PL207581B1

PL207581B1 - Izolowane białko otrzymywane przez ekstrakcję z rośliny Pilocarpus heterophyllus i jego zastosowania, przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen, kompozycja farmaceutyczna oraz sposób ekstrakcji i izolacji heterokarpiny z komórek rośliny Pilocarpus heterophyllus

Info

Publication number: PL207581B1
Application number: PL369469A
Authority: PL
Inventors: Eric Ferrandis; Beng Poon Teng; Christine Sohier; Christophe Thurieau
Original assignee: Soc De Conseils De Rech Et D'applications Scient (S C R A S )
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2011-01-31
Also published as: HU225431B1; EP1409531A2; HUP0303244A2; RU2305683C2; WO2002068461A2; US7385024B2; CZ20032612A3; CA2437516A1; JP4117194B2; EP1409531B1; IL157150A0; BR0207578A; US20040063621A1; WO2002068461A3; FR2821359B1; ATE309269T1; JP2004538254A; NZ527749A; RU2003128963A; CN100340573C

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowane białko otrzymywane przez ekstrakcję z rośliny Pilocarpus heterophyllus i jego zastosowania, przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen, kompozycja farmaceutyczna oraz sposób ekstrakcji i izolacji heterokarpiny z komórek rośliny Pilocarpus heterophyllus.

Obecny wynalazek dotyczy białka wiążącego ludzki GHRH (Hormon Uwalniający Ludzki Hormon Wzrostu). Hormon wzrostu („GH”) jest białkiem o 191 aminokwasach, które stymuluje wytwarzanie szeregu czynników wzrostu, takich jak Insulino-podobny czynnik wzrostu I (IGF-1) i wyzwala wzrost dużej liczby tkanek (szkieletu, tkanek łącznych, mięśni i trzewi). GH ma również fizjologiczną aktywność zwiększania syntezy kwasów nukleinowych, białek i lipolizy z jednoczesnym zmniejszaniem wydzielania moczu (Frohman L.A. & Kineman, R.D. Handbook of Physiology, Hormonal Control of Growth wydanej przez Kostyo, J. L. & Goodman, H. M. (Oxford Univ. Press, New York, 1999), str. 189-221).

Synteza GH jest regulowana przez czynniki o pozytywnym lub negatywnym działaniu wydzielane przez podwzgórze. Głównym czynnikiem kontrolującym wytwarzanie GH u ludzi jest „Hormon Uwalniający Hormon Wzrostu” (GHRH), peptyd o 44 aminokwasach. GH i GHRH są zaangażowane w wiele chorób, z których szczególnie należy wymienić następujące: rak (w szczególności rak prostaty lub rak płuca), akromegalia, retinopatie i nefropatie cukrzycowe; dla tych patologii, wskazane jest leczenie antagonistami GHRH. Z powodu szeregu potencjalnie możliwych chorób, w przemyśle kontynuuje się poszukiwania antagonistów GHRH.

Zgłaszający właśnie wyizolował nowe białko pochodzenia roślinnego, które ma właściwości wiązania ludzkiego GHRH.

Niniejszy wynalazek dotyczy izolowanego białka, które można otrzymać przez ekstrakcję z rośliny Pilocarpus heterophyllus, które ma masę cząsteczkową w przybliżeniu 90900 u i które obejmuje fragmenty peptydowe o sekwencjach oznaczonych jako Identyfikator Sekw. Nr 1, Identyfikator Sekw. Nr 2 i Identyfikator Sekw. Nr 3; przy czym białko to może być w postaci glikozylowanej lub nieglikozylowanej.

Korzystnie białko to jest otrzymywane z ekstraktu z komórek rośliny Pilocarpus heterophyllus, hodowanych in vitro.

W celu uproszczenia biał ko to jest dalej nazywane „heterokarpiną ”.

W zakres wynalazku wchodzi również biał ko wedł ug wynalazku jako lek.

Ponadto wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu wiążącego antygen, specyficznie wiążącego się z izolowanym białkiem według wynalazku.

W zakres wynalazku wchodzi również przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen, które specyficznie wiąże białko według wynalazku, jako lek.

Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej, która obejmuje jako składnik aktywny białko według wynalazku, jak również jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek.

Wynalazek dotyczy również zastosowania białka według wynalazku do wytwarzania leku przeznaczonego do antagonizowania działania GHRH.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi zastosowanie białka według wynalazku do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia chorób rozrostowych, szczególnie raka.

Wynalazek dotyczy również zastosowania białka według wynalazku do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia akromegalii.

W zakres wynalazku wchodzi ponadto zastosowanie białka według wynalazku do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia retinopatii i nefropatii cukrzycowych.

Wynalazek dotyczy też sposobu ekstrakcji i izolacji heterokarpiny z komórek rośliny Pilocarpus heterophyllus obejmującego etap ekstrakcji komórek Pilocarpus heterophyllus wodą w temperaturze 0 do 50°C, po którym następuje etap filtracji w celu oddzielenia filtratów bogatych w heterokarpinę od komórek Pilocarpus heterophyllus i jeden lub więcej etapów oddzielania heterokarpiny od innych składników ekstrahowanych z rośliny Pilocarpus heterophyllus.

Sekwencje oznaczone jako Identyfikator Sekw. Nr 1, Identyfikator Sekw. Nr 2 i Identyfikator Sekw. Nr 3 są następujące:

Identyfikator Sekw. Nr 1: KLIGARYFDK

Identyfikator Sekw. Nr 2: YGEDIIVGVIDSGV

Identyfikator Sekw. Nr 3: PESESY

Zastosowana powyżej nomenklatura (jak w pozostałej części obecnego zgłoszenia) do zdefiniowania peptydów jest określona przez „lUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature”,

PL 207 581 B1 według której, zgodnie ze standardowym przedstawieniem N-końcowy aminokwas (grupa aminowa) znajduje się po lewej stronie, a C-końcowy aminokwas (grupa karboksylowa) po prawej. Termin „naturalny aminokwas” odnosi się do jednego z naturalnych L-aminokwasów występujących w naturalnych białkach: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp i His.

Białko określa się jako „izolowane”, jeżeli jest pobrane ze swojego pierwotnego środowiska. W szczególnoś ci naturalne biał ko jest izolowane, jeż eli jest oddzielone od biologicznego materiał u, w którym koegzystuje w naturalnym układzie.

Heterokarpina ma właściwości wiązania ludzkiego GHRH. In vitro, heterokarpina wiąże ludzki GHRH i tym samym hamuje syntezę cyklicznego AMP indukowanego w czasie wiązania się ludzkiego

GHRH z jego receptorem. In vivo u szczurów, kompleks heterokarpina/ludzki GHRH tworzy się w kompartmencie krwi i w sposób zależny od dawki hamuje syntezę GH indukowaną przez 10 μg ludzkiego GHRH w stosunku mol na mol. Heterokarpina ma właściwość wiązania ludzkiego GHRH.

Te własności sprawiają, że związki według wynalazku są odpowiednie do zastosowania farmaceutycznego. Zatem przedmiotem wynalazku jest także heterokarpina w formie glikozylowanej lub nieglikozylowanej stosowana jako lek. Przedmiotem jest też kompozycja farmaceutyczna zawierająca jako składnik aktywny heterokarpinę w formie glikozylowanej lub nieglikozylowanej i jedną lub więcej zaróbkę. Dalszym przedmiotem jest zastosowanie heterokarpiny w formie glikozylowanej lub nieglikozylowanej do wytwarzania leków przeznaczonych do antagonizowania skutków GHRH, leczenia chorób rozrostowych (w szczególności raka), leczenia akromegalii lub leczenia retinopatii i nefropatii cukrzycowych. W odniesieniu do raka, heterokarpina jest szczególnie odpowiednia do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia rakowatych guzów trzustki, podwzgórzowo-przysadkowego nerwiaka zwoju, raka oskrzeli, jelit, i wątroby, guzów współczulno-adrenergicznych (ang. sympathoadrenergic), feochromocytoma, gruczolaka przysadki i raków tarczycy.

Przedmiotem wynalazku jest również, stosowane jako lek przeciwciało monoklonalne, lub jego fragment wiążący antygen, które specyficznie wiąże heterokarpinę.

Procesy ekstrakcji i izolacji zasadniczo obejmują następujące kolejno po sobie etapy:

a) etap ekstrakcji komórek z rośliny Pilocarpus heterophyllus wodą w temperaturze 0 do 50°C, korzystnie 4 do 25°C, po którym następuje etap sączenia w celu oddzielenia filtratów bogatych w heterokarpinę od komórek Pilocarpus heterophyllus; oraz w celu oddzielenia heterokarpiny od innych wyekstrahowanych składników

b) etap strącania wyekstrahowanych białek, na przykład, przez dodanie siarczanu amonu, z następującym po nim etapem oddzielania osadu (przez sączenie lub korzystnie przez odwirowanie);

c) rozpuszczania osadów uzyskanych w etapie b) w wodzie; i

d) etap chromatografii żelowej w celu oddzielenia heterokarpiny od innych składników roztworu.

Według innego wariantu, te procesy ekstrakcji i izolacji zasadniczo obejmują następujące etapy:

a) etap ekstrakcji komórek z rośliny Pilocarpus heterophyllus wodą w temperaturze 0 do 50°C, korzystnie 4°do 25°C, po którym następuje etap sączenia w celu oddzielenia filtratu bogatego w heterokarpinę od komórek Pilocarpus heterophyllus;

b) etap usuwania lipidów z roztworu otrzymanego w a) zakwaszonego przez dodanie nieutleniającego kwasu (na przykład kwasu solnego, kwasu siarkowego lub kwasu fosforowego) przy pH korzystnie zawartym między 2 a 4, przez ekstrakcję ciecz-ciecz (korzystnie przez stosowanie rozpuszczalnika organicznego, takiego jak dichlorometan, heptan, heksan, lub cykloheksan);

c) etap usuwania tanin przez doprowadzenie pozbawionego lipidów roztworu otrzymanego w c) do kontaktu z poliwinylopirolidonem (lub nylonem 66) i następnie filtrację przez żywicę o dużych porach (korzystnie żywicę opartą na polistyrenie, taką jak żywica Diaion^® HP 20);

d) doprowadzenie filtratu otrzymanego po etapie c) do pH zasadowego (korzystnie pomiędzy pH 9 a 11) przez dodanie zasady, takiej jak wodorotlenek amonu, wodorotlenek sodu lub wodorotlenek potasu;

e) jeden lub więcej etapów sączenia na żywicy anionowo-wymiennej, przy czym eluentem w tym etapie sączenia korzystnie jest roztwór buforu o pH pomiędzy 9 a 11 i ewentualnie obejmujący gradienty stężeń soli (takiej jak na przykład chlorek sodu lub siarczan amonu) w celu oddzielenia heterokarpiny od innych składników roztworu; i

f) etap odsolenia składający się z przeprowadzenia roztworu otrzymanego w etapie e) przez żywicę oddzielającą składniki mieszanki na podstawie ich masy cząsteczkowej (taką jak żywica Sephadex^®G25 lub Superdex^®200HR) i wymywania wodą tej mieszanki z żywicy.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające związek według wynalazku mogą być w postaci stałej jak, na przykład, pudry, pigułki, granulaty, tabletki, liposomy, kapsułki żelatynowe lub czopki. Pigułki,

PL 207 581 B1 tabletki lub żelatynowe kapsułki mogą być powleczone substancją, która chroni kompozycję przed działaniem kwasu żołądkowego lub enzymów w żołądku osobnika przez wystarczający czas, aby kompozycja mogła przejść w postaci niestrawionej do jelita cienkiego. Związek może także być podawany miejscowo, na przykład, do rzeczywistego miejsca guza. Związek może być podawany zgodnie ze sposobem przedłużonego uwalniania (na przykład przez zastosowanie kompozycji do przedłużonego uwalniania lub pompy perfuzyjnej). Odpowiednimi stałymi podłożami mogą być, na przykład, fosforan wapnia, stearynian magnezu, węglan magnezu, talk, cukry, laktoza, dekstryna, skrobia, żelatyna, celuloza, metyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidon i wosk.

Kompozycje farmaceutyczne obejmujące związek według wynalazku mogą być także w postaci ciekłej, takiej jak, na przykład, roztwory, emulsje, zawiesiny lub preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie ciekłe podłoże może stanowić, na przykład woda, rozpuszczalniki organiczne, takie jak glicerol lub glikole, takie jak glikol polietylenowy, jak również ich mieszaniny w różnych proporcjach z wodą.

Podawanie leku może być przeprowadzone drogą miejscową, doustną, pozajelitową, przez iniekcje domięśniowe itp.

Dawka związku według wynalazku w celu dostarczenia do leczenia powyżej wymienionych chorób lub zaburzeń, różni się w zależności od sposobu podania, wieku, ciężaru ciała leczonego osobnika jak również od jego stanu, a ostatecznie będzie określona przez opiekującego się lekarza lub weterynarza. Taka ilość określona przez lekarza prowadzącego lub weterynarza jest tu nazwana „terapeutycznie skuteczną ilością”.

Zgodnie z korzystnym wariantem sposobu wytwarzania heterokarpiny według wynalazku, komórki, z których ekstrahuje się hetero karpinę pochodzą z hodowli in vitro kalusów lub zawiesin komórkowych pochodzących z różnych organów rośliny. Tkanki te, hodowane na półstałej lub ciekłej pożywce, są zdolne do biosyntezy związków mających biologiczne własności.

Przez „kalus” rozumie się tu makroskopowy klaster niezróżnicowanych komórek roślinnych w hodowli na pół stał ej poż ywce. Termin „niezróż nicowane komórki” oznacza tu komórki, które mają zdolność w pewnych warunkach do mnożenia się w postaci kalusa lub zawiesiny komórkowej bez żadnego zjawiska morfogenezy. Przez „zawiesinę komórkową” rozumie się niezróżnicowane komórki, które mogą tworzyć mikroskopijne klastery w hodowli w płynnej pożywce.

Komórki z nasion Pilocarpus heterophyllus mogą być hodowane w zawiesinie, na przykład, według poniższej procedury.

Organy są odkażane zwykłymi sposobami przed poddaniem hodowli. Organy zarodka rośliny in vitro mogą także służyć jako materiał zapoczątkowujący tworzenie się kalusa (kalusogenezę) bez wymaganej uprzedniej dezynfekcji. Korzystną pożywką podstawową jest jedna z pożywek powszechnie stosowanych w hodowli in vitro, mianowicie pożywka Gamborga (opisana w Gamborg i wsp. Nutrient requirements of suspension cultures of Soybean root cells, Exp. Cell. Res. (1968), 50 (1), 151158). Źródłem węgla jest sacharoza, ale może być także stosowana glukoza w stężeniu 1 do 120 g/l, korzystnie około 30 g/l. Zawartość makroelementów może być także zmniejszona o połowę. Do pożywki dodawane są auksyna lub auksyna i cytokinina, korzystnie jako kombinacje dwóch hormonów, głównie kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego i kinetyny, ale kwas α-naftalenooctowy (NAA), kwas β-indolilooctowy (lAA), kwas β-indolilomasłowy (IBA) lub pikloram mogą być także połączone z kinetyną lub benzyloaminopuryną (BAP). Stężenie może się zmieniać od 0,1 do 10 mg/l dla auksyny (na przykład można wybrać 1 mg/l) i od 0,01 do 2 mg/l dla cytokininy (na przykład można wybrać 1 mg/l). W pożywce stosowano witaminy typowe dla innych podstawowych pożywek. Hodowle przeprowadza się w świetle lub w ciemności. Temperatura może zmieniać się od 10°C do 33°C, ale korzystnie wynosi około 23°C. pH pożywki zawiera się między 4 a 6,5 i korzystnie przed sterylizacją doprowadza się je do 5,8. Ponadto, do pożywki można dodać agar lub można go nie dodawać.

Po kilku dniach hodowli pojawiają się pierwotne kalusy, które mogą być oddzielone od oryginalnego eksplantatu, usunięte i poddane pasażowaniu po około 1 miesiącu hodowli a następnie hodowane na półstałej pożywce agarowej (w probówkach lub szalkach Petriego), przy czym w odstępach 4 do 8 tygodni, korzystnie 6 tygodni, dokonuje się pasażu i w ten sposób kalus może być utrzymywany przez lata przez następujące po sobie pasaże na nowych pożywkach. Kalus może być hodowany w mieszanej pożywce płynnej (w kolbach Erlenmeyera lub bioreaktorze) z pasażami co 2 do 6 tygodni, korzystnie co 3 tygodnie.

Otrzymane szczepy są odróżniane na podstawie ich genetycznego pochodzenia, warunków hodowli, wyglądu i nieobecności morfogenezy.

PL 207 581 B1

Liofilizowane komórki Pilocarpus heterophyllus ekstrahuje się wodą o temperaturze 0 do 50°C, korzystnie 4 do 25°C. Otrzymany w ten sposób wyciąg jest liofilizowany przed ponownym rozpuszczeniem w odpowiednim stężeniu (na przykład w przybliżeniu 30% suchej masy). Białka strącane przez dodanie stężonego roztworu siarczanu amonu (na przykład w stężeniu stanowiącym 70 do 90% stężenia nasycenia) rozpuszcza się w minimalnej ilości wody, a materiały nierozpuszczalne odzyskuje się przez odwirowanie. Następnie białka rozdziela się na kolumnie chromatograficznej (korzystnie eluentem jest woda) i wówczas można odzyskać heterokarpinę (identyfikowaną na podstawie masy cząsteczkowej w przybliżeniu 90900 u).

Wytwarzanie przeciwciał specyficznie wiążących heterokarpinę

Obecny wynalazek dostarcza czynników wiążących, takich jak przeciwciała specyficznie wiążące heterokarpinę. Taki czynnik określa się jako „specyficznie wiążący” białko, jeżeli reaguje w wykrywalnym stopniu (na przykład w teście ELISA) z omawianym białkiem i nie reaguje w wykrywalny sposób z innymi białkami. „Wiążący się” odnosi się do niekowalencyjnego połączenia między 2 oddzielnymi cząsteczkami, w wyniku którego tworzy się kompleks. Zdolność wiązania można oszacować, na przykład, przez określenie stałej wiązania dla tworzenia kompleksu. Stała wiązania jest wartością otrzymaną przez podzielenie wartości stężenia kompleksu przez iloczyn wartości stężenia nieskompleksowanych składników. 2 produkty określa się jako „związane”, gdy stała wiązania osiąga 103 l/mol. Stałą wiązania można określać stosując metody dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie.

Dowolny czynnik, który spełnia powyższe kryteria, może być uważany za czynnik wiążący.

W obecnym wynalazku, czynnikiem wiążącym jest korzystnie przeciwciało lub jego fragment. Przeciwciało może być wytworzone dowolną techniką dostępną specjaliście w dziedzinie (cf. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Na ogół przeciwciała można wytwarzać technikami hodowli komórkowych obejmującymi wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych lub przez transfekcję genów przeciwciał z bakterii lub ssaków do komórek gospodarza w celu wytworzenia zrekombinowanych przeciwciał.

Wśród tych innych technik korzystne jest stosowanie dalej opisanych. Immunogen zawierający heterokarpinę jest wstrzykiwany grupie ssaków (na przykład myszy, szczurów, królików, owiec lub kóz). Na tym etapie heterokarpina bez modyfikacji może służyć jako immunogen. Alternatywnie, wyższą odpowiedź immunologiczną można zaindukować, gdy heterokarpinę łączy się z białkiem transportowym, takim jak albumina surowicy bydlęcej lub hemocyjanina mięczaka (ang. limpet). Immunogen wstrzykuje się gospodarzowi zwierzęcemu, korzystnie według z góry określonego schematu i zwierzęta skrwawią się okresowo. W ten sposób poliklonalne przeciwciała specyficzne względem heterokarpiny można oczyszczać z surowicy odpornościowej, na przykład, przez chromatografię powinowactwa stosując heterokarpinę sprzężoną z odpowiednim stałym podłożem.

Kompozycje farmaceutyczne przeznaczone do uwolnienia GHRH

Kompozycje te można w szczególności wytwarzać z heterokarpiny i GHRH według jednego ze sposobów opisanych przez De Wolf i Brett w czasopiśmie Pharmacological Revews (2000) 52, 207-236 i cytowanej tam literatury.

Jeśli nie stwierdzono inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy tu stosowane mają to samo znaczenie, jak zwykle rozumiane przez przeciętnego specjalistę w dziedzinie, do której należy ten wynalazek.

Następujące przykłady są przedstawione w celu zilustrowania powyższych procedur i nie powinny być w żadnym przypadku rozważane jako ograniczające zakres wynalazku.

OTRZYMYWANIE HETEROKARPINY

P r z y k ł a d 1 :

Hodowla komórek in vitro

Nasienie Pilocarpus heterophyllus skiełkowuje się i usuwa uzyskany z tego kiełkowania pęd. Pęd ten hoduje się na pożywce Gamborga (Gamborg i wsp. Nutrient requirements of suspension cultures of Soybean root cellls, Exp. Cell Res. (1968), 50 (1) ,151-158), do której dodano 30 g/l sacharozy. 1 mg/l kwasu 2,4-dichlorooctowego i 0,06 mg/l kinetyny. Hodowlę prowadzi się w probówkach w temperaturze 23°C i w ciemności. Pasażowanie przeprowadza się co 6 tygodni w zwykłych warunkach. Szczepy, które mają wygląd ziarnisty, mają beżowe zabarwienie. Kinetykę wzrostu szczepów opartą na wzroście masy świeżego i suchego materiału z biomasy obserwuje się przez 8 tygodni. Kalusy z 2 probówek łączy się i zbiera się dwa razy w tygodniu, przy czym pierwszy zbiór ma miejsce w czasie 0. Kalusy i gelozę zbiera się i liofilizuje. Zaobserwowano, że wzrost jest wykładniczy do 6 tygodni hodowli przed pojawieniem się fazy wzrostu stacjonarnego.

PL 207 581 B1

Ekstrahowanie hodowli komórek g zliofilizowanych komórek Pilocarpus heterophyllus ekstrahuje się dwukrotnie przez zanurzanie w 375 ml wody w 4°C i pozostawienie na noc w 4°C, następnie w 250 ml wody w 4°C przez 4 godziny i w koń cu przemycie 125 ml wody w temperaturze 4°C. Każ dy otrzymany roztwór wodny filtruje się pod próżnią przez filtr szklany pokryty celitem w celu wydzielenia resztek komórkowych z roztworu wodnego. W celu otrzymania 9,4 g suchego materiał u wodne roztwory łączy się i nastę pnie liofilizuje. Następnie zliofilizowany suchy ekstrakt rozpuszcza się w 31 ml wody w temperaturze 20°C w celu otrzymania roztworu zawierają cego 30% suchego ekstraktu. Mał ymi porcjami dodaje się 17,4 g siarczanu amonu przy stałym mieszaniu magnetycznym w celu strącenia frakcji białkowej. Osad białkowy następnie oddziela się od roztworu siarczanu amonu przez odwirowanie w ciągu 20 minut przy 3000 obr./min. Roztwór siarczanu amonu zlewa się i strącone białka rozpuszcza się w 22 ml wody, ponownie odwirowuje i filtruje w celu wyeliminowania cząstek nierozpuszczalnych. Otrzymany filtrat następnie poddaje się chromatografii żelowej. Wstrzykuje się go na kolumnę (Buchi N° 19678, L=230 mm;

wewnętrzna średnica = 26 mm) wypełnioną Superdex™ 200 (Amersham Pharmacia Biotech, nr ref.

17-1043-01; cząstki o średniej średnicy 13 μm) przygotowaną według zaleceń producenta z użyciem ultra-czystej wody (Walter's Milli-Q) jako eluenta przy szybkości przepływu 5 ml na minutę. W ten sposób zbiera się 40 ml frakcje. W trzeciej i czwartej frakcji znaleziono białko aktywne. Frakcje liofilizuje się i otrzymuje około 14,2 mg aktywnego produktu. Czystość otrzymanego produktu wykazano przez pojawienie się pojedynczego prążka na żelu elektroferotycznym zawierającym dodecylosiarczan sodu (SDS Page). Produkt odpowiadający temu prążkowi jest określony jako heterokarpiną.

P r z y k ł a d 2:

Komórki hodowane in vitro według tej samej procedury jak opisana w Przykładzie 1 powyżej ekstrahuje się według sposobu tu opisanego. 100 g zliofilizowanych komórek Pilocarpus heterophyllus ekstrahuje się stosując 2 litry demineralizowanej wody w temperaturze 20°C, mieszaninę miesza się przez noc. Komórki i ekstrakt filtruje się przez odsysanie na filtrze ze spiekanego szkła (porowatość 3, średnica 20 cm) pokrytym złożem celitowym (uprzednio przemytym kwasem; 1 do 2 cm grubości). Odzyskane komórki przemywa się 400 ml demineralizowanej wody przed ich usunięciem. Następnie wodny przesącz zakwasza się do pH 3,0 przez dodanie w przybliżeniu 10 ml 18% kwasu solnego. Zakwaszony roztwór następnie pozbawia się lipidów przez ekstrakcję ciecz-ciecz stosując 400 ml dichlorometanu. Fazę dichlorometanu zlewa się, następnie usuwa. Pozbawiony lipidów roztwór poddaje się odparowaniu na wyparce obrotowej w celu usunięcia pozostałego dichlorometanu. Do pozbawionego lipidów roztworu (pH około 3,0) dodaje się w przybliżeniu 30 g poliwinylopirolidonu i mieszaninę miesza się przez około 30 minut w celu usunięcia tanin. Mieszaninę filtruje się przez złoże odsysając na filtrze ze spiekanego szkła (porowatość 3, średnica 10 cm) pokrytym mieszanym złożem zawierającym 25 g celitu (uprzednio przemytego kwasem) i 25 g poliwinylopirolidonu. Następnie przesącz przepuszcza się przez 400 ml złoża Diaion^® HP-20 (Mitsubishi Chemical Company) aktywowanego wcześniej według instrukcji producenta. Otrzymany przesącz następnie alkalizuje się (pH 10) przez dodanie około 60 ml 20% roztworu wodorotlenku amonu. Po 30 minutach odstania pojawia się lekkie wytrącanie. Do roztworu alkalicznego dodaje się 1 g celitu (uprzednio przemytego kwasem), następnie roztwór filtruje się przez odsysanie na filtrze membranowym (0,22 μm). Następnie około 2 litry przesączu przeprowadza się przez kolumnę HiPrep^® Q XL 16/10 zamontowaną na oczyszczaczu Akta^® i wstępnie równoważy się przy pH 10,2 0,1 M buforem piperazyna/HCl z szybkością przepływu 0,5 ml na minutę (zarówno kolumna HiPrep^® jak i oczyszczacz Akta^® są produktami firmy Amersham Biosciences). Następnie kolumnę przemywa się kolejno sześcioma objętościami kolumny wyjściowego buforu przy pH 10,2, 5 objętościami kolumny tego samego buforu zawierającego NaCl w stężeniu 0,2 M; i 10 objętościami kolumny tego samego buforu zawierającego NaCl w stężeniu 1 M. Większość heterokarpiny odzyskuje się w 3 pierwszych objętościach kolumny buforu zawierającego NaCl w stężeniu 1M. Aktywne frakcje odsala się przez przepuszczenie przez kolumnę Sephadex^®G25 (objętość złoża 260 ml) stosując jako eluent demineralizowaną wodę. Aktywne frakcje znalezione w pierwszej objętości kolumny odpowiadające objętości zatrzymania, następnie liofilizuje się i otrzymuje się 170 mg heterokarpiny. Otrzymana w ten sposób heterokarpina jest praktycznie pojedynczym prążkiem na żelu SDS PAGE.

CHARAKTERYSTYKA HETEROKARPINY

Analiza i mikrosekwencjonowanie:

Próbki nakłada się na 10% żel poliakrylamidowy. Po migracji, żele są utrwalane i barwione błękitem Coomassie.

PL 207 581 B1

Ścieżki na żelu 1, 2, 3, 4 i 5 przedstawione na Figurze 3 odpowiadają markerom ciężaru cząsteczkowego (Amersham), odpowiednio 0,5, 1 i 2 μg zawartości heterokarpiny w końcowej frakcji jak otrzymana w Przykładzie 1 i markerowi masy cząsteczkowej. Określenie masy cząsteczkowej za pomocą wykresu standardowego markera masy cząsteczkowej z użyciem standardowych narzędzi obliczeniowych dobrze znanych specjaliście w dziedzinie (na przykład, oprogramowanie komputera Viber Lourmat's Bio-Profil Bio1D) umożliwia wykazanie, że heterokarpina ma masę cząsteczkową 90900 u (± 1600 u).

Do mikrosekwencjonowania białek, prążek poliakrylamidu zawierający białko odcina się i trawi w 300 μl buforu trawiącego zawierającego 50 mM Tris (pH 8,6), 0,03% dodecylosiarczanu sodu w 35°C przez 18 godzin w obecności 0,4 μg endolizyny-C (Sigma). Otrzymane polipeptydy oddziela się stosując HPLC na kolumnie DEAE-C18 in-line o średnicy 1 mm. Gradient oddzielania jest oparty na mieszaninie acetonitrylu (od 2 do 70%) i 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA). Następnie przeprowadza się sekwencjonowanie na sekwenatorze Procise (Applied Biosystem). W ten sposób zsekwencjonowano trzy piki, umożliwiając w unikalny sposób scharakteryzowanie heterokarpiny. Odpowiadające sekwencje są w obecnym zgłoszeniu zidentyfikowane przez Identyfikator Sekw. Nr 1, Identyfikator Sekw. Nr 2 i Identyfikator Sekw. Nr 3.

Analizę glikoprotein przeprowadza się przez wykrywanie struktur cukrowych glikoprotein rozdzielonych na żelu SDS-PAGE. Ten system wykrywania jest modyfikacją metod „Periodic Acid Schaff” i prowadzi do pojawienia się karmazynowych prążków wykazujących obecność glikoprotein (Sigma). Dla heterokarpiny jak otrzymana w Przykładzie 1, uzyskano wynik przedstawiony na Figurze 4.

FARMAKOLOGICZNE WŁASNOŚCI HETEROKARPINY

Trwałe transfekcję receptora ludzkiego GHRH (hGHRH-R)

Komórki nerki ludzkiego zarodka, HEK-293 (linia komórkowa udostępniona przez Dr Stuart Sealfon, Mount Sinai Medical School, New York) wyrażające w stabilny sposób receptor ludzkiego GHRH otrzymano od Dr Kelly Mayo (Northwestern University, Chicago, IL).

Przygotowanie hodowli komórek i błon

Komórki HEK-293 transfekowane w stabilny sposób ludzkim receptorem GHRH opisanym powyżej hoduje się w DMEM (pożywce Eagla zmodyfikowanej przez Dulbecco o dużej zawartości glukozy, dostarczonej przez Life technologies uzupełnionej 0,4 mg/ml G418 (Life technologies) w obecności 10% cielęcej surowicy płodowej i 4 mM L-glutaminy (Life technologies). Komórki homogenizuje się w buforze A zawierającym 50 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM chlorku magnezu (MgCl2), 2 mM kwasu etylenoglikolo-bis(2-amino-etylo)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA) i 50 μg/ml bacytracyny, następnie poddaje się sonikacji w tym samym buforze A. W ten sposób homogenizowane komórki odwirowuje się w temperaturze 4°C przy 39000 g przez 10 minut, zawiesza w buforze A i odwirowuje ponownie w 4°C przy 40000 g przez 10 minut. Całkowite białka błonowe określa się ilościowo techniką Bradforda. W ten sposób osad z błonami przechowuje się w temperaturze -80°C do późniejszego użycia.

Test wiązania kompetytywnego na hGHRH-R:

Błony komórek HEK-293 stransfekowanych w stabilny sposób ludzkim receptorem GHRH rozcieńcza się do stężenia 100 μg/ml buforem reakcyjnym zawierającym 50 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 50 μg/ml bacytracyny i 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Błony inkubuje się w 0,05 nM [¹²⁵I] GHRH (1-44 amidów) (Amersham) w końcowym stężeniu 200 μl w obecności wzrastającego stężenia heterokarpiny przez 2 godziny w 23°C. Reakcję zatrzymuje się przez gwałtowną filtrację na 96-studzienkowych filtrach GF/C z wcześniej nałożoną 0,1% polietyleniminą. Następnie filtry przemywa się trzykrotnie w temperaturze 4°C buforem do przemywań zawierającym 50 mM Tris (pH 7,4) stosując stację filtracyjną Packard o 96-studzienkach. Tak wysuszone filtry zanurza się w 20 μl koktajlu scyntylacyjnego (Microscint O, Packard) i poddaje się liczeniu w Topcount (Pacard). Niespecyficzną aktywność określa się w obecności 100 nM hGHRH. Krzywą odpowiedzi na dawkę wykreśla się dla hGHRH (0,001 nM-100 nM), a otrzymane wyniki są załączone na Figurze 1. Kompetytywne tworzenie cyklicznego AMP

Komórki HEK-293 w stabilny sposób transfekowane receptorem ludzkiego GHRH rozmieszcza się w 48-studzienkowych płytkach hodowlanych na 3 dni. Następnie usuwa się pożywkę hodowlaną i zastępuje pożywką B zawierającą 250 μl DMEM (pożywką Eagla zmodyfikowaną przez Dulbecco, o wysokiej zawartości glukozy; dostarczaną przez Life technologies) w obecności 0,5% BSA, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) i wstępnie inkubowaną przez 5 minut w 37°C. Na koniec okresu inkubacji wstępnej, heterokarpinę testuje się przez dodatkowe 20 minut. Obserwowane stężenia są przedstawione na Figurze 2. Inkubację zatrzymuje się przez dodanie 100 μl 0,1M HCl i próbki analizuje się na zawartość cyklicznego AMP stosując zestaw FlashPlate (New England Nuclear).

PL 207 581 B1

Analiza GH u szczurów

Poziomy GH u szczurów (samce Sprague Dawley) mierzy się w próbkach krwi testem enzymatyczno-immunologicznym wytworzonym przez Spi-Bio (Spi-Bio, Francja). Szczury poddaje się dożylnym iniekcjom heterokarpiny we wzrastających dawkach (samo podłoże, 1, 3 i 10 nmoli), następnie minut później, dożylnej iniekcji 10 μg (3 nmole) hGHRH. Dziesięć minut po iniekcji hGHRH w próbkach krwi mierzy się poziomy hormonu wzrostu, jak opisano powyżej. Otrzymane wyniki są przedstawione na Figurze 5.

Krótki opis figur:

Figura 1 jest wykresem reprezentującym hamowanie wiązania ludzkiego GHRH na ludzkim receptorze GHRH jako funkcję wzrostu stężenia heterokarpiny. Figura 2 jest wykresem reprezentującym hamowanie wytwarzania cyklicznego AMP w komórkach transfekowanych w stabilny sposób ludzkim receptorem GHRH w obecności 10 nM ludzkiego GHRH w funkcji wzrostu stężenia heterokarpiny. Figura 3 jest zdjęciem płytki żelowej SDS-PAGE z białkiem wykazującej obecność heterokarpiny mającej ciężar cząsteczkowy 90900 u. Figura 4 jest zdjęciem płytki żelowej SDS-PAGE z białkiem wykazującej, że heterokarpina jest glikoproteiną (Panel B). Figura 5 jest przedstawieniem w formie histogramu hamowania syntezy GH u szczurów w obecności 10 μg ludzkiego GHRH jako funkcji wzrostu stężenia heterokarpiny.

Lista sekwencji <110> Sociśtó de Conseils de Recherches et d'Application <120> Heterokarpina, białko wiążące ludzki GHRH <130> Heterokarpina <140>

<141>

<150> FR 01/02631 <151> 2001-02-27 <160> 3 <170> Patent w wersji 2.1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Filocarpus Heterophyllus <400> 1

Lys Leu Ile Gly Ala Arg Tyr Phe Asp Lys 15 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Pilocarpus Heterophyllus <400> 2

Tyr Gly Glu Asp Ile Ile Val Gly Val Ile Asp Ser Gly Val 15 10 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Pilocarpus Heterophyllus <400> 3

Pro Glu Ser Glu Ser Tyr

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowane białko otrzymywane przez ekstrakcję z rośliny Pilocarpus heterophyllus, które ma masę cząsteczkową w przybliżeniu 90900 u i które obejmuje fragmenty peptydowe o sekwencjach oznaczonych jako Identyfikator Sekw. Nr 1, Identyfikator Sekw. Nr 2 i Identyfikator Sekw. Nr 3; przy czym białko to może być w postaci glikozylowanej lub nieglikozylowanej.
2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że jest otrzymywane z ekstraktu z komórek roś liny Pilocarpus heterophyllus, hodowanych in vitro.
3. Białko jak okreś lono w zastrz. 1 lub 2 jako lek.
4. Przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen, specyficznie wiążące się z izolowanym biał kiem okreś lonym w zastrz. 1.
5. Przeciwciał o monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen, które specyficznie wiąże białko określone w zastrz. 1, jako lek.
6. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje jako składnik aktywny białko określone w zastrz. 1 lub 2, jak również jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek.
7. Zastosowanie białka okreś lonego w zastrz. 1 lub 2 do wytwarzania leku przeznaczonego do antagonizowania działania GHRH.
8. Zastosowanie biał ka okreś lonego w zastrz. 1 lub 2 do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia chorób rozrostowych, szczególnie raka.
9. Zastosowanie białka okreś lonego w zastrz. 1 lub 2 do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia akromegalii.
10. Zastosowanie białka określonego w zastrz. 1 lub 2 do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia retinopatii i nefropatii cukrzycowych.
11. Sposób ekstrakcji i izolacji heterokarpiny z komórek rośliny Pilocarpus heterophyllus, znamienny tym, że obejmuje etap ekstrakcji komórek Pilocarpus heterophyllus wodą w temperaturze 0 do 50°C, po którym następuje etap filtracji w celu oddzielenia filtratów bogatych w heterokarpinę od komórek Pilocarpus heterophyllus i jeden lub więcej etapów oddzielania heterokarpiny od innych składników wyekstrahowanych z rośliny Pilocarpus heterophyllus.