PL207552B1

PL207552B1 - Sposób wytwarzania urządzenia, urządzenie, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie urządzenia i zestaw

Info

Publication number: PL207552B1
Application number: PL375794A
Authority: PL
Inventors: Klaus Hellerbrand; Nicola Beaucamp; Ulrich Kohnert
Original assignee: Scil Technology Gmbh
Priority date: 2002-09-10
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2010-12-31
Also published as: WO2004024199A1; CA2498512A1; JP2006503611A; DK1539261T3; EP1539261A1; ES2260685T3; CA2498512C; JP4358741B2; ATE322916T1; US20110020658A1; PL375794A1; US8257728B2; US20060240062A1; CN1681540A; US7763270B2; DE60304584T2; DE60304584D1; EP1539261B1; PT1539261E; CN100522241C

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania urządzenia, urządzenia zawierającego nośnik z powierzchnią z metalu lub stopu metalu, kompozycji farmaceutycznej zawierającej takie urządzenie, zastosowania takiego urządzenia w przyspieszonej osteointegracji i tworzeniu nowych kości oraz zestawu zawierającego takie urządzenie. Sposób wytwarzania urządzenia według wynalazku obejmuje etapy, w których (a) dostarcza się roztwór zawierający rozpuszczone białko osteoindukcyjne, (b) kontaktuje się roztwór wytworzony w poprzednim etapie z nośnikiem zawierającym powierzchnię metalu lub stopu metalu, (c) opłaszcza się powierzchnię tego nośnika przez takie rozpuszczone białko i (d) suszy się opłaszczony nośnik wytworzony w etapie (c), przy czym etapy (b) do (d) prowadzi się w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu. Wynalazek dotyczy takż e urządzenia wytwarzanego takim sposobem.

W czasie ostatnich dziesięcioleci opisano wiele metod poprawienia jakości implantów, w tym kontaktu implant kość i ich zgodności biologicznej. Wymagania dotyczące implantów są bardzo wysokie, ponieważ urządzenia te muszą być sztywno połączone z kością i muszą być stabilne, na przykład w warunkach wysokiego ciśnienia (na przykład zęby, stawy). Początkowa odpowiedź tkanki na wszczepienie zależy od obecności specyficznych czynników wzrostowych uwalnianych przez otaczające tkanki, które stymulują wzrost komórek i ich różnicowanie.

Chociaż istnieją dobrze ugruntowane metody mocowania implantów dentystycznych, ciągle mają one tendencję do obluzowywania wraz z upływem czasu. Opisano różne podejścia umożliwiające poprawę integracji odpowiednich implantów (osteointegracja). Podejścia takie obejmują opłaszczenie implantów różnego pochodzenia (na przykład ceramicznych, metalowych lub innych, patrz EP-B10657146) materiałami ulegającymi degradacji biologicznej (na przykład fosforanem triwapniowym, hydroksyapatytem) i różne metody wytrawiania powierzchni metalu. Uważa się, że nieregularności powierzchni w skali nanometrycznej i mikrometrycznej poprawiają przerastanie kolagenem i komórkami (T. Albrektsson w: Handbook of Biomaterials (Black, J and Hastings, G (edytorzy), Chapman & Hall, 5 London, 1998, str. 500-512).

Opłaszczanie metalowych implantów powierzchniami ceramicznymi opisywane jest jako, na przykład, nakładanie mieszaniny dwóch proszków, jednego proszku metalowego i jednego proszku zawierającego fosforan wapnia (EP 0467948) na materiał implantu w procesie spiekania.

Opisano wiele innych metod spiekania użytecznych do wytwarzania kompozytowych materiałów ceramicznych (Offenlegungs-schrift DE 2928007, Dokument patentowy USA 4882196). Główny nacisk kładziony jest na powlekanie powierzchni metalowych fosforanem wapnia, takimi jak fosforan triwapniowy lub hydroksyapatyt (Y. Tsui, 1998), które pozwalają na poprawę integracji implantów (Patent USA 6312472; Zgłoszenie patentowe USA A-20020038149). Własnością opisanych fosforanów wapnia i różnych innych zgodnych biologicznie materiałów nieorganicznych jest tworzenie porów. Uważa się, że te pory zwiększają integrację implantu w natywną kość (WO 00/72776; Dokument patentowy USA 4051598; EP 0806211, H. Jennissen, 2001), ponieważ natywna kość wrasta w pory równocześnie i degradując warstwę nieorganicznego fosforanu wapnia na tym implancie (WO 96/10370; WO 01/97679). Oprócz materiałów kompozytowych, opisane są implanty złożone z warstw, gdzie dolna warstwa implantu, często zawierająca metal lub stop taki jak tytan lub stop tytanowy (WO 98/43550; WO 00/72777) powleczony jest warstwą fosforanów wapnia (EP 0478532). Typowo powłokę z fosforanów wapnia otrzymuje się przez traktowanie hydrotermalne (EP 0548365) lub przez namaczanie i wytrą canie (Patent USA 6129 928, WO 97/41273) lub napylanie plazmowe (Patent USA 5697 997, Patent USA 6113 993, EP 0548365, EP 0739191, Lichtinger, 2001).

Warstwa fosforanu wapnia na głównej części implantu może być częścią mieszaniny materiałów w jednej warstwie (WO 98/48862, Patent USA 5934287; Zgł oszenie patentowe Stanów Zjednoczonych A-20020033548) albo tworem wielowarstwowym (WO 02/09788, Patent USA 6322728).

Poza modyfikacjami powierzchni opisano kilka metod opłaszczania ortopedycznych lub dentystycznych implantów białkami lub mieszaninami białek (głównie czynnikami wzrostu). Uważa się, że białka te znacząco przyśpieszają integrację implantów (Lichtinger, 2001; Shah, 1999). Opisano kilka metod bezpośredniego opłaszczania powierzchni metalowych białkami. Jednakże metody te mają kilka wad, w szczególności gwałtowne uwalnianie białek z powierzchni metalu, które nie pozwala na utrzymanie białka przez czas konieczny do indukcji tworzenia kości (Lichtinger, 2001).

W celu uniknię cia gwałtownego uwalniania (spontanicznego wyrzutu) biał ka K. Endo (1995) i Voggenreiter i wsp. (2001) opisali immobilizację białek przez kowalencyjne wiązanie z powierzchnią metalu.

PL 207 552 B1

Aktywność takich białek jest utrzymana. Jednakże kowalencyjne wiązanie może indukować zmiany strukturalne, które mają wpływ na immunogenność białek.

Wielu badaczy podkreśla, że udane wszczepianie czynników kościotwórczych w celu wewnątrzchrząstkowego tworzenia kości wymaga, żeby białka były związane z odpowiednim materiałem nośnikowym lub matrycą, które utrzymują białka w miejscu podania (Patent USA 5344654). W celu przezwyciężenia tych trudności Patent USA 5258029 uczy, że „białko osteogenne według wynalazku normalnie jest preparowane w ilościach skutecznych dla tworzenia się kości z akceptowanych farmaceutycznie stałym lub płynnym nośnikiem. Zalecane preparaty obejmują matrycę, która jest zdolna do zapewnienia struktury dla rozwijającej się kości i chrząstek. Potencjalne matryce mogą być degradowane biologicznie lub nie ulegać biologicznej degradacji, i mogą być określone chemicznie lub biologicznie”.

Zawiesinę białka TGF-β i nośnika suszy się i następnie nanosi na obciążaną protezę. Wadą tych metod jest użycie kolagenów pochodzących od zwierząt lub składników nieorganicznych, które mogą się zetrzeć podczas wszczepienia.

Inna metoda przezwyciężająca szybkie wymywanie białek opisana jest przez Lichtinger i wsp. (2001), którzy traktowali powierzchnie stopu tytanu kwasem chromosiarkowym w celu uzyskania ultrahydrofilowych powierzchni bioadhezyjnych. Jednakże w czasie wytwarzania produktów medycznych lub urządzeń medycznych należy unikać kwasu chromosiarkowego, ponieważ pozostające na powierzchni resztkowe ilości tego kwasu mogą powodować utlenianie białek i w konsekwencji ich strukturalne i funkcjonalne zmiany, a także mogą spowodować zagrożenie dla pacjenta.

Inne metody opisane w WO 00/72777 i WO 00/72778 wykorzystują depot utworzony przez układ porów grubej warstwy tlenku na powierzchni tytanowej lub przez wewnętrzne przestrzenie, kanały lub wgłębienia. Jednakże, dobrze wiadomo, że białka ulegają utlenieniu w obecności metali i jonów metali (Li i wsp. (1997), Ann. Occup. Hyg. 41, suppl. 1, 379-383). Wadą opisanych powyżej urządzeń może być zatem, fakt, że białka na powierzchni implantów ulegają utlenieniu. Utlenienie takie może powodować zmiany strukturalne, które z kolei powodują powstawanie reakcji immunogennych.

Technicznym problemem leżącym u podstaw obecnego wynalazku jest dostarczenie środków do udoskonalonego powiększania kości. Ten problem techniczny rozwiązany jest w przykładach wykonania scharakteryzowanych w zastrzeżeniach.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania urządzenia, polegający na tym, że (a) dostarcza się roztwór zawierający rozpuszczone białko osteoindukcyjne, (b) kontaktuje się roztwór wytworzony w etapie (a) z nośnikiem zawierającym powierzchnię metalu lub stopu metalu, (c) opłaszcza się powierzchnię nośnika przez rozpuszczone białko i (d) suszy się opłaszczony nośnik wytworzony w etapie (c), przy czym etapy (b) do (d) prowadzi się w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu.

Korzystnie etapy (b) do (d) prowadzi się w warunkach stężenia tlenu mniejszego niż 10% objętościowych tlenu.

Korzystnie etapy (b) do (d) prowadzi się w temperaturze poniżej 25°C.

Korzystnie jako metal lub stop metalu stosuje się tytan lub stop tytanu.

Korzystniej jako stop tytanu stosuje się stop tytanu zawierający przynajmniej 50% tytanu.

Korzystniej jako stop tytanu stosuje się stop Ti-Al-V, Ti-Al-Fe, Ti-Al-Nb lub Ti-Mo-Zr-Al.

Jeszcze korzystniej jako stop Ti-Ai-V stosuje się stop Ti6AI4V.

Korzystnie opłaszczanie prowadzi się przez zanurzenie metalicznej powierzchni w roztworze białka.

Korzystnie opłaszczanie prowadzi się przez nakraplanie roztworu białka na metaliczną powierzchnię.

Korzystnie opłaszczanie prowadzi się przez rozpryskiwanie roztworu białka na metaliczną powierzchnię.

Korzystnie suszenie prowadzi się pod próżnią.

Korzystnie suszenie prowadzi się przez liofilizację.

Korzystnie suszenie prowadzi się przez odparowanie w temperaturze pokojowej w strumieniu gazu obojętnego.

Korzystnie jako białko osteoindukcyjne stosuje się członka rodziny TGF-β.

Korzystniej jako członka rodziny TGF-β stosuje się członka podrodziny BMP.

Jeszcze korzystniej jako członka rodziny BMP stosuje się BMP2 lub BMP7.

Korzystnie jako członka rodziny TGF-β stosuje się członka podrodziny GDF.

Jeszcze korzystniej jako członka podrodziny GDF stosuje się GDF-5.

Korzystnie urządzenie jest wolne od substancji toksycznych.

PL 207 552 B1

Korzystnie roztwór pozwala na rozpuszczenie tego białka na czas wystarczający do homogennego opłaszczenia metalicznej powierzchni.

Korzystnie roztwór pozwala na uzyskanie stężenia białka osteoindukcyjnego większego niż 0,5 mg/ml.

Korzystniej roztwór ma kwaśne pH.

Jeszcze korzystniej kwaśny roztwór zawiera HCl, kwas octowy, kwas cytrynowy lub kwas bursztynowy.

Korzystniej stężenie kwasu jest mniejsze lub równe 100 mmol/l.

Korzystnie roztwór wysyca się gazem obojętnym.

Korzystniej jako obojętny gaz stosuje się azot, argon lub hel.

Korzystnie prowadzi się go w komorze z kontrolowaną atmosferą i wilgotnością.

Przedmiotem wynalazku jest również urządzenie zawierające nośnik obejmujący powierzchnię z metalu lub stopu metalu, charakteryzujące się tym, że powierzchnia ta jest jednorodnie pokryta białkiem osteoindukcyjnym, przy czym białko osteoindukcyjne nie jest związane z powierzchnią metalową nośnika za pomocą wiązania kowalencyjnego.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera urządzenie jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie urządzenia wytworzonego sposobem określonym powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zastosowania do przyśpieszonej osteointegracji i tworzenia nowych kości.

Korzystnie przyśpieszona osteointegracja i tworzenie nowych kości jest stosowane do leczenia defektów urazowych, złośliwych lub sztucznych.

Korzystnie przyśpieszona osteointegracja i tworzenie nowych kości jest stosowane do leczenia defektów dentystycznych.

Korzystnie przyśpieszona osteointegracja i tworzenie nowych kości jest stosowane do leczenia stawu biodrowego, łokciowego, kręgosłupa, kolanowego, palca lub kostki.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw, charakteryzujący się tym, że zawiera urządzenie jak określono powyżej, które zapakowane jest w pojemniku.

Sposób wytwarzania urządzenia według wynalazku zawierający etapy, w których: (a) dostarcza się roztwór zawierający rozpuszczone białko osteoindukcyjne; (b) kontaktuje się roztwór wytworzony w etapie (a) z noś nikiem zawierają cym powierzchnię metalu lub stopu metalu; (c opł aszcza się powierzchnię takiego nośnika przez rozpuszczone białko; i (d) suszy się opłaszczony nośnik wytworzony w etapie (c), przy czym etapy od (b) do (d) prowadzi się w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu.

Termin „wytwarzanie” obejmuje oprócz etapów wyraźnie opisanych dodatkowe etapy wytwarzania, takie jak pakowanie. Dogodnie, sposób według wynalazku prowadzi się jako automatyczny sposób wytwarzania wspomagany przez odpowiednie roboty. W tym wynalazku terminy „wytwarzanie” i „produkowanie” używane są wymiennie.

Termin „urządzenie” używany w odniesieniu do obecnego wynalazku oznacza jednostkę, która zawiera przynajmniej dwa składniki. Jednym ze składników jest nośnik.

Nośniki, które mogą być stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmują nośniki stałe, takie jak nośniki całkowicie metalowe lub stopowe oraz matryce metalowe lub stopowe. Ponadto zgodnie z wynalazkiem opisano nośniki stałe zawierające puste przestrzenie i zagłębienia. Co więcej nośniki takie mają dogodnie zwiększoną powierzchnię ze względu na tworzenie się makro- i mikroporów. Dogodnie występowanie takich makro- lub mikroporów ograniczone jest do warstwy powierzchniowej nośnika. Zgodnie z wynalazkiem opisano także nośniki, które zawierają przynajmniej dwa różne składniki, przy czym składnik metalowy lub stop metalu używany jest jako rdzeń lub warstwa rdzeniowa, a na przykład materiał ceramiczny stosowany jest jako warstwa powierzchniowa. Powierzchnia nośnika ma wysokie powinowactwo do białek osteoindukcyjnych, ale pomimo tego pozwala na uwalnianie takich białek in vivo. W zgodzie z obecnym wynalazkiem nośnik taki jest dogodnie metalem lub opisanym stopem. Nośnikowi zawartemu w urządzeniu według wynalazku można nadać odpowiednią formę do podawania urządzenia in vivo. Obejmuje to także wytwarzanie implantów lub całych protez chirurgicznych. Protezy takie dogodnie wytwarza się z powierzchniami metalicznymi lub opłaszcza nimi, co będzie opisane bardziej szczegółowo poniżej. Protezy wytwarza się z tytanu lub stopów tytanu, takich jak stop tytanu lub stal nierdzewna.

Drugim składnikiem takiego urządzenia jest białko lub polipeptyd, które mają własności osteoindukcyjne, które zostaną wyjaśnione szczegółowo poniżej. Białko lub polipeptyd jest immobilizowany

PL 207 552 B1 na powierzchni nośnika. Zaleca się, aby wiązanie tego białka lub polipeptydu z nośnikiem było odwracalne. Przewiduje się zatem, że takie białko lub polipeptyd, które ma własności osteoindukcyjne, nie jest sprzężone z powierzchnią metaliczną nośnika poprzez wiązanie kowalencyjne. Dogodnie, sprzęganie zachodzi w wyniku oddziaływań elektrostatycznych, oddziaływań hydrofobowych lub nieelektrostatycznych, takich jak siły Van der Waalsa. Ze względu na odwracalne wiązanie białka osteoindukcyjnego możliwe jest rozpuszczanie go, jeżeli urządzenie znajdzie się w odpowiednim środowisku, takim jak jamy ciała. Dogodnie takie rozpuszczanie białek jest powolnym uwalnianiem pozwalającym na dyfuzję białka do tkanek otaczających urządzenie. Jak wykazano w dołączonych przykładach, urządzenie pozwala na miejscowe występowanie białek osteoindukcyjnych i białek natywnych, które przyśpieszają wytwarzanie nowych kości i wrastanie kości w powierzchnię matrycy. Urządzenie według wynalazku może być implantem, to znaczy, że terminy „urządzenie” i „implant” używane są tu wymiennie. Dobrze wiadomo, że termin „implant” oznacza każde urządzenie dostarczone przez wynalazek, które jest tak zaprojektowane, żeby mogło być dostarczone całkowicie lub częściowo pod powierzchnię naskórka (Koeck, B. i Wagner, W. (edytorzy) 1996). Implant może być płaski, może mieć zwarty lub złożony kształt, to znaczy można zastosować każde urządzenie tradycyjnie stosowane lub wszczepiane. Wspomniane powyżej implanty obejmują od prostych cylindrycznego kształtu implantów, stosowanych do zastępowania kości długich lub jako podstawa sztucznych zębów, do płaskich implantów stosowanych do zastępowania płaskich kości czaszki i sztucznych stawów, takich jak biodro, kolano lub łokieć.

Opłaszczanie urządzenia według wynalazku białkiem osteoindukcyjnym ma na celu zapoczątkowanie i stymulowanie transformacji mezenchymalnych komórek macierzystych do osteoblastów i chondrocytów, co zostanie opisane poniżej. Oczywiste jest, że opłaszczone mogą być tylko te części urządzenia według wynalazku, które są skierowane w kierunku odpowiednich tkanek kostnych. Taka część dogodnie jest całą powierzchnią lub przynajmniej jej częściami, które nakładają się na powierzchnię kości. Na przykład, implant dentystyczny, który jest używany do zastąpienia brakujących zębów zawiera gwintowaną część, którą wkręca się w kość szczękową i część wystającą (gniazdo), która wykorzystywana jest do zakotwiczenia sztucznej korony zębowej. Opłaszczona białkiem osteoindukcyjnym musi więc być tylko część gwintowana. Jednakże, część, która nie jest opłaszczona białkiem osteoindukcyjnym może być powleczona innymi czynnikami, takimi jak fosforany wapnia, kolagen lub podobne czynniki.

Termin „osteoindukcyjne” oznacza zdolność do transformowania mezenchymalnych komórek macierzystych i pre-osteoblastów do osteoblastów. Wstępnym warunkiem koniecznym do osteoindukcji jest sygnał, który jest rozprowadzany przez urządzenie do otaczających tkanek, w których wspomniane wcześniej prekursory osteoblastów i inne mezenchymalne komórki macierzyste ulegają aktywacji. Użyty tu termin osteoindukcja obejmuje różnicowanie komórek mezenchymalnych do komórek prekursorowych kości, osteblastów. Co więcej, termin osteoindukcja obejmuje także różnicowanie tych osteoblastów do osteocytów, dojrzałych komórek kości. Osteoindukcja wymaga więc różnicowania niezróżnicowanych lub małozróżnicowanych komórek do osteocytów, które są zdolne do tworzenia kości. Jak opisano powyżej, białka osteoindukcyjne stosowane zgodnie z wynalazkiem są powoli uwalniane z urzą dzenia po jego wszczepieniu i wydajnie dystrybuowane w otaczają cych tkankach. Co wię cej, białka i polipeptydy tu opisane mają własności osteoindukcyjne in vivo. Na przykład, powszechnie wiadomo w dziedzinie, że nadrodzina transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) zawiera członków, którzy wykazują własności osteoindukcyjne. Poniżej wymieniono poszczególnych członków nadrodziny TGF-β, którzy mają szczególnie dobre własności osteoindukcyjne. Podsumowując, białka osteoindukcyjne na powierzchni urządzenia według wynalazku i po uwolnieniu z tego nośnika służą jako sygnał osteoindukcyjny dla prekursorów osteocytów w tkankach otaczających miejsce wszczepienia tego urządzenia.

Termin „białko osteoindukcyjne”, lub jak opisano powyżej, oznacza członków nadrodziny transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β), które mają własności osteoindukcyjne, takich jak czynnik wzrostu i różnicowania-5; patrz poniżej. Niespodziewanie, takie białka osteoindukcyjne wykazują wysokie powinowactwo do powierzchni metalicznych jak to wykazano w dołączonych przykładach. Ważnym warunkiem wstępnym dla takiego procesu adsorpcji na powierzchni metalicznej jest wystarczająca rozpuszczalność białek w roztworze opłaszczającym.

Urządzenie lub implant według wynalazku, korzystnie, jest dowolnego typu powierzchnią metaliczną opisaną powyżej. Przed doprowadzeniem do kontaktu roztworu zawierającego rozpuszczone białko osteoindukcyjne z nośnikiem zawierającym powierzchnię metalu lub stopu metalu, taką jak tu opisane, oczywiste jest, że zalecane jest by taka powierzchnia metaliczna była oczyszczona lub traktowana w celu usunięcia jakichkolwiek zanieczyszczeń powierzchni i w celu zapewnienia dużej siły dla

PL 207 552 B1 opłaszczania. W dziedzinie dobrze znanych jest kilka metod użytecznych do tego celu i są one przedstawione w dołączonych przykładach. Na przykład, powierzchnię metaliczną urządzenia według wynalazku można przemyć, na przykład, acetonem, alkoholem alkilowym, takim jak etanol i następnie dokładnie przemyć sterylną wodą destylowaną lub demineralizowaną.

Urządzenie według wynalazku ma dogodnie zwiększoną powierzchnię na skutek modyfikacji powierzchni takich jak porowatość, granulkowatość lub siatkowata powierzchnia. Takie modyfikacje można wprowadzić metodami dobrze znanymi w dziedzinie, w tym środki chemiczne lub mechaniczne. Co więcej, wykazano, że zwiększona powierzchnia mająca nieregularności w skali nanometrowej i mikrometrowej jest zalecana do osteointegracji.

Opisano wiele metod stabilizacji białek w produktach farmaceutycznych. Jednakże, doświadczenia leżące u podstaw tego wynalazku wykazały, że dobrze znane techniki stabilizacji białek w płynnych lub liofilizowanych preparatach białek nie mogą być bezpośrednio przystosowane do białek zaadsorbowanych na powierzchni metalu. Opłaszczanie białkami powierzchni metalicznej, na przykład tytanowej lub stopu tytanu według sposobów opisanych w stanie techniki opisanym powyżej powoduje występowanie zmodyfikowanych cząsteczek białka, które skutkują agregacją lub utlenianiem białek (szczegóły opisano w przykładzie 5). Co więcej, nawet dodanie związków redukujących nie zmniejsza ilości utlenionego białka (szczegółowo opisano w przykładzie 10). Dzięki opracowaniu sposobu według wynalazku możliwe jest wytwarzanie urządzeń, które po wszczepieniu efektywnie zwiększają kość. Dogodnie, można uniknąć niepożądanych skutków ubocznych, takich jak zapalenie wynikające ze zwiększonej immunogenności utlenionych białek. Co więcej, sposób według wynalazku pozwala na mniej czasochłonny i tańszy proces wytwarzania urządzeń medycznych, ponieważ opłaszczanie metalowego lub wykonanego ze stopu metalu korpusu implantu warstwą fosforanu wapnia lub kolagenu nie jest konieczne. Inną zaletą wynalazku w tym kontekście jest fakt, że ze sposobu wytwarzania wyłączone są materiały potencjalnie zanieczyszczające, takie jak kolageny, które mogą przenosić infekcje wirusowe.

W korzystnym przykł adzie wykonania sposobu wedł ug wynalazku etapy od (b) do (d) prowadzi się przy stężeniu tlenu poniżej 10% objętościowych, zwłaszcza poniżej 5% i w szczególności poniżej 2%.

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku etapy od (b) do (d) prowadzi się w temperaturze poniż ej 25°C, zwł aszcza poniż ej 15°C i w szczególno ś ci poniż ej 8°C.

W innym korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku metalem lub stopem metalu jest tytan lub stop tytanu. Zalecane jest, aby metale/stopy metalu tu opisane były zgodne biologicznie. Termin „zgodny biologicznie” oznacza jakość gwarantującą, że nie obserwuje się działania toksycznego lub uszkadzającego w układach biologicznych (Williams, D. F. 1999). Własności takie wykazuje między innymi tytan lub stopy tytanu, które są tu opisane.

Korzystniej, stop tytanu jest stopem tytanu zawierającym przynajmniej 50% tytanu. Jeszcze korzystniej taki stop tytanu jest stopem Ti-Al-V, stopem Ti-Al-Fe, stopem Ti-Al-Nb lub stopem Ti-Mo-Zr-Al, a najkorzystniej Ti6Al4V.

W innym korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku opłaszczanie prowadzi się przez zanurzanie powierzchni metalicznej w roztworze białka.

W innym korzystnym przykł adzie wykonania sposobu według wynalazku opł aszczanie prowadzi się przez nakraplanie roztworu białka na metaliczną powierzchnię.

Jako korzystny przykład wykonania sposobu według wynalazku opisany jest także przykład, w którym opłaszczanie prowadzi się przez rozpryskiwanie roztworu białka na metaliczną powierzchnię.

Termin „suszenie” obejmuje sposoby usuwania płynów, takich jak nadmiar roztworu buforującego, które ciągle są obecne po opłaszczeniu nośnika białkiem osteoindukcyjnym. Korzystnie suszenie prowadzi się przez suszenie pod próżnią lub liofilizację.

W innym korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku suszenie prowadzi się przez odparowanie w temperaturze pokojowej w strumieniu gazu obojętnego.

W innym korzystnym przykł adzie wykonania sposobu wedł ug wynalazku biał ko osteoindukcyjne należy do rodziny TGF-β. Termin „członek rodziny TGF-β” obejmuje aktywne biologicznie, dojrzałe cząsteczki takiego białka, a także odpowiednie proformy, na przykład probiałka w tym odpowiednią prodomenę takich członków rodziny TGF-β, jak bardziej szczegółowo opisano poniżej. Wykazano, że rodzina czynników wzrostu i różnicowania TGF-β bierze udział w różnych procesach biologicznych obejmujących tworzenie kości. Wszyscy członkowie tej rodziny to polipeptydy wydzielane i zawierające charakterystyczną strukturę domenową. Na samym N-końcu członkowie rodziny TGF-β zawierają peptyd sygnałowy lub liderową sekwencję wywołującą wydzielaPL 207 552 B1 nie. Po tej sekwencji występuje w kierunku C-końca prodomena i sekwencja dojrzałego polipeptydu. Sekwencja dojrzałego polipeptydu zawiera siedem konserwowanych cystein, z których sześć jest koniecznych do wytworzenia wewnątrz-cząsteczkowych wiązań disiarczkowych, a jedna konieczna jest do dimeryzacji dwóch polipeptydów. Aktywny biologicznie członek rodziny TGF-β jest dimerem, złożonym zwłaszcza z dwóch dojrzałych polipeptydów. Członkowie rodziny TGF-β są zwykle wydzielani jako preprobiałka zawierające oprócz sekwencji dojrzałej presekwencję (sekwencję sygnałową) i prosekwencję. Sekwencja sygnałowa i prodomeny są zewnątrzkomórkowo odcinane i nie są częścią cząsteczki sygnalizacyjnej. Stwierdzono jednak, że prodomena (prodomeny) może być wymagana do zewnątrzkomórkowej stabilizacji dojrzałych polipeptydów. Przegląd członków nadrodziny TGF-β zamieszczony jest w: Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-37. Sekwencje aminokwasowe członków rodziny TGF-β można uzyskać z dobrze znanych baz danych, takich jak Swiss-Prot przez internet (http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html). Sekwencje aminokwasowe preproform BMP2, BMP7 i GDF-5, członków rodziny TGF-β mające szczególnie osteogenne są pokazane także na SEQ ID Nr 1 do 3, odpowiednio.

W kontekście tego wynalazku termin „członek rodziny TGF-β”, lub białka należące do tej rodziny opisane poniżej, obejmuje wszystkie aktywne biologicznie warianty takich białek lub członków i wszystkie warianty, a także ich nieaktywne prekursory. Opisano tu białka zawierające tylko dojrzałą sekwencję a także białka zawierające dojrzałą sekwencję i prodomenę lub dojrzałą sekwencję i prodomenę i sekwencję liderową, a także ich aktywnie biologicznie fragmenty. To czy fragment członka rodziny TGF-β ma aktywność biologiczną można łatwo określić testem biologicznym opisanym na przykład w: Katagiri T, Yamaguchi A, Ikeda T, Yoshiki S, Wozney JM, Rosen V, Wang EA, Tanka H, Omura S, Suda T, (1990): The non-osteogenic mouse pluripotent cell line, C3H10T1/2, is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 295-299 lub Nishitoh H, Ichijo H, Kimura M, Matsumoto T, Makishima F, Yamaguchi A, Yamashita H, Enomoto S, Miyazono K (1996): Identification of type I and type II serine/threonine kinase receptors for growth/differentiation factor-5. J. Biol. Chem. 271: 21345-21352.

Aktywność biologiczną zgodnie z wynalazkiem można dogodnie określić na modelach in vivo tak jak opisano w załączonych przykładach. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem warianty członków rodziny TGF-β mają sekwencję aminokwasową mającą przynajmniej 75%, przynajmniej 80%, przynajmniej 90%, przynajmniej 95%, przynajmniej 96%, przynajmniej 97%, przynajmniej 98% lub przynajmniej 99% identyczności z sekwencją aminokwasową członków rodziny TGF-β tu opisanych, szczególnie do tych tu pokazanych na jednej z SEQ ID Nr 1 do 3.

Korzystniej taki członek rodziny TGF-β jest członkiem podrodziny BMP. Wykazano, że członkowie podrodziny Białek Morfogenetycznych Kości (BMP) biorą udział, między innymi, w indukcji i remodelowaniu tkanki kostnej. BMP oryginalnie wyizolowano z macierzy kostnej. Cechą szczególną tych białek jest ich zdolność do indukcji tworzenia się nowych kości w miejscach ektopowych. Różne badania in vivo wykazały ułatwianie osteogenezy i chondrogenezy komórek prekursorowych przez BMP i wskazują, że każda cząsteczka BMP może mieć różną rolę w czasie rozwoju szkieletu. Więcej szczegółów o molekularnych i biologicznych własnościach BMP opisano w: Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-27, Schmitt J, Hwang K, Winn, SR, Hollinger J (1999): Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance. J Orthop Res 17: 269-278 and Lind M (1996): Growth factors: possible new clinical tools. A review. Acta Orthop Scand 67: 407-17. Najkorzystniej taki członek rodziny BMP jest białkiem BMP2 lub BMP7. Sekwencja aminokwasowa preproformy BMP2 złożona jest w bazie Swiss-Prot pod numerem dostępu P12643 i jest pokazana poniżej. Aminokwasy od 1 do 23 odpowiadają sekwencji sygnałowej, aminokwasy od 24 do 282 odpowiadają propeptydowi i aminokwasy od 283 do 396 odpowiadają dojrzałemu białku. Sekwencja aminokwasowa preproformy BMP7 złożona jest w bazie Swiss-Prot pod numerem dostępu P18075 lub jest pokazana na SEQ ID Nr 2. Aminokwasy od 1 do 29 odpowiadają sekwencji liderowej, aminokwasy od 30 do 292 odpowiadają proformie i aminokwasy od 293 do 431 odpowiadają dojrzałemu białku. Dogodnie BMP-2 lub BMP7 oznacza preproformę, proformę lub dojrzały peptyd BMP-2 lub BMP-7, odpowiednio. Ponadto opisane są fragmenty takich białek mające dokładnie takie samą aktywność biologiczną, zwłaszcza własności osteoindukcyjne. Więcej informacji o sekwencji BMP2 i BMP7 zamieszczono poniżej. Sekwencję aminokwasową proformy BMP2 oznaczoną jako proBMP-2 można uzyskać mię

PL 207 552 B1 dzy innymi z bazy Swiss-Prot pod numerem dostępu Pro BMP2 HUMAN; P12643 i jest także pokazana na SEQ ID NR 4. Na SEQ ID NR 5 pokazano sekwencję aminokwasową rhproBMP-2 zawierający dodatkowy znacznik His na N-końcu. rhproBMP2 jest rekombinowaną formą ludzkiego pro-BMP-2.

W dołączonych przykł adach moż e być uż yty mię dzy innymi zarówno rhproBMP-2 pokazany na SEQ ID NR 4, jak i rhproBMP-2 zawierający na N-końcu znacznik His i pokazany na SEQ ID NR 5. Jednakże przykłady nie są ograniczone do SEQ ID NR 4 lub 5, odpowiednio. Jasne jest, że poniższe przykłady można wykonać także z każdą inną tu opisaną sekwencją.

Także korzystniej taki członek rodziny TGF-β jest członkiem podrodziny GDF.

Wykazano, że także czynnik wzrostu i różnicowania (GDF) bierze również udział między innymi w indukcji i remodelowaniu tkanki kostnej. Czynnik Wzrostu i Różnicowania 5 (GDF-5), znany także, jako chrząstkowe białko morfogenetyczne 1 (CDMP-1) jest członkiem podgrupy rodziny BMP, która zawiera także inne pokrewne białka, zwłaszcza GDF-6 i GDF-7. Dojrzała forma białka ma wielkość około 27 kDa i jest homodimerem. Różne badania in vivo i in vitro wykazały, że GDF-5 bierze udział w tworzeniu różnych morfologicznych cech szkieletu ssaków. Mutacje GDF-5 odpowiedzialne są za nieprawidłowości szkieletu, w tym zmniejszenie długości kości kończyn długich, nieprawidłowy rozwój stawów kończyn i mostka (Storm & Kingsley (1999), Development Biology, 209, 11-27). Sekwencja aminokwasowa między myszą a człowiekiem jest silnie konserwowana.

Korzystniej takim członkiem podrodziny GDF jest GDF-5. W najbardziej zalecanym przykładzie wykonania wynalazku taki GDF-5 jest rekombinowanym ludzkim GDF-5 (rhGDF-5), takim jaki szczegółowo opisano poniżej. Sekwencja aminokwasową preproformy GDF-5 złożona jest w bazie Swiss-Prot pod numerem dostępu P43026 lub jest także pokazana na SEQ ID NR 3. Aminokwasy 1 do 27 odpowiadają sekwencji liderowej, aminokwasy 28 do 381 odpowiadają proformie i aminokwasy 382 do 501 odpowiadają dojrzałemu białku. Dogodnie, GDF-5 oznacza preproformę, proformę lub dojrzały peptyd GDF-5. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano także fragmenty GDF-5 mające dokładnie taką samą aktywność biologiczną, zwłaszcza własności osteoindukcyjne. W bardziej zalecanym przykładzie wykonania wynalazku, taki fragment obejmuje aminokwasy 383 do 501 sekwencji pokazanej na SEQ ID Nr 3. Jasne jest też, że dowolna kombinacja wspomnianych powyżej członków rodziny TGF-β może być użyta w wykorzystanym w sposobie według wynalazku roztworze. Poniższe tabele pokazują sekwencje aminokwasowe preproform BMP-2, BMP-7 i GDF-5:

Prepreforma ludzkiego	BMP-2	(Numer dostępu	Swiss-Prot
Prim.: P12643); SEQ ID	No. 1:
Klucz	Od	Do	Długość
Sekw. sygnałowa	1	23	23
PROPEP	24	282	259
hBMP2	283	396	114

PL 207 552 B1

10	20	30	40	50	60
MVAGTRCLLA	LLLPQVLLGG	AAGLVPELGR	RKFAAASSGR	PSSQPSDEVL	SEFELRLLSM
70	80	90	100	110	120
FGLKQRPTPS	RDAWPPYML	DLYRRHSGQP	GSPAPDHRLE	RAASRANTVR	SFHHEESLEE
130	140	150	160	170	180
LPETSGKTTR	RFFFNLSSIP	TEEFITSAEL	QVFREQMQDA	LGNNSSFHHR	INIYEIIKPA
190	200	210	220	230	240
1 TANSKFPVTR	LLDTRLVNQN	ASRWESFDVT	PAVMRWTAQG	HANHGFVVEV	1 AHLEEKQGVS
250	260	270	280 i	290	300
KRHVRISRSL	HQDEHSWSQI	RPLLVTFGHD	1 GKGHPLHKRE	KRQAKHKQRK	RLKSSCKRHP
310	320 \|	330	340	350	360
LYVDFSDVGW	1 NDWIVAP?GY	HAFYCHGECP	FPLADHLNST	NHAIVQTLVN	SVNSKIPKAC
370	380	390
CVPTELSAIS	MLYLDENEKY	VLKNYQDMVV	EGCGCR

Literatura

[1] SEKWENCJA NA PODSTAWIE KWASU NUKLEINOWEGO.

MEDLINE=89072730; PubMed=3201241;

Wozney J. M., Rosen V., Celeste A.J., Mitsock L.M., Whitters M.J., Kriz R.W., Hewick R.M., Wang E.A.;

„Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities”;

Science 242: 1528-1534 (1988).

[2] KRYSTALOGRAFIA rentgenowska (2, 7 ANGSTREMA) 292-396;

MEDLINE=99175323; PubMed=10074410;

Scheufler C., Sebald W., Huelsmeyer M.;

„Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2. 7 A resolution”;

J. Mol. Biol. 287: 103-115 (1999).

PL 207 552 B1

Preproforma ludzkiego BMP-7 (Numer dostępu Swiss-Prot

Prim.:	P18075) ;	SEQ ID No. 2:
Klucz		Od	Do	Długość
Sekw.	Sygnałowa	1	29	29
PROPEP		30	2 92	263
hBMP-7		293	431	139

20 30 40 50 60

I I I I i I

MHVRSLRAAA PHSFVALWA? LFLLRSALAD FSLDNEVHSS FIHRRLRSQE RREMQREILS

80 90 100 110 120

I ! ! ! S I

ILGLPHRPRP HLQGKHNSAP MFMLDLYNAM AVEEGGGPGG QGFSYPYKAV FSTQGPPLA3

130 140 150 160 170 180

I I I I I I

LQDSHFLTDA DMVMSFVNLV EHDKEFFHPR YHHREFRFDL SKIPEGEAVT AAEFRIYKDY

190 200 210 220 230 240

I I I ! ί I

IRERFDNETF RISVYQVLQE HLGRESDLFL LDSRTLWASE EGWLVFDITA T3NHWWNPR

250 260 270 280 290 300

I I I I I I

HNLGLQLSVE TLDGQSINPK LAGLIGRHGP QNKQPFMVAF FKATEVHFRS IRSTGSKQRS

310 320 330 340 350 360 iiiii

QNRSKTPKNQ EALRMANVAE NSSSDQRQAC KKHELYVSFR DLGWQDWIIA PEGYAAYYCE

370 330 390 400 410 420

IIIII

GECAFPLNSY MNATNHA1VQ TLVHFINPET VPKPCCAPTQ LNAI3VLYFD DSSNVILKKY

430

RNMWRACGC H

PL 207 552 B1

Literatura

[1] SEKWENCJA NA PODSTAWIE KWASU NUKLEINOWEGO I SEKWENCJA CZĘŚCIOWA.

TKANKA = Łożysko;

MEDLINE=90291971; PubMed=2357959;

Oezkaynak E., Rueger D. C, Drier E. A., Corbett C, Ridge R. J., Sampath T. K., Oppermann H.;

„OP-1cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-beta family”;

EMBO J. 9: 2085-2093 (1990).

[2] SEKWENCJA NA PODSTAWIE KWASU NUKLEINOWEGO.

MEDLINE=91088608; PubMed=2263636;

Celeste A.J., lannazi J.A., Taylor R.C., Hewick R.M., Rosen V., Wang E.A., Wozney J. M.; „Identification of transforming growth factor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone”;

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 9843-9847 (1990).

[3] KRYSTALOGRAFIA rentgenowska (2,8 ANGSTREMA) 293-431.

MEDLINE=96149402; PubMed=8570652;

Griffith D.L., Keck P.C., Sampath T.K., Rueger D.C., Carlson W.D.;

„Three-dimensional structure of recombinant human osteogenic protein 1: structural paradigm for the transforming growth factor beta superfamily”;

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 878-883 (1996).

Preproforma ludzkiego GDF-5 (Numer dostęp u Swiss-Prot

Prim.: P 43026); SEQ ID No. 3:

Klucz	Od	Do	Długość
Sekw. sygnałowa	1	27	27
PROPEP	28	381	354
hGDF-5	382	501	120

10	20	30
MRLPKLLTFL	LWYLAWLDLE	FICTVLGAPD
70	80 i	90
GGHSYGGGAT	1 NANARAKGGT	GQTGGLTQPK
130	140	150

40	50	60
LGQR?QGSRP	GLAKAEAKER	?PLARNVFRP
100	110	120
1 KDEPKKLPPR	PGGPEPKPGH	?PQTRQATAR
160	170	180

TVTPKGQLPG GKAPPKAGSY PSSFLLKKAR EPGPPREPKE PFRPPPITPH EYMLSLYRTL

PL 207 552 B1

190 I	200 I	210	220	230	240
1 SDADRKGGNS	1 SVKLEAGLAN	TITSFIDKGQ	DDRGPVVRKQ	RYVFDISALE	KDGLLGAELR
250 I	260 I	270	230	290	300 1
1 ILRKKPSDTA	1 KPAVPRSRRA	AQLKLSSCPS I	GRQPAALLDV	RSVPGLDGSG 1	t WEVFDIWKLF
310	320	1 330 I	340	1 350 1	360
RNFKNSAQLC	LELEAWERGR	1 TVDLRGLGFD	RAARQVHEKA	1 LFLVFGRTKK	RDLFFNE1KA
370	380	390 1	400	410	420
RSGQDDKTVY	EYLFSQRRKR	1 RAPLATRQGK	1 RPSKNLKARC	SRKALHVNFK	DMGWDDWIIA
430	440	450	460 1	470	480
PLEYEAEHCE	GLCEFPLRSH	LEPTNHAVIQ	1 TLMNSMDPES	TPPTCCVPTR	LSPISILFID
490	500
SANNWYKGY	SDMWESCGC	R

Literatura

[1] SEKWENCJA NA PODSTAWIE KWASU NUKLEINOWEGO.

TKANKA=Łożysko;

MEDLINE=95071375; PubMed=7980526;

Hoetten G., Neidhardt H., Jacobowsky B., Pohl J.;

„Cloning and expression of recombinant human growth/differentiation factor 5”;

Blochem. Biophys. Res. Commun. 204: 646-652 (1994).

[2] SEKWENCJA NA PODSTAWIE KWASU NUKLEINOWEGO.

TKANKA=Chrząstka stawowa;

MEDLINE=95050604; PubMed=7961761;

Chang S., Hoang B., Thomas J.T., Vukicevic S., Luyten F.P., Ryba N.J.P., Kozak C.A., Reddi A.H., Moos M.;

„Cartilage-derived morphogenetic proteins. New members of the transforming growth factorbeta superfamily predominantly expressed in long bones during human embryonic development”;

J. Biol. Chem. 269: 28227-28234 (1994).

PL 207 552 B1

Może się zdarzyć, że pokazane powyżej opublikowane sekwencje, po uzyskaniu z Swiss-Prot zawierają błąd/błędy, na przykład, spowodowane błędami w czasie sekwencjonowania. Konsekwencją takich błędów sekwencjonowania może być (a) cicha mutacja/mutacje lub zmiana kodonu/kodonów, które w wyniku tego kodują inne aminokwas/aminokwasy niż wcześniej opublikowano. Jednakże, ponieważ baza Swiss-Prot jest uaktualniana, jeżeli podejrzewa się wystąpienie błędów sekwencjonowania, najświeższą sekwencję/sekwencje można otrzymać z Swiss-Prot pod wskazanym numerem dostępu lub podając odpowiednią nazwę polipeptydów wskazaną powyżej.

Na przykład, SEQ ID NR 3 może zawierać następujące podstawienia aminokwasowe w proformie preproformy ludzkiego GDF-5: w pozycji 38 aminokwas seryna (S) zastąpiony jest przez aminokwas treoninę (T), w pozycji 254 SEQ ID NR 3 aminokwas walina (V) zastąpiony jest przez aminokwas alaninę (A), w pozycji 256 SEQ ID NR 3 aminokwas arginina (R) zastąpiony jest przez aminokwas glicynę (G), w pozycji 257 SEQ ID NR 3 aminokwas seryna (S) zastąpiony jest przez aminokwas glicynę (G), w pozycji 258 SEQ ID NR 3 aminokwas arginina (R) zastąpiony jest przez aminokwas glicynę (G), w pozycji 276 aminokwas alanina (A) zastąpiony jest przez aminokwas serynę (S) i w pozycji 321 SEQ ID NR 3 aminokwas treonina (T) zastąpiony jest przez aminokwas alaninę (A). Powstająca sekwencja aminokwasową, w której mogą występować wspomniane powyżej zastąpienia aminokwasowe pokazana jest na SEQ ID NR 6. Należy także rozumieć, że zastąpienie/zastąpienia aminokwasowe w proformie sekwencji aminokwasowej preproformy GDF-5 pokazane na SEQ ID NR 3 nie zaburzają, nie zmieniają lub nie znoszą fizjologicznych funkcji GDF-5. W kontekście tego zgłoszenia jasne jest, że SEQ ID NR 6 może także być zastosowana w połączeniu ze środkami i sposobami według tego wynalazku.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku urządzenie takie jest wolne od substancji toksycznych. Termin „substancje toksyczne” obejmuje zwłaszcza te toksyczne rozpuszczalniki organiczne i dodatki, które są stosowane w sposobach opisanych w dziedzinie, na przykład, acetonitryl lub kwas chromosiarkowy. Po wszczepieniu urządzeń zawierających takie substancje mogą one powodować zapalenie lub inne reakcje. Takie urządzenia są mniej akceptowalne terapeutycznie ze względu na opisane niepożądane skutki uboczne, których nie można uniknąć stosując opisane w dziedzinie sposoby opłaszczania i niektóre sposoby traktowania powierzchni. Ponadto, międzynarodowe wytyczne dla opracowywania białek terapeutycznych wymagają, żeby unikać w procesie wytwarzania stosowania szkodliwych i toksycznych substancji (szczegółowy opis zamieszczono w: International Conference on Harmonisation (ICH), Topic Q3C; www.emea.eu.int/). Jednakże, urządzenie według wynalazku lub urządzenie wytworzone sposobem według wynalazku, korzystnie, jest wolne od takich toksycznych substancji i dlatego jest dobrze akceptowane terapeutycznie i spełnia wymagania organów regulacyjnych.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku taki roztwór pozwala na rozpuszczenie opisanych białek przez czas wystarczający do homogennego opłaszczenia opisanej metalicznej powierzchni nośnika. Termin „roztwór, który pozwala na rozpuszczenie opisanych białek przez czas wystarczający do homogennego opłaszczenia opisanej metalicznej powierzchni nośnika” oznacza roztwór, w którym białka osteoindukcyjne mogą być wydajnie rozpuszczone. Homogenne opłaszczenie oznacza, że po traktowaniu takim roztworem powierzchnia nośnika jest całkowicie opłaszczona opisanym białkiem osteoindukcyjnym. Homogenne opłaszczenie cechuje się tym, że zasadniczo jednakowe ilości białka obecne są na każdej i całej powierzchni opisanego nośnika. Homogenne opłaszczenie jest warunkiem wstępnym dla wydajnego uwalniania i homogennej dystrybucji i aktywności białka osteoindukcyjnego do tkanki otaczającej miejsce wszczepienia. Ponadto, należy rozumieć, że białka osteoindukcyjne nie są zagregowane i częściowo lub całkowicie inaktywowane w wyniku wytrącenia lub mikrowytrącenia, przez homogenne opłaszczenie osiąga się raczej przytwierdzenie aktywnych biologicznie, niezagregowanych białek. Takie homogenne opłaszczenie można osiągnąć sposobem według wynalazku i opisanym w załączonych przykładach. W załączonych przykładach opisane są także sposoby i środki kontrolowania homogennego opłaszczania, ilościowego oznaczania i charakteryzowania immobilizowanych białek. Roztwór może być zrobiony przez fachowca w oparciu o rozpuszczalność białka osteoindukcyjnego, która zależy od pH, siły jonowej i wpływu nośnika na te parametry po skontaktowaniu tego nośnika z roztworem. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwierdzono, że odpowiedni roztwór do sposobu według wynalazku zawiera tylko składniki, które nie wpływają na stan utlenienia białka osteoindukcyjnego. Na przykład, w procesie opłaszczania nie mogą być stosowane sacharydy takie jak sacharoza lub trehaloza (szczegóły opisano w przykładzie 9), które często stosuje się jako zaróbki w preparatach białkowych (czynnik stabilizujący lub spęczniający), ponieważ zmniejszają one wiąza14

PL 207 552 B1 nie białka do powierzchni metalu. Inne składniki, których powinno się unikać opisane są w załączonych przykładach poniżej.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku taki roztwór pozwala na zatężenie białka osteoindukcyjnego do ponad 0,5 mg/ml, zwłaszcza ponad 2 mg/ml i w szczególności ponad 3 mg/ml.

Także korzystny jest sposób, w którym taki roztwór ma kwaśne pH. Termin „słabo kwaśne” oznacza organiczne lub nieorganiczne związki zawierające przynajmniej jeden związany atom wodoru, który może tworzyć jon. Słabe kwasy są dobrze znane w dziedzinie i są opisane w standardowych podręcznikach, takich jak Rompp, leksykon chemiczny. Zalecane słabe kwasy, które mają niski stopień dysocjacji opisane są przez wartości pK pomiędzy 3 i 7, zwłaszcza pomiędzy 4 i 6.

Najkorzystniej takie kwaśne roztwory zawierają HCl, kwas octowy, kwas cytrynowy i/lub kwas bursztynowy.

W innym najbardziej korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, stężenie kwasu jest mniejsze niż lub równe 100 mmol/l, zwłaszcza mniejsze niż 50 mmol/l i w szczególności mniej niż 25 mmol/l a najlepiej mniejsze niż 15 mmol/l.

W innym najbardziej korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, roztwór jest wysycony gazem obojętnym, najkorzystniej azotem, argonem lub helem. W swoim najbardziej korzystnym przykładzie wykonania, sposób według wynalazku prowadzi się w komorze o kontrolowanej atmosferze, wilgotności, temperaturze i określonej szybkości wymiany powietrza.

Wynalazek dostarcza także urządzenia, które można wytworzyć sposobem według wynalazku.

Definicje i wyjaśnienia terminów przedstawione poprzednio w kontekście sposobów według wynalazku odnoszą się do urządzeń opisanych tu poniżej. Urządzenie takie posiada cechy, które nadają mu opisane powyżej sposoby. Szczególnie, urządzenie zawiera białko osteoindukcyjne, które jest homogennie opłaszczone na porowatej lub nieporowatej powierzchni urządzenia z metalu lub stopu, przy czym stan utlenienia białka osteoindukcyjnego nie jest znacząco większy w porównaniu z białkiem osteoindukcyjnym, które nie jest opłaszczone na takiej powierzchni metalu lub stopu. Zalecane urządzenia są szczegółowo opisane w przykładach poniżej.

Wynalazek obejmuje kompozycję farmaceutyczną zawierającą urządzenie według wynalazku lub urządzenie, które można wytworzyć sposobem według wynalazku. Definicje i wyjaśnienia terminów przedstawione poprzednio w kontekście sposobów i urządzeń według wynalazku odnoszą się do kompozycji farmaceutycznych tu opisanych.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie urządzenia według wynalazku lub ewentualnie urządzenia, które można wytworzyć sposobem według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zastosowania do przyśpieszonej osteointegracji i tworzenia nowych kości. Definicje i wyjaśnienia terminów przedstawione poprzednio odnoszą się do takiego zastosowania wynalazku, jakie tu opisano. Termin „osteointegracja i tworzenie nowych kości” oznacza, że kość ma zdolność tworzenia nowej kości wokół implantu i integracji z implantem. Integracja oznacza przyłączanie się komórek kości do powierzchni implantu, pozwalające na mocne i trwałe zakotwiczenie protezy rekonstruującej w warunkach obciążenia funkcjonalnego bez bólu, zapalenia lub obluzowania.

Korzystniej taka przyśpieszona osteointegracja i tworzenie nowych kości stosowana jest w celu leczenia urazowych, złośliwych lub sztucznych defektów, w celu i leczenia defektów dentystycznych lub w celu leczenia stawu biodrowego, łokciowego, kręgosłupa, kolanowego, palców lub kostki. Objawy tych opisanych powyżej chorób i zaburzeń opisane są szczegółowo w standardowych podręcznikach medycyny, takich jak Pschyrembel and Stedman.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób leczenia jednej lub więcej chorób opisach w odniesieniu do zastosowań tego wynalazku, przy czym sposób ten obejmuje przynajmniej etap podania pacjentowi urządzenia według wynalazku lub urządzenia, które można wytworzyć sposobem według wynalazku w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie. Zalecanym podmiotem jest człowiek.

Przedmiotem wynalazku jest zestaw zawierający urządzenie według wynalazku lub ewentualnie urządzenie, które można wytworzyć sposobem według wynalazku. Definicje i wyjaśnienia terminów przedstawione poprzednio w kontekście sposobów, urządzeń, kompozycji farmaceutycznych i zastosowań według wynalazku odnoszą się do zestawu tu opisanego. Części zestawu według wynalazku można zapakować pojedynczo w fiolki lub inne odpowiednie środki w zależności od odpowiedniego składnika lub w połączeniu z odpowiednimi pojemnikami lub jednostkami wielopojemnikowymi. Wytwarzanie takiego zestawu podlega dogodnie standardowym procedurom, które są dobrze znane fachowcom. Urządzenie pakowane jest dogodnie w pojemnik lub naczynie w atmosferze beztlenowej, takiej jak atmosfera gazu obojętnego, zwłaszcza zawierająca azot.

PL 207 552 B1

Figury pokazują:

Figura 1: Procent utlenionego rhGDF-5 po ekstrakcji 10 mmol/l HCl.

Figura 2: Barwienie fluorescencyjne płytki metalowej opłaszczonej rhGDF-5 w 10 mM HCl.

Figura 3: Barwienie fluorescencyjne płytki metalowej opłaszczonej rhGDF-5 w PBS.

Figura 4: Barwienie fluorescencyjne płytki metalowej opłaszczonej 10 mmol/l HCl.

Figura 5: Barwienie fluorescencyjne pustej płytki metalowej.

Figura 6: Uwalnianie rhGDF-5 z wcześniej traktowanych powierzchni tytanowych. Podsumowanie wyników badanych metod ą ELISA.

Figura 7: Opłaszczanie powierzchni tytanowej roztworem rhGDF-5 z i bez sacharozy.

Figura 8: Procent utlenionego rhGDF-5 po ekstrakcji z wcześniej traktowanych płytek w temperaturze pokojowej.

Figura 9: Procent utlenionego rhGDF-5 po ekstrakcji z wcześniej traktowanych płytek w temperaturze 4°C.

Figura 10: Wzrost zmodyfikowanego rhproBMP-2 po opłaszczeniu/ekstrakcji w porównaniu do roztworu opłaszczającego.

Wynalazek zostanie teraz opisany w odniesieniu do następujących przykładów biologicznych, które są jedynie ilustracją, a nie mają być rozumiane jako ograniczenie zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Ilościowe oznaczanie rhGDF-5 za pomocą RP-HPLC

Ilość rhGDF-5 oznaczano metodą HPLC w fazie odwróconej. Próbkę nanoszono na kolumnę Poros C8-18 (R2/10, 21. x 30 mm), zrównoważoną 0,1% kwasem mrówkowym, 21% acetonitrylem. Po przemyciu kolumny prowadzono wymywanie 0,1% kwasem mrówkowym, i gradientem 21-84% acetonitrylu (przepływ: 0,4 ml/min). Wymywanie obserwowano mierząc absorbancję przy 220 nm. Ilościowe oznaczenie prowadzono na podstawie piku przy użyciu wcześniej przygotowanej krzywej standardowej.

P r z y k ł a d 2

Ekstrakcja i ilościowe oznaczanie związanego białka

Białko ekstrahowano inkubując opłaszczony przedmiot najpierw w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie opłaszczony przedmiot inkubuje się w 10 mmol/l HCl przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Po doprowadzeniu próbki PBS do pH 2, roztwory PBS i HCl zawierające wyekstrahowany czynnik wzrostu kości badano za pomocą RP-HPLC opisanej w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 3

Ilościowe oznaczanie rozpuszczalnych agregatów w roztworach zawierających wyekstrahowane białko

Ilość rozpuszczalnych agregatów w próbkach zawierających wyekstrahowane białko oznaczano za pomocą HPLC wykluczania (sączenia molekularnego). Kolumnę (TSK 3000) równoważono 50 mmol/l kwasem octowym, 50 mmol/l kwasem fosforowym, NaOH, pH 3,0. Wymywanie obserwowano stosując wykrywanie UV przy 220 nm. Ilościowe oznaczanie prowadzono mierząc stosunek powierzchni piku agregatów w stosunku do całkowitej powierzchni piku.

P r z y k ł a d 4

Określenie chemicznych modyfikacji wyekstrahowanego białka

Ilość chemicznych modyfikacji, to znaczy utlenienie czynnika wzrostu kości w roztworach zawierających wyekstrahowane białko określano za pomocą RP-HPLC. Próbkę nanoszono na kolumnę Vydak C8-18 (2 x 250 mm), zrównoważoną 0,15% TFA, 20% acetonitrylem. Po przemyciu kolumny wymywanie czynnika wzrostu kości prowadzono 0,1% TFA, i stopniowym gradientem 20%-84% acetonitrylu (przepływ: 0,3 ml/min). Wymywanie obserwowano mierząc absorbancję przy 220 nm. Ilościowe oznaczenie prowadzono mierząc stosunek powierzchni piku cząsteczek zmodyfikowanych w stosunku do całkowitej powierzchni piku.

P r z y k ł a d 5

Opłaszczanie i uwalnianie Ti6AI4V czynnikiem wzrostu kości rhGDF-5 może być utleniony w znacznym stopniu po cyklu opłaszczania/uwalniania przy użyciu jako powierzchni płytek tytanowych. Opisany tutaj sposób i urządzenie do opłaszczania pozwalają na uniknięcie utleniania białka w czasie procedury opłaszczania.

Urządzenie do opłaszczania tytanu lub stopu tytanu czynnikiem wzrostu kości

Proces opłaszczania prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego w celu usunięcia tlenu. Żeby utrzymać te warunki używa się komory. Komora składa się z hermetycznie zamkniętej przestrzeni

PL 207 552 B1 z ciągłym przepływem obojętnego gazu, na przykład gazowym N2. Wewnątrz komory utrzymywane jest lekkie nadciśnienie. Materiały potrzebne do procesu opłaszczania przenosi się do komory przez śluzę gazową. Komora pozwala na ręczny, a także zautomatyzowany proces opłaszczania. W celu określenia i standaryzacji procesu opłaszczania w komorze mierzy się i utrzymuje wilgotność względną.

Opłaszczanie

Płytki tytanowe oczyszczano, myto wodą demineralizowaną i suszono. Płytki tytanowe opłaszczano 60 μg rhGDF-5. Każdą płytkę kładziono płasko na szalkę i opłaszczano roztworem rhGDF-5 na jednej stronie płytki metalowej. Opłaszczanie prowadzono w atmosferze gazowego N2 w komorze opisanej powyżej i w temperaturze 0°C do 4°C. Po opłaszczeniu płytkę suszono w odpowiednich warunkach przez 30 minut pod próżnią.

Ekstrakcja rhGDF-5 inkubowano najpierw w PBS, żeby naśladować warunki zbliżone do fizjologicznych. Żeby utrzymywać próbki w warunkach prawie beztlenowych, roztwór PBS odpowiednich próbek nasycano gazowym N2. Po inkubacji w PBS płytki inkubowano w 10 mmol/l HCl przez 3 godziny w odpowiedniej temperaturze. rhGDF-5 w roztworach do ekstrakcji mierzono ilościowo za pomocą RP-HPLC (patrz przykład 1). Ilość utlenionego rh-GDF-5 także określano za pomocą RP-HPLC (patrz przykład 4). W celu umożliwienia porównania próbek opłaszczonych i ekstrahowanych tak jak opisano powyżej, tę samą procedurę wykonano w temperaturze pokojowej w atmosferze tlenowej.

T a b e l a 1

Próbka	Atmosfera	Temperatura	% utlenionego białka po ekstrakcji (średnia)	SD
Implant	Powietrze	RT	10,0	1,6
Implant	N2	4°C	5,6	0,6
Roztwór ogólny	Powietrze	RT	4,7	0,0

Badane parametry w doświadczeniach miały wpływ na ilość utlenionego rhGDF-5 po ekstrakcji z płytek tytanowych: Próbki opłaszczone w obecności tlenu z powietrza w temperaturze pokojowej wykazują ilość utlenionego rhGDF-5 10,0% ± 1,6% jak pokazano w tabeli 1 i na fig. 1. Próbki obrabiane w temperaturze 4°C i w atmosferze gazowego N2 wykazują po ekstrakcji zawartość 5,6% ± 0,6% utlenionego rhGDF-5. W porównaniu z roztworem ogólnym rhGDF-5 próbki roztworu rhGDF-5 obrabiane w temperaturze 4°C i w atmosferze gazowego N2 wykazały brak znaczących różnic w ilości utlenionego rhGDF-5 (4,7% ± 0%).

P r z y k ł a d 6

Określenie homogenności opłaszczania czynnikiem wzrostu kości na powierzchniach tytanowych metodą mikroskopii fluorescencyjnej

Przy użyciu fluorescencyjnego znacznika białek zbadano gęstość opłaszczania czynnikiem wzrostu kości przedmiotu tytanowego. Badanie wykonano metodą mikroskopii fluorescencyjnej.

Opłaszczanie

Jedną płytkę kładziono płaską stroną na szalce i opłaszczano 10 μl roztworu 6,18 mg/ml 10 mmol/l HCl rhGDF-5 na jednej stronie metalowej płytki. Drugą płytkę opłaszczano 10 μl 10 mmol/l HCl. Płytki suszono przez 30 minut pod próżnią. Trzeciej płytki nie opłaszczano i stosowano ją jako ślepą. Dodatkowo płytkę opłaszcza się roztworem 6,0 mg/ml rhGDF-5 w PBS.

Fluorescencyjne barwienie białka

Do 1 ml roztworu 0,15 M NaHCO₃ dodawano 2,3 μl 10 mmol/l roztworu Alexa Fluor™ 488. 3 metalowe płytki inkubowano w 1 ml mieszaniny barwnika fluorescencyjnego w ciemności przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Stosunek białko:fluorofor wynosi 1:10. Płytkę użytą jako ślepą inkubowano tylko przez 20 minut. Po inkubacji płytki przemywano intensywnie demineralizowaną wodą i suszono w ciemności przez 15 min pod próżnią.

Sygnał fluorescencyjny wykrywano metodą mikroskopii fluorescencyjnej i dokumentowano przy użyciu oprogramowania do zbierania obrazu. Na fig. 2 obszar opłaszczony rhGDF-5 mógł być łatwo określony za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. To znaczy marker fluorescencyjny był związany z białkiem. W przeciwieństwie do tego fig. 3 pokazuje znaczenie rozpuszczalnika rhGDF-5, ponieważ opłaszczanie roztworem zawierającym PBS prowadzi do niehomogennego rozłożenia białka i skupień białka.

PL 207 552 B1

W celu wykluczenia artefaktów na fig. 4 pokazano płytkę opłaszczoną 10 mmol/l HCl. 10 mmol/l HCl jest rozpuszczalnikiem roztworu rhGDF-5. Żeby wykluczyć jakiekolwiek działania rozpuszczalnika przygotowano także ślepą płytkę, która nie była opłaszczona rhGDF-5 lub 10 mmol/l HCl, ale była także inkubowana ze znacznikiem fluorescencyjnym Alexa Fluor™ 488 (fig. 5). Zdjęcia wyraźnie pokazują, że tylko rhGDF-5 barwi się znacznikiem fluorescencyjnym. Co więcej, rozkład białka na powierzchni jest regularny, jeżeli rozpuszczalnikiem jest 10 mmol/l HCl.

P r z y k ł a d 7

Długotrwałe uwalnianie in vitro czynnika wzrostu kości z wcześniej traktowanych powierzchni tytanowych

Opracowano sposób opłaszczania powierzchni tytanowych czynnikiem wzrostu kości. Po standaryzowanej ekstrakcji twórcy wynalazku byli w stanie zanalizować białka pod kątem agregatów białkowych (przykład 3), ilości utlenionego czynnika wzrostu kości (przykład 4) oraz ilościowo określić wyekstrahowanego białka (przykład 1). W opisanym tu doświadczeniu określano kinetykę uwalniania czynnika wzrostu kości w wyniku inkubacji opłaszczonych płytek tytanowych w podłożu do hodowli komórkowych przez 30 dni. W celu odtworzenia warunków fizjologicznych i aktywności metabolicznej, wymieniano podłoże co 48 godzin i oznaczano ilość uwolnionego białka za pomocą ELISA.

Opłaszczanie

Próbkę opłaszczano jak opisano w przykładzie 5.

30-dniowe uwalnianie

Płytkę inkubowano w 6 ml uwalniającego podłoża: 89% aMEM, 1% penicylina, streptomycyna, 10% FCS przez 30 dni w temperaturze 4°C. Próbki stale obracano na mieszadle. Co 48 godzin inkubacji pobierano nadsącz i przechowywano zamrożony w temperaturze -70°C. Do próbek dodawano 6 ml świeżego podłoża.

Ilość uwolnionego białka w próbkach oznaczano ilościowo za pomocą ELISA skierowanej na czynnik wzrostu kości. Studzienki 96-studzienkowej płytki spłaszczano przeciwciałem monoklonalnym przeciw rhGDF-5. Po przemyciu płytki PBS zawierającym 0,05% Tween 20 i zablokowaniu roztworem SuperBloc (Pierce, Numer katalogowy 37515) dodawano próbki zawierające rhGDF-5 i płytki inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po przemyciu próbki (patrz powyżej) dodawano drugiego biotynylowanego przeciwciała przeciw rhGDF-5 i próbki inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po przemyciu dodawano kompleksu strepawidyna-peroksydaza i próbki inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, studzienki przemywano PBS, zawierającym 0,05% Tween 20 i ilość związanej peroksydazy określano przy użyciu substratu BM Blue-POD (Roche Diagnostics, Numer katalogowy 148428). Wykrywanie zachodzi przy długości fali 450 nm, referencyjna długość fali wynosi 630 nm. Ilość rhGDF-5 obliczano na podstawie krzywej standardowej dla rhGDF-5. Wyniki badania uwalniania czynnika wzrostu kości określonego za pomocą ELISA podsumowane są w tabeli 2 i na figurze 6. Ilość uwolnionego po 30 dniach białka określona metodą ELISA wynosi 100,4 ± 0,8.

T a b e l a 2

Dzień	ELISA: % wyekstrahowanego białka
2	37,1
5	68,7
7	87,0
9	94,0
12	98,0
14	99,1
16	99,7
19	100,4

PL 207 552 B1

P r z y k ł a d 8

Opłaszczanie i ekstrakcja rhBMP-2 z tytanu lub stopu tytanu

W tym przykładzie badano zachowanie rhBMP-2 w czasie procesu opłaszczania/ekstrakcji: rhBMP2 podobnie jak rhGDF-5 jest kolejnym członkiem rodziny białek TGF-β.

Opłaszczanie

Płytki kładziono płaską stroną na szalce i opłaszczano 10 μl roztworu 6,0 mg/ml czynnika wzrostu kości lub roztworu rhBMP2 na jednej stronie płytki. Wszystkie płytki suszono przez 30 minut pod próżnią.

Ekstrakcja

Płytki ekstrahowano PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie płytki opłaszczone czynnikiem wzrostu kości i rhBMP2 inkubowano w 10 mmol/l HCl przez 3 godziny. Wyniki opisanych powyżej doświadczeń podsumowano w tabeli 3.

T a b e l a 3

Numer próbki	Białko	% biał ka wyekstrahowanego w PBS	% biał ka wyekstrahowanego w 10 mmol/l HCl	Całkowity odzysk białka w %
1	rhGDF-5	8,8	83,2	92,0
2	rhBMP2	0	111,3	111,3
3	rhBMP2	0	105,1	105,1

Stwierdzono, że w czasie inkubacji w PBS, rhBMP-2 wcale nie ekstrahuje się, a rhGDF-5 ekstrahuje się 8,8%. Wyniki wskazują, że białka pochodzące z rodziny białek TGFβ wiążą się z powierzchniami metalicznymi i mogą być (prawie) całkowicie wyekstrahowane w 10 mmol/l HCl po inkubacji PBS.

P r z y k ł a d 9

Opłaszczanie tytanu lub stopu tytanu czynnikiem wzrostu kości w obecności sacharozy

W tym przykładzie opisano opłaszczanie powierzchni tytanowych roztworem rhGDF-5 zawierającym 10% sacharozy. Dla porównania opłaszczano powierzchnie tytanowe czynnikiem wzrostu kości w 10 mmol/l HCl.

Płytki tytanowe przemywano wodą demineralizowaną, suszono i opłaszczano, odpowiednio, 40 μg czynnika wzrostu kości w 10 mmol/l HCl albo 40 μq czynnika wzrostu kości w 10% sacharozy, 10 mmol/l HAc i 5 mmol/l HCl. Następnie materiał tytanowy przemywano PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Potem białko ekstrahowano inkubując w 100 mmol/l HCl przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Zawartość białka we wszystkich roztworach określano za pomocą RP-HPLC. Przed ilościowym oznaczeniem roztwór PBS doprowadzano do pH 2 w celu zwiększenia rozpuszczalności czynnika wzrostu kości. W opisanych tu doświadczeniach, przygotowano dwa kawałki metalu opłaszczone dwoma różnymi sposobami: Płytki tytanowe opłaszczone roztworem czynnika wzrostu kości z lub bez 10% sacharozy. Wyniki procedury opłaszczania i ekstrakcji podsumowane są w tabeli 4:

T a b e l a 4

Numer próbki	Bez sacharozy	10% sacharozy
Masa białka na przedmiocie tytanowym po opłaszczeniu (pg)	4,5	4,5
Czynnik wzrostu kości wyekstrahowany w PBS (%)	0	0
Czynnik wzrostu kości wyekstrahowany w 100 mmol/l HCl (%)	70,3	32,5
Całkowity odzysk białka (%)	70,3	32,5

Stwierdzono istotną różnicę w opłaszczaniu płytek tytanowych roztworami czynnika wzrostu kości z lub bez 10% sacharozy. Z próbki zawierającej sacharozę odzyskuje się 32,5% białka, a z próbki niezawierającej sacharozy odzyskuje się 70,3% czynnika wzrostu kości (patrz figura 7).

Doświadczenia opisane powyżej miały na celu zbadanie, czy obecność sacharozy w roztworach opłaszczających wpływa na wiązanie czynnika wzrostu kości do powierzchni metalicznej. Wyniki wykazały, że całkowity odzysk jest znacząco mniejszy niż odzysk czynnika wzrostu kości po opłaszczeniu bez sacharozy.

PL 207 552 B1

P r z y k ł a d 10

Opłaszczanie i uwalnianie Ti6AI4V czynnikiem wzrostu kości - wpływ czynników redukujących

A) wpływ czynników redukujących w roztworze opłaszczającym

W celu uniknięcia utleniania białka w czasie cyklu opłaszczania i ekstrakcji, do roztworu opłaszczającego dodano czynnik redukujący: do roztworu opłaszczającego czynnik wzrostu kości lub ich kombinacji dodano 10 mmol/l następujących związków:

μl Próbka 1 (Ślepa): 5,04 mg/ml czynnika wzrostu kości w 10 mmol/ HCl μl Próbka 2: 10 mmol/l EDTA + 3,94 mg/ml czynnika wzrostu kości μl Próbka 3: 10 mmol/l Met + 4,54 mg/ml czynnika wzrostu kości μl Próbka 4: 10 mmol/l Na₂SO₃ + 4,54 mg/ml czynnika wzrostu kości μl Próbka 5: 10 mmol/l Met + 10 mmol/l EDTA + 3,84 mg/ml czynnika wzrostu kości μ Próbka 6: 10 mmol/l EDTA + 10 mmol/l i Na₂SO₃ + 3,84 mg/ml czynnika wzrostu kości; i prowadzono opłaszczanie tak jak opisano w przykładzie 5.

Ekstrakcja

Najpierw czynnik wzrostu kości ekstrahowano PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (inkubacja w PBS jest symulacją fizjologicznej sytuacji w organizmie). Następnie, płytki ekstrahowano 10 mmol/l HCl przez 3 godziny. Ilość czynnika wzrostu kości w roztworach do ekstrakcji dla każdej próbki mierzono ilościowo za pomocą RP-HPLC jak opisano w przykładzie 1. Ilość utlenionego białka określano tak jak opisano w przykładzie 4. Wyniki opisanych powyżej doświadczeń podsumowano w tabeli 5.

T a b e l a 5

Numer próbki	1	2	3	4	5	6	7
Czynnik redukujący	Brak (ślepa)	EDTA	Met	Na2SO3	EDTA/. Met	EDTA/. Na2SO3	Roztwór ogólny
Czynnik wzrostu kości wyekstrahowany w PBS (%)	13	78	41	...	53	50	...
Ekstrakcja czynnika wzrostu kości w 10 mmol/l HCl (%)	69	...	32	76	...	...	...
Całkowity odzysk białka	82	78	73	76	53	50	...
Ilość utlenionych cząsteczek po ekstrakcji PBS (%)	...	13	8	...	9	14
Ilość utlenionych cząsteczek po ekstrakcji HCl	10	*)	12	23	*)	*)	5 w HCl (bez ekstrakcji)

*) nie stwierdzono występowania żadnego białka za pomocą ilościowego oznaczenia HPLC po ekstrakcji HCl.

Odzysk ze wszystkich próbek wynosił pomiędzy 50% a 82%. We wszystkich próbkach białko ekstrahuje się w PBS, z wyjątkiem próbki zawierającej Na2SO3. Ilość utlenionych cząsteczek określano w próbkach ekstrahowanych PBS i w próbkach ekstrahowanych HCl. Ilość utlenionych cząsteczek wynosi pomiędzy 8% a 23%. Podsumowując, użycie czynników redukujących w roztworze do opłaszczania nie jest metodą z wyboru w celu uniknięcia utleniania czynnika wzrostu kości. Albo całkowity odzysk jest niski albo białko wcześniej ekstrahuje się PBS w większej ilości albo ilość utlenionego czynnika wzrostu kości jest znacząco większa. Dlatego konieczne jest użycie innych metod w celu uniknięcia utleniania czynnika wzrostu kości w czasie cyklu opłaszczania i ekstrakcji.

B) Namaczanie powierzchni w czynnikach redukujących przed rozpoczęciem procesu opłaszczania

Opisano wpływ czynników redukujących w roztworze do opłaszczania. Porównano tu działanie różnych czynników redukujących po inkubacji traktowanych wcześniej płytek metalowych przez 24 godziny w roztworze zawierającym odpowiedni czynnik redukujący. Następnie prowadzono procedurę opłaszczania i ekstrakcji w dwóch różnych temperaturach.

Wszystkie próbki inkubowano w jednym z 10 mmol/l roztworów następujących czynników redukujących: tiokarbamid, kwas askorbinowy, siarczyn sodu, cysteina, metionina, merkaptoetanol.

Po inkubacji przez 24 godziny płytki przemywano wodą demineralizowaną i suszono 15 minut pod próżnią w temperaturze pokojowej. Wszystkie płytki kładziono płaską stroną na szalce i opłaszczano 10 μl roztworu 6,95 mg/ml rhGDF-5 na jednej stronie metalowej płytki. Połowę płytek suszono

PL 207 552 B1 pod próżnią w temperaturze 4°C, a drugą połowę płytek suszono pod próżnią w temperaturze pokojowej. Procedurę opłaszczania i ekstrakcji prowadzono w temperaturze 4°C i w temperaturze pokojowej. Najpierw rhGDF-5 ekstrahowano PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Potem płytki inkubowano w 10 mmol/l HCl przez 3 godziny. Ilość rhGDF-5 w roztworach do ekstrakcji dla każdej próbki oznaczano ilościowo za pomocą RP-HPLC (przykład 1). Następnie ilość utlenionych cząsteczek białka określano za pomocą RP-HPLC (przykład 4). W tabeli 6 próbki wymieniono zgodnie ze sposobem wcześniejszego traktowania.

T a b e l a 6

Numer próbki	Wcześniejsze traktowanie II	Temperatura C/E	% utlenionego rhGDF-5
1	tiokarbamid	4°C	12,2
2	kwas askorbinowy	4°C	12,6
3	siarczyn sodowy	4°C	9
4	cysteina	4°C	9,7
5	metionina	4°C	11,1
6	merkaptoetanol	4°C	11,3
7	tiokarbamid	RT	15,0
8	kwas askorbinowy	RT	15,1
9	siarczyn sodowy	RT	17,3
10	cysteina	RT	17,8
11	metionina	RT	16,1
12	merkaptoetanol	RT	14,7
Roztwór ogólny	brak	RT	5,0

Ilość utlenionego rhGDF-5 we wszystkich próbkach wynosi pomiędzy 9,0% a 12,6%, podczas gdy roztwór białka używany jako materiał wyjściowy zawiera 5% utlenionych cząsteczek. W próbkach inkubowanych w temperaturze 4°C ilość utlenionego białka jest niższa niż w odpowiednich próbkach traktowanych w temperaturze pokojowej. Na podstawie tych wyników można wnioskować, że żadna z użytych zaróbek nie jest zdolna do znaczącego zmniejszenia utleniania białka. Ilość utlenionego białka pokazana jest na figurach 8 i 9.

Głównym celem opisanego tu doświadczenia jest inkubacja traktowanych wcześniej płytek z różnymi czynnikami redukującymi. Wysnuto wniosek, że inkubacja płytek metalowych przez 24 godziny w roztworach czynników redukujących nie jest metodą z wyboru pozwalającą na uniknięcie utleniania białek.

P r z y k ł a d 11

Ilościowe oznaczanie rhproBMP-2 i rhBMP-2 z pomocą RP-HPLC

Ilość rhproBMP-2/rhBMP-2 określano za pomocą HPLC w odwróconej fazie. Próbkę nanoszono na kolumnę Poros C4 (20 x 2 mm), zrównoważoną 0,045% TFA. Po przemyciu kolumny prowadzono wymywanie 0,025% TFA, 84% acetonitrylem i gradientem 21-84% acetonitrylu (przepływ: 0,4 ml/min). Wymywanie obserwowano mierząc absorbancję przy 220 nm. Ilościowe oznaczenie prowadzono na podstawie piku przy użyciu wcześniej przygotowanej krzywej standardowej.

P r z y k ł a d 12

Określenie chemicznych modyfikacji wyekstrahowanego rhproBMP-2

Ilość zmodyfikowanych form czynnika wzrostu kości w roztworach zawierających wyekstrahowane białko określano za pomocą RP-HPLC. Próbkę nanoszono na kolumnę YMC C4 (4,6 x 250 mm), zrównoważoną 0,1% TFA. Po przemyciu kolumny, wymywanie prowadzono 100% acetonitrylem, 0,1% TFA, i krokowym gradientem 25%-100% acetonitrylu (przepływ: 0,8 ml/min). Wymywanie obserwowano mierząc absorbancję przy 220 nm. Względną ilość zmodyfikowanych cząsteczek obliczano na podstawie stosunku powierzchni odpowiedniego piku do całkowitej powierzchni piku.

PL 207 552 B1

P r z y k ł a d 13

Określenie ilości zmodyfikowanego rhproBMP-2 po ekstrakcji

W tym przykładzie badano zachowanie rhproBMP-2 w czasie procesu opłaszczania-ekstrakcji w warunkach optymalnych: rhproBMP2 jest rekombinowaną formą pro-BMP-2. Sekwencja aminokwasowa tego rhproBMP2 pokazana jest na SEQ ID NR 4. Po ekstrakcji określano ilość zmodyfikowanych cząsteczek.

Opłaszczanie

Płytki tytanowe opłaszczano rhproBMP-2 tak jak opisano w przykładzie 5. Jeden zestaw płytek opłaszczano w warunkach standardowych (powietrze, temperatura pokojowa) (zestaw 1); drugi zestaw płytek opłaszczano w atmosferze N2 (zestaw 2). Każdą płytkę kładziono płaską stroną na szalce i opłaszczano 10 μl roztworu 1,9 mg/ml rhproBMP-2 na jednej stronie metalowej płytki.

Ekstrakcja

Ekstrakcję prowadzono tak jak opisano w przykładzie 5. Ilość zmodyfikowanego rhproBMP-2 mierzono za pomocą RP-HPLC (patrz przykład 12). Wyekstrahowane białka charakteryzowano ilościowo poprzez oznaczenie ilościowe zmodyfikowanych cząsteczek. Zmiany ilości zmodyfikowanego rhproBMP-2 porównywano z roztworem rhproBMP-2. Otrzymane wyniki zamieszczone w tabeli 7 pokazują ilość chemicznie zmodyfikowanego po ekstrakcji rhproBMP-2:

T a b e l a 7

Numer próbki	Atmosfera	% zmodyfikowanego białka w porównaniu z roztworem opłaszczającym	MW	1 x SD
1	powietrze	6,3	4,9	1,2
2	powietrze	4,1
3	powietrze	4,2
4	N2	1,9	1,5	0,6
5	N2	1,8
6	N2	0,9
Standardowy rhBMP-2	powietrze	0	...	---

Parametry badane w tych doświadczeniach mają wpływ na ilość zmodyfikowanego rhproBMP-2 po ekstrakcji z płytek tytanowych:

Próbki opłaszczane w powietrzu mają większą ilość zmodyfikowanego rhproBMP-2: 4,9% ± 1,2% w porównaniu z roztworem do opłaszczania opisanym w tabeli 2 powyżej.

Próbki obrabiane w temperaturze pokojowej w gazowym N2 wykazują 1,5% ± 0,6% wzrost zmodyfikowanego rhproBMP-2 po ekstrakcji.

Próbki traktowane w powietrzu wykazują wzrost +4,9% (patrz figura 10) w porównaniu z roztworem ogólnym białka. Figura 10 pokazuje wzrost zmodyfikowanego rhproBMP-2 po opłaszczaniu/ekstrakcji w porównaniu z roztworem do opłaszczania. Na figurze 10, słupki błędu odpowiednich próbek nie nakładają się. Dlatego, wywnioskowano, że otaczająca atmosfera gazowa ma znaczący wpływ na ilość modyfikacji rhproBMP-2 po ekstrakcji z płytek tytanowych.

Literatura

Albrektsson T. w: Handbook of Biomaterials (Black, J i Hastings, G (edytorzy), Chapman & Hall, London, 1998, strony 500-512).

Endo, X. Dental Materials Journal 14 (2): 185-198,1995 Jennissen, H. i wsp., Biomaterialien (2001), 2,45-53 Kim, H. i wsp., J Biomed Mater Res, 45, 100-107, 1999 Koeck, B. i Wagner, W. Implantologie, Urban & Schwarzenberg 1. Auflage, 1996.

Lichtinger, T.K. i wsp., Mat.-wiss. u. Werkstofftech, 32 (2001) 937-941

Shah, A. i wsp., Biology of the cell 91,131-142 (1999) Strnad, Z. i wsp., Int J Oral Maxillofac Implants 2000; 15: 483-490

Tsui, Y. i wsp., Biomaterials, 19 (1998) 2031-2043 Voggenreiter G, Hartl H, Assenmacher S, Chatzinikolaidou M, Rumpf HM, Jennissen HP. (2001), Assessment of the Biological Activity of Chemically Immobilized rhBMP-2 on Titanium surfaces in vivo

Materialwiss. Werkstofftech. 32, 942-948

PL 207 552 B1

Wen, H. i wsp, Journal of Material Science: Materials in Medicine 9 (1998) 121-128 Williams, D. F. Proceedings of a Consensus Conference of the European Society for Biomaterials (ESB) Elsevier, Amsterdam, p. 60.

Williams, D. F. The Williams Dictionary of Biomaterials (Liverpool, UK: Liverpool University Press (1999) 40.

Lista sekwencji <110> SCIL Technology GmbH < 12 0> Sposób wytwarzania urządzenia, urządzenie, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie urządzenia i zestaw <130> G 2534 PCT <160> 6 <170> Patentln wersja 3.1 <210 1 <211> 396 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1

Met 1

Val

Ala

Gly

Thr 5

Arg

Cys

Leu

Ala 10

Leu

Pro

Gin 15

Val

Leu

Gly

Ala

Gly

Leu

Val

Pro

Glu

Leu

Gly

Arg

Lys

20

25

30

Phe

Ala

Ser

Gly

Arg

Pro

Ser

Gin

Pro

Ser

Asp

Glu

35

40

45

Val

Leu

Ser

Glu

Phe

Glu

Leu

Arg

Leu

Ser

Met

Phe

Gly

Leu

Lys

50

55

60

Gin

Arg

Pro

Thr

Pro

Ser

Arg

Asp

Ala

Val

Pro

Tyr

Met

Leu

65

70

75

80

Asp

Leu

Tyr

Arg

His

Ser

Gly

Gin

Pro

Gly

Ser

Pro

Ala

Pro

Asp

85

90

95

His

Arg

Leu

Glu

Arg

Ala

Ser

Arg

Ala

Asn

Thr

Val

Arg

Ser

Phe

100

105

110

His

Glu

Ser

Leu

Glu

Leu

Pro

Glu

Thr

Ser

Gly

Lys Thr

115

120

125

PL 207 552 B1

Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu

130 135

Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val

145 150

Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His

165

Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser

180

Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn

195 200

Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp

210 215

Gly Phe Val Val Glu Val Ala His

225 230

Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg

245

Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu

260

Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu

275 280

Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys

290 295

Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp

305 310

His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu

325

Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile

340

Ser Ser Ile Pro Thr Glu Glu Phe

140

Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp Ala

155 160

His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile

170 175

Lys Phe Pro Val Thr Arg Leu Leu

185 190

Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp

205

Thr Ala Gln Gly His Ala Asn His

220

Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser

235 240

Ser Leu His Gln Asp Glu His Ser

250 255

Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys

265 270

Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln

285

Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp

300

Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr

315 320

Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His

330 335

Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val

345 350

PL 207 552 B1

Asn

Ser

Lys 355

Ile

Pro

Lys

Ala

Cys 360

Cys

Val

Pro

Thr

Glu 365

Leu

Ser

Ala

Ile

Ser

Met

Leu

Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn

Glu

Lys

Val

Leu

Lys

Asn

370

375

380

Tyr

Gin

Asp

Met

Val

Glu

Gly

Cys

Gly

Cys

Arg

385 390 395 <210> 2 <211> 431 <212> PRT

<213> Homo

Sapiens

<400> 2

Met

His

Val

Arg

Ser

Leu

Arg

Ala

Pro

His

Ser

Phe

Val

Ala

1

5

10

15

Leu

Trp

Ala

Pro

Leu

Phe

Leu

Arg

Ser

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ser

20

25

30

Leu

Asp

Asn

Glu

Val

His

Ser

Phe

Ile

His

Arg

Leu

Arg

Ser

35

40

45

Gin

Glu

Arg

Glu

Met

Gin

Arg

Glu

Ile

Leu

Ser

Ile

Leu

Gly

Leu

50

55

60

Pro

His

Arg

Pro

Arg

Pro

His

Leu

Gin

Gly

Lys

His

Asn

Ser

Ala

Pro

65

70

75

80

Met

Phe

Met

Leu

Asp

Leu

Tyr

Asn

Ala

Met

Ala

Val

Glu

Gly

85

90

95

Gly

Pro

Gly

Gin

Gly

Phe

Ser

Tyr

Pro

Tyr

Lys

Ala

Val

Phe

Ser

100

105

110

Thr

Gin

Gly

Pro

Leu

Ala

Ser

Leu

Gin

Asp

Ser

His

Phe

Leu

Thr

115

120

125

PL 207 552 B1

Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe

130 135

Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His

145 150

Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala

165

Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg

180

Ser Val Tyr Gin Val Leu Gin Glu

195 200

Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu

210 215

Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser

225 230

His Asn Leu Gly Leu Gin Leu Ser

245

Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu

260

Lys Gin Pro Phe Met Val Ala Phe

275 280

Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser

290 295

Lys Thr Pro Lys Asn Gin Glu Ala

305 310

Asn Ser Ser Ser Asp Gin Arg Gin

325

Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp

340

Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys

140

His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu

155 160

Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile

170 175

Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg Ile

185 190

His Leu Gly Arg Glu Ser Asp Leu

205

Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu

220

Asn His Trp Val Val Asn Pro Arg

235 240

Val Glu Thr Leu Asp Gly Gin Ser

250 255

Ile Gly Arg His Gly Pro Gin Asn

265 270

Phe Lys Ala Thr Glu Val His Phe

285

Lys Gin Arg Ser Gin Asn Arg Ser

300

Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu

315 320

Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr

330 335

Gin Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu

345 350

PL 207 552 B1

Gly

Tyr

Ala 355

Ala

Tyr

Cys

Glu 360

Gly

Glu

Cys

Ala

Phe 365

Pro

Leu

Asn

Ser

Tyr

Met

Asn

Ala

Thr

Asn

His

Ala

Ile

Val

Gln

Thr

Leu

Val

His

370

375

380

Phe

Ile

Asn

Pro

Glu

Thr

Val

Pro

Lys

Pro

Cys

Ala

Pro

Thr

Gln

385

390

395

400

Leu

Asn

Ala

Ile

Ser

Val

Leu

Tyr

Phe

Asp

Ser

Asn

Val

Ile

405

410

415

Leu

Lys

Tyr

Arg

Asn

Met

Val

Arg

Ala

Cys

Gly

Cys

His

420 425 430 <210> 3 <211> 501 <212> PRT

<212

!> H

omo

Sapi

ens

<40C

)> 3

Met

Arg

Leu

Pro

Lys

Leu

Thr

Phe

Leu

Trp

Tyr

Leu

Ala

Trp

1

5

10

15

Leu

Asp

Leu

Glu

Phe

Ile

Cys

Thr

Val

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Leu

Gly

20

25

30

Gln

Arg

Pro

Gln

Gly

Ser

Arg

Pro

Gly

Leu

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Lys

35

40

45

Glu

Arg

Pro

Leu

Ala

Arg

Asn

Val

Phe

Arg

Pro

Gly

His

Ser

50

55

60

Tyr

Gly

Ala

Thr

Asn

Ala

Asn

Ala

Arg

Ala

Lys

Gly

Thr

65

70

75

80

Gly

Gln

Thr

Gly

Leu

Thr

Gln

Pro

Lys

Asp

Glu

Pro

Lys

90 95

PL 207 552 B1

Thr Val

Asp

Leu

Arg 325

Gly

Leu

Gly

Phe Asp 330

Arg

Ala

Arg

Gln 335

Val

His Glu

Lys

Ala

Leu

Phe

Leu

Val

Phe Gly

Arg

Thr

Lys

Arg

Asp

340

345

350

Leu Phe

Phe

Asn

Glu

Ile

Lys

Ala

Arg Ser

Gly

Gln

Asp

Lys

Thr

355

360

365

Val Tyr

Glu

Tyr

Leu

Phe

Ser

Gln

Arg Arg

Lys

Arg

Ala

Pro

Leu

370

375

380

Ala Thr

Arg

Gln

Gly

Lys

Arg

Pro

Ser Lys

Asn

Leu

Lys

Ala

Arg

Cys

385

390

395

400

Ser Arg

Lys

Ala

Leu

His

Val

Asn

Phe Lys

Asp

Met

Gly

Trp

Asp

405

410

415

Trp Ile

Ile

Ala

Pro

Leu

Glu

Tyr

Glu Ala

Phe

His

Cys

Glu

Gly

Leu

420

425

430

Cys Glu

Phe

Pro

Leu

Arg

Ser

His

Leu Glu

Pro

Thr

Asn

His

Ala

Val

435

440

445

Ile Gln

Thr

Leu

Met

Asn

Ser

Met

Asp Pro

Glu

Ser

Thr

Pro

Thr

450

455

460

Cys Cys

Val

Pro

Thr

Arg

Leu

Ser

Pro Ile

Ser

Ile

Leu

Phe

Ile

Asp

465

470

475

480

Ser Ala

Asn

Val

Tyr

Lys

Gln Tyr

Glu

Asp

Met

Val

Glu

485

490

495

Ser Cys

Gly

Cys

Arg

500

<210> 4

<211> 373

<212> PRT

<213> Homo

Sapiens

PL 207 552 B1

His Leu Glu Glu Lys Gin Gly Val

210 215

Arg Ser Leu His Gin Asp Glu His

225 230

Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly

245

Glu Lys Arg Gin Ala Lys His Lys

260

Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val

275 280

Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly

290 295

Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp

305 310

Ile Val Gin Thr Leu Val Asn Ser

325

Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser

340

Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys

355 360

Gly Cys Gly Cys Arg

370

Ser Lys Arg His Val Arg Ile Ser

220

Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro Leu

235 240

Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg

250 255

Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser

265 270

Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn

285

Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly

300

His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala

315 320

Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala

330 335

Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp

345 350

Asn Tyr Gin Asp Met Val Val Glu

365

<210>	5
<211>	398
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	5

Sapiens

PL 207 552 B1

Met Gly Ser Ser His His His His

5

Arg Gly Ser His Met Gly Ala Ala

Arg Lys Phe Ala Ala Ala Ser Ser

40

Asp Glu Val Leu Ser Glu Phe Glu

55

Leu Lys Gin Arg Pro Thr Pro Ser

70

Met Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His

Pro Asp His Arg Leu Glu Arg Ala

100

Ser Phe His His Glu Glu Ser Leu

115 120

Lys Thr Thr Arg Arg Phe Phe Phe

130 135

Glu Phe Ile Thr Ser Ala Glu Leu

145 150

Asp Ala Leu Gly Asn Asn Ser Ser

165

Glu Ile Ile Lys Pro Ala Thr Ala

180

Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val Asn

195 200

Phe Asp Val Thr Pro Ala Val Met

210 215

His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

15

Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg

30

Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser

Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly

Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr

80

Ser Gly Gin Pro Gly Ser Pro Ala

95

Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg

105 110

Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly

125

Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu

140

Gin Val Phe Arg Glu Gin Met Gin

155 160

Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr

170 175

Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arg

185 190

Gin Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser

205

Arg Trp Thr Ala Gin Gly His Ala

220

PL 207 552 B1

Asn His Gly Phe Val Val Glu Val

225 230

Val Ser Lys Arg His Val Arg Ile

245

His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro

260

Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys

275 280

Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser

290 295

Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp

305 310

Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His

325

Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His

340

Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys

355 360

Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu

370 375

Ala His Leu Glu Glu Lys Gin Gly

235 240

Ser Arg Ser Leu His Gin Asp Glu

250 255

Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp

265 270

Arg Glu Lys Arg Gin Ala Lys His

285

Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr

300

Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro

315 320

Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala

330 335

Ala Ile Val Gin Thr Leu Val Asn

345 350

Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu

365

Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu

380

Lys Asn Tyr Gin Asp	Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
385			390	395
<210>	6
<211>	501
<212>	PRT
<213>	Homo	Sapiens
<400>	6

PL 207 552 B1

Met Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr

5

Leu Asp Leu Glu Phe Ile Cys Thr

Gin Arg Pro Gin Gly Thr Arg Pro

40

Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Asn

55

Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala

70

Gly Gin Thr Gly Gly Leu Thr Gin

Leu Pro Pro Arg Pro Gly Gly Pro

100

Gin Thr Arg Gin Ala Thr Ala Arg

115 120

Pro Gly Gly Lys Ala Pro Pro Lys

130 135

Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro

145 150

Pro Phe Arg Pro Pro Pro Ile Thr

165

Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp

180

Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn

195 200

Gly Gin Asp Asp Arg Gly Pro Val

210 215

Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp

15

Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly

30

Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys

Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser

Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr

80

Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys

95

Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro

105 110

Thr Val Thr Pro Lys Gly Gin Leu

125

Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe

140

Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu

155 160

Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu

170 175

Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val

185 190

Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys

205

Val Arg Lys Gin Arg Tyr Val Phe

220

PL 207 552 B1

Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp

225 230

Ile Leu Arg Lys Lys Pro Ser Asp

245

Gly Gly Arg Ala Ala Gin Leu Lys

260

Gin Pro Ala Ser Leu Leu Asp Val

275 280

Ser Gly Trp Glu Val Phe Asp Ile

290 295

Asn Ser Ala Gin Leu Cys Leu Glu

305 310

Ala Val Asp Leu Arg Gly Leu Gly

325

His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val

340

Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala

355 360

Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gin

370 375

Ala Thr Arg Gin Gly Lys Arg Pro

385 390

Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn

405

Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr

420

Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His

435 440

Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg

235 240

Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly

250 255

Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg

265 270

Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly

285

Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys

300

Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg

315 320

Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gin Val

330 335

Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp

345 350

Arg Ser Gly Gin Asp Asp Lys Thr

365

Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu

380

Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys

395 400

Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp

410 415

Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu

425 430

Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val

445

PL 207 552 B1

Ile

Gln 450

Thr

Leu

Met

Asn

Ser 455

Met

Asp

Pro

Glu

Ser 460

Thr

Pro

Thr

Cys

Val

Pro

Thr

Arg

Leu

Ser

Pro

Ile

Ser

Ile

Leu

Phe

Ile

Asp

465

470

475

480

Ser

Ala

Asn

Val

Tyr

Lys

Gln

Tyr

Glu

Asp

Met

Val

Glu

485

490

495

Ser

Cys

Gly

Cys

Arg

500

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania urządzenia, znamienny tym, że (a) dostarcza się roztwór zawierający rozpuszczone białko osteoindukcyjne, (b) kontaktuje się roztwór wytworzony w etapie (a) z nośnikiem zawierającym powierzchnię metalu łub stopu metalu, (c) opłaszcza się powierzchnię nośnika przez rozpuszczone białko i (d) suszy się opłaszczony nośnik wytworzony w etapie (c), przy czym etapy (b) do (d) prowadzi się w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etapy (b) do (d) prowadzi się w warunkach stężenia tlenu mniejszego niż 10% objętościowych tlenu.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etapy (b) do (d) prowadzi się w tempe. raturze poniżej 25°C.
4. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że jako metal lub stop metalu stosuje się tytan lub stop tytanu.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako stop tytanu stosuje się stop tytanu za. wierający przynajmniej 50% tytanu.
6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że jako stop tytanu stosuje się stop Ti.Al.V, Ti.Al.Fe, Ti.Al.Nb lub Ti.Mo.Zr.Al.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako stop Ti.Ai.V stosuje się stop Ti6AI4V.
8. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 7, znamienny tym, że opłaszczanie prowadzi się przez zanurzenie metalicznej powierzchni w roztworze białka.
9. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 7, znamienny tym, że opłaszczanie prowadzi się przez nakraplanie roztworu białka na metaliczną powierzchnię.
10. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 7, znamienny tym, że opłaszczanie prowadzi się przez rozpryskiwanie roztworu białka na metaliczną powierzchnię.
11. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 10, znamienny tym, że suszenie prowadzi się pod próżnią.
12. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 10, znamienny tym, że suszenie prowadzi się przez liofilizację.
13. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 10, znamienny tym, że suszenie prowadzi się przez odparowanie w temperaturze pokojowej w strumieniu gazu obojętnego.
14. Sposób według jednego z zastrz. od 1 to 13, znamienny tym, że jako białko osteoindukcyj. ne stosuje się członka rodziny TGF^.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako członka rodziny TGF.i stosuje się człon ka podrodziny BMP.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako członka rodziny BMP stosuje się BMP2 lub BMP7.

PL 207 552 B1
17. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako członka rodziny TGF-β stosuje się członka podrodziny GDF.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako członka podrodziny GDF stosuje się GDF-5.
19. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 18, znamienny tym, że urządzenie jest wolne od substancji toksycznych.
20. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 19, znamienny tym, że roztwór pozwala na rozpuszczenie tego białka na czas wystarczający do homogennego opłaszczenia metalicznej powierzchni.
21. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 20, znamienny tym, że roztwór pozwala na uzyskanie stężenia białka osteoindukcyjnego większego niż 0,5 mg/ml.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że roztwór ma kwaśne pH.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że kwaśny roztwór zawiera HCl, kwas octowy, kwas cytrynowy lub kwas bursztynowy.
24. Sposób według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że stężenie kwasu jest mniejsze lub równe 100 mmol/l.
25. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 24, znamienny tym, że roztwór wysyca się gazem obojętnym.
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że jako obojętny gaz stosuje się azot, argon lub hel.
27. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 26, znamienny tym, że prowadzi się go w komorze z kontrolowaną atmosferą i wilgotnością.
28. Urządzenie zawierające nośnik obejmujący powierzchnię z metalu lub stopu metalu, znamienne tym, że powierzchnia ta jest jednorodnie pokryta białkiem osteoindukcyjnym, przy czym białko osteoindukcyjne nie jest związane z powierzchnią metalową nośnika za pomocą wiązania kowalencyjnego.
29. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera urządzenie jak określono w zastrz. 28.
30. Zastosowanie urządzenia wytworzonego sposobem określonym w jednym z zastrz. od 1 do 27 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zastosowania do przyśpieszonej osteointegracji i tworzenia nowych kości.
31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że przyśpieszona osteointegracja i tworzenie nowych kości jest stosowane do leczenia defektów urazowych, złośliwych lub sztucznych.
32. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że przyśpieszona osteointegracja i tworzenie nowych kości jest stosowane do leczenia defektów dentystycznych.
33. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że przyśpieszona osteointegracja i tworzenie nowych kości jest stosowane do leczenia stawu biodrowego, łokciowego, kręgosłupa, kolanowego, palca lub kostki.
34. Zestaw, znamienny tym, że zawiera urządzenie jak określono w zastrz. 28, które zapakowane jest w pojemniku.