PL207831B1 - Szczep Bifidobacterium breve, sposób wytwarzania immunostymulującego produktu mlecznego, produkt mleczny, odwodniony i/lub sterylizowany pokarm mleczny oraz pokarm mleczny rekonstytuowany - Google Patents

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest szczep Bifidobacterium breve, sposób wytwarzania immunostymulującego produktu mlecznego, produkt mleczny, odwodniony i/lub sterylizowany pokarm mleczny oraz pokarm mleczny rekonstytuowany.

Rodzaj Bifidobacterium należy do rodziny Actinomycetaceae obejmującej Gram-dodatnie pałeczki, które są ścisłymi beztlenowcami fermentującymi glukozę szlakiem fosfoketolazy fruktozo-6-fosforanowej. Wartość pH optymalna dla ich wzrostu wynosi od 6 do 7, a temperatura optymalna dla ich wzrostu wynosi od 37°C do 40°C.

Bifidobakterie są częścią normalnej, ludzkiej, jelitowej flory bakteryjnej. Stwierdzono, że mają one bardzo korzystny wpływ na stan zdrowia. W szczególności wiadomo, że karmione piersią niemowlęta, u których w jelitowej florze bakteryjnej dominującym elementem są bifidobakterie, są odporniejsze na infekcje, w szczególności zaś mniejsze jest ryzyko zachorowania na biegunkę niż w przypadku niemowląt karmionych produktami mlecznymi wytwarzanymi przez przemysł.

Rola Bifidobacterium w procesie wzrastania odporności na infekcje nie została jeszcze całkowicie wyjaśniona. Wiele badań wskazuje, że bakterie te mają zdolności immunostymulujące związane z polisacharydami obecnymi w bakteryjnych ś cianach komórkowych lub wydzielanymi przez bakterie podczas fermentacji beztlenowej. Gomez i wsp., [FEMS Microbiol. Lett., 56, 47-52, (1988)] opisuje działanie immunomodulacyjne bogatych w polisacharydy frakcji zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez Bifidobacterium adolescentis; w zgłoszeniu francuskim opublikowanym pod nr 2652590, w imieniu Laboratoires OM, opisano immunostymulujący egzopolimer o charakterze polisacharydu wytwarzany przez Bifidobacterium infantis longum; HOSONO i wsp., [Biosci. Biotech. Blochem., 61, 312-316 (1997), a w Bioscience Microflora, 17, 97-104, (1998)] opisano immunostymulujące polisacharydy wytwarzane przez liczne gatunki Bifidobacterium. Immunomodulujące działanie Bifidobacterium przejawia się także przez regulację mikroflory jelitowej, w szczególności kosztem rozwoju patogennych gatunków bakterii. ROMOND i wsp., [Anaerobe, 3, 137-143, 1997), i J. Dairy Sci., 81, 1229-1235, (1998)] opisują frakcje bogate w glikoproteiny wytwarzane przez Bifidobacterium breve w warunkach fermentacji beztlenowej, wywołujące efekt regulacji mikroflory jelitowej in vivo.

Spożywanie obecnych na rynku licznych produktów fermentowanych przez Bifidobacterium, ewentualnie w połączeniu z innymi bakteriami mlekowymi, pozwala wykorzystać działanie immunostymulujące Bifidobacterium i produktów ich fermentacji.

Jednak, w przypadku żywienia niemowląt produkty te wykazują pewne wady, są zbyt kwaśne i szczególnie w przypadku produktów sproszkowanych, po odtworzeniu mają niejednorodny wygląd spowodowany koagulacją białek mleka pod wpływem odczynu kwaśnego powstającego w czasie fermentacji. Dlatego też czasami są one nienajlepiej tolerowane przez dziecko lub matkę.

Jednakże Twórcy niniejszego wynalazku ujawnili, że wytwarzanie przez Bifidobacterium substancji o właściwościach immunostymulujących można przeprowadzić bez fermentacji, zatem i bez zakwaszenia produktu końcowego.

Szczep Bifidobacterium breve według wynalazku został zdeponowany w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) 31 maja 1999 pod numerem I-2219.

W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania immunostymuluj ą cego produktu mlecznego, w którym substrat mleczny poddaje się biokonwersji z użyciem kultury szczepu Bifidobacterium według wynalazku przez utrzymywanie w kontakcie substratu z tą kulturą, w warunkach, w których zakwaszenie wywołane przez Bifidobacterium nie przekracza 0,5 jednostek pH po 8 godzinach inkubacji dla początkowego stężenia Bifidobacterium stanowiącego 1 x 10⁷ do 5 x 10⁷ CFU na ml.

Warunki, w których zakwaszenie środowiska przez Bifidobacterium nie przekracza 0,5 jednostki pH w czasie ośmiogodzinnej inkubacji przy początkowej inokulacji w ilości od 1 do 5 x 10⁷ CFU na 1 ml, nie sprzyjają fermentacji przez Bifidobacterium. Warunki te mogą być z łatwością określone przez fachowca przy zastosowaniu prostych prób, w szczególności przez zmianę napowietrzenia pożywki hodowlanej, jej ciśnienia osmotycznego i/lub temperatury hodowli i przez pomiary pH na początku i na końcu hodowli.

Dla dużej liczby szczepów Bifidobacterium warunki te można uzyskać zarówno przez:

- utrzymywanie warunków tlenowych, na przykład, mieszając;

- utrzymywanie ciśnienia osmotycznego pożywki odpowiadającego aktywności wodnej (AW) od

0,93 do 0,97;

- utrzymywanie temperatury w zakresie od 40°C do 48°C;

PL 207 831 B1 jak również kombinacje tych warunków.

Korzystnie substrat mleczny i Bifidobacterium kontaktuje się w stosunku od 1 x 10⁷ do 1 x 10⁹ CFU na ml substratu mlecznego, a końcowa populacja Bifidobacterium pod koniec procesu biokonwersji wynosi od 1 x 10⁵ do 1 x 10⁹ CFU na ml produktu.

Korzystnie pH substratu mlecznego podczas kontaktowania z Bifidobacterium wynosi od 6,3 do 7, a pH produktu pod koniec reakcji biokonwersji wynosi korzystnie od 6 do 7.

Korzystnie czas trwania kontaktu między substratem mlecznym a bakteriami wynosi od 6 do 24 godzin.

Substratem mlecznym może być mleko lub jakakolwiek pożywka wytworzona w oparciu o mleko; może to być, na przykład, koncentrat mleczny, produkt wyjściowy do otrzymania pokarmu mlecznego dla niemowląt, jogurtu lub tym podobne.

Możliwe jest dodanie do pożywki mlecznej składników niezbędnych do wytworzenia żądanego produktu gotowego do spożycia. Jeśli, na przykład, produktem żądanym jest pokarm mleczny dla niemowląt, to dodaje się laktozę, maltodekstryny, minerały, witaminy, tłuszcz i składniki pozwalające na odtworzenie kompozycji mleka kobiecego. Jeśli jest to pożądane, tłuszcz jest włączany do roztworu i nastę pnie z nim homogenizowany, tak aby uzyskać trwałą emulsję.

Szczep Bifidobacterium breve według wynalazku został zdeponowany zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w dniu 31 maja, 1999, pod numerem I-2219 w CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) w Institucie Pasteura, 25 rue du Docteur Roux, w Paryżu.

Szczep ten ma następującą charakterystykę:

morfologia: krótkie pałeczki o rzadko spotykanych kształtach Y i V metabolizm: anaerobioza; wytwarzanie kwasów L-(+)-mlekowego i octowego fermentacja cukrów: glukozy, galaktozy, fruktozy, maltozy, sacharozy, laktozy, eskuliny, rybozy, mannitolu, sorbitolu, D-rafinozy, melibiozy.

Wynalazek dotyczy również produktu mlecznego otrzymanego przez biokonwersję substratu mlecznego z użyciem kultury szczepu Bifidobacterium według wynalazku.

Korzystnie pH produktu mlecznego wynosi 6 do 7.

Porównując, wysokość pH produktów znanych ze stanu techniki, uzyskanych w wyniku fermentacji przez Bifidobacterium, pod koniec fermentacji wynosi od 4 do 4,6.

Produkt ten może być spożyty jako taki lub może być poddawany różnym procesom prowadzącym do otrzymania żądanego produktu gotowego do spożycia. Może to być, na przykład, wzbogacenie go w środki tworzące teksturę, środki smakowe i zapachowe, dodatki witaminowe i mineralne, tłuszcz lub tym podobne, jeśli nie zostały dodane do pierwotnej pożywki. Może on być także zatężony lub rozcieńczony.

Produkt mleczny według wynalazku może stanowić bazę do przygotowania pożywienia ze świeżego mleka.

Wynalazek obejmuje także odwodniony i/lub sterylizowany pokarm mleczny, który otrzymuje się z produktu mlecznego według wynalazku przez odwodnienie i/lub sterylizację .

Korzystnie, przez poddanie go sterylizacji i/lub odwodnieniu, produkt mleczny może być także zastosowany do wytwarzania produktów spożywczych o zwiększonej trwałości do długotrwałego przechowywania. Zachowuje on swe własności immunostymulujące nawet, gdy brak w nim żywych bakterii, na przykład, po wysuszeniu lub sterylizacji UHT.

W zakres wynalazku wchodzi też pokarm mleczny rekonstytuowany przez dodanie wody do odwodnionego pokarmu mlecznego, który jest otrzymany z odwodnionego pokarmu mlecznego określonego powyżej, a jego pH wynosi 6 do 7,5, korzystnie 6,5 do 6,9.

W przeciwieństwie do pokarmów otrzymanych w wyniku fermentacji przez Bifidobacterium, znanych ze stanu techniki, pokarmy mleczne według wynalazku nie są kwaśne i zawierają białka mleka w rozpuszczalnej, nieskoagulowanej postaci. Po dodaniu wody do takiego odwodnionego pokarmu mlecznego według wynalazku jest więc możliwe otrzymanie jednolitego produktu, w którym nie następuje wytrącanie się osadu, ani rozdzielanie faz.

Pokarmy mleczne według wynalazku, dzięki swemu działaniu immunostymulującemu, zapewniają porównywalną ochronę przed infekcjami bakteryjnymi i wirusowymi jak żywność otrzymywana w wyniku fermentacji przez Bifidobacterium, znana ze stanu techniki, nie mają jednak jej niekorzystnych cech, takich, jak na przykład, zmiana smaku i wyglądu produktu. Pokarmy takie są szczególnie odpowiednie jako żywność dla niemowląt, a w szczególności niemowląt nie odstawionych od piersi, ale mogą być także stosowane jako pokarm dla osób w każdym wieku.

PL 207 831 B1

Wynalazek stanie się bardziej zrozumiały dzięki następującemu dodatkowemu opisowi, który dotyczy przykładów wytwarzania produktów mlecznych według wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie dietetycznego preparatu mlecznego w proszku, o aktywności immunostymulującej, dla niemowląt nie odstawionych od piersi

Przygotowano koncentrat mleczny, którego skład, wyrażony w gramach na 100 gramów suchej masy, jest następujący:

białka mleka (80% kazeiny i 20% białka surowicy) 13 tłuszcz roślinny 25,5 laktoza 42,25 maltodekstryny 16 minerały 3 witaminy 0,25

Tłuszcz roślinny dodaje się do odtłuszczonego krowiego mleka, podgrzanego do temperatury 75°C. Homogenizację przeprowadza się w tej samej temperaturze, dwuetapowo. Etap pierwszy przebiega pod ciśnieniem 200 kg/cm², etap drugi pod ciśnieniem 50 kg/cm². Następnie dodaje się kolejno: laktozę i maltodekstryny, uprzednio rozpuszczone w wodzie, potem roztwór witamin i minerałów.

Mieszaninę końcową pasteryzuje się w temperaturze 115°C, a następnie odparowywuje do 48% zawartości suchej masy.

Koncentrat, schłodzony do temperaturze 37°C, następnie inokuluje się kulturą bakteryjną B. breve I-2219 zawierającą 10⁹ bakterii/ml. Początkowa wartość pH wynosi 6,15, a ciśnienie osmotyczne 0,96.

Po 8 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, w zbiorniku, w obecności powietrza z okresowym mieszaniem przez 10 minut co 2 godziny, wartość pH wynosi 6,1, a wielkość populacji B. breve wynosi 10⁶ bakterii na ml. Zakwaszenie w skali Dornic wynosi 48°D.

Koncentrat jest poddawany suszeniu rozpryskowemu. Z otrzymanego proszku po dodaniu go do wody w ilości 140 g na litr wody, można uzyskać rekonstytuowane mleko o następujących własnościach: pH 6,6, zakwaszenie w skali Dornic 12°D, ciecz nie zawiera grudek skrzepu mleka.

P r z y k ł ad 2

Wytwarzanie gotowego do spożycia, sterylizowanego metodą UHT i pakowanego aseptycznie mlecznego preparatu dietetycznego o aktywności immunostymulującej dla niemowląt nie odstawionych od piersi

Przygotowano mieszaninę o następującym składzie (w g/litr):

białka 21 tłuszcz 24 węglowodany 83 minerały 5 witaminy 0,45

Mieszaninę tę przygotowuje się z następujących składników (na 100 litrów produktu końcowego):

- 58 litrów mleka odtłuszczonego,

- 2,4 kg tłuszczu,

- 4,7 kg laktozy,

- 0,7 kg maltodekstryn,

- 0,3 kg witamin,

- 0,05 kg kompleksu mineralnego.

Mleko najpierw poddaje się obróbce termicznej przy zastosowaniu systemu UHT w temperaturze od 115 do 120°C.

Tłuszcz włączony jest do mleka schłodzonego do temperatury 70°C w trakcie dwuetapowego procesu homogenizacji, 200 kg podczas pierwszego etapu, 50 kg w czasie drugiego etapu.

Mieszaninę chłodzi się do temperatury 37-38°C, a następnie inokuluje się 1,5% kulturą bakteryjną CNCM I-2219 zawierającą od 1 do 5 x 10⁹ bakterii na mililitr.

Inkubację prowadzi się w temperaturze 37°C przez 8 godzin w warunkach identycznych jak w przykładzie 1, powyżej, a następnie układ chłodzi się do temperatury 5°C.

Wartość pH roztworu wynosi 6,3, a populacja B. breve liczy 3 x 10⁷ bakterii/ml. Kwasowość w skali Dornic wynosi 23°D.

Resztki składników rozpuszcza się w około 50 litrach wody, a następnie dodaje się do otrzymanego produktu pod koniec inkubacji.

PL 207 831 B1

Tak otrzymaną mieszaninę, zanim zostanie aseptycznie zapakowana, poddaje się procesowi UHT w temperaturze 140°C przez 6 do 7 sekund.

P r z y k ł a d 3

Działanie immunostymulujące produktów mlecznych według wynalazku

Działanie immunostymulujące produktów mlecznych według wynalazku badano w następujący sposób:

- przez rozwój flory kałowej myszy skolonizowanych ludzką florą;

- przez regulację zjawiska translokacji u myszy monoksenicznych, skolonizowanych Clostridium perfringens.

Badania rozwoju flory kałowej myszy skolonizowanych ludzką florą

Użyto dorosłych myszy linii C3H skolonizowanych ludzką florą.

Są to myszy pokolenia G1, przy czym pokolenie G0 stanowiły myszy akseniczne skolonizowane w wieku dorosłym ludzką florą.

- Liczba myszy w grupie: 6

- Liczba doświadczeń: 2 na produkt.

Myszy trzyma się przez 1 tydzień w tej samej klatce, a następnie rozdziela po 6 do klatki.

Wiek myszy na początku doświadczeń wynosił minimalnie 8 tygodni, maksymalnie 11 tygodni.

We florze kałowej obserwowano następujące:

- Bifidobacterium

- Bacteroides fragilis

- zarodniki Clostridium

- ewentualnie zarodniki Cl. Perfingens Techniki mikrobiologiczne

Próbki kału pobiera się bezpośrednio przed zastosowaniem, waży aseptycznie i rozpuszcza w zredukowanym roztworze Ringera (rozcieńczenie z dodatkiem chlorowodorku cysteiny w ilości

0,3 g/l).

Zliczanie Bifidobacterium i Bacteroides fragilis na zredukowanych pożywkach BEERENS i BBE zaszczepionych bezpośrednio i inkubowanych w warunkach beztlenowych.

Do testu na zarodniki Clostridium:

- zawiesiny podgrzewa się przez 10 minut w temperaturze 75°C, inokuluje na agarze Columbia wzbogaconym glukozą (5 g/l) i chlorowodorkiem cysteiny (0,3 g/l) i inkubuje przez 5 dni,

- kolonie Clostridium identyfikuje się dzięki ich morfologii i negatywnej reakcji katalazy. Morfologia komórek jest określana przez wybarwianie Gram 3.

Wyniki uzyskane w przypadku podania kontrolnego preparatu mlecznego bezpośrednio po inokulacji szczepem CNCM I-2219 przedstawione są w tabeli I, poniżej (okres kontaktowania = 0).

T a b e l a I

	T 0	T 7 dni	T 15 dni
Bifidobacterium	8,2 ± 0,3	9,3 ± 0,1	8,6 ± 0,1
Bacteroides fragilis	7,2 ± 0,5	9,3 ± 0,1	9,2 ± 0,1
Clostridium	4,3 ± 0,1	5,1 ± 0,5	6,7 ± 0,3

Wyniki wyrażone są logarytmicznie, a liczby przedstawiają średnie wyników dla 6-ciu myszy; zaobserwowano znaczący wzrost Bacteroides fragilis i Clostridium, czego skutkiem jest zwiększenie ryzyka infekcji.

Wyniki uzyskane dla produktu mlecznego według wynalazku, inokulowanego szczepem CNCM I-2219 i pozostawionego na okres 8 godzin, w temperaturze 37°C przedstawia tabela II, poniżej.

PL 207 831 B1

T a b e l a II

	T 0	T 7 dni	T 15 dni
Bifidobacterium	7,1 ± 0,1	11 ± 0,5	10,3 ± 0,8
Bacteroides fragilis	8 ± 0,2	7,9 ± 0,3	nd < 4,7 log
Clostridium	3,9 ± 0,3	4,4 ± 0,2	4 (1 mysz) 5 inne: brak
C. perfringens	3,7 ± 0,9	nd	nd

nd: nie określona

Zaobserwowano zwiększenie liczby Bifidobacterium rzędu 2,5 log i bardzo duże zmniejszenie liczby Bacteroides i Clostridium względem kontroli, w szczególności w przypadku podawania przez 15 dni.

Badania na myszach monoksenicznych z Clostridium perfringens

Cel: ocena wpływu produktów według wynalazku na rozsiew bakterii jelitowych w różnych narządach.

Warunki eksperymentu: myszy akseniczne (wiek 8 tygodni) trzymane w sterylizowanych, odizolowanych klatkach, karmione podłożem RO3 sterylizowanym przez naświetlanie.

Testowane produkty:

- ultraczysta woda sterylizowana przez autoklawowanie

- ultraczysta woda sterylizowana przez autoklawowanie z dodatkiem produktu (PII) według wynalazku w stosunku 14 g (waga proszku) na 100 ml wody.

Roztwory powyższe wytwarza się codziennie w sposób sterylny i podaje myszom ad libitum przez 6 dni. Pod koniec tego okresu myszy inokuluje się szczepem C. perfringens LAB (pochodzącym z ludzkiego jelita) w stosunku od 3,5 do 4,5 log CFU na mysz. Wszczepienie i rozsiew Clostridium perfringens w narządach limfatycznych mierzy się zabijając po dwie myszy z każdej grupy po 24 godzinach, 48 godzinach, 4 dniach i 7 dniach po inokulacji. Przyjęto sposób liczenia oparty na metodzie najbardziej prawdopodobnej liczby, stosując trzy probówki z pożywką LS (inkubacja w temperaturze 46°C przez 24 - 48 godzin).

Wyniki przedstawiono w tabeli III.

T a b e l a III

	D1	D2	D4	D7
	PII	woda	PII	woda	PII	woda	PII	woda
Jelito kręte bliższe	2	2	0	1	0	2	2	2
Środkowe	2	0	0	1	0	2	2	2
Dalsze	2	0	0	1	0	2	2	2
Kątnica	2	0	0	2	1	2	2	2
Okrężnica	2	2	0	2	2	2	2	2
Kępki Peyer'a	1	1	0	0	1	2	2	2
Zwój krezkowy	0	2	0	0	1	2	1	2
Bakteriemia	0	0	0	0	0	0	0	0
Śledziona	0	1	0	2	0	2	1	2
Wątroba	0	0	0	0	1	2	2	2
Nerka	0	1	0	2	1	2	1	2
Płuco	0	0	0	0	0	2	0	0

Opis do tabeli III:

= sł abe wszczepienie/rozsiew = ś rednie wszczepienie/rozsiew = duż e wszczepienie/rozsiew

PL 207 831 B1

Zaobserwowano, co następuje:

- 24-godzinne opóźnienie wszczepienia C. perfringens po podaniu produktu według wynalazku;

- słabe wszczepienie w narządach limfatycznych u myszy, którym podano produkt według wynalazku (PII).

Wyniki te wykazują, że produkty mleczne według wynalazku regulują rozsiew Clostridium perfringens w narządach limfatycznych.

Claims (9)

1. Szczep Bifidobacterium breve zdeponowany w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) 31 maja 1999 pod numerem I-2219.

2. Sposób wytwarzania immunostymulującego produktu mlecznego, znamienny tym, że substrat mleczny poddaje się biokonwersji z użyciem kultury szczepu Bifidobacterium określonego w zastrz. 1 przez utrzymywanie w kontakcie substratu z tą kulturą, w warunkach, w których zakwaszenie wywołane przez Bifidobacterium nie przekracza 0,5 jednostek pH po 8 godzinach inkubacji dla początkowego stężenia Bifidobacterium stanowiącego 1 x 10⁷ do 5 x 10⁷ CFU na ml.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że substrat mleczny i Bifidobacterium kontaktuje się w stosunku od 1 x 10⁷ do 1 x 10⁹ CFU na ml substratu mlecznego, a końcowa populacja Bifidobacterium pod koniec procesu biokonwersji wynosi od 1 x 10⁵ do 1 x 10⁹ CFU na ml produktu.

4. Sposób według zastrz. 2 lub 3, znamienny tym, że pH substratu mlecznego podczas kontaktowania z Bifidobacterium wynosi od 6,3 do 7, a pH produktu pod koniec reakcji biokonwersji wynosi korzystnie od 6 do 7.

5. Sposób według zastrz. 2 - 4, znamienny tym, że czas trwania kontaktu między substratem mlecznym a bakteriami wynosi od 6 do 24 godzin.

6. Produkt mleczny otrzymany przez biokonwersję substratu mlecznego z użyciem kultury szczepu Bifidobacterium określonego w zastrz. 1.

7. Produkt mleczny według zastrz. 6, znamienny tym, że jego pH wynosi 6 do 7.

8. Odwodniony i/lub sterylizowany pokarm mleczny, znamienny tym, że jest otrzymany z produktu mlecznego określonego w zastrz. 7, przez odwodnienie i/lub sterylizację.

9. Pokarm mleczny rekonstytuowany przez dodanie wody do odwodnionego pokarmu mlecznego, znamienny tym, że jest otrzymany z odwodnionego pokarmu mlecznego określonego w zastrz. 8, a jego pH wynosi 6 do 7,5, korzystnie 6,5 do 6,9.