PL205925B1

PL205925B1 - Zastosowanie długiej pentraksyny PTX3 lub cDNA kodującego długą pentraksynę PTX3

Info

Publication number: PL205925B1
Application number: PL365292A
Authority: PL
Inventors: Alberto Mantovani; Barbara Bottazzi; Marco Presta; Marco Rusnati
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2010-06-30
Also published as: AU2251302A; US7858577B2; HU229100B1; AU2002222513B2; HUP0400541A3; CZ299673B6; ITRM20000578A1; CA2428176C; PT1331940E; AU2002222513B8; CN1304047C; HUP0400541A2; ATE322906T1; CA2428176A1; CN1473050A; PL365292A1; JP4167061B2; DE60118769D1; BR0115190A; ES2261515T3

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania długiej pentraksyny PTX3 (PTX3) lub cDNA kodującego długą pentraksynę PTX3 do wytwarzania leku do zapobiegania łub leczenia chorób wywołanych niekontrolowaną proliferacją fibroblastów lub komórek mięśni gładkich, wybranych spośród: bliznowacenia związanego z nadmierną odpowiedzią fibroblastów i nawrotu zwężenia po angioplastyce naczyń lub chorób wywołanych zmienionym rozwojem naczyń, wybranych spośród: retynopatii cukrzycowej i miażdżycy tętnic.

Do chorób spowodowanych zmienioną aktywacją czynnika wzrostu FGF-2 należą schorzenia wywołane zmienionym procesem rozwoju naczyń oraz niekontrolowaną proliferacją fibroblastów lub komórek mięśnia gładkiego.

Pierwszy związek obdarzony aktywnością skierowaną przeciwko rozwojowi naczyń został wykryty w tkance chrzestnej przez Henry'ego Brem'a i Judath Folkman w 1975 roku (J. Exp. Med. 1975 Feb. 1; 141 (2):427-39). Autorzy przypuszczali, że odkrycie to, dzięki zastosowaniu selektywnych inhibitorów patologicznego rozwoju nowych naczyń, może znaleźć zastosowanie w kontroli procesów patologicznych, takich jak wzrost nowotworu, przerzuty, przewlekłe i ostre zapalenie stawów oraz retynopatia cukrzycowa.

Proces rozwoju naczyń u dorosłego człowieka jest zazwyczaj nieaktywny, lecz przejawia normalne funkcje, na przykład, w trakcie gojenia się ran lub odnawiania śluzówki macicy podczas cyklu miesiączkowego u kobiet.

Odpowiedź związana z rozwojem naczyń jest fizjologicznie stymulowana, w sytuacji, gdy funkcje naczyniowe ulegają redukcji i przy niedostatecznej perfuzji tkanki.

Ogólnie, można stwierdzić, że w warunkach fizjologicznych, proces rozwoju naczyń stanowi pozytywną reakcję sprzężenia w odpowiedzi na niedostateczną perfuzję lub niedostateczne zaopatrzenie w tlen i składniki odżywcze. Występuje on, na przykład, w sytuacji zamknięcia tętnicy, przyrostu masy tkanki (na przykład, podczas procesu unaczynienia, jaki towarzyszy powstawaniu tkanki mięśnia) i w przypadku wzmożonej pracy związanej ze zwiększonym zapotrzebowaniem tlenu i składników odżywczych.

Wiadomo, że na wzrost podstawowych nowotworów wpływa dobre unaczynienie tkanki nowotworowej. Odpowiednie zaopatrzenie w tlen i składniki odżywcze przyspiesza wzrost nowotworu.

Wykazano, że zasięg rozwoju naczyń może stanowić nadzwyczaj negatywny czynnik w prognozowaniu nowotworów (van Hinsbergh VW, Collen A., Koolwijk P., Ann. Oncol., 10 Suppl., 4:60-3. 1999; Buolamwini J.K.; Curr., Opin., Chem., Biol., 3(4):500-9, 1999 Aug.).

Wiadomo również, że w dziedzinie nowotworów, podstawowym etapem w biologii komórki nowotworowej jest nabycie zdolności do powstawania przerzutów.

Komórki rakowe, które tworzą przerzuty tracą przyczepność z otaczającymi je strukturami, przenikają do krwi oraz naczyń limfatycznych i kolonizują inne, odległe tkanki, gdzie ulegają namnożeniu.

Powstanie przerzutu stanowi również krytyczny etap w klinicznym przebiegu choroby i jest główną przyczyną śmierci wywołanej obecnością nowotworu. Proces ten jest ściśle związany z obecnością tkanki naczyniowej w obszarze objętym przez nowotwór i przyległych do niego miejscach, która ułatwia znacznie mechanizm powstawania przerzutów.

Przemieszczanie się komórek nowotworowych poprzez otaczające je struktury możliwe jest dzięki osiągnięciu przez nie naczyń krwionośnych dochodzących do obszaru nowotworu, istniejących wcześniej lub powstałych w wyniku rozwoju nowych naczyń, i tym sposobem dostanie się do strumienia krwi (Ray J. M., Stetler-Stevenson WG.; Eur. Respir. J., 7(11):2062-72. 1994; Stetler-Stevenson W. G.. Liotta L. A., Kleiner D.E. Jr; FASEB J., 7(15):1434-41, 1993, Dec).

Istnienie łącznika między naczyniami limfatycznymi a krwionośnymi w obszarze naczyniowym nowotworu umożliwia komórkom rakowym przemieszczanie się w obu układach naczyniowych.

Ostatnie badania wykazały bezpośrednią zależność pomiędzy rozwojem naczyń a zapaleniem stawów (Koch A. E.; Arthritis and Reumatism 41:951-962, 1998). W szczególności, wykazano, że powstawanie nowych naczyń w tkance chrząstnej stawu odgrywa kluczową rolę w powstawaniu łuszczki w stawie i rozwoju zapalenia stawu. Normalna tkanka chrząstna nie posiada naczyń krwionośnych, natomiast płyn maziówkowy, pobrany od pacjentów cierpiących na zapalenie stawów, zawiera czynnik stymulujący rozwój naczyń, produkowany przez komórki śródbłonka (EASF).

Obecność tego czynnika związana jest z unaczynieniem i degradacją tkanki chrząstnej.

PL 205 925 B1

Również inne choroby związane są z nienormalnym rozwojem naczyń.

Odkryto, że w przypadku retynopatii cukrzycowej [Histol. Histopathol., 1999, Oct.; 14(4):1287-94], łuszczycy [Br J Dermatol., 1999. Dec; 141(6): 1054-60], przewlekłego zapalenia i stwardnienia tętnic [Planta Med.. 1998, Dec; 64(8):686-95], powstawanie nowych naczyń w zaatakowanej tkance jest czynnikiem sprzyjającym chorobie.

Czynnik wzrostu FGF-2 jest polipeptydem kationowym o masie 18kDa, zdolnym do indukowania zarówno rozwoju nowych naczyń in vivo, jak i proliferacji komórek, chemotaksji i produkcji proteaz w hodowli komórek ś ródbł onka (Basilico i Moscatelli, 1992, Adv. Cancer Res. 59:115-65).

Rola FGF-2 w rozwoju naczyń nowotworowych jest już znana (Pathol. Biol. (Paris) 1999, Apr.; 47(4):364-7).

W J. Pathol., 1999, Sept.; 189(1 ):72-8 doniesiono, ż e zwię kszona ekspresja FGF-2 u pacjentów cierpiących na międzybłoniak, związana jest z wyższą agresywnością i wyższą śmiertelnością pacjentów dotkniętych tego typu chorobami nowotworowymi.

W Oncogene, 1999. Nov.. 18;18(48):6719-24 wykazano, że FGF-2 nadaje właściwości powstawania przerzutów komórkom rakowym pęcherza szczura.

W Int. J. Cancer, 1999. May 5; 81(3):451-8 opisano, że FGF-2 posiada silną aktywność mitogenną i uczestniczy w rozwoju ludzkich nowotworów oraz w tworzeniu przerzutów.

Bardzo przydatna w leczeniu chorób nowotworowych jest, zatem, terapia skierowana przeciwko rozwojowi naczyń, która w porównaniu z standardowo stosowaną chemoterapią posiada następujące zalety (Cancer Research. 1998, 58, 1408-16):

1. Wyższa specyficzność: celem jest proces powstawania nowych naczyń w obszarze nowotworu;

2. Wyższa bioprzyswajalność: celem są komórki śródbłonka, łatwe do osiągnięcia, pozwala to uniknąć problemów związanych z tradycyjną chemoterapią działającą bezpośrednio na komórki rakowe;

3. Mniejsza chemooporność: jest to największa zaleta tej terapii; w istocie, polega na oddziaływaniu na genetycznie stabilne, w porównaniu z komórkami rakowymi, komórki śródbłonka, dla których pojawienie się oporności na leki jest nieprawdopodobne;

4. Mniej przerzutów: zablokowanie rozwoju nowych naczyń ogranicza namnażanie się komórek rakowych w innych częściach ciała, do których mogą dotrzeć poprzez strumień krwi;

5. Wzmożona apoptoza: blokada sieci naczyniowej w obszarze nowotworu obniża dostępność tlenu i substancji odżywczych dla komórek rakowych i w ten sposób nasila się proces apoptozy;

6. Obniżenie toksyczności układowej: efekt toksyczny, taki jak mielosupresja, efekty żołądkowojelitowe oraz przejściowe łysienie, pojawiające się podczas tradycyjnej chemioterapii, nie są obserwowane w przypadku terapii skierowanej przeciwko rozwojowi naczyń.

W celu określenia wspomnianych efektów. FGF-2 poddano reakcji z dwoma różnymi klasami receptorów, obecnymi na powierzchni komórek docelowych: z receptorami posiadającymi wysokie powinowactwo, obdarzonymi aktywnością kinaz tyrozynowych (FGFR) i receptorami o niskim powinowactwie, reprezentowanymi przez proteoglikan siarczanu eparanu (HSOG) (Johnson i Williams, 1993, Adv. Cancer Res., 60:1-41; Moscatelli, 1987, J. Cell. Physiol., 131:123-30).

FGF-2 jest silnym mitogenem dla komórek przyśrodkowych mięśnia gładkiego, koniecznym do ich proliferacji po uszkodzeniu związanym z zastosowaniem cewnika z balonikiem (J. Biol. Chem. 2000 Apr. 14;275(15): 11270-7).

Zatem, schorzenia wywołane zmienioną aktywacją czynnika wzrostu FGF-2 obejmują również rozrost komórek ściany mięśni tętnic, występujący podczas nawrotu zwężenia po zabiegu chirurgicznym naczyń lub „udrożnieniu przewodów wieńcowych” [J. Vasc. Surg., 1997, Feb.; 25(2):320-5].

Opanowanie zależnego od FGF-2 powstawania nowych naczyń stanowi jeden z podstawowych elementów kontroli i leczenia chorób związanych ze zmienionym rozwojem naczyń. Podobnie, kontrola zależnej od FGF-2, niekontrolowanej proliferacji fibroblastów lub SMC, jest krytycznym etapem w leczeniu bliznowacenia związanego z nadmierną odpowiedzią fibroblastów oraz nawrotu zwężenia po zabiegu chirurgicznym naczynia.

Dostępność nowego związku terapeutycznego, specyficznie inhibitującego aktywność biologiczną FGF-2, jest głównym celem zapobiegania i leczenia chorób związanych ze zmienioną aktywacją tego czynnika wzrostu. Schorzenia takie obejmują zapalenie stawu, nowotwór, przerzut nowotworowy, retynopatię cukrzycową, łuszczycę, przewlekłe zapalenie, miażdżycę tętnic, bliznowacenie związane z nadmierną odpowiedzią fibroblastów, nawrót zwężenia po zabiegu chirurgicznym naczynia.

PL 205 925 B1

PTX3 ulega ekspresji w różnych typach komórek (Botazzi i wsp., J. Biol. Chem., 1997, 272:32817-32823), szczególnie w fagocytach jednojądrzastych i komórkach śródbłonka, po wystawieniu na działanie zapalnych cytokin, interleukiny 1 β (IL-1 β) oraz czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α).

Biologiczna funkcja PTX3 nie została dotychczas w pełni poznana.

PTX3 zawiera dwie domeny strukturalne, domena N-końcowa nie pochodzi od jakiejkolwiek znanej cząsteczki, natomiast domena C-końcowa podobna jest do krótkiej pentraksyny, takiej jak białko C-reaktywne (CRP) (Breviario F. i wsp., J. Biol. Chem., 267:22190, 1992).

Wykazano istnienie istotnego stopnia podobieństwa pomiędzy ludzką PTX3 (hPTX3) a zwierzęcymi PTX3. W szczególności, mysia PTX3 (mPTX3) jest bardzo podobna do hPTX3 w zakresie sekwencji DNA oraz organizacji genu i jego lokalizacji. Stopień podobieństwa między ludzkim a mysim genem PTX3 wynosi 82% a wziąwszy pod uwagę substytucje konserwatywne, osiąga poziom 90% (Introna M. i wsp., Blood, 87 (1996), 1862-1872). Mysi gen PTX3 zlokalizowany jest na 3 chromosomie myszy, w regionie podobnym do ludzkiego regionu 3q (q24-28), co pozostaje zgodne z udokumentowanym położeniem hPTX3 w regionie 3q25 (Introna M. i wsp., Blood, 87 (1996), 1862-1872).

Wysoki stopień podobieństwa między sekwencjami hPTX3 a mPTX3 świadczy o zachowaniu silnie konserwatywnego charakteru pentraksyn w trakcie ewolucji (Pepys M.B., Baltz M.L., Adv. Immunol.. 34:141, 1983).

Praca przeglądowa na temat pentraksyn została opublikowana przez H. Gewurz i wsp., Current Opinion in Immunology. 1995. 7:54-64.

W międzynarodowym zgłoszeniu W099/32516, złożonym w imieniu Zgłaszającego, opisano zastosowanie długiej pentraksyny PTX3 do leczenia chorób nowotworowych, zapalnych i infekcyjnych. W aktywności przeciwrakowej PTX3, przedstawionej w W099/32516, uczestniczą leukocyty, tj., ma ona charakter immunologiczny. W W099/32516 nie opisano, ani nie zasugerowano zastosowania PTX3, jako użytecznego czynnika w leczeniu chorób związanych ze zmienioną aktywacją czynnika wzrostu FGF-2.

W US 5767252 przedstawiono czynnik wzrostu dla komórek neuronowych należący do rodziny pentraksyny (patrz również cytowane publikacje). Patent ten dotyczy dziedziny neurobiologii.

Odkryto, że długa pentraksyna PTX3 jest w stanie wiązać się z wysokim powinowactwem i specyficznością z FGF-2. Wiązanie PTX3 z FGF-2 (Kd = 8-16 nM) zapobiega wiązaniu tego ostatniego z jego receptorami kinazo-tyrozynowymi o wysokim powinowactwie i z receptorami o niskim powinowactwie, reprezentowanymi przez obecne na powierzchni komórki proteoglikany siarczanoeparanowe. Inhibicja wiązania powoduje zahamowanie aktywności biologicznej FGF-2.

Oddziaływanie pomiędzy FGF-2/PTX3 zależy, nie tylko od jego podstawowego charakteru, ale również od prawidłowej konformacji struktury czynnika wzrostu. Z tego powodu, PTX3 nie ulega wiązaniu z cytochromem C (białkiem o masie cząsteczkowej FGF-2 (18 kDa) i punkcie izoelektrycznym (pH 9,6)).

Ponadto. C-reaktywne białko, homologiczne z PTX3, nie wiąże się z FGF-2.

Zatem, celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie długiej pentraksyny PTX3 lub jej pochodnych, lub jej domen, do otrzymywania leku do zapobiegania i leczenia schorzeń niwelowanych poprzez inhibicję aktywności biologicznej czynnika wzrostu FGF-2.

Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie długiej pentraksyny lub jej pochodnych lub jej domen, do otrzymywania leku do zapobiegania i leczenia schorzeń wywołanych zmienioną aktywacją czynnika wzrostu FGF-2.

Dalszym celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie długiej pentraksyny lub jej pochodnych lub jej domen, do otrzymywania leku zapobiegającego i leczącego schorzeniom wywołanym zmienionym rozwojem naczyń, przy czym zmieniony rozwój naczyń spowodowany jest zmienioną aktywacją czynnika wzrostu FGF-2. Przykładem tego typu choroby jest: zapalenie stawu, przerzuty nowotworowe, retynopatia cukrzycowa, łuszczyca, przewlekłe zapalenie, miażdżyca tętnic lub nowotwór, przy czym nowotworem jest mięsak, rak, rakowiak, nowotwór kości i nowotwór neurowewnątrzwydzielniczy.

Innym celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie długiej pentraksyny lub jej pochodnych lub jej domen, do otrzymywania leku zapobiegającego i leczącego schorzenia związane z niekontrolowaną, zależną od FGF-2, proliferacją fibroblastów lub komórek mięśni gładkich, tak jak bliznowacenie związane z nadmierną odpowiedzią fibroblastów oraz nawrót zwężenia po zabiegu kształtującym naczynia.

PL 205 925 B1

Związek, według oczekiwanej realizacji wynalazku, jest odpowiedni do zastosowania do inhibicji aktywności FGF-2 w komórkach docelowych, nie tylko, gdy dostarczany jest w postaci rekombinowanego białka, lecz również, gdy dostarczany jest endogennie, w konsekwencji przeniesienia genu lub jego cDNA.

Zatem, kolejnym celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie pełnej długości cDNA ludzkiej PTX3 lub jej pochodnej lub jej domeny, do otrzymywania plazmidowych lub wirusowych wektorów ekspresji, zawierających wspomniany cDNA, i zastosowanie ich w terapii genowej chorób wywołanych zmienioną aktywacją czynnika wzrostu FGF-2, przy czym choroby te obejmują, na przykład, raka, przerzuty nowotworowe, bliznowacenie związane z nadmierną odpowiedzią fibroblastów oraz nawrót zwężenia po zabiegu chirurgicznym kształtującym naczynia.

Terminem „długa pentraksyna PTX3” określa się jakąkolwiek długą pentraksynę PTX3, niezależnie od źródła jej pochodzenia (ludzkie lub zwierzęce, również syntetyczne).

Termin „pochodne” dotyczy jakichkolwiek funkcjonalnych analogów długiej pentraksyny PTX3, według powyższej definicji, zawierających przynajmniej jedną mutację, zachowującą jej zdolność funkcjonalną do selektywnej inhibicji FGF-2.

Korzystnie, długa pentraksyna jest ludzką PTX3, której sekwencja została opisana w W099/-32516.

Opisywana długa pentraksyna PTX3 może być również zastosowana w połączeniu z jednym lub więcej lekiem przeciwrakowym w celu leczenia chorób nowotworowych, w których zwiększona ekspresja FGF-2 wyzwala wyższą agresywność choroby nowotworowej lub wyższą zdolność do przerzutów.

W istocie, wiadomo, że aby uniknąć niechcianych skutków ubocznych, przy zachowaniu tej samej skuteczności terapeutycznej, większość pacjentów onkologicznych traktowanych jest, nie pojedynczym lekiem przeciwrakowym, ale kombinacją kilku związków przeciwrakowych w połączeniu ze związkami skierowanymi przeciwko rozwojowi naczyń.

Mechanizm działania większości leków przeciwrakowych jest całkowicie inny niż mechanizm działania związku według wynalazku. W istocie, leki przeciwrakowe są zazwyczaj cytotoksyczne vs komórek rakowych.

Związek według oczekiwanej realizacji wynalazku, posiadający odmienny mechanizm działania, powinien wywierać efekt leczniczy (efekt adiuwanta), dodatkowo, oprócz efektu wywieranego przez lek przeć i wrakowy, z którym jest związany.

Kolejnym celem opisywanego wynalazku jest, zatem, kombinacja długiej pentraksyny PTX3 z jednym lub więcej ze znanych leków przeciwrakowych.

Innym celem przedstawianego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca długą pentraksynę PTX3 w połączeniu z jednym lub więcej ze znanych leków przeciwrakowych, takich jak związki alkilujące, inhibitory topoizomerazy, czynniki przeciwtubulinowe, związki interkalatujące, antymetabolity, produkty naturalne, takie jak alkaloidy vinca, epipodofilotoksyny, antybiotyki, enzymy, taksany i związki cytoróżnicujące, oraz jedną lub więcej zaróbek lub podłoża dopuszczalne farmakologicznie.

Dalszym celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie długiej pentraksyny PTX3, w połączeniu z jednym lub więcej ze znanych związków przeciwrakowych, do otrzymywania leku do leczenia nowotworu, dla którego zwiększona ekspresja FGF-2 wywołuje wyższą agresywność choroby nowotworowej.

Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie długiej pentraksyny PTX3, w połączeniu z jednym lub więcej ze znanych związków przeciwrakowych, do otrzymywania leku do zapobiegania pojawienia się przerzutów raka, w przypadku, których zwiększona ekspresja FGF-2 wywołuje wyższą zdolność do przerzutów.

Innym celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie długiej pentraksyny PTX3, w połączeniu z jednym lub więcej ze znanych związków przeciwrakowych, do otrzymywania leku do leczenia nowotworu, charakteryzujące się tym, że długa pentraksyna PTX3 obecna jest jako adiuwant związku przeciw rakowego.

Nieoczekiwanie, większość określonych powyżej celów zostało zrealizowane w niniejszym wynalazku, którego istotne cechy zostały zdefiniowane poniżej. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie długiej pentraksyny PTX3 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia chorób wywołanych niekontrolowaną proliferacją fibroblastów lub komórek mięśni gładkich, wybranych spośród: bliznowacenia związanego z nadmierną odpowiedzią fibroblastów i nawrotu zwężenia po angioplastyce naczyń

PL 205 925 B1 lub chorób wywołanych zmienionym rozwojem naczyń, wybranych spośród: retynopatii cukrzycowej i miażdżycy tętnic. Korzystnie długa pentraksyna PTX3 jest PTX3 obecną w naturze. Równie korzystnie długa pentraksyna PTX3 jest ludzką lub jest PTX3 pochodzącą ze źródła syntetycznego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cDNA kodującego długą pentraksynę PTX3 do wytwarzania wektora ekspresyjnego zawierającego wspomniany cDNA do wytwarzania leku do terapii genowej chorób wywołanych niekontrolowaną proliferacją fibroblastów lub komórek mięśni gładkich, wybranych spośród: bliznowacenia związanego z nadmierną odpowiedzią fibroblastów i nawrotu zwężenia po angioplastyce naczyń lub chorób wywoł anych zmienionym rozwojem naczyń , wybranych spośród: retynopatii cukrzycowej i miażdżycy tętnic. Korzystnie wspomniany cDNA, zawierający gen kodujący PTX3, zawarty jest w wektorze plazmidowym lub wirusowym.

Wynalazek zilustrowano następującymi przykładami.

P r z y k ł a d 1

Zdolność PTX3 do wiązania FGF w roztworze

Eksperyment ten przeprowadzono w celu oszacowania wiązania PTX3 z FGF-2. PTX3 otrzymano zgodnie z opisem wg Bottazzi i wsp., 1997, J. Biol. Chem. 272:32817-32823. Ludzki, rekombinowany FGF-2 uzyskano według opisu Isacchi A. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1991). 88:2628-32. FGF-2 znakowano ¹²⁵I, gdy wymagały tego warunki doświadczenia, postępując według metody Isacchi i wsp., (patrz poniżej). Przebieg doświadczenia:

100 μΐ PBS zawierającego 1 μg FGF-2 (lub alternatywnie, 1 μg PTX3) poddawano chromatografii na kolumnie z Superozą 12 (Pharmacia): kolumna ta pozwala na rozdzielenie białek na podstawie ich masy cząsteczkowej. Kolumnę wymywano PBS przy prędkości przepływu równej 1 ml/minutę, zbierano 1 ml frakcje i analizowano techniką dot-blot przy użyciu przeciwciał swoistych wobec dwóch białek. W celu oszacowania wiązania PTX3 z FGF-2, dwa białka (odpowiednio. 5 g i 1 μg) mieszano w 100 μΐ PBS i inkubowano w 4°C przez 10 min przed nałożeniem na kolumnę. Frakcje zbierano i analizowano stosując dot-blot z przeciwciałami swoistymi wobec FGF-2. Wyniki zamieszczono na figurze 1. Wykazano, że FGF-2 (18,000 D) ulega wymyciu z kolumny przy całkowitej objętości (retencji) kolumny, w przybliżeniu. 22 ml. W tych samych warunkach, PTX3 (450,000 D) wymywana jest przy objętości swobodnej kolumny (7 ml). Gdy FGF-2 inkubowany był wstępnie, przed nałożeniem na kolumnę, z PTX3 przez 10 min w 4°C, obserwowano zmianę jego właściwości chromatograficznych: w takich warunkach doświadczalnych, FGF-2 był wymywany z kolumny z objętością retencji równą objętości odpowiadającej samej PTX3.

P r z y k ł a d 2

Zdolność biotynylowanej PTX3 do wiązania immobilizowanego na plastikowych płytkach FGF-2

100 μl NaHCO₃ o pH 9.6, zawierające 500 ng FGF-2 lub składnika dopełniacza Clq inkubowano przez 18 godzin, w 4°C na 96-studzienkowych plastikowych płytkach. Po zakończeniu inkubacji, studzienki trzykrotnie przemywano PBS, a następnie inkubowano przez 2 godz. w temperaturze pokojowej z 200 μl PBS, zawierającymi 1 mg/ml albuminy surowicy krwi wołowej (BSA). Po inkubacji, studzienki przemywano trzykrotnie PBS i inkubowano z 30 ng/ml ¹²⁵I-FGF-2 w obecności wzrastających stężeń biotynylowanej PTX3 w 100 μl PBS (2 godz. w temperaturze pokojowej). Alternatywnie, studzienki były pokrywane wzrastającymi stężeniami dawek FGF-2 lub Clq i inkubowane z 100 ng/ml biotynylowanej PTX3 w 100 μl PBS. Po inkubacji, studzienki trzykrotnie przemywano PBS i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej z 100 μl koniugatu streptawidyny HRP (1/2000). Reakcję rozwijano poprzez dodanie do mikrostudzienki substratu z zestawia ABTS, peroksydazy chromogenu (Kirkegaard & Perry Laboratories). Odczytu płytek dokonywano automatycznie, przy użyciu czytnika ELISA przy 405 nm. Wyniki przedstawiono na figurze 2. Wykazano, że immobilizowany na plastikowych studzienkach FGF-2 jest zdolny do wiązania biotynylowanej PTX3 w podobny sposób, jak fizjologiczny ligand Clq PTX3 (Bottazzi B. i wsp., 1997, J. Biol. Chem. 272:32817-32823).

P r z y k ł a d 3

Charakterystyka oddziaływania PTX3-FGF-2

96-studzienkowe płytki pokrywano w 4°C 100 μl NaHCO₃ o pH 9,6, zawierającymi PTX3 lub C reaktywne białko (200 nM) lub alternatywnie, 2 μg/ml następujących białek zastosowanych jako kontrola negatywna: albumina surowicy wołowej, fibronektyna, żelatyna lub lamina. Po inkubacji, studzienki przemywano trzykrotnie PBS i blokowano przez 2 godz. w temp. pokojowej 200 μl 1 mg/ml BSA w PBS. Po inkubacji, studzienki trzykrotnie przemywano PBS, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej z 30 ng ¹²⁵I-FGF-2 przez 2 godz. Następnie, studzienki przemywano 3 razy PBS i związany ¹²⁵I-FGF-2 odzyskiwano poprzez dwukrotne przemycie każdej studzienki 200 μl 2% SDS

PL 205 925 B1 w wodzie. Poziom ¹²⁵I-FGF-2 mierzono stosując czytnik gamma. Wyniki przedstawiono na figurze 3. Wykazano, że FGF-2 wiąże się z immobilizowaną na plastiku PTX3, i że wiązanie to jest specyficzne, ponieważ FGF-2 reaguje słabo z CRP i nie reaguje z innymi immobilizowanymi białkami.

P r z y k ł a d 4

Wiązanie ¹²⁵I-FGF-2 z immobilizowaną na plastiku PTX3 w obecności nadmiaru surowego nieaktywnego FGF-2

W drugiej serii eksperymentów, badano wiązanie ¹²⁵I-FGF-2 z immobilizowaną na plastiku PTX3, w obecności nadmiaru zarówno natywnego, jak i nieaktywnego, zdenaturowanego cieplnie FGF-2 (100 nM), w obecności podobnych stężeń cytochromu C lub w obecności nadmiaru rozpuszczalnej PTX3 (300 nM). Eksperyment przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem: Wyniki zamieszczono na figurze 4. Wykazano, że nieaktywny FGF-2 i rozpuszczalna PTX3 inhibitują oddziaływania między ¹²⁵I-FGF-2 a immobilizowaną na plastiku PTX3. Obserwacja, że inaktywowany cieplnie FGF-2 i cytochrom C (o takiej samej masie cząsteczkowej i punkcie izoelektrycznym jak FGF-2) nie są zdolne do wiązania PTX3 świadczy o tym, że na zdolność wiązania PTX3 wpływa raczej prawidłowa konformacja czynnika wzrostu, niż jego podstawowe właściwości.

P r z y k ł a d 5

Stała dysocjacji (Kd) oddziaływania FGF-2/PTX3

W eksperymencie określono stałą dysocjacji (Kd) oddziaływania FGF-2/PTX3. W tym celu, inkubowano rosnące dawki ¹²⁵I-FGF-2 z immobilizowaną na plastiku PTX3 i analizowano wyniki wiązania stosując metodę Scatchard plot. Wyniki przedstawiono na figurze 5. Wykazano, że FGF-2 wiąże PTX3 w sposób zależny od stopnia nasycenia i z podwyższonym powinowactwem (Kd = 8-16 nM). Powinowactwo to jest podobne do powinowactwa wcześniej obliczonego dla oddziaływania PTX3 z jej fizjologicznym ligandem Clq.

P r z y k ł a d 6

Wpływ PTX3 na wiązanie FGF-2 z komórkami śródbłonka

Transformowane komórki śródbłonka płodowej aorty wołowej, GM7373, zaszczepiano na poziomie 80,000 komórek/cm² na 24-studzienkowych płytkach w minimalnym podstawowym podłożu Eagle'sa (Eagle's MEM), zawierającym 10% FCS. Po 24 godz. w 37°C przylegające do płytki komórki przemywano dwukrotnie podłożem Eagle'sa MEM, nie zawierającym FCS, a następnie inkubowano przez 2 godz. w 4°C z ¹²⁵I-FGF-2 (10 ng/ml) w podłożu Eagle'sa MEM, zawierającym 0,15% żelatyny i 20 mM HEPES o pH 7,5, przy braku lub w obecności wzrastających stężeń PTX3. Po inkubacji, oszacowano ilość ¹²⁵I-FGF-2, jaka związana była z receptorami o niskim (HSPG) i wysokim powinowactwie (FGFR), zgodnie z opisem Moscatelli. 1987, J. Cell. Physiol. 131:123-30. W skrócie, komórki przemywano dwa razy 2 M NaCl w 20 mM buforze HEPES (pH 7,5) w celu usunięcia ¹²⁵I-FGF-2 związanego z miejscami o niskim powinowactwie i dwukrotnie 2 M NaCl w 20 mM octanie sodu (pH 4,0), w celu usunięcia ¹²⁵I-FGF-2 związanego z miejscami o wysokim powinowactwie. Wiązanie niespecyficzne mierzone było w obecności 100-krotnego nadmiaru molarnego nieznakowanego FGF-2 i dla wszystkich stężeń. Wyniki zamieszczono na figurze 6 pokazując, że PTX3 jest zdolna do inhibitowania, w sposób niezależny od dawki wiązania, wiązania FGF-2 z jego receptorami o wysokim i niskim powinowactwie na komórkach śródbłonka.

P r z y k ł a d 7

Wpływ PTX3 na aktywność mitogenną wywieraną przez FGF-2 na komórki śródbłonka

Komórki GM 7373 zaszczepiano na poziomie 75,000 kom./cm² na 48-studzienkowej płytce w podłożu Eagle'a, zawierającym 10% FCS. Po 24 godz. w 37°C przylegające komórki przemywano dwukrotnie podłożem Eagle'sa bez FCS, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, w podłożu Eagles'a MEM, zawierającym 0,4% FCS przy braku lub w obecności FGF-2 (10 ng/ml) i wzrastających stężeń PTX3. Po inkubacji, komórki trypsynizowano i zliczano. W oddzielnych seriach eksperymentów komórki GM 7373 traktowano jak opisano wyżej, w obecności różnych bodźców mitogennych:

10% FCS; 5 μg/ml diacykloglicerolu (DAG); 10 ng/ml estru forbolu (TPA) 30 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka (EGF) lub 30 ng/ml czynnika wzrostu naczyń śródbłonka (VEGF). Wyniki zademonstrowano na fig. 7, wykazując, że PTX3 inhibituje aktywność mitogenną wywieraną na komórki śródbłonka przez FGF-2, w sposób zależny od dawki, z wartością ID50 równą 30 nM. Wartość ta jest podobna do Kd obliczonej dla oddziaływania FGF-2-PTX3. Wyniki te wskazują, że inhibicja aktywności biologicznej

FGF-2 przez PTX3 wynika z jego zewnątrzkomórkowej sekwestracji. Aktywność inhibitorowa PTX3 na FGF-2 jest specyficzna, zatem nie wykrywalna, gdy inne mitogeny stosowane są do indukowania proliferacji komórkowej.

PL 205 925 B1

P r z y k ł a d 8

Wpływ PTX3 na proliferację transformowanych płodowych komórek śródbłonka aorty wołowej

W doświadczeniu tym badano wpływ PTX3 na proliferację linii komórkowej śródbłonka aorty myszy MAE3F2T. stabilnie transfekowanych wektorem ekspresji kodującym FGF-2 (Gualandris i wsp.. 1996, Celi Growth Diff, 7:147-60). Komórki te mogą proliferować w odpowiedzi na stymulację autowydzielniczej pętli, indukowanej przez endogenny FGF-2 (Gualandris i wsp., 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60). Komórki MAE3F2T zaszczepiano na poziomie 10,000/cm² na 48-studzienkowych płytkach w podłożu Dulbecco (DMEM), wzbogaconym 10% FCS. Po 24 godz. w 37°C, przylegające komórki przemywano dwukrotnie DMEM bez FCS i inkubowano przez 72 godz. w 37°C w DMEM zawierającym 0,4% FCS w obecności lub braku PTX3 (70 nM), swoistych przeciwciał wobec FGF-2 lub suraminy (50 μg/ml). Suramina jest znana ze względu na jej zdolność do sekwestracji zewnątrzkomórkowego FGF-2 i inhibicji jego funkcji biologicznych (Rusnati i wsp.. 1996. Mol. Biol. Cell. 7:369-381). Po inkubacji, komórki trypsynizowano i zliczano w komorze Burker'a. Wyniki przedstawiono na figurze 8, wskazując, że PTX3 jest zdolna do blokowania stymulacji pętli autowydzielniczej, indukowanej przez FGF-2 w komórkach MAE3F2T. PTX3 inhibituje zależną od FGF-2 proliferację komórek, w sposób podobny do wywieranego przez przeciwciała swoiste wobec FGF-2 i suraminę.

P r z y k ł a d 9

Wpływ PTX3 na rozwój nowych naczyń indukowany in vivo przez FGF-2

Potencjał aktywności PTX3, skierowanej przeciwko rozwojowi naczyń szacowano in vivo w analizie błony płodowej omoczniowej embrionu kurczaka (CAM). W skrócie, nakłuwano skorupkę jaja kurzego 3 dni po zapłodnieniu. Po 8 dniach, nakładano na CAM żelatynowe gąbki wchłanialne i adsorbowano z 10 μl samego PBS lub zawierającego FGF-2 (500 ng/gąbkę) przy braku lub w obecności PTX3 (5 μg/gąbkę) (5-6 embrionów na grupę). Po 4 dniach, dokonano obserwacji CAM in ovo pod stereomikroskopem Zeiss SR. Dwóch nieznających badane próby sędziów oceniało punktowo odpowiedź angiogenną i wyrażało w stopniach w skali arbitralnej 0-4+, przy czym 0 oznaczało brak odpowiedzi angiogennej i 4+ odpowiadało najsilniejszej aktywności.

Wyniki przedstawiono na figurze 9, wskazując, że PTX3 jest zdolna do blokowania rozwoju nowych naczyń, indukowanego in vivo przez FGF-2.

P r z y k ł a d 10

Terapia genowa z zastosowaniem PTX3

Mysie komórki śródbłonka nadekspresjonujące FGF-2, zwane FGF2MAE3F2T (Gualandris i wsp., 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60) transfekowano pełnej długości cDNA ludzkiej PTX3, subklonowanym w handlowo dostępnym wektorze ekspresyjnym pLXSH (Clontech).

Badania in vitro na liniach transfekowanych komórek przeprowadzono w celu określenia wpływu nadprodukcji PTX3 na zależną od FGF-2 proliferację komórek FGF2MAE3F2T i ich charakter inwazyjny na 3-wymiarowym żelu fibrynowym.

Szczegółowo, kilka klonów FGF2MAE3F2T ekspresjonujących na różnym poziomie PTX3 i rodzicielskie komórki FGF2MAE3F2T (te, które nie produkują PTX3) zaszczepiano na poziomie 10,000/cm² na 48-studzienkowych płytkach, w podłożu Dulbecco (DMEM), wzbogaconym o 10% FCS. Po 24 godz. w 37°C, przylegające komórki przemywano dwukrotnie DMEM bez FCS i inkubowano w różnych przedziałach czasu w 37°C, w DMEM zawierającym 0,4% FCS. Po zakończeniu inkubacji komórki trypsynizowano i zliczano w komorze Burkera. Wyniki przedstawiono na figurze 10, wykazując, że nadekspresja PTX3 inhibituje proliferację komórek FGF2MAE3F2T oraz, że zakres tej inkubacji jest skorelowany z ilością PTX3 wyprodukowaną przez różne testowane komórki.

W celu oszacowania inwazyjnego charakteru klonów FGF2MAE3F2T nadekspresjonujących PTX3 na trójwymiarowych żelach fibrynowych, otrzymywano agregaty komórkowe na płytkach pokrytych agarową, dokładnie według opisu (Gualandris i wsp., 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60). Agregaty te zaszczepiano na pokrytych fibryną 48-studzienkowych płytkach. Natychmiast po zaszczepieniu, dodawano do każdej studzienki 250 l nie zawierającego wapnia podłoża z fibrynogenem (2,5 mg/ml) i trombiny (250 mU/ml) i pozostawiano żel na 5 min w 37°C. Następnie, na górną część żelu dodawano 500 1 podłoża hodowlanego. We wszystkich eksperymentach, w celu zapobiegnięcia rozpuszczania substratu, dodawano inhibitora fibrynolitycznego, trazylolu do żelu i podłoża hodowlanego na poziomie 200 KlU/ml. Tworzenie promieniście rosnących komórek szacowano po 2 dniach na podstawie analizy obrazu komputerowego.

PL 205 925 B1

Wyniki przedstawiono na figurze 11. Wykazano, że zdolność inwazyjna PTX3 nadekspresjonujących PTX3 klonów FGF2MAE3F2T jest znacznie niższa, niż odpowiadająca rodzicielskim komórkom FGF2MAE3F2T.

Uzyskane wyniki wskazują, że PTX3 inhibituje aktywność FGF-2 w komórkach śródbłonka, gdy jest ona endogennie produkowana po przeniesieniu kodującego ją cDNA.

Zatem, składnik według wynalazku może być zastosowany w terapii genowej według znanych metod (In vivo. 1998. Jan-Feb; 12(1):59-67; In vivo. 1998, Jan-Feb; 12(1):35-41; In vivo. 1994 NovDec; 8(5):771-80) do leczenia chorób wywołanych zmienioną aktywacją czynnika wzrostu FGF-2.

Claims

1. Zastosowanie długiej pentraksyny PTX3 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia chorób wywołanych niekontrolowaną proliferacją fibroblastów lub komórek mięśni gładkich, wybranych spośród: bliznowacenia związanego z nadmierną odpowiedzią fibroblastów i nawrotu zwężenia po angioplastyce naczyń lub chorób wywołanych zmienionym rozwojem naczyń, wybranych spośród: retynopatii cukrzycowej i miażdżycy tętnic.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że długa pentraksyna PTX3 jest PTX3 obecną w naturze.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że długa pentraksyna PTX3 jest ludzką.

PTX3.

4. Zastosowanie, według zastrz. 1, znamienne tym, że długa pentraksyna PTX3 jest PTX3 pochodzącą ze źródła syntetycznego.

5. Zastosowanie cDNA kodującego długą pentraksynę PTX3 do wytwarzania wektora ekspresyjnego zawierającego wspomniany cDNA do wytwarzania leku do terapii genowej chorób wywołanych niekontrolowaną proliferacją fibroblastów lub komórek mięśni gładkich, wybranych spośród: bliznowacenia związanego z nadmierną odpowiedzią fibroblastów i nawrotu zwężenia po angioplastyce naczyń lub chorób wywołanych zmienionym rozwojem naczyń, wybranych spośród: retynopatii cukrzycowej i miażdżycy tętnic.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że wspomniany cDNA, zawierający gen kodujący PTX3, zawarty jest w wektorze plazmidowym lub wirusowym.