PL205984B1

PL205984B1 - Wyizolowany polipeptyd, fragment izolowanego polipeptydu, wariant izolowanego polipeptydu, izolowane białko fuzyjne, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen, kompozycja farmaceutyczna, sposób otrzymywania izolowanego kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego polipeptydu, sposób wykrywania bądź diagnozowania zakażenia N.meningitidis w próbkach biologicznych oraz zastosowanie izolowanego polipeptydu, przeciwciała lub fragmentu przeciwciała wiążącego antygen

Info

Publication number: PL205984B1
Application number: PL341160A
Authority: PL
Inventors: Ian Richard Anselm Peak; Michael Paul Jennings; E.Richard Moxon
Original assignee: Univ Queensland
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2010-06-30
Also published as: US6607729B2; BR9814276A; CN101684148A; US20100331537A1; AU1649599A; JP4651703B2; IL136684A0; JP4356961B2; KR100571533B1; CA2314319C; CN1284965A; NZ505374A; EP2354230A1; US20050058660A1; US8067004B2; HUP0100094A1; KR20010033074A; US20090270591A1; CZ299646B6; EP1045859A1

Description

Opis wynalazku

Obecny wynalazek dotyczy wyizolowanego polipeptydu, fragment izolowanego polipeptydu, wariantu izolowanego polipeptydu, izolowanego białka fuzyjnego, izolowanego kwasu nukleinowego, wektora ekspresyjnego, komórki gospodarza, przeciwciała lub fragmentu przeciwciała wiążącego antygen, kompozycji farmaceutycznej, sposobu otrzymywania izolowanego kwasu nukleinowego, sposobu wytwarzania zrekombinowanego polipeptydu, sposobu wykrywania bądź diagnozowania zakażenia N. meningitidis w próbkach biologicznych oraz zastosowania izolowanego polipeptydu, przeciwciała lub fragmentu przeciwciała wiążącego antygen. Wynalazek może być wykorzystywany w terapeutycznych i profilaktycznych szczepionkach i w projektowaniu i/lub testowaniu leków.

Neisseria meningitidis jest bakterią gram ujemną i czynnikiem wywołującym meningokokowe zapalenie opon i posocznicę. Jej jedynym znanym żywicielem jest człowiek i może być ona przenoszona bez objawowo przez około 10% populacji (Caugant, D. I wsp. 1994, Journal of Clinical Microbiology, 32:323-30).

Neisseria meningitidis może tworzą otoczki polisacharydowe, co pozwala na klasyfikację bakterii na podstawie wytworzonej otoczki. Istnieje trzynaście grup serotypowych N. meningitidis: A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y i Z, z których serotypy A, B i C wywołują 90% chorób wywołanych meningokokami (Poolman, J.T., i wsp. 1995, Infectious Agents and Disease, 4:13-28). Dostępne są szczepionki przeciw serotypom A i C lecz w przypadku serotypu B otoczka polisacharydowa jest słabo immunogenna i u człowieka nie pobudza reakcji obronnej.

Co za tym idzie celem określenia użyteczności włączenia do szczepionki badane są inne składniki błonowe i pozakomórkowe. Przykłady obejmują zewnętrzne białka błonowe klasy 1, 2 i 3 (poryny), klasy 4 (Rmp) i (białka otoczki). Jakkolwiek, do chwili obecnej żaden z powyższych kandydatów nie był w stanie wywołać u dzieci pełnej obrony (Romero, J.D., 1994, Clinical Microbiology Review, 7:559-575; Poolman, J.T. i wsp. 1995).

Dla stworzenia skutecznej szczepionki niezbędna jest identyfikacja elementów N. meningitidis obecnych w większości szczepów, które są w stanie indukować ochronną odpowiedź immunologiczną (przeciwciała bakteriobójcze). W tym względzie można odnieść się do pracy Brodeur i wsp. (Publikacja Międzynarodowa WO 96/29412), która ujawnia białko powierzchniowe o masie cząsteczkowej 22 kDa, które jest wysoce konserwatywne w 99% wszystkich znanych szczepów N. meningitidis. Wstrzyknięcie oczyszczonego, zrekombinowanego białka powierzchniowego 22 kDa w 80% chroni immunizowane myszy przed rozwojem śmiertelnej infekcji N. meningitidis. Pomimo odkrycia tego białka nadal istnieje potrzeba izolacji większej ilości białek powierzchniowych N. meningitidis, które są wysoce konserwatywne w licznych szczepach i które posiadają właściwości immunoochronne względem N. meningitidis i/lub mogą być użyte w połączeniu z innymi składnikami N. meningitidis celem zwiększenia skuteczności ochrony przed tym organizmem.

Twórcy niniejszego wynalazku zidentyfikowali nowy gen, który jest obecny we wszystkich badanych szczepach N. meningitidis, który koduje nowy polipeptyd o przewidywanej masie cząsteczkowej około 62 kD. Na podstawie właściwości jego sekwencji i homologii przypuszczalnie polipeptyd ten jest adhezyną co, wraz z danymi eksperymentalnymi sugeruje, że jest ono białkiem powierzchniowym, które może być użyte, jak to opisano poniżej, do wytwarzania leczniczych i/lub profilaktycznych szczepionek przeciw N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:

(a) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 2;

(b) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 5;

(c) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 7;

(d) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 9;

(e) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 11;

(f) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 13;

(g) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 15;

(h) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 17;

(i) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 19 i (j) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 21.

Korzystnie, izolowany polipeptyd wywołuje aktywność immunologiczną względem co najmniej jednego przedstawiciela grupy obejmującej:

PL 205 984 B1 (i) N. meningitidis;

(ii) polipeptyd według wynalazku;

(iii) fragment izolowanego polipeptydu według wynalazku, (iv) wariant izolowanego polipeptydu według wynalazku.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, izolowany polipeptyd wywoł uje aktywność immunologiczną względem N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest również fragment izolowanego polipeptydu określonego powyżej, wykazujący aktywność immunologiczną, charakteryzujący się tym, że obejmuje co najmniej 20 sąsiadujących aminokwasów ze wspomnianych sekwencji aminokwasowych, przy czym fragment ten wywołuje aktywność immunologiczną u ssaka obejmującą wytwarzania elementów które swoiście wiążą N. meningitidis i/albo wspomniany polipeptyd.

Korzystnie, wspomniany fragment polipeptydu wywołuje aktywność immunologiczną względem co najmniej jednego przedstawiciela grupy obejmującej:

(i) N. meningitidis;

(ii) polipeptyd według wynalazku;

W innym korzystnym wariancie fragment polipeptydu wywoł uje aktywność immunologiczną względem N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest również wariant izolowanego polipeptydu określonego powyżej, charakteryzujący się tym, że jest w 80% identyczny z jedną z wymienionych sekwencji aminokwasowych.

Korzystnie, wariant izolowanego polipeptydu jest w 85% identyczny z jedną z wymienionych sekwencji aminokwasowych.

Korzystnie, wariant izolowanego polipeptydu jest w 90% identyczny z jedną z wymienionych sekwencji aminokwasowych.

Korzystnie, wariant izolowanego polipeptydu jest wariantem allelicznym.

Korzystnie, wariant izolowanego polipeptydu wywołuje aktywność immunologiczną względem co najmniej jednego przedstawiciela grupy obejmującej:

(i) N. meningitidis;

(ii) polipeptyd określony według wynalazku;

(iii) fragment izolowanego polipeptydu według wynalazku, (iv) wariant izolowanego polipeptydu określony według wynalazku.

Korzystnie, wariant izolowanego polipeptydu według wywołuje aktywność immunologiczną względem N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowane białko fuzyjne obejmujące izolowany polipeptyd według wynalazku, fragment izolowanego polipeptydu według wynalazku albo wariant izolowanego polipeptydu według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd charakteryzujący się tym, że zawiera jeden lub więcej fragmentów polipeptydu według wynalazku, które to fragmenty obejmują determinanty antygenowe i epitopy.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowany kwas nukleinowy charakteryzujący się tym, że koduje izolowany polipeptyd według wynalazku, fragment izolowanego polipeptydu według wynalazku wariant izolowanego polipeptydu o według wynalazku, albo izolowane białko fuzyjne według wynalazku.

Korzystnie, izolowany kwas nukleinowy że obejmuje sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej:

(1) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 1;

(2) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 3;

(3) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 4;

(4) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 6;

(5) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 8;

(6) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 10;

(7) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 12;

(8) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 14;

(9) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 16;

(10) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 18; oraz

PL 205 984 B1 (11) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 20;

Korzystnie, izolowany kwas nukleinowy koduje wariant izolowanego polipeptydu otrzymywany z bakterii z rodzaju Neisseria.

Korzystnie, izolowany kwas nukleinowy uzyskuje się ze szczepu N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest również, wektor ekspresyjny charakteryzujący się tym, że zawiera izolowany kwas nukleinowy według wynalazku, przy czym izolowany kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym regulującym transkrypcję i translację.

Przedmiotem wynalazku jest także, komórka gospodarza charakteryzująca się tym, że jest transfekowana lub transformowana wektorem ekspresyjnym według wynalazku.

Korzystnie, komórka gospodarza jest bakterią, korzystniej N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen charakteryzujące się tym, że wiąże się z izolowanym polipeptydem określonym według wynalazku, fragmentem izolowanego polipeptydu według wynalazku albo wariantem izolowanego polipeptydu według wynalazku.

Korzystnie przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen wiąże się z N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera izolowany polipeptyd według wynalazku; fragment izolowanego polipeptydu według wynalazku; wariant izolowanego polipeptydu według wynalazku; izolowane białko fuzyjne według wynalazku, przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen według wynalazku; albo izolowany kwas nukleinowy według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna jest w postaci szczepionki.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna określona powyżej do zastosowania jako lek do zapobiegania albo leczenia infekcji N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania izolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku, charakteryzujący się tym, że (i) otrzymuje się ekstrakt kwasu nukleinowego z dogodnego gospodarza; po czym (ii) tworzy się startery, które są ewentualnie zdegenerowane, przy czym startery zawierają sekwencje nukleotydowe odpowiednich części sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku, a następnie (iii) stosuje się utworzone startery do amplifikacji, na matrycy ekstraktu kwasu nukleinowego, przy pomocy techniki amplifikacji kwasu nukleinowego, jednego lub większej liczby produktów amplifikacji.

Korzystnie, ekstrakt kwasu nukleinowego otrzymuje się z bakterii z rodzaju Neisseria.

Korzystniej, ekstrakt kwasu nukleinowego jest otrzymywany ze szczepu N. meningitidis.

Korzystnie, startery są wybrane z grupy obejmującej SEQ ID NO. 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 i 31.

Korzystnie, jako technikę amplifikacji stosuje się technikę PCR.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania zrekombinowanego polipeptydu charakteryzujący tym, że (A) hoduje się komórki gospodarza według wynalazku tak, że wspomniany zrekombinowany polipeptyd wyrażany jest przez te komórki, i (B) izoluje się zrekombinowany polipeptyd.

Przedmiotem wynalazku jest również, sposób wykrywania bądź diagnozowania zakażenia N. meningitidis w próbkach biologicznych charakteryzujący się tym, że wykrywa się izolowany polipeptyd według wynalazku, fragment izolowanego polipeptydu według wynalazku albo wariant izolowanego polipeptydu według wynalazku.

Korzystnie, do wykrywania izolowanego polipeptydu, fragmentu izolowanego polipeptydu albo wariantu izolowanego polipeptydu stosuje się przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen według wynalazku.

Korzystnie, próbka biologiczna pochodzi od człowieka.

Przedmiotem wynalazku sposób wykrywania bądź diagnozowania zakażenia N. meningitidis w próbkach biologicznych charakteryzują cy się tym, ż e wykrywa się przeciwciał o lub fragment przeciwciała wiążący antygen według wynalazku.

Korzystnie, próbka biologiczna pochodzi od człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania bądź diagnozowania zakażenia N. meningitidis w próbkach biologicznych charakteryzujący się tym, że wykrywa izolowany kwas nukleinowy według wynalazku.

PL 205 984 B1

Korzystnie, do wykrywania izolowanego kwasu nukleinowego poprzez amplifikację sekwencji kwasu nukleinowego stosuje się startery oligonukleotydowe wybrane z grupy obejmującej SEQ ID NO. 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 i 31.

Korzystnie, próbka biologiczna pochodzi od człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto, zastosowanie izolowanego polipeptydu według wynalazku; fragmentu izolowanego polipeptydu według wynalazku; wariantu izolowanego polipeptydu według wynalazku; przeciwciała lub fragmentu przeciwciała wiążącego antygen według wynalazku; izolowanego białka fuzyjnego według wynalazku; albo izolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku do wytwarzania leku do zapobiegania albo leczenia infekcji N. meningitidis u człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała wiążącego antygen według wynalazku do identyfikacji in vitro równoważnika funkcjonalnego albo mimetyka izolowanego polipeptydu według wynalazku, fragmentu izolowanego polipeptydu według wynalazku albo wariantu izolowanego polipeptydu według wynalazku.

Korzystnie, identyfikacja prowadzona jest w próbce pochodzącej od ssaka nie będącego człowiekiem.

Sposób wykrywania bakterii N. meningitidis w próbkach biologicznych, w których może występować wspomniana bakteria, według wynalazku obejmuje następujące etapy:

(I) izolacji próbek biologicznych od osobnika (II) wykrycia we wspomnianej próbce sekwencji kwasu nukleinowego co dowodzi obecności wspomnianej bakterii.

Sposób wykrywania infekcji z N. meningitidis według wynalazku obejmuje etapy: (1) kontaktowania otrzymanej od pacjenta próbki biologicznej z polipeptydem, fragmentem lub wariantem polipeptydu według wynalazku, i (2) określenie obecności lub braku w próbce kompleksów utworzonych między wspomnianym polipeptydem, fragmentem lub wariantem polipeptydu i przeciwciałami specyficznymi względem N. meningitidis gdzie obecność wspomnianego kompleksu wskazuje na wystąpienie zakażenia.

Zgodnie z powyższym, polipeptydy, kwasy nukleinowe, przeciwciała lub fragmenty przeciwciał według wynalazku mogą być stosowane w zestawach do wykrywania w próbkach biologicznych bakterii N. meningitidis.

Wynalazek może być również wykorzystany do identyfikacji immunoreaktywnego fragmentu lub wariantu polipeptydu obejmującej etapy:(a) wytwarzania wspomnianego fragmentu lub wariantu polipeptydu;

(b) podania wspomnianego fragmentu ssakowi i (c) wykrycie u wspomnianego ssaka odpowiedzi immunologicznej, która obejmuje wytwarzanie czynników, specyficznie wiążących się z N. meningitidis i/lub wspomnianym polipeptydem lub jego wariantem i/lub efekt ochronny względem zakażeń wywołanych przez N. meningitidis.

Fig. 1 przedstawia mapy plazmidu i strategię klonowania. Startery A3A i A3B (odpowiednio SEQ ID NO. 28 i 29) użyto dla amplifikacji na matrycy MC58 obszaru zidentyfikowanego w bazie danych TIGR jako homologu AIDA-I. Sklonowanie produktu PCR dało pNMAIDA3, startery A3C (SEQ ID NO 30), po czym do amplifikacji w odwrotnym PCR zawierającego hiaNm fragmentu EagI o wielkoś ci 3 tys. par zasad zastosowano - A3D (SEQ ID NO 31). Sklonowanie tego produktu da ł o plazmid piEAGA3. piEAGA3 subklonowano uzyskując piEagA3.8 i piEagA3.9. Startery HiaNm:M i HiaNm:P (odpowiednio SEQ ID NO. 22 i 23) u ż yto do amplifikacji cią g ł ego fragmentu z MC58, który klonowano tworząc pHiaNm. Startery Hia-MBPA (SEQ ID NO 24) i Hia-MBPB (SEQ ID NO 25) użyto dla amplifikacji otwartej ramki odczytu hiaNm, a produkt amplifikacji klonowano w pMALC2 uzyskując pMBP-HiaNm;

Fig. 2 przedstawia Southern blot genomowego DNA z różnych szczepów N. meningitidis.

Fig. 2A przedstawia szczepy serotypu B. Ścieżka 1 - PMC28, ścieżka 2 - PMC27, ścieżka 3 PMC25, ścieżka 4 - PMC24, ścieżka 5 - PMC16, ścieżka 6 - PMC13, ścieżka 7 - PMC12, ścieżka 8 standardy masy cząsteczkowej, ścieżka 9 - 2970, ścieżka 10 - 1000, ścieżka 11 - 528, ścieżka 12 SWZ107, ścieżka 13 - H41, ścieżka 14 - H38, ścieżka 15 - NGH36, ścieżka 16 - H15, ścieżka 17 NGG40, ścieżka 18 - NGF26, ścieżka 19 - NGE30, ścieżka 20 - ścieżka NGE28.

Fig. 2B przedstawia szczepy o serotypach innych niż B. Ścieżka 1 - PMC3, ścieżka 2 - PMC17, ścieżka 3 - PMC20, ścieżka 4 - PMC23, ścieżka 5 - PMC8, ścieżka 6 - PMC9, ścieżka 7 - PMC11, ścieżka 8 - PMC14, ścieżka 9 - PMC18, ścieżka 10 - PMC21, ścieżka 11 - PMC29, ścieżka 12 - standardy masy cząsteczkowej, ścieżka 13 - PMC19, ścieżka 14 - PMC1, ścieżka 15 - PMC6, ścieżka 16 6

PL 205 984 B1

PMC10, ścieżka 17 - PMC22, ścieżka 18 - PMC26, ścieżka 19 - PMC2. Masa cząsteczkowa standardu podana w tysiącach par zasad (kpz). Genomowy DNA hybrydyzowano z sondą odpowiadającą nukleotydom 276-2054 z SEQ ID NO 1;

Fig. 3 przedstawia barwiony Coomassie żel z MBP-HiaNM. Komórki zawierające pMALC2 (ścieżka 2) lub pMBP-HiaNm (ścieżka 3) po inkubacji z IPTG. Ścieżka 1 zawiera standardy (masy cząsteczkowej (kDa). Strzałki wskazują MBP i MBP-HiaNm;

Fig. 4 Western blot z białkami MC58 i MC58ΔHiaNm inkubowany wobec surowicy króliczej. Ścieżka 1 - standard masy cząsteczkowej podany w tyś. par zasad. Ścieżka 2 - pełne białko z komórek MC58, ścieżka 3 - pełne białko z komórek MC58ΔHiaNm, ścieżka 4 - preparat OMC z MC58, ścieżka preparat OMC z komórek MC58ΔHiaNm na każdą ścieżkę nanoszono 50 μl roztworu białka o absorbancji A280 =3,75;

Fig. 5 przedstawia żel barwiony Coomassie będący wierną kopią żelu, który użyto w doświadczeniu Western blot z Fig. 4.

Ścieżki są takie same jak na Fig. 4;

Fig. 6 przedstawia zestawienie sekwencji polipeptydów HiaNm, Hia, Hsf przygotowane przy pomocy programu PILEUP i

Fig. 7 przedstawia zestawienie sekwencji polipeptydów HiaNm z 10 szczepów N. meningitidis, przygotowane przy pomocy programu PILEUP.

Szczegółowy opis wynalazku.

W tym wyszczególnieniu i w załączonych zastrzeżeniach, jeśli kontekst nie stanowi inaczej, to słowa „zawiera, „zawierają i „zawierający będą rozumiane jako określające włączenie elementu lub grupy elementów, ale nie wykluczające jakiegokolwiek innego elementu lub grupy elementów.

Sekwencje polipeptydów.

Niniejsze zgłoszenie dostarcza wyizolowanego polipeptydu określonego w SEQ ID NOS 2, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19 i 21 lub jego odpowiednich fragmentów lub wariantów, względnie pochodnych. W korzystnej postaci, polipeptyd, fragmenty, warianty i objęte wynalazkiem pochodne wykazują aktywność immunologiczną względem któregokolwiek z przedstawicieli wyselekcjonowanych z grupy obejmującej N. meningitidis, wspomniany polipeptyd, wspomniany fragment, i wspomniany wariant.

SEQ ID NO 2 odpowiada nowemu polipeptydowi powierzchniowemu o masie cząsteczkowej około 62 kDa kodowanemu przez gen hiaNm uzyskiwany ze szczepu MC58 N. meningitidis, bardzo szczegółowo opisanego poniżej. SEQ ID NOS 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21 odpowiadają homologom polipeptydów uzyskanych z sekwencji nukleotydowych uzyskanych ze szczepów N. meningitidis odpowiednio BZ10, BZ198, EG327, EG329, H15, H38, H41, P20.

Dla celów tego wynalazku określenie „aktywność immunologiczna dotyczy zdolności wcześniej wspomnianych: peptydu, fragmentu, wariantu lub pochodnej do wywołania odpowiedzi immunologicznej u ssaków, którym zostały podane, gdzie odpowiedź obejmuje wytworzenie elementów, które specyficznie wiążą N. meningitidis i/lub wspomniany polipeptyd, fragment, wariant lub pochodną i/lub efekt ochronny względem infekcji wywołanych przez N. meningitidis.

Przez „wyizolowany jest określany materiał, który jest zasadniczo lub praktycznie wolny od składników, które normalnie w stanie naturalnym mu towarzyszą.

Przez „polipeptyd rozumiany jest długi łańcuch peptydu, włącznie z białkami.

W użytym tu znaczeniu termin „fragment obejmuje mutanty z delecjami i małe peptydy, przykładowo o długości przynajmniej 6, korzystnie co najmniej 10 i korzystniej co najmniej 20 aminokwasów, które obejmują determinanty antygenowe i epitopy. Kilka takich fragmentów może być łączonych razem. Tego typu peptydy mogą być uzyskane dzięki zastosowaniu typowych technik rekombinowania kwasów nukleinowych lub syntetyzowane z użyciem konwencjonalnych technik syntezy na stałym nośniku lub w płynie. Przykładowo, można tu przywołać sposoby syntezy w roztworze lub na stałym nośniku jak opisali to Atherton i Shephard w Rozdziale 9 zatytułowanym „Peptide Synthesis publikacji zatytułowanej „Synthetic Vaccines pod edycją Nicholsone, opublikowanej przez Blackwell Scientific Publications. Alternatywnie, peptydy mogą być wytwarzane przez trawienie objętego wynalazkiem polipeptydu, takimi proteinazami jak endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C i stafylokokową proteazą V8. Uzyskane w wyniku trawienia fragmenty mogą być oczyszczane przykładowo przez wysokorozdzielczą chromatografię cieczową (HPLC).

Określenie „wariant dotyczy polipeptydów, w których jeden lub więcej aminokwasów jest zastąpione przez inne aminokwasy. Zgodnie z wiedzą w dziedzinie, oczywistym jest, że pewne aminokwasy mogą być zastąpione przez inne o zasadniczo podobnych właściwościach bez zmiany charakPL 205 984 B1 teru aktywności polipeptydu (podstawienia konserwatywne). Przykładowe konserwatywne podstawienia przedstawiono w poniższej tabeli:

Oryginalny aminokwas	Przykładowe podstawienie
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Ile,
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Zasadnicze zmiany w funkcji są wywoływane przez wyselekcjonowane podstawienia, które są mniej konserwatywne niż te, które przedstawiono w Tabeli 1. Inne podstawienia będą podstawieniami niekonserwatywnymi, z których względnie niewiele będzie tolerowane. Ogólnie podstawieniami, które prawdopodobnie spowodują większe zmiany we właściwościach są te, w których (a) reszty hydrofilowe (np. Ser lub Thr) zastępowane są przez lub zastępują reszty hydrofobowe (np. Ala, Leu, Ile, Phe lub Val); (b) cysteina lub prolina jest zastąpiona lub zastępuje inny aminokwas; (c) aminokwas posiadający łańcuch boczny o dodatnim ładunku elektrycznym (np. Arg, His lub Lys) jest zastąpiony lub zastępuje jakikolwiek aminokwas o ujemnym ładunku elektrycznym (np. Glu lub Asp) lub (d) aminokwas posiadający rozbudowany łańcuch aromatyczny (np. Phe lub Trp) jest zastąpiony lub zastępuje aminokwas posiadający mniejszy łańcuch (np. Ala, Ser) lub nie posiadający łańcucha bocznego (np. Gly).

Ogólnie warianty będą co najmniej w 75% homologiczne, lepiej co najmniej w 80%, korzystniej w 85%, a najkorzystniej w co najmniej 90% homologiczna do podstawowych sekwencji, które przykładowo przedstawiono na SEQ ID NOS 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21. Homologia jest określana jako procentowy udział aminokwasów, które są identyczne lub są konserwatywnymi podstawieniami jakie określono w Tabeli 1. Homologia może być określona przy pomocy programów porównujących sekwencje takich jak GAP (Deveraux i wsp. 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395) który włączony jest tu przez cytowanie. W ten sposób sekwencje o podobnej lub zasadniczo innej długości względem cytowanych tu mogą być porównane przez wprowadzenie luk dla wyrównania, przy czym takie luki mogą być przykładowo określone przy pomocy algorytmu porównującego GAP. Użyteczne warianty mogą być określone przy pomocy konwencjonalnych technik. Przykładowo kwasy nukleinowe kodują8

PL 205 984 B1 ce polipeptydy określone przez SEQ ID NOS 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21 mogą być imitowane przy pomocy zarówno mutagenezy losowej, przykładowo przez mutagenezę przy pomocy transpozonu lub mutagenezy specyficznej. Uzyskane fragmenty DNA są następnie przy pomocy konwencjonalnych technik klonowane do odpowiedniego gospodarza, takiego jak E.coli, w którym następuje ekspresja, a następnie wykrywane są klony posiadające pożądaną aktywność. Gdy klony są modyfikowane przez mutagenezę losową, celem wykrycia mutacji oznaczana jest sekwencja nukleotydowa pozytywnych klonów. Termin „wariant obejmuje również występujące naturalnie allele.

Przez „pochodne rozumie się polipeptydy, które uzyskiwane są z sekwencji podstawowej przez modyfikacje, przykładowo przez sprzęganie lub kompleksowanie za pomocą innej cząsteczki chemicznej lub przez technikę modyfikacji post-translacyjnych, co jest znane w dziedzinie. Takie pochodne obejmują delecje lub/i dodanie aminokwasów do polipeptydów określonych przez SEQ ID NOS 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21 lub wariantów powyższych, gdzie wspomniane warianty zachowują aktywność immunologiczną. „Dodanie aminokwasów może obejmować fuzję polipeptydów lub ich wariantów z innymi polipeptydami lub białkami. Zgodnie z tym jasne jest, że polipeptydy lub warianty objęte wynalazkiem będą mogły być włączone do większych polipeptydów i że oczekuje się, iż takie większe polipeptydy będą mogły zachować aktywność immunologiczną przykładowo przeciw N. meningitidis. Opisane wyżej polipeptydy mogą być połączone z kolejnym białkiem, przykładowo takim, które nie pochodzi z N. meningitidis. To kolejne białko może być wykorzystywane dla oczyszczania białka, przykładowo w tym celu, jak to bardziej szczegółowo opisano poniżej, wykorzystane mogą być znaczniki polihistydynowe lub białka wiążące maltozę. Alternatywnie, może być uzyskana odpowiedź immunologiczna skuteczna względem N. meningitidis lub względem innych patogenów. Inną możliwością jest, że te białka fuzyjne wywołają immunologiczną odpowiedź modulującą. Szczególne przykłady takich białek obejmują białko A lub transferazę S-glutationu (GST). Dodatkowo polipeptyd może być połączony z opartym na oligosacharydzie składnikiem szczepionki, który działa jako nośnik białka.

Innymi rozważanymi przez wynalazek pochodnymi są, lecz nie tylko, modyfikacje łańcuchów bocznych, wbudowanie nie występujących naturalnie aminokwasów i/lub ich pochodnych w czasie syntezy peptydu, polipeptydu lub białka i użycie związków sieciujących oraz innych sposobów, które prowadzą do zmian konformacyjnych objętych wynalazkiem polipeptydów, fragmentów i wariantów.

Rozważane przez obecny wynalazek przykłady modyfikacji łańcuchów bocznych obejmują modyfikacje grup aminowych przez acylację bezwodnikiem octowym, acylację grup aminowych przy pomocy bezwodnika kwasu bursztynowego i bezwodnika czterohydroftalowego, amidowanie metyloacetoimidem, podstawienia karbamoilowe grupy aminowej przez cyjanek, pirydoksylację lizyny przy pomocy pirydoksylo-5-fosforanu, a następnie redukcję NaBH4, alkilację redukującą przez reakcję z aldehydem a następnie redukcję NaBH4, i podstawienie grupy aminowej grupą trójnitrobenzylową z kwasu 2, 4, 6-trójnitrobenzenosulfonowego (TNBS).

Grupa karboksylową może być modyfikowana przez aktywację karbodiimidem za pośrednictwem tworzenia O-acyloizomocznika, po których następują specyficzne modyfikacje np. z wytworzeniem odpowiedniego amidu.

Guanidylowa grupa argininy może być modyfikowana przez tworzenie heterocyklicznego produktu kondensacji z odczynnikami takimi jak 2,3-butanodion, fenyloglioksal i glioksal.

Grupa sulfhydrylowa może być modyfikowana sposobami takimi jak utleniane kwasem do kwasu cysteinowego; tworzenie pochodnych rtęci przy pomocy kwasu 4-chlorortęciowofenylosulfonowego, 4-chlorortęciobenzoesanu, 2-chlorortęcio-4-nitrofenolu, chlorku fenylortęciowego i innych związków rtęci, tworzenia mieszanych dwusiarczków z innymi związkami tiolowymi, reakcja z imidem jabłczanowym, bezwodnikiem jabłczanowym i innymi podstawionymi jabłczanami, karboksymetylacja kwasem jodooctowym lub amidem jodooctowym lub podstawienie karbamylację cyjankiem przy alkalicznym pH.

Reszty tryptofanu mogą być modyfikowane przykładowo przez alkilowanie pierścienia indolowego bromkiem 2-hydroksy-5-nitrobenzylowym lub halogenkami sulfonylowymi lub przez utlenianie imidem N-bromobursztynowym.

Tyrozyna może być modyfikowana przez nitrowanie tetranitrometanem do postaci pochodnych 3-nitrotyrozyny.

Imidazolowy pierścień histydyny może być modyfikowany przez N-karboetoksylowanie pirowęglanem dietylu lub alkilowanie pochodnymi kwasu jodooctowego.

Przykłady wbudowania w czasie syntezy polipeptydu nie występujących w naturze aminokwasów i pochodnych obejmują ale nie są ograniczone do kwasu 4-aminomaslowego, kwasu 6-aminoheksenowego, kwasu 4-amino-3-hydroksy-5-fenylopentenowego, kwasu 4-amino-3-hydroksy-6-mePL 205 984 B1 tyloheptenowego, t-butyloglicyny, norleucyny, norwaliny, fenyloglicyny, ornityny, sarkozyny, 2-tienyloalaniny i/lub D-izomerów aminokwasów. W Tabeli 2 przedstawiono listę rozważanych w obecnym wynalazku aminokwasów nie występujących w naturze.

Nietypowy aminokwas	Nietypowy aminokwas
1	2
kwas α-aminomaslowy	L-N-metyloalanina
α-amino-a-metylomaślan	L-N-metyloarginina
karboksylan aminocyklopropenu	L-N-metyloasparagina
kwas aminoizomasłowy	kwas L-N-metyloasparaginowy
karboksylan aminonorbornylu	L-N-metylocysteina
cykloheksyloalanina	L-N-metyloglutamina
cyklopentyloalanina	kwas L-N-metyloglutaminowy
L-N-metyloizoleucyna	L-N-metylohistydyna
D-alanina	L-N-metyloleucyna
D-arginina	L-N-metylolizyna
kwas D-asparaginowy	L-N-metylometionina
D-cysteina	L-N-metylonorleucyna
D-glutaminian	L-N-metylonorwalina
kwas D-glutaminowy	L-N-metyloornityna
D-histydyna	L-N-metylofenyloalanina
D-izoleucyna	L-N-metyloprolina
D-leucyna	L-N-metyloseryna
D-lizyna	L-N-metylotreonina
D-metionina	L-N-metylotryptofan
D-ornityna	L-N-metylotyrozyna
D-fenyloalanina	L-N-metylowalina
D-prolina	L-N-metyloetyloglicyna
D-seryna	L-N-metylo-t-butyloglicyna
D-treonina	L-norleucyna
D-tryptofan	L-norwalina
D-tyrozyna	a-metylo-aminoizomaślan
D-walina	a-metylo-Y-aminomaślan
D-a-metyloalanina	a-metylocykloheksyloalanina
D-a-metyloarginina	a-metylocyklopentyloalanina

PL 205 984 B1 cd. tabeli 2

1	2
D-a-metyloasparagina	a-metylo-a-naftyloalanina
D-a-metyloasparaginian	a-metylopencyniloamina
D-a-metylocysteina	N-(4-aminobutylo)glicyna
D-a-metyloglutamina	N-(2-aminoetylo)glicyna
D-a-metylohistydyna	N-(3-aminopropylo)glicyna
D-a-metyloizoleucyna	N-amino-a-metylomaślan
D-a-metyloleucyna	a-naftyloalanina
D-a-metylolizyna	N-benzyloglicyna
D-a-metylometionina	N-(2-karbamoilo)glicyna
D-a-metyloornityna	N-(karbamoilometylo)glicyna
D-a-metylofenyloalanina	N-(2-karboksyetylo)glicyna
D-a-metyloprolina	N-(karboksymetylo)glicyna
D-a-metyloseryna	N-cyklobutyloglicyna
D-a-metylotreonina	N-cykloheptyloglicyna
D-a-metylotryptofan	N-cykloheksyloglicyna
D-a-metylotyrozyna	N-cyklodecyloglicyna
L-a-metyloleucyna	L-a-metylolizyna
L-a-metylometionina	L-a-metylonorleucyna
L-a-metylonorwalina	L-a-metyloornityna
L-a-metylofenyloalanina	L-a-metyloprolina
L-a-metyloseryna	L-a-metylotreonina
L-a-metylotryptofan	L-a-metylotyrozyna
L-a-metylowalina	L-N-metylohomofenyloalanina
N-(N-(2,2-difenyloetylokarbamoilometylo)glicyna	N-N-(3,3-difenylopropylokarbamoilometylo)glicyna
1-karboksy-1-(2,2-difenylo-etyloamino)cyklopropan

Wynalazek rozważa również modyfikowane kowalencyjnie dinitrofenolem, polipeptydy, fragmenty lub warianty według wynalazku celem uczynienia ich immunogennymi dla człowieka.

Korzystnie wynalazek obejmuje polipeptydy będące którymkolwiek z polipeptydów określonych przez SEQ ID NOS 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21.

Polipeptydy według wynalazku mogą być otrzymane przy pomocy którejkolwiek znawcom procedury podstawiania. Przykładowo polipeptydy mogą zostać przygotowane zgodnie z procedurą obejmującą etapy:

(a) przygotowanie zrekombinowanego kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd określony przez którąkolwiek z SEQ ID NOS 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21, jego fragment lub wariant lub pochodną, gdzie sekwencja nukleotydową jest połączona funkcjonalnie do kwasu nukleinowego regulującego transkrypcję i translację;

PL 205 984 B1 (b) transformacji lub transfekcji zrekombinowanym kwasem nukleinowym użytecznej komórki gospodarza.

(c) hodowania komórki gospodarza celem uzyskania ekspresji zrekombinowanego polipeptydu ze wspomnianego zrekombinowanego kwasu nukleinowego i (d) izolowania zrekombinowanych polipeptydów.

Wspomniany użyteczny kwas nukleinowy jest wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NOS 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20.

Przez „zrekombinowany polipeptyd rozumie się polipeptyd otrzymany przy pomocy technik rekombinacji na przykład przez ekspresję zrekombinowanego kwasu nukleinowego.

Określenie „zrekombinowany kwas nukleinowy, w użytym tu znaczeniu, określa utworzony in vitro kwas nukleinowy, przez manipulację kwasem nukleinowym w wyniku, której powstaje jego nie występująca w przyrodzie postać. Zgodnie z tym zrekombinowany kwas nukleinowy korzystnie zawiera wektor ekspresyjny, który może być zarówno pozachromosomową samoreplikującą się cząsteczką, taką jak plazmid, lub wektorem, który integruje się do genomu gospodarza. Ogólnie, taki wektor ekspresyjny zawiera kwas nukleinowy regulujący transkrypcję i translację połączony funkcjonalnie ze wspomnianą sekwencją.

Przez „funkcjonalnie połączony rozumie się, że regulujący transkrypcję i translację kwas nukleinowy jest pozycjonowany względem sekwencji nukleotydowej kodującej wspomniany polipeptyd, fragment, wariant lub pochodną, w taki sposób, że zachodzi inicjacja transkrypcji. Ogólnie regulujący transkrypcję i translację kwas nukleinowy będzie odpowiedni dla komórki gospodarza, w której zachodzi ekspresja. Dla różnorodnych komórek nauka zna szereg odpowiednich rodzajów wektorów i użytecznych sekwencji regulatorowych.

Zazwyczaj regulujący transkrypcję i translację kwas nukleinowy może zawierać, lecz nie tylko, sekwencje promotora, lidera lub sekwencje sygnałowe, miejsca wiązania rybosomów, miejsca startu i zatrzymania transkrypcji i sekwencje enhancerów lub aktywatorów.

W wynalazku brane pod uwagę są znane w dziedzinie promotory konstytutywne i indukowalne. Promotory te mogą być zarówno naturalnie występującymi promotorami lub promotorami hybrydowymi, które łączą elementy jednego lub większej liczby promotorów.

W korzystnej postaci wektor ekspresyjny zawiera geny bę d ą ce znacznikami selekcyjnymi, pozwalającymi na wyselekcjonowanie przekształconych komórek gospodarza. Stosowane do selekcji geny są dobrze znane w dziedzinie i różnią się w zależności od użytych komórek gospodarza.

Wektor ekspresyjny może również zawierać partnera do fuzji (zazwyczaj dostarczanego przez wektor ekspresyjny), tak, że objęty wynalazkiem zrekombinowany polipeptyd jest wyrażany jako białko fuzyjne powstałe przez połączenie wyrażonego polipeptydu z odpowiednim fuzyjnym partnerem. Główną korzyścią wynikającą z przyłączenia partnera fuzyjnego jest, że uczestniczy on w identyfikacji i/lub oczyszczaniu wspomnianego białka fuzyjnego.

Dla uzyskania ekspresji wspomnianego białka fuzyjnego jest koniecznym połączenie przez ligację zgodnej z wynalazkiem sekwencji nukleotydowej z wektorem ekspresyjnym, tak, że ramka odczytu fuzyjnego partnera jest zgodna z sekwencją nukleotydową.

Dobrze znanymi przykładami partnerów fuzyjnych są, ale nie tylko: transferaza-S-glutationu, część Fc ludzkiej IgG, białko wiążące maltozę (MBP) i heksahistydyna (His6), które są szczególnie użyteczne dla izolacji fuzyjnych polipeptydów przez chromatografię powinowactwa. Do oczyszczania przez chromatografie powinowactwa fuzyjnych polipeptydów stosownymi złożami są odpowiednio żywice, połączone z glutationem-, amylozą- i niklem- lub kobaltem-. Wiele takich złóż jest dostępnych w postaci „zestawów takich jak system QlAexpress™ (Qiagen) uż yteczny, gdy stosowany jest stosowny partner fuzyjny (HIS6) i system do oczyszczania Pharmacia GST.

Kolejnym, znanym nauce, partnerem fuzyjnym, jest zielone białko fluoryzujące (GFP). Ten partner fuzyjny służy jako „znacznik fluorescencyjny umożliwiający identyfikację objętego wynalazkiem polipeptydu fuzyjnego przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego lub przez cytometrię przepływową. Znacznik GFP jest użyteczny gdy zachodzi potrzeba wewnątrzkomórkowej lokalizacji objętego wynalazkiem polipeptydu fuzyjnego lub dla izolacji komórek wyrażających objęty wynalazkiem polipeptyd fuzyjny. Dla dalszych zastosowań szczególnie użyteczne są metody cytometrii przepływowej, takie jak sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS).

Korzystnie, partner fuzyjny posiada również miejsca cięcia dla proteaz takich jak czynnik Xa lub trombina, co umożliwia odpowiedniej proteazie częściowe trawienie białka fuzyjnego dla uwolnienia

PL 205 984 B1 polipeptydu według wynalazku. Następnie przez kolejny rozdział chromatograficzny polipeptyd może być oddzielony od swego partnera fuzyjnego.

Zgodnie z wynalazkiem, partner fuzyjny posiada również „epitopy znacznikowe, którymi zazwyczaj są krótkie sekwencje peptydowe, dla których dostępne są specyficzne przeciwciała. Dobrze znane przykłady epitopów znacznikowych, dla których dostępne są specyficzne przeciwciała monoklonalne, obejmują c-myc, hemaglutyninę z wirusa grypy i znacznik FLAG.

Objęty wynalazkiem zrekombinowany polipeptyd może być wytwarzany przez hodowanie komórek gospodarza stransformowanych wektorem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, jego fragment, wariant lub pochodną według wynalazku. Warunki odpowiednie dla ekspresji białka będą się różniły w zależności od wybranego wektora ekspresyjnego i komórki gospodarza. Znawca może to łatwo osiągnąć stosując typowe procedury doświadczalne.

Użyteczną komórką gospodarza, w której będzie zachodziła ekspresja może być zarówno komórka prokariotyczna jak i eukariotyczna. Jedną z korzystnych komórek gospodarza dla ekspresji polipeptydu zgodnego z wynalazkiem jest bakteria. Użytą bakterią może być Escherichia coli. Alternatywnie komórką gospodarza może być komórka owada, taka jak komórki SF9, w przypadku których może być użyty bakulowirusowy system ekspresji.

Znawcy dziedziny mogą wygodnie uzyskać zrekombinowane białko posługując się typowym protokołem jaki przykładowo opisali Sambrook i wsp., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANULA (Cold Spring Harbor Press, 1989), włączony tu przez cytowanie, w szczególności Rozdziały 16 i 17; Ausubel i wsp., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, Inc. 1994-1998), włączony tu przez cytowanie, w szczególności Rozdziały 10 i 16 i Coligan i wsp. CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley and Sons, Inc. 1995-1997), który jest włączony tu przez cytowanie, w szczególności Rozdziały 1, 5 i 6.

Sekwencje nukleotydowe.

Ponadto wynalazek dostarcza sekwencję nukleotydową kodującą określone powyżej polipeptyd, jego fragment, wariant lub pochodną. Dogodnie jeśli wspomniana sekwencja jest wybrana z grupy obejmującej SEQ ID NOS 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20, fragmenty sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NOS 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20, oraz sekwencje nukleotydowe homologiczne do powyższych. Korzystnie jeśli sekwencje te kodują produkt posiadający opisane wyżej działanie immunologiczne.

Jak dokładniej opisane będzie w dalszej części, SEQ ID NO 1 odpowiada genowi hiaNm uzyskanemu z N. meningitidis szczepu MC58. Gen ten koduje nowy powierzchniowy polipeptyd o masie cząsteczkowej 62 kDa (około) opisany jako SEQ ID NO 2. SEQ ID NO 3 odpowiada otwartej ramce odczytu hiaNm ze szczepu MC58 kodującej białko HiaNm. SEQ ID NOS 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20 odpowiadają sekwencją homologicznych względem hiaNM otwartych ramek odczytu uzyskanych odpowiednio z N. meningitidis szczepów BZ10, BZ198, EG327, EG329, H15, H38, H41, P20 i PMC21.

Termin „sekwencja nukleotydowa określa tu mRNA, RNA, cRNA, cDNA lub DNA.

Termin „homologi sekwencji nukleotydowej dotyczy sekwencji nukleotydowych zgodnych z wynalazkiem, które hybrydyzują z sekwencją nukleotydową typu dzikiego w zasadniczo ostrych warunkach hybrydyzacji. Użyteczne warunki hybrydyzacji będą dyskutowane dalej.

Homologiczne sekwencje nukleotydowe objęte wynalazkiem mogą być przygotowane zgodnie z poniż szą procedurą :

(i) uzyskanie, przez ekstrakcję, kwasu nukleinowego z użytecznego gospodarza;

(ii) wytworzenie starterów, które ewentualnie są zdegenerowane, gdzie każdy starter zawiera fragment, objętej wynalazkiem, sekwencji nukleotydowej typu dzikiego, i (iii) otrzymanie, przy pomocy wspomnianych starterów i technik amplifikacji kwasów nukleinowych, na matrycy wspomnianego wyekstrahowanego DNA, jednego lub większej liczby produktów amplifikacji.

Użytecznym gospodarzem może być bakteria. Korzystnie jeśli gospodarz należy do rodzaju Neisseria, korzystniej jeśli jest nim N. meningitidis.

Korzystnie, gdy startery są wybrane z grupy obejmującej:(1) 5'-TTAGATTCCACGTCCCAGATT-3' (SEQ ID NO 22);

(2) 5'-CTTCCCTTCAAACCTTCC-3' (SEQ ID NO 23) (3) 5'-GGTCGCGGATCCATGAACAAAATATACCGCAT-3' (SEQ ID NO 24);

(4) 5'-TCACCCAAGCTTAAGCCCTTACCACTGATAAC-3' (SEQ ID NO 25);

PL 205 984 B1 (5) 5'-CCAAACCCCGATTTAACC-3' (SEQ ID NO 26) (6) 5'-AATCGCCACCCTTCCCTTC-3' (SEQ ID NO 27) (7) 5 '-TTTGCAACGGTTCAGGCA-3' (SEQ ID NO 28) (8) 5'-TATTCAGCAGCGTATCGG-3' (SEQ ID NO 29) (9) 5'-TGCCTGAACCGTTGCAAA-3' (SEQ ID NO 30) I (10) 5'- CCGATACGCTGCTGAATA-3' (SEQ ID NO 31)

Znawcom dziedziny dobrze znane są techniki amplifikacji kwasu nukleinowego obejmujące reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), którą przykładowo opisał Ausubel i wsp. (1994-1998, Rozdział 15), a która jest tu włączona przez cytowanie; amplifikację z zastąpieniem nici (SDA) jaką przykładowo opisano w U.S. 5,422,252, który jest włączony tu przez cytowanie, replikację według modelu obracającego się koła (RCA) jaką przykładowo opisali Liu i wsp., (1996, J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594 i międzynarodowe zgłoszenie WO 92/01813) i Lizaradi i wsp., (międzynarodowe zgłoszenie WO 97/19193), które są włączone tu przez cytowanie; amplifikacja na bazie sekwencji kwasu nukleinowego (NASBA) jaką przykładowo opisał Sooknanan i wsp. (1994, Biotechniques 17:1077-1080), która jest włączona przez cytowanie i amplifikacja replikazą Ο-β jaką przykładowo opisali Tyagi i wsp. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5395-5400), która jest włączona przez cytowanie.

W użytym tu znaczeniu „produkt amplifikacji określa kwas nukleinowy wytworzony metodami amplifikacji kwasów nukleinowych.

„Hybrydyzować lub „hybrydyzacja w użytym tu znaczeniu określa parowanie komplementarnych zasad różnych sekwencji nukleotydowych w wyniku, czego powstają hybrydy DNA-DNA lub RNA-RNA zgodne z regułami parowania zasad.

W DNA komplementarnymi zasadami są:

(i) A i T i (ii) C i G.

W RNA komplementarnymi zasadami są:

(i) A i U i (ii) C i G.

W hybrydach RNA-DNA komplementarnymi zasadami są:

(i) A i U (ii) A i T i (iii) G i C.

Zazwyczaj zasadniczo komplementarne sekwencje nukleotydowe są wykrywane przy pomocy metod blotowania, które obejmują etapy w czasie, w którym nukleotydy są unieruchamiane na złożu (syntetycznie na syntetycznej błonie jaką przykładowo jest nitroceluloza), etap hybrydyzacji oraz etap detekcji. Technika typu Southern blot jest używana dla identyfikacji komplementarnych sekwencji DNA, technika typu Northern blot stosowana jest dla identyfikacji komplementarnych sekwencji RNA. Dla identyfikacji komplementarnych sekwencji polinukleotydowych tworzących hybrydy DNA/DNA, DNA/RNA lub RNA/RNA można zastosować blotowanie typu Dot i slot. Tego typu techniki są dobrze znane znawcom i zostały opisane przez Ausubel i wsp. (1994-1998, cytowany), 2.9.1 do 2.9.20.

Zgodnie z tymi metodami, blot typu Southern wymaga zależnego od wielkości elektroforetycznego rozdziału cząsteczek DNA w żelach, przeniesienia, rozdzielonych z uwagi na wielkość cząsteczek DNA na syntetyczną błonę i hybrydyzacji związanych z błoną DNA z wyznakowanymi radioaktywnie, enzymatycznie lub fluorochromatycznie cząsteczkami komplementarnych nukleotydów. W technikach blotów dot i slot, próbki DNA są bezpośrednio nanoszone na syntetyczną błonę i hybrydyzowane jak wyżej.

Alternatywne etapy blotowania, takie jak hybrydyzacja łysinkowa lub kolonijna, są stosowane gdy identyfikowana jest komplementarna sekwencja nukleotydowa obecna w cDNA lub genomowych bibliotekach genów. Typowy przykład takiej procedury został opisany przez Sambrook i wsp., (1989, cytowany) w Rozdziałach 8-12.

Typowo dla określenia warunków hybrydyzacji zastosowane mogą być następujące ogólne sposoby postępowania. Sekwencje nukleotydowe są blotowane/przenoszone, w wyżej opisany sposób, na syntetyczną błonę. Objęta wynalazkiem sekwencja typu dzikiego jest znakowana jak opisano

PL 205 984 B1 to powyżej i badana jest zdolność tej wyznakowanej sekwencji do hybrydyzacji z unieruchomionymi na błonie sekwencjami nukleotydowymi.

Znawcy dziedziny powinni dostrzegać, że na hybrydyzację będzie wpływało wiele czynników. Aby uzyskać wykrywalny sygnał, zazwyczaj radioaktywność specyficzna wyznakowanej radioaktywnie sekwencji polinukleotydowej powinna być większa lub równa około 10⁸ dpm/mg. Wyznakowane radioaktywnie sekwencje nukleotydowe o radioaktywności specyficznej 10⁸ do 10⁹ dpm/mg mogą wykrywać około 0,5 pg DNA. Jest dobrze znane w dziedzinie, że aby uzyskać detekcję, na filtrze musi zostać unieruchomione dostatecznie dużo DNA. Pożądany jest nadmiar unieruchomionego DNA, zazwyczaj wynoszący 10 μο. Czułość hybrydyzacji zwiększa dodanie na czas jej trwania, obojętnego polimeru, takiego jak 10% (wag./obj.) siarczanu dekstranu (masa cząsteczkowa 500000) lub poli(glikolu etylenowego) 6000 (patrz Ausubel, cytowany, 2.10.10).

Dla uzyskania znaczących wyników hybrydyzacji pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi unieruchomionymi na błonie, a wyznakowanymi sekwencjami nukleotydowymi, z unieruchomioną na filtrze sekwencją nukleotydową musi hybrydyzować dostateczna ilość wyznakowanej sekwencji nukleotydowej po czym następuje płukanie. Płukanie powoduje, że wyznakowana sekwencja nukleotydowa hybrydyzuje jedynie z unieruchomioną sekwencją nukleotydową o pożądanym poziomie komplementarności do wyznakowanej sekwencji nukleotydowej.

„Ostrość warunków hybrydyzacji w użytym tu znaczeniu określa temperaturę, warunki siły jonowej oraz czy w czasie hybrydyzacji obecny jest określony rozpuszczalnik organiczny. Im ostrzejsze będą warunki hybrydyzacji tym hybrydyzować będą bardziej do siebie komplementarne unieruchomione sekwencje polinukleotydowe oraz znakowane sekwencje polinukleotydowe.

„Ostre warunki hybrydyzacji określają takie warunki, w których hybrydyzują ze sobą jedynie takie sekwencje nukleotydowe, w których zasady komplementarne występują z wysoką częstością.

Typowymi ostrymi warunkami hybrydyzacji są przykładowo (1) 0,75 M dwuzasadowy fosforan sodowy/ 0,5 M jednozasadowy fosforan sodowy/ 1 mM disodowa EDTA/ 1% sarkozyl, temperatura około 42°C przez około 30 minut, lub (2) 6,0 M mocznik/0,4% sól sodowa siarczanu laurylu/0,1x SSC w około 42°C przez co najmniej 30 minut; lub (3) 0,1xSSC/0,1% SDS w około 68°C przez co najmniej 20 min. lub (4) 1x SSC/0,1% SDS w 55°C przez około 60 minut lub (5) 1x SSC/0,1% SDS w około 62°C przez około 60 minut lub (6) 1x SSC/0,1% SDS w około 68°C przez około 60 minut lub (7) 0,2x SSC/0.1% SDS w około 55°C przez około 60 minut lub (8) 0,2x SSC/0,1% SDS w około 62°C przez około jedną godziną (9) 0,2x SSC/0,1% SDS w około 68°C przez około 60 minut. Szczegółowe przykłady podano w CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, cytowany, na stronach 2.10.1 do 1.10.16 i Sambrook i wsp. w MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbour Press, 1989) w sekcjach 1.101 do 1.104, które włączone są przez cytowanie.

Choć płukanie w ostrych warunkach jest typowo prowadzone w temperaturach od około 42°C do 68°C znawca uzna, że mogą być użyteczne inne ostre warunki płukania. Maksymalna hybrydyzacja zachodzi zazwyczaj w temperaturach od 20°C powyżej do 25°C poniżej Tm dla powstawania hybryd DNA-DNA. Jest dobrze wiadome, że Tm jest temperaturą topnienia lub temperaturą, w której następuje dysocjacja dwóch komplementarnych sekwencji polinukleotydowych. Nauka dobrze zna sposoby szacowania Tm (patrz CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, cytowany, strona 2.10.8). Dla DNA-RNA hybryd maksymalna hybrydyzacja zazwyczaj zachodzi w temperaturach o około 10 do 15°C poniżej Tm.

W dziedzinie znane są inne ostre warunki hybrydyzacji. Znawca stwierdzi, że można manipulować wieloma czynnikami dla optymalizacji specyficzności hybrydyzacji. Optymalizacja ostrości ostatecznego płukania służy dla upewnienia się odnośnie wysokiego stopnia hybrydyzacji.

Znawcom dobrze znane są sposoby wykrywania znakowanych sekwencji nukleotydowych hybrydyzujących z unieruchomionymi sekwencjami nukleotydowymi. Metody te obejmują autoradiografię, wykrywanie chemiluminiscencji, fluorescencji i wykrywanie kolorymetryczne.

Przeciwciała

Wynalazek opisuje również przeciwciała przeciw wcześniej wzmiankowanym polipeptydom, ich fragmentom, wariantom i pochodnym. Przeciwciała te mogą obejmować każde użyteczne przeciwciało, które wiąże się lub tworzy połączenia z objętymi wynalazkiem polipeptydem, jego fragmentem, wariantem lub pochodną. Przykładowo przeciwciała mogą obejmować przeciwciała poliklonalne. Przeciwciała takie mogą być uzyskane przez wstrzyknięcie, celem uzyskania surowicy poliklonalnej, polipeptydu jego fragmentu, wariantu lub pochodnej wytwarzającemu przeciwPL 205 984 B1 ciała zwierzęciu, którym może być mysz lub królik. Naukowcom jest dobrze znany sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych. Przykładowy protokół, który może być zastosowany, został przykładowo opisany przez Coligan i wsp., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley and Sons, Inc„ 1991), który jest włączony przez cytowanie i Ausubel i wsp., (1994-1998, cytowany), szczególnie w Sekcji III Rozdziału 11.

Zamiast przeciwciał poliklonalnych otrzymywanych od wytwarzającego je zwierzęcia, otrzymane mogą zostać przeciwciała monoklonalne, produkowane przykładowo sposobem opisanym w artykule Kohler i Milstein (1975, Nature 256, 495-497, który jest włączony przez cytowanie, lub za pomocą jego nowych modyfikacji, takich jak na przykład opisana przez Coligan i wsp., (1991, cytowany) przez unieśmiertelnione komórki szpiku lub inne wytwarzające przeciwciało komórki, które pochodzą od gatunków, które były zaszczepione jednym lub większą liczbą objętych wynalazkiem polipeptydów, ich fragmentów, wariantów lub pochodnych.

Wynalazek obejmuje również swoim zakresem przeciwciała, które zawierają fragmenty Fc lub Fab opisanych powyżej monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał. Alternatywnie przeciwciała mogą zawierać pojedynczy łańcuch przeciwciał Fv (scFvs) przeciw polipeptydowi objętemu wynalazkiem. Taki scFvs może być przygotowany, przykładowo zgodnie z metodami opisanymi odpowiednio w dokumencie patentowym US 5,091, 513, europejskim dokumencie patentowym Nr 239, 400 lub w artykule Winter i Milstein (1991, Nature, 349 293), które są włączone przez cytowanie.

Objęte wynalazkiem przeciwciała mogą być użyte w izolowaniu naturalnych lub zrekombinowanych polipeptydów N. meningitidis przez chromatografię powinowactwa. Przykładowo można się tu odnieść do procedury chromatografii immunopowinowactwa opisanej w rozdziale 9.5 pracy Coligan i wsp. (1995-1997, cytowana).

Przeciwciała mogą być użyte do skriningu bibliotek ekspresyjnych w poszukiwaniu objętych wynalazkiem wariantów polipeptydów. Przeciwciała z wynalazku mogą również być użyte dla wykrycia opisanych wcześniej infekcji N. meningitidis.

Wykrywanie N. meningitidis.

Obecność lub brak N. meningitidis u pacjentów może być określony przez izolację próbek biologicznych od pacjentów, mieszanie przeciwciał lub opisanych wyżej fragmentów przeciwciał z próbkami biologicznymi do uzyskania postaci mieszaniny i wykrywanie specyficznie związanego przeciwciała lub fragmentu w mieszaninie co wskazuje na obecność w próbce N. meningitidis.

Określenie „próbka biologiczna w użytym tu znaczeniu określa próbkę, która może być próbką wydzieloną od pacjentów w postaci obrobionej, nie obrobionej, rozcieńczonej lub stężonej. Dogodnie, próbka biologiczna jest wybrana z grupy obejmującej pełną krew, surowicę, osocze, ślinę, mocz, pot, płyn puchlinowy, płyn otrzewnowy, płyn maziowy, płyn owodniowy, płyn rdzeniowy, bioptaty skóry i im podobne.

Zastosowana może być jakakolwiek użyteczna technika pozwalająca na wykrycie powstających kompleksów. Przykładowo, zgodne z wynalazkiem przeciwciała lub fragmenty przeciwciał posiadające związany z nimi znacznik mogą być wykorzystane w testach immunologicznych. Takie, dobrze znane znawcom dziedziny testy immunologiczne mogą obejmować, ale nie są ograniczone do, testów radioimmunologicznych (RIA), testów immunoenzymosorpcyjny (ELISA) i techniki immunochromatograficzne (ICT). Przykładowo, można tu przywołać „Current Protocols in Immunology (1994, cytowany), które dostarczają różnorodnych oznaczeń immunologicznych, które mogą być użyte zgodnie z obecnym wynalazkiem. Z punktu widzenia dziedziny wynalazku zrozumiałym jest, że oznaczenie immunologiczne może obejmować oznaczenie kompetycyjne.

Znacznik związany z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała może być jednym z wyżej wymienionych:

i. znacznikiem bezpośrednio przyłączonym do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała;

ii. znacznikiem pośrednio przyłączonym do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała; np. znacznikiem przyłączonym do innego odczynnika stosowanego w teście, który następnie wiąże się do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała i iii. przyłączonego do produktu końcowego reakcji przeciwciała lub fragmentu przeciwciała.

Znacznik może być wybrany z grupy obejmującej chromogen, substrat, enzym, fluorofor, cząsteczkę chemiluminesceiny, jon lantanowca takiego jak europ (Eu³⁴), izotop radioaktywny i bezpośrednio widoczny znacznik.

PL 205 984 B1

W przypadku bezpośrednio widocznego znacznika może być użyty metal koloidalny lub nie metaliczna cząsteczka, cząsteczka barwnika, enzym lub substrat, organiczny polimer, cząsteczkę lateksu, liposom lub inne nośniki niosące substancję niosącą sygnał i im podobne.

Wiele enzymów użytecznych jako znaczniki ujawniono w opisach patentowych U.S.4, 366,241, U.S. 4, 843, 000, i U.S.4, 849, 338 które wszystkie są tu włączone przez cytowanie. Użyteczne znaczniki enzymatyczne do zastosowania w obecnym wynalazku obejmują alkaliczną fosfatazę, peroksydazę chrzanową, lucyferazę, β-galaktozydazę, oksydazę glukozy, lizozym, dehydrogenazę jabłczanową i im podobne. Znacznik enzymatyczny może być użyty sam lub w kombinacji z drugim, obecnym w roztworze enzymem.

Użyteczne fluorofory są wybrane z grupy obejmującej izocyjanian fluoresceiny (FITC), izocyjanian czterometylorodaminy (TRITL) lub R-fikoerytrynę (RPE).

Wynalazek może być również zastosowany w sposobie wykrywania infekcji N. meningitidis u pacjentów, gdzie wspomniany sposób obejmuje etapy kontaktowania pochodzących od pacjentów próbek biologicznych z objętym wynalazkiem polipeptydem, fragmentem, wariantem lub pochodną i określenia obecności lub nieobecności kompleksu pomiędzy wspomnianym polipeptydem, fragmentem, wariantem lub pochodną i specyficznymi przeciwciałami przeciw N. meningitidis w rzeczonej surowicy gdzie wspomniany kompleks jest wskaźnikiem wspomnianej infekcji.

W korzystnej postaci detekcja powyższego kompleksu jest uzyskiwana dzięki wykrywalnie zmodyfikowanemu wspomnianemu polipeptydowi, fragmentowi, wariantowi lub pochodnej z użytecznym znacznikiem, co jest dobrze znane w dziedzinie, i użyciu tak zmodyfikowanego składnika w dogodnym oznaczeniu immunologicznym jakie przykładowo opisano powyżej.

W kolejnej postaci wynalazek dostarcza sposobu wykrywania bakterii N. meningitidis w próbkach biologicznych podejrzanych o zawieranie wspomnianych bakterii, wspomniana metoda obejmuje etapy pobierania próbek biologicznych od pacjentów, wykrywania objętych wynalazkiem sekwencji kwasów nukleinowych we wspomnianych próbkach co wykazuje obecność wspomnianych bakterii.

Wykrycie wspomnianych sekwencji kwasu nukleinowego może być wykonane przy pomocy jakiejkolwiek użytecznej techniki. Przykładowo, jest znane dziedzinie, że zgodna z wynalazkiem wyznakowana sekwencja kwasu nukleinowego może być użyta jako sonda w doświadczeniu typu Southern blot z kwasem nukleinowym uzyskanym od pacjenta. Alternatywnie wyznakowana zgodna z wynalazkiem sekwencja kwasu nukleinowego może być wykorzystana jako sonda w doświadczeniu Northern blot z wydzielonym od pacjenta RNA. Korzystnie, wydzielony od pacjenta kwas nukleinowy jest wykorzystywany wraz z oligonukleotydowymi starterami odpowiadającymi sekwencjom sensownej i antysensownej zgodnego z wynalazkiem kwasu nukleinowego lub otaczającymi go sekwencjami dla amplifikacji kwasu nukleinowego w reakcji takiej jak PCR lub łańcuchowa reakcja ligazy (LCR), które przykładowo opisano w międzynarodowym zgłoszeniu WO 89/09385, które włączono tu przez cytowanie. Dostępne są również różnorodne techniki automatycznego wykrywania na fazie stałej. Przykładowo, dla wykrywania kwasów nukleinowych używane są oznaczenia wykorzystujące wielkoskalowe uporządkowanie osadzonego startera (VLSIPS™) co przykładowo opisali Fodor i wsp. (1991, Science 251: 767-777) i Kazal i wsp. (1996, Nature Medicine 2:753-759). Powyższe techniki są dobrze znane znawcom dziedziny.

Kompozycje farmaceutyczne

Kolejną cechą wynalazku jest użycie zgodnego z wynalazkiem polipeptydu, fragmentu, wariantu lub pochodnej („czynników immunogenicznych) jako składników aktywnych w kompozycjach farmaceutycznych dla ochrony pacjentów przed zakażeniem N. meningitidis. Dogodnie, kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Przez „farmaceutycznie akceptowalny nośnik rozumie się stały lub płynny wypełniacz, rozpuszczalnik lub substancję zamykającą, która może być bezpiecznie użyta dla podania ogólnoustrojowego. W zależności od szczególnej drogi podania użyte mogą być różnorodne, dobrze znane w dziedzinie, farmaceutycznie akceptowalne nośniki. Nośniki te mogą być wybrane z grupy obejmującej cukry, skrobię, celulozę i jej pochodne, słód, żelatynę, talk, siarczan wapnia, oleje roślinne, syntetyczne oleje, poliole, kwas alginowy, zbuforowane roztwory fosforanów, emulgatory, izotoniczny roztwór soli wolną od pirogenów wodę.

Dla dostarczenia pacjentowi objętej wynalazkiem kompozycji może być zastosowana jakakolwiek użyteczna droga podania. Przykładowo, zastosowane może być podanie doustne, doodbytnicze, pozajelitowe, podjęzykowe, dopoliczkowe, donaczyniowe, dostawowe, domięśniowe, doskórne, podPL 205 984 B1 skórne, inhalacja, dooczne, dootrzewnowe, do płynu rdzeniowo-mózgowego, śródskórnie i podobnymi sposobami. Przykładowo, dla podania immunogenicznych kompozycji, szczepionek i szczepionek DNA odpowiednie są wstrzyknięcia domięśniowe i podskórne.

Dawki przyjmują postaci tabletek, dyspersji, zawiesin, zastrzyków, roztworów, syropów, kołaczyków, kapsułek, czopków, aerozoli, plastrów śródskórnych i im podobnych. Formy podawania mogą również obejmować wstrzykiwane lub wszczepiane urządzenia kontrolujące uwalnianie substancji, zaprojektowane specjalnie dla tych celów lub inne postaci implantów dostosowane tak, aby dodatkowo funkcjonowały w pożądany sposób. Kontrolowane uwalnianie czynnika leczniczego może być osiągnięte przez jego powleczenie, przykładowo hydrofobowymi polimerami w tym żywicami akrylowymi, woskami, wyższymi alkoholami alifatycznymi, poli(kwasami mlekowymi) i poli(kwasami glikolowymi) i pewnymi pochodnymi celulozy, takimi jak hydroksypropylometyloceluloza. Dodatkowo kontrolowane uwalnianie może być skutkiem zastosowania innych matryc polimerowych, liposomów i/lub mikrosfer.

Objęta obecnym wynalazkiem kompozycja farmaceutyczna użyteczna dla podania doustnego lub pozajelitowego może występować jako niezależne jednostki takie jak kapsułki, saszetki lub tabletki, z których każda zawiera wcześniej określoną ilość jednego lub większej liczby objętych wynalazkiem czynników terapeutycznych w postaci proszku lub granulek albo jako roztwór lub zawiesina w roztworach wodnych, płynach niewodnych, emulsji woda-w-oleju lub olej-w-wodzie. Kompozycja taka może być przygotowana którąkolwiek z metod farmaceutycznych, lecz wszystkie one obejmują etap łączenia jednego lub większej liczby opisanych wyżej czynników immunogenicznych z nośnikiem, który stanowi jeden lub więcej niezbędnych składników. Ogólnie kompozycje są przygotowywane przez gruntowne mieszanie do uzyskania jednorodnej mieszaniny objętych wynalazkiem czynników immunogenicznych z płynnymi nośnikami lub dokładnie rozdrobnionymi nośnikami stałymi lub jednym i drugim, a następnie jeśli jest to niezbędne nadanie produktowi pożądanej postaci.

Powyższa kompozycja może być podana w sposób zgodny z postacią dawki w takiej ilości, która efektywnie wywołuje odpowiedź immunologiczną chroniącą pacjenta przed infekcją N. meningitidis. Dawka podana pacjentowi, w kontekście obecnego wynalazku, powinna być wystarczająca dla wywołania u pacjenta korzystnej, trwałej odpowiedzi, która w określonym czasie zmniejszy poziom N. meningitidis lub zahamuje wywołaną przez N. meningitidis infekcję. Ilość podawan(ych)ego składnik(ów)a może zależeć od leczonego podmiotu w tym od jego wieku, płci, wagi i ogólnego stanu zdrowia. Zgodnie z tym dokładna ilość wymaganego do podania immunogenicznego składnika(ów) będzie zależała od osądu lekarza. Określając efektywną ilość środka immunogenicznego który ma być podany w czasie leczenia lub profilaktyki skierowanej przeciwko N. meningitidis, lekarz może oceniać stężenie w osoczu w krwioobiegu, postęp choroby i wytwarzanie przeciwciał przeciw N. meningitidis. W każdym przypadku znawca dziedziny może łatwo określić użyteczną dawkę objętych wynalazkiem immunogenicznych czynników. Taka dawka immunogenicznych środków objętych wynalazkiem może przyjmować wartości nanogramowe do miligramowych.

Powyższe kompozycje mogą być zastosowane jako szczepionki terapeutyczne lub profilaktyczne. Zgodnie z tym, wynalazek obejmuje wytwarzanie szczepionek zawierających jako składniki aktywne jeden lub więcej objętych wynalazkiem czynników immunogennych. Do produkcji takich szczepionek rozważona może być każda dogodna procedura. Przykładowe procedury obejmują te, które opisano w New Generation Vaccines (1997, Levine i wsp., Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong), które tu włączone są przez cytowanie.

Zgodny z wynalazkiem czynnik immunogeniczny może być mieszany, sprzęgany lub łączony z innymi antygenami, włącznie z epitopami komórek B lub T innych antygenów. Dodatkowo jak opisano powyżej może być on łączony z nośnikiem.

Gdy używany jest haptenowy peptyd z wynalazku (tj. peptyd, który reaguje ze skierowanymi przeciwko niemu antygenami, lecz sam nie może wywołać odpowiedzi immunologicznej) może być on połączony z immunogenicznym nośnikiem. W stanie techniki dobrze znane są użyteczne nośniki, które przykładowo obejmują: tyroglobulinę, albuminy takie jak ludzka albumina surowicy, toksyny, toksoidy, lub jakikolwiek materiał reagujący krzyżowo ze zmutowaną postacią (CRM) toksyny tężca, dyfterytu, krztuśca, Pseudomonas, E.coli, Staphylococcus i Streptococcus, kwasami poliaminowymi takimi jak poli(lizyna:kwas glutaminowy), wirus grypy, rotawirus VP6, parvowirus VP1 i VP2, białko otoczki wirusa żółtaczki typu B, zrekombinowana szczepionka przeciwko wirusowi żółtaczki typu B i im podobne. Alternatywnie, może być użyty fragment lub epitop białka

PL 205 984 B1 nośnikowego lub innych białek immunogenicznych. Przykładowo, objęty wynalazkiem haptenowy peptyd może być połączony z epitopem komórki C dla toksyny bakteryjnej, toksoidu lub CRM. Zgodnie z tym można tu przywołać dokument U.S. 5, 785, 973, który jest włączony tu przez cytowanie.

Dodatkowo w kompozycjach szczepionek skierowanych przeciw Neisseria lub przeciw innym bakteriom lub wirusom jako nośnik białkowy może działać objęty wynalazkiem polipeptyd, fragment, wariant lub pochodna.

Objęte wynalazkiem czynniki immunogeniczne mogą być podane jako składniki multiwalentnych szczepionek w kombinacji z antygenami N. meningitidis lub antygenami innych organizmów w tym patogennych bakterii H. influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E.coli, S. pneumoniae itp. Alternatywnie lub dodatkowo mogą być one podane łącznie z oligosacharydowymi lub polisacharydowymi składnikami N. meningitidis.

Szczepionki mogą zawierać również fizjologicznie akceptowalne rozcieńczalniki lub dodatki takie jak woda, roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami i roztwór soli fizjologicznej.

Szczepionki i kompozycje immunogeniczne mogą zawierać adiuwanty, co jest dobrze znane w stanie techniki. Do uż ytecznych adiuwantów należą, ale nie tylko: substancje czynne powierzchniowo takie jak heksadecyloamina, oktadecyloamina, estry aminokwasów oktadecylowych, lizolektyna, bromek dimetylodioktadecyloamoniowy, N,N-dikoktadecylo-N,N'bis(2-hydroksyetylo-propanodiamina), metoksyheksadecyloglicerol i poliole (pluronic); poliaminy takie jak piren, siarczan dekstranu, poli IC karbopol; peptydy takie jak dwupeptyd muramylowy i jego pochodne, dimetyloglicyna, tufcyna; emulsje olejowe i żele mineralne takie jak fosforan glinu, wodorotlenek glinu lub ałun; limfokiny, QuilA i stymulują ce odpowiedź immunologiczn ą kompleksy (ISCOMS).

Objęte wynalazkiem czynniki immunogeniczne mogą być wyrażane przez osłabionych gospodarzy wirusowych. Przez określenie „osłabieni gospodarze wirusowi rozumie się wektory wirusowe, które są zarówno naturalnie wirulentne lub zostały uczynione zasadniczo awirulentnymi. Wirus może być uczyniony zasadniczo awirulentnym przy pomocy jakiegokolwiek z użytecznych sposobów fizycznych (np. ogrzewanie) lub chemicznych (np. działanie formaldehydem). Przez „zasadniczo awirulentne rozumie się wirusy pozbawione zdolności infekcji. Idealnie jeśli infektywność wirusa jest zniszczona bez zaburzania białek określających immunogenność wirusa. Z powyż szego wynika, ż e pożądanym będzie aby osł abieni gospodarze wirusa mogli zawierać żywe wirusy lub wirusy inaktywowane.

Osłabieni gospodarze wirusów, którzy mogą być użyteczni w szczepionce według wynalazku mogą zawierać wektory wirusowe pochodzące od adenowirusów, cytomegalowirusów i korzystnie wirusów ospy takich jak krowianka (patrz dla przykładu Paoletti i Panicali, U.S. No.4, 603, 112, który jest włączony tu przez cytowanie) i osłabione szczepy Salmonella (patrz, dla przykładu, Stocker, U.S. No.4, 550, 081, który jest włączony tu przez cytowanie). Żywe wirusy krowianki są szczególnie korzystne ponieważ powodują przedłużone pobudzenie, które może ustalić zasadniczo długotrwałą oporność.

Multiwalentne szczepionki mogą być przygotowane z jednego lub większej liczby mikroorganizmów, które wyrażają różne epitopy N. meningitidis (np. inne białka powierzchniowe lub epitopy N. meningitidis). Dodatkowo do szczepionki mogą być włączone epitopy innych patogennych mikroorganizmów.

W korzystnym wariancie wynalazku będzie to wymaga ł o utworzenia zrekombinowanego wirusa krowianki dla ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku. Po wprowadzeniu do gospodarza, zrekombinowany wirus krowianki wyraża czynnik immunogeniczny a tym samym wywołuje odpowiedź gospodarza typu CTL. Dla przykładu można tu przywołać dokument patentowy U.S.4, 722, 848 włączony tu przez cytowanie, który opisuje wektory krowiankowe i sposoby użyteczne w protokole immunizacji.

Z obecnego ujawnienia dla znawców bę dzie jasne, ż e istnieje szeroka gama innych wektorów, które mogą być użyteczne do terapeutycznego podania lub immunizacji jako czynniki immunogeniczne według wynalazku.

W innym wariancie wynalazku jako szczepionka może być użyta sekwencja nukleotydowa w postaci znanej nauce szczepionki z „nagiego DNA. Przykł adowo, zgodny z wynalazkiem wektor ekspresyjny może być wprowadzony do ssaka, gdzie in vivo powodować będzie produkcję polipeptydu, przeciw któremu gospodarz rozwinie odpowiedź immunologiczną, co przykładowo opisali Barry, M. i wsp. (1995, Nature, 377: 632-635), który tu jest włączony przez cytowanie.

PL 205 984 B1

Zestawy do wykrywania

Obecny wynalazek dostarcza również zestawów dla detekcji w próbkach biologicznych N. meningitidis. Będą one zawierały jeden lub więcej szczególnych opisanych wyżej czynników co zależeć będzie od charakteru opracowanego sposobu testowania. Zgodnie z tym zestawy mogą zawierać co najmniej jeden polipeptyd, fragment, wariant, pochodną przeciwciało, fragment przeciwciała lub kwas nukleinowy według wynalazku. Opcjonalnie zestawy mogą również zawierać odpowiednie odczynniki do wykrywania znaczników, pozytywne i negatywne składniki kontrolne, roztwory do płukania, bufory do rozcieńczania i im podobne. Przykładowo, oparty na kwasie nukleinowym zestaw do detekcji może obejmować (i) zgodny z wynalazkiem kwas nukleinowy (który może być użyty jako pozytywny składnik pozytywny), (ii) z starter oligonukleotydowy według wynalazku i opcjonalnie polimerazę DNA, ligazę DNA, itp., w zależności od użytej techniki amplifikacji kwasu nukleinowego.

Przygotowanie fragmentów immunoreaktywnych.

Wynalazek może być wykorzystany również w sposobie identyfikacji immunoreaktywnych fragmentów polipeptydu, wariantu lub pochodnej według wynalazku. Zasadniczo sposób ten obejmuje wytworzenie fragmentu polipeptydu, wariantu lub pochodnej, podanie fragmentu ssakowi; i wykryciu u ssaka odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedź taka będzie obejmowała wytwarzanie składników, które specyficznie wiążą N. meningitidis i/lub wspomniane polipeptydy, warianty lub pochodne i/lub efekt ochronny przeciw infekcji N. meningitidis.

Przed sprawdzaniem szczególnego fragmentu pod kątem immunoreaktywności w wyżej wspomnianej metodzie, różnorodne zalecane metody mogą być użyte dla dedukcji czy szczególny fragment może być użyty dla uzyskania przeciwciał, które reagują krzyżowo z naturalnym antygenem. Te metody wskaźnikowe mogą wykorzystywać amino- lub karboksy-sekwencję terminalną, co przykładowo zostało opisane w Rozdziale 11.14 przez Ausubel i wsp. (1994-1998, cytowany). Alternatywnie metody wskaźnikowe mogą być oparte na przewidywaniu hydrofilowości co przykładowo opisali Kyte i Doolittle (1982, J.Mol. Biol. 157:105-132) i Hopp i Woods (1983, Mol. Immunol. 20:483-489), które zostały włączone tu przez cytowanie lub przewidywanie struktury drugorzędowej jak przykładowo zostało opisane przez Choo i Fasmana (1978, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276) które włączono przez cytowanie.

Ogólnie najlepsze wyniki daje stosowanie peptydów zbudowanych z 10 do 15 aminokwasów. Z powodzeniem stosowane są peptydy zbudowane zaledwie z 6 lub aż z 20 aminokwasów. Takie fragmenty peptydów mogą być następnie chemicznie łączone z cząsteczką nośnika takiego jak hemocyjanina (KLH) lub albumina z surowicy wołowej (BSA) co przykładowo opisano w Sekcji 11.14 i 11.15 Ausubel i wsp. (1994-1998, cytowany).

Peptydy mogą być użyte do immunizacji zwierząt jak to przykładowo dyskutowano powyżej. Miano przeciwciał przeciw naturalnemu lub wyjściowemu polipeptydowi, z którego selekcjonowany był peptyd może być określone przykładowo przez oznaczenie radioimmunologiczne lub ELISA jak przykładowo opisano w Sekcjach 11.16 i 11.13 Ausubel i wsp. (1994-1998, cytowany).

Immunoreaktywność przeciwciała względem naturalnego lub wyjściowego polipeptydu może być określona jakąkolwiek użyteczną metodą taką jak przykładowo Western blot.

Funkcjonalne związki blokujące.

Uważa się, polipeptydy określone przez SEQ ID NOS 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21 mają właściwości adhezyjne. W rzeczywistości wykazują one pewne podobieństwo do adhezyn z Haemophilus influenzae, które są antygenami powierzchniowymi. Konkretnie, posiadają one około 67% homologię do białka Hia z H. influenzae (Barenkamp, S. i St. Geme III, J. 1996 Molecular Microbiology 19: 1215-1233), i 74% homologię do białka Hsf z H. influenzae (St. Geme III, J. I wsp., 1996, Journal of Bacteriology 178: 6281-6287; i U.S. No 5, 646, 259). W porównaniach tych stosując program GAP (Deveaux, 198, cytowany) luki ważono jako 3, a długość ważono jako 0,001. Przyrównane sekwencje tych białek zobrazowano na Fig. 6. Tak więc, zaburzenie funkcji tych polipeptydów powinno dawać znaczącą terapeutyczną korzyść gdyż będzie zapobiegało adhezji bakterii N. meningitidis na atakowanych komórkach. Zaburzenie funkcji może być osiągnięte różnymi sposobami.

Przykładowo mogą być podawane cząsteczki takie jak odczynniki chemiczne lub polipeptydy, które blokują receptory na powierzchni komórki, które oddziałują z polipeptydami określonymi przez SEQ ID NOS 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21. Konkurują one z infekującym organizmem o obszary receptorowe. Takie cząsteczki mogą przykładowo zawierać polipeptydy objęte wynalazkiem, w szczególności fragmenty lub ich funkcjonalne równoważniki jak również mimetyki.

PL 205 984 B1

Określenie „mimetyki jest użyte tu dla określenia związków chemicznych, które zostały zaprojektowane tak, aby przypominały szczególny obszar białek lub peptydów. Zastosowane mogą być również przeciwciała antyidiotypowe rozwinięte przeciw wyżej opisanym przeciwciałom, które blokują wiązanie się bakterii do powierzchni komórki. Alternatywnie, mogą efektywnie bronić komórkę przed infekcja N. meningiticlis cząsteczki, które będą oddziaływały z miejscami receptorowymi w polipeptydach określonych przez SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21. Takie cząsteczki mogą obejmować blokujące przeciwciała, peptydy lub inne odczynniki chemiczne.

Wszystkie cząsteczki, farmaceutyczne kompozycje, w których są one łączone z farmaceutycznie akceptowanymi nośnikami użyteczne w sposobach postępowania z pacjentami dla zapobiegania infekcjom N. meningiticlis przez podawanie takich cząsteczek lub kompozycji stanowią kolejną postać wynalazku.

Objęte wynalazkiem polipeptydy mogą być użyte dla przebadania składników pod kątem ich użycia w powyższych sposobach. Przykładowo, objęte wynalazkiem polipeptydy mogą być łączone ze znacznikiem i wprowadzane do hodowli komórkowych w obecności badanego odczynnika. Obserwowana może być zdolność odczynnika do hamowania wiązania znakowanego polipeptydu z powierzchnią komórki. W takich przeszukiwaniach znakowane polipeptydy mogą być użyte bezpośrednio na organizmie takim jak E.coli. Alternatywnie sama N. meningiticlis może być modyfikowana tak aby wyrażała zmodyfikowaną i wykrywalną postać polipeptydu. W tym sposobie korzystnym jest użycie modyfikowanych szczepów N. meningiticlis ponieważ jest bardziej prawdopodobnym, że trzeciorzędowa struktura białka będzie bardziej przypominała to, które jest wyrażane w bakteriach typu dzikiego. Aby wynalazek mógł być lepiej zrozumiany i zastosowany w praktyce poniżej opisane będą jego szczególne, korzystne postaci, które nie ograniczają wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Klonowanie, subklonowanie i konstrukcja mutanta hiaNm.

Pierwotnie gen hiaNm został wyizolowany przy pomocy typowej metody amplifikacji przez PCR. Krótko, dzięki naszym wcześniejszym pracom na homologu białka AIDA-I z E.coli (Jennings, M. i wsp., 1995, Microbial Pathogenesis, 19: 391-407, Peak, I. i wsp., Microbial Pathogenesis, w druku) dokonano analizy homologii identyfikując interesujące sekwencje w oparciu o wstępne wyniki uzyskane w ramach realizacji projektu ustalania sekwencji genomu MC58¢3 (The Institute for Genomic Research, ftp://ftp.tigr.org/pub/data/n meningitidis/) i amplifikacji przez PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) z wykorzystaniem oligonukleotydów A3A (5'-TTTGCAACGGTTCAGGCA-3', SEQ ID NO 28) i A3B (5'-TATTCAGCAGCGTATCGG-3', SEQ ID NO 29), obszaru homologicznego. Otrzymany produkt o długości 449 par zasad był wrekombinowany do pT7Blue skutkiem czego powstał plazmid pNMAIDA3. Dla sklonowania całego genu zaprojektowano kolejne oligonukleotydy, które użyto w reakcji odwrotnego PCR. Oligonukleotydami tymi były odpowiednio, A3C (SEQ ID NO 30) i A3D (SEQ ID NO 31) i odpowiadające komplementarnej nici A3A (SEQ ID NO 28) i A3B (SEQ ID NO 31). Matrycą dla tych reakcji był chromosomalny DNA szczepu NC50, który strawiono restrykcyjnie EagI a następnie poddano samoligowaniu. Uzyskane produkty reakcji PCR o wielkości 3 tys. par zasad wrekombinowano do wektora pCRII (Invitrogen) uzyskując plazmid piEagA3. Strawiono go EagI i EcoRI w wyniku czego uzyskano fragmenty o wielkości 1,4 tys. par zasad i 1,6 tyś. par zasad, zawierające sklonowany DNA, które wrekombinowano do plazmidu pBluescriptSKII, M13minus (Stratagen) uzyskując plazmidy piEagA3.8 i piEagA3.9. Plazmid pHiaNm utworzono amplifikację hiaNM przez PCR, dodanie sekwencji 5' i 3' przy pomocy starterów oligonukleotydowych HiaNm:P (5'-TT-AGATTCCACGTCCCAGATT-3', SEQ ID NO 22) i HiaNM:M (5'-CTTCCCTTCAAACCTTCC-3', SEQ ID NO 23), odpowiadające nukleotydom w pozycji (ntp) odpowiednio 113 do 133 i 2102 do 2185 z SEQ ID NO 1 i klonowanie produktu w pT7Blue. Plazmid pHiaNmΔKan został stworzony przez wbudowanie kasetki warunkującej oporność na kanamycynę do unikalnego miejsca rozpoznawanego przez Bglll w pHiaNm odpowiadające ntp 680 w SEQ ID NO 1. Kasetka warunkująca oporność na kanamycynę została wycięta z pUC4Kan (Pharmacia) za pomocą BamHI. Plazmid pHiaNmΔKan wprowadzono przez transformację do szczepu MC58 N. meningitidis inkubując przez 3 godziny w 37°C w atmosferze z 5% CO2 bakterie z plazmidowym DNA na agarze Brain Heart Infusion (Acumedia Manufacturer's Inc.) uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie krwią końską („płytki BHI). Pojedynczą kolonię przeniesiono na świeżą pożywkę selekcyjną hodowano i użyto w dalszych badaniach. Zmutowany szczep oznaczono MC58ΔHiaNm. Rozbicie genu hiaNm w tym

PL 205 984 B1 szczepie potwierdzono metodą Southern blot używając jako sondy fragment odpowiadający ntp 276-2054 z SEQ ID NO 1.

P r z y k ł a d 2

Analiza sekwencji nukleotydowych.

Analizę sekwencji nukleotydowej przeprowadzono stosując zestaw do sekwencjonowania PRISM Dye terminator sequencing Kit z polimerazą DNA FS AmpliTaq lub zestaw BigDye terminator sequencing Kit i postępując zgodnie z zaleceniami producenta (Perkin Elmer) stosując automatyczny sekwenser model 373a (Applied Biosystems). W przypadku każdego szczepu hiaNm amplifikowano w trzech niezależnych reakcjach PCR stosując startery HiaNm5'A2: 5'-CCAAACCCCGATTTAACC-3' (SEQ ID NO 26) i HiaNm3'A: 5'-AATCGCCACCCTTCCCTTC-3' (SEQ ID NO 27) co przedstawiono na Fig. 1 i co odpowiada ntp 230-247 i 2114-2097 w SEQ ID NO 1, a uzyskane produkty oczyszczano i łączono. Był y one uż yte jako matryce dla bezpoś redniego sekwencjonowania obu nici. Uzyskane dane analizowano programami GCG (Deveraux i wsp. (1984) Nucleic Acid Research 12, 387-395) i AssemblyLIGN (Oxford Molecular). Dla uzyskania peł nej sekwencji koniecznym był o wyprodukowanie szeregu oligonukleotydów. Sekwencje hiaNm szczepów przedstawiono jako SEQ ID NOS 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20, a wydedukowane z nich sekwencje aminokwasowe przedstawiono jako SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21.

Porównanie hiaNm z tych szczepów wykazało, że są one w 90 do 99% identyczne z hiaNm z MC58. Dodatkowo hiaNm z MC58 jest w 62% i 68% homologiczny z hia i hsf z Haemophilus influenzae. Jakkolwiek w badanych szczepach hiaNm ma długość 1770 do 1800 par zasad. Jest to znacząca różnica bowiem hia i hsf mają długość odpowiednio 3294 i 7059 par zasad. Wydedukowany polipeptyd HiaNm kodowany przez hiaNm wykazuje również homologię z szeregiem innych białek bakteryjnych w tym AIDA-I, adhezyny wymaganej w dyfuzyjnej adherencji wywołującego biegunkę szczepu Escherichia coli 2787 (0126: H27), HMW1 kolejnej adhezyny Haemophilus, UspA1 wysokocząsteczkowego białka z Moraxella catarrthalis, i SepA biorącym udział w zakażaniu tkanki przez Shigella flexneri (Benz, I. I Schmidt, M.A., 1992, Molecular Microbiology 6:1539-1546, Barenkamp, S.J. i Leininger, E. 1992,

Infection and Immunity 60: 1302-1313, Aebi,C. I wsp. 1997, Infection and Immunity 65: 4367-4377, Benjelloun-Touimi, Z i wsp. 1995, Molecular Microbiology 17:123-135). Ich (i innych białek) homologia dotyczy pierwszych pięćdziesięciu aminokwasów HiaNm. Analiza tych sekwencji ujawniła we wszystkich badanych HiaNm obecność przewidywanych sekwencji sygnałowych z miejscem cięcia przy 50 aminokwasie. Taka długa sekwencja sygnałowa jest powszechna w białkach lokalizowanych w zewnętrznej błonie bakterii Gram ujemnych (Henderson, I i wsp., 1998, Trends in Microbiology 6:370-8). Wspomniane wyżej białka, do których homologiczne jest pierwsze pięćdziesiąt aminokwasów HiaNm jest przedstawicielami rodziny zewnętrznobłonowych białek „autotransporterowych (Henderson, I., cytowany). Sugeruje to silnie, że HiaNm lokalizuje się w zewnętrznej błonie N. meningitidis.

P r z y k ł a d 3

Analiza Southern blot.

Analiza Southern blot prowadzono stosując typowe techniki (Sambrook i wsp. cytowana, Ausubel i wsp. cytowana). Krótko, genomowy DNA uzyskany z 70 szczepów N. meningitidis, należących do szeregu grup serologicznych, trawiono enzymami restrykcyjnymi i rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym przed kapilarnym przeniesieniem na filtr nylonowy. Tak uzyskane błony hybrydyzowano z wyznakowaną sondą. Zastosowana sonda odpowiada ntp 276-2054 z SEQ ID NO 1, obejmując pełną ramkę odczytu hiaNm ze szczepu MC58. Była ona wyznakowana DIG (dioksygeniną) zgodnie z instrukcją załączoną przez producenta (Boehringer Mannheim). Płukano w ostrych warunkach (dwa płukania po 5 minut w 22°C w 2X SSC/),1% SDS następnie dwa płukania przez 30 minut w 68°C, 0,2x SSC/0.1% SDS). Hybrydyzację wykrywano kolorymetrycznie stosując zgodnie z zaleceniami producenta błękit nitro-tetrazolowy/fosforan bromo-chloro-indolilu (NBT/BCIP). Sygnał wykryto we wszystkich badanych szczepach, (przykładowo Fig. 2). Poza prototypowym szczepem MC58, badano również niżej podane szczepy:

Nazwa szczepu	Źródło	Serotyp	Nazwa szczepu	Źródło	Serotyp
1	2	3	4	5	6
PMC 3 (J1079)	2A	A	NGF26	1	B
PMC17 (K874)	2	A	NGG40	1	B

PL 205 984 B1 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6
PMC 20 ((H79)	2	A	H15	1	B
PMC 23 (K750)	2	A	SWZ107	1	B
PMC 12 (K852)	2	B	528	1	B
PMC 13 (K859)	2	B	2970	1	B
PMC 16 (K873)	2	B	1000	1	B
PMC 24 (K782)	2	B	MPJB28	3^C	B
PMC 25 (K791)	2	B	MPJB56	3	B
PMC 27 (K816)	2	B	MPJB88	3	B
PMC 28 (K837)	2	B	MPJB157	3	B
BZ10	1^B	B	MPJB328	3	B
BZ47	1	B	MPJB627	3	B
BZ83	1	B	MPJB820	3	B
BZ133	1	B	MPJB945	3	B
BZ 147	1	B	PMC 8 (K157)	2	C
BZ163	1	B	PMC 9 (K497)	2	C
BZ169	1	B	PMC 11 (K848)	2	C
BZ198	1	B	PMC 14(K860)	2	C
BZ232	1	B	PMC 18 (K879)	2	C
NG3/88	1	B	PMC 21 (K656)	2	C
NG4/88	1	B	PMC29 (K841)	2	C
NG6/88	1	B	MPJC05	3	C
EG327	1	B	MPJC14	3	C
EG329	1	B	MPJC154	3	C
DK353	1	B	MPJC302	3	C
179/82	1	B	MPJC379	3	C
66/84	1	B	PMC19	2	W
DK24	1	B	MPJW025	3	W
NGH36	1	B	PMC 1 (J603)	2	X
H38	1	B	PMC 6 (K131)	2	X
H41	1	B	PMC 10 (K526)	2	Y
NGE28	1	B	PMC 22 (K685)	2	Y

PL 205 984 B1 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6
NGE30	1	B	PMC 26 (K810)	2	Y
NGP20	1	B	PMC 2 (J1049)	2	Z

^A World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Meningococci, Oslo, Norwegia.

^B Public Health Organization Collaborating Centre for Reference Laboratory, Manchester, Wielka Brytania ^C Brisbane Hospitals, obecnie w kolekcji szczepów M.P. Jennings, Department of Microbiology, University of Queensland, Brisbane, Australia.

P r z y k ł a d 4

Ekspresja i częściowe oczyszczenie MBP-HiaNm

Skonstruowano wektor plazmidowy, który umożliwia ekspresję białka będącego fuzją białka wiążącego maltozę i HiaNm (MBP-HiaNm). Plazmid pHiaMBP został wytworzony przez amplifikację hiaNm z MC58 przy pomocy starterów Hianm-NBPA 5'-GGTCGCGGATCCATGAACAAAATATACCGCAT-3' (SEQ ID NO 24) i HiaNm-MBPB 5'-TCACCCAAGCTTAAGCCCTTACCACTGATAAC-3' (SEQ ID NO 25). Startery te zawierają kodony start i stop dla hiaNm ze szczepu MC58 N. meningitidis i wprowadzone miejsce restrykcyjne umożliwiające łatwe klonowanie. Mapy restrykcyjne plazmidu i pozycje oligonukleotydów są pokazane na Fig. 1. Uzyskany produkt PCR ligowano do strawionego restrykazami BamHI/Hindlll plazmidu pMALC2 (New England BioLabs) a uzyskany plazmid pHiaMBP (patrz Fig. 1) ponownie wprowadzono do szczepu DH5a E.coli. Ten szczep E.coli zawierający pHiaMBP indukowano tak aby zachodziła ekspresja fuzyjnego białka HiaNm-MBP w warunkach zalecanych przez producenta (New England BioLabs). Ekstrakty komórkowe otrzymane z kultur zawierających pHiaMBP rozdzielano w 10% SDS-PAGE, a białko fuzyjne częściowo oczyszczano przez wymywanie przy pomocy Mini-Gel Electro-eluter (BioRad) postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Frakcje zawierające białko fuzyjne HiaNm-MBP wykrywano przez Western blot używając surowicę króliczą przeciw MBP (New England Biolabs). Czystość białka fuzyjnego HiaNm-MBP określano przez SDS-PAGE a następnie barwienie Coomassie, ilość odzyskiwanego białka szacowano przez oznaczenie BCA (Sigma) lub pomiar absorbancji dla fali o długości 280 nm.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie poliklonalnej surowicy

Uzyskane w Przykładzie 4 częściowo oczyszczone białko fuzyjne HiaNm-MBP użyto do wytworzenia w królikach surowicy poliklonalnej. Próbki wyeluowanego białka fuzyjnego HiaNm-MBP dializowano względem jałowego buforowanego fosforanami roztworu soli fizjologicznej pH 7,4 (PBS) (Sigma). Następnie mieszano je z adiuwantem (MPL+TDM+CWS, Sigma) w stężeniu 50-100 μg/ml i zaszczepiano z dwu tygodniowymi przerwami królikom rasy Biały Nowozelandzki. Surowicę ekstrahowano przez trwającą 1 godzinę koagulację w temperaturze pokojowej, po której prowadzono inkubację w 4°C przez noc, po czym wirowano w 4°C przy 4 000 x obr./min. Nadsącz usuwano i ponownie wirowano. Surowice przechowywano w porcjach w - 80°C. Uzyskaną surowicę używano w testach bakteriobójczych i Western blot (patrz poniżej).

Dla sprawdzenia specyficzności uzyskanych surowic przeprowadzono analizy typu Western blot. Przed elektroforetycznym przeniesieniem na filtr nitrocelulozowy przy pomocy aparatu Semi-Dry Blotter (BioRad) białka ze szczepu MC58 N. meningitidis i szczepu MC58ΔHianm były niezależnie rozdzielane elektroforetycznie w SDS-PAGE. Przed kolorymetryczną detekcją przy pomocy NBT/BCIP filtr był inkubowany kolejno z surowicą i skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą IgG przeciw królikowi (Sigma). Doświadczenie to wykazało, że przeciwciała były wychwytywane przez białko fuzyjne HiaNm-MBP czego obrazem była obecność specyficznego wykrywanego w MC58 ale nie w MC58ΔHiaNm prążka (patrz Fig. 4). Wydedukowana masa cząsteczkowa polipeptydu HiaNm wynosi 62,3 kDa. Prążek wykryty surowicą migrował odpowiednio przy pozornej masie cząsteczkowej przekraczającej 150 kDa. Co najmniej trzy homologiczne białka „autotransporterowe ujawniają również taką nienormalną migrację, o czym donosiła literatura: wysoko cząsteczkowe białka z błony zewnętrznej UspA1 i UspA2 z Moraxella catarrhalis posiadają przewidywaną masę cząsteczkową odpowiednio 66,5 kDa i 88,3 kDa lecz migrują jak białka o masie odpowiednio 85 kDa i 120 kDa i jako UspA kompleks 350 kDa i 720 kDa (Aebi, C. i wsp., 1997, Infection and Immunity, 65: 4367-4377, Klingam, K.L. and Murphy, T.F., 1994, Infection and Immunity, 62: 1150-1155). Podobnie, Hia z Haemophilus influenzae posiada przewidywaną masę cząsteczkową 116 kDa, lecz jeśli ulega ekspresji z faga Hia migruje jak

PL 205 984 B1 cząsteczka o masie cząsteczkowej większej niż 200 kDa (Barenkamp, S. i St. Gerne III, J. 1996 Molecular Microbiology 19; 1215-1233).

Aby potwierdzić, że HiaNm jest związane z zewnętrzną błoną N. meningitidis sporządzono kompleksy zewnętrznej błony (omc), postępując zasadniczo tak, jak wcześniej opisano (van der Ley, P. i wsp., 1991, Infection and Immunity, 59: 2963-71). Krótko, bakterię hodowano przez noc na płytkach z agarem BHI (Acumedia Manufacturer's Inc) uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie krwią końską, po czym przeprowadzano ją w zawiesinę w 10 mM Tris pH 8,0 i przed rozbiciem błon ultradźwiękami zabijano termicznie. Nierozpuszczalną frakcję komórkową usuwano przez wirowanie przy 10000 x g (rcf, względna siła odśrodkowa), a następnie nadsącz wirowano ponownie przy 50000 x g. Osad przeprowadzano w zawiesinę w 1% sarkozylu/10 mM Tris pH 8,4 i wirowano przy 10000 x g. Nadsącz wirowano przy 75 000x g i przed spektrofotometrycznym oznaczeniem ilościowym przy długości fali 280 nm osad przeprowadzano w zawiesinę w Tris pH 8,4. Próbki nie rozpuszczalnej w sarkozylu frakcji, które zawierają białka zewnętrznej błony, (50 μ!, A280 = 3,75) poddano, jak opisano powyżej, SDS-PAGE i Western blot. Przedstawione na Fig. 4 wyniki pokazują, że reaktywność z surowicą anty HiaNmMBP obserwowano w szczepie MC58 typu dzikiego, a nie w MC58ΔHiaNm, w którym unieczynniony był hiaNm. Wzrost reaktywności względem surowicy anty-HiaMBP obserwowano, w przypadku hodowli MC58, pomiędzy próbkami uzyskanymi z całej komórki i zawierającymi tą samą ilość białka próbkami omc co jest zgodne z poglądem, że HiaNm jest związany z błonami.

P r z y k ł a d 6

Oznaczenie aktywności bakteriobójczej

Stosując dziki szczep typu MC58 i MC58ΔHiaNm przeprowadzono test aktywności bakteriobójczej celem określenia czy surowica odpornościowa anty-HiaMBP zawiera przeciwciała bakteriobójcze specyficzne dla HiaNm. Oznaczenie to przeprowadzono stosując zmodyfikowana metodę opisaną przez Hoogerhout i wsp. (1995, Infection and Immunity, 63: 3473-3478). Krótko, MC58 i MC58ΔHiaNm były hodowane przez noc na płytkach BHI w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Bakterie z całonocnych hodowli przeniesiono na świeże podłoża i hodowano w tych samych warunkach przez kolejne 4 do 6 godzin po czym zawieszano w 1 ml PBS. Liczbę bakterii szacowano przez lizę próbek w 0,2N NaOH/1% SDS i pomiar absorbancji przy długości fali 260 nm gdzie A260=1=10⁹ cfu/ml. Zawiesinę bakterii doprowadzano do stężenia około 10⁵ cfu/ml w PBS. Testowana surowica królicza była inaktywowana termicznie przez 45 min. w 56°C. Jako źródło komplementu użyto surowice z czterotygodniowych królików rasy Biały Nowozelandzki, które łączono (Central Animal Breeding House, University of Queensland). Oznaczenia prowadzono w jałowych polistyrenowych, płaskodennych, 96 studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania. Całkowita ilość umieszczona w każdej studzience wynosiła 24 gl: 12 μl dwukrotnie seryjnie rozpuszczonej w PBS surowicy i 6 μl zawiesiny bakterii (zawierającej pomiędzy 300-900 bakterii). Surowica i bakterie były inkubowane w temperaturze pokojowej przez 10 min. przed podaniem 6 gl 80% dopełniacza w PBS (końcowe stężenie 20% obj/obj). Kontrolami były a) PBS, bakterie i dopełniacz b) PBS, bakterie i surowica. Po dodaniu wszystkich składników i wymieszaniu, 7 gl próbki z każdej kontrolnej studzienki rozprowadzano na płytce BHI. Płytki do mikromiareczkowania były następnie inkubowane w 37°C w 5% atmosferze CO2 przez 60 min. Po inkubacji 7 gl próbki z każdej studzienki rozprowadzono na płytkach BHI. Wszystkie płytki BHI inkubowano następnie przez 14 do 18 godzin w 37°C w atmosferze z 5% CO2 i liczono kolonie bakterii. Surowica bakteriobójcza jest określana jako najwyższe rozcieńczenie seryjne, przy którym co najmniej 90% bakterii jest zabite. Użyta surowica pochodziła z tych samych królików i tej samej krwi testowej użytych w doświadczeniach typu Western blot, które omówiono powyżej w Przykładzie 5. Doświadczenia te spójnie pokazują, że ograniczoną ilość (około trzykrotnie, Tabela 4) zabitych bakterii MC58ΔHiaNm w porównaniu do szczepu dzikiego MC58, co wskazuje, że surowica odpornościowa anty-HiaMBP zawiera przeciwciała bakteriobójcze specyficzne dla HiaNm.

Szczep	Miano*
MC58	12(+/- 4,61)
MC58AHiaNm	3,5 (+/- 1)

*Z czterech niezależnych doświadczeń.

PL 205 984 B1

Dyskusja

U niektórych bakterii patogennych repetytywny DNA jest połączony z determinantami wirulentności. Badania Southern blot z użyciem takich repetytywnych motywów DNA ujawniły obecność przynajmniej trzech zawierających te motywy loci w szczepie MC58 N. meningitidis (Peak, I. I wsp., 1996, FEMS Microbiology Letters, 137:109114). Geny te sklonowano, a analiza sekwencji dwóch z trzech połączonych z sekwencjami repetytywnymi loci (nmrep2 i nmrep3) ujawniła otwarte ramki odczytu o długości około 670 aminokwasów (Jennings, M, i wsp., 1995, Microbial Pathogenesis, w druku). Ujawniają one homologię względem siebie i względem karboksylowego końca adhezyny AIDA-I z E.coli. Długość AIDA-I wynosi 1286 aminokwasów. Obszar karboksylowego końca tworzy w adhezynie przypuszczalną domenę odpowiedzialną za transport do zewnętrznej błony. Domena amino-końcowa przekracza błonę przez przypuszczalną domenę transportującą i jest określana jako domena pasażerska.

Ponieważ Nmeb2 i Nmeb3 posiadają sekwencje homologiczne do transportującej domeny AIDA-I to mogą one tworzyć pory błonowe. Nmrep2 i Nmrep3 są w przybliżeniu w połowie tak duże jak AIDA-I i są homologiczne do domeny śródbłonowej domeny AIDA-I. Przypuszczamy, że u N. meningitidis występuje locus kodujący polipeptyd o sekwencji homologicznej do amino-końcowej domeny AIDA-I. Szukaliśmy takich homologii w danych uzyskanych dzięki projektowi sekwencjonowania szczepu N. meningitidis MC58c3 (TIGR, cytowany) i znaleźliśmy jeden obszar wykazujący homologię do genu oznaczonego AIDA-I z Haemophilus influenzae szczepu Rd(HI1732), który wykazuje homologię do AIDA-I z E.coli (Fleischmann i wsp., 1995 Science 269: 496-512). Z uwagi na zaobserwowaną homologię zgłaszający postanowił prowadzić dalsze badania.

Początkowo gen został wyizolowany jako produkt amplifikacji DNA przez PCR o długości 471 par zasad nazwany genmaa84r z N. meningitidis szczepu MC58 3, którego sekwencja została potwierdzona. Dalsze doświadczenia z PCR pozwoliły zamplifikować dłuższe fragmenty. Zostały one sklonowane i jak pokazano na Fig. 1 podjęto analizę sekwencji. Gen wykazuje homologię do aminokońcowego obszaru AIDA-I z E.coli i oznaczyliśmy go jako aida3 gdyż jest trzecim przedstawicielem homologów AIDA-I z N. meningitidis (wraz z nmrep2 i nmrep3). Później zidentyfikowano dwa kolejne geny hia i hsf z H. influenzae co opublikowano (Barenkamp, S. i St. Geme III, J. 1996 Molecular Microbiology 19: 1215-1233, St. Geme III, J. I wsp., 1996, Journal of Bacteriology 178: 6281-6287), do których aida3 jest bardziej podobny. Dlatego zmieniliśmy nazwę genu na hiaNm. (HI1732 z H. influenzae gen najpierw zidentyfikowany jako homolog AIDA-I był również przemianowany na hia w oparciu o doniesienia Barenkamp i St. Geme III).

W opisie opisano korzystne postaci wynalazku bez jego ograniczania do jakiejkolwiek konkretnej postaci lub szczególnego zbioru cech. Co za tym idzie powinno być docenione przez znawców dziedziny, że w świetle dokonanego ujawnienia, w szczególnych, przykładowo podanych wariantach wynalazku mogą być dokonane różnorodne modyfikacje i zmiany bez wykraczania poza zakres obecnego wynalazku. Intencją jest, aby wszystkie takie modyfikacje i zmiany były objęte zakresem załączonych zastrzeżeń.

PL 205 984 B1

LISTA < 110> Peak, łan R. (tylko w USA)

Jennings, Michael P. (tylko w USA) Maxam, Edward R. (tylko w USA) University of Queensland (z wyjątkiem USA) Isis Innovation Limited (z wyjątkiem USA) <120> Nowy antygen powierzchniowy <130> Antygen HiaNm z Neisseria meningitidis <140> PCT/AU98/01031 · <141> 1998-12-14 <150> GB 9726398.2 <151> 1997-12-12 <160>31 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211>2308 <212>DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221>CDS <222> (276)..(2054) <400> 1

gaaaaaccac	aggaatrcat	cagcaaaaac	agaaacccca	ccgccgtcac	tcccgeaaaa	60
gcgggaatcc	agacccgtcg	gcacggaaaa	ccraccgaat	aaaacagtcc	ccttagattc	120
cacgtcccag	attcccgccc	tcgeggggaa	tgacgagatt	traagttggg	ggaatteatc	180
agaaaacccc	caacccccaa	a&accgggcg	gatgccgcac	catccgcccc	caaaccccga	240
cttaaccatt	caaacaaacc	aaaagaaa&a	acaaa atg aac aaa ata Met Asn Lys 11«	rac cgc Tyr Arg	293

' 5

atc atc Ile Ile

tgg aat Trp Asn 10

agt gcc

ctc Leu

aat Asn

gcc cgg gtc gcc gta tcc gag

ctc Leu

341

Ser

Ala

Ala 15

Trp

Val

val

Val

Ser 20

Glu

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

acc

gtg

aag

acc

gcc

gta'

3Θ9

Thr

Aeg

Asn

ais

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

25

30

35

tLg

gcg

aca

ctg

ttg

tet

gca

acg

gtt

eag

gca.

agt

get

aac

aat

gaa

437

LftU

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

Ala

Ser

Ala

Asn

Aan

Glu

40

45

50

aga

cca

aga

aag

aaa

gat

tta

tat

tta

gac

ccc

gta

caa

cgc

acr

gtt

485

Arg

Pro

Arg

Lys

Asp

Leu

Tyr

Leu

Asp

Pro

Val

Gin

Arg

Thr

Val

35

60

«5

70

gcc

gtg

erg

ata

gtc

aat

tcc

gac

aaa

gaa

ggc

acg

gga

gaa

aaa

gaa

533

Ala

Val

Leu

Ile

Val

Asn

Ser

Asp

Lys

Siu

Gly

Thr

Gly

Glu

Lya

Glu

75

80

85

aaa

gta

gaa

aat

cca

gat

tgg

gca

gta

tat

tte

aac

gag

aaa

gga

581

Lys

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asn

G1U

Lya

Gly

90

»5

100

PL 205 984 B1

gta Val

eta Leu

aca Thr 105

gee Ala

aga Arg

gaa Glu

atc Ile

acc Thr 110

etc Leu

aaa Lys

gee Ala

ggc Gly

gac Asp 115

aac Asn

ctg Leu

aaa Lys

atc

aaa

caa

aac

ggc

aca

aac

ttc

acc

tac

teg

ctg

aaa

gac

ctc

Ile

Lys

Gln

Asn

Gly

Thr

Asn

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

120

125

130

aca

gat

ctg

acc

agt

gtt

gga

act

gaa

aaa

tta

teg

ttt

age

gca

aac

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

135

140

145

150

ggc

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca-

age

gac

acc

aaa

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

155

160

165

aaa

gaa

acg

get

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

gtt

cat

ctg

aac

ggt

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

170

175

180

att

ggt

teg

act

ttg

acc

gat

acg

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

185

190

195

PL 205 984 B1

aac Asn

gta Val 200

acc Thr

aac Asn

gac Asp

aac Asn

gtt Val 205

acc Thr

gat Asp

gac Asp

gag Glu

aaa Lys 210

aaa Lys

cgt Arg

gcg Ala

gca Ala

917

agc

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

gct

gg=

tgg

aac

att

aaa

ggc

gtt

aaa

965

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

215

220

225

230

ccc

ggt

aca

gct

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

gtc

cgc

act

tac

gac

1013

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

235

240

245

aca

gtc

gag

ttc

ttg

agc

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

1061

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

250

255

260

gaa

agc

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gtg

aag

1109

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Val

Lys

265

270

275

act

tct

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

gac

1157

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

280

285

290

aaa

ggc

gag

aat

ggt

tct

aca

gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

1205

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

295

300

305

310

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

aag

gct

ggt

tgg

aga

atg

aaa

1253

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

PL 205 984 B1

315

320

325

aca

acc

gct

aat

ggt

caa

aca

ggt caa

gct

gac

aag

ttt

gaa

acc

1301

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

330

335

340

gtt

aca

tca

ggc

aca

aat

gta

acc

ttt gct

agt

ggt

aaa

ggt

aca

act

1349

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe Ala

Ser

Gly

Lys

Gly

Thr

345

350

355

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc aac

atc

act

gtt

atg

tat

gat

1397

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly Asn

Ile

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

360

365

370

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

eta

aac

gtc aat

cag

ctg

caa

aac

age

ggt

1445

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

375

380

385

390

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca ggt

tet

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

1493

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

395

400

405

agc

ggc

aat

gtt

tcg

ccg

age

aag

gga aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

1541

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

410

415

420

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att acc

ege

aac

ggt

aaa

aat

atc

1589

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

425 430 435

PL 205 984 B1

gac Asp

atc Ile 440

gcc Ala

act Thr

tcg Ser

atg Met

acc Thr 445

ccg Pro

cag Gin

ttt Phe

tcc Ser

agc Ser 450

gtt Val

tcg Ser

ctc Leu

ggc Gly

1637

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

ttg

agc

gtg

gat

ggg

gac

gca

ttg

aat

1685

Ala

Gly

Ala

Asp

Al a

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

455

460

465

470

gtc

ggc

agc

aag

gac

aac

aaa

ccc

gtc

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

1733

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

475

480

485

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggc

1781

Prc

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

490

495

500

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cgc

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

1829

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

505

510

515

cgt

gcg

ggc

atc

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

gca

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

1877

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

520

525

530

tat

ttg

ccc

ggc

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

act

tat

cgc

1925

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

535

540

545

550

ggc

gaa

gcc

ggt

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcc

agt

att

tcc

gac

ggc

gga

1973

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

PL 205 984 B1

555 560 565

aat

tgg

att

atc

aaa

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

teg ege ggc

cat

ttc

2021

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser Arg Gly

His

Phe

510

575

580

ggt

gct

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

gggctttatc

gcctgtctgc

2074

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

585

590

tgttgggaca ggcggaaggt ttgaagggaa gggtggcgat ttgccgcctg agacctttgc 2134 aaaatccccc caaaatcccc taaattccca ccaagacatt taggggattt ctcatgagca 2194 ccttcttccg gcaaaccgcg caagccatga ttgccaaaca catcaaccgt ttcccgctat 2254 tgaagttgga ccaagtgatt gattggcagc cgatcgagca gtacctgaac cgtc 2308 <210> 2 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 2

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp

10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala

25 30

PL 205 984 B1

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln

40 45

Ala Ser Ala Asn Asn Glu Arg Pro Arg Lys Lys Asp Leu Tyr Leu Asp

55 60

Pro Val Gin Arg Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu

70 75 80

Gly Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val

90 95

Tyr Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys

100 105 110

Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr

115 120 125

Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys

130 135 140

Leu Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr

145 150 155 160

Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr

165 170 175

Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu

180 185 190

PL 205 984 B1

Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn

355 360 365

Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn

370 375 380

Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly

385 390 395 400

Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys

405 410 415

Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr

420 425 430

Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe

435 440 445

Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val

450 455 460

Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val

465 470 475 480

Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn

485 490 495

Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp

500 505 510

PL 205 984 B1

Asn Val Asp Gly

515

Ala Gly Leu Val

530

Gly Gly Gly Thr

545

Ser Ile Ser Asp

Asn Ser Arg Gly

580

Asn Ala Arg Ala

520

Gln Ala Tyr Leu

535

Tyr Arg Gly Glu

550

Gly Gly Asn Trp

565

His Phe Gly Ala

Gly Ile Ala Gln

Pro Gly Lys Ser

540

Ala Gly Tyr Ala

555

Ile Ile Lys Gly

570

Ser Ala Ser Val

585

Ala Ile Ala Thr

525

Met Met Ala Ile

Ile Gly Tyr Ser

560

Thr Ala Ser Gly

575

Gly Tyr Gln Trp

590 <210> 3 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 3 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgtcgtatcc 60 gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120 acactgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aaagaccaag aaagaaagat 180 ttatatttag accccgtaca acgcactgtt gccgtgttga tagtcaattc cgataaagaa 240

PL 205 984 B1 ggcacgggag aaaaagaaaa agtagaagaa aattcagatt gggcagtata tttcaacgag 300 aaaggagtac taacagccag agaaatcacc ctcaaagccg gcgacaacct gaaaatcaaa 360 caaaacggca caaacttcac ctactcgctg aaaaaagacc tcacagatct gaccagtgtt 420 ggaactgaaa aattatcgtt tagcgcaaac ggcaataaag tcaacatcac aagcgacacc 480 aaaggcttga attttgcgaa agaaacggct gggacgaacg gcgacaccac ggttcatctg 540 aacggtattg gttcgacttt gaccgatacg ctgctgaata ccggagcgac cacaaacgta 600 accaacgaca acgttaccga tgacgagaaa aaacgtgcgg caagcgttaa agacgtatta 660 aacgctggct ggaacattaa aggcgttaaa cccggtacaa cagcttccga taacgttgat 720 ttcgtccgca cttacgacac agtcgagttc ttgagcgcag atacgaaaac aacgactgtt 780 aatgtggaaa gcaaagacaa cggcaagaaa accgaagtta aaatcggtgt gaagacttct 840 gttattaaag aaaaagacgg taagttggtt actggtaaag acaaaggcga gaatggttct 900 tctacagacg aaggcgaagg cttagtgact gcaaaagaag tgattgatgc agtaaacaag 960 gctggttgga gaatgaaaac aacaaccgct aatggtcaaa caggtcaagc tgacaagttt 1020 gaaaccgtta catcaggcac aaatgtaacc tttgctagtg gtaaaggtac aactgcgact 1080 gtaagtaaag atgatcaagg caacatcact gttatgtatg atgtaaatgt cggcgatgcc 1140

PL 205 984 B1 ctaaacgtca atcagctgca aaacagcggt tggaatttgg attccaaagc ggttgcaggt 1200 tcttcgggca aagtcatcag cggcaatgtt tcgccgagca agggaaagat ggatgaaacc 1260 gtcaacatta atgccggcaa caacatcgag attacccgca acggtaaaaa tatcgacatc 1320 gccacttcga tgaccccgca gttttccagc gtttcgctcg gcgcgggggc ggatgcgccc 1380 actttgagcg tggatgggga cgcattgaat gtcggcagca agaaggacaa caaacccgtc 1440 cgcattacca atgtcgcccc gggcgttaaa gagggggatg ttacaaacgt cgcacaactt 1500 aaaggcgtgg cgcaaaactt gaacaaccgc atcgacaatg tggacggcaa cgcgcgtgcg 1560 ggcatcgccc aagcgattgc aaccgcaggt ctggttcagg cgtatttgcc cggcaagagt 1620 atgatggcga tcggcggcgg cacttatcgc ggcgaagccg gttacgccat cggctactcc 1680 agtatttccg acggcggaaa ttggattatc aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc 1740 catttcggtg cttccgcatc tgtcggttat cagtggtaa 1779 <210> 4 <2il> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

PL 205 984 B1 <221> CDS <222> (1) . . (1797) <400> 4

atg Met

aac Asn

aaa Lys

ata Ile

tcc Ser 5

ege Arg

atc Ile

att Ile

tgg Trp

aat Asn 10

agt Ser

gee Ala

etc Leu

aat Asn

gee Ala 15

tgg Trp

gtc

gta

tcc

gag

etc

aca

ege

aac

cac

acc

aaa

ege

gee

tcc

gca

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

gcg

acc

gee

gta

ttg

gcg

aca

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gln

35

40

45

gcg

aat

get

acc

gat

gac

gat

tta

tat

tta

gaa

ccc

gta

caa

ege

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gln

Arg

50

55

60

act

get

gtc

gtg

ttg

age

ttc

cgt

tcc

gat

aaa

gaa

ggc

acg

gga

gaa

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

aaa

gaa

ggt

aca

gaa

gat

tea

aat

tgg

gca

gta

tat

ttc

gac

gag

aaa

Lys

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

85

90

95

aga

gta

eta

aaa

gee

gga

gca

atc

acc

etc

aaa

gee

ggc

gac

aac

ctg

Arg

Val

Leu

Lys

Ala

Gly

Ala

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

PL 205 984 B1

100

105

110

aaa

atc

aaa

caa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gac

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Asp

115

120

125

agt

agc

ttc

acc

tac

tcc

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

agt

Ser

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

130

135

140

gtt

gaa

act

gaa

aaa

tta

tcg

ttt

ggc

gca

aac

ggt

aat

aaa

gtc

aac

Val

Glu

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

145

150

155

160

atc

aca

agc

gac

acc

aaa

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

gct

ggg

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

165

170

175

acg

aac

ggc

gac

ccc

acg

gtt

cat

ctg

aac

ggt

atc

ggt

tcg

act

ttg

Thr

Asn

Gly

Asp

Pro

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

180

185

190

acc

gat

acg

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

195

200

205

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

aaa

cgt

gcg

gca

agc

gtt

aaa

gac

gta

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

Lys

Arg

Ala

Ser

val

Lys

Asp

Val

210 215 220

PL 205 984 B1

tta Leu 225

aac Asn

gca Ala

ggc Gly

tgg Trp

aac Asn 230

att Ile

aaa Lys

ggc Gly

gtt Val

aaa Lys 235

ccc Pro

ggt Gly

aca Thr

gct Ala 240

720

tcc

gat

aac

gtc

gat

ttc

gtc

ege

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

768

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

245

250

255

agc

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

agc

aaa

gac

aac

816

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

260

265

270

ggc

aag

aga

acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

864

Gly

Lys

Arg

Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

275

280

285

3άδ

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

ggc

aaa

ggc

gag

aat

ggt

912

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

290

295

300

tet

aca

gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

960

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

305

310

315

320

gat

gca

gta

aac

aag

gct

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

gct

aat

1008

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

325

330

335

ggt

caa

aca

ggt

caa

gct

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tca

ggc

aca

1056

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

PL 205 984 B1

340

345

350

aaa

gta

acc

ttt

gct

agt

ggt

aat

ggt

aca

act

gcg act

gta

agt

aaa

1104

Lys

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

Gly

Thr

Ala Thr

Val

Ser

Lys

355

360

365

gat

caa

ggc

aac

atc

act

gtt

aag

tat

gat

gta aat

gtc

ggc

gat

1152

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val Asn

Val

Gly

Asp

370

375

380

gcc

eta

aac

gtc

aat

cag

ctg

caa

aac

age

ggt

tgg aat

ttg

gat

tcc

1200

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp Asn

Leu

Asp

Ser

365

390

395

400

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tet

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

age ggc

aat

gtt

tcg

1248

Lys

Al a

Val

Ala

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser Gly

Asn

Val

Ser

405

410

415

ccg

age

aag

gga

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

att aat

gcc

ggc

aac

1296

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile Asn

Ala

Gly

Asn

420

425

430

aac

atc

gag

att

acc

ege

aac

ggc

aaa

aat

atc

gac atc

gcc

act

tcg

1344

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp Ile

Ala

Thr

Ser

435

440

445

atg

acc

ccg

caa

ttt

tcc

age

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg ggg

gcg

gat

gcg

1392

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala Gly

Ala

Asp

Ala

450 455 460

PL 205 984 B1

ccc Pro 465

act Thr

tta Leu

agc Ser

gtg Val

gat Asp 470

gac Asp

gag Glu

ggc Gly

gcg Ala

ttg Leu 475

aat Asn

gtc Val

ggc Gly

agc Ser

aag Lys 480

1440

gat

gcc

aac

aaa

ccc

gtc

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

1488

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

485

490

4 95

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggt

gtg

gcg

caa

aac

1536

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

500

505

510

ttg

aac

cgc

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgc

gcg

ggt

atc

1584

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

515

520

525

gcc

caa

gcg

atc

gca

acc

gca

ggt

ttg

gct

cag

gcc

tat

ttg

ccc

ggc

1632

A-i. a

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

530

535

540

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

ggt

act

tat

cgc

ggc

gaa

gcc

ggt

1680

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

54 5

550

555

560

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcg

agc

att

tct

gac

act

ggg

aat

tgg

gtt

atc

1728

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

565

570

575

aag

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

tcg

cgc

ggt

cat

ttc

ggt

act

tcc

gca

1776

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Thr

Ser

Ala

PL 205 984 B1

580 585 590

tct gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

1797

Ser Val

Gly

Tyr

Gln

Trp

595

<210> 5

<211> 598

<212> PRT

<213> Neisss

r ia

meningitidis

<400> 5

Met Asn

Lys

Ile

Ser

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

Val Val

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

Thr Val

Ais.

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gln

35

40

45

Ala Asn

Ala

Thr

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gln

Arg

50

55

60

Thr Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

Lys Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

90 95

PL 205 984 B1

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu

100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp

115 120 125

Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser

130 135 140

Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn

145 150 155 160

Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly

165 170 175

Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu

180 185 190

Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp

195 200 205

Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val

210 215 220

Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala

225 230 235 240

Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu

245 250 255

PL 205 984 B1

Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr

260

Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile

275 280

Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr

290 295

Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly

305 310

Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp

325

Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys

340

Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn

355 360

Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val

370 375

Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin

385 390

Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly

405

Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn

265 270

Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys

285

Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly

300

Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile

315 320

Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn

330 335

Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr

345 350

Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys

365

Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp

380

Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser

395 400

Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser

410 415

PL 205 984 B1

Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu

420

Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly

435 440

Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val

450 455

Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu

465 470

Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile

485

Giu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala

50C

Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val

515 520

Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly

530 535

Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly

545 550

Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile

565

Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn

425 430

Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser

445

Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala

460

Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys

475 480

Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys

490 495

Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn

505 510

Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile

525

Leu Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly

540

Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly

555 560

Ser Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile

570 575

PL 205 984 B1

Lys Gly Thr Ala	Ser Gly Asn	Ser Arg Gly His 585	Phe Gly Thr Ser Ala 590
	580
Ser	Val	Gly	Tyr	Gin	Trp
		595

<210> 6 <211> 1785 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> ί 1) . .(1785) <400> 6 atg aac aaa ata tac cgc atc att tgg aat agt gcc ctc aat gcc tgg 48

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp

10 15

gtc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

gcg

acc

gcc

gta

ttg

gcg

aca

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

144

PL 205 984 B1

gcg Ala

aat Asn 50

get Ala

acc Thr

gat Asp

gac Asp

gac Asp 55

gat Asp

tta Leu

tat Tyr

tta Leu

gaa Glu 60

ccc Pro

gta Val

caa Gln

ege Arg

act

get

gtc

gtg

ttg

age

ttc

cgt

tcc

gat

aaa

gaa

ggc

acg

gga

gaa

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

aaa

gaa

ggt

aca

gaa

gat

tea

aat

tgg

gca

gta

tat

ttc

gac

gag

aaa

Lys

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

85

90

95

aga

gta

eta

aaa

gee

gga

gca

atc

acc

etc

aaa

gee

ggc

gac

aac

ctg

Arg

Val

Leu

Lys

Ala

Gly

Ala

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

100

105

110

ddd

atc

aaa

caa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gac

agt

age

ttc

acc

Lys

Ile

Lys

Gln

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Asp

Ser

Phe

Thr

115

120

125

tac

tcc

ctg

aaa

gac

etc

aca

gat

ctg

acc

agt

gtt

gaa

act

gaa

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Glu

Thr

Glu

130

135

140

aaa

tta

teg

ttt

ggc

gca

aac

ggt

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

age

gac

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

145

150

155

160

acc

aaa

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

get

ggg

acg

aac

ggc

gac

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

PL 205 984 B1

165

170

175

ccc

acg

gtt

cat

ctg

aac

ggt

atc

ggt

tcg

act

ttg

acc

gat

acg

ctg

576

Pro

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

180

185

190

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

624

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

195

200

205

gac

gag

aaa

cgt

gcg

gca

age

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

gca

ggc

672

Asp

Glu

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

21C

215

220

tgg

aac

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

gct

tcc

gat

aac

gtt

720

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

225

230

235

240

gat

ttc

gtc

cgc

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

age

gca

gat

acg

768

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

245

250

255

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

816

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

260

265

270

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

864

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

275 280 285

PL 205 984 B1

aag Lys

ttg Leu 2 90

gtt Val

act Thr

ggt Gly

aaa Lys

ggc Gly 295

aaa Lys

gac Asp

gag Glu

aat Asn

ggt Gly 300

tct Ser

aca Thr

gac Asp

912

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

960

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

305

310

315

320

aag

gct

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

gct

aat

ggt

caa

aca

ggt

1008

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

325

330

335

caa

gct

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tca

ggc

aca

aat

gta

acc

ttt

1056

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

340

345

350

gct

agt

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

1104

a

Ser

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

355

360

365

aac

atc

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

eta

aac

gtc

1152

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

370

375

380

aat

cag

ctg

caa

aac

agc

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

1200

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

385

390

395

400

ggt

tct

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

agc

ggc

aat

gtt

tcg

ccg

agc

aag

gga

1248

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

PL 205 984 B1

405 410 415

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

420

425

430

acc

cgc

aac

ggt

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

atg

gcg

ccg

cag

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Ala

Pro

Gin

435

440

445

ttt tcc

agc

gtt

tcg

ctc

ggt

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

ttg

agc

1392

Phe Ser

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

450

455

460

gtg gat

gac

gag

ggc

gcg

ttg

aat

gtc

ggc

agc

aag

gat

acc

aac

aaa

1440

Val Asp

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Thr

Asn

Lys

465

470

475

480

ccc gtc

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

1488

Pro Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

485

490

495

aca aac

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cgc

1536

Thr Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

500

505

510

atc gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc

gcc

caa

gcg

att

1584

Ile Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

515

520

525

PL 205 984 B1

gca Ala

acc Thr 530

gca Ala

ggt Gly

eta Leu

gtt Val

cag Gin 535

gcg Ala

tat Tyr

ctg Leu

ccc Pro

ggc Gly 540

aag Lys

agt Ser

atg Met

1632

gcg

atc

ggc

gac

act

tat

ege

ggc

gaa

gcc

ggt

tac

gcc

atc

ggc

1680

Ala

Ile

Gly

Asp

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

545

550

555

560

tac

tca

agt

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg

att

atc

aaa

ggc

acg

gct

1728

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

565

570

575

tcc

ggc

aat

tcg

ege

ggc

cat

ttc

ggt

gct

tcc

gca

tct

gtc

ggt

tat

1776

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

580 585 590 caa tgg taa

Gin Trp

595 <210> 7 <211> 594 <212> PRT <213> Neisseria meningitióis <400> 7

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 1 5 10 15

PL 205 984 B1

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala

25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin

40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg

55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu

70 75 80

Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys

90 95

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu

100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp Ser Ser Phe Thr

115 120 125

Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu

130 135 140

Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp

145 150 155 160

Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp

165 170 175

PL 205 984 B1

Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile

180

Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn

195 200

Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser

210 215

Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro

225 230

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr

245

Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu

260

Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr

275 280

Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys

290 295

Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala

305 310

Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr

325

Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu

185 190

Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp

205

Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly

220

Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val

235 240

Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr

250 255

Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr

265 270

Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly

285

Asp Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp

300

Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn

315 320

Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly

330 335

PL 205 984 B1

Gln Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe

340 345 350

Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly

355 360 365

Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val

370 375 380

Asn Gln Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala

385 390 395 400

Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly

405 410 415

Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile

420 425 430

Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Ala Pro Gln

435 440 445

Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser

450 455 460

Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Thr Asn Lys

465 470 475 480

Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val

485 490 495

PL 205 984 B1

Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg

500 505 510

Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile 515 520 525

Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met 530 535 540

Ala Ile Gly Gly Asp Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly

545 550 555 560

Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala

565 570 575

Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr 580 585 590

Gin Trp <210> 8 <211> 1785 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> (1)..(1785)

PL 205 984 B1 <400> 8

atg Met 1

aac Asn

aaa Lys

ata Ile

tac Tyr 5

cgc Arg

atc Ile

att Ile

tgg Trp

aat Asn 10

agt Ser

gcc Ala

ctc Leu

aat Asn

gcc Ala 15

tgg Trp

gtc

gcc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

Val

Al a

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

gcg

acc

gcc

gta

ttg

gcg

aca

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gcg

agt

act

acc

gat

gac

gat

tta

tat

tta

gaa

ccc

gta

caa

cgc

Ala

Ser

Thr

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gin

Arg

50

55

60

act

gct

gtc

gtg

ttg

age

ttc

cgt

tcc

gat

aaa

gaa

gg=

acg

gga

gaa

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

aaa

gaa

gtt

aca

gaa

gat

tea

aat

tgg

gga

gta

tat

ttc

gac

aag

aaa

Lys

Glu

Val

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Gly

Val

Tyr

Phe

Asp

Lys

85

90

95

gga

gta

eta

aca

gcc

gga

aca

atc

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

ctg

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Gly

Thr

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

100

105

110

aaa

atc

aaa

caa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gcc

agt

age

ttc

acc

PL 205 984 B1

Lys	Ile	Lys 115	Gin	Asn	Thr
tac	tcg	ctg	aaa	aaa	gac
Tyr	Ser	Leu	Lys	Lys	Asp
	130
aaa	tta	tcg	ttt	agc	gca
Lys	Leu	Ser	Phe	Ser	Ala
145					150
acc	aaa	ggc	ttg	aat	ttc
Thr	Lys	Gly	Leu	Asn	Phe
				165
acc	acg	gtt	cat	ctg	aac
Thr	Thr	Val	His	Leu	Asn
			180
ctg	aat	acc	gga	gcg	acc
Leu	Asn	Thr	Gly	Ala	Thr
		195
gac	gag	aaa	aaa	cgt	gcg
Asp	Glu	Lys	Lys	Arg	Ala
	210
tgg	aac	att	aaa	ggc	gtt
Trp	Asn	Ile	Lys	Gly	Val
225					230

Asn	Glu 120	Asn	Thr	Asn	Ala
ctc	aca	gat	ctg	acc	agt
Leu	Thr	Asp	Leu	Thr	Ser
135					140
aac	agc	aat	aaa	gtc	aac
Asn	Ser	Asn	Lys	Val	Asn
				155
gcg	aaa	aaa	acg	gct	gag
Ala	Lys	Lys	Thr	Ala	Glu
			170
ggt	atc	ggt	tcg	act	ttg
Gly	Ile	Gly	Ser	Thr	Leu
		185
aca	aac	gta	acc	aac	gac
Thr	Asn	Val	Thr	Asn	Asp
	200
gca	agc	gtt	aaa	gac	gta
Ala	Ser	Val	Lys	Asp	Val
215					220
aaa	ccc	ggt	aca	aca	gct
Lys	Pro	Gly	Thr	Thr	Ala

235

Ser 125	Ser	Phe	Thr
gtt	gga	act	gaa	432
Val	Gly	Thr	Glu
atc	aca	agc	gac	480
Ile	Thr	Ser	Asp 160
acc	aac	ggc	gac	528
Thr	Asn	Gly 175	Asp
acc	gat	acg	ctg	576
Thr	Asp 190	Thr	Leu
aac	gtt	acc	gat	624
Asn 205	Val	Thr	Asp
tta	aac	gca	ggc	672
Leu	Asn	Ala	Gly
tcc	gat	aac	gtt	720
Ser	Asp	Asn	Val 240

PL 205 984 B1

gat Asp

ttc Phe

gtc Val

ege Arg

act Thr 245

tac Tyr

gac Asp

aca Thr

gtc Val

gag Glu 250

ttc Phe

ttg Leu

age Ser

gca Ala

gat Asp 255

acg Thr

768

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac

aac

ggc

aag

aga

acc

816

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Arg

Thr

260

265

270

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tct

gtt

atc

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

864

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

275

280

285

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

gac

aaa

ggc

gag

aat

gat

tct

aca

gac

912

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

Lys

Gly

Glu

Asn

Asp

Ser

Thr

Asp

29C

295

300

aaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

960

Lys

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

305

310

315

320

aag

get

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

get

aat

ggt

caa

aca

ggt

1008

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gln

Thr

Gly

325

330

335

caa

get

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

aca

aat

gta

acc

ttt

1056

Gln

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

340

345

350

get

agt

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

1104

PL 205 984 B1

Ala

Ser

Gly 355

Lys

Gly

Thr

Thr Ala 360

Thr

Val

Ser

Lys

Asp 365

Asp

Gin

Gly

aac

atc

act

gtt

atg

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

eta

aac

gtc

1152

Asn

Ile

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

370

375

380

aat

cag

ctg

caa

aac

agc

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

1200

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

385

390

395

400

ggt

tet

teg

ggc

aaa

gtc

atc

agc

ggc

aat

gtt

teg

ccg

agc

aag

gga

1248

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

405

410

415

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

1296

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

420

425

430

acc

ege

aac

ggc

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

teg

atg

acc

ccg

caa

1344

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

435

440

445

ttt

tcc

agc

gtt

teg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

tta

agc

1392

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

450

455

460

gtg

gat

gac

gag

ggc

gcg

ttg

aat

gtc

ggc

agc

aag

gat

gcc

aac

aaa

1440

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

465 470 475 480

PL 205 984 B1

ccc

gtc

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

1488

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

485

490

495

aca

aac

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cac

1536

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

His

500

505

510

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc

gcc

caa

gcg

att

1584

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

515

520

525

gca

acc

gca

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ctg

ccc

ggc

aag

agt

atg

1632

Ai a

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

530

535

540

gcg

atc

ggc

act

tat

cgc

ggc

gaa

gcc

ggt

tat

gcc

atc

ggc

1680

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

545

550

555

560

tac

tca

age

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg

att

atc

aaa

ggc

acg

gct

1728

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

565

570

575

tcc

ggc

aat

tcg

cgc

ggc

cat

ttc

ggt

gct

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

1776

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

580

585

590

cag tgg taa

PL 205 984 B1

Gin Trp

595 <210> 9 <211> 594 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 9

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp

10 15

Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala

25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin

40 45

Ala Ser Thr Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg

55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu

70 75 80

Lys Glu Val Thr Glu Asp Ser Asn Trp Gly Val Tyr Phe Asp Lys Lys

90 95

Gly Val Leu Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu

100 105 110

PL 205 984 B1

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu

115 120

Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr

130 135

Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Ser

145 150

Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys

165

Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile

180

Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn

195 200

Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser

210 215

Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro

225 230

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr

245

Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu

260

Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr

125

Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu

140

Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp

155 160

Lys Thr Ala Glu Thr Asn Gly Asp

170 175

Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu

185 190

Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp

205

Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly

220

Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val

235 240

Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr

250 255

Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr

265 270

PL 205 984 B1

Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr

275 280

Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys

290 295

Lys Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala

305 310

Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr

325

Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val

340

Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala

355 360

Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val

370 375

Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp

385 390

Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser

405

Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile

420

Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly

285

Gly Glu Asn Asp Ser Ser Thr Asp

300

Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn

315 320

Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly

330 335

Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe

345 350

Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly

365

Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val

380

Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala

395 400

Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly

410 415

Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile

425 430

PL 205 984 B1

Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp

435 440

Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala

450 455

Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn

465 470

Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala

485

Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly

500

Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala

515 520

Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala

53C 535

Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg

545 550

Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly

565

Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe

580

Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin

445

Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser

460

Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys

475 480

Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val

490 495

Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn His

505 510

Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile

- 525

Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met

540

Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly

555 560

Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala

570 575

Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr

585 590

PL 205 984 B1

Gin Trp <210> 10 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> (1)..(1776) <400> 10

atg Met 1

aac Asn

gaa Glu

ata Ile

ttg Leu 5

cgc Arg

atc Ile

att Ile

tgg Trp

aat Asn 10

agc Ser

gcc Ala

ctc Leu

aat Asn

gcc Ala 15

tgg Trp

gtc

gtt

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

aag

acc

gcc

gta

ttg

gcg

act

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gca

agt

gct

aac

aat

gaa

gag

caa

gaa

gat

tta

tat

tta

gac

ccc

Ala

Ser

Ala

Asn

Glu

Gin

Glu

Asp

Leu

Tyr

Leu

Asp

Pro

50

55

60

PL 205 984 B1

gtg Val 65

eta Leu

cgc Arg

act Thr

gtt Val

gcc Ala 70

gtg Val

ttg Leu

ata Ile

gtc Val

aat Asn 75

tcc Ser

gat Asp

aaa Lys

gaa Glu

ggc Gly 80

acg

gga

gaa

aaa

gaa

aaa

gta

gaa

aat

tea

gat

tgg

gca

gta

tat

Thr

Gly

Glu

Lys

Glu

Lys

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Trp

Ala

Val

Tyr

85

90

95

ttc

aac

gag

aaa

gga

gta

eta

aca

gcc

aga

gaa

atc

acc

ctc

aaa

gcc

Phe

Asn

Glu

Lys

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Arg

Glu

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

100

105

110

ggc

gac

aac

ctg

aaa

atc

aaa

caa

aac

ggc

aca

aac

ttc

acc

tac

tcg

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Gly

Thr

Asn

Phe

Thr

Tyr

Ser

115

120

125

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

agt

gtt

gga

act

gaa

aaa

tta

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

Lys

Leu

130

135

140

tcg

ttt

agc

gca

aac

ggc

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

agc

gac

acc

aaa

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

145

150

155

160

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

gct

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

165

170

175

gtt

cat

ctg

aac

ggt

att

ggt

tcg

act

ttg

acc

gat

acg

ctg

aat

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

PL 205 984 B1

180

185

190

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

195

200

205

aaa

cgt

gcg

gca

agc

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

gct

ggc

tgg

aac

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

210

215

220

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

gct

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

225

230

235

240

gtc

cgc

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

agc

gca

gat

acg

aaa

aca

Va ±

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

245

250

255

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

agc

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

260

265

270

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tct

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275

280

285

gtt

act

ggt

aaa

gac

aaa

ggc

gag

aat

ggt

tct

aca

gac

gaa

ggc

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

290

295

300

PL 205 984 B1

gaa Glu 305

ggc Gly

tta Leu

gtg Val

act Thr

gca Ala 310

aaa Lys

gaa Glu

gtg Val

att Ile

gat Asp 315

gca Ala

gta Val

aac Asn

aag Lys

gct Ala 320

960

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

gct

aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

gct

1008

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

325

330

335

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

aca

aat

gta

acc

ttt

gct

agt

1056

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

1104

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

355

360

365

act

gtt

atg

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

eta

aac

gtc

aat

cag

1152

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

370

375

380

ctg

C33

aac

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tet

1200

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

395

400

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

age

ggc

aat

gtt

tcg

ccg

age

aag

gga

aag

atg

1248

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

acc

cgc

1296

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

PL 205 984 B1

420 425 430

aac Asn

ggt Gly

aaa Lys 435

aat Asn

atc Ile

gac Asp

atc Ile

gee Ala 440

act Thr

teg Ser

atg Met

acc Thr

ccg Pro 445

cag Gln

ttt Phe

tcc Ser

age

gtt

teg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

ttg

age

gtg

gat

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

450

455

460

ggg

gac

gca

ttg

aat

gtc

ggc

age

aag

gac

aac

aaa

ccc

gtc

ege

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

465

470

475

480

att

acc

aat

gtc

gee

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

Ile

Tnr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

485

490

495

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

ege

atc

gac

aat

Ala

Gln

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gln

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

500

505

510

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc

gee

caa

gcg

att

gca

acc

gca

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gln

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

515

520

525

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ttg

ccc

ggc

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

Gly

Leu

Val

Gln

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

530 535 540

PL 205 984 B1

ggc Gly 545

ggc Gly

act Thr

tat Tyr

cgc Arg

ggc Gly 550

gaa Glu

gcc Ala

ggt Gly

tac Tyr

gcc Ala 555

atc Ile

ggc Gly

tac Tyr

tcc Ser

agt Ser 560

1680

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg

att

atc

aaa

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

1728

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

565

570

575

tcg

cgc

ggc

cat

ttc

ggt

gct

tcc

gca

tct

gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

1776

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

590

<210> 11
<211> 591
<212> PRT
<213> Neisseria	meningitidis
<400> 11
Met Asn Glu	Ile	Leu Arg Ile	Ile	Trp	Asn	Ser	Ala	Leu	Asn	Ala	Trp
1		5			10					15
Val Val Val	Ser	Glu Leu Thr	Arg	Asn	His	Thr	Lys	Arg	Ala	Ser	Ala
	20			25					30
Thr Val Lys	Thr	Ala Val Leu	Ala	Thr	Leu	Leu	Phe	Ala	Thr	Val	Gin
35			40					45
Ala Ser Ala	Asn	Asn Glu Glu	Gin	Glu	Glu	Asp	Leu	Tyr	Leu	Asp	Pro

55 60

PL 205 984 B1

Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr

225 230

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu

245

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys

260

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val

275 280

Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu

290 295

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu

305 310

Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr

325

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser

340

Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val

355 360

Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val

370 375

Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe

235 240

Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr

250 255

Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val

265 270

Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu

285

Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly

300

Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala

315 320

Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala

330 335

Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser

345 350

Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile

365

Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin

380

PL 205 984 B1

Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser

385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met

405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg

420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser

435 440 445

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp

450 455 460

Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg

465 470 475 480

Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val

485 490 495

Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn

500 505 510

Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala

515 520 525

Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly

530 535 540

PL 205 984 B1

Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly

545 550

Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile

565

Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala

580 585 <210> 12 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> (1)..(1797) <400> 12

Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser

555 560

Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn

570 575

Ser Val Gly Tyr Gln Trp

590

atg	aac	aaa	ata	tac	cgc	atc	att	tgg
Met 1	Asn	Lys	Ile	Tyr 5	Arg	Ile	Ile	Trp
gtc	gtc	gta	tcc	gag	ctc	aca	cgc	aac
Val	Val	Val	Ser 20	Glu	Leu	Thr	Arg	Asn 25
acc	gtg	gcg	acc	gcc	gta	ttg	gcg	aca

aat	agt	gcc	ctc	aat	gcc	tgg
Asn	Ser	Ala	Leu	Asn	Ala	Trp
10					15

cac	acc	aaa	cgc	gcc	tcc	gca
His	Thr	Lys	Arg	Ala	Ser	Ala
				30

ctg ttg ttt gca acg gtt cag 144

PL 205 984 B1

Thr

Val

Ala 35

Thr

Ala

Val

Leu

Ala 40

Thr

Leu

Phe

Ala 45

Thr

Val

Gin

gcg

aat

gct

acc

gat

gac

gat

tta

tat

tta

gaa

ccc

gta

caa

ege

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gin

Arg

50

55

60

act

gct

gtc

gtg

ttg

agc

ttc

cgt

tcc

gat

aaa

gaa

ggc

acg

gga

gaa

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

S33

gaa

ggt

aca

gaa

gat

tca

aat

tgg

gca

gta

tat

ttc

gac

gag

aaa

Lys

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

85

90

95

a g 3

gta

eta

aaa

gcc

gga

gca

atc

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

ctg

Arg

Val

Leu

Lys

Ala

Gly

Ala

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

100

105

110

□ 33

atc

aaa

caa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gac

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Asp

115

120

125

agt

agc

ttc

acc

tac

tcc

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

agt

Ser

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

130

135

140

gtt

gaa

act

gaa

aaa

tta

teg

ttt

ggc

gca

aac

ggt

aat

aaa

gtc

aac

Val

Glu

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

145 150 155 160

PL 205 984 B1

atc Ile

aca Thr

age Ser'

gac Asp

acc Thr 165

aaa Lys

ggc Gly

ttg Leu

aat Asn

ttt Phe 170

gcg Ala

aaa Lys

gaa Glu

acg Thr

gct Ala 175

ggg Gly

acg

aac

ggc

gac

ccc

acg

gtt

cat

ctg

aac

ggt

atc

ggt

tcg

act

ttg

Thr

Asn

Gly

Asp

Pro

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

180

185

190

acc

gat

acg

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

195

200

205

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

aaa

cgt

gcg

gca

age

gtt

aaa

gac

gta

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

210

215

220

tta

aac

gca

ggc

tgg

aac

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

gct

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

225

2 30

235

240

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

gtc

cgc

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

245

250

255

age

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac

aac

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

260

265

270

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

PL 205 984 B1

Gly

Lys

Lys 275

Thr Glu

Val

Lys

Ile 280

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser 285

Val

Ile

Lys

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

ggc

aaa

gac

gag

aat

ggt

912

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Asp

Glu

Asn

Gly

290

295

300

tct

aca

gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

960

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

305

310

315

320

gat

gca

gta

aac

aag

get

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

get

aat

1008

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

325

330

335

ggt

caa

aca

ggt

caa

get

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

aca

1056

Gly

Gln

Thr

Gly

Gln

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

340

345

350

aaa

gta

acc

ttt

get

agt

ggt

aat

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

1104

Lys

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

355

360

365

gat

caa

ggc

aac

atc

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

1152

Asp

Gln

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

370

375

380

gcc

eta

aac

gtc

aat

cag

ctg

caa

aac

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

1200

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gln

Leu

Gln

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

385

390

395

400

PL 205 984 B1

aaa Lys

gcg Ala

gtt Val

gca Ala

ggt Gly 405

tct Ser

tcg Ser

ggc Gly

aaa Lys

gtc Val 410

atc Ile

agc Ser

ggc Gly

aat Asn

gtt Val 415

tcg Ser

1248

ccg

agc

aag

gga

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

1296

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

420

425

430

aac

atc

gag

att

acc

cgc

aac

ggc

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

1344

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

435

440

445

atg

acc

ccg

caa

ttt

tcc

agc

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

1392

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

4 50

455

460

ccc

act

tta

agc

gtg

gat

gac

gag

ggc

gcg

ttg

aat

gtc

ggc

agc

aag

1440

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

465

470

475

480

gat

gcc

aac

aaa

ccc

gtc

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

1488

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

485

490

495

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggt

gtg

gcg

caa

aac

1536

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

500

505

510

ttg

aac

cgc

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgc

gcg

ggt

atc

1584

PL 205 984 B1

1632

Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile

515 520 525

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

gca

ggt

ttg

gct

cag

gcg

tat

ttg

CCC

ggc

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

530

535

540

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

ggt

act

tat

cgc

ggc

gaa

gcc

ggt

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

545

550

555

560

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcg

agc

att

tct

gac

act

ggg

aat

tgg

gtt

atc

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

565

570

575

1728

aag

ggc

acg gct

tcc

ggc

aat

tcg

cgc

ggc

cat

ttc

ggt

gct

tcc

gca

Lys

Gly

Thr Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

580

585

590

tct gtc	ggt	tat	cag	tgg taa	1797
Ser Val	Gly	Tyr	Gin	Trp
	595

<210> 13 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 13

PL 205 984 B1

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile

5

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala

40

Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp

55

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg

70

Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile

100

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu

115 120

Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys

130 135

Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe

145 150

Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp

15

Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala

30

Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin

Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg

Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu

80

Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys

95

Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu

105 110

Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp

125

Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser

140

Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn

155 160

PL 205 984 B1

Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly

165 170 175

Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu

180 185 190

Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp

195 200 205

Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val

210 215 220

Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala

225 230 235 240

Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu

245 250 255

Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn

260 265 270

Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys

275 280 285

Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Asp Glu Asn Gly

290 295 300

Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile

305 310 315 320

PL 205 984 B1

Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp

325

Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys

340

Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn

355 360

Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val

370 375

Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin

385 390

Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly

405

Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu

420

Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly

435 440

Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val

450 455

Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu

465 470

Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn

330 335

Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr

345 350

Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys

365

Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp

380

Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser

395 400

Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser

410 415

Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn

425 430

Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser

445

Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala

460

Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys

475 480

PL 205 984 B1

Asp Ala Asn	Lys	Pro 485	Val	Arg	Ile	Thr Asn Val 490	Ala	Pro	Gly	Val 495	Lys
Glu Gly Asp	Val	Thr	Asn	Val	Ala	Gin Leu Lys	Gly	Val	Ala	Gin	Asn
	500					505			510
Leu Asn Asn	Arg	Ile	Asp	Asn	Val	Asp Gly Asn	Ala	Arg	Ala	Gly	Ile
515					520			525
Ala Gin Ala	Ile	Ala	Thr	Ala	Gly	Leu Ala Gin	Ala	Tyr	Leu	Pro	Gly
530				535			540
Lys Ser Met	Met	Ala	Ile	Gly	Gly	Gly Thr Tyr	Arg	Gly	Glu	Ala	Gly
545			550			555					560
Tyr Ala Ile	Gly	Tyr	Ser	Ser	Ile	Ser Asp Thr	Gly	Asn	Trp	Val	Ile
		565				570				575
Lys Gly Thr	Ala	Ser	Gly	Asn	Ser	Arg Gly His	Phe	Gly	Ala	Ser	Ala
	580					585			590
Ser Val Gly	Tyr	Gin	Trp
595
<210> 14
<211> 1800
<212> DNA
<213> Neisseria	meningitidis

PL 205 984 B1 <220>

<221> CDS

<225

:> (i). ·

(1800)

<400 14

atg

aac

aaa

ata

tac

cgc

atc

att

tgg

aat

agt

gcc

ctc

aat

gcc

tgg

48

Met

Asn

Lys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

gtc

gcc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

96

Val

Ala

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

aag

acc

gcc

gta

ttg

gcg

acg

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

144

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gcg

aat

gct

acc

gat

gaa

gat

gaa

gag

tta

gaa

ccc

gta

192

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp

Glu

Leu

Glu

Pro

Val

50

55

60

cgc

tet

gct

ctg

gtg

ttg

caa

ttc

atg

atc

gat

aaa

gaa

ggc

aat

gga

240

Arg

Ser

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

Phe

Met

Ile

Asp

Lys

Glu

Gly

Asn

Gly

65

70

75

80

gaa

aac

gaa

tet

aca

gga

aat

ata

ggt

tgg

agt

ata

tat

tac

gac

aat

288

Glu

Asn

Glu

Ser

Thr

Gly

Asn

Ile

Gly

Trp

Ser

Ile

Tyr

Asp

Asn

85

90

95

cac

aac

act

eta

cac

ggc

gca

acc

gtt

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

336

PL 205 984 B1

His

Asn

Thr

Leu 100

His

Gly

Ala

Thr

Val 105

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly 110

Asp

Asn

ctg

aaa

atc

aaa

caa

aac

acc

aat

aaa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Lys

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

115

120

125

gac

agt

agc

ttc

acc

tac

tcg

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

Asp

Ser

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

130

135

140

agt

gtt

gaa

act

gaa

aaa

tta

tcg

ttt

ggc

gca

aac

ggc

aat

aaa

gtc

Ser

Val

Glu

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

145

150

155

160

aac

atc

aca

agc

gac

acc

aaa

ggc

ttg

aat

ttc

gcg

aaa

gaa

acg

gct

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

165

170

175

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

gtt

cat

ctg

aac

ggt

att

ggt

tcg

act

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

180

185

190

ttg

acc

gat

acg

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

195

200

205

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

aag

aaa

cgt

gcg

gca

agc

gtt

aaa

gac

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

210

215

220

PL 205 984 B1

gta tta

aac

gca

ggc

tgg

aac

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

720

Val Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

225

230

235

240

get tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

gtc

cac

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

768

Ala Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

Val

His

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

245

250

255

ttg age

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac

816

Leu Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

260

265

270

aac ggc

aag

aga

acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tct

gtt

att

864

Asn Gly

Lys

Arg

Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

275

280

285

aaa gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

ggc

aaa

ggc

gag

aat

912

Lys Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Gly

Glu

Asn

290

295

300

ggt tct

tct

aca

gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

960

Gly Ser

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

305

310

315

320

att gat

gca

gta

aac

aag

get

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

get

1008

Ile Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

325

330

335

aat ggt

caa

aca

ggt

caa

get

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

1056

PL 205 984 B1

Asn

Gly

Gin

Thr 340

Gly

Gin Ala Asp

Lys 345

Phe

Glu

Thr

Val

Thr 350

Ser

Gly

aca

aat

gta

acc

ttt

gct

agt

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

1104

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

355

360

365

aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

1152

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

370

375

380

gat

gcc

eta

aac

gtc

aat

cag

ctg

caa

aac

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat

1200

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

385

390

395

400

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tet

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

age

ggc

aat

gtt

1248

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val '

405

410

415

tcg

ccg

age

aag

gga

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

1296

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

420

425

430

aac

atc

gag

att

acc

cgc

aac

ggt

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

1344

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

435

440

445

tcg

atg

acc

ccg

cag

ttt

tcc

age

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

1392

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

450 455 460

PL 205 984 B1

gcg Ala 465

ccc Pro

act Thr

ttg Leu

agc Ser

gtg Val 470

gat Asp

gac aag ggc gcg

ttg Leu

aat Asn

gtc Val

ggc Gly

agc Ser 480

1440

Asp

Lys

Gly

Ala 475

aag

gat

gcc

aac

aaa

ccc

gtc

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

1488

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

485

490

495

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg

caa

1536

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

500

505

510

aac

ttc

aac

cgc

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

1584

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

515

520

525

atc

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

gca

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ctg

ccc

1632

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

530

535

540

ggc

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

act

tat

cgc

ggc

gaa

gcc

1680

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

545

550

555

560

ggt

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcc

agt

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg

att

1728

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

565

570

575

atc

aaa

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

tcg

cgc

ggt

cat

ttc

ggt

gct

tcc

1776

PL 205 984 B1

Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser
580	585	590

gca	tet	gtc	ggt	tat	cag	tgg	taa	1800
Ala	Ser	Val	Gly	Tyr	Gin	Trp
		595					600

<210> 15 <211> 599 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 15

Met

Asn

Lys

Ile

Tyr 5

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

Vai

Ala

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

Al a

Asn

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp

Glu

Leu

Glu

Pro

Val

50

55

60

Arg

Ser

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

Phe

Met

Ile

Asp

Lys

Glu

Gly

Asn

Gly

65

70

75

80

Glu

Asn

Glu

Ser

Thr

Gly

Asn

Ile

Gly

Trp

Ser

Ile

Tyr

Asp

Asn

PL 205 984 B1

His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr

100

Leu Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn

115 120

Asp Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu

130 135

Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser

145 150

Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly

165

Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val

180

Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr

195 200

Asp Asn Val Thr Asp Asp Lys Lys

210 215

Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile

225 230

Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val

95

Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn

105 110

Lys Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn

125

Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr

140

Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val

155 160

Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala

170 175

His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr

185 190

Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn

205

Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp

220

Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr

235 240

His Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe

PL 205 984 B1

245 250 255

Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp

260 265 270

Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile

275 280 285

Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn

290 295 300

Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val

305 310 315 320

Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala

325 330 335

Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly

340 345 350

Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser

355 360 365

Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly

370 375 380

Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp

385 390 395 400

Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val

PL 205 984 B1

405

Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp

420

Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn

435 440

Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser Ser

450 455

Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp

465 470

Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg

485

Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val

500

Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn

515 520

Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala

530 535

Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly

545 550

410 415

Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly

425 430

Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr

445

Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp

460

Lys Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser

475 480

Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val

490 495

Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln

505 510

Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly

525

Gly Leu Val Gln Ala Tyr Leu Pro

540

Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala

555 560

Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile

PL 205 984 B1

				565				570		575
Ile	Lys	Gly	Thr	Ala	Ser	Gly Asn	Ser	Arg Gly His	Phe Gly	Ala Ser
			580				585		590
Ala	Ser	Val	Gly	Tyr	Gin	Trp
		595

<210 16 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220 <221> CDS <222> (1)..(1779) <400> 16

atg

aac aaa

ata

tac

cgc

atc

att

tgg

aat

agt

gcc

ctc

aat

gcc

tgg

Met

Asn Lys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

gtc

gcc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

Val

Ala

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

aag

acc gcc

gta

ttg

gcg

aca

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

Thr

Val

Lys

Thr Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

144

PL 205 984 B1

gcg Ala

aat Asn 50

gct Ala

acc Thr

gat Asp

gaa Glu

gat Asp 55

gaa Glu

gag Glu

tta Leu 60

gaa Glu

tcc Ser

gta Val

caa Gin

cgc

tct

gtc

gta

ggg

agc

att

caa

gcc

agt

atg

gaa

ggc

agc

gtc

gaa

Arg

Ser

Val

Gly

Ser

Ile

Gin

Ala

Ser

Met

Glu

Gly

Ser

Val

Glu

65

70

75

80

ttg

gaa

acg

ata

tca

tta

tca

atg

act

aac

gac

agc

aag

gaa

ttt

gta

Leu

Glu

Thr

Ile

Ser

Leu

Ser

Met

Thr

Asn

Asp

Ser

Lys

Glu

Phe

Val

85

90

95

gac

cca

tac

ata

gta

gtt

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

ctg

aaa

atc

Asp

Pro

Tyr

Ile

Val

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

100

105

110

333

caa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gcc

agt

agc

ttc

acc

tac

tcg

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Ala

Ser

Phe

Thr

Tyr

Ser

115

120

125

ctg

aaa

gac

ctc

aca

ggc

ctg

atc

aat

gtt

gaa

act

gaa

aaa

tta

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Gly

Leu

Ile

Asn

Val

Glu

Thr

Glu

Lys

Leu

130

135

140

tcg

ttt

ggc

gca

aac

ggc

aag

aaa

gtc

aac

atc

ata

agc

gac

acc

aaa

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Lys

Val

Asn

Ile

Ser

Asp

Thr

Lys

145

150

155

160

ggc

ttg

aat

ttc

gcg

aaa

gaa

acg

gct

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

PL 205 984 B1

Gly Leu Asn

Phe

Ala 165

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly 170

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr 175

Thr

gtt

cat

ctg

aac

ggt

atc

ggt

tcg

act

ttg

acc

gat

atg

ctg

aat

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Met

Leu

Asn

180

185

190

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

195

200

205

333

aaa

cgt

gcg

gca

age

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

gca

ggc

tgg

aac

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

210

215

220

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

gct

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

225

230

235

240

gcc

cgc

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

age

gca

gat

acg

aaa

aca

Vć_

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

245

250

255

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

260

265

270

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275 280 285

PL 205 984 B1

gtt Val

act Thr 290

ggt Gly

aaa Lys

ggc Gly

aaa Lys

ggc Gly 295

gag Glu

aat Asn

ggt Gly

tct Ser

tct Ser 300

aca Thr

gac Asp

gaa Glu

ggc Gly

912

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

aag

get

960

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

305

310

315

320

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

get

aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

get

1008

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gln

Thr

Gly

Gln

Ala

325

330

335

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

aca

aaa

gta

acc

ttt

get

agt

1056

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

ggt

aat

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

1104

Gly

Asn

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gln

Gly

Asn

Ile

355

360

365

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

eta

aac

gtc

aat

cag

1152

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gln

370

375

380

ctg

caa

aac

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tct

1200

Leu

Gln

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

395

400

teg

ggc

aaa

gtc

atc

age

ggc

aat

gtt

teg

ccg

age

aag

gga

aag

atg

1248

PL 205 984 B1

Ser

Gly

Lys

Val

Ile 405

Ser

Gly

Asn

Val

Ser 410

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys 415

Met

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

acc

cgc

1296

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

420

425

430

aac

ggc

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

atg

acc

ccg

caa

ttt

tcc

1344

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

agc

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

tta

agc

gtg

gat

1392

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

450

455

460

gac

gag

ggc

gcg

ttg

aat

gtc

ggc

agc

aag

gat

gcc

aac

aaa

ccc

gtc

1440

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

465

470

475

480

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

1488

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

485

4 90

495

gtc

gcg

caa

ctt

aaa

ggt

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cgc

atc

gac

1536

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

500

505

510

aat

gtg

aac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

1584

Asn

Val

Asn

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

515

520

525

PL 205 984 B1

gca Ala

ggt Gly 530

ctg Leu

gtt Val

cag Gin

gcg Ala

tat Tyr 535

ctg Leu

ccc Pro

ggc Gly

aag Lys

agt Ser 540

atg Met

gcg Ala

atc Ile

1632

ggc

act

tat

ctc

ggc

gaa

gcc

ggt

tat

gcc

atc

ggc

tac

tca

1680

Gly

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

545

550

555

560

agc

att

tcc

gcc

ggc

gga

aat

tgg

att

atc

aaa

ggc

acg

gct

tcc

ggc

1728

Ser

Ile

Ser

Ala

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

565

570

575

aat

teg

ege

ggc

cat

ttc

ggt

gct

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

cag

tgg

1776

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580 585 590 raa 1779 <210> 17 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 17

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp

10 15

100

PL 205 984 B1

Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala

40

Ala Asn Ala Thr Asp Glu Asp Glu

55

Arg Ser Val Val Gly Ser Ile Gin

70

Leu Glu Thr Ile Ser Leu Ser Met

Asp Pro Tyr Ile Val Val Thr Leu

100

Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr

115 120

Leu Lys Lys Asp Leu Thr Gly Leu

130 135

Ser Phe Gly Ala Asn Gly Lys Lys

145 150

Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr

165

Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala

30

Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin

Glu Glu Glu Leu Glu Ser Val Gin

Ala Ser Met Glu Gly Ser Val Glu

80

Thr Asn Asp Ser Lys Glu Phe Val

95

Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile

105 110

Asn Ala Ser Ser Phe Thr Tyr Ser

125

Ile Asn Val Glu Thr Glu Lys Leu

140

Val Asn Ile Ile Ser Asp Thr Lys

155 160

Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr

170 175

PL 205 984 B1

101

Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu Asn

180 185 190

Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu

195 200 205

Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn

210 215 220

Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe

225 230 235 240

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr

245 250 255

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val

260 265 270

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu

275 280 285

Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly

290 295 300

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala

305 310 315 320

102

PL 205 984 B1

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser

340 345 350

Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile

355 360 365

Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin

370 375 380

Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser

385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met

405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg

420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser

435 440 445

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp

450 455 460

Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val

465 470 475 480

Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn

485 490 495

PL 205 984 B1

103

Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp

500 505 510

Asn Val Asn Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr

515 520 525

Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile

530 535 540

Gly Gly Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser

545 550 555 560

Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly

565 570 575

Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp

580 585 590 <210> 18 <211> 1770 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> (1) . .(1770) <400> 18 atg aac aaa ata tac cgc atc att tgg aat agt gcc ctc aat gcc tgg 48

104

PL 205 984 B1

Met 1

Asn

Lys

Ile

Tyr 5

Arg

Ile

Trp Asn 10

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

gta

gtc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

gcg

acc

gcc

gta

ttg

gcg

aca

ctg

tcc

gca

acg

gtt

cag

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gcg

aat

gct

acc

gat

acc

gat

gaa

gat

gaa

gag

tta

gaa

tcc

gta

gca

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Thr

Asp

Glu

Asp

Glu

Leu

Glu

Ser

Val

Ala

50

55

60

cgc

tet

gct

ctg

gtg

ttg

caa

ttc

atg

atc

gat

aaa

gaa

ggc

aat

gga

Arg

Ser

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

Phe

Met

Ile

Asp

Lys

Glu

Gly

Asn

Gly

65

70

75

80

gaa

atc

gaa

tet

aca

gga

gat

ata

ggt

tgg

agt

ata

tat

tac

gac

gat

Glu

Ile

Glu

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Gly

Trp

Ser

Ile

Tyr

Asp

85

90

95

cac

aac

act

eta

cac

ggc

gca

acc

gtt

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

His

Asn

Thr

Leu

His

Gly

Ala

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

100

105

110

ctg

aaa

atc

aaa

caa

agc

ggc

aaa

gac

ttc

acc

tac

teg

ctg

aaa

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Ser

Gly

Lys

Asp

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

115

120

125

PL 205 984 B1

105

gag Glu

ctg Leu 130

aaa Lys

gac Asp

ctg Leu

acc Thr

agt Ser 135

gtt Val

gaa Glu

act Thr

gaa Glu

aaa Lys 140

tta Leu

teg Ser

ttt Phe

ggc Gly

gca

aac

ggt

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

age

gac

acc

aaa

ggc

ttg

aat

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

145

150

155

160

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

get

ggg

acg

aac

ggc

gac

ccc

acg

gtt

cat

ctg

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Pro

Thr

Val

His

Leu

165

170

175

aac

ggt

atc

ggt

teg

act

ttg

acc

gat

acg

ctt

gcg

ggt

tct

get

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Ala

Gly

Ser

Ala

180

185

190

cct

cac

gtt

gat

gcg

ggt

aac

caa

agt

aca

cat

tac

act

cgt

gca

Ser

Kis

Val

Asp

Ala

Gly

Asn

Gln

Ser

Thr

His

Tyr

Thr

Arg

Ala

195

200

205

agt

att

aag

gat

gtg

ttg

aat

gcg

ggt

tgg

aat

att

aag

ggt

gtt

aaa

Ser

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

210

215

220

act

ggc

tea

aca

act

ggt

caa

tea

gaa

aat

gtc

gat

ttc

gtc

cgc

act

Thr

Gly

Ser

Thr

Gly

Gln

Ser

Glu

Asn

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

225

230

235

240

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

age

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

106

PL 205 984 B1

Tyr Asp

Thr

Val

Glu 245

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp 250

Thr

Lys

Thr

Thr 255

Val

aat

gtg

gaa

agc

aaa

gac

aac

ggc

aag

aga

acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

816

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Arg

Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

260

265

270

gcg

aag

act

tct

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

864

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

275

280

285

aaa

ggc

aaa

ggc

gag

aat

ggt

tct

aca

gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

912

Lys

Gly

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

290

295

300

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

aag

gct

ggt

tgg

aga

960

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

305

310

315

320

atg

aaa

aca

acc

gct

aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

gct

gac

aag

ttt

1008

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

325

330

335

gaa

acc

gtt

aca

tca

ggc

aca

aaa

gta

acc

ttt

gct

agt

ggt

aat

ggt

1056

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

Gly

340

345

350

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

act

gtt

aag

1104

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

355

360

365

PL 205 984 B1

107

tat Tyr

gat Asp 370

gta Val

aat Asn

gtc Val

ggc Gly

gat Asp 375

gcc Ala

eta Leu

aac Asn

gtc Val

aat Asn 380

cag Gin

ctg Leu

caa Gin

aac Asn

1152

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tet

tcg

ggc

aaa

1200

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

Gly

Lys

385

390

395

400

gtc

atc

age

ggc

aat

gtt

tcg

ccg

age

aag

gga

aag

atg

gat

gaa

acc

1248

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

405

410

415

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

acc

cgc

aac

ggc

aaa

1296

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

420

425

430

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

atg

acc

ccg

caa

ttt

tcc

age

gtt

tcg

1344

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

Ser

435

440

445

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

tta

age

gtg

gat

gac

gag

ggc

1392

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Glu

Gly

450

455

460

gcg

ttg

aat

gtc

ggc

age

aag

gat

gcc

aac

aaa

CCC

gtc

cgc

att

acc

1440

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

465

470

475

480

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

gca

caa

1488

108

PL 205 984 B1

Asn

Val

Ala

Pro

Gly 485

Val

Lys

Glu Gly

Asp Val 4 90

Thr

Asn

Val

Ala 495

Gin

ctt

aaa

ggt

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cgc

atc

gac

aat

gtg

aac

1536

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asn

500

505

510

ggc

aac

gcg

cgc

gcg

ggt

atc

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

gca

ggt

ttg

1584

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

515

520

525

gct

cag

gcc

tat

ttg

ccc

ggc

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

ggt

1632

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

530

535

540

act

tat

ctc

ggc

gaa

gcc

ggt

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcg

age

att

tet

1680

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

545

550

555

560

gac

act

ggg

aat

tgg

gtt

atc

aag

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

tcg

cgc

1728

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

565

570

575

ggt

cat

ttc

ggt

act

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

1770

Gly

His

Phe

Gly

Thr

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

590

<210> 19 <211> 589

PL 205 984 B1

109 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400 19

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp

10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala

25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ala Thr Val Gin

40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Thr Asp Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser Val Ala

55 60

Arg Ser Ala Leu Val Leu Gin Phe Met Ile Asp Lys Glu Gly Asn Gly

70 75 80

Glu Ile Glu Ser Thr Gly Asp Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asp

90 95

His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn

100 105 110

Leu Lys Ile Lys Gin Ser Gly Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys

115 120 125

Glu Leu Lys Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly

130 135 140

110

PL 205 984 B1

Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn

145 150 155 160

Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu

165 170 175

Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Ala Gly Ser Ser Ala

180 185 190

Ser His Val Asp Ala Gly Asn Gln Ser Thr His Tyr Thr Arg Ala Ala

195 200 205

Ser Ile Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys

210 215 220

Thr Gly Ser Thr Thr Gly Gln Ser Glu Asn Val Asp Phe Val Arg Thr

225 230 235 240

Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val

245 250 255

Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly

260 265 270

Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly

275 280 285

Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu

290 295 300

PL 205 984 B1

111

112

PL 205 984 B1

Ala 465

Leu

Asn

Val

Gly Ser 470

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys 475

Pro

Val

Arg

Ile

Thr 480

Asn

Val

Ala

Pro

Gly Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

485

490

495

Leu

Lys

Gly

Val

Ala Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asn

500

505

510

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

515

520

525

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

530

535

540

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

545

550

555

560

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp Val

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

565

570

575

Gly

His

Phe

Gly

Thr Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

<210> 20

<211> 1776

<212> DNA

<213> Neisseria

meningitidis

PL 205 984 B1

113 <220>

<221> CDS <222> (1)..(1776) <400> 20

atg Met 1

aac Asn

aaa Lys

ata Ile

tac Tyr 5

cgc Arg

atc Ile

att Ile

tgg Trp

aat Asn 10

agt Ser

gcc Ala

ctc Leu

aat Asn

gca Ala 15

tgg Trp

gtc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

aag

acc

gcc

gta

ttg

gcg

act

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gca

agt

gct

aac

aat

gaa

gag

caa

gaa

gat

tta

tat

tta

gac

ccc

Ala

Ser

Ala

Asn

Glu

Gin

Glu

Asp

Leu

Tyr

Leu

Asp

Pro

50

55

60

gta

caa

cgc

act

gtt

gcc

gtg

ttg

ata

gtc

aat

tcc

gat

aaa

gaa

ggc

Val

Gin

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Leu

Ile

Val

Asn

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

65

70

75

80

acg

gga

gaa

aaa

gaa

aaa

gta

gaa

aat

tca

gat

tgg

gca

gta

tat

Thr

Gly

Glu

Lys

Glu

Lys

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Trp

Ala

Val

Tyr

85

90

95

114

PL 205 984 B1

ttc Phe

aac Asn

gag Glu

aaa Lys 100

gga Gly

gta Val

eta Leu

aca Thr

gcc Ala 105

aga Arg

gaa Glu

atc Ile

acc Thr

ctc Leu 110

aaa Lys

gcc Ala

ggc

gac

aac

ctg

aaa

atc

aaa

caa

aac

ggc

aca

aac

ttc

acc

tac

teg

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

Lys

Gln

Asn

Gly

Thr

Asn

Phe

Thr

Tyr

Ser

115

120

125

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

agt

gtt

gga

act

gaa

aaa

tta

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

Lys

Leu

130

135

140

teg

ttt

age

gca

aac

ggc

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

age

gac

acc

aaa

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

145

150

155

160

gg=

teg

aat

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

get

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

165

170

175

gtt

cat

ctg

aac

ggt

att

ggt

teg

act

ttg

acc

gat

acg

ctg

aat

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

180

185

190

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

195

200

205

aaa

cgt

gcg

gca

age

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

get

ggc

tgg

aac

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

PL 205 984 B1

115

210

215

220

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

gct

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

720

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

225

230

235

240

gtc

cgc

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

agc

gca

gat

acg

aaa

aca

768

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

245

250

255

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

agc

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

816

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

260

265

270

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

864

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275

280

285

gtt

act

ggt

aaa

gac

aaa

ggc

gag

aat

ggt

tet

aca

gac

gaa

ggc

912

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

290

295

300

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

aag

gct

960

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

305

310

315

320

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

gct

aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

gct

1008

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

325

330

335

116

PL 205 984 B1

gac Asp

aag Lys

ttt Phe

gaa Glu 340

acc Thr

gtt Val

aca Thr

tca Ser

ggc Gly 345

aca Thr

aat Asn

gta Val

acc Thr

ttt Phe 350

gct Ala

agt Ser

1056

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

1104

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

355

360

365

act

gtt

atg

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

eta

aac

gtc

aat

cag

1152

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

370

375

380

ctg

caa

aac

agc

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tct

1200

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

395

400

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

agc

ggc

aat

gtt

tcg

ccg

agc

aag

gga

aag

atg

1248

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

acc

cgc

1296

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

420

425

430

aac

ggt

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

atg

acc

ccg

cag

ttt

tcc

1344

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

agc

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

ttg

agc

gtg

gat

1392

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

PL 205 984 B1

117

450

455

460

ggg

gac

gca

ttg

aat

gtc

ggc

agc

aag

gac

aac

aaa

ccc

gtc

cgc

1440

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

465

470

475

480

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

1488

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

485

4 90

4 95

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cgc

atc

gac

aat

1536

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

500

505

510

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

gca

1584

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

515

520

525

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ttg

ccc

ggc

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

1632

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

530

535

540

ggc

act

tat

cgc

ggc

gaa

gcc

ggt

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcc

agt

1680

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

545

550

555

560

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg

att

atc

aaa

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

1728

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

565

570

575

118

PL 205 984 B1

tcg

cgc ggc

cat

ttc

ggt

gct

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

1776

Ser

Arg Gly

His

Phe

Gly Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

590

<210> 21

<211> 591

<212> PRT

<213> Neisseria

meningitidis

<400> 21

Met

Asn Lys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

Vai

Vai Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Val Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

Ala

Ser Ala

Asn

Glu

Gin

Glu

Asp

Leu

Tyr

Leu

Asp

Pro

50

55

60

Val

Gin Arg

Thr

Val

Ala

Val

Leu

Ile

Val

Asn

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

65

70

75

80

Thr

Gly Glu

Lys

Glu

Lys

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Trp

Ala

Val

Tyr

85

90

95

Phe

Asn Glu

Lys

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Arg

Glu

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

PL 205 984 B1

119

120

PL 205 984 B1

260 265 270

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu

275 280 285

Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly

290 295 300

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala

305 310 315 320

Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala

325 330 335

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser

340 345 350

Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile

355 360 365

Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin

370 375 380

Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser

385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met

405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg

PL 205 984 B1

121

420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser

435 440 445

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp

450 455 460

Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg

465 470 475 480

Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val

485 490 495

Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn

500 505 510

Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala

515 520 525

Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly

530 535 540

Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser

545 550 555 560

Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn

565 570 575

Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp

122

PL 205 984 B1

580 585 590 <210> 22 <211> 21 <212> DNA .

<213> Sekwencja syntetycznej cząsteczki <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki: 5' starter oligonukleotydowy dla PCR <400> 22 ttagatrcca cgtcccagat t 21 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki: 3' starter oligonukleotydowy dla PCR <400> 23 cttcccttca aaccttcc 18 <210> 24 <211> 32

PL 205 984 B1

123 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki: 5' starter oligonukleotydowy dla PCR <400> 24 ggtcgcggat ccatgaacaa aatataccgc at 32 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki: 3' starter oligonukleotydowy dla PCR <400> 25 tcacccaagc ttaagccctt accactgata ac 32 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki: 5' starter oligonukleotydowy dla PCR

124

PL 205 984 B1 <400> 26 ccaaaccccg atttaacc 18 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki: 3' starter oligonukleotydowy dla PCR <4C0> 27 aatcgccacc cttcccttc 19 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka <220 <223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki:

starter oligonukleotydowy dla PCR <400 28 tttgcaacgg ttcaggca 18

PL 205 984 B1

125 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki: starter oligonukleotydowy dla PCR <400> 29 tattcagcag cgtatcgg 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki:

starter oligonukleotydowy dla PCR <400> 30 tgcctgaacc gttgcaaa 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna cząsteczka

126

PL 205 984 B1 <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej cząsteczki:

starter oligonukleotydowy dla PCR <400> 31 ccgatacgct gctgaata 18

Claims

Zastrzeżenia patentowe

(1) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 1;

1. Wyizolowany polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:

(a) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 2;

(b) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 5;

(c) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 7;

(d) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 9;

(e) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 11;

(f) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 13;

(g) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 15;

(h) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 17;

(i) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 19 i (j) sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO 21.
(2) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 3;

2. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że wywołuje aktywność immunologiczną względem co najmniej jednego przedstawiciela grupy obejmującej:

(i) N. meningitidis;

(ii) polipeptyd określony w zastrz 1;

(iii) fragment izolowanego polipeptydu określony w zastrz. 4, (iv) wariant izolowanego polipeptydu określony w jednym z zastrz. od 7 do 10.
(3) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 4;

3. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że wywołuje aktywność immunologiczną względem N. meningitidis.
(4) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 6;

4. Fragment izolowanego polipeptydu określonego w zastrz. 1 wykazujący aktywność immunologiczną, znamienny tym, że obejmuje co najmniej 20 sąsiadujących aminokwasów ze wspomnianych sekwencji aminokwasowych, przy czym fragment ten wywołuje aktywność immunologiczną u ssaka obejmują c ą wytwarzania elementów które swoiś cie wiążą N. meningitidis i/albo wspomniany polipeptyd.
(5) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 8;

5. Fragment polipeptydu według zastrz. 4, znamienny tym, że wywołuje aktywność immunologiczną względem co najmniej jednego przedstawiciela grupy obejmującej:

(i) N. meningitidis;

(ii) polipeptyd określony w zastrz 1;

(iii) fragment izolowanego polipeptydu określony w zastrz. 4, (iv) wariant izolowanego polipeptydu określony w jednym z zastrz. od 7 do 10.
(6) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 10;

6. Fragment polipeptydu według zastrz. 4, znamienny tym, że wywołuje aktywność immunologiczną względem N. meningitidis.
(7) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 12;

7. Wariant izolowanego polipeptydu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że jest w 80% identyczny z jedną z wymienionych sekwencji aminokwasowych.
(8) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 14;

8. Wariant izolowanego polipeptydu według zastrz. 7, znamienny tym, że jest w 85% identyczny z jedną z wymienionych sekwencji aminokwasowych.
(9) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 16;

9. Wariant izolowanego polipeptydu według zastrz. 8, znamienny tym, że jest w 90% identyczny z jedną z wymienionych sekwencji aminokwasowych.
(10) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 18; oraz (11) sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO 20;

10. Wariant izolowanego polipeptydu według zastrz. 7, znamienny tym, że jest wariantem allelicznym.

PL 205 984 B1

127
11. Wariant izolowanego polipeptydu według zastrz. 7 albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że wywołuje aktywność immunologiczną względem co najmniej jednego przedstawiciela grupy obejmującej:

(i) N. meningitidis;

(ii) polipeptyd określony w zastrz 1;

(iii) fragment izolowanego polipeptydu określony w zastrz. 4, (iv) wariant izolowanego polipeptydu określony w jednym z zastrz. od 7 do 10.
12. Wariant izolowanego polipeptydu według zastrz. 7 albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że wywołuje aktywność immunologiczną względem N. meningitidis.
13. Izolowane białko fuzyjne obejmujące izolowany polipeptyd określony w zastrz. 1, fragment izolowanego polipeptydu określony w zastrz. 4 albo wariant izolowanego polipeptydu określony w jednym z zastrz. od 7 do 10.
14. Wyizolowany polipeptyd, znamienny tym, że zawiera jeden lub więcej fragmentów określonych w zastrz. 2, które to fragmenty obejmują determinanty antygenowe i epitopy.
15. Izolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje izolowany polipeptyd określony w zastrz. 1, fragment izolowanego polipeptydu okreś lony w zastrz. 4, wariant izolowanego polipeptydu określony w jednym z zastrz. od 7 do 10, albo izolowane białko fuzyjne określone w zastrz. 13.
16. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 15, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej:
17. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 15, znamienny tym, że koduje wariant izolowanego polipeptydu otrzymywany z bakterii z rodzaju Neisseria.
18. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 17, znamienny tym, że uzyskuje się go ze szczepu N. meningitidis.
19. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera izolowany kwas nukleinowy określony w jednym z zastrz. od 15 do 18 przy czym izolowany kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym regulującym transkrypcję i translację.
20. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transfekowana lub transformowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 19.
21. Komórka gospodarza według zastrz. 20, znamienna tym, że jest nią bakteria.
22. Komórka gospodarza według zastrz. 21, znamienna tym, że jest nią N. meningitidis.
23. Przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen, znamienne tym, że wiąże się z izolowanym polipeptydem okreś lonym w zastrz. 1, fragmentem izolowanego polipeptydu okreś lonym w zastrz. 4 albo wariantem izolowanego polipeptydu okreś lonym w jednym z zastrz. od 7 do 10.
24. Przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen według zastrz. 23, znamienne tym, że wiąże się z N. meningitidis.
25. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera izolowany polipeptyd określony w zastrz. 1; fragment izolowanego polipeptydu okreś lony w zastrz. 4; wariant izolowanego polipeptydu określony w jednym z zastrz. od 7 do 10; izolowane białko fuzyjne określone w zastrz. 13, przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen określone w jednym z zastrz. od 23 do 24; albo izolowany kwas nukleinowy określony w jednym z zastrz. od 15 do 18 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że jest w postaci szczepionki.
27. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 26, do zastosowania jako lek do zapobiegania albo leczenia infekcji N. meningitidis.

128

PL 205 984 B1
28. Sposób otrzymywania izolowanego kwasu nukleinowego określonego w jednym z zastrz. od 15 do 18, znamienny tym, że (i) otrzymuje się ekstrakt kwasu nukleinowego z dogodnego gospodarza; po czym (ii) tworzy się startery, które są ewentualnie zdegenerowane, przy czym startery zawierają sekwencje nukleotydowe odpowiednich części sekwencji kwasów nukleinowych określonych w jednym z zastrz. od 15 do 18, a nastę pnie (iii) stosuje się utworzone startery do amplifikacji, na matrycy ekstraktu kwasu nukleinowego, przy pomocy techniki amplifikacji kwasu nukleinowego, jednego lub większej liczby produktów amplifikacji.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że ekstrakt kwasu nukleinowego otrzymuje się z bakterii z rodzaju Neisseria.
30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że ekstrakt kwasu nukleinowego jest otrzymywany ze szczepu N. meningitidis.
31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że startery są wybrane z grupy obejmującej SEQ ID NO. 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 i 31.
32. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako technikę amplifikacji stosuje się technikę PCR.
33. Sposób wytwarzania zrekombinowanego polipeptydu, znamienny tym, że (A) hoduje się komórki gospodarza określone w zastrz. 20 tak, że wspomniany zrekombinowany polipeptyd wyrażany jest przez te komórki, i (B) izoluje się zrekombinowany polipeptyd.
34. Sposób wykrywania bądź diagnozowania zakażenia N. meningitidis w próbkach biologicznych, znamienny tym, że wykrywa się izolowany polipeptyd określony w zastrz. 1, fragment izolowanego polipeptydu określony w zastrz. 4 albo wariant izolowanego polipeptydu określony w jednym z zastrz. od 7 do 10.
35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że do wykrywania izolowanego polipeptydu, fragmentu izolowanego polipeptydu albo wariantu izolowanego polipeptydu stosuje się przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen określone w jednym z zastrz. od 28 do 29.
36. Sposób według zastrz. 34 albo 35, znamienny tym, że próbka biologiczna pochodzi od człowieka.
37. Sposób wykrywania bądź diagnozowania zakażenia N. meningitidis w próbkach biologicznych, znamienny tym, że wykrywa się przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążący antygen określone w jednym z zastrz. od 23 do 24.
38. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że próbka biologiczna pochodzi od człowieka.
39. Sposób wykrywania bądź diagnozowania zakażenia N. meningitidis w próbkach biologicznych, znamienny tym, że wykrywa izolowany kwas nukleinowy określony w jednym z zastrz. od 15 do 18.
40. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że do wykrywania izolowanego kwasu nukleinowego poprzez amplifikację sekwencji kwasu nukleinowego stosuje się startery oligonukleotydowe wybrane z grupy obejmującej SEQ ID NO. 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 i 31.
41. Sposób według zastrz. 39 albo 40, znamienny tym, że próbka biologiczna pochodzi od człowieka.
42. Zastosowanie izolowanego polipeptydu określonego w zastrz. 1; fragmentu izolowanego polipeptydu określonego w zastrz. 4; wariantu izolowanego polipeptydu określonego w jednym z zastrz. od 7 do 10; przeciwciała lub fragmentu przeciwciała wiążącego antygen określonego w jednym z zastrz. od 23 do 24; izolowanego białka fuzyjnego określonego w zastrz. 13; albo izolowanego kwasu nukleinowego określonego w jednym z zastrz. od 15 do 18 do wytwarzania leku do zapobiegania albo leczenia infekcji N. meningitidis u człowieka.
43. Zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała wiążącego antygen określonego w jednym z zastrz. od 23 do 24 do identyfikacji in vitro równoważ nika funkcjonalnego albo mimetyka izolowanego polipeptydu określonego w zastrz. 1, fragmentu izolowanego polipeptydu określonego w zastrz. 4 albo wariantu izolowanego polipeptydu okreś lonego w jednym z zastrz. od 7 do 10.
44. Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, że identyfikacja prowadzona jest w próbce pochodzącej od ssaka nie będącego człowiekiem.