PL205966B1 - Ciągła amniocytarna linia komórkowa, sposób jej wytwarzania, zastosowanie amniocytów, zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego, zastosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej i sposób wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowych - Google Patents
Ciągła amniocytarna linia komórkowa, sposób jej wytwarzania, zastosowanie amniocytów, zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego, zastosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej i sposób wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowychInfo
- Publication number
- PL205966B1 PL205966B1 PL357495A PL35749500A PL205966B1 PL 205966 B1 PL205966 B1 PL 205966B1 PL 357495 A PL357495 A PL 357495A PL 35749500 A PL35749500 A PL 35749500A PL 205966 B1 PL205966 B1 PL 205966B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- adenoviral
- vectors
- cell line
- cells
- gene
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 250
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 165
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 69
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 title claims description 56
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 45
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 369
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 claims description 108
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 75
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 54
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 32
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 29
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 27
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 claims description 22
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 22
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 17
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 230000010415 tropism Effects 0.000 claims description 9
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 108010087905 Adenovirus E1B Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 108010057856 Adenovirus E2 Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 50
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 43
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 39
- 230000006870 function Effects 0.000 description 34
- 239000000047 product Substances 0.000 description 34
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 31
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 22
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 18
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 18
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 17
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 16
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 15
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 7
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 4
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 3
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 3
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150066038 E4 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 2
- 108010059343 MM Form Creatine Kinase Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101710198224 Ornithine carbamoyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 101150029409 CFTR gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000696272 Gull adenovirus Species 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 241000709727 Human poliovirus 3 Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008934 Muscle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074084 Muscle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101150057876 OTC gene Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 101710173835 Penton protein Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 208000016624 Retinal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002390 cell membrane structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N gastrin-releasingpeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 102000008371 intracellularly ATP-gated chloride channel activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 102000034272 protein filaments Human genes 0.000 description 1
- 108091005974 protein filaments Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 244000057424 walen Species 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
- C12N2810/405—Vectors comprising RGD peptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
- C12N2810/6018—Adenoviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Manufacturing Of Steel Electrode Plates (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są ciągła amniocytarna linia komórkowa, sposób jej wytwarzania, zastosowanie amniocytów, zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego, zastosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej i sposób wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowych.
Adenowirusy
Adenowirusy są stosunkowo jednorodną grupą wirusów, charakteryzującą się ikozaedralnym kapsydem, który składa się głównie z kodowanych przez wirusa białek heksonu, pentonu i włókna oraz genomu z liniowego, dwuniciowego DNA o wielkości około 36 tysięcy par zasad (kb). Genom wirusowy zawiera na końcach sekwencje odwróconych powtórzeń terminalnych (ITR), które zawierają wirusowe miejsce początku replikacji. Ponadto, na lewym końcu genomu znajduje się sygnał upakowywania, który jest konieczny do upakowywania genomu wirusowego do kapsydów wirusowych podczas cyklu infekcyjnego. Adenowirusy wyizolowano z wielu gatunków. W oparciu o parametry, które pozwalają na rozróżnienie pomiędzy różnymi serotypami, takie jak hemaglutynacja, rakotwórczość i homologia sekwencji DNA (Wigand i in., w: Adenovirus DNA, Doerfler, red., Martinus Nijoff Publishing, Boston, str. 408-441, 1986) stwierdzono, że istnieje ponad 40 różnych serotypów ludzkich. Dotąd wektory adenowirusowe zazwyczaj otrzymuje się z serotypów 2 (Ad2) i 5 (Ad5). Infekcje Ad2 i Ad5 są endemiczne u ludzi. Ad2 i Ad5 nie są onkogenne u ludzi i ich bezpieczeństwo jest dobrze udokumentowane, ponieważ z powodzeniem i bez komplikacji prowadzono szczepienia personelu wojskowego w USA (Pierce i in., Am. J. Epidemiol. 87, 237-246, 1968). Biologia adenowirusów jest stosunkowo dobrze poznana, ponieważ adenowirusy odgrywają zasadniczą rolę w biologii molekularnej jako narzędzie doświadczalne do wyjaśniania różnych fundamentalnych procesów biologicznych, takich jak replikacja DNA, transkrypcja, cięcie i składanie RNA i transformacja komórkowa. Cząstki adenowirusowe wnikają do komórki podczas infekcji poprzez endocytozę za pośrednictwem receptorów, w której, zgodnie z obecnym poglądem, oddziaływanie domeny głowy białka włókna z receptorem wirusów coxsackie i adenowirusów (CAR) bierze udział w adhezji cząstek wirusowych na powierzchni komórkowej (Bergelson i in., Science 275, 1320-1323, 1997). Na drugim etapie zachodzi internalizacja cząstki wirusowej, w której zasadniczą rolę odgrywa oddziaływanie podstawy pentonu z integrynami (Wickham i in., Cell 73, 309-319, 1993). Po wniknięciu cząstki do komórki, genom wirusowy wchodzi do jądra komórkowego w postaci kompleksu DNA-białko. Cykl infekcji adenowirusowej dzieli się na fazę wczesną i późną, rozdzielone początkiem replikacji adenowirusowej (Shenk, w: Virology, Fields, red., Lippincott-Raven Publishing, Filadelfia, str. 2111-2148, 1996). W fazie wczesnej zachodzi ekspresja wczesnych funkcji wirusowych E1, E2, E3 i E4. Faza późna charakteryzuje się transkrypcją genów późnych, które są odpowiedzialne za ekspresję strukturalnych białek wirusowych i tworzenie nowych cząstek wirusowych.
E1A jest pierwszym genem wirusowym, eksprymowanym przez chromosom wirusowy po osiągnięciu jądra komórkowego. Gen E1A koduje białka 12S i 13S, które powstają poprzez alternatywne składanie eksonów RNA E1A. Białka E1A aktywują transkrypcję licznych genów komórkowych i wirusowych dzięki oddziaływaniom z czynnikami transkrypcyjnymi. Głównymi funkcjami E1A są a) aktywacja innych wczesnych funkcji wirusowych E1B, E2, E3 i E4 oraz b) pobudzanie komórek spoczynkowych do wejścia w fazę S cyklu komórkowego. Ekspresja samego E1A prowadzi do programowanej śmierci komórkowej (apoptozy).
E1B jest jednym z wczesnych genów wirusowych aktywowanych przez E1A. Gen E1B koduje białko 55 kD protein E1B i białko 19 kD E1B, które powstają w wyniku alternatywnego składania eksonów RNA E1B. Białko 55 kD moduluje przebieg cyklu komórkowego dzięki oddziaływaniu z genem supresora nowotworów p53, uczestniczy w zapobieganiu transportu komórkowego mRNA w późnej fazie infekcji oraz zapobiega pobudzanej E1A apoptozie komórek. Prawdopodobnie w zapobieganiu pobudzanej E1A apoptozie komórek ważne jest białko 19 kD E1B.
Wszystkie adenowirusy ludzkie są zdolne do transformowania komórek gryzoni w hodowli komórkowej. Z zasady do transformacji nowotworowej konieczna jest koekspresja E1A i E1B.
Gen białka IX, który koduje strukturalny składnik kapsydu wirusowego, jest zawarty w jednostce transkrypcyjnej E1B.
Geny E2A i E2B kodują różne białka, które mają zasadnicze znaczenie w replikacji genomu wirusowego. Obejmują one białko prekursorowe białka terminalnego (pTP), polimerazę DNA (Pol) oraz białko wiążące jedną nić (SSBP). Podczas replikacji, pTP wiąże się z ITR genomu wirusowego. Działa
PL 205 966 B1 ono jako białkowy starter replikacji DNA, którą rozpoczyna Pol wraz z czynnikami komórkowymi. Pol, SSBP i komórkowy czynnik NFII, oraz przypuszczalnie inne czynniki, konieczne są do wydłużania łańcucha DNA.
E4 koduje różne białka. Między innymi, białko 34 kD E4 blokuje, wraz z białkiem 55 kD E1B 55 kD, akumulację komórkowych mRNA w cytoplazmie, a jednocześnie ułatwia transport wirusowych RNA z jądra komórkowego do cytoplazmy.
Po rozpoczęciu replikacji genomu wirusowego zachodzi ekspresja wirusowych białek strukturalnych, które są konieczne do utworzenia kapsydu wirusowego i do utworzenia kompleksu wirusowego DNA z kodowanymi przez wirusa białkami wiążącymi DNA. Jest oczywiste, że początkowo powstaje pusty kapsyd, do którego następnie wnika genom wirusowy. Do tego procesu konieczny jest element występujący cis w genomie wirusowym, tak zwany sygnał upakowywania, który jest położony na lewym końcu genomu wirusowego i, w przypadku Ad5, rozciąga się w regionie od 260 pary zasad do 460 pary zasad (Hearing i in., J. Virol. 62, 2555-2558, 1987; Graeble i Hearing, J. Virol. 64, 20472056, 1990). Sygnał upakowywania zachodzi na sekwencję wzmacniającą E1A, która ma zasadnicze znaczenie dla aktywności promotora E1A. Dokładny mechanizm upakowywania genomu wirusowego w kapsydzie wirusowym nie jest jasny, ale jest prawdopodobne, że konieczne są do tego oddziaływania białek komórkowych i/lub wirusowych z sygnałem upakowywania.
Wektory adenowirusowe
Wektory adenowirusowe są szczególnie ważne jako wektory ekspresyjne, zwłaszcza w celu terapii genowej. Jest tak z kilku powodów: biologię adenowirusów dokładnie zbadano. Cząstki wirusowe są stabilne i można je wytwarzać w stosunkowo prosty sposób i w wysokich mianach. Genetyczne manipulowanie genomem adenowirusowym jest łatwe. Wektory adenowirusowe są zdolne do wydajnej transdukcji komórek, w których zachodzi i w których nie zachodzi replikacja in vitro i in vivo.
a) Wektory adenowirusowe pierwszej generacji
Pierwsza generacja wektorów adenowirusowych (Gilardi i in., FEBS Letters 267, 60-62, 1990; Stratford-Perricaudet i in., Hum. Gene Ther. 1, 241-256, 1990) charakteryzuje się delecjami genów E1A i E1B. E1A i E1B mają właściwości transformujące i transaktywujące. Ponadto, E1A jest konieczny do aktywowania genów wirusowych, a E1B jest konieczny do akumulacji transkryptów wirusowych. W niektórych wektorach wydeletowany jest ponadto E3, w celu zwię kszenia zdolnoś ci pobierania obcego DNA. E3 nie jest konieczny do wytwarzania adenowirusów w hodowli komórkowej. Zdolność do pobierania obcego DNA wynosi około 8 kb. Wektory adenowirusowe pierwszej generacji wytwarzano dotąd głównie w komórkach 293 (patrz poniżej), które komplementują brak E1A i E1B w wektorach.
b) Wektory wirusowe drugiej generacji
Wektory adenowirusowe drugiej generacji charakteryzują się, poza delecjami E1A i E1B, delecjami E2 i/lub E4 in (Engelhardt i in., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 6196-6200, 1994; Yang i in., Nature Genet., 7, 362-367, 1994; Gorziglia i in., J. Virol. 70, 4173-4178, 1996; Krougliak i Graham, Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586, 1995; Zhou i in., J. Virol. 70, 7030-7038, 1996). W niektórych wektorach wydeletowano ponadto E3 w celu zwiększenia zdolności do pobierania obcego DNA. Wektory adenowirusowe drugiej generacji opracowano w celu dalszego obniżenia transkrypcji genów wirusowych i ekspresji biał ek wirusowych oraz w celu dalszego zmniejszenia zatem przeciwwirusowej odpowiedzi immunologicznej. Zdolność do pobierania obcego DNA jest nieznacznie zwiększona w porównaniu z wektorami adenowirusowymi pierwszej generacji. Wektory adenowirusowe drugiej generacji wytwarza się w liniach komórkowych, które komplementują, poza E1A i E1B, określony brak (E2 i/lub E4).
c) Wektory adenowirusowe o dużej pojemności DNA
Wektory adenowirusowe o dużej pojemności DNA charakteryzują się tym, że nie zawierają żadnych wirusowych sekwencji kodujących DNA (Kochanek i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 57315736, 1996; Fisher i in., Virology 217, 11-22, 1996; Kumar-Singh i Chamberlain, Hum. Mol. Genet. 5, 913-921, 1996). Wektory te zawierają tylko wirusowe końce obejmujące ITR i sygnał upakowywania. Zdolność do pobierania obcego DNA wynosi około 37 kb, ponieważ wydeletowano bez porównania większą część genomu adenowirusowego. Opisano różne układy do wytwarzania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA (Kochanek i in., supra; Parks i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13565-13570, 1996; Hardy i in., J. Virol. 71, 1842-1849, 1997). Zaletą tych wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA w porównaniu z wektorami adenowirusowymi pierwszej i drugiej generacji jest większa zdolność pobierania obcego DNA oraz niższa toksyczność i immunogenność (Schiedner i in., Nature Genet. 18, 180-183, 1998; Morral i in., Hum. Gene Ther. 9, 2709-2716, 1998). Obecnie, wektory adenowirusowe o dużej pojemności wytwarza się z pomocą wirusów wspomagają4
PL 205 966 B1 cych z wydeletowanymi E1A i E1B, które zapewniają funkcje wirusowe konieczne do produktywnego cyklu infekcji w położeniu trans. Dotąd wektory adenowirusowe o dużej pojemności DNA wytwarzano w komórkach 293 lub w liniach komórkowych pochodzących od komórek 293. Zgodnie z jedną z metod wytwarzania (Parks i in., supra; Hardy i in., supra), wektory adenowirusowe wytwarza się w modyfikowanych komórkach 293, które, poza E1A i E1B, eksprymują rekombinazę Cre bakteriofaga P1. W układzie tym sygnał upakowywania wirusa wspomagającego flankują sekwencje rozpoznawania loxP bakteriofaga P1. Po infekcji komórek 293 eksprymujących Cre, wirusem wspomagającym i wektorem adenowirusowym o dużej pojemności DNA, sygnał upakowywania wirusa wspomagającego jest wycinany. Z tego powodu, zachodzi głównie upakowywanie wektora zawierającego normalny sygnał upakowywania, a nie wirusa wspomagającego.
d) Wydeletowane wektory adenowirusowe
Wektory te opisano jako wektory pierwszej generacji, które mają sekwencje rozpoznawania loxP bakteriofaga P1, położone w genomie wirusowym tak, że po infekcji komórek 293 eksprymujących Cre, większość wirusowych sekwencji kodujących lub wszystkie wirusowe sekwencje kodujące ulegają delecji przez rekombinację pomiędzy sekwencjami rozpoznawania loxP. Wielkość genomu tych wirusów wynosi około 9 kb. Zdolność do pobierania obcego DNA podobnie wynosi około 9 kb (Lieber i in., J. Virol. 70, 8944-8960, 1996).
Wirus towarzyszący adenowirusom (AAV)
AAV należy do rodziny parwowirusów, rodzaju dependowirus, i ma dwie różne formy życiowe, występując albo jako wirus lityczny, albo jako prowirus. Aby zaszła infekcja lityczna, wirus wymaga koinfekcji wirusem wspomagającym (adenowirusem, wirusem ospy bydlęcej, wirusem opryszczki). W nieobecności wirusa wspomagają cego, AAV jest niezdolny do replikacji, ulega integracji z genomem i istnieje jako nieaktywny prowirus. Gdy komórki zawierające AAV w postaci zintegrowanego prowirusa zostają zainfekowane np. adenowirusem, prowirus jest zdolny do ponownego wejścia w lityczny cykl infekcji (Samulski, Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 74-80, 1993).
Kapsydy AAV zawierają genom będący jednoniciowym, liniowym DNA o albo dodatniej albo ujemnej polarności. Istnieje kilka serotypów AAV. Najbardziej zbadanym serotypem jest AAV-2. Genom AAV-2 składa się z 4680 nukleotydów. Genom zawiera na końcach sekwencje odwróconych powtórzeń terminalnych (ITR) o długości 145 par zasad. Pierwszych 125 par zasad tworzy strukturę „spinki do włosów w kształcie litery T, składającą się z dwóch wewnętrznych palindromów.
Genom AAV koduje niestrukturalne białka replikacyjne (Rep) i strukturalne białka kapsydu (Cap). Różne białka replikacyjne (Rep78, Rep68, Rep52, Rep40) tworzone są z wykorzystaniem różnych promotorów (p5 i p19) lub przez alternatywne składanie eksonów. Różne białka kapsydu (VP1, VP2, VP3) są tworzone przez alternatywne składanie eksonów, przy wykorzystaniu promotora p40.
Wektory AAV
Wektory AAV zawierają tylko ITR AAV i pewne sąsiadujące, niekodujące sekwencje AAV. Z tego powodu zdolność pobierania obcego DNA wynosi około 4,5 kb. Opisano różne układy do wytwarzania rekombinowanych wektorów AAV (Skulimowski i Samulski, w: Methods in Molecular Genetics, tom 7, Adoph, red., Academic Press, str. 3-12). W układach tych dostarcza się składniki konieczne do replikacji, ekspresji i upakowywania rekombinowanego wektora. W szczególności są to kasety ekspresyjne, które kodują białka Rep i Cap AAV, oraz adenowirusowe funkcje wspomagające. Adenowirusowymi funkcjami wspomagającymi koniecznymi do wytwarzania AAV są, szczególnie, E1A, E1B, E2, E4 i VA. Funkcje E1A i E1B zapewniają komórki 293, które dotychczas stosowano do wytwarzania. W opisanych dotą d sposobach wytwarzania, funkcje E2, E4 i VA obecnie zazwyczaj zapewnia się albo przez koinfekcję adenowirusem, albo przez kotransfekcję plazmidami eksprymującymi E2, E4 i VA (Samulski i in., J. Virol. 63, 3822-3828, 1989; Allen i in., J. Virol. 71, 6816-6822, 1997; Tamayose i in., Hum. Gene Ther. 7, 507-513, 1996; Flotte i in., Gene Ther. 2, 29-37, 1995; Conway i in., J. Virol. 71, 8780-8789, 1997; Chiorini i in., Hum. Gene Ther. 6, 1531-1541, 1995; Ferrari i in., J. Virol. 70, 3227-3234, 1996; Salvetti i in., Hum. Gene Ther. 9, 695-706, 1998; Xiao i in., J. Virol. 72, 2224-2232, 1998, Grimm i in., Hum. Gene Ther. 9, 2745-2760, 1998; Zhang i in., Hum. Gene Ther. 10, 2527-2537, 1999). Alternatywnie, opracowano strategie, w których do wytwarzania wektorów AAV stosowano wektory hybrydowe adenowirus/AAV lub wirus opryszczki/AAV (Conway i in., supra; Johnston i in., Hum. Gene Ther. 8, 359-370, 1997, Thrasher i in., Gene Ther. 2, 481-485, 1995; Fisher i in., Hum. Gene Ther. 7, 2079-2087, 1996; Johnston i in., Hum. Gene Ther. 8, 359-370, 1997). Wspólne dla wszystkich tych sposobów jest to, że obecnie do wytwarzania stosuje się komórki 293 eksprymujące E1A i E1B.
PL 205 966 B1
Linie komórkowe do wytwarzania
Ze względów bezpieczeństwa wektory adenowirusowe przeznaczone do stosowania u ludzi zazwyczaj mają delecje genów E1A i E1B. Ich wytwarzanie zachodzi w komplementujących liniach komórkowych, które zapewniają funkcje E1 w położeniu trans. Większość wektorów adenowirusowych wytwarzano dotychczas w linii komórkowej 293. W ostatnich latach wytworzono dalsze linie komórkowe, które można stosować do wytwarzania wektorów adenowirusowych z delecjami E1.
a) Komórki HEK 293
Komórki HEK 293 przez długi czas były jedynymi komórkami, które mogły być stosowane do wytwarzania wektorów adenowirusowych z delecjami E1. Komórki HEK 293 wytworzono w 1977 r. przez transfekowanie częścią adenowirusowego DNA ludzkich zarodkowych komórek nerki (komórek HEK). W łącznie ośmiu doświadczeniach transfekcji, każdym z przeciętnie 20 hodowlami HEK, możliwe było otrzymanie tylko jednego unieśmiertelnionego klonu komórkowego (Graham i in., J. Gen. Virol. 36, 59-74, 1977). Linia komórkowa (komórki HEK 293) ustalona z tego klonu komórkowego zawiera pełne lewostronne 11% genomu adenowirusowego (pary zasad od 1 do 4344 genomu Ad5), włącznie z genami E1A i E1B oraz lewostronnym ITR i adenowirusowym sygnałem upakowywania (Louis i in., Virology 233, 423-429, 1997). Znacznym problemem przy wytwarzaniu wektorów adenowirusowych jest homologia sekwencyjna pomiędzy wektorami adenowirusowymi z wydeletowanym E1 a częścią adenowirusowego DNA zintegrowanego w komórkach 293. Rekombinacja homologiczna pomiędzy genomem wirusowym a adenowirusowym DNA zintegrowanym w komórkach 293 jest odpowiedzialna za tworzenie zdolnych do replikacji adenowirusów (RCA) (Lochmiiller i in., Hum. Gene Ther. 5, 1485-1491, 1994; Hehir i in., J. Virol. 70, 8459-8467, 1996). Z tego powodu komórki HEK 293 są nieodpowiednie do wytwarzania wektorów adenowirusowych o jakości farmaceutycznej, ponieważ wytwarzane jednostki są często zanieczyszczone niedopuszczalnymi ilościami RCA. RCA są niedopuszczalne w produktach wytwarzanych do stosowania klinicznego, ponieważ zdolne do replikacji adenowirusy wykazują wyraźnie wyższą toksyczność niż adenowirusy defektywne pod względem replikacji, są zdolne do niekontrolowanej replikacji w tkankach ludzkich, a ponadto są zdolne do komplementacji adenowirusów defektywnych pod względem replikacji (Lochmϋller i in., supra; Imler i in., Hum. Gene Ther. 6, 711-721, 1995; Hehir i in., supra).
b) Ludzkie zarodkowe komórki siatkówki (komórki HER) i ustalone linie komórkowe
Chociaż komórki gryzoni można łatwo transformować adenowirusowymi funkcjami E1, ludzkie komórki pierwotne okazały się stosunkowo odporne na transformację E1A i E1B. Jak wspomniano powyżej, Graham i współpracownicy mogli wyizolować tylko pojedynczy klon komórkowy z komórek HEK, które transfekowano częścią DNA Ad5. Gallimore i współpracownicy przez długi czas próbowali bez powodzenia transformować pierwotne komórki HEK funkcjami E1 Ad12 (Gallimore i in., Anticancer Res., 6, 499-508, 1986). Doświadczenia te prowadzono bez powodzenia w ciągu trzech lat, z użyciem ponad 1 mg fragmentu EcoRI cDNA Ad12 zawierającego geny E1A i E1B. Po wielu próbach możliwe było, pomimo dużej liczby przeprowadzonych doświadczeń, wyizolowanie tylko czterech linii komórkowych HEK Ad12-E1 (Whittaker i in., Mol. Cell. Biol., 4, 110-116, 1984). Podobnie, Gallimore i współpracownicy bez powodzenia próbowali transformować inne ludzkie komórki pierwotne funkcjami E1, włącznie z keratynocytami, fibroblastami skóry, hepatocytami i nabłonkowymi komórkami dróg moczowych (Gallimore i in., Anticancer Res., 6, 499-508, 1986). Jedyny rodzaj komórek ludzkich, które można było dotychczas powtarzalnie transformować adenowirusowymi funkcjami E1, stanowią ludzkie zarodkowe komórki siatkówki (komórki HER). Komórki HER są mieszaniną komórek pochodzących z białej siatkówki neuronalnej. W celu otrzymania tych komórek konieczne jest usunięcie oka z jamy oczodołowej płodu ludzkiego, zazwyczaj pomiędzy tygodniami 16 a 20 ciąży. Oko otwiera się przez poziome nacięcie i białą siatkówkę neuronalną można usunąć kleszczami i umieścić w hodowli komórkowej.
W oparciu o wcześniejsze obserwacje, że a) wywołane Ad12 nowotwory przede wszystkim pochodzą z pierwotnego nabłonka neuronalnego (Mukai i in., Prog. Neuropathol. 3, 89-128, 1976), oraz że b) Ad12 wywołuje nowotwory siatkówki u szczurów i pawianów po wszczepieniu wewnątrzgałkowym (Mukai i in., supra; Mukai i in., Science 210, 1023-1025, 1980), Byrd i współpracownicy stwierdzili, że ludzkie zarodkowe retinoblasty (komórki HER) można transformować genami E1 Ad12 (Byrd i in., Nature 298, 69-71, 1982). Chociaż wydajność transformacji komórek HER była niższa niż ta w przypadku komórek pierwotnych szczura, wydajność transformacji była ponad 100 razy wyższa od tej komórek HEK. Rozpoczęto badania w celu wytworzenia komplementujących linii komórkowych, które można stosować w odniesieniu do izolowanych mutantów E1 Ad12.
PL 205 966 B1
W dalszych badaniach tej grupy (Gallimore i in., Cancer Cells 4, 339-348, 1986) wykazano, że komórki HER można wydajnie transformować plazmidowym DNA eksprymującym geny E1A i E1B Ad5. Wydajność transformacji i ustalania linii komórkowych eksprymujących E1A i E1B była około 20 razy wyższa w przypadku genów E1 Ad5 niż genów E1 Ad12.
W oparciu o te dane, Fallaux i współpracownicy (Fallaux i in., Hum. Gene Ther. 7, 215-222, 1996; Fallaux i in., Hum. Gene Ther. 9, 1909-1917, 1998) ustalili linie komórkowe eksprymujące E1A i E1B, przez transformację komórek HER plazmidami eksprymującymi geny E1A i E1B Ad5. Wytworzono linię komórkową przez transformację plazmidem, który zawiera geny E1A i E1B Ad5 (nukleotydy 79-5789 genomu Ad5) i który eksprymuje E1A pod kontrolą naturalnego promotora E1A (Fallaux i in., supra; zgłoszenie patentowe WO97/00326). Możliwe było ustalenie dalszych linii komórek HER eksprymujących E1A i E1B przez transfekcję plazmidem zawierającym nukleotydy 459-3510 genomu Ad5, w których gen E1A znajduje się pod kontrolą promotora ludzkiej kinazy fosfoglicerynianowej (PGK), i w których naturalny sygnał poliadenylacji E1B zastąpiono sekwencją poli(A) antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) (Fallaux i in., supra; zgłoszenie patentowe WO97/00326). Te linie komórek HER określono jako linie komórkowe PER. Zaletą tych nowych linii komórkowych PER w porównaniu z komórkami 293 lub linią komórkową 911 jest brak homologii sekwencyjnej pomiędzy DNA wektorów adenowirusowych pierwszej generacji a zintegrowanym DNA Ad5. Z tego powodu występuje znaczne ograniczenie możliwości tworzenia RCA. Te transformowane E1A i E1B linie komórek HER (komórki 911 i komórki PER) były zdolne do komplementowania braku E1 w wektorach adenowirusowych pierwszej generacji, a zatem mog ł y być stosowane do wytwarzania tych wektorów.
Linię komórkową, którą w podobny sposób ustalono przez transformację komórek HER plazmidem pTG6559, wymieniono w publikacji Imlera i współpracowników (Imler i in., supra; patrz także WO 94/28152). Plazmid pTG6559 zawiera sekwencje kodujące geny E1A i E1B oraz gen białka IX (nukleotydy 505-4034 genomu Ad5), z genem E1A znajdującym się pod kontrolą mysiego promotora kinazy fosfoglicerynianowej (PGK), a łączny sygnał poliadenylacji genów E1B i białka IX zastąpiono sygnałem poliadenylacji genu β-globiny królika.
W przeciwieństwie do opisanych prób ustalenia ludzkich komórek pierwotnych przez transformację genami E1A i E1B Ad5, w nielicznych przypadkach dokonywano prób stabilnej ekspresji E1A i E1B różnych serotypów w uprzednio ustalonych liniach komórkowych (Grodzicker i in., Cell, 21, 453-463, 1980; Babiss i in., J. Virol. 46, 454-465, 1983; Shiroki i in., J. Virol. 45, 1074-1082, 1983; Imler i in., supra; patrz także WO 94/28152). Wadami tych linii komórkowych są konieczność koekspresji markera selekcyjnego i często brak stabilności ekspresji E1A i E1B. Ponieważ te linie komórkowe są od początku unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi, ekspresja E1A i E1B nie jest konieczna do ich przeżywania, tak że w tym przypadku nie jest konieczna naturalna selekcja przez E1A i E1B, w przeciwieństwie do stosowania komórek pierwotnych.
W przeszłości wytwarzanie linii komórkowych do wytwarzania wektorów adenowirusowych lub wytwarzania wektorów AAV było związane z określonymi trudnościami. Ludzkie komórki zarodkowe nerki (komórki HEK) można otrzymywać z nerek płodów ludzkich. Dokonuje się tego przez usunięcie nerek z płodu i umieszczenie komórek nerki w hodowli komórkowej. Wynikiem transfekcji komórek HEK częścią DNA Ad5 i integracji lewego końca DNA Ad5 oraz ekspresji genów E1A i E1B była transformacja komórek w jednym opublikowanym przypadku. W ten sposób możliwe było ustalenie jednej linii komórkowej (komórek 293) (Graham i in., supra; patrz powyżej „Linie komórkowe do wytwarzania, część a). Komórki 293 stosuje się do wytwarzania wektorów adenowirusowych oraz do wytwarzania wektorów AAV.
Ludzkie zarodkowe komórki siatkówki (komórki HER) można otrzymać z gałki ocznej płodów ludzkich. Dokonuje się tego przez usunięcie oka z płodu i umieszczenie komórek z siatkówki w hodowli. Możliwe było transfekowanie komórek HER adenowirusowymi genami E1A i E1B w celu ich transformacji (patrz powyżej „Linie komórkowe do wytwarzania, część b). Komórki transformowane E1A i E1B można stosować do wytwarzania wektorów adenowirusowych.
W obu przypadkach konieczne jest usuwanie narządów z płodów ludzkich, które pochodzą albo z poronień samoistnych, albo z poronień terapeutycznych ze wskazań lekarskich, bądź z przerwania ciąży z powodów socjalnych, oraz założenie hodowli komórkowej z tego narządu. Po założeniu hodowli pierwotnej, komórki te można następnie transformować przez transfekcję adenowirusowymi genami E1A i E1B. Ustalone w ten sposób linie komórkowe eksprymujące E1A i E1B można następnie stosować do wytwarzania wektorów adenowirusowych lub wektorów AAV.
PL 205 966 B1
Jest oczywiste, że otrzymywanie komórek pierwotnych z narządów płodów jest skomplikowane. Ponieważ hodowlę pierwotną można założyć tylko ze świeżej tkanki, do otrzymania odpowiedniej tkanki konieczne są specjalne wysiłki logistyczne. Ponadto stosowanie tkanki płodowej, pochodzącej z samoistnego poronienia, poronienia terapeutycznego ze wskazań lekarskich albo z przerwania ciąży z powodów socjalnych budzi szczególne wą tpliwoś ci etyczne i wymaga ostroż ności przy zakł adaniu hodowli pierwotnej. Chociaż laboratorium twórców wynalazku znajduje się w klinice ginekologicznej, w której często prowadzi się przerywanie ciąży, otrzymanie odpowiedniej tkanki nie było możliwe w cią gu ponad roku. Pobieranie tkanki pł odowej po poronieniu wymaga oś wiadczenia zgody przez ciężarną kobietę po otrzymaniu odpowiedniej informacji. Często niemożliwe było uzyskanie zgody ciężarnej kobiety na usunięcie narządu po otrzymaniu przez nią szczegółowych informacji o projekcie, tj. pobraniu oka płodu do naukowych badań medycznych.
Dotychczas nie opisano zastosowania ciągłej amniocytarnej linii komórkowej do wytwarzania wektorów przenoszących geny. Donoszono jedynie o ludzkich amniocytach, które transformowano wirusem małpim (SV40) i/lub wirusem mięsaka Kirstena (Sack, In Vitro 17, str. 1-19, 1981; Walen i in., In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 57-65, 1986). Infekcja samym SV40 powodowa ła wydłużony czas ż ycia (nazywany unieśmiertelnianiem), podczas gdy infekcja samym wirusem mięsaka Kirstena nie wydłużała okresu życia. Infekcja oboma wirusami ostatecznie prowadzi do złośliwej komórki nowotworowej (Walen i Arnstein, supra). W związku z tym należy zauważyć, że transformowane SV40 amniocytarne linie komórkowe są nieodpowiednie do wytwarzania wektorów przenoszących geny, ponieważ te komórki same wytwarzają SV40, o którym wiadomo, że jest wirusem onkogennym (Graffney i in., Cancer Res. 30, 871-879, 1970). Zdolność do transformacji komórek ludzkich SV40 nie dostarcza żadnych informacji dotyczących zdolności do transformacji funkcjami E1 adenowirusa i ich zastosowania do wytwarzania wektorów przenoszących geny. Przykładowo keratynocyty można transformować SV40 (patrz Sack, supra), ale keratynocytów wyraźnie nie można, podobnie jak fibroblastów skóry i hepatocytów, transformować Ad12 (Gallimore i in., 1986, supra). Ponadto, w odniesieniu do wytwarzania wektorów wirusowych, szczególnie wektorów adenowirusowych, w unieśmiertelnionych komórkach, ważne jest nie tylko unieśmiertelnienie dzięki określonym funkcjom unieśmiertelniającym; ważne są także dobra zdolność do ulegania infekcji i dobry produktywny przebieg infekcji. Właściwości tych nie można przewidzieć; na pytanie, czy określony rodzaj komórek można stosować do wytwarzania wektorów przenoszących geny, musi zostać podana odpowiedź na nowo dla każdego rodzaju komórek.
Celem niniejszego wynalazku było więc opracowanie nowego sposobu wydajnego, prostego i łatwo powtarzalnego wytwarzania amniocytarnej linii komórkowej, oraz jej zastosowania między innymi do wytwarzania wektorów adenowirusowych, wektorów AAV oraz wektorów retrowirusowych lub lentiwirusowych.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że transfekcja komórek płynu owodniowego (amniocytów), które rutynowo otrzymuje się przez biopsję płynu owodniowego (punkcję owodni) z powodów diagnostycznych podczas diagnozy prenatalnej, adenowirusowymi genami E1A i E1B prowadzi do dużej liczby ciągłych linii komórkowych, które eksprymują geny E1A i E1B w sposób funkcjonalnie aktywny i które są odpowiednie do wytwarzania wektorów przenoszących geny.
Wynalazek dotyczy ciągłej amniocytarnej linii komórkowej zawierającej kwas nukleinowy kodujący produkty genowe regionów E1A i E1B adenowirusa.
Korzystna jest linia komórkowa według wynalazku, w której kwas nukleinowy koduje również produkty genowe regionów E2A, E2B i/lub E4 adenowirusa i/lub rekombinazy Cre.
Korzystna jest linia komórkowa według wynalazku, w przypadku której ekspresja produktu genowego regionu E1A zachodzi pod kontrolą promotora konstytutywnego, korzystnie promotora kinazy fosfoglicerynianowej (PGK).
Korzystna jest linia komórkowa według wynalazku, w przypadku której ekspresja produktu genowego (produktów genowych) regionu E1B zachodzi pod kontrolą promotora adenowirusowego, korzystnie adenowirusowego promotora E1B.
Korzystna jest linia komórkowa według wynalazku, w przypadku której adenowirusowe produkty genowe pochodzą z ludzkiego adenowirusa typu 5.
Korzystna linia komórkowa jest ludzką linią komórkową.
W szczególnoś ci wynalazek dotyczy cią g ł ej amniocytarnej linii komórkowej N52.E6 (DSM ACC2416).
PL 205 966 B1
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania ciągłej amniocytarnej linii komórkowej, charakteryzującego się tym, że transfekuje się amniocyty kwasem nukleinowym kodującym produkty genowe regionu E1A i E1B adenowirusa.
Korzystnie stosuje się amniocyty pierwotne, a zwłaszcza ludzkie amniocyty pierwotne.
Korzystnie kwas nukleinowy stosuje się w postaci wektora ekspresyjnego.
Korzystny jest sposób według wynalazku, w którym ekspresja produktu genowego regionu E1A zachodzi pod kontrolą promotora konstytutywnego, korzystnie promotora kinazy fosfoglicerynianowej (PGK), a ekspresja produktu genowego (produktów genowych) regionu E1B zachodzi pod kontrolą promotora adenowirusowego, korzystnie adenowirusowego promotora E1B.
W korzystnym sposobie transfekcja amniocytów i/lub uzyskanej linii komórkowej powoduje dodatkowo ekspresję produktów genowych regionów E2A i/lub E2B i/lub E4 i/lub rekombinazy Cre adenowirusa.
Korzystny jest sposób, w którym produkty genowe adenowirusa pochodzą z ludzkiego adenowirusa typu 5.
Wynalazek dotyczy także zastosowania amniocytów do wytwarzania ciągłych amniocytarnych linii komórkowych transformowanych adenowirusem.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję nukleotydową regionów E1A i E1B do wytwarzania ciągłych amniocytarnych linii komórkowych.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania ciągłej amniocytarnej linii komórkowej zdefiniowanej powyżej do wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowych zawierających mutację w genach E1A i/lub E1B.
Korzystne jest zastosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej do wytwarzania wektorów adenowirusowych, wektorów AAV (wirusa towarzyszącego adenowirusowi), wektorów retrowirusowych, wektorów lentiwirusowych, chimerycznych wektorów adenowirusowo-AAV, chimerycznych wektorów adenowirusowo-retrowirusowych i/lub chimerycznych wektorów adenowirusowolentiwirusowych.
W szczególnoś ci wektorami adenowirusowymi są wektory adenowirusowe pierwszej generacji, wektory adenowirusowe drugiej generacji, wektory adenowirusowe o dużej pojemności DNA i/lub wydeletowane wektory adenowirusowe.
Korzystne jest zastosowanie amniocytarnej linii komórkowej do wytwarzania wektorów przenoszących geny o zmienionym tropizmie i/lub mutantów adenowirusowych o zmienionym tropizmie.
Korzystnie stosowaną amniocytarną linią komórkową jest linia zdefiniowana powyżej.
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowych zawierających mutację w genach E1A i/lub E1B, charakteryzującego się tym, że stosuje się ciągłą amniocytarną linię komórkową zdefiniowaną powyżej.
Jedną postać wynalazku stanowi ciągła amniocytarna linia komórkowa, zawierająca co najmniej jeden kwas nukleinowy, który powoduje ekspresję produktów genowych regionów E1A i E1B adenowirusa. „Ciągła linia komórkowa zgodnie z wynalazkiem oznacza, że odpowiednie komórki w pewien sposób zmodyfikowano genetycznie, tak że są one zdolne do kontynuowania wzrostu w sposób ciągły w hodowli komórkowej. Natomiast „komórki pierwotne stanowią komórki, które otrzymano przez pobranie z organizmu i hodowlę i które mają tylko ograniczony czas życia. Ciągłą amniocytarną linię komórkową zgodnie z wynalazkiem można otrzymać sposobem przedstawionym w niniejszym opisie, polegającym na transfekcji amniocytów pierwotnych funkcjami E1 adenowirusa. Co najmniej jednym kwasem nukleinowym, który powoduje ekspresję adenowirusowych produktów genowych E1, może być jakikolwiek odpowiedni kwas nukleinowy bądź kwasy nukleinowe, które prowadzą do stabilnej ekspresji tych produktów genowych. Może/mogą on/one występować w postaci zintegrowanej z genomem gospodarza, czyli chromosomalnie, albo występować poza chromosomem, np. jako ulegający episomalnej replikacji plazmid lub minichromosom. Ekspresja różnych produktów genowych może ponadto nastąpić dzięki jednej i tej samej cząsteczce kwasu nukleinowego lub np. cząsteczkom różnych kwasów nukleinowych. „Ekspresja oznacza w obecnym stanie wiedzy proces wytwarzania produktu genowego będącego określonym białkiem, które powoduje powstanie określonej cechy lub określonej właściwości, bądź będącego postacią RNA nieulegającego translacji do białka (np. antysensownych RNA, tRNA). Odpowiednie możliwości osiągnięcia pożądanej ekspresji będą oczywiste dla fachowca w świetle niniejszego opisu, w szczególności także opisanego sposobu. Nowa amniocytarna linia komórkowa jest odpowiednia nie tylko do stosowania do wytwarzania wektorów przenoszących geny w ogóle, ale również, w szczególności, do wytwarzania adenowirusowych wektorów pierwPL 205 966 B1 szej generacji, charakteryzujących się delecjami genów E1A i E1B, które są komplementowane przez linię komórkową.
Co najmniej jeden kwas nukleinowy korzystnie również powoduje ekspresję produktów genowych regionów E2A, E2B i/lub E4 adenowirusa i/lub rekombinazy Cre. Czyni to linię komórkową szczególnie odpowiednią do wytwarzania wektorów adenowirusowych drugiej generacji, które charakteryzują się, poza delecjami genów E1A i E1B, delecjami genów E2 i/lub E4. Ekspresja rekombinazy Cre bakteriofaga P1 jest szczególnie korzystna przy wytwarzaniu wektorów adenowirusowch o dużej pojemności za pomocą wirusa wspomagającego z wydeletowanymi E1A i E1B (patrz także Parks i in., supra; Hardy i in., supra). Ekspresja produktów genowych regionu E1A korzystnie znajduje się pod kontrolą promotora konstytutywnego, korzystnie promotora kinazy fosfoglicerynianowej (PGK). Dla ekspresji produktów genowych regionu E1B korzystne jest jeśli znajduje się on pod kontrolą promotora adenowirusowego, korzystnie adenowirusowego promotora E1B. Możliwą alternatywą jest wykorzystanie np. promotora cytomegalowirusa (CMV). Wszystkie adenowirusowe produkty genowe korzystnie pochodzą z adenowirusa tego samego podrodzaju, np. ludzkiego adenowirusa typu 5 (Ad5). Ciągła amniocytarna linia komórkowa jest zazwyczaj ludzką linią komórkową, ponieważ jest ona szczególnie odpowiednia do wytwarzania wektorów przenoszących geny, pochodzących od wirusów ludzkich, takich jak np. ludzki adenowirus lub ludzki AAV.
Możliwą alternatywą jest linia komórkowa pochodząca z naczelnych lub innych ssaków, takich jak np. bydło, która jest szczególnie odpowiednia do wytwarzania wektorów przenoszących geny, pochodzących od wirusów występujących i endemicznych u poszczególnych gatunków. Przykładowo ciągłe amniocytarne linie komórkowe otrzymane przez transformację amniocytów genami E1A i E1B adenowirusa bydlęcego są odpowiednie do wytwarzania wektorów pochodzących od adenowirusa bydlęcego.
Inną postać niniejszego wynalazku stanowi sposób wytwarzania ciągłej amniocytarnej linii komórkowej, w szczególności linii komórkowej zdefiniowanej powyżej, który polega na tansfekowaniu amniocytów co najmniej jednym kwasem nukleinowym, który powoduje ekspresję adenowirusowych produktów genowych regionu E1A i regionu E1B. Otrzymane klony komórkowe można następnie ewentualnie dalej izolować i w razie potrzeby klonować w celu otrzymania pojedynczych linii komórkowych. Określenie „transfekcja oznacza w niniejszym opisie jakikolwiek sposób odpowiedni do wprowadzania tego/tych kwasu(ów) nukleinowego(ych) do komórek. Przykładami, które można wymienić, są elektroporacja, układy liposomalne każdego typu oraz połączenia tych sposobów. Określenie „amniocyty oznacza w niniejszym opisie w szerszym znaczeniu wszystkie komórki, które są obecne w płynie owodniowym i mogą być otrzymane przez biopsję płynu owodniowego. Pochodzą one albo z owodni, albo z tkanki płodu, który znajduje się w styczności z płynem owodniowym. Trzy główne klasy amniocytów opisano i rozróżniono na podstawie kryteriów morfologicznych: komórki fibroblastopodobne (komórki F), komórki nabłonkowate (komórki E) oraz komórki płynu owodniowego (komórki AF) (Hohn i in., Pediat. Res. 8, 746-754, 1974). Dominującym rodzajem komórek są komórki AF. Zatem w węższym znaczeniu „amniocyty oznaczają w niniejszym opisie amniocyty typu AF. Korzystnie stosuje się amniocyty pierwotne. Komórkami określanymi jako komórki „pierwotne są te, które można otrzymać przez pobranie z organizmu i hodowlę i które mają jedynie ograniczony czas życia, podczas gdy tak zwane „ciągłe linie komórkowe są zdolne do nieograniczonej kontynuacji wzrostu. Tak więc szczególnie korzystne jest stosowanie ludzkich pierwotnych amniocytów, co prowadzi do wytwarzania ludzkich linii komórkowych (patrz powyżej). Jednakże możliwe jest również stosowanie pierwotnych amniocytów pochodzących z naczelnych i innych gatunków ssaków, takich jak bydło. W ś wietle niniejszego opisu dla fachowca bę dzie takż e oczywiste, ż e do wytwarzania odpowiednich ciągłych linii komórkowych można stosować analogiczne komórki, które można otrzymać z błon owodni, np. przez trypsynizację lub przez biopsję kosmka kosmówki.
Co najmniej jednym kwasem nukleinowym, który powoduje ekspresję produktów adenowirusowego genu E1, może być genomowy DNA, cDNA, syntetyczny DNA, RNA i mRNA. Kwas nukleinowy korzystnie stosuje się w postaci DNA wektora ekspresyjnego. Jego przykładami są wektory integrujące, plazmidy bakteryjne, ulegające episomalnej replikacji plazmidy lub minichromosomy. Preferuje się plazmidy ekspresyjne, których integrację z genomem komórki biorcy osiąga się przez transfekcję. Określenie „co najmniej jeden kwas nukleinowy oznacza, że elementy, które powodują ekspresję, mogą być obecne albo w jednym i tym samym kwasie nukleinowym, albo w różnych kwasach nukleinowych. Przykładowo można dostarczać oddzielne kwasy nukleinowe do ekspresji produktów genowych regionów E1A, E1B, E2A, E2B i/lub E4 i/lub rekombinazy Cre. Można sobie także wyobrazić, że
PL 205 966 B1 amniocyty przeznaczone do transfekcji już eksprymują jeden z tych produktów genowych, tak że trzeba tylko spowodować ekspresję innego(ych) produktu(ów) genowego(ych), albo że ekspresję jednego lub większej liczby z tych produktów genowych inicjuje się jedynie przez wprowadzenie odpowiednich elementów regulujących. Dla fachowca dostępne są odpowiednie techniki i sposoby wytwarzania i ewentualnie mutagenezy kwasów nukleinowych oraz ekspresji genów i analizy biał ek (patrz np. Sambrook, J. i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Glover, D.M., DNA cloning: A practical approach, tom. II: Expression Systems, IRL Press (1995); Ausubel i in., Short protocols in molecular biology, John Wiley & Sons (1999); Rees, A.R. i in., Protein engineering: A practical approach, IRL Press (1993)). Korzystne jest, aby produkt genowy lub produkty genowe regionu E1A były eksprymowane pod kontrolą promotora konstytutywnego, w szczególności promotora kinazy fosfoglicerynianowej (PGK), oraz aby produkty genowe regionu E1B były eksprymowane pod kontrolą promotora adenowirusowego, w szczególności adenowirusowego promotora E1B. Zamiast promotora adenowirusowego można również stosować np. promotor cytomegalowirusa (CMV).
W szczególnej postaci, transfekcja amniocytów i/lub otrzymanej linii komórkowej dodatkowo powoduje ekspresję otrzymanych produktów genowych regionów E2A i/lub E2B i/lub E4 adenowirusowych i/lub rekombinazy Cre. W związku z tym fachowcowi dostępne są wszystkie możliwości dyskutowane powyżej lub w inny sposób ujawnione w tej dziedzinie. W odniesieniu do pojedynczych genów, dodatkowe informacje można znaleźć w następujących publikacjach: E2A: Genbank, nr dostępu M73260; Kruiyer i in., Nucl. Acids Res. 9, 4439-4457, 1981; Kruiyer i in., Nucl. Acids Res. 10, 4493-4500, 1982. E2B: Genbank, nr dostępu M73260; Dekker i in., Gene 27, 115-120, 1984; Shu i in., Virology 165, 348-356, 1988. E3: Genbank, nr dostępu M73620; Cladaras i in., Virology 140, 28-43, 1985. E4: Genbank, nr dostępu M73620 i D12587; Virtanen i in., J. Virol. 51, 822-831, 1984; Dix i in., J. Gen. Virol. 73, 2975-2976, 1992. W niektórych przypadkach ramki odczytu znane są tylko dla Ad2 i można je następnie zazwyczaj wyznaczyć , w przypadku np. Ad5, przez porównanie sekwencji. Rekombinaza Cre: Genbank, nr dostępu X03453; Sternberg i in., J. Mol. Biol. 187, 197-212, 1986.
Wszystkie adenowirusowe produkty genowe korzystnie pochodzą z określonego serotypu adenowirusowego, w szczególności z ludzkiego adenowirusa typu 5 (Ad5). Szczególny serotyp adenowirusowy, z którego pochodzą geny E1A i E1B stosowane do transformacji amniocytów, nie ma zasadniczego znaczenia dla tego wynalazku. Przykłady serotypów adenowirusowych, które można stosować zgodnie z wynalazkiem są już znane w tej dziedzinie i obejmują ponad 40 serotypów ludzkich, np. Ad12 (podrodzaj A), Ad3 i Ad7 (podrodzaj B), Ad2 i Ad5 (podrodzaj C), Ad8 (podrodzaj D), Ad4 (podrodzaj E), Ad40 (podrodzaj F) (Wigand i in., w: Adenovirus DNA, Doerfler, red., Martinus Nijhoff Publishing, Boston, str. 408-441, 1986). W korzystnej postaci wynalazku wektory adenowirusowe pochodzące z podrodzaju C wytwarza się przez transformację amniocytów genami E1A i E1B, które pochodzą z adenowirusa tego samego rodzaju. Przykładowo wektory adenowirusowe serotypu 2 lub 5 wytwarza się przez transformację amniocytów genami E1A i E1B serotypu 2 lub 5. Wektory adenowirusowe oparte na Ad12 wytwarza się przez transformację amniocytów genami E1A i E1B Ad12 itd. W celu wytwarzania wektorów adenowirusowych dla gatunków innych niż człowiek, w tym z dobrze znanych adenowirusów pochodzących od bydła, owiec, świń i innych ssaków, amniocytarne linie komórkowe wytwarza się przez transformację amniocytów określonego gatunku. Jest to zazwyczaj konieczne, ponieważ funkcje adenowirusowe zazwyczaj nie mogą być wydajnie komplementowane poza granicami gatunku.
W szczególnej postaci, amniocyty otrzymane z powodów diagnostycznych w ramach diagnozy prenatalnej przez biopsję płynu owodniowego i nie używane dalej w celach diagnostycznych transfekowano plazmidem ekspresyjnym, który eksprymował geny E1A i E1B Ad5. Konstrukt ten zaprojektowano tak, że gen E1A znajdował się pod kontrolą promotora mysiej kinazy fosfoglicerynianowej, a gen E1B był pod kontrolą naturalnego adenowirusowego promotora E1B. Naturalne miejsce akceptorowe składania E1B i sekwencję poliadenylacji E1B zastąpiono odpowiednimi sekwencjami wirusa SV40. Kilka tygodni po transfekcji plazmidowym DNA obserwowano dużą liczbę klonów komórkowych i wyizolowano je, sklonowano, ustalono jako unieś miertelnione linie komórkowe i analizowano. We wszystkich analizowanych klonach komórkowych zachodziła ekspresja białek E1A i E1B. Wykazano, przez infekcję wektora adenowirusowego z delecją E1, który eksprymował β-gal, oraz następnie wybarwianie, że wszystkie te komórki mogły ulegać infekcji. Doświadczenia infekcji z wektorami adenowirusowymi pierwszej generacji z delecją E1 ujawniły, że linie komórkowe były odpowiednie do wytwarzania wektorów adenowirusowych. W doświadczeniach tych linie komórkowe początkowo infekowano wektorem adenowirusowym pierwszej generacji, który eksprymował β-gal. Po 48-72 godzinach, gdy
PL 205 966 B1 komórki wykazywały efekt cytopatyczny (CPE), zbierano je i wektor adenowirusowy uwalniano z nich przez trzykrotne zamrażanie i rozmrażanie. Część lizatu komórkowego stosowano do infekowania komórek 293, i po 24 godzinach od przeniesienia genu immunohistochemicznie wykrywano ekspresję β-gal. Na podstawie liczby komórek dodatnich pod względem β-gal możliwe było bezpośrednie obliczenie wydajności wektora przez wytwarzanie w poszczególnych liniach komórkowych. Amniocytarne linie komórkowe można otrzymywać w ten sposób bez trudności i powtarzalnie, i są one szczególnie odpowiednie do wytwarzania wektorów przenoszących geny. Niektóre z wyizolowanych linii komórkowych umożliwiały wytwarzanie wektorów adenowirusowych równie dobrych, bądź lepszych, niż komórki 293. Jak oczekiwano, linie komórkowe wykazywały różnice pod względem wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego (patrz fig. 4). Linie komórkowe N52.E6 i N52.F4 wyróżniały się szybkim wzrostem i szczególnie dobrym wytwarzaniem wektorów adenowirusowych, co stanowi korzystne właściwości do stosowania tych linii komórkowych do wytwarzania wektorów genów.
Struktura plazmidu ekspresyjnego, który eksprymuje E1A i E1B, stosowanego do transformowania amniocytów, wyklucza tworzenie adenowirusów zdolnych do replikacji (RCA) przez homologiczną rekombinację wektora adenowirusowego lub adenowirusowego wirusa wspomagającego z DNA zintegrowanym w transformowanych amniocytach, w przeciwieństwie do komórek 293. Jako alternatywę do tego, pojedyncze funkcje E1 można wprowadzać w różnych plazmidach ekspresyjnych do komórek przeznaczonych do transformowania. Oczywiście można również, jak w przypadku linii komórkowej 293, przeprowadzić transformację amniocytów i badać partie otrzymane podczas wytwarzania wektorów przenoszących geny pod względem zawartości RCA, np. stosując PCR lub próbę infekowania. Ewentualnie partie zawierające RCA można następnie odrzucać.
Tak więc kolejna postać wynalazku dotyczy ciągłej amniocytarnej linii komórkowej, którą można otrzymać sposobem przedstawionym w niniejszym opisie. W szczególnej postaci wynalazek dotyczy ciągłej amniocytarnej linii komórkowej N52.E6, którą zdeponowano 26 października 1999 r. w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego i nadano jej numer dostępu DSM ACC2416.
W innej postaci wynalazek dotyczy zastosowania amniocytów do wytwarzania transformowanych adenowirusem ciągłych amniocytarnych linii komórkowych. Określenie „transformowane adenowirusem oznacza w niniejszym opisie transformację jednym lub większą liczbą transformujących genów adenowirusowych. Zatem „transformacja odnosi się do przekształcania komórki eukariotycznej, która podlega kontroli wzrostu, w tak zwaną ciągłą linię komórkową, która wykazuje nieograniczony wzrost. Kolejną postacią jest zastosowanie adenowirusowych produktów genowych regionów E1A i E1B do wytwarzania ciągłych amniocytarnych linii komórkowych.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania ciągłej amniocytarnej linii komórkowej do wytwarzania wektorów przenoszących geny. „Wektory przenoszące geny oznaczają w niniejszym opisie ogólnie wszystkie wektory, dzięki którym jeden lub większą liczbę genów terapeutycznych można przenosić lub wprowadzać do pożądanych komórek docelowych, a w szczególności mających tę właściwość wektorów wirusowych. Ponadto ciągłe amniocytarne linie komórkowe można stosować do wytwarzania mutantów adenowirusowych. „Mutanty adenowirusowe oznaczają adenowirusy, które mają co najmniej jedną mutację genów E1A i/lub E1B. W korzystnej postaci, w przeciwieństwie do adenowirusowych wektorów przenoszących geny, nie zawierają one jednak żadnych genów terapeutycznych. Do typowych przykładów należą mutanty adenowirusowe, które nie eksprymują białka 55 kD E1B (np. mutant adenowirusa dl1520 (Barker i in., Virology 156, 107-121, 1987)). Mutanty adenowirusowe, które nie eksprymują białka 55 kD E1B, są przedmiotem szczególnego zainteresowania w leczeniu zrakowaceń, ponieważ mutant wirusa ulega replikacji wyłącznie w komórkach nowotworowych, a nie ulega replikacji lub ulega jej w nieznacznym stopniu w pierwotnych komórkach normalnych (Bischoff i in., Science 274, 373-376, 1996; Kirn i in., Nature Med. 4, 1341-1342, 1998).
Korzystną postać stanowi zastosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej do wytwarzania wektorów adenowirusowych, wektorów AAV (wirusa towarzyszącego adenowirusowi), wektorów retrowirusowych, wektorów lentiwirusowych, chimerycznych wektorów adenowirusowo-AAV, chimerycznych wektorów adenowirusowo-retrowirusowych i/lub chimerycznych wektorów adenowirusowo-lentiwirusowych. Możliwe jest również zastosowanie do wytwarzania wektorów herpeswirusowych.
Wektory AAV normalnie zawierają tylko ITR AAV i niektóre sąsiadujące niekodujące sekwencje AAV. Ich zdolność do pobierania obcego DNA wynosi około 4,5 kb. Jak opisano powyżej, istnieją różne układy do wytwarzania rekombinowanych wektorów AAV. Wspólne dla tych wszystkich układów jest to, że dostarczają składniki konieczne do replikacji, ekspresji i upakowywania rekombinowanego wektora.
PL 205 966 B1
Szczegółowo, obejmują one kasety ekspresyjne, które kodują białka rep i cap AAV oraz adenowirusowymi funkcjami wspomagającymi koniecznymi do wytwarzania AAV są geny E1A, E1B, E2, E4 i VA. Funkcje E1A i E1B dostarcza się w amniocytarnych liniach komórkowych eksprymujących E1A i E1B, i dlatego można je stosować do wytwarzania wektorów AAV. Funkcje E2, E4 i VA można zapewnić przez koinfekcję adenowirusem lub przez kotransfekcję plazmidami eksprymującymi E2, E4 i VA, bądź przez stosowanie wektorów hybrydowych adenowirus/AAV lub wirus opryszczki (Samulski i in., supra; Allen i in., supra; Tamayose i in., supra; Flotte i in., supra; Conway i in., supra; Chiorini i in., supra; Ferrari i in., supra; Salvetti i in., supra; Xiao i in., supra; Grimm i in., supra; Zhang i in., supra).
Wektory retrowirusowe, to jest wektory pochodzące od retrowirusów, są również bardzo ważne jako środki do transfekcji w zakresie procedur terapii genowej, np. do terapii genowej w ośrodkowym układzie nerwowym (Suhr i in., Arch. Neurol. 56, 287-292, 1999). Wektory retrowirusowe można wytwarzać w liniach komórkowych stabilnie wytwarzających wektor albo przez transfekcję krótkotrwałą. Indywidualne składniki stosowane do wytwarzania wektorów retrowirusowych zazwyczaj obejmują jeden lub większą liczbę plazmidów, które eksprymują białka strukturalne oraz białka replikacji i integracji, jak również plazmid, który zawiera sam wektor (Miller, w: Retroviruses, Coffin, Hughes, Varmus, red., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997, str. 437-473). Jeśli stosuje się te plazmidy, które zawierają miejsce początku replikacji, takie jak np. miejsce początku replikacji SV40, amniocytarne linie komórkowe modyfikuje się tak, że białka, które pobudzają replikację plazmidu, są stabilnie eksprymowane. Przykładowo w przypadku plazmidów, które zawierają miejsce początku replikacji SV40, stosuje się amniocytarną linię komórkową, która eksprymuje antygen T SV40.
Wektorami lentiwirusowymi są wektory pochodzące od lentiwirusów (Naldini i in., Science 272, 263-267, 1996; Dull i in., J. Virol. 72, 8463-8471, 1998). Wektory lentiwirusowe można wytwarzać w liniach komórkowych stabilnie wytwarzających wektor lub przez transfekcję krótkotrwałą.
„Wektory chimeryczne oznaczają wektory, które są produktem fuzji kwasów nukleinowych z dwóch lub większej liczby róż nych wektorów wirusowych. Ciągłe amniocytarne linie komórkowe można stosować do wytwarzania wektorów chimerycznych zgodnie z niniejszym opisem. W układzie tym np. wektor adenowirusowy, korzystnie wektor adenowirusowy o dużej pojemności, zawiera fragment DNA, który zawiera informację konieczną do integracji wirusa, który pochodzi np. od retrowirusa lub od AAV. Po transkrypcji w komórce docelowej wirus integrujący, zawierający gen terapeutyczny, uwalniany jest z otoczenia adenowirusowego (np. w przypadku wstawki retrowirusowej przez wytwarzanie infekcyjnych cząstek retrowirusowych, które transdukują sąsiadujące komórki i trwale integrują się jako DNA). W przeszłości opisano przykłady wektorów chimerycznych wytwarzanych w komórkach 293, np. chimerycznych wektorów adenowirusowo-retrowirusowych (Feng i in., Nature Biotech. 15, 866-870, 1997) oraz chimerycznych wektorów adenowirusowo-AAV (Recchia i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2615-2620, 1999). Wytwarzanie w amniocytarnych liniach komórkowych, które eksprymują E1A i E1B, jest korzystne, ponieważ, w przeciwieństwie do komórek 293, nie mogą powstawać wektory zdolne do replikacji przez rekombinację homologiczną.
Wektory adenowirusowe, to jest wektory pochodzące od adenowirusów, są bardzo ważne, w szczególności jako środki do transfekcji w zakresie procedur terapii genowej. Wektory adenowirusowe mogą być wektorami adenowirusowymi pierwszej generacji, wektorami adenowirusowymi drugiej generacji, wektorami adenowirusowymi o dużej pojemności DNA i/lub wydeletowanymi wektorami adenowirusowymi, które są wytwarzane za pomocą ciągłej amniocytarnej linii komórkowej.
a) Wytwarzanie wektorów adenowirusowych pierwszej generacji
Wektory adenowirusowe pierwszej generacji zazwyczaj charakteryzują się delecjami genów E1A i E1B. Niektóre wektory adenowirusowe pierwszej generacji mają, poza delecją genów E1A i E1B, także delecje regionu E3. Funkcje E3 nie są konieczne do namnażania wektorów adenowirusowych w hodowli komórkowej.
Wektory adenowirusowe pierwszej generacji można wytwarzać w amniocytarnych liniach komórkowych, które eksprymują E1A i E1B. Dokonuje się tego przez infekowanie komórek, które eksprymują E1A i E1B, korzystnie za pomocą 3-5 jednostek infekcyjnych na komórkę (3-5 MOI). Po około 36 - 72 godzinach komórki wykazują wpływ cytopatyczny. Komórki zbiera się zgodnie ze standardowymi protokołami. Wektory adenowirusowe można wyodrębniać z nich przez wirowanie przy gradiencie gęstości CsCl lub metodami chromatograficznymi.
b) Wytwarzanie wektorów adenowirusowych drugiej generacji
Wektory adenowirusowe drugiej generacji charakteryzują się delecjami genów E1A i E1B. Niektóre wektory adenowirusowe drugiej generacji mają również delecję regionu E3. Poza delecją genów
PL 205 966 B1
E1A i E1B, wektory adenowirusowe drugiej generacji charakteryzują się inaktywacją, a korzystnie delecją, co najmniej jednego innego istotnego genu adenowirusowego, np. genu E2A, genu E2B i/lub genu E4, bądź np. delecjami funkcji E2 łącznie z delecjami funkcji E4.
W celu wytworzenia wektorów adenowirusowych drugiej generacji, funkcje, których sam wektor nie eksprymuje z powodu inaktywacji i/lub delecji, musi zapewnić amniocytarna linia komórkowa. W tym celu amniocytarne linie komórkowe, które stabilnie eksprymują E1A i E1B, można stabilnie modyfikować przez transfekcję kasetą ekspresyjną, która eksprymuje produkty genowe odpowiedzialne za jedną lub większą liczbę innych funkcji adenowirusowych. Przykładowo, w celu wytworzenia wektora adenowirusowego drugiej generacji, który ma, poza delecją genów E1A i E1B, także delecję genu E2A, E2B i/lub E4, właściwy gen lub geny wprowadza się przez transfekcję, wraz z markerem selekcyjnym, do amniocytarnej linii komórkowej, która eksprymuje E1A i E1B. Klony komórkowe, które oprócz eksprymowania funkcji E1A i E1B, eksprymują także funkcje E2A, E2B i/lub E4, można następnie stosować do wytwarzania określonego wektora drugiej generacji. Geny E2 i/lub E4 znajdują się zazwyczaj pod transkrypcyjną kontrolą promotora heterologicznego, który albo jest aktywny konstytutywnie, albo może być regulowany.
c) Wytwarzanie wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA
Wektory adenowirusowe o dużej pojemności DNA charakteryzują się delecją większości lub całości wirusowych sekwencji kodujących. Wektory te korzystnie zawierają tylko wirusowe ITR i wirusowy sygnał upakowywania. Funkcje adenowirusowe zapewnia wirus wspomagający, działający trans. Opisano różne układy do wytwarzania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA. Dla wszystkich opisanych dotąd układów i stosowania wirusa wspomagającego wspólną cechą jest to, że wirus wspomagający odpowiada niezdolnemu do replikacji adenowirusowi z delecją E1A i E1B. Wirus wspomagający zawiera albo pełny sygnał upakowywania (Mitani i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3854-3858, 1995; Fisher i in., Virology 217, 11-22, 1996; Kumar-Singh i Chamberlain, Hum. Mol. Genet. 5, 913-921, 1996) lub zmutowany sygnał upakowywania (Kochanek i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5731-5736, 1996). W tym ostatnim przypadku wektor jest korzystnie upakowywany w kapsydach wirusowych, ponieważ wirus wspomagający zawiera osłabiony sygnał upakowywania i dlatego jest upakowywany z niższą wydajnością. Alternatywnie, sygnał upakowywania wirusa wspomagającego może być wycinany po infekcji wytwarzającej linii komórkowej przez zastosowanie rekombinazy (Parks i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13565-13570, 1996; Hardy i in., J. Virol. 71, 1842-1849, 1997). Przykładowo, sygnał upakowywania wirusa wspomagającego mogą flankować sekwencje rozpoznawania loxP bakteriofaga P1. Wynikiem ekspresji rekombinazy Cre bakteriofaga P1 jest wycinanie sygnału upakowywania wirusa wspomagającego. Jednakże, z powodu braku sygnału upakowywania, nie zachodzi upakowywanie wirusa wspomagającego w kapsydy. Gen rekombinazy Cre bakteriofaga P1 wprowadza się przez transfekcję, wraz z markerem selekcyjnym, do amniocytarnej linii komórkowej, która eksprymuje E1A i E1B. Klony komórkowe, które oprócz eksprymowania funkcji E1A i E1B, eksprymują także funkcję Cre bakteriofaga P1, można następnie stosować do wytwarzania określonego wektora o dużej pojemności DNA.
d) Wytwarzanie „wydeletowanych wektorów adenowirusowych „Wydeletowane wektory adenowirusowe opisano jako wektory pierwszej generacji, które mają sekwencje rozpoznawania loxP bakteriofaga P1 położone w genomie wirusowym tak, że po infekcji komórek 293, które eksprymują Cre, większość wirusowych sekwencji kodujących lub wszystkie wirusowe sekwencje kodujące ulegają delecji w wyniku rekombinacji pomiędzy sekwencjami rozpoznawania loxP. Wielkość genomu tych wektorów wynosi około 9 kb. Zdolność do pobierania obcego DNA również wynosi około 9 kb (Lieber i in., J. Virol, 70, 8944-8960, 1996). Do stosowania przy wytwarzaniu wydeletowanych wektorów adenowirusowych, gen rekombinazy Cre bakteriofaga P1 wprowadza się przez transfekcję, wraz z markerem selekcyjnym, do amniocytarnej linii komórkowej, która eksprymuje E1A i E1B. Klony komórkowe, które oprócz eksprymowania funkcji E1A i E1B, eksprymują także funkcję Cre bakteriofaga P1, można następnie stosować do wytwarzania określonego wydeletowanego wektora Ad.
e) Wytwarzanie wektorów przenoszących geny, o zmodyfikowanym tropizmie
W korzystnej postaci, ciągłą amniocytarną linię komórkową stosuje się do wytwarzania wektorów przenoszących geny, o zmodyfikowanym tropizmie. Tropizm wirusa i wektora wirusowego pochodzącego od tego wirusa decyduje, czy określony rodzaj komórek można z powodzeniem transdukować wektorem, czy nie. Pobieranie wektora przenoszącego gen do komórki jest pierwszym etapem do zakończonego powodzeniem przeniesienia genu do tej komórki. Tropizm wektora wirusowego jest
PL 205 966 B1 zatem zasadniczym czynnikiem do wydajnego przenoszenia genów in vitro lub in vivo do określonej komórki lub do tkanki. Oddziaływanie powierzchni wektora wirusowego (kapsydu w przypadku wektorów adenowirusowych lub AAV, otoczki wirusowej w przypadku wektorów retrowirusowych lub lentiwirusowych) z błoną komórkową komórki docelowej jest konieczne do pobierania przez określoną komórkę. Chociaż dokładny mechanizm pobierania wektora wirusowego przez komórkę docelową niekiedy różni się dla różnych wektorów, we wszystkich przypadkach zasadniczą rolę odgrywa oddziaływanie struktur powierzchniowych wektora wirusowego (zazwyczaj ligandów białkowych) ze strukturami na komórce docelowej (zazwyczaj receptorami lub cząsteczkami adhezyjnymi). Pobieranie wektorów adenowirusowych zachodzi np. przez endocytozę za pośrednictwem receptorów. Wymaga ona wiązania części kapsydu adenowirusowego z receptorami komórkowymi. W przypadku wektorów adenowirusowych pochodzących od Ad2 lub Ad5, zgodnie z obecnym stanem wiedzy, zazwyczaj jest to wiązanie części domeny głowy białek włókna z receptorem wirusa Coxsackie i adenowirusów (CAR) oraz części podstawy pentonu z integrynami ανβ3 lub ανβ5. Wiązanie domeny głowy z CAR jest, według obecnego stanu wiedzy, konieczne do adhezji wektora do błony komórkowej komórki docelowej, podczas gdy wiązanie podstawy włókna z integrynami jest konieczne do internalizacji wektora przez komórkę docelową.
Amniocytarne linie komórkowe można stosować do wytwarzania wektorów o zmodyfikowanym tropizmie. Dotyczy to np. wytwarzania wektorów adenowirusowych pierwszej i drugiej generacji, wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA, wydeletowanych wektorów adenowirusowych, chimerycznych wektorów adenowirusowych wektorów AAV, wektorów retrowirusowych i/lub lentiwirusowych. Do wytwarzania wektorów o zmodyfikowanym tropizmie w amniocytarnych liniach komórkowych można stosować różne strategie. Strategia stosowana do określonej modyfikacji tropizmu może być różna dla różnych wektorów (np. wektora adenowirusowego, wektora AAV, wektora retrowirusowego). Wspólną cechą różnych strategii jest to, że powierzchnię określonego wektora (kapsydu wirusowego w przypadku wektorów adenowirusowych i AAV, otoczki wirusowej w przypadku wektorów retrowirusowych i lentiwirusowych) zmienia się tak, aby zmienić wiązanie wektora z komórką docelową. Przykładami modyfikacji dla wektorów adenowirusowych są:
a) Wymiana białek włókna pomiędzy różnymi serotypami: jej wynikiem są wektory adenowirusowe, których kapsyd zawiera białko włókna innego serotypu. Jej przykładami są wymiana naturalnego białka włókna wektorów adenowirusowych pochodzących od serotypu 2 na białko włókna pochodzące z serotypu 17 (Zabner i in., J. Virol. 73, 8689-8695, 1999) lub z serotypu 9 (Roelvink i in., J. Virol. 70, 7614-7621, 1996). Innymi przykładami są wymiana naturalnego białka włókna wektorów adenowirusowych pochodzących od serotypu 5 na białko włókna pochodzące z serotypu 7a (Gall i in., J. Virol, 70, 2116-2123, 1996) lub z serotypu 3 (Stevenson i in., J. Virol. 71, 4782-4790, 1997; Krasnykh i in., J. Virol. 70, 6839-6846, 1996; Douglas i in., Neuromuscul. Disord. 7, 284-298, 1997).
b) Usunięcie białka włókna: białko włókna można usunąć przez manipulacje genetyczne, tak że pobieranie wektora zachodzi jedynie poprzez oddziaływanie podstawy pentonu lub białko heksonu (Falgout i in., J. Virol. 62, 622-625, 1988; Legrand i in., J. Virol. 73, 907-919, 1999).
c) Modyfikacja końca C białka włókna peptydem: jej przykładami są modyfikacja końca C peptydem polilizynowym (Yoshida i in., Hum. Gene Ther. 9, 2503-2515, 1998: Wickham i in., Nat. Biotechnol. 14, 1570-1573, 1996; Wickham i in., J. Virol. 71, 8221-8229, 1997), peptydem polihistydynowym (Douglas i in., Nat. Biotechnol. 17, 470-475, 1999) lub peptydem uwalniającym gastrynę (Michael i in., Gene Ther. 2, 660-668, 1995).
d) Modyfikacja części domeny głowy białka włókna przez wstawienie peptydu: jej przykładami są wstawienie epitopu FLAG (Krasnykh i in., J. Virol. 72, 1844-1852, 1998) lub wstawienie peptydu RGD (Dmitriev i in., J. Virol. 72, 9706-9713, 1998; Kasono i in., Clin. Cancer Res. 5, 2571-2579, 1999).
e) Modyfikacja podstawy pentonu: jednym z jej przykładów jest zastąpienie motywu RGD w podstawie pentonu motywem LDV w celu pośredniczenia w wiązaniu wektora z integrynami α4β1 (Wickham i in., Gene Ther. 2, 750-756, 1995).
f) Modyfikacja białka heksonu: jednym z jej przykładów jest wstawienie epitopu pochodzącego z wirusa polio typu 3 (Crompton i in., J. Gen. Virol. 75, 133-139, 1994).
Alternatywna strategia, którą można zastosować do zmiany tropizmu wektorów w amniocytarnych liniach komórkowych opiera się na stosowaniu ligandów, które pośredniczą w wiązaniu wektora ze strukturami błony komórkowej, takimi jak np. receptory komórkowe lub cząsteczki adhezyjne. Tymi ligandami mogą być peptydy, białka lub przeciwciała. Ligandy można łączyć z powierzchnią wektorów różnymi sposobami. Wiązanie ligandów z powierzchnią wektorów (kapsydów w przypadku wektorów
PL 205 966 B1 adenowirusowych lub AAV) można tworzyć przez stosowanie przeciwciał lub przez reakcję sieciowania chemicznego. W przypadku stosowania przeciwciał można stosować przeciwciała, których specyficzność jest ukierunkowana wobec kapsydu wektora (np. wobec domeny głowy białka włókna). Alternatywnie, można stosować przeciwciała, których specyficzność jest ukierunkowana wobec epitopu, który wprowadzono jako nowy epitop (np. epitopu FLAG lub epitopu myc) do kapsydu wektora. Ich przykłady są dobrze znane fachowcowi. Przykłady stosowania przeciwciał bispecyficznych opisano w Wickham i in., J. Virol. 70, 6831-6838, 1996 (anty-FLAG/anty-integryna α ); w Wickham i in., Cancer Immunol. Immunther. 45, 149-151, 1997; Harari i in., Gene Ther. 6, 801-807, 1999 (anty-FLAG/anty-selektyna E) do transdukcji komórek śródbłonkowych; w Miller i in., Cancer Res. 58, 5738-5748, 1998; Blackwell i in., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 125, 856-863, 1999 (anty-Ad/anty-EGFR) do transdukcji komórek nowotworowych; w Wickham i in., J. Virol. 71, 7663-7669, 1997 (anty-FLAG/anty-CD3) do transdukcji komórek T; w Tillman i in., J. Immunol. 162, 6378-6383, 1999 (anty-CD40/anty-Ad) do transdukcji komórek dendrytycznych. Przykłady stosowania przeciwciał jednołańcuchowych o specyficzności wobec jednej determinanty kapsydu wirusowego, która jest sprzęgnięta z ligandem, opisano w Watkins i in., Gene Ther. 4, 1004-1012, 1997; w Goldman i in., Cancer Res. 57, 1447-1451, 1997; Rancourt i in., Clin. Cancer Res. 4, 2455-2461, 1998; Gu i in., Cancer Res. 59, 2608-2614, 1999; Rogers i in., Gene Ther. 4, 1387-1392, 1997 (anty-Ad/FGF2) do transdukcji komórek nowotworowych, które eksprymują FGF2; w Douglas i in., Nat. Biotechnol. 14, 1574-1578, 1996; Douglas i in., Neuromuscular Disord. 7, 284-298, 1997 (anty-Ad/Folat) do transdukcji komórek nowotworowych, które eksprymują receptor kwasu foliowego na powierzchniach komórkowych.
W przypadku wektorów przenoszących geny, których naturalny tropizm zniesiono i zastą piono innym tropizmem, np. przez wprowadzenie liganda do domeny głowy białka włókna Ad5, może być konieczne zmodyfikowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej przez korzystnie stabilną ekspresję receptora, który rozpoznaje ten nowy ligand (Douglas i in., Nat. Biotechnol. 17, 470-475, 1999). Podobnie, możliwe jest stosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej do wytwarzania wektorów przenoszących geny, które wykazują brak wytwarzania jednego lub większej liczby białek strukturalnych. Dokonuje się tego dzięki komplementacji określonych braków wektora przenoszącego gen w cią g łej amniocytarnej linii komórkowej. Przykł adowo wektor adenowirusowy, który ma mutację w genie kodują cym biał ko wł ókna, moż na wytwarzać w amniocytarnej linii komórkowej, która komplementuje brak białka włókna. Uzyskuje się to przez wprowadzenie kasety ekspresyjnej włókna do amniocytarnej linii komórkowej i stabilną lub pobudzalną ekspresję białka włókna w tej amniocytarnej linii komórkowej (Von Seggern i in., J. Gen. Virol. 79, 1461-1468, 1998). Białko włókna eksprymowane w amniocytarnej linii komórkowej może być naturalnym, niemodyfikowanym białkiem włókna lub zmienionym białkiem włókna, np. o zmienionym tropizmie (Von Seggern i in., supra). W ciągłej amniocytarnej linii komórkowej można również wytwarzać wektory adenowirusowe całkowicie pozbawione białka włókna (Legrand i in., J. Virol., 73, 907-919, 1999; Von Seggern i in., J. Virol. 73, 1601-1608, 1999).
Korzystne jest zastosowanie amniocytarnych linii komórkowych, które eksprymują E1A i E1B, ponieważ, w przeciwieństwie do komórek 293, nie mogą powstawać wektory zdolne do replikacji przez rekombinację homologiczną. W szczególnej postaci tego zastosowania amniocytarnej linii komórkowej do wytwarzania wektorów przenoszących geny, tą linią komórkową jest linia komórkowa według wynalazku.
Geny terapeutyczne
Produktami genów, w szczególności genów terapeutycznych, które mogą być kodowane i być eksprymowane przez wektory wytwarzane w transformowanych komórkach amniocytarnych, to jest ciągłej amniocytarnej linii komórkowej, mogą być np. dowolne białka mięśniowe, czynniki krzepnięcia krwi, białka błonowe lub białka cyklu komórkowego. Przykładami białek, które mogą być eksprymowane przez wektory wytwarzane w transformowanych amniocytach, są dystrofina (Hoffman i in., Cell 51, 919, 1987), czynnik VIII (Wion i in., Nature 317, 726, 1985), białko regulatora transbłonowego, którego mutacje powodują mukowiscydozę (CFTR) (Anderson i in., Science 251, 679, 1991), transkarbamylaza ornitynowa (OTC) (Murakami i in., J. Biol. Chem., 263, 18437, 1988), alfa1-antytrypsyna (Fagerhol i in., w: Hum. Genet., tom 11, Harris, red., Plenum, Nowy Jork, str. 1, 1981). Geny kodujące białka są znane i można je klonować z bibliotek genomowego DNA lub cDNA. Przykładami takich genów są gen dystrofiny (Lee i in., Nature 349, 334, 1991), gen czynnika VIII (Toole i in., Nature 312, 342, 1984), gen CFTR (Rommens i in., Science 245, 1059, 1989, Riordan i in., Science 245, 1066, 1989), gen OTC (Horwich i in., Science 224, 1066, 1984), oraz gen alfa1-antytrypsyny (Lemarchand i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6482, 1992).
PL 205 966 B1
Przykładami innych genów eksprymowanych przez wektory, które można wytwarzać w transformowanych amniocytach, są gen p53 do leczenia zrakowaceń (Wills i in., Hum. Gene Ther. 5, 1079, 1994, Clayman i in., Cancer Res. 55, 1, 1995), gen Rb do leczenia proliferacyjnych zaburzeń naczyniowych (Chang i in., Science 267, 518, 1995) lub gen kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (HSV) typu 1 do leczenia zrakowaceń. Gen eksprymowany przez wektory wytwarzane w transformowanych amniocytach nie musi kodować białka. Zatem np. możliwa jest ekspresja funkcjonalnych RNA. Przykładami takich RNA są antysensowne RNA (Magrath, Ann. Oncol. 5, Suppl 1, 67-70, 1994, Milligan i in., Ann. NY Acad. Sci. 716, 228-241, 1994, Schreier, Pharma. Acta. Helv., 68, 145-159, 1994) oraz katalityczne RNA (Cech, Biochem. Soc. Trans. 21, 229-234, 1993; Cech, Gene 135, 33-36, 1993; Long i in., FASEB J. 7, 25-30, 1993; Rosi i in., Pharm. Therap. 50, 245-254, 1991).
Wektory wytwarzane w transformowanych amniocytach mogą, poza genem terapeutycznym, zawierać jakikolwiek gen reporterowy w celu umożliwienia lepszego śledzenia ekspresji wektora. Przykłady genów reporterowych są znane ze wcześniejszych prac i obejmują np. gen β-galaktozydazy (Fowler i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1507, 1977).
Wektory, które można wytwarzać w transformowanych amniocytach, mogą zawierać więcej niż jeden gen. Maksymalna liczba genów, które można wytwarzać w takich wektorach, zależy od zdolności do pobierania określonego wektora oraz od wielkości genów.
Wybór promotorów, które kontrolują ekspresję genów terapeutycznych wektorów wytwarzanych w transformowanych amniocytach nie ma istotnego znaczenia. Do ekspresji białka lub funkcjonalnego RNA można stosować promotory wirusowe lub niewirusowe, które wykazują konstytutywną, specyficzną tkankowo lub podlegającą regulacji aktywność. Do konstytutywnej ekspresji genu można stosować np. promotor SV40 lub cytomegalowirusa (Andersson i in., J. Biol. Chem. 264, 8222-8229, 1964). Stosowanie promotora mięśniowej kinazy kreatynowej (MCK) umożliwia specyficzną tkankowo ekspresję białka lub funkcjonalnego RNA w mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym. Ekspresję genu można ilościowo i jakościowo kontrolować dzięki zastosowaniu układu podlegającego regulacji (Furth i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9302-9306, 1994).
Wektory, które można wytwarzać w transformowanych amniocytach, mogą obejmować elementy genetyczne, które wpływają na zachowanie wektora wewnątrz komórki biorcy. Przykładami takich elementów są elementy, które ułatwiają kierowanie do jądra DNA wektora (Hodgson, Biotechnology 13, 222-225, 1995).
Wytwarzane w ten sposób wektory można stosować in vitro lub in vivo. Przenoszenie genów in vitro zachodzi poza organizmem, np. dzięki dodawaniu wektora do komórek w hodowli lub do komórek pierwotnych, które pobrano z organizmu w celach przenoszenia genów. W przypadku przenoszenia genów in vivo, cząstki wirusowe można stosować w różny sposób, zależnie od tkanki przeznaczonej do transdukcji. Przykładami są iniekcja do tętniczego lub żylnego układu naczyniowego, bezpośrednia iniekcja do odpowiedniej tkanki (np. wątroby, mózgu, mięśnia), wkraplanie do odpowiedniego narządu (np. płuc lub układu żołądkowo-jelitowego) lub bezpośrednie stosowanie na powierzchnię (np. skóry lub pęcherza moczowego).
Poniższe figury i przykłady szczegółowo ilustrują wynalazek.
Fig. 1 przedstawia schemat klonowania: Fig 1A przedstawia schematycznie etapy klonowania dla plazmidu STK146. Fig. 1B przedstawia około 15% lewostronnego genomu adenowirusa typu 5, włącznie z RNA E1, regionami kodującymi, początkowymi punktami transkrypcji E1A i E1B oraz miejscami donorowym i akceptorowym składania i sekwencjami poliadenylacji, które są istotne dla klonowania. Ważne jest, że miejsce donorowe składania przy 3511 parze zasad Ad5 zostaje zachowane podczas klonowania w plazmidzie STK146, ale że miejsce akceptorowe składania i sygnał poliadenylacji zastąpiono odpowiednimi funkcjami SV40. Ponadto, promotor E1A Ad5 zastąpiono promotorem PGK. A zatem, STK146 zawiera sekwencje Ad5 od pary zasad 505 do 5322, a linie komórkowe transformowane tym plazmidem nie zawierają żadnych sekwencji Ad5, które są obecne w wektorach adenowirusowych pierwszej lub drugiej generacji lub wirusów wspomagających z loxP.
Fig. 2 przedstawia wysepki komórkowe (fig. 2A i fig. 2B) otrzymane z amniocytów przez transformację adenowirusowymi funkcjami E1, i linie komórkowe N52.E6 (DSMZ ACC2416; fig. 2C) oraz N52.F4 (fig. 2D) sklonowane z pojedynczych komórek. Należy zauważyć, że tym razem linie komórkowe i klony pojedynczych komórek różnią się morfologicznie od amniocytów tym, że są zazwyczaj mniejsze i nie występuje kontaktowe hamowanie ich wzrostu.
Fig. 3 przedstawia status integracji STK146 w ośmiu różnych transformowanych E1 amniocytarnych liniach komórkowych określony metodą Southerna.
PL 205 966 B1
Fig. 4 przedstawia, wymienione w tabeli, wytwarzanie wektora adenowirusowego pierwszej generacji w różnych sklonowanych liniach komórkowych na podstawie bfu (jednostek tworzących komórki o barwie niebieskiej) na komórkę oraz wydajność transfekcji odpowiednich linii komórkowych na podstawie tworzenia łysinek.
Fig. 5 przedstawia ekspresję białek E1A i E1B Ad5 w jedenastu sklonowanych amniocytarnych liniach komórkowych (metoda Western blot).
Fig. 6 przedstawia przebieg czasowy syntezy rekombinowanych wektorów adenowirusowych w dwu sklonowanych liniach komórkowych, N52.E6 i N52.F4. Fig. 6A przedstawia syntezę wektora adenowirusowego pierwszej generacji, a fig. 6B przedtawia syntezę wektora o dużej pojemności DNA.
P r z y k ł a d y
1. Klonowania
Schemat klonowania przedstawia fig. 1.
a) Plazmid STK136
Plazmid STK136 zawiera promotor mysiej kinazy fosfoglicerynianowej (Seq. No. 1; Adra i in., Gene 60, 65-74, 1987) w pBluescript KsII (Stratagene) i utworzono go w następujący sposób:
3,5 ąg plazmidu PGK-hAAT (Kay i in., Hepatology 21, 815-819, 1995) strawiono EcoRV i frakcjonowano pod względem wielkości w 1,5% żelu agarozowym. Prążek 0,5 kb, zawierający pożądany fragment promotora PGK, wycięto po wybarwieniu bromkiem etydyny i DNA poddano elektroelucji. Jednocześnie, pBluescript KSII strawiono EcoRV i HincII, i wolne końce DNA zdefosforylowano. Następnie, po ekstrakcji fenolem/chloroformem i wytrąceniu etanolem, równomolowe ilości tych fragmentów DNA zligowano i transformowano ultrakompetentne bakterie XL-2 Blue (Stratagene). Klony plazmidowe scharakteryzowano przez trawienie restrykcyjne i otrzymany plazmid nazwano STK136 (izolat nr 6).
b) Plazmid STK137
Plazmid STK137 zawiera pełną kasetę ekspresyjną E1 Ad5, włącznie z 3'-końcowym sygnałem składania i sygnałem poliadenylacji z SV40, przy czym wytworzono go w następujący sposób:
Amplifikacja metodą PCR sekwencji pary zasad 505-841 Ad5 (PCR I) (Seq. No. 2) ng plazmidu pXC1 (Microbix) zamplifikowano z użyciem 400 ng każdego z oligonukleotydów 27759 (Seq. No. 3) i 27634 (Seq. No. 4), 0,2 mM dNTP i 1,25 U polimerazy Pfu w 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris/HCl, pH 8,75, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 100 μg/ml BSA w następujących warunkach:
I 10 minut w temperaturze 94°C,
1 minuta w temperaturze 94°C, minuty w temperaturze 50°C, minuty w temperaturze 72°C,
III 10 minut w temperaturze 72°C.
powtarzając etap II w 15 cyklach. DNA oczyszczono z użyciem zestawu do oczyszczania produktów PCR QIAquick (Qiagen) w sposób podany przez producenta i wytrącono etanolem.
W celu sklonowania fragmentu otrzymanego metodą PCR, 2,5 μg pBluescript KSII strawiono EcoRV i zdefosforylowano wolne końce DNA, zligowano z równomolowymi ilościami fragmentu otrzymanego przez PCR i stransformowano komórki XL-2 Blue. Otrzymany plazmid dalej w niniejszym opisie określany jest jako nr 1.
Amplifikacja metodą PCR sekwencji par zasad 3328-3522 Ad5 (PCR II) Seq. No. 5):
ng plazmidu pXC1 (Microbix) zamplifikowano z użyciem 400 ng każdego z oligonukleotydów 27635 (Seq. No. 6) i 27636 (Seq. No. 7) w warunkach opisanych powyżej. Po PCR, DNA wyekstrahowano fenolem/chloroformem, wytrącono etanolem, strawiono EcoRI, ponownie wyekstrahowano fenolem/chloroformem, wytrącono i rozpuszczono w 30 μl TE.
Amplifikacja metodą PCR 3'-końcowego sygnału składania i sygnału poliadenylacji z SV40 za pomocą par zasad 1978-2749 plazmidu pGL2-Basic (PCR III) (Seq. No. 8):
ng plazmidu pGL2-Basic (Promega, GenBank/EMBL, nr dostępu: X65323) zamplifikowano z użyciem 800 ng każdego z oligonukleotydów 27637 (Seq. No. 9) i 27638 (Seq. No. 10), 0,4 mM dNTP i 2,5 U polimerazy Pfu, w warunkach opisanych powyżej. Po PCR, DNA wyekstrahowano fenolem/chloroformem, wytrącono etanolem, strawiono EcoRI, ponownie wyekstrahowano fenolem/chloroformem, wytrącono etanolem i rozpuszczono w 30 μ TE. Następnie 10 μ każdego z DNA otrzymanego przez PCR II i III zligowano w objętości 50 μ!, wyekstrahowano fenolem/chloroformem, wytrącono etanolem i strawiono BamHI w objętości 100 μ. Po ponownej ekstrakcji fenolem/chloroformem i wytrąceniu etanolem, DNA zligowano z równomo18
PL 205 966 B1 lową ilością DNA pBluescript KSII, który uprzednio strawiono BamHI i zdefosforylowano. Otrzymany plazmid dalej w niniejszym opisie określany jest jako nr 29. Do dalszego klonowania, 3,5 μg DNA plazmidu nr 29 strawiono SacII i Bglll, zdefosforylowano, wyekstrahowano fenolem/chloroformem i wytrącono etanolem. Jednocześnie 3,5 μg pXC1 strawiono Bglll i SacII i fragment o długości 2,9 kb frakcjonowano przez elektroforezę i poddano elektroelucji. Równomolowe ilości obu DNA zligowano i stransformowano komórki XL-2 Blue. Otrzymany plazmid dalej w niniejszym opisie określany jest jako nr 5. Do końcowego klonowania STK137, plazmid nr 1 strawiono HincII i BspEI oraz frakcjonowano przez elektroforezę i poddano elektroelucji fragment o długości około 350 pz. Jako DNA wektora, plazmid nr 5 strawiono Kspl (izoschizomer SacII), końce wypełniono z użyciem polimerazy T4 i przeprowadzono ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolem. DNA następnie strawiono BspEI, końce zdefosforylowano i ponownie przeprowadzono ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolem. Oba DNA zligowano i stransformowano komórki XL-2 Blue. Otrzymany plazmid nazwano STK137 (izolat nr 34).
c) Plazmid STK146 (Seq. No. 18)
Plazmid STK146 zawiera promotor mysiej PGK, pełny region E1 Ad5 (pary zasad 505-3522) oraz 3'-końcowy sygnał składania i sygnał poliadenylacji SV40.
W celu sklonowania, 4 μg STK137 strawiono EcoRV i BamHI, frakcjonowano przez elektroforezę i fragment o długości 3,7 kb poddano elektroelucji. Ponadto, 3,3 μg STK136 strawiono EcoRV i BamHI, zdefosforylowano, wyekstrahowano fenolem/chloroformem i wytrącono etanolem. Zligowano równomolowe ilości obu plazmidów i stransformowano komórki XL-2 Blue. Otrzymany z tego plazmid nazwano STK139. Końcowa analiza sekwencji STK139 ujawniła mutację w pozycji 2613 bp (numeracja odnosi się do sekwencji DNA Ad5), która prowadzi do wymiany aminokwasu tyrozyny na asparaginę (2613 TAC GAC). Z tego powodu fragment zawierający mutację w STK139 zastąpiono fragmentem BstEII (1915 para zasad)-Bglll (3328 para zasad) fragment pXC1. Dokonano tego przez strawienie STK139 BstEII i BglII, defosforylację, ekstrakcję fenolem/chloroformem, wytrącenie etanolem, frakcjonowanie przez elektroforezę i elektroelucję fragmentu o długości 5,8 kb. pXC1 podobnie strawiono BstEII i BglII, frakcjonowano przez elektroforezę i poddano elektroelucji fragment o długości 1,4 kb. Po ligacji i transformacji zsekwencjonowano DNA z 4 klonów plazmidowych; dwa z nich zawierały właściwą sekwencję w pozycji 2613 bp. Izolat numer 2 zsekwencjonowano całkowicie i dalej w niniejszym opisie określa się go jako STK146.
d) Analiza sekwencji STK146
500 ng STK146 nr 2 zsekwencjonowano z użyciem 10 pmoli następujących sekwencji starterów w standardowych warunkach:
| Starter 28231 | Ad5 nt. | 901-920 | (Seq. No. 11) |
| 28232 | Ad5 nt. | 1301-1320 | (Seq. No. 12) |
| 28233 | Ad5 nt. | 1701-1720 | (Seq. No. 13) |
| 28234 | Ad5 nt. | 2100-2119 | (Seq. No. 14) |
| 28235 | Ad5 nt. | 2500-2519 | (Seq. No. 15) |
| 28236 | Ad5 nt. | 2853-2872 | (Seq. No. 16) |
| 28237 | Ad5 nt. | 3249-3268 | (Seq. No. 17) |
| 2. Hodowanie amniocytów pierwotnych i linii komórkowych |
Wszystkie odczynniki, pożywki i surowice do hodowli komórkowych zakupiono w GIBCO Life Technologies. Linię komórkową 293, którą stosowano jako kontrolę w niektórych doświadczeniach, hodowano w modyfikowanej pożywce Eagle'a (MEM) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 1x penicyliną/streptomycyną (100x, nr kat. 10378-016) w temperaturze 37°C, 95% wilgotności i 5% CO2. Nowe stransformowane E1 linie komórkowe utworzono z użyciem pierwotnych komórek płodowych, które otrzymano z płynu owodniowego przez punkcję owodni jako część diagnozy prenatalnej. Po biopsji komórki wysiewano rutynowymi metodami w plastikowych butelkach hodowlanych i hodowano w pożywce Ham F10 (odżywcza mieszanina Ham F10 z L-glutaminą, nr kat. 31550-023), 10% FCS, 2% Ultroser® G, 1x roztworem antybiotyków/środków przeciwgrzybiczych (100x, nr kat. 15254-012), 2,5 μg/ml Fungizione® (amfoteracyna B, nr kat. 15290-018). Część komórek przylegała do podstawy butelki do hodowli komórkowej i proliferowała. Ilość komórek wystarczająca do analizy chromosomów była dostępna po około 2 tygodniach. Po ustaleniu kariotypu, hodowle amniocytów o ilościowo i strukturalnie normalnych chromosomach stosowano do wytwarzania linii komórkowej. W różnych doświadczeniach stosowano komórki z trzech różnych źródeł, pobranych przez punkcję owodni 3, 6 lub 7 tygodni wcześniej. Stosowaną pożywką odżywczą była pożywka Ham F10, 10% FCS, 2% Ultroser®Cr, 1x roztwór antybiotyków/środków przeciwgrzybiczych, 2,5 μg/ml Fungizione®. Warunki hodowli były
PL 205 966 B1 następujące: temperatura 37°C, wilgotność 95% i 5% CO2. Po siedmiu dniach od transfekcji, amniocyty hodowano dalej w pożywce Ham F10, 10% FCS, 1x roztwór penicyliny/streptomycyny. Po wytworzeniu klonów pochodzących od pojedynczych komórek, przenoszono je na nowe płytki i hodowano dalej w alfa-MEM z 10% FCS, 1x roztworem penicyliny/streptomycyny.
3. Transfekcja i transformacja amniocytów
Do transfekcji amniocyty wysiewano w płytkach do hodowli komórkowych (średnica 60 mm, pole powierzchni 22,1 cm2) z gęstością 2-5 x 105 na płytkę i transfekowano następnego dnia. Do transfekcji, 20 μg plazmidu STK146 trawiono ScaI, ekstrahowano fenolem/chloroformem, wytrącano etanolem i rozpuszczano 20 μl TE, co dawało stężenie DNA wynoszące 0,5 μg/μl. We wstępnych doświadczeniach amniocyty transfekowano 3 lub 7 tygodni po pobraniu, każde w 5 płytkach, z użyciem zestawu do transfekcji Effectene, w następujący sposób, podany przez producenta (Qiagen), w następujący sposób:
μl STK146 strawionego Scal mieszano ze 146 μl buforu EC. Po dodaniu 8 μl roztworu wzmacniającego, roztwór krótko wytrząsano i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 5 minut. Następnie dodawano 25 μl Effectene i, po wytrząsaniu w ciągu 10 sekund, inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu dalszych 10 minut. W tym czasie od komórek ostrożnie odsysano pożywkę i zastępowano 4 ml świeżej pożywki odżywczej (patrz część 2. powyżej). Po zakończeniu inkubacji mieszaninę transfekcyjną mieszano z 1 ml świeżej pożywki odżywczej i ostrożnie dodawano kroplami do komórek. Komórki hodowano dalej w sposób opisany powyżej. Siedem dni po transfekcji komórki z każdej płytki przenoszono do większej płytki (średnica 150 mm, pole powierzchni 147,8 cm2). Wykonywano to przez ostrożne odsysanie pożywki i komórki przemyte PBS odłączano trypsyną, przenoszono do nowej płytki i dalej hodowano w sposób opisany w części 2. Od 18 do 22 dni po transfekcji, wysepki klonów komórkowych były wyraźnie widoczne i wyraźnie morfologicznie odróżnialne od komórek amniocytarnych (fig. 2A, 2B). Główna część hodowli niestransformowanych amniocytów składa się z większych komórek, które wykazują kontaktowe hamowanie ich wzrostu. Komórki w koloniach pochodzących od pojedynczej stransformowanej komórki są znacznie mniejsze, szybciej rosną i nie wykazują kontaktowego hamowania ich wzrostu. Rosną one w postaci wysepek komórkowych składających się z mniejszych komórek, które są silnie zbite ze sobą, jednoznaczne pod mikroskopem świetlnym i bez trudu można je identyfikować. Te wysepki komórkowe pobierano i przenoszono do nowej płytki (średnica 60 mm) zawierającej opisaną powyżej pożywkę. Po dalszym wzroście linie komórkowe przenoszono do płytek do hodowli komórkowych o polu powierzchni 147,8 cm2 i hodowano dalej w sposób opisany w części 2. Po pierwszym przeniesieniu do płytek do hodowli komórkowych o polu powierzchni 147,8 cm2, pasaże komórek kontynuowano. Początkowo hodowano około 40 klonów komórkowych z komórek, które transfekowano 3 i 7 tygodni po pobraniu. Następnie, to jest po przedłużonej hodowli, wystąpiła drastyczna zmiana w morfologii niektórych z klonów komórkowych, i wykazywały one niestabilność charakterystyki swojego wzrostu. Dalsze doświadczenia ograniczono do dalszej hodowli i analizy ośmiu morfologicznie stabilnych linii komórkowych. Określono je następująco: GS.A55 (utworzona z amniocytów transfekowanych 3 tygodnie po pobraniu), GS.N21, GS.N24, GS.N27, GS.N49, GS.N51, GS.N52, GS.N53 (utworzone z amniocytów transfekowanych siedem tygodni po pobraniu).
Podczas pierwszych pasaży wszystkie klony komórkowe wykazywały porównywalną morfologię, ale uległo to zmianie podczas następnych pasaży. Tak więc np. niektóre z klonów komórkowych zmieniły się przyjmując wysoce zaokrąglony kształt i, po dalszych pasażach, nie wykazywały już adhezji. Inne klony komórkowe wykazywały silną wakuolizację, ale nie wydawało się to wywierać żadnego wpływu na ich wzrost. Po sklonowaniu pojedynczych komórek, wszystkie linie komórkowe wykazywały jednolitą morfologię i np. N52.EG i N52.F4 miały wygląd komórek nabłonka. Były one porównywalne z komórkami 293 pod względem szybkości wzrostu i gęstości komórek.
4. Wydajność transformacji
W celu dokładniejszego określenia wydajności transformacji funkcjami E1, siedem nowych płytek, z których każda zawierała 2-5 x 105 komórek, stransfekowano w sposób opisany w części 3. Komórki przenoszono już po 24 godzinach od transfekcji do płytek o powierzchni 147,8 cm2 i hodowano dalej w pożywce Ham F-10, 10% płodowa surowica cielęca, 2% Ultroser® G, 1x roztwór antybiotyków/środków przeciwgrzybiczych, 2,5 μg/ml Fungizione w ciągu 5 dni oraz w pożywce Ham, 10% płodowa surowica cielęca, 1x roztwór penicyliny/streptomycyny w ciągu dalszych 25 dni. Niestransfekowane komórki na płytce w takich samych warunkach jako kontrolę. Podczas tego czasu zliczano wyraźnie odróżnialne morfologicznie (patrz fig. 2A, B) kolonie powstające w wyniku zdarzeń transformacji. Pochodzące od pojedynczych komórek klony zliczano na wszystkich płytkach do hodowli ko20
PL 205 966 B1 mórkowych, poza płytką nietransfekowanej kontroli. Średnio występowały 4 klony na płytkę, co odpowiadało wydajności transformacji 1 na 0,5-1 x 105 komórek.
5. Klonowanie pojedynczych komórek
Jak już wspomniano, niektóre z linii komórkowych wykazywały różne charakterystyki morfologiczne, co jest powodem, dla którego z każdej linii komórkowej wyprowadzono do dziesięciu linii pochodzących od pojedynczych kolonii. Pasaże pojedynczych linii komórkowych różniły się w tych przypadkach: GS.A55: P17, GS.N21: P24, GS.N24: P20, GS.N27: P19, GS.N49: P21, GS.N51: P39, GS.N52: P22, GS.N53: P20. W tym celu komórki odłączano od płytek do hodowli komórkowych i przy stężeniu 5 x 106 komórek/ml rozcieńczano 1:1000, 1:50000 i 1:500000 w pożywce odżywczej. 100 ąl komórek z każdego z rozcieńczeń wysiewano w 96-studzienkowych płytkach, i dalej hodowano klony komórkowe, które jednoznacznie pochodziły od pojedynczych komórek. Fig. 2C przedstawia linię komórkową GS.N52.E6 (DSMZ Nr), a fig. 2D przedstawia linię komórkową GS.N52.F4; obie linie komórkowe otrzymano z pierwotnej linii komórkowej GS.N52.
6. Charakteryzowanie linii komórkowych z E1
a) Analizy metodą Southern blot
Analizy metodą Southern blot prowadzono w celu badania statusu integracji regionu E1 w liniach komórkowych. Dokonano tego przez wyizolowanie genomowego DNA ze wszystkich ośmiu amniocytarnych klonów z E1 (patrz część 5.) i 5 ąg każdego z nich strawiono EcoRV, frakcjonowano przez elektroforezę i przenoszono na membranę nylonową. EcoRV przecina w jednym miejscu kasetę ekspresyjną E1. Hybrydyzacja z wyznakowanym promieniotwórczo DNA STK146 potwierdziła integrację 1-2 kopii STK146 we wszystkich klonach. Fig. 3 przedstawia wzór integracji w klonach komórkowych z E1. Dla wszystkich klonów występują głównie dwa wyraźne prążki odpowiadające fragmentom o wysokiej masie cząsteczkowej, co wskazuje na integrację jednej kopii. Każdy z klonów komórkowych GS.N24 i GS.N52 wykazywał dodatkowy prążek o stosunkowo silnej intensywności, co może wskazywać na integrację tandemowych kopii STK146. Dla żadnego klonu nie obserwowano prążków mniejszych niż STK146 strawiony Scal i EcoRV, co sugerowało, że wszystkie obecne zintegrowane fragmenty były całkowite i bez delecji.
b) Wytwarzanie rekombinowanych adenowirusów
Po klonowaniu pojedynczych komórek, klony komórkowe testowano pod względem ich zdolności do wytwarzania rekombinowanych adenowirusów. Dokonano tego raz przez zainfekowanie 3-5 klonów pochodzących od pojedynczych komórek każdej z linii komórkowych, o warstwie spójnej w około 70%, na 24-studzienkowych płytkach z około 5 MOI (wielokrotność infekcji) Adegal (rekombinowanego wektora adenowirusowego pierwszej generacji). Po 48 godzinach od infekcji, komórki lizowano przez trzykrotne zamrożenie i rozmrożenie i analizowano ilość wytwarzanego Adegal przez infekowanie komórek 293, a następnie wybarwianie (MacGregor i in., w: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, red. Humana, Clifton, NJ, tom 7, str. 217-235, (1991)) w celu wykrywania wytwarzania β-galaktozydazy (fig. 4). Metoda ta zapewnia jedynie przybliżone wytwarzanie rekombinowanego adenowirusa, ponieważ liczba komórek, i dlatego też liczba stosowanych wirusów, może różnić się z powodu ich wielkości i szybkości wzrostu. Klony komórkowe, które zapewniały największą wydajność w tym pierwszym teście, dokładniej analizowano w dalszym doświadczeniu. Dokonano tego przez wysianie około 3 x 107 komórek na 3 płytkach (średnica 100 mm, pole powierzchni 60 cm2). Komórki zliczano następnego dnia i infekowano dokładnie 5 MOI Adegal w oparciu o stwierdzoną liczbę komórek. Po 48 godzinach od infekcji, komórki zbierano i lizowano przez trzykrotne zamrażanie i rozmrażanie, a ilość wytwarzanego Adegal analizowano przez infekowanie komórek 293, a następnie wybarwianie. Wynik przedstawiono na fig. 4.
c) Wydajność transfekcji
Niektóre ze sklonowanych linii komórkowych testowano pod względem tworzenia łysinek. Dokonano tego przez transfekcję płytek z hodowlami spójnymi w około 70% (średnica 60 mm) 2 ąg infekcyjnego plazmidu GS66 metodą z użyciem fosforanu wapnia. Plazmid GS66 zawiera pełny genom adenowirusowy z delecją regionu E1 od nukleotydu 440 do nukleotydu 3523. Adenowirusowe terminalne sekwencje odwrócone (ITR) flankują w tym plazmidzie miejsca rozszczepiania restrykcyjnego Swal, tak że infekcyjnego wirusa i łysinki można tworzyć po transfekcji plazmidem strawionym Swal. Po około 24 godzinach od infekcji, komórki pokrywano około 10 ml MEM, 1% agarozy, 0,5x roztworem penicyliny/streptomycyny, 0,05% ekstraktem drożdżowym. Łysinki były widoczne po inkubacji w temperaturze 37°C, 95% wilgotności, 5% CO2 w ciągu około 1 tygodnia. Fig. 4 przedstawia liczbę zliczonych łysinek, w każdym przypadku uśrednioną dla dwóch niezależnych transfekcji.
PL 205 966 B1
d) Ekspresja funkcji E1A i E1B Ad5
Ekspresję białek E1A Ad5 i 21kd E1B w sklonowanych liniach komórkowych wykrywano drogą analizy metodą typu Western, z użyciem przeciwciał monoklonalnych.
Komórki ostrożnie oddzielano od płytki do hodowli komórkowej (średnica 10 cm) w PBS/1mM
EDTA, osadzano i zawieszano w 150 μΐ 50 mM Tris/HCl, pH 8, 140 mM NaCl, 0,5% NP40, 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,5 mM PMSF, 5% glicerolu. Komórki lizowano przez dodatkowe rozbijanie w homogenizatorze Dounce i odwirowywano przy 13000 obrotach na minutę w ciągu 10 minut, i stężenie białka w supernatancie oznaczano z użyciem zestawu do oznaczania białka (BIORAD, Microassay Procedure). 10 μg białka frakcjonowano w 12% żelu poliakryloamidowym z SDS, przenoszono na membranę nitrocelulozową (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) i inkubowano z przeciwciałem przeciw E1A lub 21kD E1B (Calbiochem, rozcieńczenie 1:300). Następnego dnia blot przemywano i poddawano reakcji z drugim przeciwciałem, skierowanym przeciw immunoglobulinom myszy (E1A) lub szczura (E1B), z którymi sprzęgnięto peroksydazę chrzanową. Reakcję peroksydazy chrzanowej rozpoczynano przez inkubację równych objętości roztworu wzmacniającego 1 i 2 (ECL, Amersham Pharmacia Biotech), a wywołaną w ten sposób reakcję fotochemiczną uwidaczniano przez krótką ekspozycję błony rentgenograficznej. Fig. 5 przedstawia wynik analizy metodą Western.
e) Przebieg czasowy syntezy rekombinowanych wektorów adenowirusowych pierwszej generacji i wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA
Dwie sklonowane linie komórkowe, N52.E6 i N52.F4, wykazywały najwyższe wydajności rekombinowanych wektorów adenowirusowych pierwszej generacji w doświadczeniach opisanych powyżej. Dalsza znajomość przebiegów czasowych jest ważna dla optymalnego wytwarzania wektorów adenowirusowych, szczególnie gdy te komórki przystosowane są do hodowli zawiesinowych i powodzenia infekcji nie można sprawdzać poprzez wpływ cytopatyczny. Do tej analizy, kilka płytek (średnica 6 cm), każdą z 3 x 106 komórek, infekowano 5 MOI Adegal i zbierano po podanych czasach od infekcji. Wydajność rekombinowanego adenowirusa ponownie określano przez infekowanie komórek 293, wybarwianie i zliczanie komórek o barwie niebieskiej (fig. 6 A).
W przyszłości zamierza się także stosować nowe linie komórkowe do wytwarzania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności (patrz powyżej). Wytwarzanie tych wektorów adenowirusowych wymaga wirusów wspomagających, które zapewniają wydeletowane funkcje i białka do litycznego cyklu infekcyjnego w położeniu trans. Sygnał upakowywania tych wirusów wspomagających deletuje się po infekcji za pomocą sekwencji rozpoznawania loxP i rekombinazy Cre, eksprymowanej przez linię komórkową. Dlatego też w przyszłych doświadczeniach zamierza się transfekować nowe transformowane E1 linie komórkowe plazmidem eksprymującym Cre, przy czym rekombinaza będzie stabilnie eksprymowana.
We wstępnych doświadczeniach badano, czy nowe amniocyty z E1 są również zdolne do wytwarzania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA oraz czy kinetyka wytwarzania i ilość wytwarzanych wektorów odpowiadają tym uzyskiwanym dla istniejących komórek 293, które eksprymują Cre. W tym celu kilka płytek, każdą z 3 x 106 komórek linii komórkowych N52.E6 i N52.F4, infekowano 5 MOI wirusa wspomagającego z loxP i 10 MOI AdGS46 (wektora adenowirusowego, który eksprymuje β-gal, o dużej pojemności DNA) i zbierano w podanych czasach po infekcji. Wydajność wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA, które eksprymowały β-gal, ponownie określano przez infekowanie komórek 293, wybarwianie i zliczanie komórek o barwie niebieskiej (fig. 6B). Ilość wektorów adenowirusowych o dużej pojemności DNA syntetyzowanych w amniocytach odpowiada tej wytwarzanej także w komórkach 293 eksprymujących Cre (dane nieprzedstawione).
PL 205 966 B1
Wykaz sekwencji <110> Stefan Kochanek <120> Ciągła amniocytarna linia komórkowa, sposób jej wytwarzania, zastosowanie amniocytów, zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego, zastosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej i sposób wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowych
| <160> | 18 |
| <170> | Word 6.0, PC-DOS/MS-DOS |
| <210> | 1 |
| <211> | 513 |
| <212> | DNA |
| <213> | Mysz, promotor kinazy fosfoglicerynianowej |
| <400> | 1 |
| 1 | GAATTCTACC GGGTAGGGGA GGCGCTTTTC CCAAGGCAGT CTGGAGCATG |
| 51 | CGCTTTAGCA GCCCCGCTGG CACTTGGCGC TACACAAGTG GCCTCTGGCC |
| 101 | TCGCACACAT TCCACATCCA CCGGTAGGCG CCAACCGGCT CCGTTCTTTG |
| 151 | GTGGCCCCTT CGCGCCACCT TCTACTCCTC CCCTAGTCAG GAAGTTCCCC |
| 201 | CCCGCCCCGC AGCTCGCGTC GTGCAGGACG TGACAAATGG AAGTAGCACG |
| 251 | TCTCACTAGT CTCGTGCAGA TGGACAGCAC CGCTGAGCAA TGGAAGCGGG |
| 301 | TAGGCCTTTG GGGCAGCGGC CAATAGCAGC TTTGCTCCTT CGCTTTCTGG |
| 351 | GCTCAGAGGC TGGGAAGGGG TGGGTCCGGG GGCGGGCTCA GGGGCGGGCT |
| 401 | CAGGGGCGGG GCGGGCGCCC GAAGGTCCTC CGGAGGCCCG GCATTCTCGC |
| 451 | ACGCTTCAAA AGCGCACGTC TGCCGCGCTG TTCTCCTCTT CCTCATCTCC |
| 501 | GGGCCTTTCG ACC |
PL 205 966 B1
| <210> | 2 |
| <211> | 336 |
| <212> | DNA |
| <213> | Ad 5 |
| <400> | 2 |
| 1 | GAGTGCCAGC | GAGTAGAGTT | TTCTCCTCCG | AGCCGCTCCG | ACACCGGGAC |
| 51 | TGAAAATGAG | ACATATTATC | TGCCACGGAG | GTGTTATTAC | CGAAGAAATG |
| 101 | GCCGCCAGTC | TTTTGGACCA | GCTGATCGAA | GAGGTACTGG | CTGATAATCT |
| 151 | TCCACCTCCT | AGCCATTTTG | AACCACCTAC | CCTTCACGAA | CTGTATGATT |
| 201 | TAGACGTGAC | GGCCCCCGAA | GATCCCAACG | AGGAGGCGGT | TTCGCAGATT |
| 251 | TTTCCCGACT | CTGTAATGTT | GGCGGTGCAG | GAAGGGATTG | ACTTACTCAC |
| 301 | TTTTCCGCCG | GCGCCCGGTT | CTCCGGAGCC | GCCTCAC |
| <210> | 3 |
| <211> | 29 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencj a |
| <400> | 3 |
ATCGAGTGCC AGCGAGTAGA GTTTTCTCC 29
| <210> | 4 |
| <211> | 22 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
<400> 4
GTGAGGCGGC TCCGGAGAAC CG 22 <210> 5 <211> 216
PL 205 966 B1 <212> DNA <213> Ad5 <400> 5
| 1 51 101 151 201 | CTCGCGGATC GGTGCAGACC ATGCTGGATG CACCCGCGCT AAATGGAATT | CAGATCTGGA AGGTGCTGAG GTACGATGAG ACCCGCACCA CTGCGAGTGT GGCGGTAAAC ATATTAGGAA CCAGCCTGTG TGACCGAGGA GCTGAGGCCC GATCACTTGG TGCTGGCCTG GAGTTTGGCT CTAGCGATGA AGATACAGAT TGAGGTACTG CCGGTC |
| <210> | 6 | |
| <211> | 32 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | Sekwencja | sztuczna |
<400> 6
GACGCCAATT CCATTTCAGT ACCTCAATCT GT 32
| <210> | 7 |
| <211> | 32 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
| <400> | 7 |
CTCGCGGATC CAGATCTGGA AGGTGCTGA GG 32 <210> 8 <211> 782
PL 205 966 B1 <212> DNA <213> SV40 (pGL2basic), Genbank nr dostępu Χ65323 <400> 8
| 1 | CGACTGAATT | CAATTTTTAA | GTGTATAATG | TGTTAAACTA | CTGATTCTAA |
| 51 | TTGTTTGTGT | ATTTTAGATT | CCAACCTATG | GAACTGATGA | ATGGGAGCAG |
| 101 | TGGTGGAATG | CCTTTAATGA | GGAAAACCTG | TTTTGCTCAG | AAGAAATGCC |
| 151 | ATCTAGTGAT | GATGAGGCTA | CTGCTGACTC | TCAACATTCT | ACTCCTCCAA |
| 201 | AAAAGAAGAG | AAAGGTAGAA | GACCCCAAGG | ACTTTCCTTC | AGAATTGCTA |
| 251 | AGTTTTTTGA | GTCATGCTGT | GTTTAGTAAT | AGAACTCTTG | CTTGCTTTGC |
| 301 | TATTTACACC | ACAAAGGAAA | AAGCTGCACT | GCTATACAAG | AAAATTATGG |
| 351 | AAAAATATTC | TGTAACCTTT | ATAAGTAGGC | ATAACAGTTA | TAATCATAAC |
| 401 | ATACTGTTTT | TTCTTACTCC | ACACAGGCAT | AGAGTGTCTG | CTATTAATAA |
| 451 | CTATGCTCAA | AAATTGTGTA | CCTTTAGCTT | TTTAATTTGT | AAAGGGGTTA |
| 501 | ATAAGGAATA | TTTGATGTAT | AGTGCCTTGA | CTAGAGATCA | TAATCAGCCA |
| 551 | TACCACATTT | GTAGAGGTTT | TACTTGCTTT | AAAAAACCTC | CCACACCTCC |
| 601 | CCCTGAACCT | GAAACATAAA | ATGAATGCAA | TTGTTGTTGT | TAACTTGTTT |
| 651 | ATTGCAGCTT | ATAATGGTTA | CAAATAAAGC | AATAGCATCA | CAAATTTCAC |
| 701 | AAATAAAGCA | TTTTTTTCAC | TGCATTCTAG | TTGTGGTTTG | TCCAAACTCA |
| 751 | TCAATGTATC | TTATCATGTC | TGGATCCGTC | GA | |
| <210> | 9 | ||||
| <211> | 32 | ||||
| <212> | DNA | ||||
| <213> | Sekwencja | sztuczna |
<400> 9
PL 205 966 B1
CGACTGAATT CAATTTTTAA GTGTATAATG TG 32
| <210> | 10 |
| <211> | 27 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
| <400> | 10 |
TCGACGGATC CAGACATGAT AAGATAC 27
| <210> | 11 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
| <400> | 11 |
CCTTGTACCG GAGGTGATCG 20
| <210> | 12 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
| <400> | 12 |
TGGCGCCTGC TATCCTGAGA 20 <210> 13
PL 205 966 B1
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
| <400> | 13 |
TACATCTGAC CTCATGGAGG 20
| <210> | 14 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
| <400> | 14 |
CAAGAATCGC CTGCTACTGT 20
| <210> | 15 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
| <400> | 15 |
GGCTGCAGCC AGGGGATGAT 20
| <210> | 16 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
PL 205 966 B1 <400> 16
AGGGTTCGGG GCTGTGCCTT 20
| <210> | 17 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | Sekwencja sztuczna |
| <400> | 17 |
CCTGAACGGG GTGTTTGACA 20
| <210> | 18 |
| <211> | 7090 |
| <212> | DNA |
| <213> | Plazmid STK146 |
| <400> | 18 |
| 1 | GTGGCACTTT | TCGGGGAAAT | GTGCGCGGAA | CCCCTATTTG | TTTATTTTTC |
| 51 | TAAATACATT | CAAATATGTA | TCCGCTCATG | AGACAATAAC | CCTGATAAAT |
| 101 | GCTTCAATAA | TATTGAAAAA | GGAAGAGTAT | GAGTATTCAA | CATTTCCGTG |
| 151 | TCGCCCTTAT | TCCCTTTTTT | GCGGCATTTT | GCCTTCCTGT | TTTTGCTCAC |
| 201 | CCAGAAACGC | TGGTGAAAGT | AAAAGATGCT | GAAGATCAGT | TGGGTGCACG |
| 251 | AGTGGGTTAC | ATCGAACTGG | ATCTCAACAG | CGGTAAGATC | CTTGAGAGTT |
| 301 | TTCGCCCCGA | AGAACGTTTT | CCAATGATGA | GCACTTTTAA | AGTTCTGCTA |
| 351 | TGTGGCGCGG | TATTATCCCG | TATTGACGCC | GGGCAAGAGC | AACTCGGTCG |
| 401 | CCGCATACAC | TATTCTCAGA | ATGACTTGGT | TGAGTACTCA | CCAGTCACAG |
PL 205 966 B1
| 451 | AAAAGCATCT | TACGGATGGC | ATGACAGTAA | GAGAATTATG | CAGTGCTGCC |
| 501 | ATAACCATGA | GTGATAACAC | TGCGGCCAAC | TTACTTCTGA | CAACGATCGG |
| 551 | AGGACCGAAG | GAGCTAACCG | CTTTTTTGCA | CAACATGGGG | GATCATGTAA |
| 601 | CTCGCCTTGA | TCGTTGGGAA | CCGGAGCTGA | ATGAAGCCAT | ACCAAACGAC |
| 651 | GAGCGTGACA | CCACGATGCC | TGTAGCAATG | GCAACAACGT | TGCGCAAACT |
| 701 | ATTAACTGGC | GAACTACTTA | CTCTAGCTTC | CCGGCAACAA | TTAATAGACT |
| 751 | GGATGGAGGC | GGATAAAGTT | GCAGGACCAC | TTCTGCGCTC | GGCCCTTCCG |
| 801 | GCTGGCTGGT | TTATTGCTGA | TAAATCTGGA | GCCGGTGAGC | GTGGGTCTCG |
| 851 | CGGTATCATT | GCAGCACTGG | GGCCAGATGG | TAAGCCCTCC | CGTATCGTAG |
| 901 | TTATCTACAC | GACGGGGAGT | CAGGCAACTA | TGGATGAACG | AAATAGACAG |
| 951 | ATCGCTGAGA | TAGGTGCCTC | ACTGATTAAG | CATTGGTAAC | TGTCAGACCA |
| 1001 | AGTTTACTCA | TATATACTTT | AGATTGATTT | AAAACTTCAT | TTTTAATTTA |
| 1051 | AAAGGATCTA | GGTGAAGATC | CTTTTTGATA | ATCTCATGAC | CAAAATCCCT |
| 1101 | TAACGTGAGT | TTTCGTTCCA | CTGAGCGTCA | GACCCCGTAG | AAAAGATCAA |
| 1151 | AGGATCTTCT | TGAGATCCTT | TTTTTCTGCG | CGTAATCTGC | TGCTTGCAAA |
| 1201 | CAAAAAAACC | ACCGCTACCA | GCGGTGGTTT | GTTTGCCGGA | TCAAGAGCTA |
| 1251 | CCAACTCTTT | TTCCGAAGGT | AACTGGCTTC | AGCAGAGCGC | AGATACCAAA |
| 1301 | TACTGTCCTT | CTAGTGTAGC | CGTAGTTAGG | CCACCACTTC | AAGAACTCTG |
| 1351 | TAGCACCGCC | TACATACCTC | GCTCTGCTAA | TCCTGTTACC | AGTGGCTGCT |
| 1401 | GCCAGTGGCG | ATAAGTCGTG | TCTTACCGGG | TTGGACTCAA | GACGATAGTT |
| 1451 | ACCGGATAAG | GCGCAGCGGT | CGGGCTGAAC | GGGGGGTTCG | TGCACACAGC |
| 1501 | CCAGCTTGGA | GCGAACGACC | TACACCGAAC | TGAGATACCT | ACAGCGTGAG |
| 1551 | CTATGAGAAA | GCGCCACGCT | TCCCGAAGGG | AGAAAGGCGG | ACAGGTATCC |
| 1601 | GGTAAGCGGC | AGGGTCGGAA | . CAGGAGAGCG | CACGAGGGAG | CTTCCAGGGG |
| 1651 | GAAACGCCTG | GTATCTTTAT | AGTCCTGTCG | GGTTTCGCCA | CCTCTGACTT |
| 1701 | GAGCGTCGAT | TTTTGTGATG | CTCGTCAGGG | GGGCGGAGCC | TATGGAAAAA |
| 1751 | CGCCAGCAAC | GCGGCCTTTT | TACGGTTCCT | GGCCTTTTGC | TGGCCTTTTG |
PL 205 966 B1
| 1801 | CTCACATGTT | CTTTCCTGCG | TTATCCCCTG | ATTCTGTGGA | TAACCGTATT |
| 1851 | ACCGCCTTTG | AGTGAGCTGA | TACCGCTCGC | CGCAGCCGAA | CGACCGAGCG |
| 1901 | CAGCGAGTCA | GTGAGCGAGG | AAGCGGAAGA | GCGCCCAATA | CGCAAACCGC |
| 1951 | CTCTCCCCGC | GCGTTGGCCG | ATTCATTAAT | GCAGCTGGCA | CGACAGGTTT |
| 2001 | CCCGACTGGA | AAGCGGGCAG | TGAGCGCAAC | GCAATTAATG | TGAGTTAGCT |
| 2051 | CACTCATTAG | GCACCCCAGG | CTTTACACTT | TATGCTTCCG | GCTCGTATGT |
| 2101 | TGTGTGGAAT | TGTGAGCGGA | TAACAATTTC | ACACAGGAAA | CAGCTATGAC |
| 2151 | CATGATTACG | CCAAGCGCGC | AATTAACCCT | CACTAAAGGG | AACAAAAGCT |
| 2201 | GGGTACCGGG | CCCCCCCTCG | AGGTCATCGA | ATTCTACCGG | GTAGGGGAGG |
| 2251 | CGCTTTTCCC | AAGGCAGTCT | GGAGCATGCG | CTTTAGCAGC | CCCGCTGGCA |
| 2301 | CTTGGCGCTA | CACAAGTGGC | CTCTGGCCTC | GCACACATTC | CACATCCACC |
| 2351 | GGTAGGCGCC | AACCGGCTCC | GTTCTTTGGT | GGCCCCTTCG | CGCCACCTTC |
| 2401 | TACTCCTCCC | CTAGTCAGGA | AGTTCCCCCC | CGCCCCGCAG | CTCGCGTCGT |
| 2451 | GCAGGACGTG | ACAAATGGAA | GTAGCACGTC | TCACTAGTCT | CGTGCAGATG |
| 2501 | GACAGCACCG | CTGAGCAATG | GAAGCGGGTA | GGCCTTTGGG | GCAGCGGCCA |
| 2551 | ATAGCAGCTT | TGCTCCTTCG | CTTTCTGGGC | TCAGAGGCTG | GGAAGGGGTG |
| 2601 | GGTCCGGGGG | CGGGCTCAGG | GGCGGGCTCA | GGGGCGGGGC | GGGCGCCCGA |
| 2651 | AGGTCCTCCG | GAGGCCCGGC | ATTCTCGCAC | GCTTCAAAAG | CGCACGTCTG |
| 2701 | CCGCGCTGTT | CTCCTCTTCC | TCATCTCCGG | GCCTTTCGAC | CAGCTTGATA |
| 2751 | TCGAGTGCCA | GCGAGTAGAG | TTTTCTCCTC | CGAGCCGCTC | CGACACCGGG |
| 2801 | actgaaaatg | AGACATATTA | TCTGCCACGG | AGGTGTTATT | ACCGAAGAAA |
| 2851 | TGGCCGCCAG | TCTTTTGGAC | CAGCTGATCG | AAGAGGTACT | GGCTGATAAT |
| 2901 | CTTCCACCTC | CTAGCCATTT | TGAACCACCT | ACCCTTCACG | AACTGTATGA |
| 2951 | TTTAGACGTG | ACGGCCCCCG | AAGATCCCAA | CGAGGAGGCG | GTTTCGCAGA |
| 3001 | TTTTTCCCGA | CTCTGTAATG | TTGGCGGTGC | AGGAAGGGAT | TGACTTACTC |
| 3051 | ACTTTTCCGC | CGGCGCCCGG | TTCTCCGGAG | CCGCCTCACC | TTTCCCGGCA |
| 3101 | GCCCGAGCAG | CCGGAGCAGA | GAGCCTTGGG | TCCGGTTTCT | ATGCCAAACC |
PL 205 966 B1
| 3151 | TTGTACCGGA | GGTGATCGAT | CTTACCTGCC | ACGAGGCTGG | CTTTCCACCC |
| 3201 | AGTGACGACG | AGGATGAAGA | GGGTGAGGAG | TTTGTGTTAG | ATTATGTGGA |
| 3251 | GCACCCCGGG | CACGGTTGCA | GGTCTTGTCA | TTATCACCGG | AGGAATACGG |
| 3301 | GGGACCCAGA | TATTATGTGT | TCGCTTTGCT | ATATGAGGAC | CTGTGGCATG |
| 3351 | TTTGTCTACA | gtaagtgaaa | ATTATGGGCA | GTGGGTGATA | GAGTGGTGGG |
| 3401 | TTTGGTGTGG | TAATTTTTTT | TTTAATTTTT | ACAGTTTTGT | GGTTTAAAGA |
| 3451 | ATTTTGTATT | GTGATTTTTT | TAAAAGGTCC | TGTGTCTGAA | CCTGAGCCTG |
| 3501 | AGCCCGAGCC | agaaccggag | CCTGCAAGAC | CTACCCGCCG | TCCTAAAATG |
| 3551 | GCGCCTGCTA | TCCTGAGACG | CCCGACATCA | CCTGTGTCTA | GAGAATGCAA |
| 3601 | TAGTAGTACG | GATAGCTGTG | ACTCCGGTCC | TTCTAACACA | CCTCCTGAGA |
| 3651 | TACACCCGGT | GGTCCCGCTG | TGCCCCATTA | AACCAGTTGC | CGTGAGAGTT |
| 3701 | GGTGGGCGTC | GCCAGGCTGT | GGAATGTATC | GAGGACTTGC | TTAACGAGCC |
| 3751 | TGGGCAACCT | TTGGACTTGA | GCTGTAAACG | CCCCAGGCCA | TAAGGTGTAA |
| 3801 | ACCTGTGATT | GCGTGTGTGG | TTAACGCCTT | TGTTTGCTGA | ATGAGTTGAT |
| 3851 | GTAAGTTTAA | TAAAGGGTGA | GATAATGTTT | AACTTGCATG | GCGTGTTAAA |
| 3901 | TGGGGCGGGG | CTTAAAGGGT | ATATAATGCG | CCGTGGGCTA | ATCTTGGTTA |
| 3951 | CATCTGACCT | CATGGAGGCT | TGGGAGTGTT | TGGAAGATTT | TTCTGCTGTG |
| 4001 | CGTAACTTGC | TGGAACAGAG | CTCTAACAGT | ACCTCTTGGT | TTTGGAGGTT |
| 4051 | TCTGTGGGGC | TCATCCCAGG | CAAAGTTAGT | CTGCAGAATT | AAGGAGGATT |
| 4101 | ACAAGTGGGA | ATTTGAAGAG | CTTTTGAAAT | CCTGTGGTGA | GCTGTTTGAT |
| 4151 | TCTTTGAATC | TGGGTCACCA | GGCGCTTTTC | CAAGAGAAGG | TCATCAAGAC |
| 4201 | TTTGGATTTT | TCCACACCGG | GGCGCGCTGC | GGCTGCTGTT | GCTTTTTTGA |
| 4251 | gttttataaa | GGATAAATGG | AGCGAAGAAA | CCCATCTGAG | CGGGGGGTAC |
| 4301 | CTGCTGGATT | TTCTGGCCAT | GCATCTGTGG | AGAGCGGTTG | TGAGACACAA |
| 4351 | GAATCGCCTG | CTACTGTTGT | CTTCCGTCCG | CCCGGCGATA | ATACCGACGG |
| 4401 | AGGAGCAGCA | GCAGCAGCAG | GAGGAAGCCA | GGCGGCGGCG | GCAGGAGCAG |
| 4451 | AGCCCATGGA | ACCCGAGAGC | CGGCCTGGAC | CCTCGGGAAT | GAATGTTGTA |
PL 205 966 B1
| 4501 | CAGGTGGCTG | AACTGTATCC | AGAACTGAGA | CGCATTTTGA | CAATTACAGA |
| 4551 | GGATGGGCAG | GGGCTAAAGG | GGGTAAAGAG | GGAGCGGGGG | GCTTGTGAGG |
| 4601 | CTACAGAGGA | GGCTAGGAAT | CTAGCTTTTA | GCTTAATGAC | CAGACACCGT |
| 4651 | CCTGAGTGTA | TTACTTTTCA | ACAGATCAAG | GATAATTGCG | CTAATGAGCT |
| 4701 | TGATCTGCTG | GCGCAGAAGT | ATTCCATAGA | GCAGCTGACC | ACTTACTGGC |
| 4751 | TGCAGCCAGG | GGATGATTTT | GAGGAGGCTA | TTAGGGTATA | TGCAAAGGTG |
| 4801 | GCACTTAGGC | CAGATTGCAA | GTACAAGATC | AGCAAACTTG | TAAATATCAG |
| 4851 | GAATTGTTGC | TACATTTCTG | GGAACGGGGC | CGAGGTGGAG | ATAGATACGG |
| 4901 | AGGATAGGGT | GGCCTTTAGA | TGTAGCATGA | TAAATATGTG | GCCGGGGGTG |
| 4951 | CTTGGCATGG | ACGGGGTGGT | TATTATGAAT | GTAAGGTTTA | CTGGCCCCAA |
| 5001 | TTTTAGCGGT | ACGGTTTTCC | TGGCCAATAC | CAACCTTATC | CTACACGGTG |
| 5051 | TAAGCTTCTA | TGGGTTTAAC | AATACCTGTG | TGGAAGCCTG | GACCGATGTA |
| 5101 | AGGGTTCGGG | GCTGTGCCTT | TTACTGCTGC | TGGAAGGGGG | TGGTGTGTCG |
| 5151 | CCCCAAAAGC | AGGGCTTCAA | TTAAGAAATG | CCTCTTTGAA | AGGTGTACCT |
| 5201 | TGGGTATCCT | GTCTGAGGGT | AACTCCAGGG | TGCGCCACAA | TGTGGCCTCC |
| 5251 | GACTGTGGTT | GCTTCATGCT | agtgaaaagc | GTGGCTGTGA | TTAAGCATAA |
| 5301 | CATGGTATGT | GGCAACTGCG | AGGACAGGGC | CTCTCAGATG | CTGACCTGCT |
| 5351 | CGGACGGCAA | CTGTCACCTG | CTGAAGACCA | TTCACGTAGC | CAGCCACTCT |
| 5401 | CGCAAGGCCT | GGCCAGTGTT | TGAGCATAAC | ATACTGACCC | GCTGTTCCTT |
| 5451 | GCATTTGGGT | AACAGGAGGG | GGGTGTTCCT | ACCTTACCAA | TGCAATTTGA |
| 5501 | GTCACACTAA | GATATTGCTT | GAGCCCGAGA | GCATGTCCAA | GGTGAACCTG |
| 5551 | AACGGGGTGT | TTGACATGAC | CATGAAGATC | TGGAAGGTGC | TGAGGTACGA |
| 5601 | TGAGACCCGC | ACCAGGTGCA | GACCCTGCGA | GTGTGGCGGT | AAACATATTA |
| 5651 | GGAACCAGCC | TGTGATGCTG | GATGTGACCG | AGGAGCTGAG | GCCCGATCAC |
| 5701 | TTGGTGCTGG | CCTGCACCCG | CGCTGAGTTT | GGCTCTAGCG | ATGAAGATAC |
| 5751 | AGATTGAGGT | ACTGAAATGG | AATTCCTCTA | GTGATGATGA | GGCTACTGCT |
| 5801 | GACTCTCAAC | ATTCTACTCC | TCCAAAAAAG | AAGAGAAAGG | TAGAAGACCC |
PL 205 966 B1
| 5851 | CAAGGACTTT | CCTTCAGAAT | TGCTAAGTTT | TTTGAGTCAT | GCTGTGTTTA |
| 5901 | GTAATAGAAC | TCTTGCTTGC | TTTGCTATTT | ACACCACAAA | GGAAAAAGCT |
| 5951 | GCACTGCTAT | ACAAGAAAAT | TATGGAAAAA | TATTCTGTAA | CCTTTATAAG |
| 6001 | TAGGCATAAC | AGTTATAATC | ATAACATACT | GTTTTTTCTT | ACTCCACACA |
| 6051 | GGCATAGAGT | GTCTGCTATT | AATAACTATG | CTCAAAAATT | GTGTACCTTT |
| 6101 | AGCTTTTTAA | TTTGTAAAGG | GGTTAATAAG | GAATATTTGA | TGTATAGTGC |
| 6151 | CTTGACTAGA | GATCATAATC | AGCCATACCA | CATTTGTAGA | GGTTTTACTT |
| 6201 | GCTTTAAAAA | ACCTCCCACA | CCTCCCCCTG | AACCTGAAAC | ATAAAATGAA |
| 6251 | TGCAATTGTT | GTTGTTAACT | TGTTTATTGC | AGCTTATAAT | GGTTACAAAT |
| 6301 | AAAGCAATAG | CATCACAAAT | TTCACAAATA | AAGCATTTTT | TTCACTGCAT |
| 6351 | TCTAGTTGTG | GTTTGTGCAA | ACTCATCAAT | GTATCTTATC | ATGTCTGGAT |
| 6401 | CCACTAGTTC | TAGAGCGGCC | GCCACCGCGG | TGGAGCTCCA | ATTCGCCCTA |
| 6451 | TAGTGAGTCG | TATTACGCGC | GCTCACTGGC | CGTCGTTTTA | CAACGTCGTG |
| 6501 | ACTGGGAAAA | CCCTGGCGTT | ACCCAACTTA | ATCGCCTTGC | AGCACATCCC |
| 6551 | CCTTTCGCCA | GCTGGCGTAA | TAGCGAAGAG | GCCCGCACCG | ATCGCCCTTC |
| 6601 | CCAACAGTTG | CGCAGCCTGA | ATGGCGAATG | GGACGCGCCC | TGTAGCGGCG |
| 6651 | CATTAAGCGC | GGCGGGTGTG | GTGGTTACGC | GCAGCGTGAC | CGCTACACTT |
| 6701 | GCCAGCGCCC | TAGCGCCCGC | TCCTTTCGCT | TTCTTCCCTT | CCTTTCTCGC |
| 6751 | CACGTTCGCC | GGCTTTCCCC | GTCAAGCTCT | AAATCGGGGG | CTCCCTTTAG |
| 6801 | GGTTCCGATT | TAGTGCTTTA | CGGCACCTCG | ACCCCAAAAA | ACTTGATTAG |
| 6851 | GGTGATGGTT | CACGTAGTGG | GCCATCGCCC | TGATAGACGG | TTTTTCGCCC |
| 6901 | TTTGACGTTG | GAGTCCACGT | TCTTTAATAG | TGGACTCTTG | TTCCAAACTG |
| 6951 | GAACAACACT | CAACCCTATC | TCGGTCTATT | CTTTTGATTT | ATAAGGGATT |
| 7001 | TTGCCGATTT | CGGCCTATTG | GTTAAAAAAT | GAGCTGATTT | AACAAAAATT |
| 7051 | TAACGCGAAT | TTTAACAAAA | TATTAACGCT | TACAATTTAG |
Claims (21)
- Zastrzeżenia patentowe1. Ciągła amniocytarna linia komórkowa zawierająca kwas nukleinowy kodujący produkty genowe regionów E1A i E1B adenowirusa.
- 2. Linia komórkowa według zastrz. 1, w której kwas nukleinowy koduje również produkty genowe regionów E2A, E2B i/lub E4 adenowirusa i/lub rekombinazy Cre.
- 3. Linia komórkowa według zastrz. 1 albo 2, w przypadku której ekspresja produktu genowego regionu E1A zachodzi pod kontrolą promotora konstytutywnego, korzystnie promotora kinazy fosfoglicerynianowej (PGK).
- 4. Linia komórkowa według zastrz. 1 - 3, w przypadku której ekspresja produktu genowego (produktów genowych) regionu E1B zachodzi pod kontrolą promotora adenowirusowego, korzystnie adenowirusowego promotora E1B.
- 5. Linia komórkowa według zastrz. 1 - 4, w przypadku której adenowirusowe produkty genowe pochodzą z ludzkiego adenowirusa typu 5.
- 6. Linia komórkowa według zastrz. 1 - 5, która to linia komórkowa jest ludzką linią komórkową.
- 7. Ciągła amniocytarna linia komórkowa N52.E6 (DSM ACC2416).
- 8. Sposób wytwarzania ciągłej amniocytarnej linii komórkowej, znamienny tym, że transfekuje się amniocyty kwasem nukleinowym kodującym produkty genowe regionu E1A i E1B adenowirusa.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się amniocyty pierwotne, a zwłaszcza ludzkie amniocyty pierwotne.
- 10. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że kwas nukleinowy stosuje się w postaci wektora ekspresyjnego.
- 11. Sposób według zastrz. 8 - 10, znamienny tym, że ekspresja produktu genowego regionu E1A zachodzi pod kontrolą promotora konstytutywnego, korzystnie promotora kinazy fosfoglicerynianowej (PGK), a ekspresja produktu genowego (produktów genowych) regionu E1B zachodzi pod kontrolą promotora adenowirusowego, korzystnie adenowirusowego promotora E1B.
- 12. Sposób według zastrz. 8 - 11, znamienny tym, że transfekcja amniocytów i/lub uzyskanej linii komórkowej powoduje dodatkowo ekspresję produktów genowych regionów E2A i/lub E2B i/lub E4 adenowirusa i/lub rekombinazy Cre.
- 13. Sposób według zastrz. 8 - 12, znamienny tym, że produkty genowe adenowirusa pochodzą z ludzkiego adenowirusa typu 5.
- 14. Zastosowanie amniocytów do wytwarzania ciągłych amniocytarnych linii komórkowych transformowanych adenowirusem.
- 15. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję nukleotydową regionów E1A i E1B do wytwarzania ciągłych amniocytarnych linii komórkowych.
- 16. Zastosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej zdefiniowanej w zastrz. 1 - 6, do wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowych zawierających mutację w genach E1A i/lub E1B.
- 17. Zastosowanie według zastrz. 16 do wytwarzania wektorów adenowirusowych, wektorów AAV (wirusa towarzyszącego adenowirusowi), wektorów retrowirusowych, wektorów lentiwirusowych, chimerycznych wektorów adenowirusowo-AAV, chimerycznych wektorów adenowirusowo-retrowirusowych i/lub chimerycznych wektorów adenowirusowo-lentiwirusowych.
- 18. Zastosowanie według zastrz. 17, w którym wektorami adenowirusowymi są wektory adenowirusowe pierwszej generacji, wektory adenowirusowe drugiej generacji, wektory adenowirusowe o dużej pojemności DNA i/lub wydeletowane wektory adenowirusowe.
- 19. Zastosowanie według zastrz. 16 - 18 do wytwarzania wektorów przenoszących geny o zmienionym tropizmie i/lub mutantów adenowirusowych o zmienionym tropizmie.
- 20. Zastosowanie według zastrz. 16 - 19, w którym amniocytarną linią komórkową jest linia zdefiniowana w zastrz. 1 - 7 albo 14.
- 21. Sposób wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowych zawierających mutację w genach E1A i/lub E1B, znamienny tym, że stosuje się ciągłą amniocytarną linię komórkową zdefiniowaną w zastrz. 1 - 6.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19955558A DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 1999-11-18 | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
| PCT/EP2000/010992 WO2001036615A2 (de) | 1999-11-18 | 2000-11-07 | Permanente amniozyten-zelllinie, ihre herstellung und verwendung zur herstellung von gentransfervektoren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL357495A1 PL357495A1 (pl) | 2004-07-26 |
| PL205966B1 true PL205966B1 (pl) | 2010-06-30 |
Family
ID=7929523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL357495A PL205966B1 (pl) | 1999-11-18 | 2000-11-07 | Ciągła amniocytarna linia komórkowa, sposób jej wytwarzania, zastosowanie amniocytów, zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego, zastosowanie ciągłej amniocytarnej linii komórkowej i sposób wytwarzania wektorów przenoszących geny i/lub mutantów adenowirusowych |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1230354B1 (pl) |
| JP (1) | JP4456790B2 (pl) |
| CN (1) | CN100412201C (pl) |
| AT (1) | ATE257512T1 (pl) |
| AU (1) | AU784003B2 (pl) |
| CA (1) | CA2391591C (pl) |
| CZ (1) | CZ300124B6 (pl) |
| DE (2) | DE19955558C2 (pl) |
| DK (1) | DK1230354T3 (pl) |
| ES (1) | ES2211647T3 (pl) |
| HU (1) | HU227440B1 (pl) |
| IL (2) | IL149291A0 (pl) |
| PL (1) | PL205966B1 (pl) |
| PT (1) | PT1230354E (pl) |
| TR (1) | TR200400402T4 (pl) |
| WO (1) | WO2001036615A2 (pl) |
Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1528101A1 (en) * | 2003-11-03 | 2005-05-04 | ProBioGen AG | Immortalized avian cell lines for virus production |
| US20070207461A1 (en) | 2004-02-23 | 2007-09-06 | Crucell Holland B.V. | Virus Purification Methods |
| CA2602944C (en) | 2005-04-11 | 2015-08-11 | Crucell Holland B.V. | Virus purification using ultrafiltration |
| DE102005054628A1 (de) | 2005-11-16 | 2007-05-24 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Verfahren zur Herstellung von permanenten humanen Zelllinien |
| SI2061803T2 (sl) | 2006-08-28 | 2023-01-31 | Ares Trading S.A. | Postopek za čiščenje proteinov, ki vsebujejo FC |
| US10041049B2 (en) | 2008-11-03 | 2018-08-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Method for the production of adenoviral vectors |
| DE102009003439A1 (de) | 2009-02-05 | 2010-08-26 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Neue permanente humane Zelllinie |
| CA2777116C (en) | 2009-10-15 | 2020-09-01 | Crucell Holland B.V. | Process for adenovirus purification from high cell density cultures |
| JP5393896B2 (ja) | 2009-10-15 | 2014-01-22 | クルセル ホランド ベー ヴェー | アデノウイルス粒子の精製方法 |
| MX2012007936A (es) | 2010-02-15 | 2012-11-22 | Crucell Holland Bv | Metodo para la produccion de vectores adenovirales del serotipo 26 del adenovirus. |
| EP2606128B1 (de) | 2010-08-16 | 2014-09-10 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Permanente humane amniozyten zellinie zur herstellung von influenzaviren |
| KR101427200B1 (ko) * | 2011-11-24 | 2014-08-07 | 주식회사 바이로메드 | 아데노바이러스 생산 신규 세포주 및 그의 용도 |
| SI2825640T1 (sl) | 2012-03-12 | 2016-08-31 | Crucell Holland B.V. | Šarže rekombinantnega adenovirusa s spremenjenimi konci |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| JP5805908B2 (ja) | 2012-03-22 | 2015-11-10 | クルセル ホランド ベー ヴェー | Ｒｓｖに対するワクチン |
| EP2662451A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-11-13 | Stefan Kochanek | Nucleic acid construct and use of the same |
| WO2014060594A1 (en) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Production of a hcmv based vaccine in human amniocyte cell lines |
| EP2722337A1 (en) | 2012-10-19 | 2014-04-23 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Production of a HCMV based vaccine in human amniocyte cell lines |
| KR102236497B1 (ko) | 2013-04-25 | 2021-04-06 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정화된 가용성 예비융합 ｒｓｖ ｆ 폴리펩타이드 |
| CN105408348B (zh) | 2013-06-17 | 2021-07-06 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| DE112014003136A5 (de) | 2013-07-01 | 2016-04-21 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Immortalisierte humane Chorionzelllinie sowie Verfahren zur Immortalisierung humaner Chorionzellen |
| RS58080B1 (sr) | 2014-11-04 | 2019-02-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Terapeutske vakcine protiv hpv16 |
| EP3042952A1 (en) | 2015-01-07 | 2016-07-13 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | O-glycan sialylated recombinant glycoproteins and cell lines for producing the same |
| JP6735288B2 (ja) | 2015-04-14 | 2020-08-05 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | 双方向性プロモーターを有する２つの導入遺伝子を発現する組換えアデノウイルス |
| EA039065B1 (ru) | 2015-07-07 | 2021-11-29 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Вакцина против rsv |
| US10457708B2 (en) | 2015-07-07 | 2019-10-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |
| JP6470872B2 (ja) | 2015-08-20 | 2019-02-13 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | 治療用ｈｐｖ１８ワクチン |
| JP7233928B2 (ja) | 2016-04-05 | 2023-03-07 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | Ｒｓｖに対するワクチン |
| IL262108B2 (en) | 2016-04-05 | 2023-04-01 | Janssen Vaccines Prevention B V | Soluble pre-fusion rsv f proteins are stabilized |
| JP7053491B2 (ja) | 2016-05-02 | 2022-04-12 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | 治療用ｈｐｖワクチン組み合わせ |
| CN109154000B (zh) | 2016-05-12 | 2022-07-05 | 扬森疫苗与预防公司 | 有效和平衡的双向启动子 |
| CN109311946A (zh) | 2016-05-30 | 2019-02-05 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的融合前rsv f蛋白 |
| RU2745500C2 (ru) | 2016-06-20 | 2021-03-25 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Эффективный и сбалансированный двунаправленный промотор |
| WO2018011196A1 (en) | 2016-07-14 | 2018-01-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Hpv vaccines |
| US11034978B2 (en) | 2017-02-09 | 2021-06-15 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and short promoter for expression of heterologous genes |
| EP3382014A1 (en) | 2017-03-29 | 2018-10-03 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Recombinant glycoproteins with reduced antennary fucosylation |
| AU2018267971A1 (en) | 2017-05-17 | 2019-11-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
| SG11202001458SA (en) | 2017-09-15 | 2020-03-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Method for the safe induction of immunity against rsv |
| WO2019086466A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| WO2019086461A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus vectors and uses thereof |
| WO2019086450A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| CN111372943B (zh) | 2017-10-31 | 2023-12-05 | 扬森疫苗与预防公司 | 腺病毒及其用途 |
| MX2021005607A (es) | 2018-11-13 | 2021-06-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Proteinas f de prefusion del vrs estabilizadas. |
| TWI852977B (zh) | 2019-01-10 | 2024-08-21 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
| EP3736286A1 (en) | 2019-05-09 | 2020-11-11 | Biotest AG | Single chain factor viii molecule |
| JP2022532742A (ja) | 2019-05-15 | 2022-07-19 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | アデノウイルスベースのワクチンによる呼吸器合胞体ウイルス感染の予防的処置 |
| WO2020229577A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine |
| EP4017521A1 (en) | 2019-09-02 | 2022-06-29 | Biotest AG | Factor viii protein with increased half-life |
| EP3785726A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-03 | Biotest AG | Factor viii protein with increased half-life |
| US20220372515A1 (en) | 2019-10-03 | 2022-11-24 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus vectors and uses thereof |
| CR20220220A (es) | 2019-11-18 | 2022-09-20 | Janssen Biotech Inc | Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos |
| TW202144389A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途 |
| TW202144388A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途 |
| US20230190881A1 (en) | 2020-02-17 | 2023-06-22 | Biotest Ag | Subcutaneous administration of factor viii |
| US20230024133A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-01-26 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate Neoantigens And Their Uses |
| US20230035403A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-02-02 | Janssen Biotech, Inc. | Method For Determining Responsiveness To Prostate Cancer Treatment |
| EP4175664A2 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
| EP4229204A1 (en) | 2020-10-15 | 2023-08-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Nucleic acid constructs for simultaneous gene activation |
| CA3197730A1 (en) | 2020-10-15 | 2022-04-21 | F. Hoffman-La Roche Ag | Nucleic acid constructs for va rna transcription |
| TW202323529A (zh) | 2021-10-18 | 2023-06-16 | 美商再生元醫藥公司 | 包括腺病毒相關病毒聚核苷酸的真核細胞 |
| EP4508241A1 (en) | 2022-04-13 | 2025-02-19 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for determining aav genomes |
| CN119256220A (zh) | 2022-05-23 | 2025-01-03 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于区分aav颗粒血清型和aav颗粒荷载状态的基于拉曼的方法 |
| CN119301260A (zh) | 2022-06-03 | 2025-01-10 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于生产重组aav颗粒的方法 |
| KR20250036743A (ko) | 2022-07-14 | 2025-03-14 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 재조합 aav 입자를 생산하는 방법 |
| CA3264505A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | METHOD FOR SEPARING SOLID AND EMPTY VAA PARTICLES |
| AU2024216670A1 (en) | 2023-02-07 | 2025-07-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the detection of anti-aav particle antibodies |
| AU2024239386A1 (en) | 2023-03-21 | 2025-08-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of recombinant aav particle preparations |
| CN117487761A (zh) * | 2023-09-25 | 2024-02-02 | 南京农业大学 | 表达Cre基因猪骨髓巨噬细胞系的构建方法及其应用 |
| WO2025158316A1 (en) | 2024-01-26 | 2025-07-31 | Janssen Biotech, Inc. | Ovarian neoantigens and use thereof |
| WO2025168663A1 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing recombinant adeno-associated viral particles |
| WO2025252480A1 (en) | 2024-06-07 | 2025-12-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for purifying plasmid dna |
| WO2026022064A1 (en) | 2024-07-22 | 2026-01-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel aav rep orfs and rep polypeptides |
| WO2026037757A1 (en) | 2024-08-13 | 2026-02-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modified aav particles |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL160406A0 (en) * | 1995-06-15 | 2004-07-25 | Crucell Holland Bv | A cell harbouring nucleic acid encoding adenoritus e1a and e1b gene products |
-
1999
- 1999-11-18 DE DE19955558A patent/DE19955558C2/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-11-07 PT PT00979539T patent/PT1230354E/pt unknown
- 2000-11-07 WO PCT/EP2000/010992 patent/WO2001036615A2/de not_active Ceased
- 2000-11-07 AT AT00979539T patent/ATE257512T1/de active
- 2000-11-07 EP EP00979539A patent/EP1230354B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 CA CA002391591A patent/CA2391591C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 TR TR2004/00402T patent/TR200400402T4/xx unknown
- 2000-11-07 IL IL14929100A patent/IL149291A0/xx active IP Right Grant
- 2000-11-07 HU HU0203387A patent/HU227440B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-11-07 CZ CZ20021709A patent/CZ300124B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-11-07 ES ES00979539T patent/ES2211647T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 CN CNB008159017A patent/CN100412201C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 DE DE50004995T patent/DE50004995D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 DK DK00979539T patent/DK1230354T3/da active
- 2000-11-07 JP JP2001538494A patent/JP4456790B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 PL PL357495A patent/PL205966B1/pl unknown
- 2000-11-07 AU AU16990/01A patent/AU784003B2/en not_active Expired
-
2002
- 2002-04-23 IL IL149291A patent/IL149291A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2211647T3 (es) | 2004-07-16 |
| IL149291A0 (en) | 2002-11-10 |
| IL149291A (en) | 2008-11-26 |
| HUP0203387A2 (hu) | 2002-12-28 |
| DE50004995D1 (de) | 2004-02-12 |
| CN100412201C (zh) | 2008-08-20 |
| PT1230354E (pt) | 2004-04-30 |
| WO2001036615A2 (de) | 2001-05-25 |
| DE19955558C2 (de) | 2003-03-20 |
| DK1230354T3 (da) | 2004-03-22 |
| EP1230354A2 (de) | 2002-08-14 |
| EP1230354B1 (de) | 2004-01-07 |
| HUP0203387A3 (en) | 2005-07-28 |
| CZ300124B6 (cs) | 2009-02-18 |
| JP4456790B2 (ja) | 2010-04-28 |
| WO2001036615A3 (de) | 2002-01-10 |
| DE19955558A1 (de) | 2001-06-07 |
| ATE257512T1 (de) | 2004-01-15 |
| CZ20021709A3 (cs) | 2002-08-14 |
| CA2391591C (en) | 2008-12-30 |
| HU227440B1 (en) | 2011-06-28 |
| CN1433476A (zh) | 2003-07-30 |
| PL357495A1 (pl) | 2004-07-26 |
| AU784003B2 (en) | 2006-01-12 |
| AU1699001A (en) | 2001-05-30 |
| CA2391591A1 (en) | 2001-05-25 |
| JP2003514526A (ja) | 2003-04-22 |
| TR200400402T4 (tr) | 2004-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU784003B2 (en) | Permanent amniocyte cell line, the production thereof and its use for producing gene transfer vectors | |
| US6558948B1 (en) | Permanent amniocytic cell line, its production and use for the production of gene transfer vectors | |
| US20090098599A1 (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| Wu et al. | A 50-kDa membrane protein mediates sialic acid-independent binding and infection of conjunctival cells by adenovirus type 37 | |
| KR20010034487A (ko) | 섬유 혹의 ｈｉ 루프내에 이종성 펩타이드 에피토프를함유하는 아데노바이러스 벡터 | |
| WO2001083729A2 (en) | Vectors for ocular transduction and use thereof for genetic therapy | |
| US7456008B2 (en) | Modified virus comprising one or more non-native polypeptides | |
| US20110189234A1 (en) | Adenovirus particles having a chimeric adenovirus spike protein, use thereof and methods for producing such particles | |
| AU2001270879A1 (en) | Modified virus having altered tropism | |
| EP1141357A1 (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| CN113462657A (zh) | 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用 | |
| Murakami et al. | Chimeric adenoviral vectors incorporating a fiber of human adenovirus 3 efficiently mediate gene transfer into prostate cancer cells | |
| KR102208879B1 (ko) | 핵산 구조 및 이의 용도 | |
| DE29924144U1 (de) | Permanente Amniozyten-Zelllinie | |
| De Vrij et al. | Enhanced transduction of CAR-negative cells by protein IX-gene deleted adenovirus 5 vectors | |
| Mei et al. | Highly heterogeneous fiber genes in the two closely related adenovirus genome types Ad35p and Ad34a | |
| CN113462658A (zh) | 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用 | |
| HK40061867A (en) | Recombinant newcastle disease virus, preparation method, recombinant plasmid and application thereof | |
| CN109082443A (zh) | 一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法 | |
| HK40061868A (en) | Recombinant newcastle disease virus, preparation method, recombinant plasmid and application of recombinant newcastle disease virus | |
| Class et al. | Patent application title: NUCLEIC ACID CONSTRUCT AND USE OF THE SAME Inventors: Stefan Kochanek (Ulm, DE) Stefan Kochanek Tanja Lucas (Regensburg, DE) Claudia Kueppers (Weil Am Rhein, DE) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |