PL207183B1 - Pochodna nukleozydu, modyfikowany oligonukleotyd oraz sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu - Google Patents

Pochodna nukleozydu, modyfikowany oligonukleotyd oraz sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu

Info

Publication number
PL207183B1
PL207183B1 PL359949A PL35994903A PL207183B1 PL 207183 B1 PL207183 B1 PL 207183B1 PL 359949 A PL359949 A PL 359949A PL 35994903 A PL35994903 A PL 35994903A PL 207183 B1 PL207183 B1 PL 207183B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
group
closo
dicarb
undecaborano
metallocarboranyl
Prior art date
Application number
PL359949A
Other languages
English (en)
Other versions
PL359949A1 (pl
Inventor
Zbigniew J. Leśnikowski
Agnieszka Olejniczak
Original Assignee
Ct Mikrobiologii I Wirusologii Polskiej Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ct Mikrobiologii I Wirusologii Polskiej Akademii Nauk filed Critical Ct Mikrobiologii I Wirusologii Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL359949A priority Critical patent/PL207183B1/pl
Priority to PCT/PL2004/000030 priority patent/WO2004096824A2/en
Priority to MXPA05011909A priority patent/MXPA05011909A/es
Priority to US10/555,351 priority patent/US8026348B2/en
Priority to CA002524585A priority patent/CA2524585A1/en
Priority to EP04730776A priority patent/EP1636247A2/en
Publication of PL359949A1 publication Critical patent/PL359949A1/pl
Publication of PL207183B1 publication Critical patent/PL207183B1/pl

Links

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy struktur, metod syntezy i zastosowania nukleozydów i oligonukleotydów zawierających klastery boru w połączeniu z metalami i innymi pierwiastkami oraz ich izotopami.
Nukleozydy i nukleotydy, komponenty kwasów nukleinowych oraz oligonukleotydy, krótkie fragmenty kwasów nukleinowych znajdują szereg zastosowań min. w biologii, medycynie i nanotechnologii [Agrawal, 1996; Cotter, 1996; Crooke, 1995; Ells, 1996; Jefferies i De ClercQ, 1995; Keller i Manak, 1993; Niemeyer, 1997; Seeman i inni, 1998; Wiedbrauk i Farkas, 1995).
Ze względu na specyficzne wymagania zależne od określonych zastosowań naturalne nukleozydy, nukleotydy i oligonukleotydy poddawane są modyfikacjom w celu uzyskania pożądanych właściwości. Modyfikacji poddany może być każdy element nukleozydu, nukleotydu i oligonukleotydu, a mianowicie reszta cukrowa, zasada nukleinowa oraz reszta fosforanowa (Agrawal, 1993; Micklefield, 2001; Shabarova i Bogdanov, 1994; Sanghvi i Cook, 1994; Uhlmann, E., Peyman, A., 1990).
Jedna z modyfikacji nukleozydów, nukleotydów i oligonukleotydów polega na przyłączeniu boru, szczególnie w postaci klasterów zawierających bor, takich jak karborany. Grupa karboranylowa może być przyłączona do nukleozydu bezpośrednio lub za pomocą łącznika. Większość nukleozydów modyfikowanych grupą karboranylową to nukleozydy pirymidynowe (Lesnikowski i Schinazi, 1995; Tjarks, W., 2000).
Jak dotąd opracowano trzy typy modyfikacji oligonukleotydów zawierających grupę karboranylowa (C2B10H11-): 1) CBMP-oligonukleotydy (zawierają grupę karboranylową przyłączoną do atomu fosforu wiązania internukleotydowego), 2) CDU-oligonukleotydy (zawierają grupę karboranylową przyłączoną do zasady nukleinowej; Fulcrand-E1 Kattan i inni, 1994; Schinazi i inni, 1994; Lesnikowski i inni, 1996a; Lesnikowski i inni, 1996b; Lesnikowski i inni 1997; Lesnikowski i Schinazi, 1998; Leśnikowski i inni, 1999). Ten typ modyfikacji oligonukleotydów został opatentowany (Schinazi, Fulcrand-E1 Kattan i Lesnikowski, 2001). 3) 2'-CBM-oligonukleotydy (zawierają grupę karboranylową przyłączoną do reszty cukrowej w pozycji 2', Olejniczak i inni, 2002).
Inną grupą modyfikowanych nukleozydów, nukleotydów i oligonukleotydów są pochodne zawierające kompleks metalu (Bigey i inni, 1997;
Dervan i inni, 1988; Dougan i inni, 1997; Dubey i inni, 2000; Hurley i Tor, 1998; Ossipov i inni, 2001; Strobel i inni, 1988; Yu i inni, 2000).
Znane są koniugaty nukleozydów z kompleksami metali i innymi niż karborany ligandami, najczęściej związanymi z nośnikiem na zasadzie oddziaływań niekowalencyjnych, lub też koniugaty zawierające jedynie grupę karboranylową - bez jonu metalu.
U.S. Patent No. 6,180,766 prezentuje nukleozydy i oligonukleotydy zawierające klastery boru. Proponuje się zastosowanie nukleozydów i oligonukleotydów jako nośniki boru dla terapii nowotworów metodą wychwytywania neutronów przez bor (ang. boron neutron capture therapy, BNCT) jak również inne zastosowania w terapii i diagnostyce. Ujawniono tylko pochodne nukleozydów i oligonukleoptydów zawierające grupę karboranylową.
Zgłoszenie WO 2002053571 prezentuje nowe pochodne policyklicznych węglowodorów oraz naftalenodiimidów typu ferrocenu oraz metodę ich wytwarzania, interkalatory zawierające policykliczne węglowodory i naftalenodiimidy typu ferrocenu oraz elektrochemiczną metodę detekcji genów z ich wykorzystaniem. Ujawnione związki są łatwe do otrzymania i oczyszczania po syntezie i są użytecznymi interkalatorami w stosunku do dwuniciowych DNA i RNA o strukturze podwójnej helisy. Wzmiankowane pochodne policyklicznych węglowodorów typu ferrocenu mogą zawierać w pierścieniu zarówno podstawniki elektronodonorowe jak i elektronoakceptorowe.
Opisano jedynie pochodne typu ferrocenu, a zaproponowany element modyfikujący wbudowywany jest w cząstkę kwasu nukleinowego na zasadzie słabych oddziaływań interkalacyjnych, co znacznie ogranicza możliwość stosowania proponowanych związków. Przedmiotem JP 2001064298 jest synteza koniugatów oligonukleotydów i ferrocenu i ich wykorzystanie do elektrochemicznej detekcji DNA. Ujawniono metodę otrzymywania aktywnych konduktywnie lub elektrochemicznie oligonukleotydów. Oligonukleotydy przekształcane są w formę rozpuszczalną w rozpuszczalnikach organicznych w wyniku solwatacji na drodze tworzenia par jonowych z odpowiednimi lipidami a nastę pnie poddawane reakcji z odpowiednim związkiem typu estru kwasu ferrocenomonokarboksylowego i imidu kwasu N-hydroksy bursztynowego. Opisano metodę otrzymywania koniugatów oligonukleotydów zawierających jon metalu, ale zakres stosowania metody ograniczony jest tylko do wprowadzania żelaza do oligonukleotydu.
PL 207 183 B1
W zgłoszeniu US 5599796 opisano metodę i związki, które mogą być wykorzystane do leczenia nowotworów układu moczopłciowego, a w szczególności nowotworów prostaty, pęcherza moczowego i nerek, za pomocą BNCT. Jako noś niki boru proponuje się modyfikowane borem nukleozydy, w szczególnoś ci takie, które są wystarczają co lipofilowe aby przeniknąć przez membrany ukł adu moczopłciowego w ilości koniecznej dla osiągnięcia efektu terapeutycznego przy zastosowaniu naświetlań wiązką neutronów o niskiej energii. Przykładowymi związkami są: 5-karboranylo-2'-deoksyurydyna (CDU) i 5-o-karboranylo-1-(2-deoksy-2-fluoro-beta-D-arabinofuranozylo)uracyl (CFAU), a także nukleozydy i nukleotydy zawierające grupę -O-[(karboran-1-yl)alkilo]fosforanową, -S-[(karboran-1-yl)alkilo]tiofosforanową, -Se-[(karboran-1-yl)alkilo]selenofosforanową lub (karboran-1-yl)fosfonianową. Proponuje się także wykorzystanie oligonukleotydów o określonej sekwencji, zawierających jedno lub kilka wiązań 3',5' internukleotydowych zawierających grupę (karboran-1-yl)fosfonianową jako czynników antysensowych umożliwiających selektywną modulację ekspresji wybranych genów. Proponowana terapia polega na podaniu odpowiedniego związku zawierającego bor na drodze iniekcji, doustnie lub w inny sposób umożliwiający akumulację związku w tkance nowotworowej po czym nowotwór naświetlany jest wiązką neutronów o niskiej energii.
Przedmiotem zgłoszenia JP 2002080491 jest synteza elektrofilowych analogów nukleotydów zawierających bor oraz ich prekursorów. Opisywane tam analogi nukleotydów o podanej strukturze (HO)2BX[P(O)(O-)O]nNu (I; Nu = reszta nukleozydyIowa; X = CF2, CH2; n = 2, 3) otrzymywane są na drodze difluorometylowania substratu o ogólnej strukturze HP(O)(OR1)2 (R1 = alkil), następnie reakcji ze związkiem (R2O)3B (R2 = niższe alkile), odblokowania, ponownego zablokowania przy użyciu 1,2-dioli, sprzężenia z odpowiednim nukleozydem, a następnie końcowego odblokowania. Przedmiotem zgłoszenia US5130302 są modyfikowane borem nukleozydy, nukleotydy i oligonukleotydy i ich zastosowania. Proponowana jest nowa klasa biologicznie aktywnych farmaceutyków o strukturze modyfikowanych nukleozydów i nukleotydów zawierających bor. Wzmiankowane nukleozydy i nukleotydy modyfikowane są podstawnikami zawierającymi bor, przyłączonymi do endoaminowych atomów azotu purynowych i pirymidynowych zasad nukleinowych lub ich analogów. Proponuje się także metodę syntezy oligonukleotydów zawierających wspomniane wyżej modyfikowane nukleozydy, oraz przykłady ich zastosowań.
Oba cytowane opisy proponują metodę syntezy niektórych pochodnych nukleozydów zawierających tylko jeden atom boru. Nie pozwala ona na wbudowanie większej ilości atomów boru ani innych metali.
Zgłoszenie US5466679 prezentuje pochodne urydyny zawierające grupę karboranylową oraz ich zastosowanie w BNCT. Proponuje się pochodne nukleozydów np. urydyny oraz pochodne aminokwasów modyfikowanych grupą karboranylową, posiadających potencjalną zdolność do wbudowywania się na drodze enzymatycznej do kwasów nukleinowych i białek komórek nowotworowych ich wykorzystanie w BNCT.
Przedmiotem opisu US5171849 jest 2'- i 3'-karboranylourydyna i jej addukty z eterem dietylowym: Proponuje się metodę syntezy 2'- i 3'-karboranylourydyny i jej adduktów z eterem dietylowym. Wspomniane związki charakteryzują się podwyższoną lipofilowością i mogą być wykorzystane jako nośniki boru w BNCT.
W opisie US5405598 proponuje się nowe związki zawierające grupę karboranylową, które mogą być wykorzystane jako nośniki boru w BNCT.
Proponowane w tych trzech opisach związki zawierają co prawda 10 razy więcej boru niż opisane wcześniej, ale nadal dwa razy mniej niż proponowane w niniejszym zgłoszeniu. Dodatkowo zaproponowana metoda pozwala na wbudowanie do modyfikowanej biocząsteczki jonów metali, co nie było uprzednio rozważane.
Celem wynalazku jest dostarczenie nowych związków, będących modyfikowanymi nukleozydami lub ich pochodnymi, zawierających kompleks metalu, w którym ligandem byłby klaster metalu, korzystnie boranowy, w szczególności grupę metalokarboranylową. Zastosowanie grupy metalokarboranylowej jest wysoce pożądane, gdyż może ona zawierać wyjątkowo dużo atomów boru lub innych metali bądź pierwiastków, oraz ich jonów czy też izotopów. Pozwoliłoby to uzyskać dodatkowe walory użytkowe nowych związków.
Tak określony cel został nieoczekiwanie zrealizowany w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest pochodna nukleozydu zawierająca grupę metalokarboranylową przyłączoną przynajmniej do jednej grupy wybranej spośród: zasady nukleinowej, reszty cukrowej, lub analogu reszty cukrowej. Korzystnie zasadą nukleinową jest puryna albo pirymidyna albo ich pochodna, szczególnie
PL 207 183 B1 korzystnie zasadą nukleinową jest tymina, uracyl, 5-halouracyl, cytozyna, 5-halocytozyna, adenina, guanina, 2,6-diaminopuryna, 2-amino-6-chloropuryna, 2-aminopuryna, 5-alkilouracyl, 5-alkilocytozyna, 2-tiouracyl, 2,4-ditiouracyl albo 4-tiouracyl. Korzystnie grupa metalokarboranylowa zawiera atom metalu (Me) wybrany spośród Sn, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Sc, Cr, Mg, Zr, Mo, Sm, Yb, Hf, W, Hg, Gd, U oraz Y albo niemetal wybrany spośród As, S, Si, Se, Te, P, Sb, Bi, Ge oraz N, lub ich izotopów.
Szczególnie korzystnie grupa metalokarboranylowa jest przyłączona do cząsteczki nukleozydu bezpośrednio lub za pomocą łącznika, korzystnie o wzorze -[(CH2)n-(W)m]k- gdzie n wynosi od 0 do 5, m wynosi 0 albo 1, k wynosi od 1 do 6, natomiast W jest O, S, S(O), S(O)2, Se, NR (gdzie R = H, alkil, haloalkil, alkoksyalkil lub aryl), X-P(Z)(Y)O (gdzie X = O, S, Se; Z = O, S, Se; Y = OH, SH, SeH lub alkil, haloalkil, alkoksyalkil, aryl lub halogen, w szczególności fluor), a także CH=CH, CC, N=N, CHOH i CHN3. W szczególnie korzystnej pochodnej nukleozydu wedł ug wynalazku grupa metalokarboranylowa jest grupą -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-Me-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} lub -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3-Mecyklopentadienylową]}, przy czym szczególnie korzystnie grupa metalokarboranylowa jest grupą - {8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} lub -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3-kobalt-cyklopentadienylową]}. Pochodna nukleozydu pirymidynowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera grupę 3N lub 4-O-{dietylenoksy-{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]}. Korzystnie pochodna nukleozydu według wynalazku charakteryzuje się tym, że co najmniej jedna z grup hydroksylowych (-OH) reszty cukrowej lub jej analogu została zastąpiona grupą o strukturze -OP(Z)(Y)X (Z = O, S, Se; Y = OH, SH, SeH lub alkil, haloalkil, alkoksyalkil, aryl lub halogen; X = OH, SH, SeH lub alkil, haloalkil, alkoksyalkil, aryl lub halogen) albo -OP(Y)X [Y = alkil, haloalkil, alkoksyalkil (-Oalkil), aryl, aryloksyl (-Oaryl), NR2 lub halogen; X =alkil, haloalkil, alkoksyalkil (-Oalkil), aryl, aryloksyl (-Oaryl), NR2 lub halogen]. Równie korzystnie pochodna nukleozydu według wynalazku jest nukleotydem, korzystnie mono-, di- albo trójfosforanem nukleozydu. W korzystnej pochodnej nukleozydu według wynalazku wolne grupy hydroksylowe reszty cukrowej lub jej analogu oraz grupy aminowe zasady nukleinowej zabezpieczone są grupami ochronnymi, umożliwiając wykorzystanie nukleotydu w syntezie DNA- i RNA-oligonukleotydów. Równie korzystnie grupa metalokarboranylowa jest przyłączona bezpośrednio lub za pomocą łącznika do atomu fosforu nukleotydu. Przedmiotem wynalazku jest także związek wybrany spośród 5'-O-monometoksytrytyIo-3'-O-acetylo-3-N-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (24a), 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-acetylo-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (24b), 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (28b), 8-dioksano-O-COSAN (23), 5'-O-monometoksytrytylo-4-O-(bisetoksy-8-COSAN)tymidyny (25a), amidofosforyn 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-(N,N-5-diizopropylo-O-cyjanoetylo)-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidyny (26).
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nukleozyd modyfikowany grupą metalokarboranylową może być nukleozydem naturalnym, występującym w naturze, np. tymidyną, deoksycytydyną, deoksyadenozyną, deoksyguanozyną wraz z ich odpowiednikami w serii rybonukleozydów, lub też jego syntetycznym analogiem zmienionym tak w obrębie zasady nukleinowej jak i reszty cukrowej, np. nukleozydem acyklicznym czy też zawierać modyfikowaną zasadę nukleinową. Wymienione w opisie nukleozydy są jedynie przykładami i nie wyczerpują przedmiotu niniejszego wynalazku.
Zgodnie ze szczególną realizacją niniejszego wynalazku, metalokarborany mogą zawierać co najmniej jeden klaster boru oraz jeden lub więcej jon metalu lub pełniący jego funkcję atom lub jon niemetalu.
Przedmiotem wynalazku jest także modyfikowany DNA- lub RNA-oligonukleotyd o długości od 2 do 40 jednostek nukleotydowych zawierający co najmniej jedną grupę metalokarboranylową przyłączoną do zasady nukleinowej, wiązania internukleotydowego lub reszty cukrowej. Korzystnie, modyfikacja zawierająca grupę metalokarboranylową jest przyłączona do 3'-terminalnego nukleotydu, lub też znajduje się przy końcu 3' łańcucha oligonukleotydowego, albo równie korzystnie modyfikacja zawierająca grupę metalokarboranylową jest przyłączona do 5'-terminalnego nukleotydu, lub też znajduje się przy końcu 5' łańcucha oligonukleotydowego, albo równie korzystnie modyfikacja zawierająca grupę metalokarboranylową znajduje się w środkowej części łańcucha oligonukleotydowego. Korzystnie modyfikowany oligonukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że grupa metalokarboranylowa zawiera atom metalu (Me) wybrany spośród Sn, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Sc, Cr, Mg, Zr, Mo, Sm, Yb, Hf, W, Hg, Gd, U oraz Y albo niemetal wybrany spośród As, S, Si, Se, Te, P, Sb, Bi, Ge oraz N, lub ich izotopów. Korzystnie, modyfikowany oligonukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że grupa metalokarboranylowa jest przyłączona do cząsteczki nukleozyPL 207 183 B1 du bezpośrednio lub za pomocą łącznika, korzystnie o wzorze -[(CH2)n-(W)m]k- gdzie n wynosi od 0 do 5, m wynosi 0 albo 1, k wynosi od 1 do 6, natomiast W jest O, S, S(O), S(O)2, Se, NR (gdzie R = H, alkil, haloalkil, alkoksyalkil lub aryl), X-P(Z)(Y)O (gdzie X = O, S, Se; Z = O, S, Se; Y = OH, SH, SeH lub alkil, haloalkil, alkoksyalkil, aryl lub halogen, w szczególności fluor), a także CH=CH, CC, N=N, CHOH i CHN3. Korzystnie modyfikowany oligonukleotyd wed ł ug wynalazku zdolny jest do hybrydyzacji in vitro i/lub in vivo do komplementarnej sekwencji DNA lub RNA, korzystniej jest zdolny do hybrydyzacji in vivo do komplementarnej sekwencji dwuniciowego DNA. Korzystnie, modyfikowany oligonukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że grupa metalokarboranylowa jest grupą -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-Me-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} lub -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3-Mecyklopentadienylową]}. Korzystnie, modyfikowany oligonukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że grupa metalokarboranylowa jest grupą -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} lub -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3-kobalt-cyklopentadienylową]}. Korzystnie, modyfikowany oligonukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera grupę 3N- lub 4-O-{dietylenoksy-{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]}. Korzystnie, modyfikowany oligonukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera 3N- lub 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidynę (BCCoT). W jednej z korzystnych realizacji, modyfikowany oligonukleotyd według wynalazku jest 5'-d(BCCoTGCTGGTTTGGCTG)-3'.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, oligonukleotydy modyfikowane grupą karboranylową obejmują oligonukleotydy naturalne typu DNA i RNA jak również oligonukleotydy modyfikowane zarówno w obrębie zasady nukleinowej, reszty cukrowej jak i wiązania internukleotydowego. Przykładami, nie wyczerpującymi przedmiotu niniejszego wynalazku są analogi tiofosforanowe, metylofosfonianowe, peptydowe (PNA), zawierające co najmniej jedną z wymienionych modyfikacji.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu, charakteryzujący się tym, że nukleozyd lub jego analog z odpowiednio zablokowanymi grupami hydroksylowymi i posiadający przynajmniej jedn ą grupę ketonową zdolną do uczestniczenia w równowadze ketoiminowej i/lub aminową albo hydroksylową zasady azotowej miesza się z 8-dioksano-{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-Me-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anem]}, lub z 8-tetrahydrofurano-{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-Me-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anem]} w środowisku bezwodnym dodaje się silną zasadę nieorganiczną lub organiczną typu DBU, BDDDP oraz węglowodór lub jego pochodną o temperaturze topnienia od -100 do 150 celcjuszy i prowadzi się reakcję w temperaturze od 0 do 100 celcjuszy, a uzyskany produkt wydziela się i odbezpiecza się grupę 3' lub 5' albo obie 3' i 5' grupy hydroksylowe. Korzystnie, w sposobie według wynalazku jako zasadę stosuje się wodorek sodu, glinowodorek sodu albo t-butanolan potasu. Równie korzystnie, w sposobie według wynalazku jako węglowodór stosuje się toluen, ksyleny, mezytylen, heksametylobenzen i naftalen. Równie korzystnie, w sposobie według wynalazku atom (Me) wybiera się spośród metali Sn, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Sc, Cr, Mg, Zr, Mo, Sm, Yb, Hf, W, Hg, Gd, U oraz Y albo niemetali As, S, Si, Se, Te, P, Sb, Bi, Ge oraz N, lub ich izotopów. Równie korzystnie, w sposobie według wynalazku zasadą azotową jest puryna albo pirymidyna albo ich pochodna, szczególnie korzystnie zasadą nukleinową jest tymina, uracyl, 5-halouracyl, cytozyna, 5-halocytozyna, adenina, guanina, 2,6-diaminopuryna, 2-amino-6-chloropuryna, 2-aminopuryna, 5-alkilouracyl, 5-alkilocytozyna, 2-tiouracyl, 2,4-ditiouracyl albo 4-tiouracyl. Równie korzystnie, w sposobie według wynalazku uzyskany nukleozyd fosforyluje się lub fosfityluje i/lub przyłącza się do oligonukleotydu. W niniejszym wynalazku proponuje się całkowicie nowy typ koniugatów nukleozydów, nukleotydów i oligonukleotydów zarówno pirymidynowych jak i purynowych zawierających metal w postaci grupy metalokarboranylowej oraz prawie dwa do osiemnastu razy więcej boru na każdą grupę modyfikującą niż to było możliwe do tej pory. Ze względu na unikalne właściwości klasterów boranowych tworzą one kompleksy z całą gamą metali takich jak Sn, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Sc, Cr, Mg, Zr, Mo, Sm, Yb, Hf, W, Hg, Gd, U oraz Y i inne oraz związki z wieloma niemetalami takimi jak As, S, Si, Se, Te, P, Sb, Bi, Ge oraz N, lub ich izotopów, i inne (Grimes, 1995; Hall i inni, 2000; Hosmane i Maguire, 1987; Housecroft, 1990; Saxena i Hosmane, 1993).
Zaprezentowane w niniejszym wynalazku nukleozydy, oligonukleotydy oraz oligonukleotydy modyfikowane grupą metalokarboranylową mogą znaleźć wiele potencjalnych zastosowań, przykładowo jako: modyfikowane startery do amplifikacji DNA i cDNA in vitro, leki, nośniki boru dla terapii nowotworów metodą wychwytywania neutronów przez bor (BNCT), nośniki izotopów pierwiastków wykorzystywanych w różnych rodzajach radioterapii, sondy molekularne, elementy bioczujników, ma6
PL 207 183 B1 teriały dla nanotechnologii oraz wiele innych zastosowań, które są do przewidzenia przez specjalistę w oparciu o znane właściwości składników wchodzących w skład zaprezentowanych związków.
Dla lepszego zilustrowania istoty wynalazku oraz umożliwienia jego realizacji opis uzupełniony został figurami.
Na figurze 1 przedstawiona została synteza 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-acetylo-3-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (24a) i 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-acetylo-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (24b) oraz 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (28b).
Na figurze 2 przedstawiona została synteza modyfikowanego monomeru: 5'-O-monodetoksytrytylo-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidyny 3'-O-(N,N-diizopropylo-beta-cyjanoetylo)-amidofosforynu (26).
Na figurze 3 przedstawione zostało widmo UV 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (28b).
Figura 4 prezentuje chromatogram HPLC 4-O-(bisetoksy-8-COSAN)tymidyny (28b).
Figura 5 przedstawia widmo masowe (FAB) 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidyny (28b).
Figura 6 prezentuje widmo masowe (FAB) 5'-monometoksytrytylo-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidyny 3'-O-(N,N-diizopropylo-2-cyjanoetylo)amidofosforynu (26).
Na figurze 7 przedstawiona została synteza tetradekanukleotydu 5'-d(BECTGCTGGTTTGGCTG)-3' komplementarnego do fragmentu genomu wirusa cytomegalii (HCMV) (27) zawierającego 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidynę (BECT).
P r z y k ł a d 1. Synteza 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-acetylo-4-O-(bisetoksy-8-COSAN)tymidyny (24a) i 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-acetylo-3-N-(bisetoksy-8-COSAN)tymidyny (24b). (Figura 1)
5'-O-Monometoksytrytylo-3'-O-acetylotymidynę (22), (0,9 g, 1,6 mmola) oraz 8-dioksano-O-COSAN (23) (1,4 g, 3,3 mmola) zmieszano razem i suszono pod próżnią pompy olejowej nad pięciotlenkiem fosforu przez po czym dodano wodorek sodu (zawiesina w oleju, 80 mg, 3,3 mmola). Do suchej mieszaniny substratów dodano toluen i całość ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 8-24 godzin. Po schłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do temperatury pokojowej odwirowano nadmiar wodorku sodu i odparowano. Surowy produkt (ok. 2,4 g) oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, jako eluent stosowano metanol w chloroformie. Izomer 24a:
Wydajność: 450 mg (29%). TLC (CH3CN/CHCI3, 1:2): Rf= 0,41; UV (CH3CN): lambda,™ = 252,46 nm, lambdamax = 235,25 nm, 280,74 nm, 311,07 nm; delta 1H-NMR (C6D6): 1,50-4,00 (bm, 21H, BH-metalokarboran), 1,48 (s, 3H, CH3 w pozycji 5 tyminy), 1,62 (s, 3H, CH3CO), 2,55 (m, 2H-2'), 2,77-3,07 (m, 4H, 4 x CH-metalokarboran), 3,21 (bs, 4H, 2 x OCH2), 3,37 ( s, 3H, CH3O), 3,45-3,51 (q, 2H-5',5, J5'5'' = 9,04), 3,88 (bs, 2H, OCH2), 4,08 (s, 1H-4'), 4,37-4,43 (m, 2H, OCH2), 5,43 (s, 1H-3'), 6,64 (s, 1H-F), 6,82 (d, 2H, □-H arom. gr. 4-CH3OPh), 7,06-7,52 (m, 12H, H arom.gr. MMTr), 8,20 (s, 1H-6); delta 13C-NMR (C6D6): 12,33 (CH3 w pozycji 5 tyminy), 21,09 (CH3 gr. CH3CO), 40,22 (C-2'), 48,12, 51,85, 51,95 (C-metalokarboran), 55,60 (CH3O), 64,43 (C-5'), 68,27, 71,68, 73,26 (OCH2), 75,53 (C-3'), 85,97 (C-4'), 87,75 ( C-1'), 88,56 (C-metylidenowy gr. MMTr), 114,55, 129,14, 129,23, 129,55, 131,41, 142,33, 144,94, 145,09, (MMTr), 135,95 (C-6), 158,93 (C-2), 160,21 (C4 gr. 4-CH3OPh), 170,58 (C-4), 172,52 (CO gr. CH3CO); □11B-NMR (CeD6); 30,50-32,00 (bs, 18B); FAB-MS (-VE, NBA) 966,9 [M-1]. Izomer 24b: Wydajność: 300 mg (19%). TLC (CH3CN/CHCI3, 1:2): Rf = 0,14; UV (CH3CN): lambdamin = 225,41,246,72, 290,16 nm, lambdamax = 234,02, 258,20, 313,93 nm; delta 1H-NMR (C6D6): 1,8-3,5 (bm, 21H, BH-metalokarboran), 1,58 (s, 3H, CH3CO), 1,71 (s, 3H, CH3 w pozycji 5 tyminy), 2,54 (m, 2H-2'), 2,95-3,08 (m, 4H, 4 x CH-metalokarboran), 3,28-3,41 (bs, 4H, 2 x OCH2), 3,43 (s, 3H, CH3O), 3,46-3,52 (q, 2H-5',5), 3,92 (bs, 2H, OCH2), 3,96 (s, 1H-4'), 4,48-4,59 (m, 2H, OCH2), 5,36 (s, 1H-3'), 6,31 (s, 1H-1'), 6,87 (d, 2H, □-H arom. gr. 4-CH3OPh), 7,28-7,60 (m, 12H, H arom. gr. MMTr), 8,11 (s, 1H-6); delta 13C-NMR (C6D6): 13,62 (CH3 w pozycji 5 tyminy), 20,99 (CH3 gr. CH3CO), 39,76 (C-2'), 48,10, 51,94 (C-metalokarboran), 55,72 (CH3O), 64,61 (C-5'), 68,73, 73,48 (OCH2), 75,67 (C-3'), 86,41 (C-4'), 87,46 ( C-1'), 88,74 (C-metylidenowy gr. MMTr), 114,65, 129,23, 131,40, 144,85, 145,06 (MMTr), 135,92 (C-6), 156,91 (C-2), 160,24 (C4 gr. 4-CH3OPh), 170,30 (CO gr. CH3CO), 176,38 (C-4); delta 11B-NMR (C6D6); 30,50-32,00 (bs, 18B); FAB-MS (-VE, NBA) 966,9 [M-1].
W analogiczny sposób do nukleozydu tak w obrębie zasady nukleinowej puryny lub pirymidyny, jaki i reszty cukrowej wprowadzić można inne rodzaje metalokarboranów.
P r z y k ł a d 2. Synteza 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidyny (28).
Do roztworu 5'-O-monometoksytrytylo-4-O-(bisetoksy-8-COSAN)tymidyny (24a) (0,1 g, 0,1 mmola) w acetonitrylu (5 mL) dodano 80% kwas octowy (10 mL). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej po czym odparowano rozpuszczalnik pod próżnią pompy wodnej. Surowy produkt 28 oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując jako eluent liniowy
PL 207 183 B1 gradient metanolu w chloroformie. Frakcje zawierające pożądany produkt połączono razem, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność: 40 mg (58%). TLC (CHCI3/CH3OH, 8:2):
Rf = 0,18; UV (CH3CN): lambdamin = 237,93 nm, lambdamax = 282,76 nm, lambdamax = 310,67 nm; delta 1H-NMR (CD3OD): 1,2-3,2 (bm, 21H, BH-metalokarboran), 2,02 (s, 3H, CH3 w pozycji 5 tyminy), 2,16-2,21 (m 1H-2'), 2,40-2,44 (m, 1H-2), 3,60-3,65 (m, 4H, 2 x OCH2), 3,73-3,76 (dd, 1H-5'), 3,82-3,85 (m, 3H, 1H-5 i OCH2), 3,96 (q, 1H-4'), 4,13 (s, 2H, 2 X CH-metalokarboran), 4,38-4,39 (m, 1H-3'), 4,42-4,46 (m, 1H, OCH2), 4,52-4,56 (m, 1H, OCH2), 6,26 (t, 1H', J1'2' = 6,36), 8,13 (s, 1H-6); delta 13C-NMR (CD3OD): 12,40 (CH3 w pozycji 5 tyminy), 42,24 (C-2'), 48,04 (C-metalokarboran), 55,15 (C-metalokarboran), 62,54 (C-5'), 68,13 (OCH2), 69,83 (OCH2), 69,98 (OCH2), 71,69 (C-3'), 73,07 (OCH2), 87,97 (C-1'), 89,11 (C-4'), 142,08 (C-6), 158,20 (C-2), 172,16 (C-40); delta 11B-NMR (CD3OD) (z odsprzęganiem H): 28,54 (s), 10,30 (s), 6,33 (s), 3,48 (s), 1,32 (s), od -1,59 do -2,19 (d), -11,47 (s), -14,68 (s); FAB-MS (-VE, NBA) 652,6 [M-1].
P r z y k ł a d 3. Synteza amidofosforynu 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-(N,N-diizopropylo-betacyjanoetylo)-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidyny (26) (patrz figura 2).
5'-O-Monometoksytrytylo-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidynę (25a) (0,1 g, 0,1 mmola) suszono pod próżnią pompy olejowej, a następnie rozpuszczono w chlorku metylenu (1,3 mL) i dodano W,W-diizopropyloetyloaminę (75 gL, 0,54 mmola). Do otrzymanego roztworu dodano kroplami odczynnik fosfitylujący (beta-cyjanoetylo)(W,W',-diizopropyloamino)chlorofosfinę (72 gL, 0,3 mmola). Postęp reakcji kontrolowano za pomocą TLC. Reakcję zakończono po 4 godzinach poprzez dodanie do mieszaniny reakcyjnej bezwodnego metanolu. Mieszaninę rozcieńczono chlorkiem metylenu do objętości 4 mL. Roztwór ekstrahowano 5% wodorowęglanem sodu fazę organiczną oddzielono i suszono bezwodnym siarczanem magnezu. Odsączony środek suszący przemyto chlorkiem metylenu zawierającym trietyloaminę (1%, 3x4 mL). Po odparowaniu rozpuszczalnika surowy produkt (0,1 g) oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Jako eluent zastosowano mieszaninę acetonitryl/chlorek metylenu. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano rozpuszczalniki, pozostałość suszono pod próżnią pompy olejowej. Wydajność: 78 mg (60%). TLC (CH3CN/CH2CI2, 1:3): Rf= 0,25; UV (CH3CN): lambdamin = 255,17 nm, lambdamax = 281,61 nm, 311,25 nm; delta 31P-NMR (C6D6): 149,01, 149,82 (1:1); FAB-MS [-VE, NBA] 1177 [M + 2Na].
P r z y k ł a d 4. Synteza oligonukleotydu modyfikowanego grupą 4-O-{2-(2-etoksy)etoksy-{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3 '-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} (III), [4-O-(dietylenoksy-8-COSAN), Baco]: 5'-d(BCCoTGCTGGTTTGGCTG)-3' (27) (patrz figura 7)
Syntezę niemodyfikowanego fragmentu oligonukleotydu wykonano stosując standardową metodę syntezy na fazie stałej. Przyłączenie modyfikowanego monomeru, amidofosforynu O-monometoksytrytylo-3'-O-(N,N-diizopropylo-beta-cyjanoetylo)-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (26) oraz etap utlenienia i „kapowania, wykonano ręcznie. W celu aktywowania monomeru 26 do roztworu 26 (20 mg, 0,02 mmola) w bezwodnym acetonitrylu dodano roztwór 1-H-tetrazolu w bezwodnym acetonitrylu (0,5 M, 90 gL, 0,045 mmola). Zaktywowany monomer 26 wprowadzono do kolumny za pomocą strzykawki, po zakończeniu reakcji kolumnę przemyto acetonitrylem (2x5 mL) i suszono pod próżnią pompy olejowej. Po etapie utlenienia kolumnę przemyto acetonitrylem i suszono na linii próżniowej. Modyfikowany oligomer 27 z pozostawioną grupą 5'-MMTr odcinano od złoża za pomocą 30% wodnego roztworu amoniaku w ciągu 1 godziny po czym usunięto grupy ochronne zasad nukleinowych przez ogrzewanie w tym samym roztworze w temperaturze 50 °C przez 2 godziny. Roztwór 5'-blokowanego oligonukleotydu 27a odparowano do sucha w wirówce próżniowej, a następnie rozpuszczono w wodzie i oczyszczano za pomocą RP-HPLC stosując gradient acetonitrylu w 0,1 M buforze TBAF. Szybkość przepływ eluenta 1 mL/min, stosowano detekcję UV przy długości fali lambda = 266 nm. Frakcje zawierające oczyszczony oligomer 27a połączono i odparowano do sucha. Grupę 5'-MMTr usuwano dodając do 5'-blokowanego oligonukleotydu 80% kwas octowy (1 mL), próbkę inkubowano 20 minut w temperaturze pokojowej po czym zatężono do sucha i wykonano drugi etap oczyszczania za pomocą RP-HPLC.
Spis wybranej literatury.
Agrawal, S., ed., Antisense Therapeutics. (1996). Humana Press, Totowa, N.J.
Agrawal, S., ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogs. Synthesis and Properties. (1993). Humana Press Inc., Totowa, N.J.
Bigey P., Holst Sonnichsen, S., Meunier, B., Nielsen, P.E. DNA binding and cleavage by a cationic manganese porphirin-peptide nucleic acid conjugate. Bioconjugate Chem., 8, 267-270, (1997).
PL 207 183 B1
Cotter, F.E., ed., Molecular Diagnosis of Cancer. (1996). Humana Press, Totowa, N.J. Crooke, S.T. Therapeutic Applications of Oligonucleotides. (1995). Springer-Verlag, New York.
Mack, D.P., Iverson, B.L., Dervan, P.B. Design and chemical synthesis of a sequencespecific DNA-cleaving protein.. J. Am. Chem. Soc, 110, 7572-7474, (1988).
Dougan, H., Hobbs, J.B., Weitz, J.I., Lyster, D.M. Synthesis and radioiodination of stannyl oligodeoxyribonucleotide. Nucl. Acids. Res., 25, 2897-2901, (1997).
Dubey, I., Pratviel, G., Meunier, B. Synthesis and DNA cleavage of 2'-O-amino-linked metalloporphirin-oligonucleotide conjugates. J. Chem. Soc. Perkin Transactions, Iss 18, 3088-3095, (2000).
Ehrlich, G.D., Greenberg, S.J. PCR-Based Diagnostics in Infectious Disease. (1994).
Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK.
Elles, R., ed., Molecular Diagnosis of Genetic Diseases. (1996). Humana Press, Totowa, N.J.
Fulcrand-El Kattan, G., Leśnikowski, Z.J., Yao, S., Tanious, F., Wilson, W.D., Shinazi, R.F. Carboranyl Oligonucleotides. 2. Synthesis and Physicochemical Properties of Dodecathymidylate Containing 5-(o-Carboranyl-1-yl)-2'-O-Deoxyuridine. J. Am. Chem. Soc, 116, 7494-7501,(1994).
Grimes, R.N. „Transition Metal Metallacarboranes in „Comprehensive organometallic Chemistry II, Vol. 1. (1995). Housecroft, C.E., ed. Pergamon, pp. 373-430.
Hall I.H., Tolmie C.E., Barnes B.J., Curtis M.A., Russell J.M., Finn M.G., Grimes R.N. Cytotoxicity of tantalum (V) and niobium (V) small carborane complexes and mode of action in P388 lyphocytic leukemia cells. Applied Organometallic Chem., 14, 108-118, (2000).
Hosmane, N.S., Maguire, J.A. „Recent Advances in the Chemistry of Main Group Heterocarboranes in „Advances in Boron and the Boranes. (1987). Liebman, J.F., Greenberg, A., Williams, R.E., ed. VCH., str. 297-329.
Hurley, D.J., Tor, Y. Metal-containing oligonucleotides: Solid-Phase synthesis and luminescence properties. J. Am. Chem. Soc, 120, 2194-2195, (1998).
Housecroft, CE. Boranes and metalloboranes - Structure, bonding and reactivity. (1990).
John Wiley and Sons, New York, N.Y.
Jefferies D.J., De Clerq, E., ed., Antiviral Chemotherapy. (1995).
John Wiley and Sons, Chichester UK.
Keller, G.H., Manak, M.M. DNA Probes. Background, applications and procedures. (1993). M Stockton Press, New York, N.Y.
Lesnikowski, Z.J., Schinazi, R.F. Carboranyl Oligonucleotides. 1. Synthesis of Thymidine(3',5')thymidine (o-carboranyl-1-yl)methylphosphonate. J. Org. Chem., 58: 6531-6534,(1993).
Lesnikowski, Z.J. and Schinazi, R.F. Boron Neutron Capture Therapy of Cancers: Nucleic Bases, Nucleosides, and Oligonucleotides as Potential Boron Carriers. Polish J. Chem. 69, 827-840(1995).
Lesnikowski, Z.J., Fulcrand-El Kattan, G., Lloyd, R.M. Jr., Schinazi, R.F. Biological Properties of Dodeca(thymidine phosphates) Containing 5-(o-Carboran-1-yl)-2'-deoxyuridine. Phosphorus, Sulfur, and Silicon, 109-110, 385-388, (1996a).
Lesnikowski, Z.J., Fulcrand-El Kattan, G., Lloyd, R.M. Jr., Juodawlkis A., Schinazi R.F. Carboranyl Oligonucleotides. 3. Biochemical Properties of Oligonucleotides Containing 5-(o-carboranyl-1-yl)-2'-deoxyuridine. Biochemistry, 35, 5741-5746, (1996b).
Lesnikowski, Z.J., Lloyd, R.M. Jr., Schinazi, R.F. Comparison of Physicochemical Properties of (o-Carboran-1-yl)methylphosphonate and Methylphosphonate Oligonucleotides. Nucleosides and Nucleotides, 16, 1503-1505 (1997).
Lesnikowski, Z.J., Schinazi, R.F. Boron Containing Oligonucleotides. Nucleosides and Nucleotides, 17, 635-648 (1998).
Lesnikowski, Z.J., Shi J., Schinazi R.F. Nucleic acids and nucleosides containing carboranes. J. Organomet. Chem., 581, 156-169 (1999).
Micklefield, J., Backbone modification of nucleic acids: Synthesis, structure and therapeutic applications. Current Med. Chem., 8, 1157-1179 (2001).
Niemeyer, CM. DNA as a Material for Nanotechnology. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 585-587 (1997).
Olejniczak A.B., Koziołkiewicz M., Lesnikowski Z.J., Carboranyl oligonucleotides. 4.
Synthesis, and physicochemical studies of oligonucleotides containing 2'-O-(o-carboran-1-yl)methyl group, Antisense Nucl. Acid Drug Develop., 2002, 12, 79-94.
PL 207 183 B1
Ossipov, D., Pradeepkumar, P.I., Holmer, M., Chattopadhyaya, J. Synthesis of [Ru(phen)2dppz]2+ tethered oligo-DNA and studies on the metallointercalation mode into the DNA duplex. J. Am. Chem. Soc, 123, 3551-3562 (2001).
Sanghvi Y.S., Cook, P.D., ed., Carbohydrate Modifications in antisense research. (1994). American Chemical Society, Washington, D.C
Saxena A.K., Hosmane N.S. Recent Advances in the Chemistry of Carborane Metal Complexes Incorporating d- and f-Block Elements. Chem. Rev., 93, 1081-1124, (1993). Seeman, N., Wang Hui, et al., New motifs in DNA nanotechnology. (1998). Nantechenology 9, 257-273 (1998).
Shabarova, Z., and Bogdanov, A. Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids. (1994). VCH, Weinheim.
Schinazi, R.F., Leśnikowski, Z.J., Fulcrand-El Kattan, G., Wilson, W.D. Carboranyl Oligonucleotides for Antisense Technology and Boron Neutron Capture Therapy of Cancers. American Chemical Society Symposium Series, Vol. 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghvi YS, Cook PD, Eds., Chapter 11, pp. 169-182 (1994).
Schinazi, R.F, Fulcrand-El Kattan, G., Lesnikowski, Z.J. Nucleosides and oligonucleotides containing boron clusters. U.S. Patent No. 6,180, 766 (2001).
Strobel, S.A., Heinz, E.M., Dervan, P.B. Double-strabd cleavage of genomic DNA at a single site by triple-helix formation. J. Am. Chem. Soc, 110, 7927-7929, (1988).
Tjarks, W., The use of boron clusters in the rational design of boronated nucleosides for neutron capture therapy of cancer. J. Organomet. Chem., 614-615, 37-47 (2000).
Uhlmann, E., Peyman, A. Antisense oligonucleotides - A new therapeutic principle. Chem. Rev., 90, 543-584, (1990).
Wiedbrauuk, D.L., Farkas, D.H., ed., Molecular Methods for Virus detection. (1995).
Academic Press, Inc., San Diego, CA.
Yu, C.J., Yowanto, H., Wan, Y., Meade, T.J., Chong, Y., Strong, M., Donilon, L.H., Kayyem, J.F., Gozin, M., Blackbum, G.F. Uridine-conjugated ferrocene DNA oligonucleotides: unexpected cyclization reaction of the uridine base. J. Am. Chem. Soc, 122, 6767-6768, (2000).

Claims (33)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Pochodna nukleozydu zawierająca grupę metalokarboranylową przyłączoną przynajmniej do jednej grupy wybranej spośród: zasady nukleinowej, reszty cukrowej, lub analogu reszty cukrowej.
  2. 2. Pochodna nukleozydu według zastrz. 1, znamienna tym, że zasadą nukleinową jest puryna albo pirymidyna albo ich pochodna.
  3. 3. Pochodna nukleozydu według zastrz. 2, znamienna tym, że zasadą nukleinową jest tymina, uracyl, 5-halouracyl, cytozyna, 5-halocytozyna, adenina, guanina, 2,6-diaminopuryna, 2-amino-6-chloropuryna, 2-aminopuryna, 5-alkilouracyl, 5-alkilocytozyna, 2-tiouracyl, 2,4-ditiouracyl albo 4-tiouracyl.
  4. 4. Pochodna nukleozydu według zastrz. 1, znamienna tym, że grupa metalokarboranylowa zawiera atom metalu (Me) wybrany spośród Sn, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Sc, Cr, Mg, Zr, Mo, Sm, Yb, Hf, W, Hg, Gd, U oraz Y albo niemetal wybrany spośród As, S, Si, Sf, Te, P, Sb, Bi, Ge oraz N, lub ich izotopów.
  5. 5. Pochodna nukleozydu według jednego z zastrz. 1-4, znamienna tym, że grupa metalokarboranylowa jest przyłączona do cząsteczki nukleozydu bezpośrednio lub za pomocą łącznika, korzystnie o wzorze -[(CH2)n-(W)m]k- gdzie n wynosi od 0 do 5, m wynosi 0 albo 1, k wynosi od 1 do 6, natomiast W jest O, S, S(O), S(O)2, Se, NR (gdzie R = H, alkil, haloalkil, alkoksyalkil lub aryl), X-P(Z)(Y)O (gdzie X = O, S, Se; Z - O, S, Se; Y = OH, SH, SeH lub alkil, haloalkil, alkoksyalkil, aryl lub halogen, w szczególności fluor), a także CH=CH, CC, N=N, CHOH i CHN3.
  6. 6. Pochodna nukleozydu według zastrz. 2, znamienna tym, że grupa metalokarboranylowa jest grupą -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-Me-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} lub -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3-Mecyklopentadienylową]}.
  7. 7. Pochodna nukleozydu według zastrz. 5, znamienna tym, że grupa metalokarboranylowa jest grupą -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} lub
    -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3-kobalt-cyklopentadienylową]}.
    PL 207 183 B1
  8. 8. Pochodna nukleozydu pirymidynowego według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera grupę 3N lub 4-O-{dietylenoksy-{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]}.
  9. 9. Pochodna nukleozydu według zastrz. 5, znamienna tym, że co najmniej jedna z grup hydroksylowych (-OH) reszty cukrowej lub jej analogu została zastąpiona grupą o strukturze -OP(Z)(Y)X (Z = O, S, Se; Y = OH, SH, SeH lub alkil, haloalkil, alkoksyalkil, aryl lub halogen; X = OH, SH, SeH lub alkil, haloalkil, alkoksyalkil, aryl lub halogen) albo -OP(Y)X [Y = alkil, haloalkil, alkoksyalkil (-Oalkil), aryl, aryloksyl (-Oaryl), NR2 lub halogen; X=alkil, haloalkil, alkoksyalkil (-Oalkil), aryl, aryloksyl (-Oaryl), NR2 lub halogen]
  10. 10. Pochodna nukleozydu według jednego z poprzednich zastrz., znamienna tym, że jest nukleotydem, korzystnie mono-, di- albo trójfosforanem nukleozydu.
  11. 11. Pochodna nukleozydu według zastrz. 10, znamienna tym, że wolne grupy hydroksylowe reszty cukrowej lub jej analogu oraz grupy aminowe zasady nukleinowej zabezpieczone są grupami ochronnymi, umożliwiając wykorzystanie nukleotydu w syntezie DNA- i RNA-oligonukleotydów.
  12. 12. Pochodna nukleozydu według zastrz. 10, znamienna tym, że grupa metalokarboranylowa jest przyłączona bezpośrednio lub za pomocą łącznika do atomu fosforu nukleotydu.
  13. 13. Związek wybrany spośród 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-acetylo-3-N-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (24a), 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O-acetylo-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (24b), 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)-tymidyny (28b), 8-dioksano-O-COSAN (23), 5'-O-monometoksytrytylo-4-O-(bisetoksy-8-COSAN)tymidyny (25a), amidofosforyn 5'-O-monometoksytrytylo-3'-O -(N,N-diizopropylo-b-cyjanoetylo)-4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidyny (26).
  14. 14. Modyfikowany DNA- lub RNA- oIigonukleotyd o długości od 2 do 40 jednostek nukleotydowych, zawierający co najmniej jedną grupę metalokarboranylową przyłączoną do zasady nukleinowej, wiązania internukleotydowego lub reszty cukrowej.
  15. 15. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrzeżenia 14, w którym modyfikacja zawierająca grupę metalokarboranylową jest przyłączona do 3'-terminalnego nukleotydu, lub też znajduje się przy końcu 3' łańcucha oligonukleotydowego.
  16. 16. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrzeżenia 14, w którym modyfikacja zawierająca grupę metalokarboranylową jest przyłączona do 5'-terminalnego nukleotydu, lub też znajduje się przy końcu 5' łańcucha oligonukleotydowego.
  17. 17. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrzeżenia 14, w którym modyfikacja zawierająca grupę metalokarboranylową znajduje się w środkowej części łańcucha oligonukleotydowego.
  18. 18. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że grupa metalokarboranylowa zawiera atom metalu (Me) wybrany spośród Sn, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Sc, Cr, Mg, Zr, Mo, Sm, Yb, Hf, W, Hg, Gd, U oraz Y albo niemetal wybrany spośród As, S, Si, Se, Te, P, Sb, Bi, Ge oraz N, lub ich izotopów.
  19. 19. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że grupa metalokarboranylowa jest przyłączona do cząsteczki nukleozydu bezpośrednio lub za pomocą łącznika, korzystnie o wzorze -[(CH2)n-(W)m]k- gdzie n wynosi od 0 do 5, m wynosi 0 albo 1, k wynosi od 1 do 6, natomiast W jest O, S, S(O), S(O)2, Se, NR (gdzie R = H, alkil, haloalkil, alkoksyalkil lub aryl), X-P(Z)(Y)O (gdzie X = O, S, Se; Z = O, S, Se; Y = OH, SH, SeH lub alkil, haloalkil, alkoksyalkil, aryl lub halogen, w szczególności fluor), a także CH=CH, CC, N=N, CHOH i CHN3.
  20. 20. Modyfikowany oligonukleotyd jak w zastrz. 14 zdolny do hybrydyzacji in vitro i/lub in vivo do komplementarnej sekwencji DNA lub RNA.
  21. 21. Modyfikowany oligonukleotyd jak w zastrz. 14 zdolny do hybrydyzacji in vivo do komplementarnej sekwencji dwuniciowego DNA.
  22. 22. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że grupa metalokarboranylowa jest grupą -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-Me-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} lub -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3-Mecyklopentadienylową]}.
  23. 23. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że grupa metalokarboranylowa jest grupą -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]} lub -{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3-kobalt-cyklopentadienylową]}.
  24. 24. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że zawiera grupę 3N- lub 4-O-{dietylenoksy-{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-kobalt-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anową]}.
  25. 25. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że zawiera 3N-lub 4-O-(dietylenoksy-8-COSAN)tymidynę (BCCoT).
    PL 207 183 B1
  26. 26. Modyfikowany oligonukleotyd według zastrz. 18, znamienny tym, że jest 5'-d(BCCoTGCTGGTTTGGCTG)-3'.
  27. 27. Sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu, określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że nukleozyd lub jego analog z odpowiednio zablokowanymi grupami hydroksylowymi i posiadający przynajmniej jedną grupę ketonową zdolną do uczestniczenia w równowadze keto-iminowej i/lub aminową albo hydroksylową zasady azotowej miesza się z 8-dioksano-{8-[(1,2-dikarba-closo-undekaborano)-3,3'-Me-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anem]}, lub z 8-tetrahydrofurano-{8-[(1,2-di- karba-closo-undekaborano)-3,3'-Me-(1',2'-dikarba-closo-undekaborano)anem]} w środowisku bezwodnym dodaje się silną zasadę nieorganiczną lub organiczną typu DBU, BDDDP oraz węglowodór lub jego pochodną o temperaturze topnienia od -100 do 150 celcjuszy i prowadzi się reakcję w temperaturze od 0 do 100 celcjuszy, a uzyskany produkt wydziela się i odbezpiecza się grupę 3' lub 5' albo obie 3' i 5' grupy hydroksylowe.
  28. 28. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się wodorek sodu, glinowodorek sodu albo t-butanolan potasu.
  29. 29. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że jako węglowodór stosuje się toluen, ksyleny, mezytylen, heksametylobenzen i naftalen.
  30. 30. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że atom (Me) wybiera się spośród metali Sn, Mn, Tc, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Sc, Cr, Mg, Zr, Mo, Sm, Yb, Hf, W, Hg, Gd, U oraz Y albo niemetali As, S, Si, Se, Te, P, Sb, Bi, Ge oraz N, lub ich izotopów.
  31. 31. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że zasadą azotową jest puryna albo pirymidyna albo ich pochodna.
  32. 32. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że zasadą nukleinową jest tymina, uracyl, 5-halouracyl, cytozyna, 5-halocytozyna, adenina, guanina, 2,6-diaminopuryna, 2-amino-6-chloropuryna, 2-aminopuryna, 5-alkilouracyl, 5-alkilocytozyna, 2-tiouracyl, 2,4-ditiouracyl albo 4-tiouracyl.
  33. 33. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że uzyskany nukleozyd fosforyluje się lub fosfityluje i/lub przyłącza się do oligonukleotydu.
PL359949A 2003-05-02 2003-05-02 Pochodna nukleozydu, modyfikowany oligonukleotyd oraz sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu PL207183B1 (pl)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL359949A PL207183B1 (pl) 2003-05-02 2003-05-02 Pochodna nukleozydu, modyfikowany oligonukleotyd oraz sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu
PCT/PL2004/000030 WO2004096824A2 (en) 2003-05-02 2004-04-30 Nucleoside derivative, modified oligonucleotide, method for their synthesis and applications thereof
MXPA05011909A MXPA05011909A (es) 2003-05-02 2004-04-30 Derivado de nucleosido, oligonucleotido modificado, metodo para su sintesis y aplicaciones de los mismos.
US10/555,351 US8026348B2 (en) 2003-05-02 2004-04-30 Nucleoside derivative, modified oligonucleotide, method for their synthesis and applications thereof
CA002524585A CA2524585A1 (en) 2003-05-02 2004-04-30 Nucleoside derivative, modified oligonucleotide, method for their synthesis and applications thereof
EP04730776A EP1636247A2 (en) 2003-05-02 2004-04-30 Nucleoside derivative, modified oligonucleotide, method for their synthesis and applications thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL359949A PL207183B1 (pl) 2003-05-02 2003-05-02 Pochodna nukleozydu, modyfikowany oligonukleotyd oraz sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL359949A1 PL359949A1 (pl) 2004-11-15
PL207183B1 true PL207183B1 (pl) 2010-11-30

Family

ID=34271096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL359949A PL207183B1 (pl) 2003-05-02 2003-05-02 Pochodna nukleozydu, modyfikowany oligonukleotyd oraz sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL207183B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL359949A1 (pl) 2004-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2370451B1 (en) Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
JP3207915B2 (ja) オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド類似体の固相合成のための方法と化合物
EP1015469B2 (en) Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues
US7572582B2 (en) Oligonucleotide analogues
US20030134808A1 (en) Oligonucleotide analogues
US5646267A (en) Method of making oligonucleotides and oligonucleotide analogs using phospholanes and enantiomerically resolved phospholane analogues
AU8646091A (en) Modified internucleoside linkages
JPH07508042A (ja) 新規２’−０−アルキルヌクレオシドおよびホスホロアミダイトの製造法およびその使用
JPH10505318A (ja) ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド含有ホウ素クラスター
WO2002018406A1 (en) Alkylated hexitol nucleoside analogues and oligomers thereof
PL207183B1 (pl) Pochodna nukleozydu, modyfikowany oligonukleotyd oraz sposób otrzymywania pochodnej nukleozydu
US7820810B2 (en) Process for the synthesis of 2′-O-substituted purine nulceosides
US20070009889A1 (en) Nucleoside derivative, modifed oligonucleotide, method for their syntesis and applicantions thereof
US6486313B1 (en) Oligonucleotides having alkylphosphonate linkages and methods for their preparation
EP2948467A1 (en) Method for the solid-phase based synthesis of phosphate-bridged nucleoside conjugates
JPH07501542A (ja) アミノ炭化水素ホスホン酸塩成分を有するオリゴヌクレオチド