PL208343B1 - Zastosowanie DSPA alfa 1 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Zgodnie z wynalazkiem opisano terapeutyczne zastosowanie nieneurotoksycznych aktywatorów plazminogenu, zwłaszcza ze śliny Desmodus rotundus (DSPA), w leczenia udaru.

Pojęcie udar obejmuje różne obrazy kliniczne chorób, które są podobne pod względem swoich objawów klinicznych. Na podstawie patogenezy można dokonać pierwszego zróżnicowania tych obrazów chorób do tak zwanych udarów niedokrwiennych i udarów krwotocznych.

W przypadku udarów niedokrwiennych (ischemii) dochodzi do zmniejszenia albo przerwania przepływu krwi przez mózg na skutek niedostatecznego doprowadzenia krwi tętniczej, co jest spowodowane często zakrzepicą naczynia zwężonego na skutek stwardnienia tętnic, a także na skutek zatorów tętniczych względnie sercowych.

Udary krwotoczne opierają się natomiast na perforacji uszkodzonych na skutek nadciśnienia tętniczego tętnic doprowadzających krew do mózgu. Jednak spośród wszystkich udarów mózgu tylko około 20% jest spowodowanych przez tę postać udaru krwotocznego, zatem największe znaczenie mają udary spowodowane zakrzepicą.

Niedokrwieniu tkanek neuronowych towarzyszy, w porównaniu z innymi niedokrwieniami tkanek, w znacznym stopniu martwica dotkniętych komórek. Zwiększone występowanie martwicy można wyjaśnić na podstawie nowszej wiedzy zjawiskiem tak zwanej ekscytotoksyczności, w przypadku której chodzi o złożoną kaskadę wielu etapów reakcji. Kaskada ta zapoczątkowywana jest w ten sposób, że niedokrwienne neurony cierpiące na skutek braku tlenu tracą szybko ATP i ulegają depolaryzacji. Prowadzi to do silnego postsynaptycznego uwalniania neuroprzekaźnika, glutaminianu, który aktywuje związane z błoną receptory glutaminianu, które regulują kanały kationowe. Skutkiem podwyższonego uwalniania glutaminianu receptory glutaminianu stają się nadaktywne.

Receptory glutaminianu regulują zależne od napięcia kanały kationowe, które otwierają się po związaniu się glutaminianu ze swoim receptorem. Przy tym do komórki wpływa strumień Na⁺ i Ca²⁺, który prowadzi do masowego zakłócania zależnej od Ca²⁺ komórkowej przemiany materii, włącznie z przemianą energii. Za występującą potem śmierć komórki mogłaby być odpowiedzialna aktywacja enzymów katabolicznych zależnych od Ca²⁺ (Lee, Jin-Mo i wsp., The changing landscape of ischemic brain injury Mechanisms; Dennis W. Zhoi Glutamat neurotoxicity and diseases of nervous system).

Chociaż mechanizm neurotoksyczności z udziałem glutaminianu nie jest obecnie jeszcze szczegółowo zrozumiały, to wydaje się, że istnieje jedność stanowisk co do tego, że po niedokrwieniu mózgu to zjawisko przyczynia się w znacznym stopniu do śmierci komórek nerwowych (Jin-Mo Lee i wsp.).

W przypadku terapii ostrego niedokrwienia mózgu obok zapewnienia funkcji ż yciowych i stabilizacji parametrów fizjologicznych na pierwszym planie stoi począ tkowo dążenie do ponownego otwarcia zamkniętego naczynia. Ten cel realizuje się za pomocą różnych środków. Czysto mechaniczne ponowne otwieranie nie dało dotychczas zadowalających wyników, jak np. PTCA w przypadku w zawale serca. Dotychczas dostateczną poprawę stanu pacjenta moż na był o uzyskać tylko drogą skutecznej fibrynolizy, którą można przeprowadzić poprzez stosowanie miejscowe z użyciem cewnika (PROCAT, badanie z prourokinazą), przy czym ten sposób pomimo pierwszych pozytywnych wyników nie doprowadził jednak dotychczas do oficjalnego zaakceptowania tej procedury farmaceutycznej.

Właściwa dla organizmu fibrynoliza opiera się na proteolitycznej aktywności proteazy serynowej, plazminy, która pojawia się na skutek katalizy (aktywacji) z nieaktywnego prekursora, plazminogenu. Naturalna aktywacja plazminogenu zachodzi za pomocą właściwych dla organizmu aktywatorów plazminogenu, u-PA (aktywator plazminogenu typu urokinazy) i t-PA (tkankowy aktywator plazminogenu). Ten ostatni tworzy razem z fibryną, w przeciwieństwie do u-PA, tak zwany kompleks aktywatorowy. W związku z tym aktywność katalityczna t-PA zależy od fibryny i w obecności fibryny wzrasta około 550-krotnie. Katalizę za pośrednictwem t-PA plazminy do plazminogenu oprócz fibryny może pobudzać także fibrynogen, jednak w o wiele mniejszym stopniu. Zatem aktywność t-PA w obecności fibrynogenu wzrasta zaledwie 25-krotnie. Aktywność t-PA pobudzają ze swojej strony także produkty cięcia fibryny (fibrin degradation products (FDP)).

Wczesne sposoby podejścia do trombolitycznego leczenia ostrego udaru sięgają już lat 50-tych XX wieku, przy czym jednak dopiero od 1995 roku prowadzono pierwsze obszerne badania kliniczne ze streptokinazą, środkiem fibrynolitycznym z paciorkowców beta-hemolizujących. Streptokinazą tworzy z plazminogenem kompleks, który może przekształcać cząsteczki innego plazminogenu w plazminę .

PL 208 343 B1

Terapia za pomocą streptokinazy jest jednak związana z istotnymi niedogodnościami, ponieważ streptokinazą jako proteaza bakteryjna może wywoływać w organizmie reakcje alergiczne. Ponadto z powodu wcześ niejszego zakażenia paciorkowcowego może występować także tak zwana odporność streptokinazowa z odpowiednim tworzeniem się przeciwciał, co jeszcze bardziej utrudnia terapię. Poza tym badania kliniczne w Europie (Multicenter Acute Stroke Trial of Europę (MAST-E), Multicenter Acute Stroke Trial of Italy (MAST-I)) i Australii (Australien Streptokinase Trial (AST)) wskazywały na zwiększone ryzyko umieralności i znaczne zagrożenie krwawieniami wewnątrzmózgowymi (intracerebral hemorrhage, ICH) po leczeniu pacjentów streptokinazą, tak że te badania musiały zostać wcześnie przerwane.

W alternatywnym sposobie podejścia do terapii stosuje się urokinazę , także klasyczny środek fibrynolityczny, który w przeciwieństwie do streptokinazy nie ma właściwości antygenowych, ponieważ chodzi tu o właściwy dla organizmu enzym występujący w licznych tkankach. Stanowi on aktywator plazminogenu niezależny od kofaktora. Urokinazę wytwarza się w hodowlach komórek nerkowych.

W przypadku tkankowego aktywatora plazminogenu, tak zwanego rt-PA, który wytwarza się w rekombinowanych komórkach chomika, dostępne są obszerne doświadczenia w obszarze terapeutycznej trombolizy (patrz EP 0 093 619, amerykański opis patentowy nr 4 766 075). W latach 90-tych XX wieku przeprowadzono z zastosowaniem t-PA szereg badań klinicznych na skalę światową, przy czym głównym wskazaniem był zawał mięśnia sercowego, jednak uzyskano częściowo niezrozumiałe albo sprzeczne wyniki. W ten sposób w tak zwanym badaniu European Acute Stroke Trial (ECASS) leczono początkowo pacjentów dożylnie za pomocą rt-PA w ciągu sześciu godzin po wystąpieniu objawów udaru, a po 90 dniach badano stopień umieralności oraz wskaźnik Barthela jako miarę uszkodzenia albo zdolności pacjentów do samodzielnego życia. Nie zaobserwowano żadnej znaczącej poprawy zdolności do życia, a nawet pewne, jednak nieznaczne, zwiększenie umieralności. Pozwala to na wyciągnięcie wniosku, że mogłoby być ewentualnie korzystne trombolityczne leczenie pacjentów, wybranych celowo indywidualnie w zależności od danej historii choroby, za pomocą rt-PA bezpośrednio po wystąpieniu udaru. Na podstawie obserwowanego podwyższonego ryzyka krwotoku wewnątrzmózgowego (ICH) już po kilku godzinach po wystąpieniu udaru należało odradzać jednak ogólne stosowanie rt-PA w ciągu badanego okresu czasu sześciu godzin po wystąpieniu udaru (według C. Lewandowski C i Wiliam Barsan, 2001: Treatment of Acute Stroke w: Annals of Emergency Medicine 37:2, str. 202 ff).

Trombolityczne leczenie udaru było później przedmiotem badań klinicznych w National Institute of Neurologie Disorder and Stroke (tak zwany NINDS rtPA Stroke Trial) w USA. W tyra badaniu na pierwszym planie stało testowanie wpływu dożylnego leczenia za pomocą rt-PA w ciągu tylko trzygodzinnego okresu czasu po wystąpieniu objawów na stan zdrowia pacjentów po trzech miesiącach. Chociaż autorzy także i tu stwierdzali zwiększone ryzyko ICH, to na podstawie rozpoznanego w czasie badań pozytywnego wpływu tego leczenia na zdolność pacjentów do życia zalecano jednak leczenie za pomocą rt-PA w ciągu tego ograniczonego okresu czasu trzech godzin.

W dwóch dalszych badaniach (ECASS II Trial; Alteplase Thrombolysis for Acute Noninterventional Therapy in Ischemic Stroke (ATLANTIS) badano, czy te pozytywne wypowiedzi o skuteczności leczenia za pomocą rt-PA w ciągu trzech godzin po wystąpieniu udaru dadzą się potwierdzić także w przypadku leczenia w sześciogodzinnym okresie czasu. Na to pytanie nie można jednak było odpowiedzieć pozytywnie, ponieważ przy leczeniu w tym okresie czasu obok podwyższonego ryzyka ICH nie można było zaobserwować żadnej poprawy objawów klinicznych albo zmniejszenia umieralności.

Te obecnie sprzeczne wyniki doprowadziły do wielkiej ostrożności przy stosowaniu rt-PA. I tak już w 1996 roku stwierdzono w publikacji American Heart Association, że wśród lekarzy panuje wyraźny sceptycyzm co do trombolitycznego leczenia udaru, który jednak nie ma miejsca w odniesieniu do leczenia zawału mięśnia sercowego za pomocą środków fibrynolitycznych (van Gijn J, MD, FRCP, 1996 - Circulation 1996, 93:1616-1617).

Zasadność tego sceptycyzmu znajduje potwierdzenie w opublikowanym po raz pierwszy w 1997 roku i zaktualizowanym w marcu 2001 roku przeglądzie wszystkich Stroke Trials. Zgodnie z nim wszelkie leczenie za pomocą środków trombolitycznych (urokinaza, streptokinazą, rt-PA albo urokinaza rekombinowana prowadziły do znacznie zwiększonej umieralności w ciągu pierwszych dziesięciu dni po udarze,), zwłaszcza na skutek ICH, podczas gdy przy leczeniu w ciągu okresu czasu 6 godzin ogólna liczba albo zmarłych albo niepełnosprawnych pacjentów zmniejszała się. Stąd odradzano szerokie stosowanie środków trombolitycznych w leczeniu udaru.

PL 208 343 B1

Te wyniki skłoniły już wcześniej innych autorów do raczej sarkastycznej wypowiedzi, że pacjenci z udarem mają teraz do wyboru umrzeć albo przeż yć z niepeł nosprawnoś cią (SCRIP 1997: 2265, 26).

Jednak terapia za pomocą rt-PA stanowi obecnie jedyną metodę leczenia ostrego niedokrwienia mózgu, która dopuszczona jest przez Food and Drug Administration (FDA) w USA, przy czym jednak ta metoda jest ograniczona do stosowania rt-PA w ciągu trzech godzin po wystąpieniu udaru.

Dopuszczenie rt-PA miało miejsce w roku 1996. Bezpośrednio przedtem, a mianowicie w roku 1995, zwrócono pierwszy raz uwagę na szkodliwe skutki uboczne t-PA, które tłumaczą dramatyczne skutki t-PA w leczeniu udaru poza 3-godzinnym okresem czasu leczenia. Zgodnie z tym komórki mikroglejowe i komórki nerwowe hipokampu wytwarzają właściwy dla organizmu t-PA, który uczestniczy w ekscytotoksyczności za pośrednictwem glutaminianu. Ten wniosek końcowy nasuwa się przez porównanie myszy z niedoborem t-PA i myszy typu dzikiego, którym w danym przypadku wstrzyknięto do hipokampu agonistę glutaminianu, przy czym myszy z niedoborem t-PA wykazywały znacznie większą odporność na zewnętrznie (dooponowo) zastosowany glutaminian (Tsirka SE i wsp., Nature, tom 377, 1995, Exzitoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator). Te wyniki zostały potwierdzone w roku 1998, gdy Wang i wsp. po dożylnym podaniu t-PA myszom z niedoborem t-PA wykryli prawie podwójną ilość martwiczych tkanek nerwowych. Natomiast u myszy typu dzikiego ten ujemny wpływ zewnętrznego t-PA stanowił tylko około 33% (Wang i wsp., 1998, Nature, Tissue plasminogen activator (t-PA) increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild type and t-PA deficient mice).

Kolejne wyniki dotyczące pobudzania ekscytotoksyczności za pomocą t-PA opublikowali Nicole i wsp. na początku roku 2001 (Nicole O; Docagne F Ali C; Margaill I; Carmeliet P; MacKenzie ET; Vivien D i Buisson A, 2001: The proteolitic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signalling; w: Nat Med. 7, 59-64). Wykryli oni, że t-PA uwalniany przez zdepolaryzowane neurony korowe reaguje z tak zwaną podjednostką NR1 receptora glutaminianu typu NMDA i rozszczepia ją. Ta modyfikacja prowadzi do zwiększenia aktywności receptora, która ze swojej strony jest odpowiedzialna za większe uszkodzenie tkanki. Po zastosowaniu glutaminianu agonista NMDA indukował ekscytotoksyczność. t-PA działa w ten sposób neurotoksycznie drogą aktywacji receptora glutaminianu typu NMDA.

Według jednego z kolejnych sposobów wyjaśnienia neurotoksyczność t-PA powinna sprowadzać się bezpośrednio do aktywacji plazminy z plazminogenu. Zgodnie z tym modelem właściwym efektorem neurotoksyczności jest plazmina (Chen ZL i Strickland S, 1997: Neuronal Death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalysed degradation of laminin. Cell:91, 917-925).

Przegląd zależnych od czasu skutków neurotoksycznych t-PA przedstawia figura 9, na której widać ponadto wyraźnie większą toksyczność rekombinowanego t-PA w porównaniu z endogennym t-PA, która przypuszczalnie wynika z tego, że rt-PA wchodzi do tkanki w wyższych stężeniach.

To, że pomimo tych wskazań na neurotoksyczne skutki uboczne t-PA i pomimo wykrytego zwiększenia umieralności na skutek t-PA miało jednak miejsce prawne dopuszczenie przez FDA środków leczniczych, można wyjaśnić tylko brakiem bezpiecznych i skutecznych alternatyw i bardzo pragmatyczną analizą kosztów-zysków. Zatem wciąż istnieje jednak zapotrzebowanie na bardziej bezpieczne terapie, przy czym gdyby były one wciąż oparte na środkach trombolitycznych, o ile nie byłoby możliwe całkowite odstąpienie od trombolizy, musi być uwzględniony problem neurotoksyczności (patrz na przykład Wang i wsp. a.a.O.; Lewandowski i Barsan 2001 a.a.O).

Z tego względu nie doszły do skutku prowadzone dalej badania znanych środków trombolitycznych, włącznie z DSPA (aktywator plazminogenu z Desmodus rotundus), mające na celu opracowanie nowego środka terapeutycznego do leczenia udaru, chociaż w zasadzie mogłyby nadawać się wszystkie środki trombolityczne i na przykład w przypadku DSPA już w pierwszej publikacji wskazywano na jego możliwą przydatność w tej dziedzinie wskazań medycznych (Medan P; Tatlisumak T; Takano K; Carano RAD; Hadley SJ; Fisher M: Thrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogen activator (rDSPA) in a rat embolic stroke model, w: Cerebrovasc Dis 1996: 6; 175-194 (4^th International Symposium on Thrombolic Therapy in Acute Ishemic Stroke)). Właśnie w przypadku DSPA chodzi jednak o aktywator plazminogenu o wysokiej homologii (podobieństwie) do t-PA, tak że jednocześnie z rozczarowaniem co do neurotoksycznych skutków ubocznych t-PA także i w DSPA nie pokładano żadnych dalszych nadziei.

W ostatnim czasie realizuje się między innymi strategię , mają c ą celu poprawę dotychczasowego trombolitycznego leczenia udaru za pomocą środków trombolitycznych poprzez doprowadzanie substancji już nie dożylnie, lecz do tętnic, poprzez cewnik bezpośrednio w pobliże zakrzepu

PL 208 343 B1 wewnątrznaczyniowego. Pierwsze doświadczenia w tym względzie polegają na stosowaniu rekombinacyjnie otrzymanej urokinazy. W ten sposób można ewentualnie zmniejszyć dawkę wymaganą do trombolizy i zmniejszyć część skutków ubocznych. Taka postać zastosowania wymaga jednak wysokich nakładów technicznych i dlatego nie wszędzie jest dostępna. Ponadto wymaga ona pewnego czasu dla dokładnego przygotowania pacjenta, który to czas nie zawsze jest do dyspozycji, co stanowi dodatkowe zagrożenie. Aktualne wysiłki są ukierunkowane na środki przeciwkrzepliwe, takie jak heparyna, aspiryna albo Ancrod, substancję czynną z jadu żmii malajskiej. Dwa badania kliniczne ukierunkowane między innymi także na badanie skutków heparyny (International Stroke Trial (IST) oraz Trial ORG 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST)) nie wskazują jednak na znaczące zmniejszenie umieralności i zapobieganie ponownemu udarowi.

Kolejna nowa metoda leczenia nie jest ukierunkowana ani na zakrzep, ani na upłynnianie krwi, ani na zapobieganie krzepnięciu, lecz próbuje się w niej poprawić żywotność komórek uszkodzonych przez przerwanie dopływu krwi (WO 01/51613 A1 i WO 01/51614 A1). W tym celu stosuje się antybiotyki z grupy chinonów, aminoglikozydów albo chloramfenikol. Z podobnego względu proponuje się ponadto rozpoczęcie bezpośrednio po udarze podawania cytycholiny, która w organizmie rozszczepia się na cytydynę i cholinę. Produkty tego rozszczepienia są składnikami błony komórki nerwowej i mogą zatem sprzyjać regeneracji uszkodzonej tkanki (amerykań ski opis patentowy nr US 5 827 832).

Najnowsze próby ukierunkowane na poszukiwanie bezpiecznych metod leczenia opierają się ponadto na nowej wiedzy polegającej na tym, że część śmiertelnych skutków udaru sprowadza się pośrednio tylko do przerwania dopływu krwi, a bezpośrednio do ekscyto- albo neurotoksyczności z udziałem nadmiernie pobudzonego receptora glutaminianu, który z kolei zwiększa się zwłaszcza także na skutek t-PA (patrz wyżej). Stąd pewnym sposobem podejścia do zmniejszenia tej ekscytotoksyczności jest zastosowanie tak zwanych środków neuroochronnych, które można stosować samodzielnie albo w połączeniu ze środkami fibrynolitycznymi w celu zminimalizowania ich skutków neurotoksycznych. Przy tym mogą one prowadzić albo bezpośrednio, na przykład jako antagoniści receptorów glutaminianu, albo pośrednio poprzez blokowanie zależnych od napięcia kanałów sodowych albo wapniowych, do osłabienia ekscytotoksyczności (Jin-Mo Lee i wsp., a.a.O).

Hamowanie kompetycyjne (antagonizacja) receptora glutaminianu typu NMDA jest przy tym możliwa na przykład za pomocą 2-amino-5-fosfonowalerianianu (APV) albo 2-amino-5-fosfonoheksanokarboksylanu (APH). Hamowanie niekompetycyjne można osiągnąć na przykład za pomocą substancji, które wiążą się po fencyklidynowej stronie kanałów, takich jak fencyklidyna, MK-801, dekstrorfan albo ketamina.

Leczenie za pomocą środków neuroochronnych nie zakończyło się dotychczas pożądanym powodzeniem, prawdopodobnie dlatego, że muszą być one łączone ze środkami trombolitycznymi w celu uzyskania dzia ł ania ochronnego i dotyczy to w równej mierze takż e i innych substancji czynnych (patrz Fig. 10).

Nawet połączenie t-PA ze środkiem neuroochronnym pozwala tylko co najwyżej na powodzenie w sensie ograniczenia uszkodzenia i nie pozwala na uniknię cie w ten sposób niedogodnoś ci zwią zanych z neurotoksycznością samego zastosowanego środka fibrynolitycznego.

Stąd celem niniejszego wynalazku jest opracowanie nowego terapeutycznego podejścia do leczenia udaru u człowieka.

Cel ten osiągnięto poprzez zastosowanie do terapeutycznego leczenia udaru nietoksycznych czynników aktywujących.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie DSPA alfa 1 do wytwarzania leku do leczenia udaru u ludzi po upł ywie trzech godzin od wystą pienia udaru.

Korzystnie leczenie to następuje po upływie sześciu godzin od wystąpienia udaru.

Korzystnie następuje ono po upływie dziewięciu godzin od wystąpienia udaru.

Korzystnie DSPA alfa 1 może być wyizolowany z Desmodus rotundus.

Korzystnie DSPA alfa 1 jest wyizolowany z Desmodus rotundus.

Wynalazek oparty jest na zastosowaniu aktywatora plazminogenu, którego aktywność jako dojrzałego enzymu ulega selektywnemu wielokrotnemu zwiększeniu przez fibrynę, a mianowicie ponad 650 razy.

Zastosowanie według wynalazku opiera się na wiedzy, że neurotoksyczność aktywatora plazminogenu tkankowego (t-PA) powinna sprowadzać się do tego, że na skutek rozkładu tkanki w mózgu spowodowanego udarem uszkadza się albo ulega zniszczeniu bariera krew-tkanka mózgowa, a krążący we krwi fibrynogen może w ten sposób wnikać do tkanki nerwowej, w której aktywuje on t-PA,

PL 208 343 B1 co prowadzi do dalszych uszkodzeń tkanki bezpośrednio na skutek aktywacji receptora glutaminianu albo aktywacji plazminogenu. W celu uniknięcia tego efektu stosuje się teraz zgodnie z wynalazkiem aktywator plazminogenu, który wykazuje większą selektywność względem fibryny i odwrotnie mniejszą podatność na aktywację przez fibrynogen. Stąd wynika, że aktywator plazminogenu tu opisany przy przechodzeniu fibrynogenu z krwi do tkanki nerwowej na skutek uszkodzonej bariery krew-tkanka mózgowa nie aktywuje się albo aktywuje w znacznie mniejszym stopniu w porównaniu z t-PA, ponieważ jego aktywator, fibryna, na skutek swojej wielkości nie może wnikać do tkanki nerwowej. Aktywatory plazminogenu tu opisane są zatem nieneurotoksyczne.

Zgodnie z wynalazkiem opisano zastosowanie nietoksycznych aktywatorów plazminogenu, zawierających co najmniej jeden element tak zwanej triady zymogenowej. Porównywalna triada jest znana z katalitycznego centrum serynowych proteaz rodziny chymotrypsyny, która składa się z trzech współdziałających aminokwasów, asparaginianu 194, histydyny 40 i seryny 32. Ta triada nie jest jednak obecna w t-PA należącym do rodziny serynowych proteaz typu chymotrypsyny. Wiadomo jednak, że docelowa mutageneza naturalnego t-PA prowadzi w obecności fibryny, w celu wprowadzenia co najmniej jednego z tych aminokwasów w odpowiednie położenia, do zmniejszenia aktywności proenzymu (jednołańcuchowy t-PA) i zwiększenia aktywności dojrzałego enzymu (dwułańcuchowy t-PA). Zatem wprowadzenie co najmniej jednego aminokwasu z triady albo aminokwasów, które pełnią odpowiednie funkcje w triadzie, prowadzi do zwiększenia zymogenności t-PA (stosunek aktywności dojrzałego enzymu do aktywności proenzymu) przy znacznym zwiększeniu specyficzności fibryny dzięki konformacyjnemu oddziaływaniu pomiędzy wprowadzonymi resztami aminokwasowymi i ewentualnie resztami aminokwasowymi o sekwencji typu dzikiego.

Zatem wiadomo, że mutageneza naturalnego t-PA w celu podstawienia Phe305 do His (F305H) oraz Ala 292 do Ser (A292S) prowadzi do 2-krotnego zwiększenia zymogenności, podczas gdy jednak już przy samym wariancie F305H ma miejsce zwiększenie 5-krotne (EL Madison, Kobe A, Gething M-J, Sambrook JF, Goldsmith EJ 1993: Converting Tissue Plasminogen Activator to a Zymogen: A regulatory Triad of Asp-His-Ser; Science: 262, 419-421). Te mutanty t-PA wykazują w obecnoś ci fibryny 30000-krotny (F305H) względnie 130000-krotny wzrost aktywności (F305H, A292S). Obydwa mutanty zawierają dodatkowo podstawienie Arg275 do R275E w miejscu rozszczepienia Arg275-Ile276 w celu zapobieżenia rozszczepieniu przez plazminę, przez co jednołańcuchowy t-PA przekształcany jest w postać dwułańcuchową. Tylko ten mutant zwiększa specyficzność t-PA względem fibryny 6900-krotnie (K Tachias, Madison EL 1995: Yariants of Tissue-type Plasminogen Activator Which Display Substantially Enhanced Stimulation by Fibrin, w: Journal of Biological Chemistry 270, 31:18319-18322).

Pozycje 305 i 292 w t-PA są homologiczne względem pozycji His40 i Ser32 znanej triady proteaz serynowych. Przez odpowiednie podstawienie histydyną względnie seryną te aminokwasy mogą współdziałać z asparaginianem 477 t-PA, tak że w mutantach t-PA może być utworzona znana funkcjonalna triada (Madison i wsp., 1993).

Te mutanty t-PA można stosować do leczenia udaru, ponieważ dzięki swojej większej specyficzności względem fibryny nie wykazują one neurotoksyczności, albo wykazują tylko wyraźnie mniejszą, w porównaniu z t-PA typu dzikiego. Ujawnienie wymienionych mutantów t-PA F305H, F305H, A292S, samodzielnie albo w połączeniu z R275E, przedstawiono w pełni w publikacji Madison i wsp., 1993, oraz Tachias i Madison, 1995.

Zwiększenie specyficzności aktywatorów plazminogenu względem fibryny jest możliwe alternatywnie także drogą punktowej mutacji Asp194 (albo asparaginianu w pozycji homologicznej). Aktywatory plazminogenu należą do grupy proteaz serynowych z rodziny chymotrypsyny i dlatego zawierają konserwowany aminokwas Aspl94, który jest odpowiedzialny za trwałość katalitycznie aktywnej konformacji dojrzałych proteaz. Wiadomo, że Asp194 w zymogenach proteaz serynowych współdziała z His40. Drogą aktywującego rozszczepienia zymogenu takie wzajemne oddziaływania stają się niemożliwe, a łańcuch boczny Asp194 obraca się o około 170°, aby na koniec utworzyć z Ilel6 nowy mostek solny. Ten mostek solny uczestniczy w trwałości oksyanionowej kieszonki katalitycznej triady dojrzałej proteazy serynowej i występuje także w t-PA.

Wprowadzenie mutacji punktowej Aspl94 zaburza przede wszystkim tworzenie, względnie trwałość, konformacji katalitycznej proteaz serynowych. Pomimo tego zmutowane aktywatory plazminogenu wykazują w obecności ich kofaktora, fibryny, zwłaszcza w porównaniu z dojrzałą postacią typu dzikiego, znaczny wzrost aktywności, który można wyjaśnić tylko tym, że wzajemne oddziaływanie z fibryną pozwala na zmianę konformacji pozwalającą na aktywność katalityczną (L Strandberg, Madison EL,

PL 208 343 B1

1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator with Substantially Enhanced Response and Selectivity towards Fibrin Co-factors, w: Journal of Biological Chemistry 270, 40:2344-23449). W ten sposób mutanty Asp194 aktywatorów plazminogenu wykazują wysoki wzrost aktywności w obecności fibryny, który pozwala na ich opisane tu zastosowanie.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też zastosowanie t-PA, w którym Asp194 jest zastąpiony przez glutaminian (D194E) względnie asparaginę (D194N). W ten sposób przy braku fibryny aktywność t-PA zmniejsza się o współczynnik 1-2000, natomiast w obecności fibryny można uzyskać wzrost aktywności o współczynnik od 498000 do 1050000. Te mutanty mogą zawierać ponadto substytucję Arg15 do R15E, która zapobiega rozszczepieniu przez plazminę jednołańcuchowego t-PA na wiązaniu peptydowym Arg15-Ile16, przez co powstaje dwułańcuchowy t-PA. Tylko na skutek tej mutacji aktywacja t-PA przez fibrynę zwiększa się o współczynnik 12000. Ujawnienie mutacji w pozycjach 194 oraz 15 t-PA przedstawiono obszernie w publikacji Strandberg i Madison, 1995.

Zwiększenie zależności aktywatorów plazminogenu od fibryny można osiągnąć ponadto poprzez wprowadzenie mutacji punktowych do tak zwanej pętli autolizy. Ten odcinek aminokwasowy jest znany z trypsyny, występuje jednak także jako odcinek homologiczny w proteazach serynowych i charakteryzuje się zwłaszcza trzema aminokwasami hydrofobowymi (Leu, Pro i Phe). Pętla autolizy w aktywatorach plazminogenu jest odpowiedzialna za oddział ywanie z plazminogenem. Mutacje punktowe w tym obszarze mogą prowadzić do tego, że wzajemne oddziaływanie białko/białko pomiędzy plazminogenem i aktywatorem plazminogenu nie może już funkcjonalnie zachodzić, przy czym jednak mutacje punktowe są istotne tylko przy braku fibryny. Natomiast w obecności fibryny są one odpowiedzialne za wzrost aktywności aktywatorów plazminogenu (K Song-Hua, Tachias K, Lamba D, Bode W, Madison EL, 1997: Identification of a Hydrophobic exocite on Tissue Type Plasminogen Activator that Modulates Specificity for Plasminogen, w: Journal of Biological Chemistry 272, 3, 181-1816).

Zgodnie z wynalazkiem opisano też zastosowanie t-PA z mutacjami punktowymi w pozycjach 420-423. Jeżeli te reszty podstawia się z zastosowaniem mutagenezy ukierunkowanej, to zależność t-PA od fibryny zwiększa się o współczynnik do 61000 (K Song-Hua i wsp.). Song-Hua i wsp. badali mutacje punktowe L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A i F423E.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też zastosowanie zmodyfikowanego aktywatora plazminogenu tkankowego o sekwencji aminokwasowe j według SEQ ID NO 1 (Fig. 13). Ten zmodyfikowany t-PA różni się od t-PA typu dzikiego wymianą następujących hydrofobowych aminokwasów w pozycjach 420-423 w pętli autolizy: His420, Asp421, Ala422 i Dys423. Ten t-PA zawiera dogodnie jedną fenyloalaninę w pozycji 194. Poza tym pozycja 275 może być zajęta przez glutaminian. Dogodnie pozycja 194 jest zajęta przez fenyloalaninę.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też zastosowanie zmodyfikowanej urokinazy. Taka urokinaza może zawierać aminokwas według SEQ ID NO 2 (Fig. 14), w której hydrofobowe aminokwasy pętli autolizy są zastąpione przez Val420, Thr421, Asp422 i Ser423. Taka urokinaza zawiera dogodnie Ile275 oraz Glu194. Ten mutant wykazuje w porównaniu z urokinaza typu dzikiego zwiększoną 500-krotnie specyficzność względem fibryny.

Oba mutanty, zarówno urokinazy, jak i t-PA, badano w próbach półilościowych i wykazały one w porównaniu z t-PA typu dzikiego zwiększoną specyficzność względem fibryny.

Wysoki wzrost aktywności w obecności fibryny, a mianowicie wzrost 100000-krotny, wykazuje ponadto także aktywator plazminogenu (DSPA) ze śliny nietoperza-wampira (Desmodus rotundus), który zatem stosowany jest według wynalazku. Pojęcie DSPA obejmuje cztery różne proteazy, które pełnią zasadniczą rolę w przypadku nietoperza-wampira, a mianowicie wydłużają czas krwawienia spowodowanych przez te zwierzęta ran zwierząt-ofiar (Cartwright, 1974). Te cztery proteazy (DSPA_a1, DSPA_a2, DSPA_e, DSPA_Y) wykazują wysokie podobieństwo (homologię) do siebie i do ludzkiego t-PA.

Wykazują one także podobne albo zgodne fizjologiczne aktywności. DSPA jest przedmiotem europejskiego opisu patentowego EP 0 352 119 A1 oraz amerykańskich opisów patentowych nr US 6 008 019 i 5 830 849, w których je obszernie ujawniono.

W przypadku DSPA_a1 chodzi o dotychczas najlepiej zbadaną proteazę tej grupy, która wykazuje ponad 72% homologię swojej sekwencji aminokwasowej względem znanej ludzkiej aminokwasowej sekwencji t-PA (Kratzschmar i wsp., 1991). Przy tym jednak pomiędzy t-PA i DSPA istnieją dwie istotne różnice, a mianowicie, po pierwsze, DSPA w postaci w pełni aktywnej cząsteczki ma postać pojedynczego łańcucha w przeciwieństwie do t-PA, który przekształcany jest w postać dwułańcuchową (Gardell i wsp., 1989; Kratzschmar i wsp., 1991), a po drugie, katalityczna aktywność DSPA jest prawie bezwzględnie zależna od fibryny (Gardell i wsp.; Bringmann i wsp., 1995: Toschi i wsp., 1998).

PL 208 343 B1

Zatem na przykład aktywność DSPA_a1 w obecności fibryny zwiększa się 100000-krotnie, natomiast aktywność t-PA zwiększa się tylko 550-krotnie. Aktywność DSPA jest w znacznie mniejszym stopniu indukowana przez fibrynogen i zwiększa się tylko 7-9-krotnie (Bringmann i wsp., 1995). Zatem DSPA jest znacznie bardziej zależny od fibryny i specyficzny dla fibryny niż t-PA typu dzikiego, który jest aktywowany przez fibrynę tylko 550-krotnie.

Dzięki swoim właściwościom fibrynolitycznym i wielkiemu podobieństwu do t-PA DSPA jest jednak interesującym kandydatem do opracowania środka trombolitycznego. Pomimo tego w przeszłości zastosowanie terapeutyczne DSPA jako środka trombolitycznego ograniczało się do leczenia zawału mięśnia sercowego, ponieważ na skutek udziału t-PA w neurotoksyczności zależnej od glutaminianu nie istniały żadne perspektywy stosowania z powodzeniem aktywatora plazminogenu spokrewnionego z t-PA do leczenia ostrego udaru.

Aktualnie nieoczekiwanie okazało się, że DSPA pomimo wysokiego podobieństwa (homologii) do t-PA i pomimo daleko idącej zgodności jego skuteczności fizjologicznej z t-PA w przeciwieństwie do niego nie wykazuje żadnego działania neurotoksycznego. Temu stwierdzeniu towarzyszy pośrednio rozpoznanie polegające na tym, że DSPA można stosować jako środek trombolityczny także do leczenia udaru bez związanego z tym zagrożenia uszkodzenia tkanki nerwowej. Oznacza to zwłaszcza, że DSPA można stosować także później niż trzy godziny po wystąpieniu objawów udaru.

W związku z tym zgodnie z wynalazkiem opisano możliwość modyfikowania albo wytwarzania także i innych aktywatorów plazminogenu tego rodzaju, które mają tę właściwość DSPA względnie nie wykazują neurotoksyczności t-PA. Podstawą tego jest rozpoznany związek pomiędzy strukturą a działaniami biochemicznymi, który umożliwi w przyszłości przekształcanie neurotoksycznych aktywatorów plazminogenu w nieneurotoksyczne aktywatory plazminogenu względnie wytwarzanie na bazie znanych albo nowo odkrytych neurotoksycznych aktywatorów plazminogenu nieneurotoksycznych aktywatorów plazminogenu.

Ta nowa wiedza opiera się na badaniach porównawczych in vivo neurodegeneracyjnego działania t-PA z jednej strony, i DSPA z drugiej strony, które prowadzono za pomocą tak zwanego modelu kwasu kainowego oraz modelu do badania uszkodzenia prążkowia wywołanego przez NMDA.

Model kwasu kainowego (także model uszkodzenia przez kwas kainowy) polega na tym, że kaskadę neurotoksycznego glutaminianu pobudza się drogą zewnętrznego stosowania kwasu kainowego (KA) jako agonisty receptora glutaminianu typu kwasu kainowego (typu KA) oraz receptorów glutaminianu NMDA i AMPA.

Przez zastosowanie szczepu myszy z niedoborem t-PA jako modelu doświadczalnego można było w ten sposób wykazać, że wrażliwość zwierząt doświadczalnych na kwas kainowy osiągała poziom myszy typu dzikiego tylko przy dodatkowym podawaniu zewnętrznego t-PA. Natomiast infuzja DSPA o równomolowym stężeniu w takich samych warunkach doświadczalnych nie mogła przywrócić wrażliwości względem kwasu kainowego (KA). Zgodnie z tym działania t-PA nie można było zastąpić przez DSPA. Zestawienie tych wyników jest przedstawione w Tabeli 2.

T a b e l a 2

		Nienaruszona długość hipokampu (mm)
Grupa	Liczba	Po przeciwnej stronie	Po tej samej stronie	Procenty
leczenia	zwierząt	średnia (SEM)	średnia (SeM)	pozostałości
Infuzja t-PA (1,85 gM) + KA	12	15,99 (0,208)	3,63 (0,458)	22,7*
Infuzja DSPA (1,85 gM) + KA	11	16,07 (0,124)	13,8 (0, 579)	85,87
Infuzja t-PA (1,85 gM) + PBS	3	16,75 (0,381)	17,08 (0,363)	101,97
Infuzja DSPA (1,85 gM) + PBS	3	15,75 (0,629)	15,83 (0,363)	100,50
Infuzja t-PA (0,185 gM) + KA	3	15,60 (0,702)	5,07 (1,09)	32,5
Infuzja DSPA (18,5 gM) + KA	3	16,06 (0,176)	13,80 (1,22)	85,93

*P < 0,0001

Badania ilościowe na tym modelu wykazywały, że nawet 10-krotny wzrost stężenia DSPA nie mógł przywrócić wrażliwości myszy z niedoborem t-PA na KA, natomiast już 10-krotnie niższe stężenie t-PA powodowało uszkodzenie tkanki indukowane przez KA. Stąd wynika wniosek, że DSPA

PL 208 343 B1 ma co najmniej 100-krotnie niższy potencjał neurotoksyczny niż t-PA pod względem stymulacji neurodegeneracji po leczeniu KA, (patrz także Fig. 11 i 12).

W drugim modelu neurodegeneracji porównywano moż liwe działanie t-PA oraz DSPA na stymulację zależnej od NMDA neurodegeneracji u myszy typu dzikiego. W tym celu myszom typu dzikiego wstrzykiwano NMDA (jako agonistę receptora glutaminianu typu NMDA) samodzielnie albo w połączeniu z t-PA albo DSPA. Ten model pozwala na porównanie działania tych proteaz w warunkach, w których i tak dochodzi do neurodegeneracji oraz napływu białek osocza na skutek zerwania bariery krew-tkanka mózgowa (Chen i wsp., 1999).

Przy pracach na tym modelu wstrzykiwanie NMDS prowadziło do powtarzalnych uszkodzeń w prążkowiu myszy. Objętość tych uszkodzeń zwiększyła się przez łączne wstrzyknięcie t-PA i NMDA o co najmniej 50%. Natomiast łączne wstrzyknięcie z DSPA_a1 nie prowadziło do żadnego zwiększenia ilości lub wielkości uszkodzeń spowodowanych przez wstrzyknięcie NMDA. Nawet w obecności białek osocza, które mogą swobodnie dyfundować w regionie uszkodzeń indukowanych NMDA, DSPA nie prowadził do żadnego wzrostu neurodegeneracji (patrz także Tabela 3).

T a b e l a 3

Grupa leczenia	Liczba myszy typu dzikiego	Średnia objętość uszkodzenia (mm3) (SEM)
NMDA samodzielnie	8	1,85 (0,246)
NMDA + t-PA	8	3,987 (0,293)*
NMDA + DSPA	8	1,656 (0,094)**
t-PA samodzielnie	3	0,20 (0,011)
DSPA samodzielnie	3	0,185 (0,016)

*P < 0,0001 ** nieznaczący

Te wyniki wskazują, że DSPA w centralnym układzie nerwowym ssaka, także człowieka, stanowią w istocie obojętną proteazę i w przeciwieństwie do t-PA nie wywołują żadnego zwiększenia neurotoksyczności indukowanej przez KA albo NMDA. Ten brak neurotoksyczności sprawia, że DSPA wbrew oczekiwaniu jest odpowiednim środkiem trombolitycznym do leczenia ostrego udaru.

Pierwsze wyniki badań klinicznych wskazują na możliwość przenoszenia tych wyników także na leczenie udaru u człowieka. Zatem należy stwierdzić wyraźną poprawę w przypadku pacjentów po dokonanej z powodzeniem perfuzji (poprawa o 8 punktów NIHSS albo punktów NIHSS w skali 0-1), co uwidocznia Tabela 1.

T a b e l a 1

Pacjent		NIHSS
	Linia podstawowa	po Tmt	Dzień 7	Dzień 30	Dzień 90	sAEs
1001	12	7	4	4	*	Ponowny zawał
1002	8	9	2	0	0
1003	8	10	12	10	*
1004	8	4	2	0	0
1005	11	11	4	5	*
1006	9	7	1	*	*
1007	14	6	*	*	*
2001	19	20	--	--	--	ICH, śmierć
2002	15	21	--	--	--	ICH, śmierć
3001	8	7	6	5	*
3002	15	16	9	8	*
3003	10	19	21	*	--	Śmierć, dzień 39

PL 208 343 B1

Brak neurotoksyczności DSPA oraz również pozostałych nieneurotoksycznych aktywatorów plazminogenu (patrz wyżej) stanowi szczególną zaletę w leczeniu udaru, która polega na tym, że stosowanie tych aktywatorów plazminogenu, inaczej niż w przypadku t-PA typu dzikiego, nie jest ograniczone tylko do wąskiego przedziału czasowego trzech godzin po wystąpieniu udaru. Przeciwnie, leczenie może być rozpoczęte w późniejszym czasie, a więc bez wahania także po sześciu godzinach albo jeszcze później, ponieważ nie ma prawie wcale ryzyka stymulacji odpowiedzi ekscytotoksycznych, jak w przypadku t-PA. Pierwsze badania kliniczne z DSPA wykazały nawet bezpieczne leczenie pacjentów w przedziale czasowym dłuższym niż sześć do dziewięciu godzin po wystąpieniu objawów udaru.

Ta czasowo nieograniczona możliwość leczenia za pomocą nieneurotoksycznych aktywatorów plazminogenu jest właśnie dlatego tak ważna, że z ich pomocą po raz pierwszy staje się niewątpliwie możliwe leczenie pacjentów z ostrym udarem, u których nie można z dostateczną pewnością ustalić w czasie początku udaru. Ta grupa pacjentów była dotychczas wyłączona ze wzglę dów ostrożności i oceny ryzyka z trombolizy za pomocą aktywatorów plazminogenu. W ten sposób odpada istotne przeciwwskazanie dla dopuszczonego zastosowania środka trombolitycznego przy udarze.

DSPA oraz pozostałe nieneurotoksyczne aktywatory plazminogenu same nie wykazują żadnych neurotoksycznych skutków ubocznych, a jednakże może okazać się zalecane podawanie ich w leczeniu udaru w połączeniu ze ś rodkiem neuroochronnym, aby w ten sposób moż liwie ograniczyć uszkodzenie tkanki spowodowane w przeciwnym razie przez właściwy dla organizmu glutaminian. Do tego celu mogą służyć środki neuroochronne hamujące kompetycyjnie albo niekompetycyjnie receptor glutaminianu. Użyteczne połączenia to na przykład połączenie ze znanymi inhibitorami receptorów glutaminianu typu NMDA, typu kwasu kainowego albo typu kwiskwalanu, a więc na przykład z APV, APH, fencyklidyna, MK-801, dekstrorfanem albo ketaminą.

Zalecane może być także połączenie z kationami, ponieważ kationy, a zwłaszcza jony Zn, blokują kanał kationowy regulowany przez receptor glutaminianu i w ten sposób zmniejszają skutki neurotoksyczne.

W kolejnym zalecanym rozwiązaniu nieneurotoksyczne aktywatory plazminogenu można łączyć z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem. Szczególnie zalecane może być połączenie ze środkiem terapeutycznym, który przez ożywienie komórek sprzyja zmniejszeniu uszkodzenia tkanki, przyczynia się do regeneracji już uszkodzonej tkanki albo służy zapobieganiu dalszych udarów. Zalecane mogą być na przykład połączenia z antybiotykami, takimi jak chinony, środki przeciwkrzepliwe, takie jak heparyna albo hirudyna, oraz z cytycholiną albo aspiryną.

Zalecane może być ponadto połączenie z co najmniej jednym inhibitorem trombiny, takim jak trombomodulina, analogi trombomoduliny, takie jak na przykład solulina, triabina albo pallidypina. Zalecane są także połączenia z substancjami przeciwzapalnymi, które mają wpływ na infiltrację leukocytów.

Badania porównawcze t-PA i DSPA A.

Metody 1.

Zwierzęta

Myszy typu dzikiego (c57/Black 6) i myszy z niedoborem t-PA (myszy t-PA) (c57/Black 6) (Carmeliet i wsp., 1994) zostały dostarczone przez dr Petera Carmelieta, Leuven, Belgia.

2. Ekstrakcja białek z tkanki mózgowej

Oznaczanie aktywności proteolitycznej w tkance mózgowej po infuzji t-PA albo DSPAai prowadzono drogą analizy zymograficznej (Granelli-Piperno i Reich, 1974). Po 7-dniowym czasie trwania infuzji do hipokampu myszy usypiano, a na koniec poddawano perfuzji przezsercowo za pomocą PBS i wyjmowano mózg. Następnie pobierano obszar hipokampu, umieszczano w naczyniach Eppendorfa i poddawano inkubacji w takich samych obję toś ciach (masa/obję tość) (okoł o 30-50 μ l) z 0,5% buforem lizującym NP-40 bez inhibitorów proteaz (0,5% NP-40, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Wyciągi mózgowe homogenizowano za pomocą szklanego homogenizatora z napędem ręcznym i pozostawiano przez 30 minut na lodzie. Następnie próbki poddawano wirowaniu, usuwano supernatant i oznaczano ilość występujących białek (odczynnik Bio-Rad).

3. Zymograficzna analiza proteaz

Aktywność proteolityczną w próbkach albo wyciągach z tkanki mózgowej oznaczano drogą analizy zymograficznej sposobem Granelli-Piperno i Reicha (1974). Próbki rekombinowanego białka (do

100 nmoli) albo wyciągu z tkanki mózgowej (20 μg) poddawano analizie SDS-PAGE (10%) w warunkach nieredukujących. Następnie żele zdejmowano z płytek, przemywano przez dwie godziny w 1% Triton X100, a na koniec umieszczano na żelu agarozowym ze spolimeryzowanym fibrynogenem

PL 208 343 B1 i plazminogenem (Granelli-Piperno i Reich, 1974). Ż ele poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w komorze z nawilż aniem aż do rozpoznawania stref proteolitycznych.

4. Infuzja t-PA, DSPA, a na koniec wstrzyknięcie kwasu kainowego

Model uszkodzenia kwasem kainowym opiera się na sposobie postępowania Tsirka i wsp. (1995). Zwierzętom wstrzykiwano dootrzewnowe atropinę (4 mg/kg), a następnie usypiano je za pomocą wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu (70 mg/kg). Następnie umieszczano je w stereotaktycznej ramce, tak że mogła być wszczepiona osmotyczna mikropompka (Alzet model 1007D, Alzet CA, USA) ze 100 μΐ PBS albo rekombinowanym ludzkim t-PA (0,12 mg/ml, 1,85 μΜ) albo DSPAai (1,85 μΜ) podskórnie pomiędzy łopatki. Pompki łączono za pomocą sterylnych rurek z kaniulą mózgową i przez otwór w czaszce umieszczano na współrzędnych: ciemieniowej - 2,5 mm, środkowo-bocznej 0,5 mm i grzbietowo-brzusznej 1,6 mm, tak aby ciecz wprowadzać w pobliżu linii środkowej. Następnie kaniulę przyklejano w wymaganym położeniu i otwierano pompki w celu infuzji przez siedem dni odpowiednich roztworów przy szybkości przepływu 0,5 μl na godzinę.

Dwa dni po infuzji proteaz myszy usypiano ponownie i umieszczano w stereotaktycznej ramce, a na koniec wstrzykiwano 1,5 nmola kwasu kainowego w 0,3 μl PBS jednostronnie do hipokampu, przy czym współrzędne wynosiły: ciemieniowa 2,5 mm, środkowo-boczna 1,7 mm i grzbietowobrzuszna 1,6 mm. Ekscytotoksynę (KA) doprowadzano w ciągu 30 sekund. Po potraktowaniu kwasem kainowym igła pozostawała przy tych współrzędnych przez kolejne 2 minuty w celu zapobieżenia cofaniu się cieczy.

5. Badanie mózgu

Pięć dni po wstrzyknięciu KA zwierzęta usypiano i poddawano przezsercowej perfuzji za pomocą 30 ml PBS, a następnie 70 ml 4% roztworu paraformaldehydu, utrwalano dodatkowo przez 24 godziny w tym samym środku utrwalającym, po czym następowała inkubacja w 30% sacharozie przez kolejne 24 godziny. Na koniec na zmrożonym mikrotomie pobierano wieńcowe skrawki (40 μm) mózgu i albo barwiono je tioniną (BDH, Australia) albo przygotowywano je do badania immunohistochemicznego.

6. Ocena ilościowa utraty neuronów w hipokampie

Ocenę ilościową utraty neuronów w subpolach CA1-CA3 hipokampu prowadzono w sposób opisany poprzednio (Tsirka i wsp., 1995; Tsirka i wsp., 1996). Przygotowywano pięć kolejno następujących skrawków hipokampu grzbietowego ze wszystkich leczonych grup, przy czym skrawki obejmowały faktycznie miejsce wstrzyknięcia KA i obszar uszkodzenia. Subpola (CA1-CA3) hipokampu tych skrawków śledzono za pomocą rysunków hipokampu w komorze świetlnej. Całkowitą długość tych subpól mierzono w porównaniu z 1 mm standardami, które badano przy tym samym powiększeniu. Ustalano długość skrawków tkanek z żywymi neuronami piramidowymi (o normalnej morfologii) i długość skrawków tkanki bez neuronów (bez żadnych komórek, bez zabarwienia tioniną), a długości, które stanowiły nienaruszone neurony i ubytek neuronów w obszarze każdego subpola hipokampu uśredniano pomiędzy skrawkami i oznaczano odchylenie standardowe.

7. Wewnątrzprążkowe uszkodzenia na skutek ekscytoksyczności NMDA, z albo bez t-PA albo

DSPA

Myszy typu dzikiego (c57/Black6) usypiano i umieszczano w ramce stereotaktycznej (s.o). Następnie myszy otrzymywały do lewego prążkowia jednostronne wstrzyknięcie 50 nmola NMDA samodzielnie albo w połączeniu z 46 μM rt-PA albo 46 μM DSPA_a1. Jako kontrolę wstrzykiwano ponadto t-PA i DSPA_a1 samodzielnie przy stężeniu 46 μM. Współrzędne iniekcyjne były jak następuje: ciemieniowa -0,4 mm, środkowo-boczna 2,0 mm i grzbietowo-brzuszna 2,5 mm. Roztwory (objętość całkowita 1 gl dla każdego traktowania) przenoszono w ciągu okresu czasu 5 minut z szybkością 0,2 gl/min, przy czym igłę pozostawiano w miejscu wstrzyknięcia przez kolejne 2 minuty po wstrzyknięciu w celu zminimalizowania cofania się cieczy. Po 24 godzinach myszy usypiano i poddawano przezsercowej perfuzji za pomocą 30 ml PBS, a następnie 70 ml 4% roztworu paraformaldehydu, dodatkowemu utrwalaniu przez 24 godziny w tym samym środku utrwalającym, a następnie przez kolejne 24 godziny inkubacji w 30% sacharozie. Następnie pobierano skrawki wieńcowe (40 gm) na zmrożonym mikrotomie i umieszczano na nośnikach szklanych pokrytych żelatyną.

8. Ocena ilościowa objętości uszkodzenia po wstrzyknięciu NMDA

Ocenę ilościową objętości uszkodzeń prążkowia prowadzono metodą opisaną przez Callawaya i wsp. (2000), przy czym przygotowano 10 kolejnych skrawków wieńcowych, które obejmowały obszar uszkodzenia. Uszkodzony obszar poddawano wizualizacji metodą Callawaya, a objętość uszkodzenia oceniano ilościowo stosując urządzenie Micro Computer Imaging Device (MCID, Imaging Research Inc., Brock University, Ontario, Kanada).

PL 208 343 B1

9. Immunohistochemia

Immunohistochemię prowadzono standardowymi metodami, a skrawki wieńcowe poddawano przez 5 minut zanurzaniu w roztworze składającym się z 3% H2O2/10% metanolu, a następnie przez 60 minut inkubacji z 5% normalną surowicą z krwi koziej. Następnie skrawki poddawano przez noc inkubacji albo z przeciwciałem anty-GFAP (1:1000, Dako, Carpinteria, Ca, USA) w celu wykrycia astrocytów albo przeciwciałem anty-MAC-1 (1:1000, Serotec, Raleigh, NC, USA) w celu wykrycia tkanki glejowej albo z poliklonalnymi przeciwciałami anty-DSPA (Schering AG, Berlin). Po przemyciu skrawki poddawano inkubacji z przepływającymi biotynylowanymi wtórnymi przeciwciałami (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Następnie przed końcowym barwieniem za pomocą 3,3'-diamino-benzydyny/0,03% H2O2 następowała przez 60 minut inkubacja końcowa z kompleksem awidyna/biotyna (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Następnie skrawki przenoszono na nośniki pokryte żelatyną, suszono, odwadniano i zakryto pokrywką.

B. Wyniki

1. Infuzja t-PA albo DSPA wchodzi do hipokampu myszy z niedoborem t-PA i zachowuje swoją aktywność proteolityczną

Pierwsze próby miały na celu potwierdzenie, że zarówno DSPA, jak i t-PA zachowują swoją aktywność proteolityczną w ciągu 7-dniowego okresu czasu infuzji. W tym celu inkubowano przez siedem dni porcje t-PA i DSPA (100 nmoli) na łaźni wodnej zarówno w temperaturze 37°C, jak i w temperaturze 30°C. W celu określenia aktywności proteolitycznej próbki w 5-krotnym rozcieńczeniu poddawano analizie SDS-PAGE w warunkach nieredukujących, a aktywność proteolityczną mierzono drogą analiz zymograficznych. W danym przypadku jako kontrolę stosowano porcję t-PA i DSPA, która w czasie tych siedmiu dni pozostawa ł a w stanie zamrożenia. Jak widać na Fig. 1, mia ła miejsce tylko nieznaczna utrata aktywności DSPA albo t-PA przy inkubacji w tym okresie czasu zarówno w temperaturze 30°C, jak i 37°C.

2. Aktywność t-PA i DSPA można wykrywać także po infuzji w wyciągach z hipokampu myszy z niedoborem t-PA

Początkowo należało stwierdzić, że proteazy podane przy infuzji były obecne głównie w mózgu leczonych zwierząt i zachowywały tam swoją aktywność proteolityczną. W tym celu myszy z niedoborem t-PA otrzymywały przez siedem dni infuzję z t-PA albo DSPA (s.o). Na koniec myszy uśmiercano drogą przezsercowej perfuzji za pomocą PBS i wyjmowano im mózgi, przy czym wydzielano obszary po tej samej i przeciwnej stronie hipokampu, jak również obszar móżdżka (jako kontrolę negatywną).

Próbki tkanki (20 μg) poddawano analizie SDS-PAGE i zymograficznej zgodnie z opisem w części metodycznej. Jak widać z Fig. 2, mierzono aktywności zarówno t-PA, jak i DSPA w obszarze hipokampu po tej samej stronie, przy czym trochę aktywności mierzono po stronie przeciwnej. Wskazuje to, że poddane infuzji proteazy zachowują swoją aktywność nie tylko w mózgu, lecz rozchodzą się poza tym w obszarze hipokampu. Przy kontroli nie wykryto żadnej aktywności w wyciągu otrzymanym z móżdżka.

3. Immunohistochemiczne wykrywanie DSPA

W celu wykrycia, że DSPA faktycznie rozszedł się w obszarze hipokampu, analizowano immunohistochemicznie po infuzji DSPA wieńcowe skrawki mózgu myszy z niedoborem t-PA. W obszarze hipokampu wykryto antygen DSPA, a otoczenie miejsca infuzji wykazywało silne zabarwienie. Ten wynik potwierdza, że poddany infuzji DSPA jest rozpuszczalny i rzeczywiście występuje w hipokampie.

4. Infuzja DSPA nie odnawia już zależnej od KA neurodegeneracji in vivo

Myszy z niedoborem t-PA są odporne na neurodegenerację zależną od kwasu kainowego, natomiast infuzja rt-PA do hipokampu prowadzi do całkowitego odnowienia wrażliwości na uszkodzenie zależne od kwasu kainowego. W celu odpowiedzi na pytanie, czy DSPA może zastąpić t-PA w tym działaniu, myszy z niedoborem t-PA otrzymywały do hipokampu za pomocą minipompki osmotycznej infuzję z t-PA albo DSPA. W przypadku obydwu grup stosowano 12 myszy. Dwa dni później zwierzęta otrzymywały wstrzyknięcie kwasu kainowego i pozostawiano je w spokoju. Pięć dni później zwierzęta uśmiercano i wyjmowano mózgi oraz poddawano je obróbce (s.o). Przed potraktowaniem KA myszy z niedoborem t-PA poddawano poza tym infuzji PBS (n=3) jako kontrole.

Przygotowano wieńcowe skrawki mózgu, a neurony wykrywano drogą barwienia według Nissi. Stało się oczywiste, że myszy z niedoborem t-PA po infuzji PBS były odporne na KA. Natomiast infuzję z rekombinowanym t-PA prowadziły do odnowy wrażliwości na traktowanie KA. W przeciwieństwie do tego infuzja o tym samym stężeniu DSPA w obszarze hipokampu nie zmieniała wrażliwość tych zwierząt na KA (patrz Fig. 4a i 4b).

PL 208 343 B1

Ocena ilościowa tych wyników miała miejsce z użyciem 12 myszy w każdej grupie. U 2 z 12 myszy poddanych infuzji DSPA obserwowaliśmy nieznaczną neurodegenerację, której przyczyna nie jest jeszcze jasna i może być niezależna od DSPA.

Połączone dane uwzględniają nieznaczny efekt, jaki obserwowano u tych dwóch zwierząt. Wszystkie 12 myszy z niedoborem t-PA było wrażliwe na traktowanie KA. Te wyniki wskazują, że w przypadku infuzji t-PA albo DSPAai przy równomolowych stężeniach tylko podawanie t-PA prowadzi do odnowy wrażliwości na neurodegenerację indukowaną przez KA.

5. Infuzja DSPA nie powoduje żadnej aktywacji tkanki mikroglejowej

Odnowa wrażliwości na KA myszy z niedoborem t-PA po infuzji t-PA daje w wyniku niewątpliwie aktywację tkanki mikroglejowej (Rogove i wsp., 1999). Aby określić wielkość aktywacji tkanki mikroglejowej po infuzji t-PA albo DSPA, a następnie potraktowaniu KA, skrawki wieńcowe myszy poddawano immunohistochemicznemu barwieniu pod kątem aktywnych komórek tkanki mikroglejowej stosując przeciwciało Mac-1. Odnowa wrażliwości na KA po infuzji t-PA dawała w wyniku wyraźny wzrost komórek pozytywnych względem Mac-1. Nie obserwowano tego u myszy, które otrzymywały infuzję DSPA. Zatem obecność DSPA nie prowadzi po potraktowaniu KA do aktywacji komórek mikroglejowych.

6. Miareczkowanie DSPA i t-PA w obszarze hipokampu myszy

Stężenie t-PA, które stosowano do infuzji, opierało się na stężeniu (100 μΐ o 0,12 mg/ml (1,85 gM) opisanym przez Tsirka i wsp. (1995). Doświadczenia z obciążaniem za pomocą KA powtórzyliśmy stosując 10-krotnie mniejszą ilość t-PA (0,185 μM) i większą ilość DSPA (18,5 μM). Niższe stężenie t-PA było wciąż jeszcze w stanie odnowić wrażliwość na traktowanie KA (n=3). Szczególnie interesujące było to, że po potraktowaniu KA infuzja DSPA o 10-krotnie większym stężeniu powodowała tylko nieznaczną utratę neuronów. Te dane wskazują silnie na to, że DSPA nie podwyższa wrażliwości względem KA.

7. Wpływ t-PA i DSPA na zależną od NMDA neurodegenerację u myszy typu dzikiego

Działanie t-PA i DSPA badano dalej na modelu neurodegeneracji u myszy typu dzikiego. Wstrzyknięcie t-PA do prążkowia tych myszy prowadzi niewątpliwie do zwiększenia efektów neurodegeneracyjnych wywołanych przez analog glutaminianu, NMDA (Nicole i wsp., 2001).

W tym celu do obszaru prążkowia myszy typu dzikiego podawano w obecności t-PA albo DSPA (w danym przypadku 46 μM) wstrzyknięcia NMDA o objętości całkowitej 1 gl. Po 24 godzinach wyjmowano mózgi i oceniano ilościowo wielkość uszkodzeń metodą Callawaya (Callaway i wsp., 2000) (s.o). Jak widać z Fig. 7, wstrzyknięcie tylko NMDA powodowało powtarzające się uszkodzenie u wszystkich potraktowanych myszy (n=4). Gdy jednak wstrzykiwano łącznie t-PA i NMDA, to wielkość uszkodzeń wzrastała o około 50% (P < 0,01, n=4). W wyraźnym przeciwieństwie do tego łączne wstrzykiwanie NMDA i DSPA o takim samym stężeniu nie powodowało żadnego wzrostu wielkości uszkodzeń w porównaniu z samym NMDA.

Wstrzykiwanie samego t-PA albo DSPA nie prowadziło do dającej się wykazać neurodegeneracji, a brak działania t-PA przy jego samodzielnym podawaniu jest zgodny z wynikami Nicole'a i wsp. (2001). Te dane wskazują, że obecność DSPA nie zwiększa już dalej neurodegeneracji także i w czasie procesu neurodegeneracyjnego.

W celu potwierdzenia, że wstrzyknięcie DSPA rozeszło się faktycznie w obszarze hipokampu, prowadzono immunohistochemiczne badania nad skrawkami wieńcowymi z zastosowaniem przeciwciała DSPA. Badania wykazały, że DSPA wszedł faktycznie w obszar prążkowia.

Analiza kinetyczna aktywacji plazminogenu drogą pośredniej próby chromogennej

W pośrednich chromogennych próbach aktywności t-PA stosowano podłoże Lys-Plasminogen (American Diagnostica) i Spectroenzyme PL (American Diagnostica) i prowadzono je według Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M. J., Sambrook J.F. (1989) Nature 339 721-724; Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.J., Sambrook J.F. i Bassel-Duby R.S. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3530-3533, oraz Madison E.L., Goldsmith E.J., Gething M.J., Sambrook J.F. i Gerard R.D. (1990) J. Biol. Chem. 265, 21423-21426. Próby prowadzono zarówno w obecności, jak i przy braku, kofaktorów DESAFIB (American Diagnostica). DESAFIB, preparat rozpuszczalnych monomerów fibryny, uzyskiwano drogą rozszczepienia ludzkiego fibrynogenu o wysokiej czystości za pomocą proteazy Batroxobin. Batroxobin rozszczepia przy tym wiązanie Arg¹⁶-Gly¹⁷ w łańcuchu Aa fibrynogenu i uwalnia przy tym fibrynopeptyd A. Otrzymany des-AA-fibrynogen w postaci monomerów fibryny I jest rozpuszczalny przy braku peptydu Gly-Pro-Arg-Pro. Stężenie Lys-plazminogenu zmienia się od 0,0125 do 0,2 gM w obecności DESAFIB, a przy braku kofaktora zmienia się od 0,9 do 16 gM.

PL 208 343 B1

Pośrednie próby chromogenne w obecności różnych stymulatorów

Pośrednie standardowe próby chromogenne prowadzono zgodnie z cytowanymi wyżej publikacjami, przy czym stosowano zestawy o ogólnej objętości 100 μΐ z 0,25-1 ng enzymu, 0,2 μΜ Lysplazminogenu i 0,62 mM Spectrozym PL. Próby prowadzono w obecności albo buforu, 25 μg/ml DESAFIB, 100 μg/ml bromocyjanowych fragmentów fibrynogenu (American Diagnostica) albo 100 μg/ml stymulacyjnego 13 aminokwasowego peptydu P368. Analizy prowadzono na płytkach do mikromiareczkowania, a gęstość optyczną przy długości fali 405 nm mierzono przez 1 godzinę co każde 30 sekund w urządzeniu Molecular Devices Thermomax. Temperatura reakcji wynosiła 37°C.

Odesłania

Baranes D, Lederfein D, Huang YY, Chen M, Bailey CH, Kandel ER. 1998. Tissue plasminogen activator contributes to the late phase of LTP and to synaptic growth in the hippocampal mossy fiber pathway. Neuron 21:813-25.

Bringmann P, Gruber D, Liese A, Toschi L, Kratzchmar J, Schleuning WD, Donner P. 1995. Structural features mediating fibrin selectivity of vampire bat plasminogen activators. J Biol Chem 270:25596-25603.

Callaway JK, Knight MJ, Watkins DJ, Beart PM, Jarrott B, Delaney PM. 2000. A novel, rapid, computerized method for quantitation of neuronal damage in a rat model of stroke. J Neurosci Methods 102:53-60.

Carmeliet P, Schoonjans L, Kieckens L, Ream B, Degen J, Bronson R, De Vos R, van den Oord JJ, Collen D, Mulligan RC. 1994. Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice Nature 368: 419-424.

Cartwright T. 1974. The plasminogen activator of vampire bat saliva. Blood 43:317-326.

Chen ZL Strickland S. 1997. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmincatalysed degradation of laminin. Cell 91:917-925.

Chen, Z-L, Indyk, J.A., Bugge, T.H., Kombrinck, K.W., and Strickland S. 1999. Neuronal Death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J. Neuroscience 19:9813-9820

Frey U, Muller M, Kuhl D. 1996. A different form of long-lasting potentiation revealed in tissue plasminogen activator mutant mice. J Neurosci 16:2057-2063.

Gardell SJ, Duong LT, Diehl RE, York JD, Hare TR, Register RB, Jacobs JW, Dixon RA, Friedman PA. 1989. Isolation, characterization, and cDNA cloning of a vampire bat salivary plasminogen activator. J Biol Chem 264: 17947-17952.

Gardell SJ, Ramjit DR, Stabilito II, Fujita T, Lynch JJ, Cuca GC, Jain D, Wang SP, Tung JS, Mark GE, i wsp. 1991. Effective thrombolysis without marked plasminemia after bolus intravenous administration of vampire bat salivary plasminogen activator in rabbits. Circulation 84:244-253.

Granelli-Piperno, A and Reich, E. 1974. A study of proteases and protease inhibitor complexes in biological fluids. J. Exp. Med. 148: 223-234.

Huang YY, Bach ME, Lipp HP, Zhuo M, Wolfer DP, Hawkins RD, Schoonjans L, Kandel ER, Godfraind JM, Mulligan R, Collen D, Carmeliet P. 1996. Mice lacking the gene encoding tissue-type plasminogen activator show a selective interference with late-phase long-term potentiation in both Schaffer collateral and mossy fiber pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 93:8699-86704.

Kratzschmar J, Haendler B, Langer G, Boidol W. Bringmann P, Alagon A, Donner P, Schleuning WD.

1991. The plasminogen activator family from the salivary gland of the vampire bat Desmodus rotundus: cloning and expression. Gene 105:229-237.

Madani R, Hulo S, Toni N, Madani H, Steimer T, Muller D, Vassalli JD. (1999) Enhanced hippocampal long-term potentiation and leaming by increased neuronal expression of tissue-type plasminogen activator in transgenic mice. EMBO J.18:3007-3012.

Mellott MJ, Stabilito II, Holahan MA, Cuca GC, Wang S, Li P, Barrett JS, Lynch JJ, Gardell SJ.

1992. Vampire bat salivary plasminogen activator promotes rapid and sustained reperfusion concomitant systemie plasminogen activation in a canine model of arterial thrombosis. Arterioscler. Thromb. 12:212-221.

Muschick, P., Zeggert D., Donner, P., Witt, W. 1993. Thrombolytic properties of Desmodus (vampire bat) plasminogen activator DSPAai, Alteplase and streptokinase following intravenous bolus injection in a rabbit model of carotid artery thrombolysis. Fibrinolysis 7: 284-290.

PL 208 343 B1

M^ler, C.M., Griesinger, C.B. 1998. Tissue plasminogen activator mediates reverse occlusion plasticity in visual cortex. Nature Neuroscience. 1: 47-53. National Institute of Neurological Disorders and stroke rt-PA study group. 1995. New. Engl. J. Med. 333: 1581-1587.

Nicole, O., Docagne, F., Ali, C., Margaill, I., Carmeliet, P., MacKenzie, E.T., Vivien, D. & Buisson, A. (2001) The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptormediated signaling. Nat Med 7, 59-64.

Rogove AD, Siao C, Keyt B, Strickland S, Tsirka SE. 1999. Activation of microglia reveals a non-proteolytic cytokine function for tissue plasminogen activator in the central nervous system. J Cell Sci 112:4007-4016.

Schleuning WD, Alagon A, Boidol W, Bringmann P, Petri T. Kratzschmar J, Haendler B, Langer G, Baldus B, Witt W, i wsp. 1992. Plasminogen actlvators from the saliva of Desmodus rotundus (common vampire bat): unique fibrin specificity. Ann N Y Acad Sci 667-395-403.

Seeds, N.W., Williams, B.L., Bickford, P.C. 1-995. Tissue plasminogen activator induction in purkinje neurons after cerebellar motor learning. Science. 270:1992-1994.

Stewart RJ, Fredenburgh JC, Weitz JI. 1998. Characterization of the interactions of plasminogen and tissue and vampire bat plasminogen activators with fibrinogen, fibrin, and the complex of D-dimer noncovalently linked to fragment E. J Biol Chem 273:18282-18299.

Traynelis, SF, Lipton, SA. 2001. Is tissue plasminogen activator a threat to neurons? Nature Medicine, 7:17-18. Toschi L, Bringmann P, Petri T. Donner P, Schleuning WD. 1998. Fibrin selectivity of the isolated protease domains of tissue-type and vampire bat salivary gland plasminogen activators. Eur J Blochem 252:108-112.

Tsirka SE, Gualandris A, Amaral DG, Strickland S. 1995. Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator. Nature. 377:340-344.

Tsirka, S., Rogove, A. D., and Strickland, S. 1996. Neuronal celi death and tPA. Nature 384:123-124.

Tsirka SE, Rogove AD, Bugge TH, Degen JL, Strickland S. 1997. An extracellular proteolytic cascade promotes neuronal degeneration in the mouse hippocampus. J Neurosci 17:543-552.

Tsirka SE, Bugge TH, Degen JL, Strickland S. 1997. Neuronal death in the central nervous system demonstrates a non-fibrin substrate for plasmin. Proc Natl Acad Sci USA 94:9779-9781.

Wang YF, Tsirka SE, Strickland S, Stieg PE, Soriano SG, Lipton SA. 1998. Tissue plasminogen activator (tPA) increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild-type and tPA-deficient mice. Nat Med. 4:228-231.

Walker JB, Nesheim ME. 2001. A kinetic analysis of the tissue plasminogen activator and DSPAalphal cofactor activities of untreated and TAFIa-treated soluble fibrin degradation products of varying size. J Biol Chem 276: 3138-3148.

Witt W, Maass B, Baldus B, Hildebrand M, Donner P, Schleuning WD. 1994. Coronary thrombolysis with Desmodus salivary plasminogen activator in dogs. Fast and persistent recanalization by intravenous bolus administration. Circulation. 90:421-426.

Claims (5)

1. Zastosowanie DSPA alfa 1 do wytwarzania leku do leczenia udaru u ludzi po upływie trzech godzin od wystąpienia udaru.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że następuje po upływie sześciu godzin od wystąpienia udaru.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że następuje po upływie dziewięciu godzin od wystąpienia udaru.

4. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że DSPA alfa 1 może być wyizolowany z Desmodus rotundus.

5. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że DSPA alfa 1 jest wyizolowany z Desmodus rotundus.