PL205982B1

PL205982B1 - Liofilizowany preparat zawierający przeciwciała przeciw receptorowi EGF oraz sposób jego otrzymywania

Info

Publication number: PL205982B1
Application number: PL369848A
Authority: PL
Inventors: Hanns-Christian Mahler; Hans-Peter Zobel; Robert Müller; Christiane Bachmann; Udo Haas; Ludwig Krüger; Ulrike Martini-Marr
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-11-25
Publication date: 2010-06-30
Also published as: RU2339402C2; US20050220786A1; CN100515495C; WO2003053465A2; UA83461C2; PE20030777A1; CA2470316A1; JP2005513110A; KR100942399B1; CN1606455A; BR0215266A; PL369848A1; DE10163459A1; EP1455824A2; ZA200405785B; CO5590939A2; US20080166346A1; RU2004122632A; AU2002358533B2; NZ534211A

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy stabilnego liofilizowanego preparatu farmaceutycznego zawierającego przeciwciała, które są skierowane przeciw receptorowi epidermalnego czynnika wzrostu (ang. epidermal growth factor receptor - EGFR) i jego otrzymywania.

W wielu badaniach in vitro i in vivo wykazano, że blokada EGFR przeciwciał ami działa przeciw guzom nowotworowym na różnych płaszczyznach, przykładowo poprzez zahamowanie rozrostu komórek nowotworowych, zmniejszenie angiogenezy wywoływanej nowotworami, indukcję apoptozy komórek nowotworowych i wzrost toksycznego działania radioterapii i tradycyjnej chemioterapii.

MAB c225 (Cetuximab^®) jest klinicznie przetestowanym przeciwciałem, który łączy się z receptorem EGF. MAB c225 jest przeciwciałem chimerycznym, którego zmienne regiony są pochodzenia mysiego, a stałe regiony pochodzenia ludzkiego i został on po raz pierwszy opisany przez Naramura et al., Cancer Immunol Immunoteraphy 1993, 37: 343-349 jak i w opisie patentowym WO 96/40210 A1.

MAB425, przeciwciało pierwotnie pochodzenia mysiego przebadane na komórkach nowotworowych, jest skierowane przeciw EGFR, a zwłaszcza A431 komórek rakowych (Carcinoma). Jego ludzkie i chimeryczne formy ujawniono na przykład w opisie patentowym EP 0 531 472 A1; Kettleborough et al., Protein Engineering 1991, 4: 773-783; Bier et al., Cancer Chemother Pharmacol 2001, 47: 519-524; Bier et al., Cancer Immunol Immunother 1998, 46: 167-173. EMD 72000 jest przy tym przeciwciałem (h425) znajdującym się w fazie klinicznej l/ll, którego stały obszar składa się z jednego łańcucha κ i jednego ludzkiego łańcucha γ-1.

Ludzkie przeciwciała anty-EGFR mogą zostać przygotowane według technologii „XenoMouse, jak przedstawiono w opisach patentowych WO 91/10741 A1, WO 94/02602 A1, WO 96/33735 A1. Specyficzne, poddawane na bieżąco testom klinicznym przeciwciało ABX-EGF zostało wytworzone zgodnie z tą technologią (Abgenix, Crit Rev Oncol Hematol 2001, 38: 17-23; Cancer Research 1999, 59: 1236-43).

Kolejne przeciwciała skierowane przeciw EGFR przedstawiono na przykład w opisie patentowym EP 0 586 002 B1 jak również w J Natl Cancer Inst 1993, 85: 27-33 (MAB 528).

Tak jak i inne przeciwciała również przeciwciała-EGFR w zastosowaniu terapeutycznym są podawane pozajelitowo w formie roztworu do zastosowań terapeutycznych. Szczególnym problemem roztworów zawierających te przeciwciała jest ich skłonność do agregacji i tworzenia proteinowych multimerów. W przypadku multimerów dających się zredukować może to prowadzić do niezamierzonego intermolekularnego tworzenia mostków dwusiarczkowych przez interakcję między sąsiadującymi cząsteczkami. Wystąpić mogą także nietolerujące wody wzajemne oddziaływania i związane z tym tworzenie niedających się zredukować multimerów. Ponadto dochodzi do deamidacji w następstwie prowadzącej do reakcji redukowania protein. Opisane reakcje denaturacji zachodzą zwłaszcza podczas składowania w podwyższonej temperaturze lub przy naprężeniach ścinających, jakie występują na przykład podczas transportu. Ogólnie mówiąc, płynne preparaty wykazują zatem mniejszą użyteczność jako forma leku do szerszego zastosowania.

Metodą stosowaną do stabilizacji przeciwciał jest liofilizacja roztworów zawierających przeciwciała jak i substancje pomocnicze. Przez usunięcie wody zredukowane zostaje tworzenie produktów rozpadu i agregacji (Hsu et al., Dev. Biol. Stand. 1991, 74: 255-267 i Pikal et al., Dev. Biol. Stand. 1991, 74: 21-27).

Opis patentowy WO 93/00807 A1 przedstawia liofilizowane preparaty białkowe, które zawierają w celu stabilizacji polietylenoglikol i cukier. Polietylenoglikol nie jest jednak ż e toksykologicznie tolerowany i dlatego powinno się go - jeśli to możliwe - unikać w środkach farmaceutycznych, szczególnie gdy są one przewidziane do podawania pozajelitowego.

Opis patentowy WO 98/22136 A2 ujawnia liofilizowany preparat zawierający jedno przeciwciało, cukier lub aminocukier, aminokwas i środek powierzchniowo czynny. Wprawdzie preparat ten zastrzeżono dla przeciwciał w ogólności, jednakże jako działający przykład realizacji ujawniono jedynie preparaty zawierające przeciwciała monoklonalne, które skierowane są przeciw wirusowi Hepatitis B (AK HBV), jak i w każdym przypadku preparat zawierający przeciwciało przeciw L-selektin (ang. Anti-Lselectin) oraz przeciwciało przeciw receptorowi czynnika wzrostu L-nerwu (ang. Anti-L-Nerve-GrowthFactor-Rezepłor - Anti-L-NGFR). Podczas gdy preparaty zawierające AK HBV i Anti-L-Selektin zostały utworzone z roztworów o stężeniu przeciwciał do max 8 mg/ml oraz ewentualnie 7 mg/ml, to ujawniony preparat z przeciwciałem Anti-LNGFR skierowanym przeciw czynnikowi wzrostu został wytworzony z roztworu zawierającego tylko 0.25 mg/ml przeciwciał , przy identycznym jakoś ciowym i iloś ciowym

PL 205 982 B1 zestawieniu substancji pomocniczych. Chociaż preparat zawierający Anti-LNGFR zawiera przez to ponad 20-krotnie mniejszy udział przeciwciał i oczekuje się wynikającej z tego również odpowiednio mniejszej ilości produktów rozpadu, nie ujawniono żadnych danych odnośnie stabilizacji w porównaniu do preparatów z pozostałymi przeciwciałami.

Celem wynalazku było dostarczenie stabilnego preparatu zawierającego przeciwciała skierowane przeciw EGFR. Preparat ten nie powinien zawierać żadnych nietolerowanych toksykologicznie substancji pomocniczych i powinien być stabilny w zaostrzonych warunkach przechowywania, jak podwyższonej temperaturze i wilgotności powietrza, przez dłuższy czas oraz winien być odtwarzalny (ang. reconstituting) w wodnym rozpuszczalniku aby otrzymać gotowy do zaaplikowania roztwór o wysokiej zawartoś ci substancji czynnej.

Nieoczekiwanie okazało się, że preparat, który spełnia powyższe wymogi może zostać otrzymany po przeprowadzeniu liofilizacji wodnego roztworu zawierającego obok jednego z przeciwciał anty-EGFR, cukier lub aminocukier, aminokwas i środek powierzchniowo czynny.

Istotą wynalazku jest zatem stabilny liofilizowany preparat, charakteryzujący się tym, że zawiera przeciwciało skierowane przeciw receptorowi epidermalnego czynnika wzrostu (receptor EGF), takie jak przeciwciało MAB c225 lub EMD 72000 lub jedno z analogicznych mysich, przeciwciał ludzkich lub chimerycznych, a ponadto korzystnie dodatkowo cukier lub aminocukier, aminokwas, bufor i/lub środek powierzchniowo czynny.

Przeciwciała według wynalazku były i mogą być tworzone za pomocą wskazanej powyżej technologii „XenoMouse. Przeciwciałem anty-EGFR obecnym w preparacie według wynalazku jest korzystnie MAB c225 lub EMD 72000 ewentualnie lub jedno z odpowiadających im mysich, przeciwciał ludzkich lub chimerycznych. Szczególnie korzystne są preparaty, które zawierają jako przeciwciało MAB c225 lub EMD 72000. Według korzystnej realizacji wynalazku, liofilizowany preparat farmaceutyczny składa się w istocie z jednego przeciwciała, jednego cukru lub aminocukru, jednego aminokwasu, jednego bufora i jednego środka powierzchniowo czynnego.

Preparat według wynalazku jest fizjologicznie dobrze tolerowany, łatwo go wytworzyć, dokładnie dozować i jest stabilny względem zawartości, produktów rozpadu i agregacji w czasie składowania podczas wielokrotnych procesów zamrażania i odmrażania. Może być on stabilnie przechowywany w lodówce (w temperaturze 2-8°C) i w temperaturze pokojowej (23-27°C, 60% względnej wilgotności powietrza) przez czas od co najmniej 3 miesięcy do - od jednego roku do dwóch lat. Nieoczekiwanie okazało się, że preparat daje się stabilnie przechować przez wymienione okresy trwałości w wyższych temperaturach i wilgotności powietrza, przykładowo w temperaturze 40°C i 75% względnej wilgotnoś ci powietrza.

Liofilizowany preparat może zostać w łatwy sposób odtworzony do postaci gotowego do zaaplikowania niewykazującego dostrzegalnych cząstek roztworu, poprzez dodanie wodnych rozpuszczalników, przykładowo wody dla iniekcji lub izotonicznego roztworu wodnego. Odtworzony roztwór jest stabilny przez około 5 dni, ale szczególnie korzystna jest aplikacja w przeciągu czterech godzin.

Istotą wynalazku jest zatem również wodny preparat farmaceutyczny otrzymywany poprzez odtworzenie preparatu liofilizowanego mający pH korzystnie w zakresie od 5 do 8, korzystne od 6.0 do 7.4, szczególnie korzystnie o około 7.2 i o stężeniu osmotycznie czynnych cząstek w roztworze od 250 do 350 mOsmol/kg. Odtworzony preparat może więc zostać bezpośrednio podany zasadniczo bezboleśnie dożylnie, dotętniczo i również podskórnie. Ponadto do preparatu tego można dodać roztwory wlewowe, jak na przykład roztwór glukozy, izotoniczny roztwór soli kuchennej lub roztwór z preparatu krwiopochodnego, które również mogą zawierać dalsze substancje aktywne, pozwalające na aplikację większej ilości substancji czynnych.

Preparat według wynalazku umożliwia przygotowanie roztworów przeciwciał, które w swoim stężeniu są dostosowane do wymagań klinicznych. Korzystne są roztwory przeciwciał o stężeniu przeciwciał od około 0.5 do 25 mg/ml, szczególnie korzystnie od 5 do 20 mg/ml, a zwłaszcza od 10 do 15 mg/ml. Preparat według wynalazku umożliwia zatem wytworzenie gotowych do zastosowania preparatów o wyraźnie wyższym stężeniu przeciwciał niż jak przedstawiono w przypadku preparatów ujawnionych w opisie patentowym WO 98/22136 A2.

W preparacie według wynalazku, jako cukier mogą wystę pować mono-, di-, lub trisacharydy. Przykładowo jako monosacharydy można wymienić glukozę, mannozę, galaktozę, fruktozę i sorbozę jako disacharydy - sacharozę, laktozę, maltozę lub trehalozę i jako trisacharyd - rafinozę. Korzystnie preparat zawiera sacharozę, laktozę, maltozę lub trehalozę, szczególnie korzystna jest sacharoza.

PL 205 982 B1

Podobnie preparat może zawierać aminocukry, to jest monosacharydy, które zamiast jednej grupy hydroksylowej posiadają jedną pierwszo-, drugo-, trzeciorzędową grupę aminową lub acylowaną grupę aminową (-NH-CO-R). Szczególnie korzystne według wynalazku są glukozamina, N-metyloglukozamina, galaktozamina i kwasy neuraminowe.

Cukier/aminocukier występujący w preparacie według wynalazku zawarty jest w takiej ilości, że po jego odtworzeniu z przewidzianą objętością rozpuszczalnika w otrzymanym roztworze występuje w stężeniu od około 1 do 200 mg/ml. Korzystnie cukier w roztworze odtworzonym zawarty jest w stężeniu od 30 do 65 mg/ml.

Odpowiednimi aminokwasami stosowanymi według wynalazku są zasadowe aminokwasy, jak na przykład między innymi arginina, histydyna, ornityna, lizyna, przy czym aminokwasy korzystnie występują w formie ich nieorganicznych soli (korzystnie w formie soli kwasu solnego to jest jako chlorowodorków aminokwasu). W przypadku, gdy stosuje się wolne aminokwasy, następuje regulowanie oczekiwanej wartości pH przez dodanie odpowiedniej fizjologicznie tolerowanej substancji buforującej, jak na przykład organicznego lub nieorganicznego kwasu, jak kwas cytrynowy lub fosforowy, siarkowy, octowy, mrówkowy lub ich sole. Korzystne są cytryniany i fosforany, z których można uzyskać szczególnie stabilne produkty liofilizacji.

Korzystnymi aminokwasami są arginina, lizyna czy ornityna. Ponadto można zastosować kwaśne aminokwasy, jak na przykład kwas glutaminowy i asparginowy, lub neutralne aminokwasy jak na przykład izoleucyna, leucyna, i alanina, lub aromatyczne aminokwasy, jak na przykład fenyloalanina, tyrozyna lub tryptofan. Zawartość aminokwasu w preparacie według wynalazku wynosi 1 do 100 mg/ml, korzystnie 1 do 50 mg/ml, szczególnie korzystnie 3-30 mg/ml (każdorazowo w odniesieniu do roztworu odtworzonego).

Stosowanymi środkami powierzchniowo czynnymi są wszystkie stosowane w farmaceutycznych preparatach środki powierzchniowo czynne, korzystnie polisorbaty i polimery polioksyetylenopolioksypropylenowe. Szczególnie korzystne jest monolaurynian polioksyetylenosorbitolu (20) i monooleinian polioksyetylenosorbitolu (20). Według wynalazku, preparat zawiera środek powierzchniowo czynny w ilości od 0.001 do 1% wagowych, korzystne od 0.005 do 0,1% wagowych i szczególnie korzystne około 0.01% wagowych (każdorazowo w odniesieniu do roztworu odtworzonego).

Jeśli preparat według wynalazku zawiera bufory, można tu właściwie zastosować wszystkie fizjologicznie tolerowane substancje, które nadają się do osiągnięcia oczekiwanej wartości pH. Ilość substancji buforującej jest dobierana tak, że po odtworzeniu preparatu liofilizowanego, na przykład wodą w celu iniekcji, otrzymany roztwór wodny wykazuje stężenie buforu od 5 mmol/l do 20 mmol/l, korzystnie około 10 mmol/l. Jako bufor korzystnie stosuje się bufor cytrynianowy lub fosforanowy. Odpowiednimi buforami fosforanowymi są roztwory soli mono- i/lub disodowych oraz sole potasowe kwasu fosforowego, jak wodorofosforan disodowy lub diwodorofosforan potasu, jak również mieszaniny soli sodowych i potasowych, jak na przykład mieszaniny wodorofosforanu disodowego i diwodorofosforanu potasu.

Jeśli odtworzony roztwór przez osmotyczne właściwości przeciwciał i wykorzystanych do stabilizacji substancji pomocniczych nie będzie izotoniczny, może on dalej zawierać substancję izotonizującą, korzystnie fizjologicznie tolerowaną sól, jak na przykład chlorek sodu lub potasu, lub fizjologicznie tolerowany poliol, jak na przykład glukoza czy gliceryna, w stężeniu wystarczającym do izotonizacji.

Liofilizowany preparat według wynalazku może ponadto zawierać dalsze fizjologicznie tolerowane substancje pomocnicze, jak na przykład przeciwutleniacze, jak kwas askorbinowy lub glutation, substancje konserwujące jak fenol, m-krezol, metylo- lub propyloparaben, chlorobutanol, tiomersal lub chlorek bezalkonium, glikol polietylenowy (PEG) jak PEG 3000, 3350, 4000 lub 6000 lub cyklodekstryna jak hydroksypropylo-e-cyklodekstryna, sulfobutyloetylo-e-cyklodekstryna, lub γ-cyklodekstryna.

Preparat według wynalazku może zostać przygotowany podczas, poprzez przygotowanie wodnego preparatu zawierającego jako substancję czynną MAB c225 lub EMD 72000 i jako substancje dodatkowe cukier lub aminocukier, aminokwas i środek powierzchniowo czynny jak również w danym przypadku dalsze farmaceutyczne substancje pomocnicze i następnie liofilizacje roztworu.

Wodny preparat może zostać wytworzony poprzez dodanie do roztworu zawierającego MAB c225 lub EMD 72000, rzeczonych substancji pomocniczych. Na tym etapie, określone objętości roztworów bazowych zawierających rzeczone substancje pomocnicze w określonych stężeniach, dodawane są korzystnie do roztworu posiadającego określone stężenie MAB c225 lub EMD 72000, otrzymanego z tego preparatu, a następnie mieszaninę, jeśli właściwe, rozcieńcza się wodą do wcześniej określonego stężenia. Alternatywnie, substancje pomocnicze mogą być również dodane jako substancje stałe do roztworu wyjściowego zawierającego MAB c225. Jeśli MAB c225 lub EMD 72000 wystęPL 205 982 B1 pują jako substancje stałe, na przykład w formie liofilizatu, preparat według wynalazku może zostać wytworzony poprzez uprzednie rozpuszczenie odpowiedniego przeciwciała w wodzie lub w wodnym rozpuszczalniku zawierającym jedną lub więcej dalszych substancji pomocniczych, a następnie dodanie wymaganej ilości roztworów bazowych zawierających dalsze substancje pomocnicze, dalszych substancji pomocniczych w formie stałej i/lub wody. MAB c225 lub EMD 72000 można także korzystnie rozpuścić również bezpośrednio w roztworze zawierającym wszystkie dalsze substancje pomocnicze.

Jedna lub więcej z substancji pomocniczych zawartych w preparacie według wynalazku, może korzystnie zostać dodana podczas lub pod koniec procesu wytwarzania danego przeciwciała EGFR. Reakcję tą można korzystnie przeprowadzić poprzez rozpuszczenie MAB c225 lub EMD 72000 bezpośrednio w wodnym roztworze zawierającym jedną, więcej niż jedną lub wszystkie wymienione substancje pomocnicze, w końcowym etapie oczyszczania przeprowadzonym po jego wytworzeniu. W celu przygotowania preparatu, odpowiednie dalszy(e) składnik(i) mogą być dodawane w każdym przypadku w niewielkich ilościach i/lub w ogóle niedodawane. Szczególnie korzystne jest, gdy dany składnik będzie rozpuszczany bezpośrednio w roztworze wodnym zawierającym wszystkie dalsze substancje pomocnicze, w ostatniej fazie oczyszczania następującego po jego wytworzeniu, dając bezpośrednio roztwór do liofilizacji.

Roztwór zawierający dane przeciwciało jak i substancje pomocnicze reguluje się do wartości pH od 5 do 8, sterylnie filtruje i liofilizuje.

Poniższe przykłady wyjaśniają wynalazek, jednak nie ograniczają go.

Jeżeli zastosowano 10 mmol/l buforu fosforanu sodu ewentualnie potasu o pH 7.2, zawierał on 2.07 g/l 7-hydratu wodorofosforanu disodowego i 0.31 g/l monohydratu diwodorofosforanu sodu lub

1.220 g/l wodorofosforanu dipotasowego i 0.4050 g/l diwodorofosforanu potasowego.

P r z y k ł a d 1

Produkt liofilizacji sporządza się z wodnego roztworu zawierającego:

mg/ml EMD 72000 mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2 mmol/l argininy

3% wag. sacharozy

0.01% wag. monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20)

0.4% wag. PEG 6000

Przygotowanie to przeprowadza się poprzez zmieszanie określonych objętości wodnych roztworów zawierających dane substancje pomocnicze w określonych stężeniach.

Zastosowano następujące roztwory:

Roztwór A (roztwór substancji aktywnej) zawierający:

mg/ml EMD 72000 mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2

Roztwór B (bufor/ roztwór soli):

mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2

6% wag. sacharozy

0.02% wag. monolaurynianu polioksyetyleno (20) sorbitolu mmol/l argininy

0.8% wag. polietylenoglikolu 6000

Dla wytworzenia preparatu według wynalazku łączy się jednakowe ilości roztworu A oraz roztworu B.

Przygotowany roztwór filtruje się sterylnie przed napełnianiem. Ampułki wypełnia się 2 ml roztworu. Następnie zamyka się częściowo zatyczką i poddaje się liofilizacji. Po przeprowadzeniu liofilizacji ampułki zamyka się i obciska.

P r z y k ł a d 2

Produkt liofilizacji sporządza się z wodnego roztworu zawierającego:

mg/ml EMD 72000 mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2 mmol/l argininy

3% wag. sacharozy

0.01% wag. monolaurynianu polioksyetyleno(20) sorbitolu

PL 205 982 B1

Zastosowano następujące roztwory:

Roztwór A (roztwór substancji aktywnej) zawierający:

mg/ml EMD 72000 mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2

Roztwór B (bufor/roztwór soli):

mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2 6% wag. sacharozy

0.02% wag. monolaurynianu polioksyetyleno(20) sorbitolu 34 mmol/l argininy

Dla wytworzenia preparatu według wynalazku łączy się jednakowe ilości roztworu A oraz roztworu B. Przygotowany roztwór filtruje się sterylnie przed napełnianiem. Ampułki wypełnia się 20 ml roztworu. Następnie ampułki zamyka się częściowo zatyczką i poddaje się liofilizacji. Po przeprowadzeniu liofilizacji ampułki zamyka się i obciska.

P r z y k ł a d 3

Produkt liofilizacji sporządza się z wodnego roztworu zawierającego:

mg/ml MAB c225 (Cetuximab^®) mmol/l cytrynianu 100 mmol/l argininy 4% wag. mannitolu

0.01% wag. monooleinianu polioksyetyleno(20) sorbitolu

Zastosowano następujące roztwory:

Roztwór A (roztwór substancji aktywnej) zawierający:

mg/ml MAB c225 5 mmol/l cytrynianiu 127 mmol/l argininy

0.01% wag. monooleininu polioksyetyleno(20)-sorbitolu Roztwór B (bufor/roztwór soli):

mmol/l cytrynianu 19.05% wag. mannitolu

0.01% wag. monooleinianu polioksyetyleno(20) sorbitolu

Dla wytworzenia preparatu według wynalazku łączy się 7.9 ml roztworu A oraz 2.1 ml roztworu B. Przygotowany roztwór filtruje się sterylnie przed napełnianiem. Ampułki wypełnia się 2 ml roztworu za pomocą pipety. Następnie ampułki zamyka się częściowo zatyczką i poddaje się liofilizacji. Po przeprowadzeniu liofilizacji ampułki zamyka się i obciska.

P r z y k ł a d 4

Produkt liofilizacji sporządza się z wodnego roztworu zawierającego:

mg/ml MAB c225 mmol/l cytrynianu 100 mmol/l argininy 1.5% wag. sacharozy

0.01% wag. monolaurynianu polioksyetyleno(20) sorbitolu

Zastosowano następujące roztwory:

Roztwór A (roztwór substancji aktywnej) zawierający:

mg/ml MAB c225 mmol/l cytrynianu 127 mmol/l argininy

0.01 % wag. monooleinianu polioksyetyleno(20)-sorbitolu Roztwór B (bufor/roztwór soli):

mmol/l cytrynianu 7.1% sacharozy

0.01 % wag. monooleinianu polioksyetyleno(20) sorbitolu

PL 205 982 B1

W celu wytworzenia preparatu według wynalazku łączy się 7.9 ml roztworu A oraz 2.1 ml roztworu B.

Przygotowany roztwór filtruje się sterylnie przed napełnianiem. Ampułki wypełnia się 2 ml roztworu za pomocą pipety. Następnie ampułki zamyka się częściowo zatyczką i poddaje się liofilizacji.

Po przeprowadzeniu liofilizacji ampułki zamyka się i obciska.

P r z y k ł a d 5

Produkt liofilizacji sporządza się z wodnego roztworu zawierającego:

mg/ml MAB c225 mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2 mmol/l chlorowodorku L-argininy mmol/l sacharozy

0.01% wag. monolaurynianu polioksyetyleno(20) sorbitolu wartość pH na 7.5 reguluje się za pomocą kwasu fosforowego

Zastosowano następujące roztwory:

Roztwór A (roztwór substancji aktywnej) zawierający:

mg/ml MAB c225 mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2 woda do zastrzyków

Roztwór B (bufor/roztwór soli):

mmol/l buforu fosforanu potasu pH 7.2

35.6 mmol/l chlorowodorku L-argininy

219 mmol/l sacharozy

0.025% wag. monolaurynianu polioksyetyleno(20) sorbitolu wartość pH na 7.5 reguluje się za pomocą kwasu fosforowego

W celu wytworzenia preparatu według wynalazku łączy się 6 ml roztworu A oraz 4 ml roztworu B.

Przygotowany roztwór filtruje się sterylnie przed napełnianiem. Ampułki wypełnia się 2 ml roztworu za pomocą pipety. Następnie ampułki zamyka się częściowo zatyczką i poddaje się liofilizacji. Po przeprowadzeniu liofilizacji ampułki zamyka się i obciska.

P r z y k ł a d 6 (preparat porównawczy 1)

Sporządza się wodny roztwór zawierający:

mg/ml MAB c225 mmol/l buforu fosforanu sodu pH 7.2

145 mmol/l chlorku sodu

Zastosowano następujące roztwory:

Roztwór A (roztwór substancji aktywnej) zawierający:

mg/ml MAB c225 mmol/l buforu fosforanu sodu pH 7.2

145 mmol/l chlorku sodu (Roztwór otrzymano poprzez wymywanie składnika aktywnego z kolumny za pomocą roztworu B w końcowym etapie chromatograficznego oczyszczania składnika aktywnego, przeprowadzonym po jego przygotowaniu).

Roztwór B (bufor/roztwór soli):

Odpowiada roztworowi A, ale nie zawiera składnika aktywnego.

Dla wytworzenia preparatu porównawczego łączy się po 10 ml roztworów A oraz B.

P r z y k ł a d 7 (preparat porównawczy 2)

Sporządza się wodny roztwór zawierający:

mg/ml MAB c225 mmol/l buforu fosforanu sodu pH 7.2 mmol/l chlorku sodu

0.01% wag. monooleinianu polioksyetyleno(20) sorbitolu.

PL 205 982 B1

Zastosowano następujące roztwory:

Roztwór A (roztwór substancji aktywnej) zawierający:

9.7 mg/ml MAB c225 mmol/l buforu fosforanu sodu pH 7.2

Roztwór B (bufor/roztwór soli):

Odpowiada roztworowi A, ale nie zawiera składnika aktywnego.

Roztwór C (roztwór polioksyetylenosorbitolu-estru kwasu tłuszczowego):

Odpowiada roztworowi B, ale zawiera dodatkowo 1% wag. monooleinianu polioksyetyleno(20) sorbitolu.

Dla wytworzenia preparatu porównawczego łączy się 10 ml roztworu A, 9.8 ml roztworu B oraz 0.2 ml roztworu C.

Przygotowany roztwór filtruje się sterylnie przed napełnianiem. Ampułki wypełnia się 2 ml roztworu za pomocą pipety. Następnie ampułki zamyka się zatyczką i obciska.

Badanie stabilności preparatów

Stabilność preparatów według wynalazku z Przykładów 1 i 2 sprawdza się w warunkach zaostrzonych (ang. stress test). W tym celu produkty liofilizacji przechowywano w temperaturze 40°C i wilgotności względnej (ang. relative atmospheric humidity - RAH) 75%. Preparaty przechowywano przez określony czas i badano odpowiednimi metodami analitycznymi. Ewentualne niestabilności uzewnętrzniały się w przeciwciałach, głównie poprzez budowę agregatów oraz poprzez budowę produktów rozpadu. Produkty rozpadu korzystnie wykrywano dzięki elektroforezie żelowej (dodecylosulfonian sodu-poliakryloamido-elektroforeza żelowa (SDS-PAGE) oraz przez ogniskowanie izoelektryczne (IEF)), podczas gdy ocena wizualna oraz pomiar zmętnienia służyły do wykrycia widzialnej agregacji, a chromatografia (HPLC-SEC) posłużyła do określenia rozpuszczalnych agregatów. Dla określenia preparatów przeprowadzono test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), który posłużył do oceny integracji oraz zdolności wiązania do receptora.

Wyniki zawarte w Tabelach 1 i 2 wskazują jasno na jakość i stabilność utworzonych preparatów również przy podwyższonych temperaturach przechowywania oraz podwyższonej wilgotności względnej (40°C / 75%).

Okres przechowywania (miesiące)	Wartość pH	ELISA (miano wzgl.)	SDS-PAGE [% monomerów IG]	SEC-HPLC
nieredukowane	redukowane
Temperatura 2 - 8°C
0	7.11	1.00	100	100	100
6	7.14	1.01	99.3	100	99.6
12	7.15	1.04	99.9	99.1	99.7
24	7.16	1.03	100	100	100
Temperatura 25°C, wilgotność względna 60%
6	7.17	1.03	99.1	99.0	99.5
12	7.15	1.01	98.7	99.1	99.6
24	7.16	1.03	100	100	99.5
Temperatura 40°C, wilgotność względna 75%
6	7.17	1.10	98.8	98.2	99.3
12	7.15	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
24	7.16	0.98	100	100	99.3

Tabela 1: Stabilność preparatu z Przykładu 1

PL 205 982 B1

Okres przechowywania (tygodnie)	Wartość pH	ELISA (miano wzgl.)	SDS-PAGE [%monomerów IG]	SEC-HPLC
nieredukowane	redukowane
Temperatura 2 - 8°C
0	7.20	0.97	100	100	99.33
13	7.23	1.00	n.d.	n.d.	99.24
26	7.21	1.02	99.47	99.57	99.27
Temperatura 25°C, wilgotność względna 60%
13	7.24	1.05	n.d.	n.d.	99.22
26	7.24	0.97	99.47	99.64	99.21
Temperatura 40°C, wilgotność względna 75%
13	7.23	1.04	n.d.	n.d.	99.08
26	7.25	0.97	99.61	99.62	98.85

Tabela 2: Stabilność preparatu z Przykładu 2

Stabilność preparatów według wynalazku z Przykładów 3 do 7 sprawdzano również w warunkach zaostrzonych (stress test). W tym celu przechowywano ampułki z roztworem z Przykładów 3-5 oraz, dla celów porównawczych, ampułki zawierające roztwór z Przykładów 6-7 w temperaturze 25°C i wilgotności względnej 60% oraz w temperaturze 40°C i wilgotności względnej 75%. Przed przechowywaniem oraz po określonych okresach przechowywania, w każdym przypadku 3 ampułki poddawano obserwacji przez bezpośrednie napromieniowanie źródłem zimnego światła, i określano absorpcję roztworów przy 350 oraz 550 nm, stanowiącą miarę zmętnienia. Ponadto 3 ampułki były każdorazowo usuwane i analizowane pod kątem zawartości MAB c225 oraz produktów rozkładu za pomocą filtracji żelowej HPLC.

Badanie chromatograficzne HPLC przeprowadzano z gradientami acetonitryl / woda 95/5 (V/V) (B) oraz roztwór buforujący pH 2.5 / acetonitryl 95/5 (VA/) (A) jako eluentami. Kolumna: LiChroCHART^® 125-2 HPLC; Superspher^® 60 RP-select B, przepływ: 0.3 ml/min, detekcja przy 210 nm.

Wyniki badania stabilności przedstawiono w Tabeli 3.

Badany roztwór	Przechowywanie w 40°C/75% wilg. wzgl.	MAB c225 [%]	Agregaty [%]	Produkty rozpadu [%]	Zmętnienie przy λ = 350 nm	Zmętnienie przy λ = 550 nm	Ocena wzrokowa
1	2	3	4	5	6	7	8
Prz.3	0	99.30	0.20	0.51	0.0211	0.0055	klarowny
Prz.3	4	99.04	0.62	0.34	0.0214	0.0029	klarowny
Prz.3	8	98.54	1.12	0.34	0.0224	0.0020	klarowny
Prz. 3	13	98.43	1.18	0.40	0.0246	0.0019	klarowny

Prz. 4	0	99.33	0.19	0.48	0.0198	0.0045	klarowny
Prz. 4	4	99.11	0.40	0.50	0.0174	0.0025	klarowny
Prz. 4	8	99.19	0.44	0.38	0.0181	0.0021	klarowny
Prz. 4	13	99.20	0.45	0.36	0.0172	0.0014	klarowny

Prz. 5	0	99.58	0.19	0.04	0.0195	0.0050	klarowny
Prz. 5	4	99.51	0.24	0.25	0.0165	0.0028	klarowny
Prz. 5	8	99.56	0.22	0.22	0.0156	0.0023	klarowny
Prz. 5	13	99.52	0.28	0.20	0.0187	0.0045	klarowny

PL 205 982 B1 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6	7	8
Prz. 6	0	99.69	0.62	0.15	0.0130	0.0021	klarowny
Prz. 6	4	92.00	0.84	7.38	0.0232	0.0047	mętny
Prz. 6	8	89.94	1.39	8.68	0.0338	0.0044	mętny
Prz. 6	13	86.66	3.26	10.11	0.0403	0.0061	mętny

Prz. 7	0	99.72	0.17	0.11	0.0128	0.0016	klarowny
Prz. 7	4	98.60	0.56	0.84	0.0200	0.0022	klarowny
Prz. 7	8	96.49	2.21	1.32	0.0280	0.0033	klarowny
Prz. 7	13	86.46	4.84	8.73	0.0382	0.0036	mętny

Tabela 3

Rysunki fig. 1 do fig. 5 przedstawiają ponadto porównanie wyników różnych badań stabilności preparatów według wynalazku z Przykładu 4 względem preparatów porównawczych 1 oraz 2, w określonych okresach przechowywania w temperaturze 40°C i wilgotności względnej 75%. Preparaty liofilizowane z Przykładu 4 każdorazowo odtwarzano z wodą do zastrzyków, do wodnego roztworu z trzykrotną ilością wody w porównaniu do roztworu wyjściowego, który służył do wykonania preparatu przez liofilizację.

Rysunek fig. 1 przedstawia ubytek zawartości substancji aktywnej w preparatach porównawczych 1 oraz 2 w porównaniu do preparatu według wynalazku z Przykładu 4, mierzony jako zawartość monomeru za pomocą HPLC-SEC.

Rysunek fig. 2 przedstawia przyrost produktów rozkładu w preparatach porównawczych 1 oraz 2 w porównaniu do preparatu według wynalazku z Przykładu 4, mierzony za pomocą HPLC-SEC.

Rysunek fig. 3 przedstawia przyrost agregacji w preparatach porównawczych 1 oraz 2 w porównaniu do preparatu według wynalazku z Przykładu 4, mierzony za pomocą HPLC-SEC.

Rysunek fig. 4 przedstawia przyrost gęstości optycznej przy λ = 350 nm w preparatach porównawczych 1 oraz 2 w porównaniu do preparatu według wynalazku z Przykładu 4.

Rysunek fig. 5 przedstawia przyrost gęstości optycznej przy λ - 550 nm w preparatach porównawczych 1 oraz 2 w porównaniu do preparatu według wynalazku z Przykładu 4.

Wyniki te pokazują wyraźnie, że preparaty według wynalazku, w porównaniu do ciekłych preparatów porównawczych wykazują znacznie wyższą stabilność.

Claims

1. Liofilizowany preparat farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera przeciwciało skierowane przeciw receptorowi epidermalnego czynnika wzrostu (receptor EGF), takie jak przeciwciało MAB c225 lub EMD 72000 lub jedno z analogicznych mysich, przeciwciał ludzkich lub chimerycznych.

2. Liofilizowany preparat farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo cukier lub aminocukier, aminokwas, bufor i/lub środek powierzchniowo czynny.

3. Liofilizowany preparat farmaceutyczny według zastrz. 2, znamienny tym, że cukrem jest mono-, di- lub trisacharyd, korzystnie sacharoza, maltoza lub trehaloza.

4. Liofilizowany preparat farmaceutyczny według zastrz. 2, znamienny tym, że aminocukrem jest glukozamina, N-metyloglukozamina, galaktozamina lub kwas neuraminowy.

5. Liofilizowany preparat farmaceutyczny według zastrz. 2, znamienny tym, że aminokwasem jest zasadowy, kwaśny lub neutralny aminokwas, korzystnie arginina, lizyna, lub ornityna.

6. Liofilizowany preparat farmaceutyczny według zastrz. 2, znamienny tym, że środkiem powierzchniowo czynnym jest polisorbat lub polimer polioksyetyleno-polioksypropylenu.

7. Liofilizowany preparat farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że środkiem powierzchniowo czynnym jest ester polioksyetylenu sorbitanowego kwasu tłuszczowego, taki jak monooleinian sorbitanowy polioksyetylenu (20) lub monolaurynian sorbitanowy polioksyetylenu (20).

PL 205 982 B1

8. Liofilizowany preparat farmaceutyczny według dowolnego z zastrz. 1-7, znamienny tym, że zawiera ponadto środek izotonizujący w stężeniu wystarczającym do izotonizowania.

9. Liofilizowany preparat farmaceutyczny według zastrz. 8, znamienny tym, że środkiem izotonizującym jest chlorek sodu.

10. Wodny preparat farmaceutyczny zawierający mono- lub poliklonalne przeciwciała, znamienny tym, że jest otrzymywany poprzez odtworzenie produktu liofilizacji zdefiniowanego w dowolnym z zastrz. 1-9 w wodnym rozpuszczalniku.

11. Wodny preparat farmaceutyczny według zastrz. 10, znamienny tym, że roztwór ma pH od 5 do 8, korzystnie od 6 do 7.4.

12. Wodny preparat farmaceutyczny według zastrz. 11, znamienny tym, że pH roztworu wynosi około 7.2.

13. Sposób otrzymywania liofilizowanego preparatu farmaceutycznego zdefiniowanego w dowolnym z zastrz. 1-9, znamienny tym, że przygotowuje się wodny preparat, zawierający jako substancję aktywną przeciwciało MAB c225 lub EMD 72000 oraz cukier lub aminocukier, aminokwas i/lub środek powierzchniowo czynny jako substancje pomocnicze oraz, jeśli właściwe inne farmaceutyczne substancje pomocnicze, a roztwór ten poddaje się następnie liofilizacji.