PL205888B1 - Aminopeptydaza, gen kodujący aminopeptydazę, wektor ekspresyjny, transformant Escherichia coli i sposób wytwarzania białka typu naturalnego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku jest aminopeptydaza, gen kodujący aminopeptydazę, wektor ekspresyjny, transformant Escherichia coli i sposób wytwarzania białka typu naturalnego. Bardziej szczegółowo, przedmiotem niniejszego wynalazku jest gen kodujący aminopeptydazę, klonowany i wytwarzany z zastosowaniem rekombinacyjnej techniki DNA, wektor ekspresyjny zawierający ten gen, transformant komórkowy transfekowany wektorem ekspresyjnym i aminopeptydaza rekombinacyjna, niezbędna do wytworzenia rekombinowanego ludzkiego hormonu wzrostu w białku typu naturalnego i która może ulegać ekspresji z dużą wydajnością, stabilniej i korzystniej w porównaniu z konwencjonalnymi metodami oczyszczania.

Stan techniki

Ogólnie, białka rekombinowane wytwarzane są jako białka typu nienaturalnego, gdy ulegają one ekspresji na dużą skalę za pośrednictwem manipulacji genetycznej w drobnoustrojach. Bardziej szczegółowo, większość białek rekombinowanych poddanych nieodpowiedniej obróbce wytwarzanych jest z inicjatorem - metioniną (MET) na końcu aminowym. Białka rekombinowane zawierające metioninę na końcu aminowym mogą wywoływać reakcje immunogenne lub stawać się niestabilne, tak że nie pełnią one zasadniczej roli białka w przypadku podania go człowiekowi lub innym zwierzętom. Tak więc duże znaczenie ma opracowanie nowego sposobu wytwarzania takiego białka rekombinowanego, które byłoby takie jak białko typu naturalnego (zobacz Nature, 1987, 326, 315; J. Bacteriol., 1987, 169, 751-757; Bio/Technology, 1990, 8, 1036-1040; Appl. Microbiol. Biotechnol., 1991, 36, 211-215).

Ludzki hormon wzrostu jest hormonem polipeptydowym o masie cząsteczkowej 22125 daltonów, zawierającym na końcu aminowym sekwencję Phe-Pro-Thr i złożonym z 191 aminokwasów wydzielanym przez ludzką przysadkę mózgową. Hormon ten stosuje się głównie do leczenia karłowatości przysadkowej (zobacz Raben, M. S., J. Clin Endocr., 1958, 18, 901). Do tej pory ludzki hormon wzrostu ekstrahowano i oczyszczano z przysadek mózgowych pobieranych ze zwłok. Jednak ze względu na ograniczoną podaż występują trudności z zapewnieniem hormonu wszystkim pacjentom. Ostatnio przeprowadzono kilka badań dotyczących ekspresji i wydzielania ludzkiego hormonu wzrostu z Escherichia coli, drożdży i tym podobnych na drodze manipulacji genowej. Obecnie w lecznictwie stosuje się także ludzki hormon wzrostu wytworzony technologią DNA (w odniesieniu do Escherichia coli zob. koreańską publikację patentową nr 89-1244 i nr 87-701; Otwarty patent koreański nr 87-2258 i 84-8695; w przypadku drożdży zob. koreańską publikację patentową nr 92-99; otwarty patent koreański nr 90-9973 i 90-9976).

Jeżeli jednak ludzki hormon wzrostu wytwarza się opisaną powyżej techniką rekombinacji DNA, na końcu aminowym oprócz 191 reszt aminokwasowych znajdujących się w ludzkim hormonie wzrostu typu naturalnego dodaje się jedną resztę metioninową i kodon inicjacyjny syntezy białka i w ten sposób wytwarza się metionylowany ludzki hormon wzrostu, rozpoczynający się sekwencją Met-Phe-Pro-Thr na końcu aminowym, utworzony ze 192 reszt aminokwasowych. Metionylowany ludzki hormon wzrostu wykazuje taką samą aktywność biologiczną, jak ludzki hormon wzrostu typu naturalnego (Moore, J. A., Endocrinology, 1988, 122, 2920-2926); nie donoszono, aby wywoływał on objawy niepożądane na skutek obecności reszty metioninowej na końcu aminowym. W rzadkich przypadkach może jednak dochodzić do wytwarzania przeciwciał z powodu obecności metioniny; opisywano, że do wytworzenia przeciwciał dochodzi częściej niż w przypadku stosowania hormonu wzrostu typu naturalnego (Lancet, 29 marca 1986, 697).

Dlatego istnieje kilka sposobów wytwarzania hormonu typu naturalnego niezawierających metioniny. A mianowicie, ludzki hormon wzrostu wytwarza się sposobem pierwszym, w którym koniec aminowy poddaje się fuzji z końcem karboksylowym innego białka, a następnie trawieniu swoistą proteazą (zobacz międzynarodowe zgłoszenie PCT WO 89/12678; europejskie zgłoszenie patentowe EP 20209; patent europejski EP 321940); i sposobem drugim obejmującym (1) ekspresję hormonu wzrostu w obrębie komórek, (2) trawienie metioniny przy wydzielaniu z komórek gospodarzy i (3) odzyskiwanie ludzkiego hormonu wzrostu typu naturalnego z pożywki hodowlanej (zob. patent europejski EP 008832; patent Stanów Zjednoczonych USP 4755465; patent japoński JP 01273591; europejskie zgłoszenie patentowe EP 306673; koreańskie zgłoszenie patentowe nr 92-10932). Jednak przedstawione powyżej sposoby wykazują pewne niekorzystne cechy. Mianowicie, konieczne jest skomplikowane konstruowanie nowych wektorów ekspresyjnych i przeprowadzanie etapów transformacji komórek gospodarzy oraz jednoczesna optymalizacja warunków ekspresji za pomocą dodatkowych działań.

PL 205 888 B1

Z drugiej strony, w przypadku, gdy biał ko egzogenne wytworzone z zastosowaniem technologii rekombinacji DNA zawiera dodatkowy aminokwas na końcu aminowym, można łatwo wykorzystać aminopeptydazę w celu usunięcia dodatkowego aminokwasu i uzyskania białka egzogennego o takiej samej strukturze, jak białko typu naturalnego. Bardziej szczegółowo, można wykorzystać swoistą aminopeptydazę tnącą wybiórczo tylko resztę metioninową, obecną na końcu aminowym metionylowanego ludzkiego hormonu wzrostu, oczyszczanego konwencjonalnymi metodami, w celu wytworzenia ludzkiego hormonu wzrostu typu naturalnego (zobacz międzynarodowe zgłoszenie PCT WO86/04609 i WO 86/204527 A1).

Dotychczas wykazano, że do wytworzenia ludzkiego hormonu wzrostu można wykorzystywać różnego typu aminopeptydazy. Bardziej szczegółowo, opisywano zastosowanie aminopeptydazy oczyszczonej z Aeoromonas proteolytica (zobacz międzynarodowe zgłoszenie PCT WO 86/01229; patent europejski EP 0489711, A3, BGT Company; Prescott i Wilks, Method in Enzymology, 1976, 44, 530-543), aminopeptydazę oczyszczaną z nerek świni (zob. międzynarodowe zgłoszenie PCT WO 86/204527 A1; Bio/Technology, 1987, 5, 824-827, firma Takeda), aminopeptydazę dipeptydylową oczyszczaną z Dictyostelium discoidium (zobacz patent europejski EP 557076, patent Stanów Zjednoczonych USP 5126249, A1, firma Eli Lilly) i aminopeptydazę ze Streptomyces thermonitripican.

Po to aby osiągnąć powyższe cele aminopeptydaza nie powinna działać na sekwencję aminokwasową białka typu naturalnego, a jednocześnie usuwać zbędne reszty aminokwasowe obecne na końcu aminowym białka rekombinowanego. A mianowicie, gdy oryginalne białko ma sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się od X-Y-Z na końcu aminowym, a białko rekombinowane ma sekwencję aminokwasową Met-X-Y-Z- zawierającą dodatkową resztę metioninową na końcu aminowym, aminopeptydaza powinna odcinać tylko resztę metioninową, a nie działać na inne aminokwasy (X-Y-Z-), to znaczy w wyniku jej działania powinno powstawać białko rekombinowane o takiej samej sekwencji aminokwasów, jak białko typu naturalnego. Tak więc aminopeptydaza spełniająca takie wymagania powinna być zgodna w odniesieniu do swej swoistości substratowej w zależności od białka docelowego w zastosowaniach przemysłowych. Chociaż enzym ten ma taką cechę, korzystne jest, aby sam w sobie wykazywał wię kszą aktywność podstawową .

Do tej pory wyekstrahowano z drobnoustrojów i opisano ponad kilkadziesiąt aminopeptydaz. Cechą wspólną większości jest to, że wymagają one do aktywacji obecności jonów metali, takich jak jony wapnia, cynku i tym podobnych. Aminopeptydazy te wykazują różne właściwości w zależności do masy cząsteczkowej, zasadniczych jonów metali, optymalnych warunków reakcji, swoistości substratów itp., w zależności od drobnoustrojów, chociaż wykazują one wspólną cechę w stosunku do aktywności trawienia reszt aminokwasowych na końcu aminowym białka (zobacz FEMS Microbiol. Rev., 1996, 18,319-3440). Takie aminopeptydazy klasyfikuje się jako egzopeptydazy i wykazują one właściwość oddzielania aminokwasu z końca aminowego białka-substratu.

Bardziej szczegółowo, aminopeptydazy takie opisano i wydzielono konkretnie z Bacillus sp., na przykład Bacillus subtilis (zob. Arch. Biochem. Biophys., 1979, 197, 63-77; Arch. Biochem. Biophys., 1980, 202, 540-545; J. Biochem., 1994, 107, 603-607; patent japoński JP 03285684, firma DiacelChem), Bacillus stearothermophilus (zobacz Meth. Enzymol., 1970, 19, 544-552; Biochem. Biophys. Acta, 1976, 438, 212-220; patent europejski EP 101653, firma Untika), Bacillus thuringensis (Biokhimiya, 1984, 49, 1899-1907), Bacillus licheniformis (Arch. Biochem. Biophys., 1978, 186, 383-391; Mikrobiol. Zh., 1989, 51, 49-52) i tak dalej.

W wyż ej wymienionych pozycjach piś miennictwa, aminopeptydazy oczyszczano i analizowano pod kątem właściwości enzymatycznych, stosując leucyno-p-nitroanilid i, jako substrat, kilka dipeptydów lub podobnych substancji. Jednakże, oligopeptydów rozpoczynających się od sekwencji Met-X-Pro na końcu aminowym ani białek rozpoczynających się od sekwencji Met-X-Pro na końcu aminowym nie stosowano jako substratu do mierzenia aktywności enzymatycznej. Nie potwierdzono zatem jeszcze, czy te aminopeptydazy można by było wykorzystać do usuwania metioniny z białek rekombinowanych, zawierających na końcach aminowych sekwencję Met-X-Pro.

Ponadto, aminopeptydazy pochodzące z Bacillus licheniformis zilustrowano w poniższy sposób. Rodriguez i wsp. oczyścili aminopeptydazę pochodzącą z Bacillus licheniformis ATTC 12759 i badali jej właściwości enzymatyczne. W niniejszym wynalazku ujawniono również sposób wytwarzania ludzkiego hormonu wzrostu typu naturalnego z zastosowaniem aminopeptydazy pochodzącej z Bacillus licheniformis, charakterystykę oczyszczonej aminopeptydazy w zakresie jej właściwości enzymatycznych i jej sekwencję aminokwasową na końcu aminowym (koreański otwarty patent nr 1998-071239). W tym wynalazku, ukierunkowanym na wytworzenie na dużą skalę biał ka typu naturalnego na drodze

PL 205 888 B1 rekombinowanych technik DNA, wykazano, że aminopeptydaza mogła by usuwać tylko resztę metioninową w substratach syntetycznych, oligopeptydach, białkach i tym podobnych i rozpoznawać swoistą sekwencję aminokwasową Met-X-Pro (w niniejszym opisie X oznacza dowolny aminokwas, niezależnie od jego rodzaju) i zatem mogłaby nadawać się do wytwarzania ludzkiego hormonu wzrostu typu naturalnego (koreański otwarty patent nr 1998-071239). Te konwencjonalne sposoby wykazały, że aminopeptydaza może być wytwarzana z Bacillus licheniformis i wykorzystywana do produkcji białka rekombinowanego typu naturalnego. Oprócz tego, dostarczyły one jedynie informacji o częściowej sekwencji aminokwasowej końca aminowego; a nie ustalono wciąż w całości genu aminopeptydazy.

Dlatego też podjęte usiłowania zakończone sukcesem doprowadziły do uzyskania nowej aminopeptydazy do wytwarzania białka rekombinowanego typu naturalnego. Bardziej szczegółowo, dokonano klonowania genu aminopeptydazy pochodzącej z Bacillus licheniformis, wyznaczono jego sekwencję nukleotydową i aminokwasową i dokonano ekspresji sklonowanego genu aminopeptydazy w rekombinowanych szczepach bakteryjnych. Nastę pnie, wykazano, ż e biał ko rekombinowane wykazuje aktywność aminopeptydazy, jest przydatne do łatwego stosowania w innych reakcjach enzymatycznych, jak również do wytwarzania białek typu naturalnego.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest aminopeptydaza posiadająca sekwencję aminokwasową SEQ ID No:1

Aminopeptydaza według wynalazku korzystnie zawiera jedną z sekwencji aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej sekwencje aminokwasowe poddane częściowej delecji na końcu aminowym sekwencji aminowej o pełnej długości według SEQ. ID nr 1, między alaniną 30 a alaniną 31, między lizyną 39 a asparaginą 40, między asparaginą 40 a waliną 41, między waliną 41 a glutaminą 42 lub między glutaminą 42 a lizyną 43.

W innej korzystnej realizacji aminopeptydaza zawiera sekwencję aminokwasową poddaną czę ściowej delecji na końcu karboksylowym, między seryną 443 a tyrozyną 444, według SEQ. ID nr 1.

Przedmiotem wynalazku jest także gen kodujący aminopeptydazę, posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID No:1, która to aminopeptydaza może korzystnie zawierać jedną z sekwencji aminokwasowych dobranych z grupy obejmującej sekwencje aminokwasowe poddane częściowej delecji na końcu aminowym sekwencji aminowej o pełnej długości według SEQ. ID nr 1, między alaniną 30 a alaniną 31, mię dzy lizyną 39 a asparaginą 40, mię dzy asparaginą 40 a waliną 41, mię dzy waliną 41 a glutaminą 42 lub między glutaminą 42 a lizyną 43, lub w innej korzystnej realizacji aminopeptydaza może zawierać sekwencję aminokwasową poddaną częściowej delecji na końcu karboksylowym, między seryną 443 a tyrozyną 444, według SEQ. ID nr 1.

W korzystnym wykonaniu wynalazku gen zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No:2.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny pLAP132, charakteryzujący się tym, że zawiera gen kodujący aminopeptydazę o sekwencji nukleotydowej pełnej długości według SEQ. ID nr 2.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest transformant Escherichia coli XLOLR/LAP132, który jest transfekowany wektorem ekspresyjnym pLAP132 (numer dostępu KCTC 1000 BP).

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka typu naturalnego, polegający na tym, że obejmuje następujące etapy: (1) etap oczyszczania białek rekombinacyjnych zawierających sekwencję metionina-X-prolina na końcu aminowym, (2) etap dodawania zdefiniowanej powyżej aminopeptydazy do mieszaniny oczyszczającej i (3) etap trawienia sekwencji metionina X prolina przy końcu aminowym białka rekombinowanego za pomocą aminopeptydazy.

W korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku X w sekwencji metionina X prolina moż e być dowolnym typem aminokwasu.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia oznaczanie sekwencji aminokwasowej fragmentów peptydów aminopeptydazy, uzyskanych po trawieniu trypsyną.

Fig. 2 przedstawia analizę aminopeptydazy pochodzącej z Bacillus licheniformis, ulegającej ekspresji z transformantu Escherichia coli na drodze elektroforezy na żelu SDS-poliakrylamidowym.

Fig. 3 przedstawia analizę aminopeptydazy pochodzącej z Bacillus licheniformis, poddanej ekspresji z transformantu Bacillus subtilis na drodze elektroforezy na żelu SDS-poliakrylamidowym.

Fig. 4 przedstawia schematycznie badanie aktywności enzymatycznej w aminopeptydazie pochodzącej z Bacillus licheniformis, ulegającej ekspresji z transformantu Bacillus subtilis.

Korzystne wykonania wynalazku

Stwierdzono, że aminopeptydaza według niniejszego wynalazku wykazuje aktywność enzymatyczną w odniesieniu do stanu polipeptydu z przed delecji peptydu sygnałowego (sekwencja utworzoPL 205 888 B1 na z aminokwasów od 1 do 30 według SEQ. ID nr 1) i po delecji peptydu sygnałowego. Chociaż poza delecją niektóre aminokwasy na końcu aminowym i na końcu karboksylowym ulegają odcięciu od peptydu sygnałowego, aktywność enzymatyczna zostaje utrzymana. Tak więc aminopeptydaza zawierająca sekwencję aminokwasów według SEQ. ID nr 1, jak również aminopeptydazy z częściową delecją na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym, w porównaniu z sekwencją aminokwasów według SEQ. ID nr 1, mogą pozostawać w zakresie niniejszego wynalazku.

Korzystnie aminopeptydaza według niniejszego wynalazku zawiera sekwencję aminokwasów z częściową delecją na końcu aminowym między alaniną 30 a alaniną 31, między lizyną 39 a asparaginą 40, między asparaginą 40 a waliną 41, między waliną 41 a glutaminą 42 lub między glutaminą 42 a lizyną 43, według SEQ. ID nr 1. Korzystniej aminopeptydaza zawiera sekwencję aminokwasów z częściową delecją na końcu aminowym między alaniną 30 a alaniną 31, między glutaminą 42 a lizyną 43.

Korzystnie, aminopeptydaza według niniejszego wynalazku zawiera sekwencję aminokwasów z częściową delecją na końcu karboksylowym, między seryną 443 a tyrozyną 444, według SEQ. ID nr 1.

Korzystniej aminopeptydaza zawiera sekwencję aminokwasów z częściową delecją na końcu aminowym między glutaminą 42 a lizyną 43 według SEQ. ID nr 1 oraz na końcu karboksylowym, między seryną 443 a tyrozyną 444, według SEQ. ID nr 1.

Oprócz tego geny kodujące aminopeptydazę pochodzącą z Bacillus licheniformis mogą zawierać gen kodujący sekwencję aminokwasów według SEQ. ID nr 1, gen kodujący wszystkie poddane delecji postacie aminopeptydaz wymienione powyżej i gen według SEQ. ID nr 2.

W celu zbadania czynnoś ci i aktywnoś ci enzymatycznej aminopeptydazy przeprowadzono następującą procedurę, stosując białko zawierające sekwencję aminokwasów według SEQ. ID nr 1, właściwe dla niego geny i polipeptyd w odpowiedniej postaci poddanej delecji.

W celu wyjaśnienia czynności polipeptydów posiadających aktywność enzymatyczną aminopeptydazy pochodzącej z Bacillus licheniformis, gen kodujący aminopeptydazę klonowano z DNA chromosomalnego Bacillus licheniformis. Bardziej szczegółowo, w celu klonowania genów, polipeptydy posiadające aktywność enzymatyczną aminopeptydazy pochodzącej z Bacillus licheniformis oczyszczano, trawiono trypsyną, aby uzyskać pewną liczbę fragmentów peptydowych, po czym ustalano ich sekwencję aminokwasową. Informację o sekwencji aminokwasowej wykorzystywano do syntezy oligonukleotydów, które przeznaczone były do zastosowania jako primery, po czym dokonywano powielenia fragmentów DNA odpowiadających części genu aminopeptydazy. Następnie, wykorzystując te fragmenty DNA jako sondy, wyszukano gen aminopeptydazy z biblioteki chromosomalnej pochodzącej z Bacillus licheniformis.

Wyżej wymienione geny aminopeptydazy zbadano w celu ustalenia sekwencji nukleotydowej za pomocą analizatora sekwencji DNA, jak to przedstawiono na SEQ. ID nr 2 i ustalono, że wydedukowana sekwencja DNA na podstawie informacji genetycznej SEQ. ID nr 1, została zidentyfikowana jako taka, która posiada taką samą sekwencję jak sekwencja aminokwasowa aminopeptydazy oczyszczanej z naturalnych komórek gospodarzy. W wyniku tego, polipeptyd aminopeptydazowy, wytworzony według niniejszego wynalazku, badano przesiewowo stosując bazę danych dla informacji genetycznych i stwierdzono, że gen ten jest zidentyfikowany nową sekwencją DNA, której nigdy do tej pory nie opisywano, i która to nowa sekwencja wykazuje aktywność enzymatyczną aminopeptydazy, gdy ulega ekspresji w drobnoustrojach rekombinowanych.

Następnie, stwierdzono również, że dojrzała aminopeptydaza została poddana częściowemu trawieniu. W celu zbadania składu aminopeptydazy na końcu karboksylowym, zbadano aminopeptydazę oczyszczoną z rekombinowanego transformatu bakteryjnego i aminopeptydazę oczyszczoną z naturalnych komórek gospodarzy - Bacillus licheniformis - w celu ustalenia masy cząsteczkowej za pomocą spektrometrii masowej. W wyniku tej procedury potwierdzono, że w obu przypadkach doszło do odcięcia 6 reszt aminokwasowych na końcu karboksylowym.

Potwierdzono, że aminopeptydaza według niniejszego wynalazku stała się dojrzała, że aminopeptydaza ulegała ekspresji w komórce i że doszło do delecji peptydu sygnałowego na końcu aminowym w czasie wydzielania pozakomórkowego. Oprócz tego, stwierdzono, że dojrzała aminopeptydaza również została poddana częściowemu trawieniu.

Tak więc polipeptyd aminopeptydazowy według niniejszego wynalazku utrzymuje aktywność enzymatyczną przy obecności peptydu sygnałowego i nawet z częściowym odcięciem na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym, z nieobecnością peptydu sygnałowego.

P r z y k ł a d y

Praktyczne i korzystne wykonania niniejszego wynalazku zostały zilustrowane w poniższych przykładach.

PL 205 888 B1

P r z y k l a d 1

Klonowanie genu aminopeptydazy pochodzącego z Bacillus licheniformis (1-1) Częściowe oznaczenie sekwencji aminokwasowej w aminopeptydazie oczyszczonej z Bacillus licheniformis

W celu oczyszczenia biał ka aminopeptydazy z Bacillus licheniformis przeprowono nastę pują c ą procedurę.

W kolbach przygotowano wyjałowioną pożywkę zawierającą 10 g tryptonu, 5 g wyciągu z drożdży, 10 g na l NaCl i dodano do tego szczep KCTC 3058 Bacillus licheniformis w celu hodowania go w temperaturze 40°C, przy 120 obrotach na minutę, przez około 16 godzin. Opisany powyż ej bulion, zawierający hodowlę, przeniesiono następnie na nową pożywkę i hodowano w temperaturze 40°C, mieszając przy 200-400 obrotach na minutę, ponad 30 rozpuszczonego tlenu. Następnie dokonano oznaczenia stężenia glukozy w odstępie jednej godziny i hodowlę zakończono, gdy aktywność aminopeptydazy osiągnęła ponad 35 U na ml. W celu hodowania komórek przygotowano w stanie jałowym bulion do hodowli, zawierający 2 kg peptonu, 6 kg wyciągu z drożdży, 4 kg fosforanu potasowego, kg NaCl, SAG, 15 g MgSO₄7H₂O, 1,53 g FeSO₄7H₂O, 1,53 g ZnSO₄7H₂O, 1,53 g MnSO₄ i 10 kg glukozy na 200 l wody destylowanej w fermentatorze o objętości 400 l. Po zakończeniu hodowli w celu usunięcia pozostałości komórek zastosowano ciągłe wirowanie i odzyskiwano nadsącz. Tak uzyskany nadsącz zatężano za pomocą koncentratora, po czym dodawano ZnSO4 do uzyskania około 0,3 mM. Z zatężonego roztworu oczyszczono aminopeptydazę na drodze trójetapowej chromatografii kolumnowej. Przy chromatografii stosowano kolejno SP-Sepharose FF, Sephacryl S-200 i DEAE-Sepharose FF. Stwierdzono, że aminopeptydaza oczyszczona powyższą metodą wykazuje 95% czystość, przy analizie metodą chromatografii wysokociśnieniowej z odwróconymi fazami.

Uzyskaną aminopeptydazę strącano, stosując 10% kwas trójchlorooctowy (TCA), płukano acetonem i suszono. Wysuszony osad białka rozpuszczano w 8 M moczniku i 0,4 M wodorowęglanie amonowym i traktowano ditiotreitolem (DTT) i jodoacetamidem, na zmianę, tak aby doszło do rozcięcia mostków dwusiarczkowych w aminopeptydazie. Po obróbce próbkę ponownie rozpuszczono w wodzie destylowanej, dodano około 0,05 mg trypsyny na 2 mg aminopeptydazy i poddawano obróbce w temperaturze 37°C przez około 8 godzin. Próbkę potraktowaną trypsyną wstrzykiwano do chromatografu wysokociśnieniowego z odwróconymi fazami (RP-HPLC) i zbierano frakcje głównych pików peptydowych. Do chromatografii z odwróconymi fazami zastosowano kolumnę Vydac C18 z odwróconymi fazami i zastosowano liniowy gradient stężenia, stosując rozpuszczalnik A (wysoko oczyszczona woda zawierająca 0,05% kwasu trójfluorooctowego (TFA)) oraz rozpuszczalnik B (wysoko oczyszczona woda zawierająca 0,05% TFA i 80% cyjanek metylu). W tym momencie analizę przeprowadzano z prędkością przepływu 0,5 ml/min i uzyskano chromatogram przez absorbancję promieniowania nadfioletowego o długości 214 nm. Stosując tę procedurę uzyskano ponad 10 pików. Uzyskaną próbkę peptydu analizowano odpowiednio, metodą spektrometrii masowej i wybierano peptydy utworzone z ponad 15 aminokwasów. W wybranej próbce oznaczano sekwencję aminokwasową za pomocą analizatora sekwencji aminokwasów. Fig. 1 przedstawia sekwencję aminokwasową wybranego peptydu, przy czym każdy aminokwas oznaczono jedną literą. Peptydy ponumerowano w porządku dowolnym, zgodnie z czasem elucji przez chromatografię z odwróconymi fazami, a część oznaczoną strzałką (Fig. 1) wykorzystano do dostarczenia informacji o syntezie primerów oligonukleotydów. Spośród tych próbek peptydów próbka oznaczona symbolem T4, jak wydedukowano, zawierała 2 różne peptydy jednocześnie, ponieważ dwa aminokwasy pojawiły się w tym samym czasie w każdym cyklu, podczas wykonywania analizy sekwencji aminokwasów. Ponadto, spośród tych próbek peptydów, ta sama sekwencja aminokwasów znajdowała się pomiędzy T6 a T9, T11 a T13, T16 a T17. Bardziej szczegółowo, odpowiednio T4 opisana w SEQ. ID nr 4 i 5, T6 w SEQ. ID nr 6, T7 w SEQ. ID nr 7, T9 w SEQ. ID nr 8, T11 w SEQ. ID nr 9, T13 w SEQ. ID nr 10, T16 w SEQ. ID nr 11, T17 w SEQ. ID nr 12, co opisano niezależnie w Wykazie Sekwencji.

(1-2) Klonowanie genu aminopeptydazy i ustalanie sekwencji nukleotydowej

Stosując informacje o peptydach podane w przykładzie 1 (1-1), dokonano syntezy primerów nukleotydowych do PCR genów aminopeptydazy. Bardziej szczegółowo, wykorzystano primer leżący w kierunku końca 5' (LAP-5) opisany w SEQ. ID nr 13 i primer leżący w kierunku końca 3' (LAP-3) opisany w SEQ. ID nr 14; wytworzono je, stosując sekwencje aminokwasowe opisane w SEQ. ID nr 15 i w SEQ. ID nr 16, spośród sekwencji aminokwasowych wymienionych w Przykładzie 1 (1-1). Wykonano kolejno 32-krotnie PCR, stosując urządzenie do termicznych cykli DNA; denaturację w temperaturze 94°C przez 30 sekund, annealing w temperaturze 40°C przez 45 sekund i wydłużanie w tempePL 205 888 B1 raturze 72°C przez 1 minutę; jako matrycę stosowano DNA chromosomalne Bacillus licheniformis. W wyniku tego uzyskano fragment DNA o dł ugoś ci 390 par zasad.

W tym samym czasie wytworzono genomowe DNA Bacillus licheniformis metodą Murraya i Thompsona i dokonano częściowego trawienia enzymem restrykcyjnym Sau3A i rozdzielono go na 0,8% żelu agarozowym, po czym izolowano fragmenty DNA odpowiadające wielkości 2-3 kb. Dokonano ligacji fragmentu DNA do wektora ekspresyjnego λ ZAP (Stratagene, LaJolla, USA) strawionego BamHI i dodano do ekstraktu pakującego. Następnie mieszaninę wypełniającą przeniesiono do XL-1 Blue MRF' E. coli. Ten, przygotowany w opisany wyżej sposób filtr biblioteki poddano skriningowi, stosując oznakowany ³²P fragment PCR, i poszukiwano w nim klonów zawierających gen aminopeptydazy. W wyniku tej procedury potwierdzono, że wybrany klon zawierał insert DNA o wielkości około 2,6 kb i nazwano go klonem „LAP 132.

Analizowano sekwencję nukleotydową LAP 132 i wynik opisano w SEQ. ID nr 2. Bardziej szczegółowo, sekwencja ta składała się z kodonu inicjacyjnego ATG, rozpoczynającego się na nukleotydzie 192 i kodonu terminacji TAA na 1539 i zawierała otwartą ramkę odczytu (ORF) o długości 1347 par zasad, jak to przestawiono w SEQ. ID nr 2 i w SEQ. ID nr 3. Stwierdzono, że nukleotyd kodował 449 aminokwasów. Sekwencja aminokwasów kodowana przez wyżej podaną informację na temat sekwencji nukleotydów była w pełni tożsama z wynikiem ustalonym przez analizę sekwencji aminokwasów fragmentów peptydów pochodzących z aminopeptydazy oczyszczonej w sposób opisany powyżej. Domen końca aminowego aminopeptydazy według niniejszego wynalazku zawierała hydrofobowe reszty aminokwasowe, stanowiące przedłużenie kationowych reszt aminokwasowych, co było podobne do sekwencji sygnałowej niezbędnej do wydzielania. Tak więc wydedukowano, że aminopeptydaza była strawiona między alaniną 30 a alaniną 31 w momencie wydzielenia. W otwartym patencie koreańskim nr 1998-071239 opisano aminopeptydazę, której koniec aminowy rozpoczyna się, w zasadzie, od sekwencji aminokwasowych opisanych w SEQ. ID nr 17 i heterogenne postacie aminopeptydaz, których miejsca rozszczepienia różnią się nieco od opisanych w niniejszym wynalazku. Wywnioskowano, że różnica ta spowodowana była strawieniem inną proteazą zewnątrzkomórkową, po wydzieleniu aminopeptydazy z oryginalnych szczepów. Aminopeptydazę według niniejszego wynalazku porównano w zakresie sekwencji aminokwasowej z inną aminopeptydazą, zarejestrowaną w Genebank, stosując przeszukiwanie BLAST. W wyniku tego stwierdzono 62% homologię z aminopeptydazą pochodzącą z Bacillus subtilis i 58% homologii z aminopeptydazą pochodzącą z Bacillus halodurans. Aminopeptydaza według niniejszego wynalazku jest zatem nową aminopeptydazą nie opisywaną uprzednio.

Autorzy niniejszego wynalazku przekształcili gen aminopeptydazy LAP 132 pochodzący z Bacillus licheniformis do szczepu XLOLR/LAP 132 E. coli i nazwali go „XLOLR/LAP 132 E. coli. Złożyli oni tę strukturę w International Deposit Organization, Korean Collection for Type Cultures (KCTC) Korean research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) w Republice Korei 26 kwietnia 2001, pod numerem akcesyjnym KCTC 1000 BP.

P r z y k ł a d 2

Ekspresja genu aminopeptydazy w transformancie Escherichia coli

Dokonano subklonowania genu aminopeptydazy klonowanego do wektora ekspresyjnego pBKCMV (Stratagene, USA) i wektorowi ekspresyjnemu nadano nazwę „pLAP32; został on przeznaczony do zastosowania jako źródło genu aminopeptydazy. Następnie fragment PCR o długości około 1,2 kb, zawierający region kodujący aminopeptydazę, subklonowano do wektora pET11a (Stratagene, USA) i temu wektorowi ekspresyjnemu nadano nazwę pETLAP45. Wektor ekspresyjny transformowano do BL21(DE3) E. coli i wykorzystano do ekspresji poddanego fuzji białka zawierającego peptyd His-tag. Ekspresję aminopeptydazy w opisanym powyżej układzie ekspresji potwierdzono przez SDS-PAGE. Jak to zilustrowano na Fig. 2, zbadana masa cząsteczkowa aminopeptydazy osiągała około 45 kDa w SDS-PAGE i była identyczna z masą cząsteczkową wydedukowaną na podstawie odpowiedniego genu. Na Fig. 2 ścieżka M przedstawia standardowy marker mas cząsteczkowych; ścieżka 1 - E. coli transformowane do wektora ekspresyjnego PET11a (nie wywołujące ekspresji); ścieżka 2 - E. coli transformowane do wektora ekspresyjnego PET11a (powodujące aktywację promotora T7); ścieżka 3 - E. coli transformowane do wektora ekspresyjnego PETLAP45 (nie wywołujące ekspresji); ścieżka 4 E. coli transformowane do wektora ekspresyjnego PETLAP45 (powodujące aktywację promotora T7). Na Fig. 2 strzałka wskazuje aminopeptydazę.

Po ekspresji genu podjęto próbę wykrycia aktywności enzymatycznej aminopeptydazy wydzielanej z transformantu E. coli. Po poddaniu transformantu E. coli sonikacji i analizie, aktywność enzy8

PL 205 888 B1 matyczną aminopeptydazy z transformantu E. coli wykrywano przede wszystkim we frakcjach rozpuszczalnych. W wyniku tego stwierdzono, że aminopeptydaza według niniejszego wynalazku ma taką samą wielkość jak aminopeptydaza wydedukowana z genu i wykazuje aktywność enzymatyczną.

P r z y k ł a d 3

Ekspresja genu aminopeptydazy w transformancie Bacillus subtilis, analiza sekwencji oczyszczonej aminopeptydazy na końcu aminowym i ustalenie jej masy cząsteczkowej (3-1) Ekspresja genu aminopeptydazy w transformancie Bacillus licheniformis

Fragment DNA trawiony Hindlll-SacI, zawierający region kodujący aminopeptydazę, jak również promotor, region 3' - niepoddany translacji, o długości około 2,6 kb, subklonowano do wektora Bacillus pRB373, i powstały wektor ekspresyjny oznaczono symbolem pRB373-LAP. Wektor ekspresyjny transformowano do Bacillus subtilis, hodowano, po czym analizowano bulion hodowlany metodą DSD-PAGE. Zaobserwowano, że aminopeptydaza była wydzielana z roztworu hodowli, a jej masa cząsteczkowa wynosiła około 45 kDa, co byłoby zgodne z masą cząsteczkową aminopeptydazy z Bacillus licheniformis (zobacz Fig. 3). Na Fig. 3 ścieżka M odpowiada standardowemu markerowi masy cząsteczkowej; ścieżka 1 - Bacillus subtilis transformowanemu do wektora ekspresyjnego pRB373; ścieżka 2 Bacillus subtilis transformowanemu do wektora ekspresyjnego pRB373-LAP; ścieżka 3 - aminopeptydazie oczyszczonej z Bacillus licheniformis. Strzałka na Fig. 3 wskazuje na aminopeptydazę.

(3-2) Analiza sekwencji polipeptydu aminopeptydazy na końcu aminowym - ekspresja z transformantu Bacillus subtilis

W celu oczyszczenia aminopeptydazy hodowano rekombinacyjny transformant Bacillus subtilis zawierający gen według niniejszego wynalazku i pożywkę hodowlaną rozdzielano, wykonując chromatografię Sp-Sepharose. Sekwencję aminokwasową na końcu aminowym oczyszczonej aminopeptydazy oznaczano w analizatorze aminokwasowym. W wyniku tego potwierdzono, że sekwencja aminopeptydazy na końcu aminowym była heterogenna, podobnie jak w przypadku aminopeptydaz pochodzących z naturalnych komórek gospodarzy i rozpoczynał a się od SEQ. ID nr 17, w wię kszoś ci wraz z sekwencjami według SEQ. ID 18. Istniała również aminopeptydaza rozpoczynająca się od Asn, Val i Glu.

(3-3) Wyznaczanie masy cząsteczkowej w polipeptydzie aminopeptydazowym ulegającym ekspresji z rekombinowanego transformantu Bacillus subtilis

Rekombinacyjny transformant Bacillus subtilis zawierający gen aminopeptydazy hodowano a pożywkę hodowlaną wykorzystywano do oczyszczania aminopeptydazy metodą chromatografii SP-Sepharose. Masę cząsteczkową aminopeptydazy badano metodą spektrometrii masowej i w wyniku tego pojawiły się substancje odpowiadające masie cząsteczkowej 42965 Da, 43241 Da i 43468 Da. Wynik ten porównano z wynikiem otrzymanym z analizy sekwencji aminokwasowej w przykładzie 3 (3-2) i wydedukowano, że z końca karboksylowego usunięto dodatkowe 6 aminokwasów. Oznacza to, że teoretyczna masa cząsteczkowa polipeptydu opisanego w SEQ. ID nr 1, którego koniec aminowy rozpoczyna się od SEQ. ID nr 17, a koniec karboksylowy kończył się na SEQ. ID nr 19, odpowiadała około 43241 Da. Masa cząsteczkowa innego polipeptydu, zawierającego o 2 aminokwasy więcej niż powyższy, odpowiadała 43468 Da, a masa cząsteczkowa kolejnego polipeptydu, po delecji 2 aminokwasów, odpowiadała 42965 Da, to znaczy była identyczna z wynikiem spektrometrii masowej.

Zbadano także aminopeptydazę oczyszczaną z naturalnej komórki gospodarza - Bacillus licheniformis - metodą spektrometrii masowej, stosując tę samą procedurę co w Przykładzie 1 (1-1) i otrzymano taki sam wynik, jak w przypadku rekombinowanego transformantu.

P r z y k ł a d 4

Pomiar aktywności aminopeptydazy i jej postaci po delecji ulegających ekspresji w rekombinowanych transformantach E. coli i Bacillus subtilis

Dokonano pomiaru aktywności aminopeptydazy stosując roztwór lizatu komórkowego, sonikowany w przypadku transformantu E. coli i w przypadku rekombinowanego transformantu Bacillus subtilis stosując roztwór hodowlany, uzyskany w przykładzie 3 (3-1).

Bardziej szczegółowo, wykorzystano metodę Pflleiderera w celu oszacowania aktywności enzymatycznej aminopeptydazy wytworzonej w przykładzie 2 i 3 (Pflleiderer, Meth. Enzymol., 1970, 19, 514-521). Do mieszaniny 1 M Tris (pH 8,5) (950 ul) i 0,1 M leucyny-p-nitroanilidu (20 ul) DMSO dodano 50 μl roztworu hodowlanego; reakcję prowadzono przez 3 minuty w temperaturze 60°C, dodano 100 μl 70% kwasu octowego, reakcję zakończono i mierzono absorbancję przy długości fali 405 nm.

W wyniku tego, jak to przedstawiono na Fig. 4, stwierdzono wyraźną różnicę między szczepem Bacillus subtilis transformowanym genem aminopeptydazy a szczepem Bacillus subtilis zawierającym wektor ekspresyjny. Ponadto aminopeptydaza oczyszczana z rekombinowanego Bacillus subtilis była

PL 205 888 B1 utworzona jednocześnie z postaci po delecji na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym, jak to przedstawiono w przykładzie 3 (3-2) i (3-3); stwierdzono również, że próbki wykazują aktywność enzymatyczną. Na Fig. 4, oznacza pRB373-LAP Bacillus subtilis przekształcony wektorem ekspresyjnym zawierającym gen aminopeptydazy; Δ oznacza LG, Bacillus subtilis hodowany w bulionie hodowlanym LB; a ♦ oznacza pRB373, Bacillus subtilis transformowany wektorem ekspresyjnym niezawierającym genu aminopeptydazy.

Wykorzystanie w przemyśle

Jak to jasno wykazano i potwierdzono powyżej, według niniejszego wynalazku gen kodujący aminopeptydazę pochodzącą z Bacillus licheniformis klonuje się i poddaje ekspresji stosując rekombinacyjny transformant bakteryjny; stwierdzono, że jest to nowy gen, nieopisywany uprzednio. Aminopeptydazę oczyszczaną według niniejszego wynalazku można korzystnie wykorzystywać do wytwarzania białek rekombinowanych typu naturalnego, jak również szeroko stosować do innych reakcji enzymatycznych.

Wykaz sekwencji <110> LG LIFE SCIENCES, LTD.

<120> Aminopeptydaza, gen kodujący aminopeptydazę, wektor ekspresyjny, transformant Escherichia coli i sposób wytwarzania białka typu naturalnego <130> lp-05-08 <160> 19 <170> Kopatentln 1,71 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220>

<221> sygnał <222> (1) . . (30) <220>

<221> domena <222> (133)..(211) <223> domena PA (związana z proteazą) <220>

<221> domena <222> (261)..(308) <223> rodzina peptydaz M20/M25/M40 <400> 1

Met 1

Lys

Arg

Lys

Met 5

Met

Met

Ile

Gly

Leu 10

Ala

Leu

Ser

Val

Ile 15

Ala

Gly

Gly

Val

Phe 20

Ala

Ala

Gly

Thr

Gly 25

Asn

Ala

Val

Gin

Ala 30

Ala

Pro

Gin

Glu

Thr 35

Ala

Ile

Ala

Lys

Asn 40

Val

Glu

Lys

Phe

Ser 45

Lys

Lys

Phe

Asn

Glu 50

Asn

Arg

Ala

Tyr

Gin 55

Thr

Ile

1-r

His

Leu 60

Ser

Glu

Thr

Val

PL 205 888 B1

Gly 65

Pro Arg Val

Thr Gly Thr Ala Glu Glu Lys

Lys

Ser

Ala

Ala

Phe 80

70

75

Ile

Ala

Ser

Gin

Met

Lys

Lys

Ser

Asn

Leu

Lys

Val

Thr

Thr

Gin

Thr

85

90

95

Phe

Ser

Ile

Pro

Asp

Arg

Leu

Glu

Gly

Thr

Leu

Thr

Val

Gin

Gly

Asn

100

105

110

Asn

Val

Pro

Ser

Arg

Pro

Ala

Ala

Gly

Ser

Ala

Pro

Thr

Ala

Ala

Glu

115

120

125

Gly

Leu

Ala

Ala

Pro

Leu

Tyr

Asp

Ala

Gly

Leu

Gly

Leu

Pro

Gly

Asp

130

135

140

Phe

Thr

Glu

Glu

Ala

Arg

Gly

Lys

Ile

Ala

Val

Ile

Leu

Arg

Gly

Glu

145

150

155

160

Leu

Thr

Phe

Tyr

Glu

Lys

Ala

Lys

Asn

Ala

Ala

Asp

Ala

Gly

Ala

Ser

165

170

175

Gly

Val

Ile

Ile

Tyr

Asn

Asn

val

Asp

Gly

Leu

Val

Pro

Leu

Thr

Pro

180

185

190

Asn

Leu

Ser

Gly

Asn

Lys

Val

Asp

Val

Pro

Val

Val

Gly

Val

Lys

Lys

195

200

205

Glu

Asp

Gly

Glu

Lys

Leu

Leu

Ser

Glu

Gin

Glu

Ala

Ile

Leu

Lys

Leu

210

215

220

Lys

Ala

His

Lys

Asn

Gin

Thr

Ser

Gin

Asn

Val

Ile

Gly

Val

Arg

Lys

225

230

235

240

Ala

Lys

Gly

Val

Lys

Asn

Pro

Asp

Ile

Val

Tyr

Val

Thr

Ser

His

Tyr

245

250

255

Asp

Ser

Val

Pro

Tyr

Ala

Pro

Gly

Ala

Asn

Asp

Asn

Ala

Ser

Gly

Thr

260

265

270

Ser

Val

Val

Leu

Glu

Leu

Ala

Arg

Ile

Met

Lys

Thr

Val

Pro

Ala

Asp

275

280

285

Lys

Glu

Ile

Arg

Phe

Ile

Thr

Phe

Gly

Ala

Glu

Glu

Ile

Gly

Leu

Leu

290

295

300

Gly

Ser

Arg

His

Tyr

Val

Ser

Thr

Leu

Ser

Glu

Gin

Glu

Val

Lys

Arg

305

310

315

320

Ser

Val

Ala

Asn

Phe

Asn

Leu

Asp

Met

Val

Ala

Thr

Ser

Trp

Glu

Asn

325

330

335

Ala

Ser

Gin

Leu

Tyr

Ile

Asn

Thr

Pro

Asp

Gly

Ser

Ala

Asn

Leu

Val

340

345

350

Trp

Gin

Leu

Ser

Lys

Ala

Ala

Ser

Leu

Ser

Leu

Gly

Lys

Asp

Val

Leu

355

360

365

Phe

Leu

His

Gin

Gly

Gly

Ser

Ser

Asp

His

Val

Pro

Phe

His

Glu

Ala

370

375

380

Gly

Ile

Asp

Ser

Ala

Asn

Phe

Ile

Trp

Arg

Glu

Pro

Gly

Thr

Gly

Ala

385

390

395

400

Leu

Glu

Pro

Trp

Tyr

His

Thr

Pro

Tyr

Asp

Thr

Ile

Glu

His

Ile

Ser

405 410 415

PL 205 888 B1

Lys

Asp

Arg

Leu 420

Lys

Thr

Ala

Gly

Gin 425

Ile

Ala

Gly

Thr

Ala 430

Val

Tyr

Asn

Leu

Thr

Lys

Lys

Glu

Asn

Arg

Thr

Pro

Ser

Tyr

Ser

Ser

Val

Ala

435 440 445

Gin <210> 2 <211> 2052 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220>

<221> RBS <222> (179)..(184) <223 > kandydat RBS 1 <220>

<221> RBS <222> (195)..(200) <223> kandydat RBS 2 <220>

<221> CDS <222> (192) . . (1538) <223> kandydat CDS 1 <220>

<221> peptyd_mat <222> (282) . . (1538) <220>

<221> peptyd_sig <222> (192)..(281) <400> 2

gatcctgata attcggacgt	attctaaaca	gaaaaaaggc tcacgtcaag catcctatta	60
aacaaaaaaa cttttttatc	aaacttcaaa	ttactggtct atcgaatcat ttatcagatg	120
catgcaggat tcacccgctc	agctgcgaat	atctcttctc aggaaaacaa gaccatcaag	180
gaggtttatg t	atg aag aga Met Lys Arg	l aaa atg atg atg atc gga ttg gcg [ Lys Met Met Met Ile Gly Leu Ala	224

10

eta Leu

tcc Ser

gta Val

ata Ile 15

gca Ala

ggc Gly

ggc Gly

gtg Val

ttc Phe 20

gee Ala

get Ala

gga Gly

acg Thr

ggg Gly 25

aat Asn

get Ala

272

gtt

caa

gcg

gcg

cct

cag

gaa

aca

gee

atc

gca

aaa

aat

gtc

gaa

aaa

320

Val

Gin

Ala

Ala

Pro

Gin

Glu

Thr

Ala

Ile

Ala

Lys

Asn

Val

Glu

Lys

30

35

40

ttc

age

aaa

aaa

ttc

aat

gaa

aac

ege

gee

tat

caa

acg

att

tac

cat

368

Phe

Ser

Lys

Lys

Phe

Asn

Glu

Asn

Arg

Ala

Tyr

Gin

Thr

Ile

Tyr

His

45

50

55

tta

ago

gaa

acg

gtc

gga

ceg

cgt

gtg

aca

ggc

acg

gcg

gaa

gaa

aaa

416

Leu

Ser

Glu

Thr

Val

Gly

Pro

Arg

Val

Thr

Gly

Thr

Ala

Glu

Glu

Lys

60

65

70

75

aag

age

gee

get

ttc

atc

gee

tea

cag

atg

aaa

aaa

tea

aat

ctg

aaa

464

PL 205 888 B1

Lys Ser Ala Ala Phe Ile Ala Ser Gin Met Lys Lys Ser Asn Leu Lys 80 85 90 gtg acc aca caa acc ttc agc ata cct gac cgg ctg gaa gga acg ctt

Val Thr Thr Gin Thr Phe Ser Ile Pro Asp Arg Leu Glu Gly Thr Leu

100 105 acc gtt cag gga aat aac gtg cct tcg cgg cct gcc gcc ggt tcc gcc

Thr Val Gin Gly Asn Asn Val Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gly Ser Ala

110 115 120 ccg aca gca gca gaa ggc ctg gcc gct cct ctc tat gat gcc ggc ctc

Pro Thr Ala Ala Glu Gly Leu Ala Ala Pro Leu Tyr Asp Ala Gly Leu

125 130 135 ggc ctg cct ggc gac ttc acc gag gaa gcg aga ggc aaa atc gcc gtc

Gly Leu Pro Gly Asp Phe Thr Glu Glu Ala Arg Gly Lys Ile Ala Val

140 145 150 155 att tta aga ggc gag ctg aca ttc tat gaa aaa gcg aaa aac gct gct

Ile Leu Arg Gly Glu Leu Thr Phe Tyr Glu Lys Ala Lys Asn Ala Ala

160 165 170 gac gca ggc gca agc gga gtg atc att tat aat aac gtc gac ggt ctc

Asp Ala Gly Ala Ser Gly Val Ile Ile Tyr Asn Asn Val Asp Gly Leu

175 180 185 gtc cct ctg act ccg aat ctc agc ggt aat aaa gtc gat gtt ccg gta

Val Pro Leu Thr Pro Asn Leu Ser Gly Asn Lys Val Asp Val Pro Val

190 195 200 gtc ggc gtc aaa aag gaa gac gga gaa aag ctg ctt tct gaa caa gaa

Val Gly Val Lys Lys Glu Asp Gly Glu Lys Leu Leu Ser Glu Gin Glu

205 210 215 gcg atc ttg aag ctg aag gct cat aaa aat caa aca tcg caa aac gta

Ala Ile Leu Lys Leu Lys Ala His Lys Asn Gin Thr Ser Gin Asn Val

220 225 230 235 atc ggc gtc cgc aaa gca aaa ggt gtc aaa aat ccg gac atc gtg tat

Ile Gly Val Arg Lys Ala Lys Gly Val Lys Asn Pro Asp Ile Val Tyr

240 245 250 gtg act tcg cat tat gac agc gtc cct tac gct ccc gga gcc aat gac

Val Thr Ser His Tyr Asp Ser Val Pro Tyr Ala Pro Gly Ala Asn Asp

255 260 265

512

560

608

656

704

752

800

848

896

944

992 aat gcc tcc ggc act tca gtc gtt ctt gaa ctg gcc cgg atc atg aag Asn Ala Ser Gly Thr Ser Val Val Leu Glu Leu Ala Arg Ile Met Lys

270 275 280

1040

acg Thr

gtt Val 285

ccg Pro

gcc Ala

gac Asp

aaa Lys

gaa Glu 290

att Ile

cgc Arg

ttt Phe

att Ile

aca Thr 295

ttc Phe

ggc Gly

gcc Ala

gaa Glu

gaa

atc

ggt

ctc

ctc

gga

tcg

cgc

cat

tat

gtc

agc

acc

ttg

tca

gag

Glu

Ile

Gly

Leu

Leu

Gly

Ser

Arg

His

Tyr

Val

Ser

Thr

Leu

Ser

Glu

300

305

310

315

1088

1136

cag Gin

gaa Glu

gtc Val

aaa Lys

cgg Arg 320

agc Ser

gtt Val

gcc Ala

aac Asn

ttt Phe 325

aac Asn

tta Leu

gat Asp

atg Met

gtg Val 330

gcg Ala

1184

aca

agc

tgg

gaa

aat

gct

tca

cag

ctg

tac

atc

aat

aca

cct

gac

ggt

1232

Thr

Ser

Trp

Glu

Asn

Ala

Ser

Gin

Leu

Tyr

Ile

Asn

Thr

Pro

Asp

Gly

335

340

345

PL 205 888 B1

tca Ser

gca Ala

aac Asn 350

ctc Leu

gtc Val

tgg Trp

cag Gin

eta Leu 355

agt Ser

aaa Lys

gcc Ala

get Ala

tet Ser 360

tta Leu

agc Ser

ctt Leu

1280

ggg

aaa

gac

gta

tta

ttt

tta

cat

caa

ggc

gga

tca

tcc

gac

cat

gtc

1328

Gly

Lys

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

His

Gin

Gly

Gly

Ser

Ser

Asp

His

Val

365

370

375

cca

ttc

cat

gaa

gcc

ggc

atc

gac

tca

gcc

aac

ttc

att

tgg

aga

gag

1376

Pro

Phe

His

Glu

Ala

Gly

Ile

Asp

Ser

Ala

Asn

Phe

Ile

Trp

Arg

Glu

380

385

390

395

ccg

gga

aca

ggt

gca

ttg

gag

cct

tgg

tac

cac

acc

cct

tac

gac

acg

1424

Pro

Gly

Thr

Gly

Ala

Leu

Glu

Pro

Trp

Tyr

His

Thr

Pro

Tyr

Asp

Thr

400

405

410

att

gaa

cac

atc

agc

aaa

gac

agg

ctg

aaa

aca

gcc

gga

caa

atc

gcg

1472

Ile

Glu

His

Ile

Ser

Lys

Asp

Arg

Leu

Lys

Thr

Ala

Gly

Gin

Ile

Ala

415

420

425

gga

aca

gcc

gtg

tat

aac

ctg

acc

aag

aaa

gaa

aac

aga

aca

ccg

tet

1520

Gly

Thr

Ala

Val

Tyr

Asn

Leu

Thr

Lys

Lys

Glu

Asn

Arg

Thr

Pro

Ser

430

435

440

ta atattaaaaa ggagcagatc gattcaatct

1570 tac agc tca gtc gec caa Tyr Ser Ser Val Ala Gin

445 gctccttttt tataccgctt cttttcaatc cttcatcagc ttaataaacc tgaagctcat caaaacgctg ccgatggcaa ccacaatcat gaccaccccc agatcctgaa aatgacccgc ggttatttct tctccaaaca acagacccag aatgacggac gaaaagatcg agccaagata gcggcatgtt tggaagagcc ccgaagtggt tccgacgatg tccggcgggc ttgccgtaaa catggcggcc tggagggcga cattgccgag tccatagctg acccccagca aagagaggat gatgcctttc cacaacatcg gtgcatcgac aaaaaacaat gtgagcagga tagcgccggc tgccattaag caagaaccaa ttaaaacagg ctgcgtttca cctgaacggt caatccatgt cccgacgaaa ggcgaaatca atacgctcgt cccggacatg aacagcatca aaagacccgt cg <210> 3 <211> 449 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 3

1630

1690

1750

1810

1870

1930

1990

2050

2052

Met 1

Lys

Arg

Lys

Met 5

Met

Met

Ile

Giy

Leu 10

Ala

Leu

Ser

Val

Ile 15

Ala

Gly

Gly

Val

Phe 20

Ala

Ala

Gly

Thr

Gly 25

Asn

Ala

Val

Gin

Ala 30

Ala

Pro

Gin

Glu

Thr 35

Ala

Ile

Ala

Lys

Asn 40

Val

Glu

Lys

Phe

Ser 45

Lys

Lys

Phe

Asn

Glu 50

Asn

Arg

Ala

Tyr

Gin 55

Thr

Ile

Tyr

His

Leu 60

Ser

Glu

Thr

Val

Gly 65

Pro

Arg

Val

Thr

Gly 70

Thr

Ala

Glu

Glu

Lys 75

Lys

Ser

Ala

Ala

Phe 80

Ile

Ala

Ser

Gin

Met 85

Lys

Lys

Ser

Asn

Leu 90

Lys

Val

Thr

Thr

Gin 95

Thr

Phe

Ser

Ile

Pro

Asp

Arg

Leu

Glu

Gly

Thr

Leu

Thr

Val

Gin

Gly

Asn

100 105 HO

PL 205 888 B1

Asn

Val

Pro 115

Ser

Arg

Pro

Ala

Ala 120

Gly

Ser

Ala

Pro

Thr 125

Ala

Ala

Glu

Gly

Leu 130

Ala

Ala

Pro

Leu

Tyr 135

ASp

Ala

Gly

Leu

Gly 140

Leu

Pro

Gly

Asp

Phe 145

Thr

Glu

Glu

Ala

Arg 150

Gly

Lys

Ile

Ala

Val 155

Ile

Leu

Arg

Gly

Glu 160

Leu

Thr

Phe

Tyr

Glu 165

Lys

Ala

Lys

Asn

Ala 170

Ala

Asp

Ala

Gly

Ala 175

Ser

Gly

Val

Ile

Ile 180

Tyr

Asn

Asn

Val

Asp 185

Gly

Leu

Val

Pro

Leu 190

Thr

Pro

Asn

Leu

Ser 195

Gly

Asn

Lys

Val

Asp 200

Val

Pro

Val

Val

Gly 205

Val

Lys

Lys

Glu

Asp 210

Gly

Glu

Lys

Leu

Leu 215

Ser

Glu

Gin

Glu

Ala 220

Ile

Leu

Lys

Leu

Lys 225

Ala

His

Lys

Asn

Gin 230

Thr

Ser

Gin

Asn

Val 235

Ile

Gly

Val

Arg

Lys 240

Ala

Lys

Gly

Val

Lys 245

Asn

Pro

Asp

Ile

Val 250

Tyr

Val

Thr

Ser

His 255

Tyr

Asp

Ser

Val

Pro 260

Tyr

Ala

Pro

Gly

Ala 265

Asn

Asp

Asn

Ala

Ser 270

Gly

Thr

Ser

Val

Val 275

Leu

Glu

Leu

Ala

Arg 280

Ile

Met

Lys

Thr

Val 285

Pro

Ala

Asp

Lys

Glu

Ile

Arg

Phe

Ile

Thr

Phe

Gly

Ala

Glu

Glu

Ile

Gly

Leu

Leu

290 295 300

Gly Ser. Arg His Tyr Val Ser Thr Leu Ser Glu Gin Glu Val Lys Arg

305

310

315

320

Ser

Val

Ala

Asn

Phe 325

Asn

Leu

Asp

Met

Val 330

Ala

Thr

Ser

Trp

Glu 335

Asn

Ala

Ser

Gin

Leu 340

Tyr

Ile

Asn

Thr

Pro 345

Asp

Gly

Ser

Ala

Asn 350

Leu

Val

Trp

Gin

Leu 355

Ser

Lys

Ala

Ala

Ser 360

Leu

Ser

Leu

Gly

Lys 365

Asp

Val

Leu

Phe

Leu 370

His

Gin

Gly

Gly

Ser 375

Ser

Asp

His

Val

Pro 380

Phe

His

Glu

Ala

Gly 385

Ile

Asp

Ser

Ala

Asn 390

Phe

Ile

Trp

Arg

Glu 395

Pro

Gly

Thr

Gly

Ala 400

Leu

Glu

Pro

Trp

Tyr 405

His

Thr

Pro

Tyr

Asp 410

Thr

Ile

Glu

His

Ile 415

Ser

Lys

Asp

Arg

Leu 420

Lys

Thr

Ala

Gly

Gin 425

Ile

Ala

Gly

Thr

Ala 430

Val

Tyr

Asn

Leu

Thr 435

Lys

Lys

Glu

Asn

Arg 440

Thr

Pro

Ser

Tyr

Ser 445

Ser

Val

Ala

Gin <210> 4

PL 205 888 B1 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 4

Ile Met Lys Thr Val Pro Ala Asp Lys Glu Ile 15 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 5

His Tyr Val Ser Thr Leu Ser Glu Gin Glu Val 15 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 6

Ala Tyr Gin Thr Ile Tyr His Leu Ser Glu Thr Val Gly Pro Arg 15 10 15 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 7

Thr Ala Gly Gin Ile Ala Gly Thr Ala Val Tyr Asn Leu Thr Lys Lys 15 10 15

Glu Asn Arg Thr Pro Ser 20 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 8

Ala 1	Tyr	Gin	Thr	Ile 5	Tyr	His	Leu	Ser	Glu 10	Thr Val	Gly Pro Arg Val 15
Thr	Gly	Thr	Ala	Glu	Glu	Lys	Lys	Ser	Ala	Ala
			20					25

<210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 9

Lys Ala Lys Gly Val Lys Asn Pro Asp Ile Val Tyr Val Thr Ser His 15 10 15

Tyr Asp Ser <210> 10

PL 205 888 B1 <211> 20 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 10

Gly Val Lys Asn Pro Asp Ile Val Tyr Val Thr Ser His Tyr Asp Ser 15 10 15

Val Pro Tyr Ala 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 11

Phe Ile Thr Phe Gly Ala Glu Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ser Arg His 15 10 15

Tyr Val Ser Thr 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 12

Ala Ala Ser Leu Ser Leu Gly Lys Asp Val Leu Phe Leu His Gin Gly 15 10 15

Gly Ser Ser Asp 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>

<223> primer LAP-5 w stronę końca 5' <400> 13 aayccngaya thgtntay <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>

<223> primer LAP-3 w stronę końca 3' <400> 14 raanagnacr tcyttncc <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 15

Asn Pro Asp Ile Val Tyr 1 5

PL 205 888 B1

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Aminopeptydaza posiadająca sekwencję aminokwasową SEQ ID No: 1
2. 2. Aminopeptydaza według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera jedną z sekwencji aminokwasowych dobranych z grupy obejmującej sekwencje aminokwasowe poddane częściowej delecji na końcu aminowym sekwencji aminowej o pełnej długości według SEQ. ID nr 1, między alaniną 30 a alaniną 31, między lizyną 39 a asparaginą 40, między asparaginą 40 a waliną 41, mię dzy waliną 41 a glutaminą 42 lub mię dzy glutaminą 42 a lizyną 43.
3. 3. Aminopeptydaza według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera sekwencję aminokwasową poddaną częściowej delecji na końcu karboksylowym, między seryną 443 a tyrozyną 444, według SEQ. ID nr 1.
4. 4. Gen kodujący aminopeptydazę, zdefiniowaną w zastrz. 1, 2 lub 3.
5. 5. Gen według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID No:2.
6. 6. Wektor ekspresyjny pLAP132, znamienny tym, że zawiera gen kodujący aminopeptydazę o sekwencji nukleotydowej peł nej dł ugości wedł ug SEQ. ID nr 2.

   PL 205 888 B1
7. 7. Transformant Escherichia coli XLOLR/LAP132, znamienny tym, że jest transfekowany wektorem ekspresyjnym pLAPl32 (numer dostępu KCTC 1000 BP).
8. 8. Sposób wytwarzania białka typu naturalnego, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy: (1) etap oczyszczania białek rekombinacyjnych zawierających sekwencję metionina-X-prolina na końcu aminowym, (2) etap dodawania aminopeptydazy zdefiniowanej w zastrz. 1, 4 lub 5 do mieszaniny oczyszczającej i (3) etap trawienia sekwencji metionina-X-prolina przy końcu aminowym białka rekombinacyjnego za pomocą aminopeptydazy.
9. 9. Sposób wytwarzania białka typu naturalnego według zastrz. 8, znamienny tym, że X w sekwencji metionina-X-prolina może być dowolnym typem aminokwasu.