzężone estrogeny stałego nośnika jeszcze przed zatężaniem lub suszeniem, aby w ten sposób uzyskać mieszaninę substancji stałych zawierającą sprzężone estrogeny i nośniki. Zarówno fazę wodną zawierają c ą mieszaninę estrogenów jak i otrzymany z niej koncentrat albo wysuszony stały produkt można w znany sposób wrabiać w stałe lub ciekłe preparaty galenowe, takie jak na przykład tabletki, drażetki, kapsułki albo emulsje. Preparaty galenowe można wytwarzać znanymi metodami z zastosowaniem znanych stałych lub ciekłych nośników, takich jak np. skrobia, celuloza, cukier mlekowy lub talk, albo ciekłe parafiny i/lub z zastosowaniem znanych farmaceutycznych substancji pomocniczych, takich jak na przykład substancje rozkruszające tabletki, substancje ułatwiające rozpuszczanie albo środki konserwujące. I tak produkt zawierający sprzężone estrogeny można w znany sposób mieszać z farmaceutycznymi nośnikami i substancjami pomocniczymi i mieszaninę przeprowadzać w odpowiednią postać do dawkowania.

W opisanej zgodnej z wynalazkiem ekstrakcji ciecz-ciecz z wodnej fazy wyjś ciowej, która moż e stanowić wodny roztwór już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, wodny koncentrat zubożonej już w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, koncentrat ciekłego moczu albo koncentrat moczu ewentualnie wstępnie oczyszczony drogą sączenia, usuwa się wiele nie-sprzężonych związków lipofilowych za pomocą jednego prostego sposobu. W przypadku oddzielanych nie-sprzężonych związków lipofilowych chodzi zwłaszcza o nie-sprzężone flawonoidy, niesprzężone izoflawonoidy, nie-sprzężone norizoprenoidy i nie-sprzężone steroidy, zwłaszcza niesprzężone pochodne androstanowe i nie-sprzężone pochodne pregnanowe.

W porównaniu z klasycznymi metodami ekstrakcji ciecz-ciecz stosuje się tu niewielkie obję toś ci rozpuszczalników organicznych, ponieważ jako wodną fazę wyjściową stosuje się zawsze koncentrat pierwotnych PMU. Jeżeli na przykład w przypadku wodnej fazy wyjściowej opisanej zgodnie z wynalazkiem ekstrakcji ciecz-ciecz stosuje się wodny koncentrat uzyskiwany według międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 98/08526, to zamiast 5000 litrów PMU stosuje się do ekstrakcji tylko około 35 litrów koncentratu i odpowiednio małe ilości rozpuszczalników organicznych.

Jeżeli do ekstrakcji ciecz-ciecz według wynalazku jako wodną fazę wyjściową stosuje się wodny roztwór zubożonej już w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy albo wodny koncentrat zuboż onej już w fenolowe skł adniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, to uzyskana jako ekstrakt substancji czynnych, zubożona w nie-sprzężone składniki lipofilowe i fenolowe składniki moczu naturalna mieszanina sprzężonych końskich estrogenów odznacza się wyraźną optymalizacją farmaceutycznych specyfikacji, jak to stwierdzono zgodnie z wynalazkiem. W szczególności dzięki ekstrakcji ciecz-ciecz występuje 8-20% polepszenie stosunku sprzężonych końskich estrogenów do suchej substancji, przy czym podczas przeprowadzania ekstrakcji nie obserwuje się znaczących strat sprzężonych końskich estrogenów. Dzięki temu uzyskana w etapie (c) faza wodna zawierająca naturalną mieszaninę sprzężonych końskich estrogenów wykazuje w porównaniu ze stanem techniki korzystny skład i podwyżPL 205 861 B1 szoną łączną zawartość hormonów w przeliczeniu na suchą substancję. Dzięki temu otrzymuje się wyraźnie polepszony pod względem jakości produkt np. pod względem składu i zawartości substancji czynnej.

Jest zupełnie niespodziewane to, że prosty sposób ekstrakcji ciecz-ciecz wodnego roztworu lub koncentratu zubożonej w fenolowe składniki moczu mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy zawierającego zróżnicowane i zmienne ilości nie-sprzężonych składników lipofilowych w tak znaczący sposób przyczynia się do polepszenia jakości uzyskiwanego ekstraktu substancji czynnych. W szczególności bardzo niespodziewane jest to, że udział nie-sprzężonych związków lipofilowych, który w zależności od stosowanych PMU może się silnie zmieniać zarówno pod kątem ilościowym jak i pod względem składu, dzięki sposobowi według wynalazku może się pewnie zmniejszyć do tego stopnia, że w etapie (c) jako fazę wodną można uzyskać mieszaninę naturalnych sprzężonych końskich estrogenów, która spełnia wysokie żądania wymagań farmaceutycznych, na przykład według USP albo farmakopei europejskiej.

Ponadto bardzo niespodziewane jest to, że podczas przeprowadzania ekstrakcji według wynalazku oddzielone zostają również takie nie-sprzężone związki lipofilowe, jak na przykład środki przeciwpienne, które były dodawane przedtem do PMU jako środki pomocnicze w uprzednich etapach obróbki, na przykład w ramach wytwarzania koncentratu.

Jako dalszą korzyść w sposobie według wynalazku wymienia się to, że dalsza obróbka uzyskanego ekstrahowanego koncentratu w postaci zubożonej w nie-sprzężone związki lipofilowe naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów i jego przeprowadzanie w postać galenową jest znacznie uproszczona i ułatwiona. Niespodziewanie ekstrakt substancji czynnych uzyskany sposobem według wynalazku odznacza się bardzo dobrym zachowaniem podczas suszenia, a substancja stała otrzymana po suszeniu wykazuje nadzwyczaj dobrą zdolność do płynięcia. I tak na przykład otrzymany zgodnie z wynalazkiem ekstrahowany koncentrat daje się wyraźnie łatwiej nanosić na nośnik niż roztwór nie ekstrahowany. Również nastawianie stężenia substancji czynnej jest uproszczone i powtarzalne.

Sposób według wynalazku, jak już wyżej opisano szczegółowo, przedstawia szereg korzyści i ulepszeń w porównaniu ze stanem techniki. I tak wynalazek umożliwia zastosowanie również zawierających zmienne ilości niesprzężonych składników lipofilowych PMU, które mogą wykazywać na przykład podwyższony udział wolnych flawonoidów, wolnych izoflawonoidów, wolnych norizoprenoidów albo wolnych pochodnych steroidowych, zwłaszcza wolnych steroidów androstanowych albo pregnanowych, przy czym nie ulegają pogorszeniu farmaceutyczne wymagania, które należy zachować. Za pomocą sposobu według wynalazku można zapewnić równomierny skład poszczególnych szarż ekstraktu, ponieważ stale eliminowane są nie-sprzężone składniki lipofilowe, których zawartość i skład w PMU może ulegać zmianie w zależności od rodzaju pożywienia ciężarnych klaczy i w związku z tym wszystkie otrzymane ekstrakty wykazują porównywalną zawartość sprzężonych końskich estrogenów w przeliczeniu na suchą substancję. Ponadto prowadzone sposobem według wynalazku oddzielanie nie-sprzężonych składników lipofilowych powoduje otrzymywanie w uzyskanym ekstrakcie wyższego stężenia substancji czynnych, to jest sprzężonych końskich estrogenów. Sposób według wynalazku wykazuje też korzyści ekonomiczne, ponieważ wyraźnie zmniejsza się obawa utraty cennych substancji czynnych przy niezachowaniu farmaceutycznych wymogów, na przykład w przypadku niedostatecznej zawartości sprzężonych estrogenów w przeliczeniu na suchą substancję. W dalszym ciągu dzięki stosowaniu sposobu według wynalazku umożliwia się znacznie dokładniejsze i powtarzalne nastawianie zawartości substancji czynnej otrzymywanego ekstraktu. Sposób według wynalazku dostarcza substancję czynną o polepszonej jakości z podwyższoną zawartością hormonów w przeliczeniu na zawartość suchej substancji. Ta substancja czynna nadaje się doskonale do wytwarzania środków farmaceutycznych, które jako substancję czynną zawierają mieszaninę sprzężonych końskich estrogenów.

Następujące przykłady bliżej wyjaśniają wynalazek, nie ograniczając jego zakresu.

P r z y k ł a d y

W nastę pujących przykł adach podaje się ogólny sposób postę powania dla uzyskania ekstraktów substancji czynnych z PMU, które zawierają naturalną mieszaninę występujących w PMU sprzężonych estrogenów i które są zubożone w dużym stopniu w nie-sprzężone związki lipofilowe, takie jak na przykład nie-sprzężone flawonoidy, nie-sprzężone izoflawonoidy, nie-sprzężone norizoprenoidy, nie-sprzężone steroidy, zwłaszcza steroidy androstanowe i pregnanowe, i porównywalne związki nie-sprzężone. Wykazuje się tu, w jaki sposób zgodnie z wynalazkiem również z PMU, które mogą

PL 205 861 B1 zawierać zmienne względnie podwyższone ilości nie-sprzężonych związków lipofilowych, można otrzymywać wysokiej jakości ekstrakt o dużej zawartości substancji czynnych.

Ekstrakcja wodnego koncentratu już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy.

Jako wodną fazę wyjściową stosuje się 35,3 kg (przykład 1) względnie 26,7 kg (przykład 2) wodnego koncentratu już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, który otrzymuje się za pomocą sposobu opisanego w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 98/08526 z około 5000 litrów PMU (zawartość suchej substancji (=TS) oraz oznaczone za pomocą HPLC i GC zawartości sprzężonych estrogenów, na przykład soli siarczanowej estronu, i niesprzężonych związków lipofilowych, na przykład formononetyny, są przedstawione w następującej tabeli przykładów dla różnych szarż wprowadzanego wodnego koncentratu). Ten wodny koncentrat miesza się w naczyniu ze stali szlachetnej za pomocą mieszadła, nastawiając wartość pH za pomocą 1N H2SO4 na około 5,0. Do otrzymanego roztworu w urządzeniu Mixer-Settler w stosunku 10:8 fazy wodnej do fazy organicznej dodaje się octan etylu (EE - ilości podane są w następującej tabeli przykładów) i miesza się energicznie w ciągu około 15 minut. Następnie mieszaninę pozostawia się na okres około 90 minut dla rozdzielenia faz. Na koniec fazy rozdziela się i do fazy wodnej ponownie w stosunku 10:2 fazy wodnej do fazy organicznej dodaje się octan etylu (EE - ilości podane są w następującej tabeli przykładów) i miesza się w ciągu 15 minut. Po ekstrakcji mieszaninę pozostawia się na okres około 30 minut dla rozdzielenia faz. Po oddzieleniu fazy organicznej fazę wodną przenosi się do kotła reakcyjnego. Z fazy wodnej pod normalnym ciśnieniem oddestylowuje się jeszcze obecne pozostałości octanu etylu. Drogą destylacji zawartość suchej substancji nastawia się na około 9%. Na koniec nastawia się wartość pH roztworu na około 11,0 przez dodawanie 1N NaOH albo Na2CO3. Zawartość sprzężonych estrogenów w tak otrzymanej wodnej fazie ekstraktu bada się za pomocą analizy HPLC i GC (zawartość suchej substancji (=TS) oraz oznaczone za pomocą HPLC i GC zawartości sprzężonych estrogenów, na przykład soli siarczanowej estronu, i nie-sprzężonych związków lipofilowych, na przykład formononetyny, są przedstawione w następującej tabeli przykładów dla różnych szarż wprowadzanego wodnego koncentratu). Stosunek poszczególnych składników hormonów wobec siebie, czyli względny udział siarczanu estronu, siarczanu ekwiliny i siarczanu 17-alfa-DH-ekwiliny w mieszaninie sprzężonych estrogenów może się zmieniać w poszczególnych szarżach ze względu na naturalne wahania w PMU. Przez nacelowane mieszanie poszczególnych szarż ze sobą można nastawiać żądany stosunek poszczególnych składników hormonów wobec siebie.

Przykład 1	Przykład 2
Zawartość [mg/g]	Ilość [g]	TS % wag.	Zawartość [mg/g]	Ilość [g]	TS % wag.
Wodny koncentrat wyjściowy		35300			26700
Sucha substancja (% wag.)	(9,8)	3495		(9,4)	2510
Sprzężone estrogeny (łącznie)	26,2	924	26,7	25,8	688	27,4
Siarczan estronu	12,1	431	12,4	16,9	452	18,0
Siarczan ekwiliny	9,3	328	9,5	5,8	156	6,2
Siarczan 17-alfa-DH-ekwiliny	4,7	166	4,8	3,0	80	3,2
Formononetyna	0,17	5,9	0,17	0,32	8,4	0,34
1. Ekstrakcja EE (octan etylu)		25400			19400
2. Ekstrakcja EE (octan etylu)		6400			4900
Otrzymana wodna faza ekstraktu		34000			23500
Sucha substancja (% wag.)	(8,9)	3026		(8,9)	2092
Sprzężone estrogeny (łącznie)	26,3	896	29,6	27,9	656	31,4
Siarczan estronu	12,4	420	13,9	18,5	434	20,8
Siarczan ekwiliny	9,3	317	10,5	6,3	147	7,0
Siarczan 17-alfa-DH-ekwiliny	4,6	158	5,2	3,2	75	3,6
Formononetyna	0	0	0	0	0	0

Ten sposób ekstrakcji można prowadzić analogicznie, jeżeli zamiast stosowanego jako wodna faza wyjściowa wodnego koncentratu już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny

PL 205 861 B1 sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy jako wodną fazę wyjściową stosuje się koncentrat ciekłego moczu, ewentualnie wstępnie oczyszczony drogą filtracji koncentrat moczu albo wodny roztwór już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy.

Claims

1. Sposób uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych końskich estrogenów, znamienny tym, że uzyskana mieszanina jest zubożona w nie-sprzężone związki lipofilowe z grupy obejmującej nie-sprzężone flawonoidy, nie-sprzężone izoflawonoidy, nie-sprzężone norizoprenoidy, nie-sprzężone steroidy, zwłaszcza steroidy androstanowe i pregnanowe, i porównywalne związki nie-sprzężone i sposób ten charakteryzuje się tym, ż e

a) wodną fazę wyjściową wybraną z grupy obejmującej (i) wodny roztwór już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, (ii) wodny koncentrat już zubożonej w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, (iii) koncentrat ciekłego moczu uzyskany przez zatężenie (iv) koncentrat moczu uwolniony od substancji stałych i substancji śluzowych w procesach oddzielania wybranych z grupy obejmującej dekantację, rozdzielanie, filtrację lub w procesie stanowiącym kombinację wymienionych sposobów albo uzyskany drogą filtracji membranowej wstępnie zatężony retentat moczu poddaje się ekstrakcji ciecz-ciecz za pomocą dostatecznej ilości środka ekstrakcyjnego i na koniec oddziela się fazę wodną, przy czym środkiem ekstrakcyjnym jest nadający się do ekstrakcji niesprzężonych związków lipofilowych z wyżej podanej grupy, niemieszający się z wodą albo mieszający się w bardzo niewielkim stopniu z wodą rozpuszczalnik organiczny wybrany z grupy obejmującej proste, rozgałęzione albo cykliczne C4-C10-alkohole, C2-C10 zestryfikowane kwasy, C3-C10-aldehydy, C4-C10-ketony, C2-C10 etery, C3-C6 nitryle i C1-C3 chlorowcoalkany oraz mieszaniny wyżej wymienionych rozpuszczalników, i

b) uzyskaną fazę wodną ewentualnie poddaje się powtórnie etapowi (a) i

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) jako wodną fazę wyjściową stosuje się wodny roztwór (i) zubożonej już w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy, albo wodny koncentrat (ii) zubożonej już w fenolowe składniki moczu naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu ciężarnych klaczy.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że zubożanie w fenolowe składniki moczu prowadzi się drogą ekstrakcji w fazie stałej na niejonowych semipolarnych żywicach adsorpcyjnych albo na hydrofobowanym żelu krzemionkowym.

4. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że jako środek ekstrakcyjny stosuje się środek wybrany z grupy obejmującej estry C1-C4-alkilowe kwasu octowego, heksanol, eter dietylowy, chlorek metylenu, eter metylo-t-butylowy oraz mieszaniny wymienionych rozpuszczalników.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako środek ekstrakcyjny stosuje się estry

C1-C4-alkilowe kwasu octowego, korzystnie octan etylu.

6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że w etapie (a) w wodnej fazie wyjściowej nastawia się wartość pH w zakresie 4-12.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że nastawia się wartość pH w zakresie 4,0 do 7,0, zwłaszcza w zakresie 4,0 do 6,0, a korzystnie w zakresie 4,7 do 5,3.

8. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że w etapie (a) stosunek objętościowy wodnej fazy wyjściowej do środka ekstrakcyjnego wynosi 5:1 do 1:3, korzystnie 2:1 do 1:2.

9. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że w etapie (b) stosunek objętościowy fazy wodnej otrzymanej w etapie (a) do środka ekstrakcyjnego wynosi 20:1 do 1:1, korzystnie 10:1 do 2:1.